KR20200111213A

KR20200111213A - 순차적으로 다중화된 면역글로불린 fc 조성물을 제조하기 위한 천연 인간 단백질 단편들의 융합 단백질

Info

Publication number: KR20200111213A
Application number: KR1020207023918A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 에스 블럭; 헨릭 올센
Original assignee: 글리크닉 인코포레이티드
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2020-09-28
Also published as: CA2902942C; HRP20190652T1; CN103154036B; MX2019012016A; IL254796B; IL254796A0; IL268724A; EP2598533A2; PL2598533T3; JP2013543483A; TW201207104A; HUE044869T2; JP6225142B2; CA2804512C; MX347343B; TW201706313A; ES2719623T3; CA2804512A1; US11117940B2; EP2598533A4

Abstract

본 발명은 면역세포 수용체에 대한 다가 면역글로불린 Fc이 존재함으로써, 전체 재조합 다중화 형태의 면역글로불린 Fc 시리즈를 포함한다. 융합단백질은 호모다이머 및 고차원 멀티머 프랙션들, 일명 스트라도머들로서 존재한다. 호모다이머 프랙션과 비교하여, 정제된 멀티머 스트라도머들은 느린 해리속도를 갖는 FcR들에 대하여 높은 친화도 및 애비더티를 가지며, 질병의 치료 및 예방에 유용하다. 본 발명은 다중화 도메인에 직접 결합하는 IgG1 Fc 부분들이 다중화 및 생물학적 활성을 개선시킨다는 사실을 입증한다.

Description

순차적으로 다중화된 면역글로불린 FC 조성물을 제조하기 위한 천연 인간 단백질 단편들의 융합 단백질{FUSION PROTEINS OF NATURAL HUMAN PROTEIN FRAGMENTS TO CREATE ORDERLY MULTIMERIZED IMMUNOGLOBULIN FC COMPOSITIONS}

관련출원에 대한 교차 참조:

본 출원은 그의 전체 기술내용이 본 명세서에 구체적인 참고로 포함된 2011년 7월 28일자 미국 가출원 제61/368,465호를 우선권으로 주장한다.

전자제출된 문서파일의 설명

본 명세서와 함께 전자제출된 문서파일의 내용은 참고로 전문통합된다: 서열목록의 컴퓨터로 해독할 수 있는 포맷 복사본(파일명: GLIK_006_01 US__SeqList_ST25.txt, 기록일: 2011년 7월 26일, 파일크기 61킬로바이트)

본 발명은 일반적으로 면역학, 자가면역, 염증, 및 종양 면역학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Fc 도메인들에 천연결합된 면역글로불린 Fc 도메인들을 포함하는 생물학적으로 활성인 생체모방 분자들, 상기 생체모방 분자들을 포함하는 조성물 및 상기 생체모방 분자들을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 림프구, NK 세포들, 단핵구-유도 세포들 및 단핵구-유도 세포들과 반응하는 면역세포들에 의해 매개되는 병리학적 질환들의 치료 및 예방, 및 상기 치료 및 예방을 위해 결합된 IgG Fc 단편들의 안정화 작용부분들을 사용하는 것에 관한 것이다.

1950년대 초반이후로 면역결핍증, 보다 최근에는 보다 통상적으로 자가면역질환 및 염증질환들을 치료하기 위해 인간 혈장으로의 면역글로불린 생성물이 사용되어 왔다.

처음에, 면역글로불린 생성물은 근육내 주사에 의해 투여되었다. 보다 최근에는, 정맥내 면역글로불린(IVIG)이 사용되었으며, 자가면역 질환인 특발성 혈소판 감소증 자반증(ITP)의 치료에 효과적임을 처음 나타내었다(Imbach P, Barandun S, d'Apuzzo V, et al: High-dose intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood. Lancet 1981 Jun 6; 1 (8232): 1228-31). 인간 IVIG(이하, "hIVIG"라고 함)는 소량의 다양한 양의 면역글로불린 A(IgA) 또는 면역글로불린 M(IgM)과 함께 95% 이상의 비변형 IgG을 함유하는 혼주혈장(pooled human plasma)으로부터 제조된 멸균의, 정제된 면역글로불린 G(IgG) 생성물의 배합물이다(예를 들어, Rutter A, Luger TA: High-dose intravenous immunoglobulins: an approach to treat severe immune-mediated and autoimmune diseases of the skin. J Am Acad Dermatol 2001 Jun; 44(6): 1010-24 참조). 오늘날 hIVIG를 단독으로 가장 통상적인 임상 용도는 만성 염증성 탈수초화 다발성 신경병증을 치료하는데 사용하는 것이다.

hIVIG가 효과적인 임상치료인 반면, 부적당한 불임가능성, 바이러스 및 프리온을 포함한 감염원 또는 불순물의 존재, 이러한 풀형 인간 혈액생성물의 유용성 부재, 로트(lot)-대-로트 변이, 고비용, 신장기능에 영향을 미치는 큰 단백질 부하, 및 보통 수시간 이상 걸리고, 때로는 매달 연이어 2일의 긴 투여시간을 포함하는, hIVIG 치료법에 심각한 단점들이 존재한다. 특히, IgA는 IgA-결핍 수용자들 내에서 알레르기 및 과민증 반응을 유발할 수 있기 때문에, hIVIG 제조법들은 관련될 수 있는 그들의 면역글로불린 A(IgA) 함량에 있어서, 매우 다양할 수 있다. hIVIG의 부정적인 측면에서, 자가면역 및 염증 질병들을 치료하기 위한 개선된 수단들의 필요성, 및 특히 동등한 효능, 큰 잠재성, 짧은 투여시간 및 큰 순도를 적어도 갖는 재조합 제조된 생성물의 풍부한 원료의 필요성이 존재한다.

그리고, 매우 다양한 타입의 다중 병리적 질환들은 단핵구, 림프구 및 NK 세포들로부터 유도된 세포들에 의해 매개된다. 모두가 아니라면, 많은 상기 질환들에 사용하기 위한 새로운 치료제 및/또는 예방제는 중요한 미충족 의료적 필요성을 충족시키며, 상업적으로 가치있다.

hIVIG의 많은 면역-조절 특성들은 IgG 분자들의 Fc 도메인안에 있다. 예를 들면, ITP의 쥣과 모델들에서, 비변형 hIVIG 및 Fc 단편은 모두 혈소판 수를 회복하는데 치료적 효능을 단독 증명하는 반면, 분리된 hIVIG Fab 단편들은 치료적으로 도움이 되지 않는다(Samuelsson, A., Towers, T. L. & Ravetch, J.V. Antiinflammatory Activity of hIVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001)). 그리고, hIVIG의 Fab 단편이 아닌 Fc도 또한, 아동기 및 성인기 특발성 혈소판감소성 자반증을 모두 치료하는데 있어서 치료적으로 유효하다(Follea, G. et al. Intravenous plasmin-treated gamma globulin therapy in idiopathic thrombocytopenic purpura. Nouv Rev Fr Hematol 27, 5-10 (1985); Solal-Celigny, P., Bernard, J., Herrera, A. & Biovin, P. Treatment of adult autoimmune thrombocytopenic purpura with high-dose intravenous plasmin-cleaved gammaglobulins. Scand J Haematol 31, 39-44 (1983); Debre, M. & Bonnet, M.-C. Infusion of Fc gamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura. Lancet 342, 945-49 (1993); Burdach, S.E., Evers, K. & Geurson, R. Treatment of acute idiopathic thrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulin G: Comparative efficacy of 7S and 5S preparations. J Pediatr 109, 770-775 (1986)).

활성화 및 억제 부재들로 구별될 수 있는, 정통 Fc 감마-수용체들의 부류들 외에, 주요 조직적합성 부류 I(MHC-I) 분자들에 속하는 신생 Fc-수용체(FcRn) 및, C-타입 렉틴의 부류에 속하는 SignR1/DC-SIGN이 IgG Fc-단편에 결합할 수 있다(Nimmerjahn and Ravetch, Antibody-mediated modulation of immune responses, Immunological Reviews, 236: 265-275 (2010)). 추가로, 면역글로불린 Fc 분자들이 결합하여 생리학적 효과를 발휘하는 Fc 감마-유사 수용체들이 있다(Davis RS. "Fc Receptorlike molecules" Annu. Rev. Immunol. 2007. 25 :525-60). hIVIG의 치료 효과는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 통해 초기에 매개되며, 장기간 관용 효과를 위해 수지상세포(DC)-대식세포 상호작용(cross-talk)에 의존한다. FcγRIIIa는 개시 단계에서 필요한 역할을 하며, FcγRIIb는 ITP의 쥣과 모델에서 실행 단계에 필요하다(Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of hIVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001); Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fey receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)). 이와 유사하게, 인간 연구들은 항-Fcγ 수용체 항체들이 불응 ITP를 치료하는데 유효함을 증명한다(Clarkson, S. et al. Treatment of refractory immune thrombocytopenic purpura with an anti-Fc gamma-receptor antibody. N Engl J Med 314, 1236-1239 (1986)). 중요하게는, hIVIG-치료된 DC들의 입양 전달이 ITP의 쥣과 모델들을 치료하는데 유효하기 때문에, 장기간 관용 효과들은 세포-세포 상호반응에 의해 매개된다(Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fey receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)).

hIVIG의 면역조절 효과에는 FcγR의 응집이 필요하다. FcγR의 응집은 hIVIG내에 존재하는 IgG "다이머"(전체 hIVIG의 5-15%)에 의해 매개된다(Bleeker, W. K. et al. Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)). 예를 들면, IVIG의 공지된 면역순환 임상 저혈압효과는 IVIG내 "다이머"의 존재와 서로 연관되어 있다(Kroez M et. al. Hypotension with Intravenous Immunoglobulin Therapy: importance of pH and dimer formation. Biologicals 31 (2003) 277-286.). 예를 들면, ITP의 쥣과 모델에서, 고함량의 "다이머"(전체 호모다이머 면역글로불린 분자들의 다이머)를 갖는 hIVIG가 혈소판 개수를 증가시켰지만, hIVIG "모노머"(전체 호모다이머 면역글로불린 분자들)는 효과적이지 않았다(Teeling, J.L. et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood 98, 1095-1099 (2001)). 그리고, IgG 응집물을 제거하기 위해 hIVIG를 제조하는데, 이온교환수지 및 폴리에틸렌 글리콜 분류법이 규칙적으로 사용되더라도, hIVIG의 임상효과는 환자의 혈청내 응집물의 존재와 서로 연관되어 있다(Augener, W., Friedman, B. & Brittinger, G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut 50, 249-252 (1985)). 중요하게는, 다이머의 비율은 또한, 아세틸하이드롤라제로 치료가능한, 혈관활성 부작용과 서로 연관되어 있다(Bleeker, W.K. et al. Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)).

IVIG의 응집체 프랙션의 효과를 유지 및 개선시키면서 높은 단백질 부하, 불편한 환자 투여, 전염 위험, IgA 아나필락시스(anaphylaxis) 및, 제한된 유용성의 문제점들을 해결하는 IVIG에 대한 대안이 필요하다.

본 발명은 인간 면역글로불린 Fc 및 단일 자연발생 다중화 도메인을 포함하는 생물학적 활성 융합 단백질 생체모방 분자들, 이를 포함하는 조성물 및 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 생체모방물들은 이러한 생체모방물들이 모델링된 후에 hIVIG와 같은, 자가면역 질병들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 및 염증 질환들을 치료하기 위한 넓은 용도를 가진다. 그리고, 이러한 생체모방물들 중 일부는 면역세포 기능을 시험하기 위한 면역학적 분석에, 질병진단시에, 및 항체-기반 면역분석법에서 Fc의 비특이적 결합을 차단시에 사용하는 것과 같은, 실험실 제제들로서의 유용성을 가진다. 그리고, 본 발명의 생체모방물 및 조성물들은 hIVIG의 상기 한계점뿐만 아니라 전구체 생체모방 스트라도머(precursor biomimetic stradomer)의 다중화 한계점을 극복하는 잇점을 가진다.

WO 2008/151088에는 자가면역 질병 및 다른 염증질환들을 포함하는, 병리학적 질환들을 치료하기 위해, hIVIG의 순차적으로 다중화된 면역글로불린 Fc 생체모방물(스트라도머로 알려져 있는, 생물학적으로 활성인 정돈된 멀티머)을 생성하기 위해, 결합된 면역글로불린 Fc 도메인들을 사용하는 것이 개시되어 있다. WO 2008/151088을 참조하며, 이의 내용은 참고로 전문통합된다. 개시된 분자들은 천연 면역글로불린 Fc에 대하여, 면역글로불린 Fc 모노머에서 친화도 태그 및 제한부위들을 포함하는 외부 서열들을 함유하도록 디자인되었다. 이러한 외부 서열들은 스트라도머(약 16개의 전체 아미노산)의 전체 아미노산 조성물의 소분획물에 대하여 전체적으로 계산되었으며, FcR 결합기능 및 다중화 기능과 같은 별도의 구별된 기능들을 갖는 도메인들 사이에 두었다. 일반적으로, 플랭킹 도메인들(flanking domains)의 독립적인 기능들을 입체적으로 제한하거나 또는 감소시키는 것을 피하기 위해, 독립적 구조 및/또는 기능들을 갖는 도메인들 사이에 작은 연결서열들(linking sequences)을 포함하는 것이 통상적이다. 그러나, 본 명세서에 개시한 바와 같이, 상기 짧은 세그먼트들을 제거하면, 멀티머 형성, 수용체 결합, 및/또는 전체 생물학적 활성이 극적으로 개선될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 선도 서열(leader sequence), IgG1 Fc 도메인 및 다중화 도메인을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 선도 서열은 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되며, IgG1 Fc 도메인은 다중화 도메인에 직접 결합된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 2와 적어도 80% 상동한 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 2와 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 2와 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 2와 적어도 99% 상동하다. 또다른 구체예에서, 서열번호: 2의 IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열은 선도 서열 및/또는 다중화 도메인에 직접 결합된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛은 다중화되었을때 FcγRIIIa 또는 DC-SIGN/SIGN-R1과 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 3과 적어도 80% 상동한 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, 다중화 도메인은 서열번호: 3과 적어도 90% 상동하다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛의 다중화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 3과 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛의 다중화 도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 3과 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들을 다중화할 수 있다. 추가의 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 카복시 말단에 직접 결합된다. 어떤 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 아미노 말단에 직접 결합된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 5와 적어도 80% 상동한 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, 다중화 도메인은 서열번호: 5와 적어도 90% 상동하다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛의 다중화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 5와 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛의 다중화 도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 5와 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들을 다중화할 수 있다. 추가의 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 카복시 말단에 직접 결합된다. 어떤 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 아미노 말단에 직접 결합된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 26과 적어도 80% 상동한 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, 다중화 도메인은 서열번호: 26과 적어도 90% 상동하다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛의 다중화 도메인의 아미노산 서열이 서열번호: 26과 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 스트라도머 유닛의 다중화 도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 26과 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들을 다중화할 수 있다. 추가의 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 카복시 말단에 직접 결합된다. 어떤 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 아미노 말단에 직접 결합된다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG2 힌지 다중화 도메인에 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, IgG2 힌지는 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 4와 적어도 80% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 4와 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 4와 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 4와 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 아이소류신 지퍼 다중화 도메인에 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 아이소류신 지퍼는 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 10과 적어도 80% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 10과 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 10과 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 10과 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 GPP 다중화 도메인에 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, GPP 다중화 도메인은 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 27과 적어도 80% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 27과 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 27과 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 27과 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG2 힌지 다중화 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, IgG2 힌지는 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 8과 적어도 80% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 8과 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 8과 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 8과 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 아이소류신 지퍼 다중화 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 아이소류신 지퍼는 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 9와 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 9와 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 9와 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 GPP 다중화 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, GPP 다중화 도메인은 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 28과 적어도 80% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 28과 적어도 90% 상동하다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 28과 적어도 95% 상동하다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 28과 적어도 99% 상동하다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 직접 차례로 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다. 추가의 구체예에서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들의 고차 멀티머들을 생성한다. 또다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 35%는 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 또다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 55%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 65%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 추가의 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 70%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 또다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 75%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다.

추가의 구체예에서, 한 구체예에서, 본 발명은 선도서열, 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 및 다중화 도메인을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 선도 서열은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되며, 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인은 다중화 도메인에 직접 결합된다.

한 구체예에서, 본 발명은 스트라도머 유닛의 아미노산 서열이 서열번호: 20을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 20을 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛을 포함하는 클러스터 스트라도머에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 스트라도머 유닛의 아미노산 서열이 서열번호: 24를 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 24를 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛을 포함하는 클러스터 스트라도머에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 스트라도머 유닛의 아미노산 서열이 서열번호: 21을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 21을 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛을 포함하는 클러스터 스트라도머에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 다중화 도메인은 IgG1 힌지 도메인이 누락된 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되며, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 생성한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 다중화 도메인은 FcR을 결합할 수 있는 IgG1 Fc의 일부에 직접 결합되거나, 또는 IgG1 Fc의 일부에 직접 결합된 다중화 도메인이 FcR을 함께 결합할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 도메인들로 구성된 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합된 다중화 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 생성한다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG1 CH2 및 CH3 도메인들로 구성된 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 다중화 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성한다.

한 구체예에서, 본 발명은 IgG1 CH2 및 IgG1 CH3 도메인에 직접 결합되는, IgG2 힌지를 포함하는 Fc 도메인에 직접 결합된 선도서열을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것으로서, IgG2 힌지는 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 생성한다. 한 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 18과 적어도 80% 상동한다. 추가의 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 18과 적어도 90% 상동한다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 18과 적어도 95% 상동한다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 유닛의 아미노산 서열은 서열번호: 18과 적어도 99% 상동한다. 다른 구체예에서, 선도 서열(서열번호: 1)은 성숙 단백질로부터 쪼개진다.

한 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 스트라도머 유닛에 관한 것이다. 한 구체예에서, IgG1 Fc 도메인은 서열번호: 2와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 상동한다. 다른 구체예에서, IgG1 Fc 도메인은 서열번호: 19와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 상동한다. 추가의 구체예에서, IgG1 Fc 도메인은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 다중화 도메인은 서열번호: 3과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 상동한다. 다른 구체예에서, 다중화 도메인은 서열번호: 5와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 상동한다. 또다른 구체예에서, 다중화 도메인은 서열번호: 26과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 상동한다. 한 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 N 말단에 직접 결합된다. 다른 구체예에서, 다중화 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 C 말단에 직접 결합된다.

한 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 각각 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 모노머들을 포함하는 클러스터 스트라도머에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 FcγRIIIa와 결합한다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 FcγRIIb에 결합한다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 대상물에 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것으로서, 다중화 도메인에 차례로 직접 결합된 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 각각 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 모노머들을 포함하는 유효량의 클러스터 스트라도머를 대상물에 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 FcγRIIIa에 결합한다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 FcγRIIb에 결합한다. 추가의 구체예에서, 면역반응의 조절방법은 미성숙 수지상 세포들 상에서 CD86을 유도하는 단계를 포함한다.

추가의 구체예에서, 면역반응의 조절방법은 항체 생성 감소에 의한 특정 기억 B 세포들의 선택적 세포자멸사와 연관되어 있다. 추가의 구체예에서, 상기 조절방법은 항체 생성 감소에 의한 활성화 기억 B 세포들의 선택적 세포자멸사와 연관되어 있다. 다른 구체예에서, 면역 조절방법은 항체의존성 세포의 세포독성을 증가시키는 NK 세포들의 조절방법일 수 있다. 또다른 구체예에서, 면역반응의 조절은 CD8베타 및 CD11c를 발현하는 세포군집들을 증가시킬 수 있다. 또다른 구체예에서, 면역 조절은 IL-6 및 IL-8과 같은 자가면역 질병이 통상적으로 증가된 사이토카인 또는 프로염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 면역 조절은 NKT 세포들을 활성화시키고, TGF-베타를 분비 및 분열시킨다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 필요 대상물에 있어서 염증성 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 다중화 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 각각 포함하거나, 또는 선택적으로, IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 다중화 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛을 포함하는 유효량의 스트라도머를 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 염증성 질병은 자가면역 질병이다. 또다른 구체예에서, 자가면역 질병은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 특발성 혈소판감소성 자반증, 자가면역 빈혈, 만성 염증성 다발신경병증, 경피증, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 자가면역 포도막염, ANCA 양성 혈관염, 셀리악병, 천포창, 피부다발성 근육염, 굿파스츄어 증후군(Goodpasture's disease), 중증근무력증, 그레이브스병, 가와사키병, 겸상적혈구 발증 및 아토피 피부염으로 구성된 그룹에서 선택된다. 추가의 구체예에서, 자가면역 질병은 공여자로부터 수용자로 기관을 이식하는 것과 관련되어 있다. 또다른 구체예에서, 자가면역 질병은 자가면역 질병으로서 전형적으로 특징화되지 않은 질병이지만, 면역계의 세포들은 알츠하이머 질병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 골감소증 및 골다공증과 같은 중요한 역할을 한다.

추가의 구체예에서, 스트라도머는 정맥내, 피하로(subcutaneously), 경구로, 코로, 복강내, 설하로, 구강으로, 경피로(transdermally), 피하(subcutaneous) 또는 피하(subdermal) 이식 또는 근육내로 투여된다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 정맥내로 투여된다. 본 발명의 스트라도머들의 개선된 효능때문에, 일부 구체예에서, 스트라도머는 전임 분자(predecessor molecule) 및/또는 IVIG에 비해, 정맥내로 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.01mg/Kg 내지 약 1000mg/Kg IV의 투여량으로 정맥내 투여된다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.1mg/Kg 내지 약 100mg/Kg IV로 투여된다. 또다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.5mg/Kg 내지 약 50mg/Kg IV로 투여된다. 또다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 1mg/Kg 내지 약 25mg/Kg IV로 투여된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 5mg/Kg 내지 약 15mg/Kg IV로 투여된다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 피하로 투여된다. 본 발명의 스트라도머의 개선된 효능때문에, 일부 구체예에서, 스트라도머는 전임 분자 및/또는 IVIG에 비해, 피하내로 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.01mg/Kg 내지 약 1000mg/Kg SQ의 투여량으로 피하 투여된다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.2mg/Kg 내지 약 150mg/Kg SQ로 투여된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.5mg/Kg 내지 약 80mg/Kg SQ로 투여된다. 또다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 2mg/Kg 내지 약 50mg/Kg SQ로 투여된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 5mg/Kg 내지 약 30mg/Kg SQ로 투여된다.

한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 투여되어서, 이식형 장치에 공유적으로 고정된다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 봉합선에 고정된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 이식편 또는 스텐트에 고정된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 심장 밸브, 관절치환부 또는 이식된 전자 리드에 고정된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 이식형 매트릭스내에 고정되고, 심어진다. 바람직한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 이식형 하이드로겔내에 고정되고, 심어진다. 한 구체예에서, 하이드로겔은 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 소듐 폴리아크릴레이트, 또는 아크릴레이트 폴리머들로 구성된다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 투여되어, 고정된 클러스터 스트라도머와 상호작용한후 다시 복귀하여 재순환하도록 면역세포들이 들어가기에 충분히 큰 공극크기를 갖는 하이드로겔에 고정된다. 추가의 구체예에서, 하이드로겔의 공극크기는 5 내지 50마이크론이다. 바람직한 구체예에서, 하이드로겔의 공극크기는 25 내지 30마이크론이다.

추가의 구체예에서, 스트라도머는 하나 이상의 추가의 약제학적 제제 및/또는 치료제를 투여하기 이전, 도중 또는 이후에 투여된다. 추가의 구체예에서, 추가의 약제학적 활성제는 스테로이드; 모노클론 항체, 융합단백질, 또는 항-사이토킨과 같은 생물학적 항-자가면역 약물; 비-생물학적 항-자가면역 약물; 면역억제제; 항생제; 및 항-바이러스제; 사이토킨; 또는 면역-조절제로서 작용할 수 있는 제제를 포함한다. 추가의 구체예에서, 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 코르티손, 덱사메타손, 모메테손, 테스토스테론, 에스트로겐, 옥산드롤론, 플루티카손, 부데소니드, 베클라메타손, 알부테롤, 또는 레발부테롤이다. 추가의 구체예에서, 모노클론 항체는 인플릭시맵, 아달리무맵, 리툭시맵, 토실리주맵, 골리무맵, 오파투무맵, LY2127399, 벨리무맵, 벨투주맵 또는 세르톨리주맵이다. 추가의 구체예에서, 융합 단백질은 에타너셉트 또는 아바타셉트이다. 또다른 구체예에서, 항-사이토킨 생물제는 아나킨라이다. 또다른 구체예에서, 항-류마티즘 비-생물 약물은 사이클로포파마이드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 하이드록시클로로퀸, 레플루노마이드, 마이노사이클린, 유기 금 화합물, 포스타마티닙, 토파시티닙, 에토리콕시브 또는 설파살라진이다. 추가의 구체예에서, 면역억제제는 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 시로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 에베로리무스, OKT3, 항흉선세포 글로불린, 배실릭시맵, 다클리주무맵, 또는 알렘투주맵이다. 또다른 구체예에서, 스트라도머는 항암제를 투여하기 이전, 도중 또는 이후에 투여된다. 또다른 구체예에서, 스트라도머 및 추가의 치료제는 함께 투여될때 치료적 시너지 효과를 나타낸다. 한 구체예에서, 스트라도머는 추가의 치료제를 투여하기 전에 투여된다. 다른 구체예에서, 스트라도머는 추가의 치료제를 투여함과 동시에 투여된다. 또다른 구체예에서, 스트라도머는 추가의 치료제를 투여한 후에 투여된다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 필요 대상물의 전염병을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 다중화 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 선도 서열을 각각 포함하거나, 또는 선택적으로 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 다중화 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛을 포함하는 유효량의 클러스터 스트라도머를 투여하는 단계를 포함한다. 또다른 구체예에서, 전염병은 세균성 전염이다. 다른 구체예에서, 전염병은 바이러스성 전염이다. 추가의 구체예에서, 전염병은 세균성 또는 바이러스성 염증이다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 정맥내, 피하로, 경구로, 복강내, 설하, 구강으로, 경피로, 피하로 또는 피하이식 또는 근육내로 투여된다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 정맥내로 투여된다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 정맥내로 투여된다. 한 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.01mg/Kg 내지 약 1000mg/Kg의 투여량으로 투여된다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.1mg/Kg 내지 약 100mg/Kg의 투여량으로 투여된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 0.5mg/Kg 내지 약 50mg/Kg의 투여량으로 투여된다. 또다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 1mg/Kg 내지 약 25mg/Kg의 투여량으로 투여된다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 약 5mg/Kg 내지 약 15mg/Kg의 투여량으로 투여된다.

