JP2015227346A - 規則的に多量体化された免疫グロブリンＦｃ組成物を作製するための天然ヒトタンパク質断片の融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

【課題】新規化合物の提供。
【解決手段】本発明は、免疫グロブリンＦｃの一連の完全な組換え型多量体化形態に関し、該多量体化形態は、免疫細胞受容体に多価の免疫グロブリンＦｃを提示する。融合タンパク質は、ホモ二量体画分、およびストラドマーと呼ばれる高次多量体画分の両方として存在する。ホモ二量体の画分と比較して、精製された多量体ストラドマーは、Ｆｃ Ｒに対する、より高い親和性および結合活性、ならびに遅い解離を有し、疾患の治療および予防において有用である。本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と多量体化ドメインを直接結合させることにより、多量体化および生物活性の強化をもたらすことを実証する。
【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１１年７月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／３６８,４６５号に基づく優先権を主張する。
電子的に提出された文書ファイルの説明
電子的に提出された文書ファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：コンピューターで読み取り可能なフォーマットの配列表のコピー（ファイル名：ＧＬＩＫ＿００６＿０１ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日時：２０１１年７月２６日、ファイルサイズ６１キロバイト）。
本発明は、一般的には、免疫学、自己免疫、炎症、および腫瘍免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、天然に結合している免疫グロブリンＦｃ領域を含む生物学的に活性な生物模倣型分子、そのような生物模倣体を含む組成物、およびそのような生物模倣体の作製および使用方法に関する。
本発明はまた、リンパ球、ＮＫ細胞、単球由来の細胞、および単球由来の細胞と相互作用する免疫細胞を介した病理学的状態の治療および予防に関し、より詳細には、そのような治療および予防のための、結合したＩｇＧ Ｆｃ断片の安定化した機能的部分の使用に関する。
ヒト血漿由来の免疫グロブリン製品は、１９５０年代初期から、免疫不全症を治療するために使用されており、最近では、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療のために、より一般的に使用されている。
初期には、免疫グロブリン製品は、筋肉内注射により投与されていた。最近では、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）が使用されており、当初は、自己免疫疾患である特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の治療において有効であるとみられていた（Imbach P, Barandun S, d'Apuzzo V, et al: High-dose intravenous gammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood. Lancet 1981 Jun 6; 1(8232): 1228-31）。ヒトＩＶＩＧ（本明細書においては「ｈＩＶＩＧ」と呼ぶ）は、一般に９５％を超える無修飾ＩｇＧと、ごく少量かつ可変量の免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）または免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）を含むプールされたヒト血漿から製造される、無菌の、精製免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）生成物の製剤である（例えば、Rutter A, Luger TA: High-dose intravenous immunoglobulins: an approach to treat severe immune-mediated and autoimmune diseases of the skin. J Am Acad Dermatol 2001 Jun; 44(6): 1010-24を参照のこと）。現在、ｈＩＶＩＧの1つの最も一般的な臨床使用は、慢性炎症性脱髄性多発神経炎の治療におけるものである。
ｈＩＶＩＧが有効な臨床的治療であったが、ｈＩＶＩＧ治療に対しては、滅菌が不十分である可能性、ウイルスおよびプリオンを含む不純物または感染病原体の存在、このプールされたヒト血液製品の入手可能性の不足、ロットごとの差異、高いコスト、腎機能に影響を与える大きなタンパク質負荷、ならびに一般的に長時間の、時には毎月連続した２日間に渡る長期の投与期間を含む、いくつかの欠点がある。とりわけ、ｈＩＶＩＧ製剤はその免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）含有量が大きく変化し得、このことは、ＩｇＡが欠乏している受容者においてはアレルギーおよびアナフィラキシー反応の原因となり得るため、懸念され得る。ｈＩＶＩＧの否定的な局面を鑑みて、自己免疫および炎症性疾患の治療のための改善された手段が必要であり、とりわけ、少なくとも、同等の有効性、より大きな作用強度、より短い投与時間、およびより高い純度を有する、組換えにより製造される製品の豊富な原料が