다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 종-특이적 또는 키메릭 스트라도머 분자들을 갖는, 인간, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 비비, 및 침팬지), 마우스, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 흰담비, 게르빌루스쥐, 기니아 피그, 햄스터, 박쥐, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 및 오리), 어류 및 파충류를 치료하기 위해 투여된다. 또다른 구체예에서, 인간은 성인 또는 어린이이다. 다른 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 자가면역 질병을 예방하기 위해 투여된다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 반려동물들 및 가축의 백신-관련 자가면역 질환들을 예방하기 위해 투여된다.

또다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 각각 포함하거나, 또는 선택적으로 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 다중화 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛들을 포함하는 유효량의 클러스터 스트라도머를 포함하는 조성물과 함께 표적 조직 또는 표적 세포들을 포함하는 시험관내 또는 생체외 분석법으로 상체들의 비-특이적 결합을 차단하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 항체들은 모노클론 항체이다. 다른 구체예에서, 항체들은 폴리클론 항체들이다. 한 구체예에서, 시험관내 또는 생체외 분석법은 면역조직화학법, 유세포분석법, 웨스턴 블롯 또는 면역형광 분석법이다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 표적 조직 또는 세포들의 종류에 대하여 종-특이적이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 각각 포함하거나, 또는 선택적으로 IgG1 Fc 도메인에 차례로 직접 결합되는 다중화 도메인에 직접 결합된 선도 서열을 포함하는 적어도 2개의 스트라도머 유닛들을 포함하는 유효량의 클러스터 스트라도머에 의해 조성물내 내독소 수준들을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 클러스터 스트라도머는 조성물내 내독소와 함께 복합된다. 또다른 구체예에서, 본 방법은 조성물로부터 스트라도머-복합-내독소를 제거하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 스트라도머-복합-내독소는 조성물로부터 여과에 의해 제거된다. 한 구체예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다.

한 구체예에서, 본 발명은 다중화 도메인에 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합된 선도 서열 또는 IgG1 Fc 도메인에 직접 결합되는 다중화 도메인에 직접 결합한 선도 서열을 포함하는 스트라도머 유닛을 발현하는 단계를 포함하는 클러스터 스트라도머의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 다중화 도메인은 형질감염된 세포로부터 스트라도머 유닛의 멀티머들을 생성하며, 상기 방법은 서열번호: 4, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 18의 스트라도머들을 발현 벡터로 코드화하는 DNA 서열을 클로닝하는 단계, 발현 벡터를 박테리아 숙주로 형질감염시키는 단계, 서열번호: 4, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 18의 스트라도머를 코드화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 DNA를 박테리아 배양액으로부터 분리하는 단계, 서열번호: 4, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 18의 스트라도머를 코드화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 DNA를 선형화하는 단계, 상기 선형화 DNA를 포유류 세포로 형질감염시키는 단계, 양성 형질감염된 세포들을 확장시켜서, 안정하게 횡단된 세포들의 풀을 얻는 단계, 배지로부터 스트라도머 단백질을 수확하는 단계, 및 스트라도머 단백질을 정제하는 단계를 포함하며, 스트라도머 단백질은 외래 서열을 함유하지 않는다. 한 구체예에서, 발현 벡터는 선택가능성 마커를 함유한다. 추가의 구체예에서, 선별마커는 항생 내성 유전자이다. 추가의 구체예에서, 항생 내성 유전자는 네오마이신 내성 유전자이다. 한 구체예에서, 포유류 세포들은 CHO 세포들, HEK293 세포들, PER.C6 세포들, CAP 세포들 또는 단백질 제조에 사용되는 다른 상업용으로 관련된 포유류 세포들이다. 한 구체예에서, 스트라도머 단백질은 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된다. 추가의 구체예에서, 단백질은 겔 여과에 의해 추가로 정제된다. 추가의 구체예에서, 단백질은 이온-교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다. 추가의 구체예에서, 단백질은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 스트라도머의 모식도이다. 도 1a는 G045c 스트라도머의 모식도이며; 도 1b는 G045old 스트라도머의 모식도이며; 도 1c는 G046 스트라도머의 모식도이며; 도 1d는 G019 스트라도머의 모식도이며; 도 1e는 G028 스트라도머의 모식도이며; 도 1f는 G051 스트라도머의 모식도이며; 도 1g는 G089 스트라도머의 모식도이며; 및 도 1h는 G096 스트라도머의 모식도이다.
도 2 a)는 제1 세대 스트라도머 화합물들과 본 발명의 직접 자연결합된 스트라도머 화합물 사이의 다중화 용량의 차이를 보여주는 단백질 겔이며, b)는 제1 세대 스트라도머 화합물들과 본 발명의 직접 자연결합된 스트라도머 화합물들 사이의 멀티머/모노머 형성 사이의 비교이다.
도 3은 외래 서열들을 함유하는 종래의 스트라도머 화합물(M045old)의 효과와 대조되는, 본 발명의 직접 자연결합된 스트라도머(M045c)가 콜라겐 유도 관절염의 심각성에 미치는 큰 효과를 나타낸다.
도 4는 프레드니솔론을 투여할때, 본 발명의 직접 자연결합된 스트라도머 화합물들이 콜라겐-유도 관절염에서 상승효과를 나타낸다.
도 5는 IgG2a 대조군과 비교하여, FcγRIIIa, FcγRIIb 및 SIGN-R1에 대한 본 발명의 M046, M045, M019 및 M028 화합물들의 개선된 결합 친화도를 나타낸다.
도 6은 (a)FcγRIIb 및 FcγRIIIa 및 (b)SIGN-R1에 대한 본 발명의 화합물의 개선된 결합 친화도를 나타낸다. M045 F1은 스트라도머의 고분자량 멀티머 프랙션인 반면, M045 F2는 스트라도머의 저분자량 멀티머 프랙션이다. M045 F3은 스트라도머의 호모다이머 프랙션이다.
도 7은 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP)의 심각성에 직접 자연결합된 스트라도머 M045c가 미치는 효과를 나타낸다.
도 8은 IgG1 Fc 대조군과 관련하여, FcγR들에 대한 항-FcγR 항체들의 결합을 스트라도머가 보다 효과적으로 차단함을 보여준다.
도 9는 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델의 심각성에 자연 결합된 스트라도머 M045c, M019, M028, M046 및 M051이 미치는 효과를 나타낸다.
도 10a는 FcγRIIIa에 대한 G075 스트라도머의 증가된 결합 및 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 G075 스트라도머의 감소된 결합을 나타낸다. b는 FcγRIIIa 및 FcγRIIb에 대한 G076 스트라도머의 증가된 결합 친화도 및 FcγRIIa에 대한 G076 스트라도머의 감소된 결합을 나타낸다.
도 11은 (a)쥐(EAN)에서 실험적 자가면역 신경염과 관련된 중량손실; (b)EAN 쥐에서 임상점수; (c)EAN 쥐에서 힙 진폭; (d)EAN 쥐에서 발목 진폭; 및 (e)EAN 쥐에서 운동신경 전도속도에 IVIg 및 알부민 대조군들과 비교하여 M051이 미치는 효과를 나타낸다.
도 12는 (a)쥐(EAN)에서 실험적 자가면역 신경염과 관련된 중량손실; (b)EAN 쥐에서 임상점수; (c)EAN 쥐에서 힙 진폭; (d)EAN 쥐에서 발목 진폭; 및 (e)EAN 쥐에서 운동신경 전도속도에 IVIg 및 알부민 대조군들과 비교하여 M045c가 미치는 효과를 나타낸다.
도 13은 부형제 대조군 및 M045c 양성 대조군과 대조되는, 본 발명의 M076(A) 자연결합된 스트라도머를 제외한, M075(A), M096(B) 및 M098(C)이 콜라겐 유도 관절염의 심각성에 미치는 큰 효과를 나타낸다.

본 명세서에 개시된 hIVIG 치환 화합물들을 위한 합리적인 분자 디자인에 대한 접근법은 상기 목적을 달성하기 위한 종래의 분자들보다 다중화 및 결과적으로 Fc 감마 수용체들에 대한 결합력이 보다 효과적인 면역학적으로 활성인 생체모방체(들)의 재조합 및/또는 생화학적 생성을 포함한다. 치환 화합물은 예를 들어, 자가면역 질병들, 염증 질병들, 암, 및 염증을 치료하기 위한 유용성을 가진다. 천연 면역글로불린과 관련하여 Fc 감마 수용체에 대한 우수한 결합 친화도때문에, 조성물들은 또한, 약제학적 및 실험용 조성물들로부터 항체-기반 면역분석 및 내독소 제거시에 Fc 차단제로서 유용성을 가진다. 각 구체예는 특정 예시적 구체예에 따라 이하에 상세히 설명된다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, "a" 또는 "an"은 본 발명의 특허청구범위 및/또는 상세한 설명에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, "하나"를 의미하지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "생체모방", "생체모방 분자", "생체모방 화합물" 및 관련 용어들은 풀링된 hIVIG, 모노클론 항체 또는 항체의 Fc 단편과 같은 다른 화합물의 기능을 모방하는 인조 화합물을 의미한다. "생물학적으로 활성인" 생체모방물들은 이들의 자연발생 대응물들과 동일하거나 또는 유사한 생물학적 활성들을 갖는 화합물들을 의미한다. "자연발생"은 생물체내에서 정상적으로 발견되는 분자 또는 그의 일부를 의미한다. 자연발생이라는 용어는 또한 실질적으로 자연적으로 발생하는 것을 의미한다. "면역학적으로 활성인" 생체모방물은 항체, 당 분야에 공지되어 있는 항체들, 사이토카인, 인터류킨 및 다른 면역분자들과 같은 자연발생 면역활성분자들과 동일하거나 또는 유사한 면역활성을 나타내는 생체모방물이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 생체모방물은 이하에 정의된 바와 같이, 스트라도머이다.

"직접 결합되는"이라는 용어는 예를 들어, 제한효소 인식부위 또는 클로닝 단편들과 같이, 간섭 또는 외부서열들 없이 서로 연결된 2개의 서열들을 의미한다. 당업자라면, "직접 결합되는"이라는 용어가 다중화 용량이 실질적으로 영향을 받지 않는한 아미노산의 추가 또는 제거를 포함하여 의미함을 이해할 것이다.

"상동한"이라는 용어는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 서열에 대하여 동일함을 의미한다. 예를 들어, "80% 상동한"이라는 것은 주어진 서열이 청구된 서열과 약 80% 아이덴티티(identity)을 공유하며, 삽입, 결실, 치환 및 프레임 쉬프트를 포함할 수 있다. 당업자라면, 서열 정렬이 서열의 전체 길이에 대한 아이덴티티를 측정하기 위한 삽입 및 결실을 고려하여 수행될 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 면역학적으로 활성인 생체모방물들은 IgG1 Fc 도메인의 하나 이상의 면역조절활성들을 갖도록 디자인되며, 적어도 (i)FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 및/또는, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV를 포함하는 FcγR을 결합할 수 있는 제1 Fc 도메인, 및 (ii)FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 및/또는, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV를 포함하는 FcγR을 결합할 수 있는 제2 Fc 도메인을 가진다. 특별히, 본 발명의 면역학적으로 활성인 화합물들은 호모다이머의 멀티머들이다. 각 호모다이머는 FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 및/또는 FcγR에 결합할 수 있는 능력을 갖는 가진다. 따라서, 다중화될때, 면역학적으로 활성인 생체모방물들은 적어도 2개의 호모다이머들을 함유하며, 각각은 FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 및/또는 FcγR에 결합할 수 있는 능력을 가진다.

이하 단락에서는, 본 발명의 생체모방물들의 구성요소들을 구조적으로 및 기능적으로 정의하며, 그후 생체모방물들 자체를 정의한다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 생체모방물들 각각은 적어도 2개의 Fc 도메인들을 가지고 있음을 주목하는 것이 제일 먼저 도움이 된다. 최소한도로, Fc 도메인은 기능적 Fcγ 수용체 결합부위를 형성하기 위해 연합하는 2개의 펩타이드 사슬 또는 아암들(모노머들)을 포함하는 다이머 폴리펩타이드(또는 큰 폴리펩타이드의 다이머 부분)이다. 그러므로, 본 명세서에서 설명된 각 단편들 및 도메인들의 기능적인 형태는 일반적으로 다이머(또는 멀티머) 형태로 존재한다. 본 명세서에서 설명된 각 단편들 및 도메인들의 모노머들은 기능적인 다이머 구조를 형성하기 위해 제2 사슬 또는 아암과 연합해야 하는 단일 사슬 또는 아암들이다.

Fc 단편

"Fc 단편"은 면역글로불린의 카복시 말단에서 규칙적으로 발견되는 단백질 부분 또는 단백질 접힘구조를 설명하기 위해 사용되는 당 분야의 용어이다. Fc 단편은 미완성의 불완전한 공정인 파파인 소화와 같은 효소적 소화를 사용하여, 모노클론 항체의 Fab 단편으로부터 분리될 수 있다(Mihaesco C and Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 43 1 - 453 (1968) 참조). (항원결합 도메인을 함유하는) Fab 단편과 결합하여, Fc 단편은 완전한 항체를 의미하는 홀로-항체를 구성한다. Fc 단편은 항체 중쇄들의 카복시 말단부들로 구성된다. Fc 단편내 사슬들 각각은 길이가 약 220-265개의 아미노산들이며, 사슬들은 디설파이드 결합을 통해 종종 결합된다. Fc 단편은 종종 하나 이상의 독립적 구조적 접힘 또는 기능적 서브도메인들을 함유한다. 특히, Fc 단편은 Fc 도메인을 포함하며, 본 명세서에서 Fcγ 수용체를 결합시키는 최소 구조로서 정의된다. 분리된 Fc 단편은 다이머화되는 2개의 Fc 단편 모노머들(예를 들면, 항체 중쇄들의 2개의 카복시 말단부들; 이하에 추가로 정의됨)을 포함한다. 2개의 Fc 단편 모노머들이 연합할때, 얻어진 Fc 단편은 Fcγ 수용체 결합활성을 가진다.

Fc 부분 단편

"Fc 부분 단편"은 항체의 전체 미만의 Fc 단편을 포함하는 도메인이며, Fcγ 수용체 결합활성을 포함하는, Fc 단편과 동일한 활성을 갖기에 충분한 구조를 유지한다. 그러므로, Fc 부분 단편은 Fc 부분 도메인이 유도되는 항체의 이소타입에 따라, 힌지 부분의 부분 또는 전체, CH2 도메인의 부분 또는 전체, CH3 도메인의 부분 또는 전체 및/또는 CH4 도메인의 부분 또는 전체가 없을 수 있다. Fc 부분 단편의 예로는 IgG3의 상부, 중심 및 하부 힌지 부분 플러스 CH2 도메인을 포함하는 분자를 포함한다(Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT and Morrison, SL, Influence of the hinge region on complement activation, Clq binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA. 1990 January; 87(1): 162-166). 따라서, 본 실시예에서, Fc 부분 단편은 IgG3의 Fc 단편내에 존재하는 CH3 도메인이 없다. Fc 부분 단편의 다른 실시예는 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인들을 포함하는 분자를 포함한다. 본 실시예에서, Fc 부분 단편은 IgG1내에 존재하는 힌지 도메인이 없다. Fc 부분 단편들은 2개의 부분 Fc 단편 모노머들을 포함한다. 본 명세서에서 추가로 정의된 바와 같이, 2개의 상기 Fc 부분 단편 모노머들이 연합했을때, 얻은 Fc 부분 단편은 Fcγ 수용체 결합활성을 가진다.

Fc 도메인

본 명세서에서 사용된 것으로서, "Fc 도메인"은 Fc 수용체(FcR)에 결합하거나 또는 결합될 수 있는 최소 부분(큰 폴리펩타이드의 문맥에서) 또는 최소 단백질 접힘구조(분리된 단백질의 문맥에서)를 의미한다. Fc 단편과 Fc 부분단편 모두에 있어서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 분자를 결합시키는 최소 결합 부분이다. Fc 도메인이 Fc 수용체에 의해 결합되는 별개의 폴리펩타이드로 제한될 수 있는 반면, Fc 도메인이 Fc 부분 단편의 일부 또는 전체 뿐만 아니라 Fc 단편의 일부 또는 전체가 될 수 있음은 분명할 것이다. 용어 "Fc 도메인"이 본 발명에서 사용되는 경우, 당업자라면 1개 이상의 Fc 도메인을 의미함을 알 것이다. Fc 도메인은 2개의 Fc 도메인 모노머들을 포함한다. 본 명세서에서 추가로 정의되는 바와 같이, 상기 2개의 Fc 도메인 모노머들이 연합할때, 얻어진 Fc 도메인은 Fc 수용체 결합활성을 가진다. 따라서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 결합할 수 있는 다이머 구조이다.

Fc 부분 도메인

본 명세서에서 사용된 것으로서, "Fc 부분 도메인"은 Fc 도메인의 일부를 의미한다. Fc 부분 도메인은 개개의 중쇄 불변 도메인들(예를 들어, CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인) 및 다른 면역글로불린 부류 및 서브부류들의 힌지 부분들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간 Fc 부분 도메인들은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 CH1 도메인들, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 CH2 도메인들, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 CH3 도메인들, IgM 및 IgE의 CH4 도메인들 및, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 힌지 도메인들을 포함한다. 다른 종에서 대응하는 Fc 부분 도메인들은 그의 종류내에 존재하는 면역글로불린 및 그의 명명에 따라 다를 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 Fc 부분 도메인들은 IgG1의 CH1, CH2 및 힌지 도메인들 및 IgG2의 힌지 도메인을 포함한다. 본 발명의 Fc 부분 도메인은 이들 도메인들 및 힌지들 중 하나 이상의 조합을 추가로 포함한다. 그러나, 본 발명의 각 Fc 부분 도메인들 및 이들의 조합은 FcγR에 결합할 수 있는 능력이 없다. 그러므로, Fc 부분 도메인들 및 이들의 조합은 Fc 도메인을 거의 포함하지 않는다. Fc 부분 도메인들은 함께 결합하여, Fcγ 수용체 결합능력을 갖는 펩타이드를 형성하여, Fc 도메인을 형성한다. 본 발명에서, Fc 부분 도메인들은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 본 발명의 생체모방물들을 생성하기 위한 구성요소로서 Fc 도메인들과 함께 사용된다. 각 Fc 부분 도메인은 2개의 Fc 부분 도메인 모노머를 포함한다. 상기 2개의 Fc 부분 도메인 모노머들이 연합할때, Fc 부분 도메인이 형성된다.

상기 설명한 바와 같이, Fc 단편들, Fc 부분 단편들, Fc 도메인들 및 Fc 부분 도메인들 각각은 다이머 단백질 또는 도메인들이다. 따라서, 상기 분자들중 각각은 다이머 단백질 또는 도메인을 형성하기 위해 연합하는 2개의 모노머들로 구성된다. 호모다이머 형태의 특성 및 활성이 위에 설명되어 있는 반면, 모노머 펩타이드들은 아래에 설명된다.

Fc 단편 모노머

본 명세서에 사용된 것으로서, "Fc 단편 모노머"는 다른 Fc 단편 모노머와 연합할때 Fc 단편을 포함하는 단일쇄 단백질이다. 따라서, Fc 단편 모노머는 홀로-항체의 Fc 단편을 형성하는 항체 중쇄들 중 하나의 카복시 말단부(예를 들어, IgG의 힌지 부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄의 연속부분)이다. 한 구체예에서, Fc 단편 모노머는 힌지 부분의 한 사슬(힌지 모노머), CH2 도메인의 한 사슬(CH2 도메인 모노머) 및 CH3 도메인의 한 사슬(CH3 도메인 모노머)를 최소로 포함하여, 연속결합되어 펩타이드를 형성한다. 다른 구체예에서, Fc 단편 모노머는 힌지 부분의 한 사슬, CH2 도메인의 한 사슬, CH3 도메인의 한 사슬 및 CH4 도메인의 한 사슬(CH4 도메인 모노머)를 적어도 포함하여, 연속결합되어 펩타이드를 형성한다. 한 구체예에서, CH2, CH3 및 힌지 도메인들은 다른 아이소타입들로부터 유래된다. 특정 구체예에서, Fc 단편 모노머는 IgG2 힌지 도메인 및 IgG1 CH2 및 CH3 도메인들을 함유한다.

Fc 도메인 모노머

본 명세서에 사용된 것으로서, "Fc 도메인 모노머"는 다른 Fc 도메인 모노머와 연합할때, Fcγ 수용체에 결합될 수 있는 Fc 도메인을 포함하는 측쇄 단백질을 의미한다. 두 Fc 도메인 모노머들의 연합은 1개의 Fc 도메인을 형성한다. Fc 도메인의 1개의 측기만 포함하는 Fc 도메인 모노머는 단독으로 Fcγ 수용체와 결합할 수 없다. 본 발명의 Fc 도메인 모노머들은 이미 설명된 Fc 도메인 모노머들과 같이 외래 서열들을 포함하지 않는다(예를 들어, WO2008/151088, 도 17 및 18 참조). 대신, 본 발명의 Fc 도메인 모노머들(서열번호: 2)은 한 말단(예를 들어, Fc 모노머의 N-말단) 상에서 선도서열(서열번호: 1)에, 및 다른 말단(예를 들어, Fc 모노머의 C 말단) 상에서 다중화 도메인(서열번호: 3)에 직접 결합된다. 서열번호: 4의 얻어진 스트라도머 모노머는 G045c로 칭한다. 다른 구체예에서, Fc 도메인 모노머는 IgG2 힌지 도메인을 포함하며, IgG1 CH2 및 CH3 도메인들은 N-말단 상에서 선도서열(서열번호: 1)에 직접 결합된다. 서열번호: 18의 얻어진 스트라도머 모노머는 G051로 칭한다. 선택적으로, 다중화 도메인(서열번호: 3)은 Fc 도메인 모노머(서열번호: 2)의 아미노 말단에 위치될 수 있다. 서열번호: 8의 얻어진 스트라도머 모노머는 G019로 칭한다. 선택적으로, 다중화 도메인은 서열번호: 3 대신에 서열번호: 5를 포함할 수 있으며, Fc 도메인 모노머의 카복시 말단에 위치되어, 서열번호: 10을 얻을 수 있거나, 또는 Fc 도메인 모노머의 아미노 말단에 위치되어, 서열번호: 9를 얻을 수 있다. 이러한 스트라도머들은 본 명세서에서 각각 G046 및 G028로 칭한다.

Fc 부분 도메인 모노머

본 명세서에 사용된 것으로서, "Fc 부분 도메인 모노머"는 다른 Fc 부분 도메인 모노머와 연합될때, Fc 부분 도메인을 포함하는 측쇄 단백질을 의미한다. 2개의 Fc 부분 도메인을 연합하면, 1개의 Fc 부분 도메인이 생성된다.

스트라도머

특정 구체예에서, 본 발명의 생체모방물들은 스트라도머들을 포함한다. 스트라도머들은 2개 이상의 Fc 수용체들, 바람직하게는 2개 이상의 Fcγ 수용체들을 결합할 수 있는 생체모방 화합물이며, 및 보다 바람직하게는 Fc 도메인에 대하여 매우 개선된 결합력을 증명하며, 및 가장 바람직하게는 애비더티(avidity)의 느린 해리특성을 증명한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 스트라도머는 NK 세포들 및 미성숙 수지상세포들과 같은 효과인자 세포들 및 다른 단핵구-유도 세포들 상에서 FcRN, DC-SIGN, SIGN-R1 및/또는 Fcγ 수용체들을 결합시키는데 사용된다. 한 구체예에서, Fcγ 수용체들은 저친화도 Fcγ 수용체들이다. 스트라도머는 4개의 다른 물리적 형태들을 가질 수 있다: 시리얼, 클러스터, 코어 또는 Fc 단편. 본 발명의 스트라도머는 바람직하게 클러스터 스트라도머이다. 입증될 것으로서, 상기 설명된 Fc 단편, Fc 부분 단편들, Fc 도메인 및 Fc 부분 도메인들은 여러 스트라도머 형태들의 구조에 사용된다. 그리고, 본 발명의 스트라도머인 다이머 구조들을 형성하는 것은, 먼저 제조된후, 자가-연합되는 각각의 Fc 도메인 모노머들 및 Fc 부분 도메인 모노머들이다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, "스트라도머 다이머"는 2개의 스트라도머 모노머들만으로 조성된 특정 형태의 스트라도머이다. 한 구체예에서, 스트라도머 다이머들은 관련 스트라도머 모노머들의 자가-연합에 의해 형성된 분자들이다. 다른 구체예에서, 스트라도머 다이머내 스트라도머 모노머들은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 스트라도머 모노머간 결합을 통해 물리적으로 결합된다. "멀티머 스트라도머"는 본 명세서에서 정의된 스트라도머 모노머의 자가-응집 또는 스트라도머 모노머간 결합을 통해 형성된 3개 이상의 스트라도머들로 구성된다.

스트라도머 모노머

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "스트라도머 모노머" 또는 "스트라도머 유닛"은 적어도 제2 스트라도머 모노머와 연합될때 적어도 2개의 Fc 도메인들을 포함하는 폴리펩타이드를 형성하는 단일의, 연속 펩타이드 분자를 의미한다. 바람직한 구현예에서 클러스터 스트라도머가 2개의 연합된 스트라도머 모노머들을 포함하는 반면, 클러스터 스트라도머는 3개 이상의 스트라도머 모노머들을 함유할 수도 있다. 스트라도머 모노머들은 스트라도머 모노머간 결합에 의해 스트라도머를 형성하기 위해 연합되거나, 또는 자가-응집을 통해 스트라도머를 형성할 수 있다.

스트라도머 모노머는 다른 스트라도머 모노머와 연합될때 스트라도머를 형성하기 위해, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 그 이상의 Fc 도메인들을 형성할 아미노산 서열을 가질 수 있다. 스트라도머 모노머는 다른 스트라도머 모노머와 연합될때 스트라도머를 형성하기 위해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 그 이상의 Fc 부분 도메인들을 형성할 아미노산 서열을 추가로 가질 수 있다.

스트라도머 단락에서 Fc 도메인들 및 Fc 부분 도메인들을 형성할 스트라도머 모노머들의 부분들은 스트라도머 모노머 분자의 연속 부분 중 카복시 말단으로부터 아미노 말단까지 간단하게 배열될 수 있다. 스트라도머 모노머를 포함하는 특정 Fc 도메인 모노머들 및 Fc 부분 도메인 모노머들의 배열은 중요하지 않다. 그러나, 상기 배열에 의해, 2개의 스트라도머 모노머들을 연합할때 2개의 기능적 Fc 도메인들이 형성되어야 한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 스트라도머는 서열번호: 4의 G045c 스트라도머, 서열번호: 10의 G046 스트라도머 또는 서열번호: 27의 G089 스트라도머 각각을 형성하기 위해, IgG1 Fc 모노머(서열번호: 2)의 N-말단 및 선도 펩타이드(서열번호: 1)의 C 말단 및 IgG1 Fc(서열번호: 2)의 C 말단 및 다중화 도메인 IgG2 힌지(서열번호: 3)의 N 말단 또는 아이소류신 지퍼(서열번호: 5) 또는 GPP 도메인(서열번호: 26) 사이의 직접 결합을 함유한다(표 1). 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 스트라도머는 서열번호: 8의 G019 스트라도머, 서열번호: 9의 G028 스트라도머 또는 서열번호: 28의 G096 스트라도머 각각을 형성하기 위한, 선도펩타이드(서열번호: 1)의 C 말단 및 다중화 도메인 IgG2 힌지(서열번호: 3), 아이소류신 지퍼(서열번호: 5) 또는 GPP 도메인(서열번호: 26)의 N-말단 사이의 직접 결합, 서열번호: 8의 G019 스트라도머, 서열번호: 9의 G028 스트라도머 또는 서열번호: 28의 G096 스트라도머를 각각 형성하기 위해(표 1), 다중화 도메인(서열번호: 3, 5 또는 26)의 C 말단 및 IgG1 Fc의 N 말단 사이의 직접 결합, 또는 서열번호: 18의 G051 스트라도머를 형성하기 위한, 선도 펩타이드(서열번호: 1)와 다중화 도메인(서열번호: 3)의 N 말단 사이의 직접 결합, 및 다중화 도메인(서열번호: 3)의 C 말단과, IgG1의 CH2 및 CH3 부분들을 함유하는 IgG1 Fc 부분 도메인의 N 말단 사이의 직접 결합을 함유한다(표 1).

스트라도머	서열
G045c (서열번호: 4)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKERKCCVECPPCP
G019 (서열번호: 8)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGERKCCVECPPCPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
G028 (서열번호: 9)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGGSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
G046 (서열번호: 10)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERG
G051 (서열번호: 18)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
G075 (서열번호: 20)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKERKCCVECPPCP.
G076 (서열번호: 21)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYAVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKERKCCVECPPCP.
G096 (서열번호: 28)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
G098 (서열번호: 24)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN A TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP
G089 (서열번호: 27)	METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP

분명한 실시예로서, 당업자들은 본 발명의 스트라도머 분자들이, 포인트 돌연변이를 선택하면서 또는 선택하지 않으면서, 최소 2개의 Fc 도메인 모노머들을 형성할 조합을 제외하고는, Fc 도메인 모노머들과 Fc 부분 도메인 모노머들의 다양한 조합들을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조함으로써 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 상기 폴리뉴클레오타이드 분자, 예를 들어 서열번호: 4, 8, 9, 10 또는 18의 스트라도머들을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드들은 발현 벡터로 삽입되어, 세균 군집을 형질전환시키거나, 또는 포유류 세포들 군집을 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 그후, 스트라도머 모노머들은 적당한 배양조건하에 형질전환된 세균 또는 형질감염된 포유류 세포들을 배양함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 안정적으로 형질감염된 세포들의 풀을 연속하는 클론 세포주는 제네티신/G418을 갖는 세포들을 선택함으로써 달성될 수 있다. 선택적으로, CMV 프로모터의 조절하에, 본 발명의 스트라도머를 코드화하는 DNA, 즉 G045c (서열번호: 4), G019 (서열번호: 8), G028 (서열번호: 9) G046 (서열번호: 10) 또는 G051 (서열번호: 18)에 의해 세포들이 순간적으로 형질감염될 수 있다. 그후, 발현된 스트라도머 모노머들은 스트라도머 모노머들을 자가-연합하거나 또는 내부-스트라도머 모노머 결합들을 사용하여 스트라도머 모노머들을 연합할때 추가의 스트라도머들을 형성할 수 있다. 그후, 발현된 스트라도머들은 예를 들면 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼들을 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양배지로부터 정제될 수 있다. 본 발명은 동일한 아미노산 서열들을 갖는 스트라도머 모노머들, 실질적으로 유사한 아미노산 서열들을 갖는 스트라도머 모노머들, 또는 같지 않은 서열들을 갖는 스트라도머 모노머들의 연합을 통해 형성된 스트라도머들을 모두 포함한다. 이후의 구체예에서, 스트라도머를 포함하는 스트라도머 모노머들의 아미노산 서열은 2개 이상의 기능적 FcγR 결합 부위들이 형성된 상기 유사성만 필요로 한다.

놀랍게도, IgG2 힌지 다중화 도메인(서열번호: 3)에 그의 말단을 통해 차례로 직접 결합되는 IgG1 Fc(서열번호: 2)의 N 말단에 직접 결합되는 선도서열(서열번호: 1)의 청구된 서열들을 함유하는 본 발명의 방법들에 의해 제조된 G045c(서열번호: 4)는 서열번호: 6 및 7에서 나타낸 바와 같이, IgG1 Fc 모노머내 제한 부위들과 같은, 기능적으로 중요하다고 예전에 생각되지 않은 외래 서열들을 함유하는 전임 분자들에 의해 관찰된 것보다 높은 차원의 멀티머를 형성시킨다. 실제로, 얻은 G045c 스트라도머 제조물의 거의 74%가 멀티머들을 함유하는 반면, 조성물의 약 26%만 모노머들을 함유한다. 이는 외래 서열들을 갖는 분자들을 함유하는 제조물과 대조적이다. 이들 제조물들은 약 27% 멀티머들만 함유하며, 조성물의 72%는 모노머로서 존재한다. 그리고, 서열번호: 4의 스트라도머 모노머들에 의해 제조된 고차원 멀티머들은 이미 설명된 스트라도머들을 함유하는 오래된 외래 서열과 비교하여 놀랍도록 우수한 효능을 가졌다. 그러므로, 본 발명의 한 구체예에서, 다중화 도메인은 스트라도머 유닛들의 고차원 멀티머들을 생성한다. 추가의 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 35%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 또다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 55%가 스트라도머 유닛의 멀티머들을 함유한다. 다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 65%는 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 또다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 70%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다. 다른 구체예에서, 얻은 스트라도머 조성물의 적어도 약 75%가 스트라도머 유닛들의 멀티머들을 함유한다.

상기 설명한 바와 같이, Fc 도메인은 FcRn, DC-SIGN, SIGN-R1 및/또는 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 그의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. 본 발명의 화합물들은 IgG2a 대조군들보다 매우 높은 친화도를 갖는, FcγRIIIa, FcγRIIb 및/또는 SIGN-R1을 포함한 동족 수용체들에 결합한다(도 5 및 6). 결과적으로, Fc 도메인의 특정 아미노산 서열은 Fc 도메인을 포함하는 Fc 부분 도메인들에 기초하여 다양할 것이다. 그러나, 본 발명의 한 구체예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 부분 및 CH2 도메인을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 구체예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 부분, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 부분, CH2 도메인 및 CH4 도메인을 포함한다. 또다른 구체예에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유한다(서열번호: 2). 다른 바람직한 구체예에서, Fc 도메인은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인들을 함유한다(서열번호: 19).

스트라도머 모노머간 결합

본 발명의 생체모방 화합물내에서 발견된 별도의 결합은 본 발명의 스트라도머들을 포함하는 2개 이상의 각 스트라도머 모노머들 사이에서 일어나는 "스트라도머 모노머간 결합"이다. 도메인 결합은 생체모방 화합물들의 각 스트라도머 모노머들을 포함하는 Fc 도메인 모노머들 및 부분 Fc 도메인 모노머들을 서로 결합하는 짧은 아미노산 서열들인 반면, 스트라도머 모노머간 결합은 생체모방 화합물들을 포함하는 2개 이상의 각 스트라도머 모노머들을 결합시킨다. 스트라도머 모노머간 결합은 각 스트라도머 모노머들을 안정적으로 연합시킬 수 있는 결합이다. 일부 구체예에서, 스트라도머 모노머간 결합은 스트라도머 모노머들 사이의 공유결합일 수 있다. 선택적으로, 스트라도머 모노머들 사이의 스트라도머 모노머간 결합은 직접적인 화학적 가교에 의한 것이다. 바람직한 구체예에서, 스트라도머 모노머 구조들은 Fc 도메인 모노머들 사이의 천연 자가-응집 특성들의 잇점을 가져서, 자가-응집 스트라도머들을 생성한다. 상기 구체예에서, 자가-응집은 본래 정상적으로 발견되는 공유 디설파이드 결합연결없이 발생한다. 이론에 구애받지 않으면서, 온전한 IgG1은 예를 들어, 힌지 부분내에 2개의 시스테인 결합들을 가지는 반면(Dorai H. Role of inter-heavy and light chain disulfide bonds in the effector functions of human immunoglobulin IgG1. Molecular Immunology. 29;12, 1992,1487-1491; Meulenbroek AJ and Zeijlemaker WP. Human IgG Subclasses: Useful diagnostic markers for immunocompetence. ISBN 90-5267-011-0), G045의 IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3 도메인들은 모노머간 결합들이 없음을 입증하며; G045에서 모든 모노머간 결합들은 IgG2 힌지 도메인의 C-말단에서 일어난다. 다른 상기 구체예에서, 디설파이드 결합들은 스트라도머들을 형성하기 위한 각 스트라도머 모노머들 사이에서 형성한다. 디설파이드 결합들은 천연 Fc 도메인 모노머 서열내에서 발생하는 시스테인 잔기들 또는 부위-방향 돌연변이생성에 의해 Fc 도메인 모노머로 통합되는 시스테인 잔기들을 사용하여, 생체모방 분자들을 포함하는 Fc 도메인 모노머들의 시스테인 잔기들 사이에서 형성한다. 상기 천연 자가-응집 성질들은 또한, 스트라도머 멀티머들내 각 스트라도머 모노머들 사이에서 스트라도머 모노머간 결합들을 형성하는데 사용될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 스트라도머 모노머간 결합을 형성하는 시스테인 잔기들은 G045의 성숙 단백질의 IgG2 힌지 도메인의 위치 236, 237, 240, 및 243에 있다. 바람직한 구체예에서, 스트라도머 모노머간 결합을 형성하는 시스테인 잔기들은 G051의 성숙 단백질의 IgG2 힌지 도메인의 위치 4, 5, 8 및 11에 있다. 대안의 구체예는 부위-방향 돌연변이생성을 통해, 각 스트라도머 모노머들을 포함하는 아미노산 서열로 도입되는 시스테인 잔기들 사이에서 디설파이드 결합이 형성하는 스트라도머 모노머간 결합을 포함한다.

위에서 설명한 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 스트라도머를 형성하는 스트라도머 모노머간 결합은 스트라도머 모노머들의 자가-응집으로부터 얻어지는 결합이다. 한 구체예에서, 스트라도머를 포함하는 2개의 스트라도머 모노머들은 스트라도머를 포함하는 2개의 각 스트라도머 모노머들이 서열상 동일하도록 하는, 동일한 펩타이드이다. 그러나, 당업자는 다른 구체예들이 아미노산 서열에 있어서 스트라도머 모노머들이 서로 상이한 스트라도머들을 포함할 것이라고 이해할 것이다.

스트라도머 모노머들내 동일한 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에서 페어링(pairing)이 일어나도록 평행으로 정렬함으로써 2개의 스트라도머 모노머들을 스트라도머를 형성할 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한, 동일하지 않은 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에서 페어링이 일어나는 구체예들, 및 2개의 스트라도머 모노머들의 정렬이 상쇄되는 경우를 제외하고는, 스트라도머 모노머들내에서 동일한 Fc 부분 도메인 모노머들 사이에서 페어링이 일어나는 구체예들을 포함한다.

클러스터 스트라도머

"클러스터 스트라도머"는 중앙 성분 "헤드" 및 2개 이상의 "레그"와 함께 라디알 형태를 갖는 생체모방물이며, 각 레그는 2개 이상의 Fc 감마 수용체들을 결합시킬 수 있는 생체모방물을 형성하는, 적어도 하나의 Fc 감마 수용체를 결합시킬 수 있는 1개 이상의 Fc 도메인들을 포함한다. 각 클러스터 스트라도머는 소위 "클러스터 스트라도머 유닛"이라고 불리우는 1개 이상의 다이머 단백질로 구성된다. 각 클러스터 스트라도머 유닛은 적어도 하나의 기능성 Fc 도메인을 포함하는 "레그" 부분 및 다중화하는 부분으로 구성된다. 다중화 부분은 다른 클러스터 스트라도머 유닛과 함께 한번 다중화된 클러스터 스트라도머 "헤드"를 형성한다. 레그 부분은 각 레그 부분내 Fc 도메인들이 있는 만큼 많은 Fcγ 수용체들을 결합시킬 수 있다. 따라서, 클러스터 스트라도머는 결합 친화도 및 애비더티를 증가시키는 2개의 Fcγ 수용체들을 결합시킬 수 있는 생체모방 화합물이다.

다중화 부분은 다이머 단백질들을 추가로 다중화시키는 펩타이드 서열이거나, 또는 다중화 부분은 다이머 단백질들의 다중화를 개선시키는 글리코실화될 수 있다. 펩타이드 다중화 부분들의 예로는 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 아이소류신 지퍼, 콜라겐 글리신-프롤라인-프롤라인 반복("GPP") 및 아연 핑거들이 포함된다. 펩타이드 다중화에 글리코실화가 미치는 영향은 당 분야에 잘 설명되어 있다(예를 들면, Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams and Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 80, No. 9, [Part 1 : Biological Sciences] (May 1, 1983), pp. 2771-277 '4; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka and Haruko Ogawa. International Congress Series Volume 1223, December 2001, Pages 97-101).

다중화 부분은 펩타이드들을 다이머시키거나 다중화시키고, IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 아이소류신 지퍼, 콜라겐 GPP 및 아연 핑거를 포함하는 펩타이드 서열이다. 당 분야에 알려져 있는 바와 같이, 인간 IgG2의 힌지 부분은 공유 다이머들을 형성할 수 있다(Yoo, E.M. et al. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). IgG2의 다이머 형성은 C-C 결합들에 의해 IgG2 힌지 구조를 통해 잠재적으로 매개되며(Yoo et al 2003), 이는 힌지 구조가 다이머 형성을 단독으로 매개할 수 있음을 보여준다. 그러나, 인간 혈청에서 밝혀진 IgG2 다이머의 양은 제한된다. 호모다이머의 다이머로서 존재하는 IgG2의 양은 총 IgG2의 10% 미만인 것으로 추정된다(Yoo et al. 2003). 그리고, 호모다이머의 다이머외 IgG2의 다중화 도메인의 정량적인 증거는 없다(Yoo et al. 2003). 즉, 천연 IgG2는 인간 혈청내 고차원 멀티머들을 형성하는 것으로 밝혀지지 않았다. 그러므로, 여기에 나타낸 결과들은 IgG2 힌지-함유 스트라도머들(즉, G045c, G019 및 G051)이 고차원 멀티머들로 존재하고, IgG2 힌지 상호작용이 가변적이고, 동적인 인간혈청내 천연 IgG2와 달리, G045c는 37℃의 100% 습도에서 분석적 초원심분리 및 3개월 안정성 연구에 의해, 비-환원 SDS-PAGE에서 입증된 매우 안정한 멀티머들을 형성하는 것으로 증명되었다는 점에서 특히 놀라운 것이다. 그리고, IgG2 힌지-함유 스트라도머 제조물내 멀티머들의 양이 인간혈청내 IgG2에 대하여 관찰된 10%보다 매우 높다. 예를 들어, G045c 제조물내 호모다이머의 다이머들을 포함하는 멀티머들의 양은 대략 67%이다.

인간 IgG2 힌지 모노머의 아미노산 서열은 다음과 같다: ERKCCVECPPCP (서열번호: 3). 서열번호: 3에서 4개의 시스테인들 중 하나의 돌연변이는 스트라도머의 크게 감소된 다중화와 관련되어 있다. IgG2 힌지 모노머의 2개의 C-X-X-C 부분들이 있다. 따라서, 본 발명의 스트라도머 모노머들은 IgG2 힌지 모노머의 완전한 12개의 아미노산 서열, 또는 Fc 도메인 모노머들을 따라 4개의 아미노산 코어들 중 일부 또는 모두를 포함한다. 코어 구조들의 X-X가 아미노산일 수 있는 반면, 바람직한 구체예에서, X-X 서열은 V-E 또는 P-P이다. 당업자는 IgG2 힌지 모노머가 코어 4개의 아미노산 구조에 더해 힌지 서열의 모든 부분으로 포함될 수 있으며, IgG2 힌지 서열의 모두 또는 IgG2 CH2 및 CH3 도메인 모노머 서열들의 일부 또는 모두를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 이론에 구애받지 않으면서, IgG2 힌지 다중화 도메인은 스트라도머 모노머의 일부와 상호반응함으로써 멀티머들을 형성할 수 있다. 즉, 한 스트라도머 모노머의 IgG2 힌지는 다른 스트라도머 모노머의 IgG2 힌지와 결합하여, 호모다이머의 다이머를 형성하거나, 또는 천연 IgG1 Fc에 대하여 Fc 수용체에 증가된 기능적 결합력을 유지하면서 고차원 멀티머들을 형성한다. 선택적으로, 한 스트라도머 모노머의 IgG2 힌지 도메인은 다른 스트라도머 모노머의 IgG1 힌지와 결합함으로써, 호모다이머의 다이머를 형성하거나, 또는 IgG1 Fc에 대하여 Fc 수용체에 증가된 기능적 결합을 유지하면서 고차원 멀티머들을 형성한다. 한 스트라도머 모노머의 IgG2 힌지 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 다른 일부, 즉 다른 스트라도머 모노머의 CH2 또는 CH3 도메인과 결합하여, 호모다이머의 다이머를 형성하거나, 또는 천연 IgG1 Fc에 대하여 Fc 수용체에 증가된 기능적 결합을 유지하면서 고차원 멀티머들을 형성할 수도 있다.

류신 및 아이소류신 지퍼는 다중화 부분으로서 사용될 수도 있다. 류신 및 아이소류신 지퍼들(꼬인-코일 도메인들)은 단백질 다이머, 트라이머 및 테트라머의 형성을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다(Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993); O'Shea et al. Science 243 :538 (1989)). 트라이머를 형성하기 위한 아이소류신 지퍼의 자연적인 경향의 잇점을 취함으로써, 클러스터 스트라도머가 생성될 수 있다.

당업자는 다른 타입의 류신 및 아이소류신 지퍼들이 사용될 수 있음을 이해할 반면, 다른 구체예에서, 설명된 대로 변형된 GCN4 전사 조절자(Morris et al., MoI. Immunol. 44:3112-3121 (2007); Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993))가 사용된다: GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGG (서열번호:5). 이 아이소류신 지퍼 서열은 Fc 도메인 모노머들의 다중화에 사용될 수 있는 여러 가능한 서열들 중 하나이다. 서열번호: 5에 나타낸 전체 서열이 사용될 수 있는 반면, 서열의 밑줄친 부분은 본 발명의 클러스터 스트라도머에 사용될 수 있는 아이소류신 지퍼의 코어 서열을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 스트라도머 모노머들은 아이소류신 지퍼의 완전한 아미노산 서열 또는 하나 이상의 Fc 도메인 모노머들을 따라 28개의 아미노산 코어를 포함할 수 있다. 당업자는, 또한 아이소류신 지퍼는 코어 28개의 아미노산 구조에 더해 지퍼의 부분으로 구성되며, 따라서 전체 서열보다 적지만 28개 이상의 아미노산들로 구성된다.

GPP는 콜라겐 단백질: 단백질 결합을 일으키는 인간 콜라겐에서 발견되는 아미노산 서열이다. 당업자는 다른 종류의 GPP 반복체들이 다중화 도메인으로서 사용될 수 있음을 이해할 반면, 바람직한 구체예에서, 설명된(Fan et al FASEB Journal 3796 vol 22 2008) 대로 글리신-프롤린-프롤린 반복체가 사용된다:(서열번호: 26). 이러한 글리신-프롤린-프롤린 반복 서열은 Fc 도메인 모노머들의 다중화를 위해 사용될 수 있는 여러 가능한 서열들 중 하나일 뿐이다. 서열번호: 26에 나타낸 전체 서열들이 사용될 수 있는 반면, 다른 길이의 반복체들도 또한 Fc 도메인 모노머들을 다중화하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, GPP 반복체내에 다른 아미노산들을 함유하는 반복체들도 또한 치환될 수 있다.

본 명세서에 개시된 스트라도머들 및 다른 생체모방 분자들은 다양한 종류들로부터 유도될 수 있음을 이해하고 있다. 대신, 본 발명의 한 생체모방 분자내 Fc 도메인 또는 Fc 부분 도메인들은 1개 이상의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상의) 종류들로부터의 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 그러나, 이들은 통상적으로 단일 종류로부터 유도될 것이다. 그리고, 본 명세서에 개시된 방법들 중 하나(예를 들면, 치료방법들)가 특정 종류에 적용될 수 있음이 인정될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 종류에 적용되는 생체모방물의 성분들은 특정 종류로부터 모두 유도될 것이다. 그러나, 모든 성분들이 다른 종류의 성분이거나, 1개 이상의 종류(관련 방법이 적용되는 종류들을 포함하거나, 또는 포함하지 않음)로부터의 성분인 생체모방물도 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 스트라도머 및 다른 생체모방물의 Fc 도메인 및 Fc 부분 도메인들을 포함하는 특정 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인들 및 힌지 부분들은 이들이 유도된 유기체 뿐만 아니라 면역글로불린 서브부류의 관점에서 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 스트라도머 또는 다른 생체모방물들은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA1, IgD, IgE, 및 IgM, 마우스 IgG2a 또는 개 IgA 또는 IgB와 같은 다양한 면역글로불린 타입들로부터 독립적으로 오는 Fc 도메인 및 부분 Fc 도메인들을 포함한다. 바람직하게는, 인간 치료제용으로, 본 발명의 Fc 도메인들은 인간 IgG1 이소타입을 가진다. 이와 유사하게, 각 Fc 도메인 및 부분 Fc 도메인은 다양한 종류들, 바람직하게는 비-인간 영장류들(예를 들어, 원숭이, 비비 및 침팬지), 인간, 쥣과, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 흰담비, 게르빌루스쥐, 기니피그, 햄스터, 박쥐를 포함하는 포유류 종류, 새(예를 들어, 닭, 칠면조 및 오리), 어류 및 파충류로부터 유도되어, 종-특이적 또는 키메릭 스트라도머 분자들을 생성한다.

각 Fc 도메인들 및 부분 Fc 도메인들도 또한 인간화될 수 있다. 당업자는 다른 Fc 도메인들 및 부분 Fc 도메인들이 다른 종류의 관능기들을 제공할 것이라는 것을 알 것이다. 예를 들어, FcγR들은 IgG 면역글로불린들에 특이적으로 결합하며, 다른 종류의 면역글로불린들에는 잘 결합되지 않는다. 따라서, 다중 Fcγ 수용체 결합 능력을 갖는 스트라도머를 디자인하고자 하는 당업자는 하부 IgG 힌지 부분 및/또는 IgG CH2 & CH3 도메인들내 도메인들을 포함하는, IgG의 잘 특징화된 Fcγ 수용체 결합 서열을 적어도 통합하는 스트라도머 Fc 도메인들을 디자인한다. 당업자는 또한, 다양한 유해한 결과들은 여러 IgA 투입과 관련된 아나필락시스와 같은, 특정 Ig 도메인들의 사용과 관련될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 개시된 생체모방물들은 일반적으로, 특정 상황에서 상기 효과들이 바람직하더라도, 상기 효과를 피하도록 디자인되어야 한다.

본 발명은 Fc 도메인 또는 Fc 부분 도메인의 자연발생 아미노산 서열과 상이한 아미노산을 갖는 Fc 도메인 및 Fc 부분 도메인들을 포함하는 스트라도머도 또한 포함한다. 본 발명의 생체모방 화합물에 포함시키기 위한 바람직한 Fc 도메인들은 FcγR의 가용성 세포외 도메인 부분 또는 홀로-Fcγ 수용체에 측정가능한 특정 결합친화도를 가진다. 많은 Fc 도메인들 및 Fc 도메인 모노머들의 1차 아미노산 서열 및 X-선 결정학 구조들은 당 분야에서 사용가능하다. 예를 들어, Woof JM, Burton DR. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. 2004 Feb;4(2):89-99를 참조한다. Fcγ 수용체 결합능력을 갖는 대표적인 Fc 도메인들은 인간 IgG1(서열번호: 2)로부터의 Fc 도메인들을 포함한다. 이러한 천연서열들은 기능 서열들의 부위 방향 돌연변이생성 맵핑을 포함하는 광범위 구조-기능 분석에 적용되었다. 이러한 종래 구조-기능 연구 및 사용가능한 결정학 데이터에 기초하여, 당 분야의 기술을 가진 자는 Fc 도메인의 FcγR 수용체 결합 능력을 보존하면서 기능적 Fc 도메인 서열 변이체들을 디자인할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기들은 모노머들 사이의 설파이드 결합력을 개선시키기 위해 첨가될 수 있거나, 또는 스트라도머 호모다이머들 사이의 상호반응을 변경시키기 위해 결실될 수 있다.

아미노산 변화는 Fc 도메인의 서열 전체적으로 발견될 수 있거나, 또는 Fc 도메인을 포함하는 특정 Fc 부분 도메인들로 분리될 수 있다. 본 발명의 스트라도머 또는 다른 생체모방물들에 사용되는 Fc 도메인의 기능적인 변이체들은 천연 Fc 도메인과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 가질 것이다. 이와 유사하게, 본 발명의 스트라도머 및 다른 생체모방물들에 사용되는 Fc 부분 도메인들의 기능적인 변이체들은 천연 Fc 부분 도메인과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 가질 것이다.

당업자는 본 발명의 Fc 단편 모노머들, Fc 부분 단편 모노머들, 스트라도머 모노머들 및 다른 모노머들의 구조시에 Fc 도메인 모노머들의 기능적인 변이체들을 사용하는 것을 본 발명이 추가로 포함함을 알 것이다. Fc 도메인 모노머들의 기능적인 변이체들은 천연 Fc 도메인 모노머 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 가질 것이다.

이와 유사하게, 본 발명은 본 발명의 Fc 단편 모노머들, Fc 부분 단편 모노머들, Fc 도메인 모노머들, 스트라도머 모노머들 및 다른 모노머들의 구조시에 Fc 도메인 모노머들의 기능적인 변이체들을 사용하는 것을 포함한다. Fc 부분 도메인 모노머들의 기능적인 변이체들은 천연 Fc 부분 도메인 모노머 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 가질 것이다.

아미노산 변화는 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 감소, 증가 또는 불변시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노산 변화들은 보전적 아미노산 치환일 것이며, 그러나 상기 변화들은 결실, 부가 및 다른 치환들을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 하기 그룹들내에서의 변화를 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신 및 류신; 아스파트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신. 또한, 아미노산 변화는 예를 들어, 시스테인 잔기들의 부가에 의해 다중화 강도를 개선시킬 수 있다.

아미노산 변화는 Fc 도메인 다형성을 일으키는 자연발생 아미노산 변화이거나, 아미노산 변화는 부위방향 돌연변이생성에 의해 도입된다. 아미노산 변화는 Fc 도메인이 그의 수용체 결합기능 및 생물학적 활성을 보유하는한 Fc 도메인내 어디에서나 일어날 수 있다. 바람직한 구체예에서, 다형성 또는 돌연변이는 개선된 수용체 결합 및/또는 개선된 다중화 또는 생물학적 기능을 일으킨다. 다형성/돌연변이는 바람직하게는 EU index as in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 따른 하나 이상의 아미노산 위치 233-435에서 일어난다. 상기 아미노산 위치내 특이적 다형성/돌연변이는 당 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Shields, et al. (2001) "High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FγRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR," J. Biol. Chem., 276(9):6591-6601에서 발견할 수 있으며, 이의 내용은 참고로 전문통합된다.

바람직한 구체예에서, 다형성/돌연변이는 IgG1 Fc의 위치 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 280, 285, 286, 288, 290, 293, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 315, 317, 322, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 337, 338, 339, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 392, 414, 415, 424, 430, 433, 434, 435, 및/또는 436의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 함유한다. 추가의 구체예에서, 다형성/돌연변이는 IgG1 Fc의 위치 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 280, 285, 286, 288, 290, 293, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 315, 317, 322, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 337, 338, 339, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 392, 414, 415, 424, 430, 433, 434, 435, 및/또는 436의 둘 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 함유한다. 또다른 구체예에서, 다형성/돌연변이는 IgG1 Fc의 위치 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 280, 285, 286, 288, 290, 293, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 315, 317, 322, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 337, 338, 339, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 392, 414, 415, 424, 430, 433, 434, 435, 및/또는 436의 셋 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 함유한다. 추가의 구체예에서, 다형성/돌연변이는 IgG1 Fc의 위치 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 280, 285, 286, 288, 290, 293, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 315, 317, 322, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 337, 338, 339, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 392, 414, 415, 424, 430, 433, 434, 435, 및/또는 436의 셋 이상의 아미노산 치환들을 함유한다.

본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "기능적 변이체"는 (폴리펩타이드일 경우) 참고서열과 동일한 생물학적 효과들을 매개할 수 있거나, 또는 (폴리뉴클레오타이드일 경우) 참고서열에 의해 코드화되는 폴리펩타이드와 같은 생물학적 효과를 매개할 수 있는 폴리펩타이드를 코드화하는 참고서열에 상동성으로 연관된 서열을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 설명된 생체모방물들의 기능적인 변이체는 특정 상동성 또는 동일성을 가지며, 단핵구 또는 DC들의 면역을 조절할 수 있다. 기능적인 서열변이체는 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드를 모두 포함한다. 서열 상동성은 디폴트 파라미터들: 필터-온, 스코어링 매트릭스-BLOSUM62, Word 사이즈 -3, E 값 - 10, 갭 코스트 - 11, 1 및 정렬 -50에 의해 동작하는 BLAST 2.0(Basic Local Alignment Search Tool)을 사용하여 평가된다.

상기로부터, 본 발명의 스트라도머들은 (a)자연발생 Fc 도메인들만; (b)변형된 아미노산 서열들을 갖는 Fc 도메인들과 자연발생 Fc 도메인들의 혼합물; 및 (c)변형된 아미노산 서열들을 갖는 Fc 도메인들만을 갖는 스트라도머들을 포함함을 알 수 있을 것이다. 필요한 모든 것은 둘 또는 그 이상의 FcγR 수용체들에 결합할 수 있는, 자연-발생 서열들과 함께 Fc 도메인들을 포함하는 대응 스트라도머의 능력의 적어도 25%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 또는 그 이상을 가지는 것이다.

본 발명의 스트라도머내에서 발생하는 상기 Fcγ 수용체 결합 부위들은 천연 서열에 대하여 변경된 결합 능력 및 친화도를 갖는 결합 부위들을 예측가능하게 유도하기 위한 유전적 조작을 통해 서열변형될 수 있다. 예를 들면, 특정 잔기들은 변형되어, FcγRIIIa에 대한 결합력을 증가시키면서 FcγRIIb에 대한 생체모방 화합물들의 Fc 도메인 결합력을 감소시킨다. hlgG Fcγ 수용체 결합 서열을 위한 구조-기능 분석에 기초한 광범위한 돌연변이생성의 예는 Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for FcgRI, FcgRII, FcgRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the FcgR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604이다. 유사 연구는 쥣과 IgG Fc(mIgG Fc) 상에서 수행되었다. 종에 걸쳐 천연 IgG Fc 도메인들의 구조적 및 1차서열 상동성에 기초하여, 당업자는 특정 Fcγ 수용체 특이성 및 결합 친화도를 갖는 결합 부위들을 디자인하기 위해, 인간 IgG Fc 및 마우스 IgG Fc의 광범위한 구조-기능 지식을 본 발명의 생체모방 화합물들내 모든 천연 Fcγ 수용체 결합 부위 서열들의 합리적인 돌연변이생성으로 해독할 수 있다.

천연 Fc 도메인들의 아미노산 서열 조성에 더해, Fc 도메인의 탄수화물 함량은 Fc 도메인 구조 및 FcγR과의 결합 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcgRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., JuI 2002; 277: 26733 - 26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright and Sherie L. Morrison. Effect of C2-Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgGl Antibodies in Glycosylation Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells. J. Immunol, Apr 1998; 160: 3393 - 3402를 참조한다. 탄수화물 함량은 특정 세포주들을 포함하는 특정 단백질 발현시스템 또는 시험관내 효소적 변형을 사용하여 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명은 변경된 탄수화물 함량을 갖는 생체모방 화합물들 뿐만 아니라 도메인이 얻어지는 홀로-항체의 천연 탄수화물 함량을 갖는 Fc 도메인들을 포함하는 스트라도머들을 포함한다. 다른 구체예에서, 스트라도머의 멀티머 성분들은 같은 스트라도머의 호모다이머 성분과 비교하여, 다른 글리코실화 패턴에 의해 특징화된다. 바람직한 구체예에서, 스트라도머는 Fc 수용체 결합을 개선시키는 글리코실화 패턴을 포함하는 멀티머를 강화시킨다.

Fc 부분 도메인을 폴리펩티드 사슬에 첨가하는 것, 다중화 부분, 또는 글리코실화 변화들은 Fcγ 수용체에 대하여 Fc 도메인의 결합을 개선시키는 Fc 도메인내 형태변화를 일으킬 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드에 대하여 외견상으로 매우 작은 변화들도 또한, 다중 Fcγ 수용체들을 결합시킬 수 있는 능력이 감소된 스트라도머 또는 다중 Fcγ 수용체들의 결합을 개선시킬 수 있는 스트라도머를 생성할 수 있다.

부분 도메인 및 부분 단편

당업자는 본 발명의 구현예에서 사용된 Fc 도메인들 및 Fc 부분 도메인들이 전장 버전(full-length version)이 될 필요가 없음을 또한 알 것이다. 즉, 본 발명은 본 발명의 스트라도머 및 다른 생체모방물들을 포함하는 Fc 부분 도메인 모노머들 및 특정 Fc 도메인 모노머들의 아미노말단, 카복시말단 또는 중간으로부터 아미노산들이 누락된 Fc 도메인 모노머들 및 Fc 부분 도메인 모노머들의 용도를 포함한다.

예를 들면, Fcγ 수용체들에 대한 인간 IgG 면역글로불린 위의 결합부위는 문헌에 설명되어 있다(예를 들면, Radaev, S., Sun, P., 2001. Recognition of Immunoglobulins by Fcg Receptors. Molecular Immunology 38, 1073 - 1083; Shields, R.L. et. al., 2001. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for FcgRI, FcgRII, FcgRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the FcgR. J. Biol. Chem. 276 (9), 6591-6604). 이러한 지식에 기초하면, 상기 면역글로불린들의 Fc 도메인들로부터 아미노산을 제거할 수 있고, Fc 도메인과 수용체 사이의 결합 상호작용에 미치는 효과들을 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Radaev, S., Sun, P., 2001에 정의된 바와 같이, 저 힌지 및 CH2의 위치 233 내지 338을 포함하는 아미노산의 적어도 약 90%를 갖는 IgG Fc 도메인들을 포함한다.

본 발명의 IgG 면역글로불린의 Fc 부분 도메인들은 힌지 부분의 모두 또는 일부, CH2 도메인의 모두 또는 일부, 및 CH3 도메인의 모두 또는 일부를 포함한다.

힌지 부분의 일부, CH2 도메인의 일부, 및 CH3 도메인의 일부만 포함하는 IgG Fc 부분 도메인은 Fc 부분 도메인 모노머들로부터 구조된다. 따라서, 본 발명은 힌지 부분의 N-말단 또는 힌지 부분의 C-말단으로부터 유도된 IgG 힌지 부분 모노머들을 포함한다. 따라서, 이들은 예를 들어, 힌지 부분의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 또는 62개(IgG1에 대하여 15개 이하, IgG2에 대하여 12개 이하, IgG3에 대하여 62개 이하, IgG4에 대하여 12개 이하)의 아미노산들을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, CH2 도메인의 N-말단 또는 CH2 도메인의 C-말단으로부터 유도된 IgG CH2 도메인 모노머들을 포함한다. 따라서, 이들은 예를 들어, CH2 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110개(IgG1 및 IgG3에 대하여 110개 이하, IgG2 및 IgG4에 대하여 109개 이하)의 아미노산들을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, CH3 도메인의 N-말단 또는 CH3 도메인의 C-말단으로부터 유도된 IgG CH3 도메인 모노머들을 추가로 포함한다. 따라서, 이들은 예를 들어, CH3 도메인의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107개(IgG1 및 IgG3에 대하여 106개 이하, IgG2 및 IgG4에 대하여 107개 이하)의 아미노산들을 함유할 수 있다.

위의 내용으로부터, 본 발명의 다른 구체예들이 (a)전장 Fc 도메인들; (b)전장 Fc 도메인과 Fc 부분 도메인들의 혼합물; 및 (c)Fc 부분 도메인들을 함유하는 스트라도머들을 포함함이 분명해질 것이다. 각 구체예들에서, 스트라도머들은 CH1 도메인들을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 설명한 바와 같이, 본 발명의 스트라도머의 각 구체예에서, 스트라도머들은 2개 이상의 Fcγ 수용체들을 결합할 수 있는 능력을 가진다.

스트라도머 및 스트라도머 모노머들의 바람직한 구현예들

본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "FcγR" 및 "Fcγ 수용체"는 Nimmerjahn F and Ravetch JV. Fcg receptors: old friends and new family members. Immunity. 2006 Jan; 24(1): 19-28에 설명한 바와 같이, 면역세포 표면상에서 발현된 단백질의 Fc 감마 수용체 패닐리의 각 멤버를 포함하거나, 또는 이후에 정의될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "FcγR"은 Fc 감마 RI, RII 및 RIII 패밀리들의 모든 멤버들을 포함한다. Fcγ 수용체는 저친화도 및 고친화도 Fcγ 수용체들을 포함하며, 인간에 있어서 FcγRI (CD64); FcγRII (CD32) 및 그의 이소타입들 및 알로타입들 FcγRIIa LR, FcγRIIa HR, FcγRIIb, 및 FcγRIIc; FcγRIII (CD 16) 및 그의 이소타입들 FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 FcγR에 결합하는 화합물들을 포함하고, 및 Davis, et al. (2004) "Differential B cell expression of mouse Fc receptor homologs," Int. Immunol., 16(9):1343-1353에 설명된 바와 같은 FcγR 상동체들은 아직 밝혀지지 않은 미래의 FcγR들 및 관련 이소타입들 및 알로타입들에 적용할 것임을 인지할 것이다.

hIVIG가 신생 Fc 수용체("FcRn")에 결합하여 완전히 포화시키고, 상기 FcRn의 경쟁적 억제가 hIVIG의 생물학적 활성에 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 설명되어 있다(예를 들면, Mechanisms of Intravenous Immunoglobulin Action in Immune Thrombocytopenic Purpura. F. Jin, J. Balthasar. Human Immunology, 2005, Volume 66, Issue 4, Pages 403-410). Fcγ 수용체들에 강하게 결합하는 면역글로불린은 FcRn에 적어도 어느 정도 결합하기 때문에, 당업자는 1개 이상의 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 스트라도머들이 FcRn에 또한 결합하고, 완전히 포화시킬 것임을 알 것이다.

본 명세서에서 사용된 "FcγRx에 특이적으로 결합할 수 있는"이라는 용어는 FcγRIII와 같은 FcγR에 결합하는 것을 의미한다. 특이적인 결합은 일반적으로 결합 분석에서 이후 과량의 표식되지 않은 리간드에 의해 치환가능한 표식 리간드의 양으로 정의된다. 그러나, 이는 당 분야에 잘 공지되어 있는 특이적인 결합을 평가하는 다른 수단들을 배제하지 않는다(예를 들어, Mendel CM, Mendel DB, 'Non-specific' binding. The problem, and a solution. Biochem J. 1985 May 15;228(l):269-72 참조). 특이적인 결합은 면역학적으로 활서인 생체모방물들의 연합 및 해리 상수들을 모두 특징화하는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(BIACORE®를 통해 상업용으로 시판됨) 또는 바이오층 간섭계(ForteBio®를 통해 상업용으로 시판됨)와 같은 당 분야에 잘 알려져 있는 여러 방법들로 측정될 수 있다(Asian K, Lakowicz JR, Geddes C. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensin g approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:538-544).

"응집된 천연 IgG의 면역학적 활성"은 IgG 응집체들에 면역시스템을 노출시킬때 면역시스템의 기능에 영향을 미치는 다중화 IgG의 특성들을 의미한다. 천연 다중화 IgG의 특별한 특성들로는 FcγR들에 대한 변경된 특이적인 결합, 면역세포들의 표면상에서 FcγR들의 가교, 또는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식균작용(ADCP) 또는 보체결합과 같은 다중화 IgG의 이펙터(effector) 기능성이 포함된다(예를 들면, Nimmerjahn F, Ravetch JV. The anti-inflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 2007; 204:11-15; Augener W, Friedman B, Brittinger G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut. 1985;50:249-252; Arase N, Arase H, Park SY, Ohno H, Ra C, Saito T. Association with FcRgamma is essential for activation signal through NKR-Pl (CD161) in natural killer (NK) cells and NKl.1+ T cells. J Exp Med. 1997;186:1957-1963; Teeling JL, Jansen- Hendriks T, Kuijpers TW, et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood. 2001;98: 1095- 1099; Anderson CF, Mosser DM. Cutting edge: biasing immune responses by directing antigen to macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 2002; 168:3697-3701; Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for FcgR: current models. Immunology Letters. 2002;82:57; Banki Z, Kacani L, Mullauer B, et al. Cross-Linking of CD32 Induces Maturation of Human Monocyte - Derived Dendritic Cells Via NF- {kappa} B Signaling Pathway. J Immunol. 2003;170:3963-3970; Siragam V, Brine D, Crow AR, Song S, Freedman J, Lazarus AH. Can antibodies with specificity for soluble antigens mimic the therapeutic effects of intravenous IgG in the treatment of autoimmune disease? J Clin Invest. 2005;l 15:155- 160 참조). 이러한 특성들은 일반적으로 호모다이머 IgG의 특성들과 비교함으로써 평가된다.

본 명세서에 사용된 것으로서, "복수의 자연발생, 응집된 IgG 면역글로불린들의 이펙터 기능성 또는 Fcγ 수용체 가교와 비교가능하거나 또는 우수하다"는 것은 hIVIG의 유사한 투여량 또는 농도를 사용하여 얻어진 약 70% 또는 그 이상의 Fcγ 수용체 가교분석값을 스트라도머가 발생시킨다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 분석값은 hIVIG를 사용하여 얻어진 분석값들의 표준오차범위내에 적어도 있다. 다른 구체예에서, 분석값은 같은 투여량에서 hIVIG의 분석값보다 110% 또는 그 이상이다. Fcγ 가교를 위한 분석법은 당 분야에 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려져 있다(예를 들면, Nimmerjahn and Ravetch, (2008) Fcγ receptors as regulators of immune responses," Nature Reviews Immunology, 8:34-47 참조).

고차원 멀티머들이 면역반응을 조절하는데 효과적인 것으로 밝혀진 반면, 본 발명자들은 호모다이머들도 또한 효과적인 면역 조절제라는 것을 알아내었다. 이론에 구애받지 않으면서, 호모다이머들이 생체내에서 고차원 멀티머들을 형성할 수 있다고 믿는다. 본 발명자들은 다중화 실험들을 통해, 순수한 호모다이머군이 낮은 수준의 혈액 또는 태아기 소혈청의 존재하에 다중화할 수 있음을 알아내었다. 그러므로, 고차원 멀티머들이 면역반응을 조절하는데 있어서 호모다이머 프랙션보다 더 효과적인 반면, 본 발명의 자연결합 스트라도머들의 호모다이머 프랙션도 또한 낮은 수준의 혈액 또는 혈청의 존재하에 호모다이머의 다중화를 통해 부분적으로 효과적인 면역 조절제가 될 수도 있다. 그러므로, "고차원 멀티머들"에 의해, 본 발명자들은 생체내에서 형성된 호모다이머외에 멀티머 뿐만 아니라 대상물로 주사하기 전에 용액내에서 형성되는 호모다이머외의 멀티머들을 의미한다.

"면역조절 활성", "조절면역반응", "면역시스템을 조절" 및 "면역 조절"은 세포타입내에서 세포타입을 성숙시키거나, 또는 다른 세포타입들로 성숙시키는 것을 포함하는, 하나 또는 그 이상의 면역세포들의 활성, 용량 및 관련 수들을 변화시킴으로써 면역시스템을 변경시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 미성숙 단핵구들의 면역조절은 보다 성숙한 단핵구들, 수지상 세포들, 대식구들 또는 파골세포들의 큰 군집들을 유도할 수 있으며, 이들 모두 미성숙 단핵구들로부터 유도된다. 다른 예로서, 기억 B 세포들의 면역조절은 특정 항체들의 제조시에 부수적으로 감소되면서 특정 기억 B 세포들을 선택적으로 세포자멸사시킬 수 있다. 다른 예로서, NK 세포들의 면역조절은 항체의존성 세포 세포독성을 개선시킬 수 있다. 다른 예로서, 면역조절 활성은 CD8 베타+/CD11c+세포들과 같이, 높은 수준에서 발현되지 않는 표현형들을 갖는 세포군들을 증가시킨다. 다른 예로서, 면역조절 활성은 IL-6 및 IL-8과 같이 자가면역 질병들에서 보통 증가되는 사이토카인 또는 염증유발 사이토카인을 감소시킬 수 있다. 다른 예로서, 면역조절활성은 이후 TGF-베타의 분비 및 제거에 의해 NKT 세포들을 활성화시킬 수 있다. 예를 들면, 면역세포 수용체들은 면역학적으로 활성인 생체모방물들에 의해 결합되고, 다양한 면역세포 변화들을 유도하기 위한 세포내 신호화를 활성화시키며, 별도로 "면역조절을 활성화하는 것"을 의미한다. 수용체 활성화를 방지하기 위해 면역세포 수용체들을 차단하는 것은 "면역조절"내에 포함되며, 별도로 "억제하는 면역조절"로 언급된다.

수지상세포들의 조절은 수지상세포의 표면상에서 CD86 및/또는 CD1a의 발현을 유도함으로써 예를 들면 T 세포에 대한 항원전달을 촉진 또는 억제시킬 수 있다. CD1a는 항원전달세포들, 특히 수지상세포들의 표면상에서 발현되는 MHC-부류 I-관련 글리코단백질이다. CD1a는 T 세포들에 대한 지질 항원들의 전달에 관여된다. CD86은 또한 항원전달세포들의 표면상에서 발현되며, T 세포들의 공동자극을 제공한다. CD86은 활성화 신호 및 억제 신호들을 각각 보내기 위한, T 세포들의 표면상의 CD28 및 CTLA-4 모두에 대한 리간드이다. 그러므로, CD86 및 그의 동족 수용체들의 발현 수준은 내성 또는 특정 면역반응이 유도될지의 여부를 결정한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 스트라도머는 항원전달세포들, 특히 수지상세포들의 표면상에서 CD86 및 CD1a의 발현을 유도함으로써 부분적으로 면역반응을 조절할 수 있다.

단핵구의 성숙 조절은 단핵구를 성숙 DC, 대식구 또는 파골세포로 분화시키는 것을 의미한다. 분화는 성숙속도 또는 방향을 촉진시키기 위해, 및/또는 분화되는 단핵구들의 수를 증가시키기 위해 조절될 수 있다. 선택적으로, 분화는 분화되는 세포들의 분화속도 및/또는 수의 관점에서 감소될 수 있다.

본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "분리된" 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 자연발생 대응물을 가지지 않거나, 또는 예를 들면 췌장, 간, 비장, 난소, 고환, 근육, 연조직, 신경조직, 위장조직 또는 유방조직 또는 종양조직(예를 들면, 유방암 조직)과 같은 조직, 또는 혈액, 혈청 또는 소변과 같은 체액에 이를 자연적으로 포함하는 성분들로부터 분리 또는 정제되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 자연적으로 연합되는 단백질 및 다른 자연발생 유기분자들로부터 건조중량 기준부 적어도 70% 유리되었을때 "분리"되었다고 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드(또는 펩타이드)의 제조율은 각각 본 발명의 건조중량 기준부 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 폴리펩타이드(펩타이드)이다. 화학합성되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 성질에 의해, 자연적으로 포함하는 성분들로부터 분리되기 때문에, 합성 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 "분리"된다.

본 발명의 분리된 폴리펩타이드(또는 펩타이드)는 천연 공급원(예를 들면, 조직 또는 체액)으로부터 예를 들어, 추출에 의해; 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 코드화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 세포내 시스템에서 생성되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 자연적으로 포함하는 성분들이 어쩔수없이 자유로울 것이기 때문에, 자연적으로 유래한 기원이 "분리"되는 공급원과 상이하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 단지 선도 펩타이드에 해당하는 서열들(서열번호: 1); IgG1 Fc 모노머(서열번호: 2) 또는 (서열번호: 19) 및 IgG2 힌지 다중화 도메인(서열번호: 3), 아이소류신 다중화 도메인(서열번호: 5) 또는 GPP 다중화 도메인(서열번호: 26)을 함유하며, 및 단백질(예를 들면, 도입된 제한효소 인식부위 또는 정제 태그들)의 클로닝 또는 정제에 도움이 될 수 있는 추가의 서열들을 포함하지 않는다. 분리 또는 정제의 정도는 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석과 같은 적당한 방법에 의해 측정될 수 있다.

약제학적 조성물

본 명세서에 설명된 스트라도머 조성물들의 투여는 통상적인 경로로, 경구로, 비경구로 또는 국소적으로 이루어질 것이다. 경로의 예로는, 봉합선과 같은 이식장치, 또는 이식가능한 폴리머, 경막내, 피질내, 또는 피부와 같은 이식장치 상에 삽입된 경구, 비강, 구강, 직장, 질, 눈, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 동맥내, 종양내, 척추, 관절내, 피하, 동맥내, 지주막하, 설하, 구강 점막, 기관지, 림프, 자궁내, 피하, 종양내 경로가 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 조성물은 본 명세서에 설명된 약제학적으로 허용되는 조성물로서 보통 투여된다. 바람직한 구체예에서, 분리된 스트라도머는 정맥내로 또는 피하로 투여된다.

본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 특정 및 모든 용매들, 분산매질, 코팅제, 항균 및 항균제, 등장성 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질들을 위한 상기 매질 및 제제의 용도는 당 분야에 잘 알려져 있다. 종래의 매질 또는 제제가 본 발명의 벡터들 또는 세포들과 맞지않는 경우를 제외하고는, 치료조성물에 있어서의 그의 용도가 고려된다. 보충 활성성분들도 또한 조성물로 통합될 수 있다.

본 발명의 스트라도머 조성물은 중성 또는 염 형태로 배합될 수 있다. 약제학적으로-허용되는 염들로는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 상기 유기산에 의해 형성되는 산 부가염(단백질의 자유 아미노기에 의해 형성됨)이 포함된다. 자유 카복시기에 의해 형성된 염들은 예를 들어, 나트륨, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기, 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 상기 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

멸균 주사액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적당한 용매내에 필요량의 스트라도머를 혼입시키고, 멸균여과함으로써 제조되었다. 일반적으로, 상기 열거된 것들로부터 다른 필요한 성분들 및 기본적인 분산매질을 함유하는 멸균 부형제로 다양한 멸균 유효성분들을 첨가함으로써 분산액들이 제조된다. 멸균 주사용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법들은 이전에 그의 멸균-여과된 용액으로부터 유효성분의 분말과 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공건조법 및 동결건조법이다.

그리고, 한 구체예는 경구투여에 적당한 스트라도머 조성물이며, 비활성 희석제와 함께 또는 없이 약제학적으로 허용가능한 담체내에 제공된다. 담체는 동화가능 또는 식용가능하여야 하며, 액체, 반-고형, 즉 페이스트 또는 고형 담체들을 포함한다. 종래의 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 그 안에 포함된 스트라도머 제조물의 치료적 효과에 또는 수용자에 유해한 것을 제외하고, 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위한 스트라도머 조성물을 경구투여하는데 있어서의 그의 용도가 적당하다. 담체 또는 희석제의 예로는 지방, 오일, 물, 식염수, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 필러 등, 또는 이들의 조합물이 포함된다. 본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "경구 투여"는 경구, 구강, 장내 또는 위장내 투여를 포함한다.

한 구체예에서, 스트라도머 조성물은 종래의 및 실제 방법, 즉 용액, 현탁액, 유화, 혼합물, 캡슐화, 마이크로캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 상기 과정들은 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에게는 일상적인 것이다.

특정 구체예에서, 분말 형태의 스트라도머 조성물은 반고형 또는 고형 담체와 함께 전체 조합 또는 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 종래의 방법에 의해 실시될 수 있다. 위장내 변성을 통해 조성물이 치료적 활성을 손실하지 않도록 혼합과정에 안정화제가 추가될 수도 있다. 경구투여 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예로서, 버퍼, 위산의 분비에 대한 길항제, 글리신 및 라이신과 같은 아미노산, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소비톨, 만니톨 등과 같은 탄수화물, 단백질분해 효소 억제제 등이 포함된다. 보다 바람직하게는, 경구투여된 조성물에 대하여, 안정화제는 위산의 분비에 대한 길항제를 포함할 수도 있다.

그리고, 반고형 또는 고형 담체와 조합되는 경구투여용 스트라도머 조성물은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐, 정제 또는 필로 추가 배합될 수 있다. 보다 바람직하게는, 젤라틴 캡슐, 정제, 또는 필은 장용성 코팅된다. 장용성 코팅은 pH가 산성인 윗창자 또는 위장내에서 조성물의 변성을 막는다. 즉, 미국특허 제5,629,001호를 참조한다. 소장에 도달했을때, 그 안의 염기성 pH는 코팅을 용해하여, 조성물이 방출되어 소장세포들, 예를 들면 파이어판(Peyer's patch) M 세포들과 상호반응하도록 한다.

다른 구체예에서, 분말 형태의 스트라도머 조성물은 면역학적으로 활성인 생체모방물을 캡슐화하는 나노입자를 생성하는 물질들, 또는 면역학적으로 활성인 생체모방물이 부착되는 물질들과 전체적으로 조합 또는 혼합된다. 각 나노입자는 100마이크론 이하의 크기를 가질 것이다. 나노입자는 경구로 생체사용할 수 없는 면역학적으로 활성인 생체모방물을 위장흡수시키는 점막점착성을 가진다.

다른 구체예에서, 분말 조성물은 안정화제와 함께, 또는 없이, 물 또는 식염수와 같은 액체 담체와 조합된다.

사용가능한 특정 스트라도머 배합물은 버퍼의 조성이 다음과 같은 칼륨이 유리된 저장성 인산염계 버퍼내 면역학적으로 활성인 생체모방 단백질의 용액이다: 6mM 인산나트륨 모노염기성 모노하이드레이트, 9mM 인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트, 50mM 염화나트륨, pH 7.0.+/- 0.1. 저장성 버퍼내 면역학적으로 활성인 생체모방 단백질의 농도는 10마이크로그램/ml 내지 100밀리그램/ml이다. 이 배합물은 예를 들어, 정맥내 투여와 같은 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

그리고, 반-고형 담체와 조합되는 국소 투여를 위한 스트라도머 조성물은 크림 또는 겔 연고로 추가배합될 수 있다. 겔 연고의 배합을 위한 바람직한 담체는 겔 폴리머이다. 본 발명의 겔 조성물을 제조하는데 사용되는 바람직한 폴리머들은 카보폴, 카복시메틸-셀룰로스 및 플루로닉 폴리머를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 특히, 분말형 Fc 멀티머 조성물은 질병을 치료하기 위해 피부에 적용하거나, 또는 피부 아래에 적용하기 위한 0.5% 내지 5% wt/부피의 강도로 카보폴(Carbopol) 980과 같은 중합제를 함유하는 수성 겔과 조합된다. 본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "국소 투여"는 피부, 상피, 피하 또는 점막 표면에 적용하는 것을 포함한다.

또한, 스트라도머 조성물은 피하 또는 피하 이식을 위한 폴리머로 배합될 수 있다. 이식가능한 약물-융합 폴리머를 위한 바람직한 배합물은 제제 일반적으로 안전한 물질(Generally Regarded as Safe)이며, 예를 들어 가교된 덱스트란 (Samantha Hart, Master of Science Thesis, Elution of Antibiotics from a Novel Cross-Linked Dextran Gel: Quantification" Virginial Polytechnic Insitute and State University, june 8, 2009), 덱스트란-티라민 (Jin, et al. (2010) Tissue Eng. Part A. 16(8):2429-40), 덱스트란 폴리에틸렌 글리콜 (Jukes, et al. (2010) Tissue Eng. Part A., 16(2):565-73), 또는 덱스트란- 글루테르알데히드 (Brondsted, et al. (1998) J. Controlled Release, 53:7-13)를 포함할 수 있다. 당업자는 많은 유사한 폴리머들 및 하이드로겔들이 폴리머 또는 하이드로겔내에 고정된 스트라도머를 혼입시키고, 공극 크기를 목적하는 직경으로 조절함으로써 형성될 수 있음을 알 것이다.

배합시에, 증상을 개선 또는 교정시키기에 치료적으로 효과적인 양으로 투약제제와 적합한 방법으로 투여된다. 배합물은 섭취가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여형태로 쉽게 투여된다. 일부 투여 변형은 치료되는 대상물의 조건에 따라 다르게 일어날 수 있다. 투여의 책임자는 어느 경우에나, 각 대상에 대한 적당한 투여량을 결정할 수 있다. 그리고, 인간 투여를 위해서는, 제제는 생물학적제제 평가 및 연구센터 표준(Biologics Evaluation and Research standards)을 위한 FDA 센터에 의해 요구되는 무균도, 일반적인 안정성 및 순도 표준을 만족시킨다.

투여경로는 치료되는 질병의 위치 및 성질과 함께 원래 다양할 것이며, 예를 들어 피부내, 경피성, 피하, 경구용, 비강용, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경피적, 기관내, 복강내, 종양내, 관류, 세척, 직접주사 및 경구투여를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 " 비경구 투여"는 소장을 통한 흡수를 포함하지 않으면서 대상에 화합물이 흡수되는 투여형태면 어느 형태나 포함한다. 본 발명에 사용되는 예시적인 비경구 투여는 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 안구내, 비강내 또는 관절내 투여를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

그리고, 본 발명의 스트라도머는 다른 약제학적 제제 이전에, 도중에 또는 이후에 선택적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 스트라도머 및 프레드니솔론을 수반 투여하면, 스트라도머 조성물 또는 프레드니솔론 단독으로 관찰된 결과보다 상승적으로 우수한 결과들을 얻게 됨을 알아내었다(도 3 참조).

아래에는 특정 예시적인 질병들을 위한, 다양한 약제학적 배합 카테고리의 특정 예들 및 바람직한 투여경로이다:

구강 또는 설하 용해성 정제: 협심증, 결절성 다발성 동맥염.

정맥내: 특발성 혈소판감소성 자반증, 봉입체 근염, 파라프로테인성 IgM 탈수초성 다발신경병증, 괴사성 근막염, 천포창, 괴저, 피부근염, 육아종, 림프종, 패혈증, 재생불량빈혈, 복합장기부전, 다발성 골수종 및 미정 의미의 모노클론 감마글로불린 장애, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병, 염증성 근육병, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 근염, 빈혈, 종양형성, 용혈성 빈혈, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1, 백혈병, 다발성 경화증 및 시신경염과 연관된 척수증, 천식, 표피융해, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증 근무력증, 신경병증, 포도막염, 갈랑-바레 증후군, 이식편대숙주병, 강직인간 증후군, 항-Yo 항체들과 연관된 부종양성소뇌변성, 항-Hu 항체들과 연관된 신생물딸림 뇌척수염 및 감각 신경병증, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 당뇨성 신경병증, 급성 특발성 자율신경이상 신경병증, 복트-고야나기 하라다증, 다초점성 운동신경병증, 항-/GMI와 연관된 하위운동신경원 증후군, 탈수초화, 막증식성 사구체신염, 심근병증, 가와사키병, 류마티스 관절염 및 에반스증후군 IM-ITP, CIDP, MS, 피부근염, 중증근무력증, 근이영양증. 본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "정맥내 투여"는 정맥내 주사 또는 투입을 통해 본 발명의 화합물 또는 조성물을 전달하기 위한 모든 기술들을 포함한다.

피부 겔, 로숀, 크림 또는 패치: 백반증, 대상포진, 여드름, 구순염.

직장 좌약, 겔 또는 투입: 괴양성 대장염, 치질 염증.

필, 트로키, 캡슐형 또는 장내 코팅으로서 경구: 크론병, 비열대성 스프루, 과민성 장 증후군, 염증성 간 질환, 바렛식도.

피질내: 뇌전증, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병.

복강내 투입 또는 이식: 자궁내막증.

질내 겔 또는 좌약: 세균성, 트리코모나스성 또는 세균성 질염.

의료장치: 관상동맥 스텐트, 인공관절.

본 명세서에 설명된 스트라도머들은 약 0.01mg/kg 내지 약 300mg/kg(체중), 및 특히 약 0.01mg/kg 내지 약 1000mg/kg(체중)의 투여량으로 투여될 수 있으며, 적어도 1일1회, 주1회, 2주에 한번 또는 한달에 한번 투여될 수 있다. 첫번째 투여용량 상이 두번째 투여용량 상의 약 0.1% 내지 약 300%를 포함하는 이상성 용량 식이요법이 사용될 수 있다.

스트라도머의 치료적 용도

합리적 디자인 및 시험관내 및 생체내 확인에 기초하여, 본 발명의 스트라도머는 자가면역 질병들을 치료하기 위한, 및 암 및 염증성 질병에 대한 생체면역치료법과 같은 다양한 다른 문맥에서 면역기능을 조절하기 위한, 중요한 생물약제로서 제공할 것이다. 본 명세서에 설명된 면역학적으로 활성인 생체모방물들에 의해 치료하기에 적당한 의료질환들은 hIVIG에 의해 통상적으로 관례대로 치료되는 것을 포함하며, 또는 hIVIG는 자가면역 혈구감소증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 길렝-바레 증후군, 중증 근무력증, 항-요소 VIII 자가면역 질병, 피부근염, 혈관염 및 포도막염과 같은 질병들(F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, 1123 (1992); P. Gajdos et al, Lancet i, 406 (1984); Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas et al., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993); D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000) 참조), 및 모노클론 항체가 사용될 수 있거나, 또는 이미 임상적인 용도로 사용되는 암 또는 염증성 질병들에 임상적으로 유용한 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 대상인 화합물에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 것들에 포함되는 질병들로는 사이토카인 네트워크내 불균형에 의한 염증성 질병, 병원성 자가항체들 또는 자가공격성 T 세포들에 의해 매개되는 자가면역 질병, 또는 만성 재발 자가면역, 염증 또는 감염성 질병 또는 프로세스의 급성 또는 만성단계를 포함한다.

그리고, 염증 성분을 갖는 다른 의료질환들은 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 심근경색증, 뇌줄중, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스관련 염증, 부산백질이영양증, 및 라스뮤젠 증후군, 웨스트 증후군 및 레녹스-가스토 증후군을 포함하는 바이러스성 뇌척수염과 연관된 것으로 알려져 있는 간질증후군과 같이, 스트라도머에 의한 치료로 인해 호전될 것이다.

본 명세서에 설명된 분리된 스트라도머를 사용한 치료법에 대한 일반적인 접근법은 치료 효과가 있는 치료적으로 유효한 양의 분리된 면역학적으로 활성인 생체모방물을 질병 또는 질환을 갖는 대상물에 투여하는 것이다. 일부 구체예에서, 질병 또는 질환들은 사이토킨 네트워크내 불균형과 연관된 염증질병들, 병원성 자가항체들 또는 자가공격성 T 세포들에 의해 매개되는 자가면역 질환, 또는 만성 재발 질병 또는 과정의 급성 또는 만성 단계로 광범위하게 카테고리화될 수 있다.

본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상의 질병 또는 질환, 또는 질병 또는 질환의 증상이 개선되도록 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 스트라도머를 대상물에 투여하는 것을 의미한다. 상기 개선은 질병 또는 질환, 질병 또는 질환의 증상을 개선 또는 교정하는 것이다. 상기 개선은 대상물의 웰빙의 일반적인 느낌에 있어서, 관찰가능한 또는 측정가능한 개선, 또는 개선이다. 따라서, 당업자는 치료에 의해 질병상태를 개선시킬 수 있지만, 질병을 완전히 치유할 수는 없음을 깨닫는다. 특히, 대상물의 개선은 염증 감소; C-반응성 단백질과 같은 염증성 실험적 마커 감소; 자가항체와 같은 자가면역 마커, 혈소판 개수, 백혈구 세포 개수 또는 적혈구 세포 개수의 개선, 발진 또는 자반병 감소, 약함, 마비, 또는 저림 감소, 과혈당증 환자에 있어서 글루코스 레벨 증가, 관절통증, 염증, 부기 또는 저하 감소, 경련 및 설사 빈도 및 용량 감소, 협심증 감소, 조직염증 감소 또는 발작빈도 감소 중 하나에 의해 입증된 자가면역 감소; 암 종양종 감소, 종양성장시간 증가, 암통증 감소, 생존율 증가 또는 삶의 질 개선; 또는 골다공증의 진행지연 또는 개선 중 하나를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 것으로서 용어"치료적으로 유효한 양"은 질병 또는 질환의 증상을 개선 또는 치료하는 양을 의미한다.

본 명세서에 사용된 것으로서 "예방"은 질병의 증상을 완전히 예방하는 것, 질병의 증상개시를 지연시키는 것 또는, 이후 발병된 질병 증상의 심각도를 줄이는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "대상물"은 본 발명의 스트라도머가 본 명세서에 설명된 방법들에 따라 투여되는 포유류 대상물을 의미한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법들은 인간 대상물을 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 방법들은 종-특이적 또는 키메릭 스트라도머 분자들을 생성하여, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 비비, 및 침팬지), 마우스, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 흰담비, 게르빌루스쥐, 기니피그, 햄스터, 박쥐, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 및 오리), 어류 및 파충류를 치료하기 위해 사용될 수도 있다.

특히, 본 발명의 스트라도머는 울혈성 심장기능상실(CHF), 혈관염, 주사코, 여드름, 습진, 심근염 및 다른 심근질환들, 전신 홍반성 루푸스, 당뇨병, 척추병증, 활막 섬유모세포, 및 골수기질; 골손실; 파제트병, 파골세포증; 다발성 골수증; 유방암; 불용성 골감소증; 영양실조, 치주질환, 고오시에씨병, 랑게르한스세포 조직구증, 척수외상, 급성 화농성 관절염, 골연화증, 쿠싱증후군, 단발성 섬유성이형성증, 다골성 섬유성이형성증, 치주염 재생, 및 골절; 유육종증; 골용해성 골암, 폐암, 신장암 및 직장암; 골전이, 골성 통증 조절, 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염 및 다른 척추관절염; 이식거부, 바이러스성 감염, 혈액종양 및 종양-유사 질환들, 예를 들면 호지킨병; 비-호지킨 림프종(버키트 림프종, 소림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 외투세포 림프종, 소포림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 모발상세포 백혈병 및 림프형질세포 백혈병), B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종과 같은 림프구 전구세포의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대과립 림프구성 백혈병을 포함하는 성숙 T 및 NK 세포들의 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 성숙된 AML, 분화없는 AML, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구 백혈성 및 급성 단핵구성 백혈병을 포함하는 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 만성골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수증식성 질환과 같은 골수종 종양, 중추신경계의 종양, 예를 들면 뇌종양(신경교종, 신경아세포종, 성상세포종, 수모세포종, 상의세포종, 및 망막모세포종), 고형종양(비인두암, 기저세포암, 췌장암, 담도암, 카포시육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 1차성 간암 또는 자궁내막암, 혈관계 종양(혈관육종 및 혈관주위세포종)) 또는 기타 암을 포함하는 질환들을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "암"은 조절되지 않은 세포성장에 의해 특징화된 포유류내 생리적 질환을 의미 또는 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골육종, 혈관육종, 혈관외벽육종, 림프관육종, 림프관내분비육종(lymphangioendotheliosarcoma), 평활근육종, 횡문근육종, 섬유육종, 혼합육종, 연골육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 척삭종, 윤활막종, 신경초종, 수막종, 생암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프 종양이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특별한 예로는 편평상피세포암(예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평세포암을 포함하는 폐암, 소세포 폐암종, 복막암, 간세포성 암, 위암(gastrointestinal cancer)을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간장암, 선암, 음경암, 고환암, 식도암, 담도암, 유잉종양, 기저세포암, 선암, 한선암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질암, 기관지원성 암종, 신세포암종, 간암, 담도암종, 융모막암종, 정상피종, 배아암종, 윌름스 종양, 고환종양, 폐암, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수증, 발덴스트롬 마이크로불린혈증, 골수형성이상질병, 중쇄 질병, 신경내분비 종양, 신경초종, 및 다른 암종 뿐만 아니라 머리 및 목암이 포함된다.

본 발명의 스트라도머는 자가면역 질병들을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "자가면역 질병"은 80개 이상의 질병 및 질환의 다양한 그룹을 의미한다. 상기 모든 질병 및 질환에서, 근본적인 문제는 신체의 면역시스템이 자신의 몸을 공격한다는 것이다. 자가면역 질병들은 연결조직, 신경, 근육, 내분비 시스템, 피부, 혈액 및 호흡 및 위장 시스템을 포함한 모든 주요 신체 시스템들에 영향을 미친다. 자가면역 질병들로는 예를 들어, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 및 타입 I 당뇨병이 포함된다.

본 발명의 조성물 및 방법들을 사용하여 치료가능한 질병 또는 질환은 특발성 혈소판감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판 감소증, 후천성 면역 혈소판 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파보바이러스 B19-연관 적혈구 무형성증, 후천성 항인자 VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란트 증후군, 다발성 골수종 및 모노클론 감마글로불린 장애, 패혈증, 재생불량성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성증, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 신생아 용혈성질환, 면역-매개 호중구감소증, 혈소판 수혈 불응증, 신생아(neonatal), 수혈후 자반증, 용혈성 요독 증후군, 전신성 맥관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 또는 에반스 증후군을 포함하는 혈액면역학적 프로세스이며, 이에 제한되지 않는다.

질병 또는 질환은 겔랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병, 파라프로테인성 IgM 탈수초성 다발성 신경병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 다초점성 운동신경병증, 항-/GMI와 연관된 하위운동신경 증후군, 탈수초증, 다발성 경화증 및 시신경염, 강직인간증후군, 항-Yo 항체들에 의한 부종양성 소뇌변성, 항-Hu 항체들에 의한 감각신경병, 뇌전증, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1과 특히 연관된 척수병증, 자가면역 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 급성 특발성 자율신경이상 신경병증을 포함하는 신경면역학적 프로세스일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

질병 또는 질환은 가와사키병, 류마티스 관절염, 펠티증후군, ANCA-양성 혈관염, 자발적 다발성근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 습관성 자연유산, 전신 홍반성 루푸스, 전신성 소아특발성 관절염, 레이노병, CREST 증후군, 또는 포도막염을 포함하는 류마티스 질병 프로세스일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

질병 또는 질환은 중독성 표피융해, 괴저, 육아종, 심상성 천포창, 물집유사 천포창, 낙엽상 천포창, 백반증, 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군, 피부경화증, 확산 및 제한된 피부전신경화증, 또는 아토피피부염(특히, 스테로이드 의존성)을 포함하는 전신경화증자가면역 피부물질 질병을 포함하는 피부면역학적 질병 프로세스일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

질병 또는 질환은 봉입체근염, 괴사성 근막염, 염증성 근육병, 근염, 항-데코린(BJ 항원) 근육병, 방종양성 괴사성 근육병증, X-결합 공포성 근육병증, 페니실아민-유도성 다발성근염, 죽상경화증, 관상동맥 질병, 또는 심근병증을 포함하는 근골격 면역 질병 프로세스일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

질병 또는 질환은 악성 빈혈, 자가면역 만성 활성 간염, 1차 담즙간경병증, 셀리악병, 포진성 피부염, 잠복성 간경병증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플병, 궤양성 대장염, 또는 원발성 경화성 담관염을 포함하는 위장성 면역학적 질병 프로세스일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

질병 또는 질환은 이식편대 숙주반응, 항체-매개 이식편 거부반응, 후-뼈 골수이식거부, 감염후 질병 염증, 림프종, 백혈병, 신생물, 천식, 항-베타 세포 항체들에 의한 타입 1 당뇨병, 스조그렌 증후군, 혼합연결성 조직질병, 애디슨병, 보그트-고야나기-하라다 증후군, 막성증식성 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 마이크로다발성 동맥염, 처그-스트라우스 증후군, 결절성 다발동맥염 또는 다장기 기능부전일 수도 있다.

다른 구체예에서, 본 명세서에 설명된 스트라도머는 혈액이 환자로부터 유래되고, 환자에게 다시 도입되기 약 30분 내지 약 3시간의 주기동안 스트라도머(들)와 일시적으로 접촉된다. 이러한 형태의 세포 치료법에서, 스트라도머에 대한 이펙터 세포들의 노출을 통해 이펙터 세포들을 조절하기 위해 생체외 매트릭스상에 고정되는 스트라도머에 환자의 이펙터 세포들이 노출된다. 조절된 이펙터 세포들을 포함하는 혈액은 환자에게 다시 주입된다. 상기 프라이밍 계통은 수많은 임상 및 치료적 용도들을 가질 수 있었다.

본 명세서에 개시된 스트라도머들은 면역반응 프로필의 특정 변화에 영향을 미치기 위해, 다양한 문맥에서 면역시스템 반응들을 변경시키기 위해 쉽게 적용될 수도 있다. 대상의 면역반응을 변경시키거나 또는 조절하는 것은 면역반응의 성분 또는 비율을 증가, 감소 또는 변경시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 사이토킨 생성 또는 분비 수준은 상기 수용체들과 상호반응하도록 디자인된 스트라도머와 FcR들의 적당한 조합을 목표로 함으로써 원하는대로 감소 또는 감소될 수 있다. 항체 생성도 또한 증가 또는 감소될 수도 있으며; 둘 이상의 사이토킨 또는 면역세포 수용체들의 비율이 변경될 수 있거나; 또는 다른 타입의 사이토킨 또는 항체들이 생성되도록 할 수 있다. 면역반응은 또한, FcγR을 발현하는 면역세포의 이펙터 기능일 수도 있으며, 본 명세서에 개시된 면역학적으로 활성인 생체모방물에 의해 조절되지 않는 면역반응과 비교하여, 단핵구 대식세포 유도 세포들의 증가 또는 감소된 식세포 포텐셜, 증가 또는 감소된 파골세포 기능, 항원-전달 세포(예를 들면, DC)에 의한 증가 또는 감소된 항원전달, 증가 또는 감소된 NK 세포 기능, 증가 또는 감소된 B-세포 기능을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 암 또는 자가면역 또는 염증성 질병을 앓는 대상은 치료적으로 유효한 양의 스트라도머를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 변경된 면역반응을 가지며, 치료적으로 유효한 양의 스트라도머는 대상의 면역반응을 변경시킨다. 이상적으로는, 이러한 조정은 대상의 질병 또는 질환을 치료한다. 변경된 면역반응은 증가 또는 감소된 반응이며, IL-6, IL-10, IL-8, IL-23, IL-7, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, TNF-알파 및 IFN-알파 중 어느 하나의 수준을 포함하는 변경된 사이토킨 수준들을 포함한다. 바람직한 구체예에서, Il-6 또는 IL-8은 치료반응이 감소된다. 특히 바람직한 구체예에서, IL-6 또는 IL-8은 치료반응이 감소된다. 그러나, 본 발명은 상기 설명된 생체모방물들의 특정 작용기작에 의해 제한되지 않는다. 변경된 면역반응은 대상의 변경된 항체수준이다. 변경된 면역반응은 대상에서 변경된 자가면역 T-세포 수준이다.

예를 들면, 자가면역 질병에서 TNF-알파 생성양을 감소시키는 것은 치료적인 효과를 가질 수 있다. 이것을 실제로 적용하는 것은 판건선, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염 및 강직성 척추염을 치료하는 것으로 임상적으로 입증된 항-TNF-알파 항체요법(예를 들면, REMICADE®)이다. 이러한 자가면역 질병들은 분명한 병인을 가지지만, 염증과 관련된 질병 프로세스 및 면역세포 활성의 중요한 면역학적 성분들을 공유한다. TNF-알파 생성을 감소시키기 위해 디자인된 스트라도머는 여기에서 효과적일 것이며, 다른 자가면역 질병에도 효과적일 것이다. 변경된 면역반응 프로필은 대상의 조직들을 표적하는 자가항체들과 같은 항체 생성의 감소를 수행하기 위한 직접적인 또는 간접적인 조절이거나, 또는 대상의 변경된 자가면역 T-세포 수준들이다. 예를 들면, 다발성 경화증은 인터페론 베타 요법에 의해 치료될 수 있는 자가반응성 T-세포들을 포함하는 자가면역 질환이다. 예를 들어, Zafranskaya M, et al., Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis, Immunology 2007 May;121(l):29-39-Epub 2006 Dec 18를 참조한다. 자가반응성 T-세포 수준을 감소시키기 위한 스트라도머 디자인은 다발성 경화증에 유효할 것이며, 자가반응성 T-세포들을 포함하는 다른 자가면역 질병들일 수 있다.

본 명세서에 설명된 스트라도머들은 수지상 세포, 대식세포, 파골세포, 단핵구, 또는 NK 세포를 포함하는 면역세포로부터의 공동-자극 분자들의 발현을 조절하기 위해 또는 인터류킨-10(IL-10), 또는 인터류킨-6(IL-6)을 포함하는 사이토카인 분비를 증가시키거나, 또는 인터류킨-12(IL-12)를 포함하는, 동일한 면역세포 분화, 성숙 또는 사이토카인 분비를 억제하는데 사용된다. 당업자는 면역학적으로 활성인 생체모방물에 면역세포를 노출시키고, 면역세포 기능의 조절을 측정함으로써 면역학적으로 활성인 생체모방물의 효능을 입증할 수도 있으며, 상기 면역세포는 수지상세포, 대식세포, 파골세포, 또는 단핵구이다. 한 구체예에서, 면역 세포는 시험관내 면역학적으로 활성인 생체모방물에 노출되며, 사이토카인 생성량 또는 세포표면수용체의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 세포표면 수용체의 양 또는 사이토카인 생성양의 변화는 면역세포기능이 조절되었음을 의미한다. 다른 구체예에서, 면역세포는 자가면역 질병을 개선시키는 정도를 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 자가면역 질병에 대한 모델 동물내 생체내 면역학적으로 활성인 생체모방물에 노출된다.

고정된 Fc를 사용하는 방법

Fc:Fc 감마 수용체(FcγR, IgG Fc에 대한 Fc 수용체) 상호작용의 역할 및 면역글로불린내에서 생물학적으로 고정된 Fc의 hIVIG 기능에 대한 중요성을 이해하기 위해, 본 발명자들은 단핵구로부터 미성숙 수지상 세포들(iDC)까지 분화하는 과정동안 단핵구의 기능에, 힌지-CH2-CH3 도메인을 함유하는, 재조합 IgG1 Fc 단편(rFCF)의 고정된 형태 및 재조합 IgG1 Fc 단편(sFc)의 가용성 형태를 갖는 hIVIG가 미치는 효과를 비교하였다.

과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 인터류킨-4(IL-4)에서 배양된 단핵구들을 고정화 rFCF 및 고정화 hIVIG(저용량 가용성 hIVIG 제외)에 노출시키면, CD86 발현이 개선되고, CD1 Ic의 발현이 지연되고, 세포상에서 CDIa의 발현이 억제된다. 그리고, 이러한 변화들은 플라스틱 상에서 rFCF의 비-특이적 단백질 고정화되기 쉽지 않으며, 가용성 열응집 (sHA)hIVIG, sHA rFCF 또는 고용량 hIVIG(멀티머 Fs를 함유하는 것으로 인지됨)에 따라, 고정화 rFCF에 의해 관찰된 것과 유사한 변화를 유도했다.

이를 보면, 본 발명자들의 데이터는 고형, 반-고형 또는 젤라틴성 기재의 표면상에 고정된 hIVIG에 iDC를 노출시키면 면역관용을 조직할 수 있는, DC들(고 CD86, 저 CDIa)의 유일한 군집이 생성되며, 면역글로불린 G(IgG) Fc 단편의 기능적인 부분을 포함하는 고정화 분자들이 국소 및 전신 염증뿐 아니라, iDC와 같은 단핵구 유도성 세포들(MDC)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 매개되는 매우 다양한 다른 병리조건들을 치료하기 위한 hIVIG의 생체모방물들로서 사용될 수 있음을 보여준다. 그리고, 분자들이 IgG Fc 단편의 기능적 부분을 포함하는 상태에서, 동물들(예, 인간 환자)의 신체에 이식되거나, 또는 신체에 부착되는, "코팅 장치"로서 본 명세서에 설명된 장치 상에 IgG Fc의 기능적인 부분을 고정화하면, 방해하지 않는한, 상기 장치에 대한 염증반응을 줄이거나, 또는 이식된 장치상에 또는 내부로 코팅된 고정된 스트라도머와 접촉시킴으로써 변경된, 순환계로 통과하는 면역세포들에 영향을 미침으로써 전신 질병들을 치료할 수 있다.

본 발명은 단핵구-유도성 세포(MDC)의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 여기에 결합된 Fc 제제와 함께 기질을 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 코팅은 시험관내, 생체내 또는 생체외 접촉될 수 있다. 선택적으로, 세포는 동물일 수 있다. 동물은 단핵구 유도성 세포 매개 질환(MDCMC)을 갖는 동물일 수 있거나, 이를 발생시킬 위험에 있다. MDC는 예를 들면, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구 또는 파골세포일 수 있다. [00260] 본 발명은 치료방법 또는 예방방법을 제공한다. 이 방법은 결합될 Fc 제제를 갖는 기질을 함유하는 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하며, 동물은 MDCMC를 가지거나 발병될 위험을 가진다.

또한, 본 발명의 스트라도머들은 생체내 고정된 Fc 제제가 될 수도 있다. "생체내 고정된 Fc 제제"는 Fc가 생체내 세포, 즉 혈소판의 표면에 고정되는 것을 의미한다. FcγR을 발현하는 혈소판들이 본 발명의 스트라도머에 의해 효과적으로 코팅되고, 이러한 코팅된 혈소판들이 깨끗해질때까지 유기체내 내성을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 스트라도머들은 놀랍게도 FcγR들을 발현하는 혈소판의 비율에 유효하게 결합하는 것으로 관찰되었다. 난자:항-난자 응집 복합체 및 RBC:항-RBC 응집 복합체가 내성을 유도하고, ITP내 혈소판의 파괴를 방해하므로, 상기 스트라도머-코팅된 혈소판들은 유기체내에서 내성을 유도할 수 있다. 이는 본 발명의 스트라도머가 그들의 면역조절 기능들을 발휘하는 다른 기작일 수 있다.

스트라도머내에 함유된 천연 면역글로불린 Fc와 비교되는 스트라도머의 Fc 감마 수용체에 대한 높은 결합 친화도에 기초하여, 본 발명의 스트라도머는 생체내 고정된 면역글로불린 Fc 대조군 제제로 유도될 수 있다. "생체내 고정된 면역글로불린 Fc 대조군 제제"는 생체내 단핵구, 수지상세포, T 세포, 조절 T 세포, 감마 델타 T 세포 및 혈소판들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포들의 표면에 고정된 스트라도머를 의미한다. Fc 감마 수용체들을 포함하는 표면 수용체들에 결합함으로써, 스트라도머들은 다른 면역글로불린들이 상기 수용체들에 결합하는 것을 막는다. 모노클론 또는 폴리클론 항체들은 유동 세포분석법과 같은 연구분석에 및 임상적인 진단에 사용된다. 본 발명의 중요한 관점은 면역글로불린 Fc가 결합하는 다른 세포 표면 수용체들 및 Fc 감마 수용체들에 상기 항체들의 Fc 성분을 비-특이적 결합시키는 것을 방지하는 것이다.

본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "단핵구-유도된 세포 매개된 질환(MDCMC)"은 단핵구-유도된 세포들에 의해 생성된 요소들의 활성으로 인한, 직접적 또는 간접적, 부분적 또는 전체적 병리질환을 의미한다. 단핵구-유도된 세포들은 단핵구, 대식세포, 깍지낀 수지상세포들(일반적으로, 수지상-유사 세포들 및 여포성 수지상-유사 세포들을 포함하는 "수지상 세포들"이라고 함)(성숙 및 미성숙), 파골세포, 소교세포-유사 세포들, 단핵구 유도 인슐린-생성 섬-유사 세포들, 단핵구-유도 미성숙 비만세포들 및 단핵구-유도 마이크로입자들을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

고정된 Fc를 사용한 방법에 관하여, 용어 "Fc 제제"는 면역글로불린 Ig(IgG) Fc 단편의 하나 이상의 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 또는 그 이상의)기능적인 부분들을 포함하는 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. IgG의 Fc 단편은 함께 결합된 IgG 분자의 2개의 IgG 중쇄들 중 C-말단부로 구성되며, 함께 결합된 두 중쇄들의 힌지 부분들, CH2 도메인들, 및 CH3 도메인들로 구성된다. "IgG Fc 단편의 기능적인 부분"은 함께 결합된 두 중쇄들의 힌지 부분들, CH2 도메인들, 및 선택적으로 CH3 도메인들의 모든 또는 일부(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 48, 또는 49)의 처음 50개의(N-말단으로부터) 아미노산들로 구성된다. 인간에서, (a)IgG1 힌지 부분은 15개의 아미노산들을 함유하며, CH2 도메인은 110개의 아미노산들을 함유하며, 및 CH3 도메인은 106개의 아미노산들을 함유하고; (b)IgG2 힌지 부분은 12개의 아미노산들을 함유하며, CH2 도메인은 109개의 아미노산들을 함유하며, 및 CH3 도메인은 107개의 아미노산들을 함유하며; (c)IgG3 힌지 부분은 62개의 아미노산들을 함유하며, CH2 도메인은 104개의 아미노산들을 함유하며, 및 CH3 도메인은 106개의 아미노산들을 함유하며; 및 (d)IgG4 힌지 부분은 12개의 아미노산들을 함유하며, CH2 도메인은 109개의 아미노산들을 함유하며, 및 CH3 도메인은 107개의 아미노산들을 함유한다.

야생형 IgG 분자들에 있어서, 상기 Fc 제제에서, IgG 중쇄들로부터 유도된 2개의 폴리펩타이드 사슬은 반드시는 아니지만, 일반적으로는 동일하다. 따라서, Fc 제제는 전체 IgG 분자, 비-면역글로불린 유도된 폴리펩타이드에 결합된 전체 IgG 분자, IgG Fc 단편, 비-면역글로불린 유도된 폴리펩타이드에 결합된 IgG Fc 단편, IgG Fc 단편의 기능적인 부분, 비-면역글로불린 유도된 폴리펩타이드 또는 이들 중 어느 하나의 멀티머들(예를 들어, 다이머, 트리머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머, 또는 데카머)에 결합된 IgG Fc 단편의 기능적인 부분이 될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. Fc 제제는 상기 스트라도머, 및 상기 Fc 제제의 정의내에 들어가는 스트라도바디들일 수 있다.

고정된 Fc에서, Fc 제제들의 면역글로불린 중쇄 성분들은 야생형 아미노산 서열들을 가질 수 있거나, 20개 이하(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1)의 아미노산 치환들을 제외한 야생형 아미노산 서열일 수 있다. 상기 치환들은 바람직하게, 보전적 치환을 반드시는 아니지만, 포함한다. 보전적인 변화들은 통상적으로, 하기 기들내에서의 변화들을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신, 및 류신; 아스파트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.

본 발명의 "Fc 제제"는 Fc 제제의 IgG 중쇄 성분들이 유도되는(참고 IgG 분자) IgG 분자들이 관심의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 능력의 적어도 25%(예를 들어, 적어도: 30%; 40; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 또는 100% 또는 그 이상)를 가진다. "Fc 제제"가 IgG 분자의 한 타입 이상으로부터 유도된 중쇄 성분들을 가지는 경우, 참고 IgG 분자는 주요 관련 Fc 수용체의 가장 큰 애비더티로 결합하는 분자이다.

본 명세서에 사용된 것으로서, "고정된 Fc"는 하기에 정의된 "기질"에 결합되는 Fc 제제를 의미한다. 용어 "고정된 Fc", "결합된 Fc" 및 "안정화 Fc"는 동의어이다. 고정된 Fc는 기질에 부착된 Fc(Fc의 기능적인 부분을 포함하는 특정 폴리펩타이드를 포함하며, 이에 제한되지 않음)의 기능적인 부분으로 포함된다. 고정된 Fc는 예를 들어, 직접 결합 뿐만 아니라 기질에 Fc의 폴리머들을 통한 간접적인 결합; 분리시에 전체 IgG Fc의 통합; IgG Fc의 기능적인 부분만의 통합; 또는 항체, 스트라도머 또는 스트라도바디와 같은 큰 폴리펩타이드의 일부로서 IgG Fc의 기능적인 도메인들 및 전체 IgG Fc의 통합을 포함한다. [00267] 고정된 Fc에 적용됨으로써, 용어 "기질"은 고형, 반고형, 또는 젤라틴성 물체를 의미한다. 기질은 동물의 신체의 표면에 이식 또는 부착(또는 접착)될 수 있다. 기질은 예를 들면, 액체 또는 기체 성분들을 포함할 수 있지만, 기질의 적어도 일부는 고형, 반-고형, 또는 젤라틴이다. 따라서, 기질은 수용성 용매에 실질적으로 불용성이지만, 비-수성 용매내에는 가용성인 물질일 수 있다. 상기 물질들은 지질(예를 들어, 인지질), 지방산, 및 다른 지용성, 수성 용매-불용성 화합물들을 포함한다. 이로부터, 물질들이 리포좀들을 포함한다는 것이 분명할 것이다. 기질은 다공성 또는 비-다공성이다. 특정 구체예에서, 기질은 이식, 부착, 또는 접착되는 표면 및/또는 신체에 대하여 비활성이다.

기질은 합성 폴리머, 예를 들어 나일론, 테플론, 다크론, 폴리비닐 클로라이드, PEU(폴리(에스터 우레탄)), PTFE(폴리테트라플루오로에테인), PMMA(메탈 메타크릴레이트), PEEK, 열가소성 엘라스토머, 방사선불투과성 폴리머, 폴리에터설폰, 실리콘, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아이소뷰틸렌 및 그의 코폴리머, 폴리에스터, 폴리올레핀, 폴리아이소뷰틸렌, 에틸렌- 알파올레핀 코폴리머, 아크릴 폴리머 및 코폴리머, 바이닐 할라이드 폴리머 및 코폴리머, 예를 들면 폴리바이닐 클로라이드, 폴리바이닐 에터, 폴리바이닐 메틸 에터, 폴리바이닐리덴 할라이드, 폴리바이닐리덴 플루오라이드, 폴리바이닐리덴 클로라이드, 폴리아크릴로나이트릴, 폴리바이닐 케톤, 폴리바이닐 방향족, 폴리스티렌, 폴리바이닐 에스터, 폴리바이닐 아세테이트, 바이닐 모노머의 코폴리머, 바이닐 모노머 및 올레핀의 코폴리머, 에틸렌- 메틸 메타크릴레이트 코폴리머, 아크릴로나이트릴-스티렌 코폴리머, ABS 수지, 에틸렌- 바이닐 아세테이트 코폴리머, 폴리아마이드, 나일론 66, 폴리카프로락톤, 알키드 수지, 폴리옥시에틸렌, 폴리이미드, 폴리에터, 에폭시 수지, 레이온-트라이아세테이트, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 뷰티레이트, 셀룰로스 아세테이트 뷰티레이트, 셀로페인, 셀룰로스 나이트레이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 에터, 카복시메틸 셀룰로스, 콜라겐, 키틴, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리실록세인, 치환된 폴리실록세인, 에틸렌 바이닐 아세테이트 코폴리머, 폴리올레핀 엘라스토머, 및 EPDM 고무, 및 이들의 조합물들을 함유하거나, 또는 이로 제조될 수 있다.

기질은 또한, 금속 또는 금속합금, 예를 들어 스테인레스 스틸, 백금, 이리듐, 티타늄, 탄탈륨, 니켈-티타늄 합금, 또는 코발트-크로뮴 합금을 함유하거나, 또는 이들로 제조될 수 있다. 그리고, 기질은 동물조직 또는 동물조직 생성물, 예를 들어 조직 또는 기관 이식편을 포함하거나, 또는 이들일 수 있다. 동물조직은 예를 들어, 뼈(예를 들어, 골형성 뼈) 또는 연골일 수 있다. 그리고, 기질은 단백질, 예를 들어 콜라겐 또는 케라틴을 함유할 수 있다. 기질은 또한, 조직 매트릭스, 예를 들어 무세포성 조직 매트릭스를 함유할 수도 있다. 미립자 및 비-미립자 무세포성 매트릭스들은 예를 들어, 미국특허 제5,336,616호 및 제6,933,326호에 설명되어 있으며, 이들의 개시내용들은 이후에 참고문헌으로 전문통합된다. 기질은 또한, 동물세포(예를 들어, 섬유아세포와 같은 조직수복세포; 간엽줄기세포)일 수 있거나, 포함할 수 있으며, 예를 들어 모발이식 플러그일 수 있다. 기질은 아가로스와 같은 폴리사카라이드이거나, 또는 이를 함유할 수 있다. 이는 또한, 염, 바람직하게는 비교적 불용성인 염, 예를 들어 황산칼슘을 함유하거나, 또는 이들일 수 있다. 기질은 겔 또는 크림일 수 있다. 그리고, 실리콘 또는 실라스틱을 함유할 수 있다. 기질은 또한, 실크, 목화, 또는 울과 같은 천연섬유를 함유할 수도 있다.

그리고, 기질은 이식가능한 의료장치일 수 있다. 예를 들어, 스텐트(예를 들어, 관상동맥 스텐트와 같은 관상 스텐트; 기관내 스텐트 또는 비 스텐트와 같은 기도 스텐트; 담도배액관 또는 췌관 스텐트와 같은 위장관 스텐트; 또는 요관 스텐트와 같은 비뇨 스텐트) 또는 수술용 봉합사(예를 들어, 브레이드 실크, 크로믹 거트, 나일론, 플라스틱 또는 금속 봉합) 또는 수술용 클립(예를 들어, 동맥 클립)일 수 있다. 기질은 예를 들어, 인공 힙, 인공 힙관절, 인공 무릎, 인공 무릎 관절, 인공 어깨, 인공 어깨 관절, 인공 손가락 또는 발가락 관절, 뼈 플레이트, 뼈 도웰, 뼈 비-연합 이식, 추간 디스크 이식, 뼈 시멘트, 또는 뼈 시멘트 스페이서일 수 있다. 또한, 동맥-정맥 션트, 이식가능한 와이어, 페이스메이커, 인공 심장, 심장보조장치, 인공 이식, 이식가능한 세동제거기, 척수자극기, 중추신경계 자극기 또는 말초신경 이식기일 수도 있다. 다른 기질들은 치과용 보철 또는 치과용 크라운들이다.

다른 구체예에서, 기질은 대형 용기 색전 필터장치 또는 케이지, 경피 장치, 피부 또는 점막하 패치 또는 이식용 약물전달장치일 수 있다. 기질은 또한, 대형 혈관 이식편일 수 있으며, 이 혈관은 예를 들어, 경동맥, 고동맥, 또는 대동맥이다. 그리고, 기질은 피하 이식, 각막 이식, 안구내 렌즈 또는 콘택트 렌즈일 수 있다.

기질은 시트, 비드, 메쉬, 분말 입자, 스레드, 비드, 또는 섬유의 형태일 수 있다. 또한, 고형, 반-고형, 또는 젤라틴성 물질이거나, 이를 포함할 수 있다.

기질은 FcγR을 발현하는 세포일 수도 있다. 바람직하게는, 기질은 혈소판이다.

본 발명에 사용가능한 폴리머는 특히 체내로 장치를 삽입 또는 이식하는 동안 생체안정성, 생체적합성이고, 신체 조직이 자극되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

Fc 제제들은 여러 방법들로 기질상에 코팅(즉, 고정 또는 안정화)될 수 있다. 예를 들면, 이들은 소수성 상호반응에 의해 부착되는 기질의 표면상에 직접 코팅될 수 있다. 이하에는 폴리머들의 용도를 포함하는 몇가지 다른 방법론들((a)-(e))이 설명되어 있다:

(a) Fc 제제는 이식가능한 합성물질의 표면상에 적층되는 혼합성 폴리머 혼합물과 혼합되어, Fc 제제를 안정화시킨다. 폴리머 혼합물을 제조하기 위해 당 분야에서 관례대로 사용되는 모노머들로는: PLMA[폴리(라우릴 메타크릴레이트)]; PEG[폴리에틸렌 글리콜], PEO[폴리에틸렌 옥사이드]; 알킬 기능화 메타크릴레이트 폴리머 PMMA, PEMA, PPMA, 및 PBMA; 이타코네이트; 퓨마레이트; 및 스티레닉스가 포함된다.

(b) 폴리머 언더코트층 또는 나노미터 크기 필름이 기질 표면에 부착된후, Fc 제제가 폴리머 언더코트 층 또는 나노미터 크기 필름에 부착되어, F 제제를 안정화시킨다.

(c) 폴리머 모노머의 박막이 이식가능한 기재표면에 적용된후, 모노머가 중합된다. 상기 모노머들의 예로는, 메테인, 테트라플루오로에틸렌, 벤젠, 메테인올, 에틸렌 옥사이드, 테트라글라임, 아크릴산, 알릴아민, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, N-비닐 파이롤리돈 및 머캅토에테인올이 포함된다. 그후, Fc 제제는 얻어진 모노머에 부착된다.

(d) 기질은 Fc 제제에 부착하는 단백질 A 또는 알부민과 같은 단백질에 의해 코팅되며, 그럼으로써 기질의 표면에 Fc를 안정화시킨다.

(e) Fc 제제는 이식가능한 합성물질에 결합하는 소수성 아미노산의 사슬에 의해 태그될 수 있으며, 안정화된 Fc를 균일하게 배향시킨다.

본 발명의 방법은 어느 동물 종에나 적용될 수 있으며, Fc 제제들의 IgG-유도성 부분들이 제조되는 IgG 분자들은 동물 종으로부터 유도될 수 있다. 본래, 관련 동물 종들은 IgG 또는 IgG-유사 분자들이 발생하는 종이다. 일반적으로, 방법들이 적용되는 종 및 본 방법에 사용되는 Fc 제제들의 IgG-유도된 부분들로부터의 종은 동일하다. 그러나, 이들은 반드시 같은 것은 아니다. 관련 동물 종들은 포유류인 것이 바람직하며, 이들은 제한없이 인간, 비-인간 영장류(예를 들면, 원숭이, 비비, 및 침팬지), 말, 소 동물(예를 들면, 황소(bull), 암소, 또는 황소(ox)), 돼지, 염소, 양, 개, 고양이, 토끼, 게르빌루스쥐, 햄스터, 쥐, 및 마우스를 포함한다. 비-포유류 종들은 예를 들어, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 및 오리) 및 어류를 포함한다.

용어 "치료하는", "치료" 및 "예방"은 스트라도머에 대하여 상기 설명한 바와 같이 고정된 Fc를 사용하여 같은 의미를 가진다.

고정된 Fc가 Fc 제제들에 의해 코팅된 이식가능한 장치인 경우, 이들은 당 분야에 잘 알려진 방법들을 사용하여 관련 대상의 조직 또는 신체 표면 또는 관련 내부기관에 이식, 부착 또는 접착될 수 있다. 이들이 예를 들어, 현탁액, 분말들로 배합되는 경우, 이들은 스트트라도머들에 대하여 상기 설명된 바와 같이 배합 및 투여될 수 있다.

본 발명의 고정된 Fc 제제는 암, 울혈성 심부전(CHF), 혈관염, 주사코, 여드름, 습진, 심근염, 및 심근의 다른 질환들, 전신 홍반성 루푸스, 당뇨병, 척추병증, 활막섬유세포, 및 골수질(bone marrow stroma); 골손실; 파젯병, 비후성 골형성; 불용성 골감소증; 영양실조, 치주염, 고셔병, 랑게르한스 조직구증, 척수손상, 급성 감염성 관절염, 골연화증, 쿠싱 증후군, 단발성 섬유성이형성증, 다발성 섬유성이형성증, 치주 재건술, 및 골절, 골통증관리, 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염 및 다른 척추관절염; 이식거부, 및 바이러스성 감염을 포함하는 질환들을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

모든 자가면역 질병들은 부분적으로 또는 전반적으로 MDCMD이다. 본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "자가면역 질병"은 80개 이상의 만성 질병들의 다양한 그룹을 의미한다. 상기 모든 질병에서, 근본적인 문제점은 신체의 면역시스템이 자신의 신체를 공격한다는 점이다. 자가면역 질병들은 연결조직, 신경, 근육, 내분비 시스템, 피부, 혈액, 및 호흡 및 위장관 시스템들을 포함하는 모든 주요 신체시스템들에 영향을 미친다.

자가면역 질병 또는 질환은 특발성 혈소판감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판감소증, 후천성 면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파보바이러스 B19-관련 적혈구 무형성증, 후천성 항인자 VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란트병, 다발성 골수증 및 의미불명 모노클론 감마병증, 패혈증, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 무형성증, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 신생아 용혈병, 면역-매개 호중구감소증, 혈소판 수혈 불응증, 신생아, 수혈후 자반증, 용혈성 요독 증후군, 전신 혈관염, 혈전성 혈소판감소증 자반증, 또는 에반스 증후군을 포함하지만 이에 제한되지 않는 혈액면역학적 프로세스이다.

자가면역 질병 또는 질환은 겔랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병, 파라프로테인성 IgM 탈수초성 다발성 신경병증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 중증근무력증, 다초점성 운동신경병증, 항-/GMI와 연관된 하위운동신경 증후군, 탈수초증, 다발성 경화증 및 시신경염, 강직인간증후군, 항-Yo 항체들에 의한 부종양성 소뇌변성, 신생물딸림뇌척수염, 항-Hu 항체들에 의한 감각신경병, 뇌전증, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프종 바이러스-1과 특히 연관된 척수병증, 자가면역 당뇨병성 신경병증, 또는 급성 특발성 자율신경이상 신경병증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경면역학적 프로세스이다.

자가면역 질병 또는 질환은 가와사키병, 류마티스 관절염, 펠티증후군, ANCA-양성 혈관염, 자발적 다발성근염, 피부근염, 항인지질 증후군, 습관성 자연유산, 전신 홍반성 루푸스, 전신성 소아특발성 관절염, 레이노병, CREST 증후군, 또는 포도막염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 류마티스 질병 프로세스이다.

자가면역 질병 또는 질환은 중독성 표피융해, 괴저, 육아종, 심상성 천포창, 물집유사 천포창, 및 낙엽상 천포창을 포함하는 자가면역 피부 수포성 질병들, 백반증, 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군, 피부경화증, 확산 및 제한된 피부전신경화증, 또는 아토피피부염(특히, 스테로이드 의존성)을 포함하는 전신경화증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 피부면역학적 질병 프로세스이다.

자가면역 질병 또는 질환은 봉입체 근염, 괴사성 근막염, 염증성 근육병, 근염, 항-데코린(BJ 항원) 근육병, 방종양성 괴사성 근육병증, X-결합 공포성 근육병증, 페니실아민-유도성 다발성근염, 죽상경화증, 관상동맥 질병, 또는 심근병증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근골격 면역 질병 프로세스이다.

자가면역 질병 또는 질환은 악성 빈혈, 자가면역 만성 활성 간염, 1차 담즙간경병증, 셀리악병, 포진성 피부염, 잠복성 간경병증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플병, 궤양성 대장염, 또는 원발성 경화성 담관염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 위장성 면역학적 질병 프로세스이다.

자가면역 질병 또는 질환은 이식편대 숙주반응, 항체-매개 이식편 거부반응, 후-뼈 골수이식거부, 감염후 질병 염증, 림프종, 백혈병, 신생물, 천식, 항-베타 세포 항체들에 의한 타입 1 당뇨병, 스조그렌 증후군, 혼합연결성 조직질병, 애디슨병, 보그트-고야나기-하라다 증후군, 막성증식성 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 마이크로다발성 동맥염, 처그-스트라우스 증후군, 결절성 다발동맥염 또는 다장기 기능부전일 수도 있다.

본 명세서에서 "암"은 조절되지 않은 세포성장에 의해 특징화된 포유류내 생리적 질환을 의미 또는 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골육종, 혈관육종, 혈관외벽육종, 림프관육종, 림프관내분비육종(lymphangioendotheliosarcoma), 평활근육종, 횡문근육종, 섬유육종, 혼합육종, 연골육종 포함), 파골세포종, 신경내분비 종양, 중피종, 척삭종, 윤활막종, 신경초종, 수막종, 생암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프 종양이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특별한 예로는 편평상피세포암(예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평세포암을 포함하는 폐암, 소세포 폐암종, 복막암, 간세포성 암, 위암(gastrointestinal cancer)을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간장암, 선암, 음경암, 고환암, 식도암, 담도암, 유잉종양, 기저세포암, 선암, 한선암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질암, 기관지원성 암종, 신세포암종, 간암, 담도암종, 융모막암종, 정상피종, 배아암종, 윌름스 종양, 고환종양, 폐암, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수증, 발덴스트롬 마이크로불린혈증, 골수형성이상질병, 중쇄 질병, 신경내분비 종양, 신경초종, 및 다른 암종, 머리 및 목암, 성숙된 AML, 분화없는 AML, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구 백혈성 및 급성 단핵구성 백혈병을 포함하는 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 만성골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수증식성 질환과 같은 골수종 종양, 중추신경계의 종양, 예를 들면 뇌종양(신경교종, 신경아세포종, 성상세포종, 수모세포종, 상의세포종, 및 망막모세포종), 고형종양(비인두암, 기저세포암, 췌장암, 담도암, 카포시육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 1차성 간암 또는 자궁내막암, 혈관계 종양(혈관육종 및 혈관주위세포종), 혈액종양 및 종양-유사 질환들, 예를 들면 호지킨 림프종; 비-호지킨 림프종(버키트 림프종, 소림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 외투세포 림프종, 소포림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 모발상세포 백혈병 및 림프형질세포 백혈병), B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종을 포함하는 림프구 전구세포의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대과립 림프구성 백혈병을 포함하는 성숙 T 및 NK 세포들의 종양, 골용해성 골암, 및 골전이가 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 것으로서, "단핵구-유도성 세포매개 질병(MDCMD)이 발병할 위험에 있는" 대상은 MDCMD될 수 있는 조건에 노출되거나, MDCMD를 발병할 유전적 성향, 즉 MDCMD를 발병할 성향을 갖는 대상이다. "MDCMD를 가질 의심을 받는" 대상은 MDCMD의 한가지 이상의 증상들을 갖는 대상이다. 위로부터, "MDCMD를 발병할 위험이 있는" 대상도 "MDCMD를 가질 위험이 있는" 대상도 모두 주요 관심의 종들 안에 있는 모든 개체가 아니라는 것이 분명해질 것이다.

상기 방법들 중 어느 하나에서, MDCMC는 기질에 의해 야기되는 것일 수 있으며, Fc 제제는 MDCMC를 예방 또는 개선하도록 한다.

면역학적 분석에 있어서의 용도

본 명세서에 개시된 면역학적으로 활성인 생체모방물들은 면역학적으로 활성인 생체모방물들이 조절되기 위해 디자인된 면역세포 기능들을 시험하기 위한 면역학적 분석법을 수행하게 위해 사용된다.

저친화도 Fcγ 수용체 경로들을 통한 신호법에는 세포표면상의 수용체 응집 및 가교가 필요하다. 이러한 응집 및 가교 변수들은 반응세포들의 표면상에서 Fc 부분과 저친화도 FcγR들 사이의 수반되는 상호작용에 의해 항원특이성 타겟에 대한 Fab 결합을 통해 충족되는 것으로 상정된다. 본 문맥에서, 항체들은 2개의 구별되는 경로들을 통해 세포 반응들을 불러일으키는 잠재성을 가진다: 1. 에피토프 특이적 타겟과의 Fab 상호작용/에 의한 차단 및 2. FcγR과의 Fc 상호작용. 이러한 지식에도 불구하고, 생체내에서 사용되는 모노클론 항체들을 사용한 대부분의 치료적 연구들의 현 조절들은 관찰된 기능적인 효과들에 대한 기여자로서 Fc:Fcγ 수용체 상호작용들의 잠재성을 적당하게 다루지 않는다. 교략 변수들로서 Fc:FcR 상호작용들을 제거하기 위해, 현재 다중 전략들이 사용되고 있다. 예를 들어, 일부 연구들은 Fc 부분이 없지만, 에피토프 특이성을 유지하는 Scv(단일쇄 가변 부분들) 또는 Fab 단편들을 사용한다. 이러한 접근법들은 신호표시를 유도하기 위한 이들 제제들 및 이들의 제한된 포텐셜의 짧은 반감기에 의해 제한된다. 다른 연구들은 Fc 단편에 융합된 리간드 또는 수용체로 조성되는 융합 단백질들을 사용한다. 상기 타입의 접근법들이 수용체 리간드 상효작용에 의해 관찰된 것으로부터 Fab 특이성 효과를 구분짓는 것을 도와주는 반면, 이들은 Fc 매개된 효과들에 대하여 효과적으로 조절하지 않는다. 동물모델에서 항체기본 치료법을 평가하는 것은 무관한 Fab 결합부위를 갖는 아이소타입 대조군 항체들을 사용할 수도 있다. 이러한 선택을 위한 근거는 이들의 Fab 결합특이성 또는 친화도와 무관한 같은 아이소타입의 항체들 사이의 추정되는 기능적인 유사성에 기초하고 있다. 그러나, 무관한 아이소타입 대조군들을 사용하는 것은 여러가지 본질적인 단점들을 가진다:

1. 상기 항체들의 Fab 단편들이 리간드 또는 항원성 에피토프에 결합할 수 없다면, Fcγ 수용체 가교의 부재때문에 저친화도 FcR 상호작용을 통해 Fc 단편들을 신호표시를 자극하지 않을 것같다. 그러므로, 실험용 항체들과 대조군 항체들 사이의 관찰된 기능적인 차이점들은 FcγR를 가교하는 수단이 없는 에피토프 특이적 타겟과의 Fab 상호작용에 정확하게 기여될 수 없다.

2. 모 항체와 상이한 당사슬 또는 다른 상대비율의 각 당사슬을 생성하는 세포내에서 이러한 아이소타입들이 생성된다면, Fab 친화도가 동일한 경우에도 저친화도 및 고친화도 FcR들에 대한 결합력은 변경될 것이다.

본 문제점을 극복하기 위한 완벽한 대조군이 없지만, 한가지 옵션은 실험항체에 의해 타겟팅된 에피토프의 발현수준에 비례하는 투여량으로 주어지고, 모항체와 같은 세포내에서 생성된 아이소타입 특이성 스트라도머들을 사용하는 것이다. 예를 들면, 쥐에서 생성된 에피토프-특이적 항체에 대한 적당한 대조군은 이펙터 세포들의 표면상에서 Fcγ 수용체를 응집시킬 수 있는 쥐 아이소타입-특이적 스트라도머이다.

일반적으로, 면역세포는 공지된 방법으로 면역세포의 활성을 조절하기에 유효한 양의 면역학적으로 활성인 생체모방물에 노출되며, 이러한 면역조절은 시험화합물이 면역조절활성과 유사한지를 측정하기 위해 시험 화합물 또는 분자와 비교된다.

다른 구체예에서, 열응집된 스트라도머 및 응집된 면역글로불린들은 당 분야에 통상의 지식을 가진 자들에게 설명되고 공지된 다양한 면역학적 분석법에서 실험실 대조군을 위한 제제로서 사용될 수 있다.

면역학적 분석법은 시험관내 분석법 또는 생체내 분석법이며, 종-적합 또는 종-부적합 스트라도머를 사용한 인간 또는 비-인간 면역세포들을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 면역학적 분석법은 면역세포의 활성을 조절하기에 효과적인 양의 면역학적으로 활성인 생체모방물을 사용하고, 그 조절을 시험화합물에 의해 면역세포의 조절과 비교함으로써 수행된다. 스트라도머는 면역학적 효과를 위해 다른 화합물들을 시험하는 단계를 포함하는 분석법에서 양성 대조군 제제의 기능을 제공할 수 있다. 이 분석법은 혼합림프구 반응을 사용하는 것과 같이 수용체 발현수준, 사이토킨 방출 및 기능을 변화시킴으로써 측정되는 이펙터 세포 Fcγ 수용체결합 및 기능적인 반응을 위한 스트라도머와 주된 모노클론 항체의 효과를 비교할 수 있다. 이 방법에서, (Fab가 없는) 스트라도머가 부분적으로 모노클론 항체와 유사한 반응을 생성한다면, 모노클론 항체 효과는 부분적으로, 그의 Fab의 특이성으로 인한 것이 아니고, 이펙터 세포상에서 1개 이상의 Fcγ 수용체를 결합 및 가교시키는 일반적인 효과로 인한 것이다.

종-특이적 및 아이소타입-특이적 항체의 생물학적 활성이 종-특이적 및 아이소타입-특이적 스트라도머에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 복제된다면, Fc-Fcγ 수용체 활성이 종-특이적 및 아이소타입-특이적 스트라도머에 기여할 수 있는 관찰된 생물학적 활성의 일부의 이유가 된다는 것이 분명하다. 따라서, 종-특이적 및 아이소타입-특이적 스트라도머들은 관찰된 생물학적 활성이 시험항체의 Fab 부분에, 또는 1개 이상의 Fcγ 수용체를 가교하고 결합하는 분자의 Fc 부분의 비특이적 효과에 기여할 수 있는 지의 여부와 정도를 측정하기 위해 잠재적인 치료적 항체들을 평가하는데 사용가능하다.

본 발명의 스트라도머들은 유세포분석법, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 및 면역형광 분석법과 같은 항체기본 면역분석법동안 Fc 수용체들의 비-특이적 결합을 차단하는데 사용가능하다. 전통적으로, 상기와 같은 분석법에서, 시험항체와 같은 종의 비-특이적 항체들이 Fc 수용체들에 대한 비-특이적 결합을 차단하기 위해 사용된다. 본 발명의 스트라도머들은 각 스트라도머가 다중 FcR 결합부위들을 가지고, 따라서 훨씬 적은 스트라도머가 사용될 수 있다는 점에서 전통적인 Fc 차단 방법들 이상의 잇점을 제공한다. 또한, 본 발명의 스트라도머가 항체의 Fab 항원-결합 부분이 없기 때문에, 종 적합성 IgG 대조군에 의한 경우에서와 같이, 죽은 세포들에 대한 비 특이적 결합이 관찰되지 않을 것이다.

본 발명의 스트라도머들은 매우 높은 친화도를 갖는 내독소와 결합하는 것으로 밝혀졌다. 표준 내독소 제거킷 및 컬럼들은 스트라도머들로부터 단단히 결합된 내독소의 상당한 비율을 제거하는데 실패한다. 그러므로, 청구된 조성물들은 약제학적 및 실험실 제제들 모두에 있어서 내독소 제거를 위한 유용한 도구를 내독소용 결합 풀로서 작용하는데 사용할 수 있다. 이것은 내독소와 스트라도머들 사이에서 형성된 복합체들이 약제학적 제제 또는 조성물로부터 내독소를 효과적으로 제거하기에 충분히 높은 친화도를 가진다는 점에서 유리하다. 한 구체예에서, 내독소-스트라도머 복합체들은 여과에 의해 조성물로부터 제거된다.

본 명세서의 모든 문헌들은 이후 참고문헌으로서 전문통합된다.

실시예

실시예 1 스트라도머들의 제조 및 정제

G045/M045 및 G051의 안정적인 발현을 위해 HEK293F 세포들(Invitrogen, Carlsbad, CA) 또 중국 햄스터 난소세포들(CHO)이 사용된다. HEK293F 또는 CHO 세포들은 단백질 발현의 규모증가를 위한 현탁액에서 배양된다.

종래 스트라도머들의 G045c(서열번호:4), G045old(서열번호:7) G051(서열번호:18), G019(서열번호: 8), G028(서열번호:9), G046(서열번호: 10), G075(서열번호: 20), G076(서열번호: 21), G096(서열번호: 28), G098(서열번호: 24), G089(서열번호: 27), 또는 대응 동물 서열들을 코드화하는 유전자들은 G045 및 G051의 고수준 발현을 용이하게 하기 위해 CMV 프로모터의 전사조절하에 Invitrogen(Carlsbad, CA)로부터의 pcDNA3.3과 같은 네오마이신 내성유전자를 함유하는 벡터로 클로닝되었다. 내독소 유리 플라스미드 DNA 분리 킷(Nucleobond,Macherey-Nagel)을 사용하여, 세균 배양액으로부터 형질감염을 위한 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 코드화하는 G045c/G045old 및 G051은 제한효소로 선형화되고, 293-F 세포 또는 CHO 세포들로 형질감염되었다. 형질감염 후, G045c, G045old 또는 G051을 발현하는 양성 세포들을 제네티신/G418에 의해 선택하여, 형질감염된 세포들의 풀을 얻었다. 클론 세포주를 얻기 위해, 안정적으로 형질감염된 세포들의 풀을 웰당 1-2개의 세포들로 96웰로 희석하여, 이로부터 안정적인 세포주의 단일 세포클론들을 얻었다. 단일 세포클론들은 단백질 발현을 위해 ELISA에 의해 선별하였다. 단일 세포클론들은 배양되어, G045c, G045old, G051, G019, G028, G046, G075, G076, G096, G098, 또는 G089, 단백질이 배지로부터 분비단백질로서 수확된다.

일시적인 형질감염에 의해 G045c, G045old, G051, G019, G028, G046, G075, G076, G096, G098, 또는 G089 단백질을 제조하기 위해, 단백질의 고수준 발현을 확실하게 하는 CMV 프로모터의 조절하에 G045c, G045old, G051, G019, G028, G046, G075, G076, G096, G098, 또는 G089 단백질들을 코드화하는 DNA에 의해 HEK293 세포들 또는 CHO 세포들을 형질감염시켰다. 형질감염은 여러개의 상업용으로 사용가능한 형질감염제제 중 하나에 의해 실시하였다. 형질감염후 4-5일 후 세포배양액 배지로부터, G045c, G045old, G051, G019, G028, G046, G075, G076, G096, G098, 또는 G089 분비단백질을 수확한다.

일시적으로 형질감염된 세포들 또는 안정적인 세포주들로부터의 세포 배양배지를 0.22um 필터를 사용하여 여과하고, 1부피의 결합버퍼(20mM 인산나트륨 pH7.2+150mM NaCl)에 의해 pH 7.2로 조정하고, AKTAXpress 정제 시스템을 사용하여 HiTrap Mabselect 단백질 A 친화도 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (GE life sciences) 0.1M 시트르산나트륨 pH 3.3에서 용출한 후, 버퍼 교환을 위해 Hiprep 26/20 탈염 컬럼상에서 단백질을 정제한다.

추가로 정제하기 위해, 50mM Tris-HCL pH 7.5+150mM NaCl에서 HiLoad Superdex 200 겔여과 컬럼(GE Lifesciences)상에서 겔여과에 의해 G045c, G045old, G051, G019, G028, G046, G075, G076, G096, G098, 또는 G089 단백질을 정제하고, Mono S 이온-교환컬럼(GE Lifesciences) 상에서 정제한다. 0-1M NaCl 구배를 갖는 20mM MES 버퍼 pH 6에서 이온-교환 정제를 실시한다. 크로마토그래피 후에 그 단백질은 투석에 의하여 PBS에 맞추어 조정된다. 얻어진 G045c 스트라도머의 모식도는 도 1에 도시되어 있다.

얻어진 G045c 단백질의 다중화 용량을 시험하기 위해, 상기 방법에 의해 생성된 같은 농도의 G045c, 및 WO 2008/151088에 이미 개시된 방법에 의해 생성된, 및 외래 클로닝서열을 함유하는 G045old를 함유하는 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 진행하였다. 놀랍게도, 외래 단편들을 제거함으로써 G045old와 비교하여, G045c에서 다중화가 극적으로 증가하였으며, G045c는 G045old와 비교하여 매우 높은 농도의 고차원 멀티머들을 나타낸다(도 2A 참조).

Gel-DocIT 이미징 시스템을 사용하여, G045old 대 G045c의 멀티머 형성을 분석하였다. 겔 그림의 밀도스캔후, 각 겔 밴드내 단백질 양을 평가하였다. 놀랍게도, G045old 시료내 멀티머 형성이 약 27.9%인 것으로 추정된 반면, 자연적으로 결합된 스트라도머들을 생성하기 위해 외래 단편들을 제거하면 G045c 시료내 멀티머 형성이 매우 높아지고, 전체 단백질의 약 73.8%인 것으로 추정되었다(도 2b 참조).

실시예 2: 관절염의 마우스 모델에서 M045old과 비교되는 M045c의 개선된 효능

콜라겐 유도성 관절염에서 M045old의 효능과 비교되는 M045c의 효능을 평가하였다. 0일 및 21일에, DBA1/J 마우스를 불완전 프로인드 보조제(Sigma, Cat #5506)에 의해 유화된 4mg/ml 용액과 함께 타입 II 소 콜라겐(Chondrex, Inc., Cat. 20021)으로 면역화하였다. 마우스를 매주 중량을 재고, 관절염 징후에 대하여 매일 점수매겼다. 각 발을 점수매기고, 4개의 점수들 모두의 합을 관절염지수(Arthritic Index(AI))로 기록하였다. 최대 가능한 AI는 하기와 같이 16이었다: 0 = 볼수있는 관절염 효과가 없음, 1 = 한 숫자의 부종 및/또는 홍반, 2 = 2개의 관절의 부종 및/또는 홍반, 3 = 2개 이상의 관절들의 부종 및/또는 홍반, 4 = 관절의 팔 변형 및 관절유착증을 포함한 숫자 및 전체 팔의 심각한 관절염. 22일에서 출발하여, (0일 치료)콜라겐 면역화 마우스 10마리를 평균 AI(3.3)에 기초한 치료군들로 분류하고, 10마리의 비-질병 마우스들을 비-질병군으로서 지정했다. 14일 치료하고, 마우스를 안락사시킨후, 관절염 지수를 측정했다. 양성 대조군 그룹에 대하여, 10마리의 마우스들을 평균 AI(3.3)에 기초하여 치료군으로 분류하고, 매일 10ml/kg 프레드니솔론을 경구투여했다. M045c 또는 M045old로 치료한 그룹에 대하여, 20마리의 마우스를 평균 AI(3.3)에 기초하여 치료군으로 분류하고, 4일마다(0일, 4일, 8일 및 12일) M045c 또는 M045old(17.4mg/kg) 400μg을 투여했다.

시험된 모든 시간지점에서 M045old 치료된 마우스와 비교하여, M045c로 치료한 마우스는 통계적으로 덜 심각한 질병을 가졌다(도 3 참조). 그러므로, 선도 서열과 IgG1 Fc 사이의 16개의 아미노산 클로닝 단편을 제거함으로써, 멀티머 형성이 커질 뿐만 아니라 염증성 질병에 대한 효능이 증가되었다.

콜라겐 유도된 관절염에서 M045c, M019, M028, M046 및 M051의 효능을 유사하게 평가하고, 프레드니솔론의 효능과 비교하였다. CIA는 상기 설명한 바와 같이 마우스에서 유도되고, 1주일에 2회 정맥내로 M045, M019, M028, M046 또는 M051 400μg 또는 매일 프레디솔론 10mg/kg으로 CIA 유도한후 22일째에 마우스를 치료하여, 상기와 같이 AI에 대하여 2주동안 점수매겼다. 시험된 스트라도머들 각각을 받은 마우스들은 통계적으로 PBS 치료된 대조군들보다 덜 심각한 질병을 가졌다(도 9 참조).

실시예 3: 관절염의 마우스 모델에서 M045 및 프레드니솔론의 상승효과

콜라겐 유도성 관절염 모델에서 M045c의 효능을 저용량 프레드니솔론과 조합하여 평가하였다. 0일 및 21일에, DBA1/J 마우스를 불완전 프로인드 보조제(Sigma, Cat #5506)에 의해 유화된 4mg/ml 용액과 함께 타입 II 소 콜라겐(Chondrex, Inc., Cat. 20021)으로 면역화하였다. 마우스를 매주 중량을 재고, 관절염 징후에 대하여 매일 점수매겼다. 각 발을 점수매기고, 4개의 점수들 모두의 합을 관절염지수(Arthritic Index(AI))로 기록하였다. 최대 가능한 AI는 하기와 같이 16이었다: 0 = 볼수있는 관절염 효과가 없음, 1 = 한 숫자의 부종 및/또는 홍반, 2 = 2개의 관절의 부종 및/또는 홍반, 3 = 2개 이상의 관절들의 부종 및/또는 홍반, 4 = 관절의 팔 변형 및 관절유착증을 포함한 숫자 및 전체 팔의 심각한 관절염. 22일에서 출발하여, (0일 치료)콜라겐 면역화 마우스 10마리를 평균 AI(3.3)에 기초한 치료군들로 분류하고, 10마리의 비-질병 마우스들을 비-질병군으로서 지정했다. 14일 치료하고, 마우스를 안락사시킨후, 관절염 지수를 측정했다. 양성 대조군 그룹에 대하여, 10마리의 마우스들을 평균 AI(3.3)에 기초하여 치료군으로 분류하고, 매일 10ml/kg 프레드니솔론을 경구투여했다. M045c로 치료한 그룹에 대하여, 10마리의 마우스를 평균 AI(3.3)에 기초하여 치료군으로 분류하고, 4일마다(0일, 4일, 8일 및 12일) M045c(17.4mg/kg) 400μg을 투여했다. 프레드니솔론과 M045c 사이의 상승을 측정하기 위해, 한 그룹을 매일 저용량 프레드니솔론 2mg/kg으로 치료하고, 한 그룹을 매 4일마다 저용량 M045c 200μg/용량으로 치료하고, 한 그룹을 매 4일마다 저용량 프레드니솔론 2mg/kg 플러스 저용량 M045c 200μg/용량 투여에 의해 투여하였다.

고용량 프레드니솔론(10mg/kg)이 콜라겐 유도성 관절염을 경감시키는데 있어서 단일 제제로서 효과적인 반면, 저용량 프레드니솔론(2mg/kg)이 아주 조금만 효과적이었다. 또한, 저용량 M045c(200μg/용량 또는 9.1mg/kg)는 비치료 대조군에 비해, 감소하는 질병 심각성에 효과없었다. 그러나, 놀랍게도 저용량 M045c와 조합된 저용량 프레드니솔론로 치료된 마우스는 프레드니솔란 및 M045c 단일 치료군과 비교했을때 질병 심각도를 (첨가제 이상) 상승적인 감소를 나타냈다(도 4 참조).

실시예 4: IgG2A, M045, M046, M028, M019 및 G051의 마우스 수용체에 대한 결합 분석

단백질 크기에 대하여 보상하기 위해, 아민 고정화를 사용하여 FcγRIIIA, FcγRIIB 및 SIGN-R1 수용체들을 각각 CM4 칩으로, 560, 500, 및 1000RU로 고정하였다.

M045c (서열번호:11), M046 (서열번호:15), M019 (서열번호:13) 및 M028 (서열번호:14)를 HBSS-EP 러닝 버퍼에서 500mM으로부터 1.9nM으로 연속희석하고, 20ul/분에서 180초간 주사하였다. 100ul/분에서 1M MgCl을 10초간 주사하여, 재생을 이룬 후, 러닝 버퍼에 의해 간단하게 세척하였다. T100 평가 소프트웨어를 사용하여 KD를 계산하였다.

마우스 FcγR3A 및 FcγR2b에 대하여, 시험된 스트라도머들 각각과 비교함에 따라, 저 낮은 친화도 및 더 빠른 해리속도를 갖는 마우스 IgG2a Fc 호모다이머들이 결합한다. 마우스 SIGN-R1에 대하여, 마우스 IgG2a Fc 호모다이머들은 눈에 띄게 결합하지 않는 반면, 선택적인 스트라도머들은 다양한 정도로 연합하고, 느리게 해리한다(도 5 참조).

본 모델에서 M045c 프랙션들을 평가하였다. AktaXpress 단백질 정제 시스템 및 GE HiLoad 16/60 Superdex 200 prep 등급 컬럼을 사용하여, M045F를 첫번째로 겔분류하였다. 프랙션 1(M045 F1)은 크기에 따라 멀티머들을 분류한후, M045 멀티머들의 고분자량 성분을 함유한다. M045 F2는 저분자량을 갖는 멀티머 성분이고, M045 F3는 스트라도머의 호모다이머 프랙션이다. 마우스 FcγRIIIa, FcγRIIb(도 6a 참조), 및 SIGN-R1(도 6b 참조)에 대하여, 다른 프랙션들 또는 IgG2a Fc 대조군과 비교하여, M045 F1에 대하여 느린 해리속도와 함께 결합 친화도가 가장 높다.

G051의 결합을 평가하기 위해, 제조사의 지시(Data Acquisition User Guide 6.4 ForteBio)에 따라 Octet 96 Red 장비(ForteBio, Menlo Park CA) 상에서 바이오레이어 간섭계 분석법을 수행하였다. 마우스 단백질의 결합 분석을 위해, His-태그된 마우스 FcγRII(R&D 시스템 cat# 1460-CD) 및 FcγRIII(R&D 시스템 cat#1960)을 각각 1X 동적 분석 버퍼(ForteBio cat #18-5032)에서 10ug/ml에서 항-펜타-His Biosensors(ForteBio cat # 18-5077) 상에서 별도로 로딩했다. 인간 단백질의 결합 분석을 위해, His-태그된 인간 FcγRIIb(R&D 시스템 cat# 1875-CD) 및 FcγRIIIa(R&D 시스템 cat# 4325-Fc)을 각각 1X 동적 분석 버퍼(ForteBio cat #18-5032)에서 10ug/ml에서 항-펜타-His Biosensors(ForteBio cat # 18-5077) 상에서 별도로 로딩했다. 센서 팁 로딩후, 1X 동적 버퍼에서 (농도범위에 걸쳐) 모노머 프랙션 또는 (농도범위에 걸쳐) 멀티머 프랙션을 제조하기 위해 팁들을 전달시킴으로써 단백질 해리를 평가하고, 1X 동적 버퍼로 센서 팁을 전달함으로써 해리를 측정하였다. 분석은 설명한 바와 같다(Data Analysis User Guide 6.4ForteBio). 호모다이머에 50kD의 MW를 할당하고, 다른 모든 단백질 제조물들에 150kD를 할당하여, 상기 설명한 바와 같이 분석법을 표준화하였다.

표 2는 큰 친화도 및 애비더티를 갖는 M051의 큰 스트라도머 멀티머 프랙션들이 호모다이머 프랙션보다 느린 해리 및 큰 친화도 및 애비더티와 차례로 결합하는 작은 멀티머 프랙션들보다 낮은 해리를 나타낸다.

시료	KD	Kon	Kdis	Rmax	R2	프랙션
M051	6.55E-9	8.53E+5	5.59E-3	0.394	0.987
M051 모노머	9.59E-7	7.24E+5	6.94E-1	0.373	0.985	2A11
M051 다이머	1.25E-8	1.45E+6	1.81E-2	0.4129	0.987	2H10
M051 트라이머	3.36E-9	1.28E+6	4.28E-3	0.5093	0.996	3E12
M051 테트라머	1.39E-9	1.56E+6	2.04E-3	0.567	0.996	3H4
M051 멀티머	1.77E-9	4.19E+6	1.15E-4	0.6237	0.998	4F4

G001(천연 IgG1 Fc)에 대한 G045 또는 G051의 결합 동력을 평가하기 위해, 위에서와 같이 Octet 96 Red Instrument 상에서 바이오레이어 간섭측정 분석법을 수행하였다. 인간 FcγRIIb, FcγRIIIa(모두 F 및 V 변이체들), 사이노몰구스 FcγRIIIa, 사이노몰구스 FcγRIIIb 및 사이노몰구스 FcγRIII에 대하여 G045 및 G001의 결합력을 측정하였다. G045를 느린 해리속도를 갖는 매우 높은 결합 친화도를 가지며, G001에 비해 시험된 수용체들의 각각에 대한 애비더티를 입증한다(표 3 및 4 참조).

수용체	단백질	KD	kon	kdis	R max	R2
인간 FcγRIIb	G045	1.42E-9	7.99E+5	1.14E-3	0.7166	0.999
인간 FcγRIIIa (F)	G045	1.22E-9	6.20E+5	7.567E-4	0.7507	0.999
인간 FcγRIIIa (V)	G045	2.95E-10	6.07E+5	1.79E-4	0.9182	0.999
사이노몰구스 FcγRIIb	G045	1.19E-9	7.56E+5	8.81E-4	0.7125	0.999
사이노몰구스 FcγRIIIa	G045	2.58E-10	6.17E+5	1.59E-4	1.0356	0.999
마우스 FcγRIIb	G045	5.42E-10	1.21E+6	6.56E-4	0.4555	0.998
마우스 FcγRIII	G045	8.00E-10	1.03E+6	8.23E+4	0.519	0.998

수용체	단백질	KD	kon	kdis	R max	R2
인간 FcγRIIb	G001	1.31E-6	6.86E+5	8.99E-1	0.19	0.986
인간 FcγRIIIa (F)	G001	2.43E-6	1.11E+5	2.69E-1	0.383	0.990
인간 FcγRIIIa (V)	G001	1.14E-6	1.18E+5	1.35E-1	0.7265	0.995
사이노몰구스 FcγRIIb	G001	2.04E-6	3.94E+5	8.06E-1	0.3456	0.988
사이노몰구스 FcγRIIIa	G001	9.15E-7	1.24E-5	1.14E-1	0.837	0.995
마우스 FcγRII *	G001	1.51E-6	2.56E+5	3.87E-1	0.1173	0.963 *
마우스 FcγRIII *	G001	4.18E-6	1.18E+5	4.91E-1	0.1026	0.904 *

이와 유사하게, 인간 FcγRIIb 및 FcγRIIIa에 대한 G051 및 G001의 결합력을 측정하였다. G051은 G001에 비해 시험된 수용체들의 각각에 대하여 느린 해리 및 애비더티의 입증과 함께 매우 높은 결합친화도를 가진다(표 5 참조).

단백질	수용체	KD	Kon	Kdis	Rmax	R2
G001	FcgRIIb	2.99E-06	3.72E+05	1.11E+00	0.3152	0.986
G001	FcgRIIIa	6.77E-07	1.64E+05	1.11E-01	0.6535	0.991
G051	FcgRIIb	4.39E-08	7.10E+05	3.12E-02	0.2868	0.991
G051	FcgRIIIa	2.30E-08	2.83E+05	6.50E-03	0.886	0.996

실시예 5: 자연결합된 스트라도머 화합물들은 ITP의 치료/예방에 효과적이다.

특발성 혈소판감소성 자반증(ITP)에 있어서 스트라도머들의 효과를 평가하기 위해, ITP의 예방적 마우스 모델에 대하여 스트라도머들을 시험하였다. 혈소판 상에 인테그린 수용체들을 코팅하는 인테그린 항-IIb 항체를 마우스에 노출시킨후 저혈소판 계산들을 유도한다. 간단히, 8주된 C57BL/6 마우스(Charles River)를 1일에 스트라도머 또는 대조군으로 꼬리혈관주사하고, 혈액을 드로잉하고, 혈소판을 계산하였다. 2일째에 혈액 드로잉 및 혈소판 계산한 후, 혈소판 손실을 유도하기 위한 복강내 주사함으로써 투여된 200㎕의 인산완충 식염수내 2㎍의 항체의 농도로 주어진 MWReg30(BD Pharmingen cat #553847)로 마우스를 치료하였다. 혈소판 계산을 위한 혈액 드로잉 및 MWReg30 주사를 3일, 4일, 및 5일째에 계속하였다. IVIG 양성 대조군은 2일 내지 5일째에 매일 투여한다. 혈소판 계수는 Drew Scientific Hemavet 950 혈구계산기에 의해 수행한다. M045c 및 그의 프랙션들을 2일째에 정시에 투여한다. 꼬리혈관 닉킹(tail vein nicking)에 의해 혈액을 수집하고, 응고를 방지하기 위해 시트르산 버퍼와 혼합하였다.

M045c는 약물 비치료 ITP 대조군 및 IgG2a Fc 대조군 모두에 대하여 본 모델에서 매우 보호적이며, IVIG 예방요법 및 MWReg30 인설트를 받지 않은 마우스 모두와 대조적이다(도 7 참조). M045c 프랙션들은 실시예 4에 설명된 바에 따라 제조하였다. M045 프랙션 1은 약물 비치료 ITP 대조군에 대하여 본 모델에서 매우 보호적인 반면, M045 프랙션 3은 그렇지 않다.

실시예 6: 자연결합된 스트라도머 복합체와의 내독소 복합체 제거

내독소를 제거하기 위해, 내독소 결합 스트라도머를 용액에 혼합한 후, 관심의 단백질을 함유하는 내독소-함유 단백질 용액을 1부피의 결합 버퍼(20mM 인산나트륨 pH7.2+150mM NaCl)에 의해 pH 7.2로 조정할 것이다. 내독소를 제거하기 위해, 단백질을 함유하는 용액이 친화도 크로마토그래피 컬럼(HiTrap Mabselect protein A affinity column, GE Life Sciences)에 적용될 것이다. 스트라도머-결합 내독소를 친화도 컬럼에 결합하고, 정제된 내독소 유리 단백질을 플로우스루 프랙션에서 용출할 것이다.

내독소를 트랩하기 위해 스트라도머들을 사용하기 위한 대체법에서, 단백질 A 코팅된 마그네틱 비드들(New England BioLabs, MA)을 내독소 결합 스트라도머와 함께 내독소-함유 단백질 용액에 혼합할 것이며, 스트라도머 결합 내독소를 마그네틱 분리에 의해 제거할 것이다.

실시예 7: 면역학적 분석법에서 Fc 차단을 위한 자연결합 스트라도머 복합체의 용도

항체-기반 연구 도구들 및 임상 진단의 민감도 및 특이성을 개선시키는 것. 항체들의 연구 유용성 및 임상진단 유용성은 비특이적 결합에 의해 제한된다. 이는 면역세포들 및 종양들을 포함하는 세포들 상에서 고친화도 Fc 감마 수용체들 및 다른 Fc 결합 수용체들에 모노클론 또는 폴리클론 항체들의 Fc 부분을 결합시킴으로써, 또는 저친화도 Fc 감마 수용체에 항체로 코팅된 항체 응집체 또는 세포 응집체들을 결합시킴으로써 일어날 수 있다.

특이적 항-Fc 감마 수용체 항체들과의 Fc 감마 수용체 상호작용을 차단할 수 있는 스트라도머들의 능력을 입증하기 위해, 본 발명자들은 흐름 세포측정을 수행하고, 특정 세포들 상에 존재하는 것으로 알려진 FcγR에 대한 항-FcγR 항체 결합을 차단할 수 있는 능력에 있어서, IgG1 Fc의 호모다이머 모노머, G001과 함께 인간 스트라도머 G045c의 증가된 투여량을 비교하였다. 스트라도머들은 농도의존성 방법으로, IgG1 Fc 대조군에 대하여, FcγR에 결합하는 항-FcγR 항체의 결합을 효과적으로 차단하는 것으로 알려졌다(도 8 참조).

면역글로불린 Fc 부분들에 결합하는 다른 수용체들 및 Fc 감마 수용체들에 대하여 매우 높은 결합 친화도때문에, 스트라도머들은 특정 항-Fc 감마 수용체 모노클론 항체들에서도 결합 및 상호작용을 차단하는데 놀랍게 효과적이다. 그러므로, 스트라도머들은 연구도구 설정 및 임상진단 설정 모두에서 투여된 항체들의 비-특이적 항체결합을 감소시키기 위한 대조군 제제로서 사용가능하다.

실시예 8: 자연결합된 스트라도머 화합물들은 실험적 자가면역 신경염을 치료하는데 있어서 효과적이다.

IVIG의 경우와 알부민의 경우와 대조하여, 각 경우에 M045c 및 M051의 효능 평가는 실험적 자가면역 신경염(EAN) 쥐 모델에서 수행하였다. 설치류 EAN 모델들은 인간 급성 염증성 다발신경염의 널리 사용되는 동물 모델들이다. 간단히, 45마리의 루이스 쥐들을 전체 소 말초신경 수초로 면역화하고, 세 그룹으로 임의 추출하였다. 9일 또는 10일째에 일반적으로 시작하는 체중 손실인 임상적인 결손이 개시할때, 치료군당 15마리의 쥐들을 IVIg(1gm/1Kg 체중), M045(20mg/Kg) 또는 M051(17.5mg/Kg)으로 치료하거나, 또는 이틀 연속으로 2회의 투여 IV로서 모두 주어진 알부민에 의해 치료하였다. 모든 약물들은 꼬리 정맥 주사로 정맥내로 투여되었다.

EAN 쥐들을 임상적으로, 전기생리학적으로, 및 조직학적으로 평가하였다. 임상질병 심각도는 1일 임상적 등급 및 체중 변화에 의해 평가하였다. 전기생리학적 연구들은 화합물 근육작용 포텐셜(CMAP) 및 운동전도속도(MCV)의 진복을 조사하는 것을 포함한다. 질병 피크인 15일째에, 각 그룹에서 5마리의 쥐들을 희생시키고, 좌골신경들을 수집하고, 조직병리학적 변화를 분석하였다. 치료 효능은 IVIg 및 알부민군, 및 재조합 M045c 또는 M051과 알부민군 사이에서 비교되었다.

시험된 스트라도머 M045c를 수용한 쥐들은 알부민 치료된 대조군들보다 통계적으로 덜 심각한 질병을 가졌다(도 12 참조). 알부민으로 치료된 ENA 쥐들은 IVIg-치료된(15 중 1) 및 M045c-치료된 쥐(15 중 0)에 비해, 높은 치사율(15 중 4)을 나타내었다. M045c 및 IVIg 치료를 받은 동물들은 매우 적은 중요한 중량손실을 나타낸다. 알부민으로 치료된 것과 비교하여, IVIg 및 M045c 치료된 쥐에서 원위 및 근위 CMAP의 진폭 및 운동전도속도(MCV) 모두를 통계적으로 크게 개선시켰다. 알부민 치료된 쥐들은 IVIg 또는 M045c로 치료된 쥐들에 비하여, 좌골신경에 있어서 활성 축삭변성 및 심각한 축삭손실을 보여주었다. 따라서, 스트라도머 M045c는 IVIg의 투여량 중 약 2%에서, 임상 금 표준 IVIg에 의해 입증된 효능과 대조적으로, 알부민과 비교되는 치사율, 체중, 임상, 전기생물학적, 및 조직병리학적 효능을 입증하였다.

시험그룹당 11마리의 쥐들로 실시한 별도의 실험에서, 시험된 스트라도머 M051을 받은 쥐들은 알부민 시험된 대조군들보다 통계적으로 덜 심각한 질병을 가졌다(도 11 참조). 본 연구에서, 11마리중 7마리의 동물들이 M051 그룹에서 4마리에 비해 대조군(알부민)그룹에서 죽었다. IVIg 또는 M051을 수용한 쥐들은 알부민을 수용한 쥐 대조군들에 비해 크게 적은 중량손실을 입증하였다. IVIg 또는 M051을 수용한 쥐들은 알부민을 수용한 쥐 대조군과 비교하여, 임상점수가 크게 개선됨을 입증하였다. IVIg 또는 M051로 치료후 CMAP의 진폭 및 MCV 모두에서 통계적으로 크게 개선되었다. 따라서, 스트라도머 M051은 IVIg의 대략 2% 투여량에서 임상적인 금 표준 IVIg에 의해 입증된 효능과 비교가능한, 알부민과 비교하여 큰 치사율, 중량, 임상, 및 전기생리학적 효능을 입증했다.

실시예 9: Fc 돌연변이를 함유하는 자연결합 스트라도머 화합물들은 FcγR에 대한 개선된 결합을 나타내고, 관절염 쥐모델에서 치료하는데 효과적이다.

실시예 4에 설명된 바에 따라 Biacore 결합 분석에 의해, Fc 돌연변이-함유 스트라도머들, FcγRIIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIa에 대한 G075(서열번호: 20) 및 G076(서열번호: 21)의 결합을 수행하였다. G075는 FcγRIIIa에 대한 결합 증가 및 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 결합 감소를 나타낸 반면, G076은 FcγRIIIa에 대한 결합 감소 및 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 결합 증가를 나타냈다(도 10A 및 B 참조).

관절염 마우스 모델에서, 스트라도머 M075(서열번호: 22), M076(서열번호: 23) 및 M098(서열번호: 25)을 함유하는 Fc 돌연변이체의 효능 평가는 상기 실시예 3에서와 같이 수행한 바에 따라 측정하였다. Fc 돌연변이-함유 스트라도머들은 부형제 및 M045c와 비교하였다. M098 및 M075 모두 CIA의 진행을 억제하는데 크게 효과적이었던 반면, M076 스트라도머는 그렇지 않았다(도 13A 및 B 참조). 본 발명자들은 각 Fc-FcR 결합을 변경하는 것으로 알려지거나, 또는 상보의존성 세포독성을 변경하는 면역글로불린의 다른 돌연변이들이, IgG1 Fc를 포함하고 Fc 수용체에 다가 IgG1 Fc를 제공하는 스트라도머에 대하여 유사하게 상보적일 것이라고 기대한다.

SEQUENCE LISTING <110> Block, David S. Olson, Henrik <120> Fusion Proteins of Natural Human Protein Fragments to Create Orderly Multimerized Immunoglobulin Fc Compositions <130> GLIK-006/01US <150> US 61/368,465 <151> 2010-07-28 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 145 150 155 160 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys 245 250 255 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu 1 5 10 15 Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu 20 25 30 Ile Gly Glu Arg Gly His Gly Gly Gly 35 40 <210> 6 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ala Ala Asp Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Glu Pro Lys 1 5 10 15 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 20 25 30 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 7 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ala Ala Asp Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Glu Pro Lys 1 5 10 15 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 20 25 30 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 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Pro 260 <210> 22 <211> 266 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro 50 55 60 Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 65 70 75 80 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 85 90 95 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ala Thr Leu Arg Val Val Ser Ala 100 105 110 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 115 120 125 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro 145 150 155 160 Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val 165 170 175 Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly 180 185 190 Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp 195 200 205 Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp 210 215 220 Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His 225 230 235 240 Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Glu Arg 245 250 255 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 265 <210> 23 <211> 266 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 23 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro 50 55 60 Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 65 70 75 80 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 85 90 95 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Ala Val Val Ser Ala 100 105 110 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 115 120 125 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro 145 150 155 160 Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val 165 170 175 Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly 180 185 190 Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp 195 200 205 Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp 210 215 220 Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His 225 230 235 240 Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Glu Arg 245 250 255 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 265 <210> 24 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 145 150 155 160 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Pro Pro Gly 245 250 255 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 260 265 270 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 275 280 <210> 25 <211> 284 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 25 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro 50 55 60 Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 65 70 75 80 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 85 90 95 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ala Thr Leu Arg Val Val Ser Ala 100 105 110 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 115 120 125 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro 145 150 155 160 Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val 165 170 175 Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly 180 185 190 Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp 195 200 205 Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp 210 215 220 Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His 225 230 235 240 Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Gly Pro 245 250 255 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 260 265 270 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 275 280 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPP multimerization domain <400> 26 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30 <210> 27 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 145 150 155 160 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Pro Pro Gly 245 250 255 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 260 265 270 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 275 280 <210> 28 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 65 70 75 80 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 85 90 95 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 100 105 110 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 115 120 125 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 130 135 140 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 145 150 155 160 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 165 170 175 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 180 185 190 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 195 200 205 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 210 215 220 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 225 230 235 240 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 245 250 255 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 260 265 270 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 <210> 29 <211> 284 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 29 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro 50 55 60 Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 65 70 75 80 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 85 90 95 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala 100 105 110 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 115 120 125 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro 145 150 155 160 Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val 165 170 175 Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly 180 185 190 Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp 195 200 205 Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp 210 215 220 Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His 225 230 235 240 Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Gly Pro 245 250 255 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 260 265 270 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 275 280 <210> 30 <211> 283 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 30 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 35 40 45 Pro Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys 50 55 60 Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 65 70 75 80 Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr 85 90 95 Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser 100 105 110 Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His 115 120 125 Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile 130 135 140 Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 145 150 155 160 Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys 165 170 175 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 180 185 190 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 195 200 205 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 210 215 220 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 225 230 235 240 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 245 250 255 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 260 265 270 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 275 280

Claims

두 개 이상의 호모다이머 펩타이드를 포함하는 다중화된 화합물로, 각 호모다이머 펩타이드는 두 개의 모노머를 포함하고, 각 모노머는 서열번호: 4(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 21-264를 포함하는 것인 다중화된 화합물.
제 1 항에 있어서,
2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 호모다이머 펩타이드를 포함하는 것인 다중화된 화합물.
두 개 이상의 호모다이머 펩타이드를 포함하는 다중화된 화합물로, 각 호모다이머 펩타이드는 두 개의 모노머로 이루어지고, 각 모노머는 서열번호: 4(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 21-264를 포함하는 것인 다중화된 화합물.
제 1 항의 다중화된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물로, 조성물은 고차원 멀티머(higher order multimer)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
두 개 이상의 호모다이머 펩타이드를 포함하는 다중화된 화합물로, 각 호모다이머 펩타이드는 두 개의 모노머를 포함하고, 각 모노머는, 서열번호: 1(SEQ ID NO: 1)의 선도 서열에 상응하는 아미노산 잔기 1-20이 결핍된 서열번호: 4(SEQ ID NO:4)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 다중화된 화합물.
제 5 항에 있어서,
2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 호모다이머 펩타이드를 포함하는 것인 다중화된 화합물.
제 5 항의 다중화된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물로, 조성물은 고차원 멀티머를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
두 개 이상의 호모다이머 스트라도머 유닛을 포함하는 다중화된 화합물로, 각 호모다이머 스트라도머 유닛은 두 개의 스트라도머 유닛 모노머를 포함하고, 각 스트라도머 유닛 모노머는, 서열번호: 3(SEQ ID NO:3)의 아미노산 서열에, 서열번호: 2(SEQ ID NO:2)의 카복시 말단에서 직접 결합되는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 다중화된 화합물.
제 8 항에 있어서,
2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 호모다이머 스트라도머 유닛을 포함하는 것인 다중화된 화합물.
제 8 항의 다중화된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물로, 조성물은 고차원 멀티머를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
서열번호: 3(SEQ ID NO:3)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에, 서열번호: 2(SEQ ID NO:2)의 카복시 말단에서 직접 결합되는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 스트라도머 유닛 모노머.
서열번호: 4(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 21-264를 포함하는 스트라도머 유닛 모노머.
서열번호: 4(SEQ ID NO:4)의 스트라도머 유닛 모노머를 암호화하는 핵산.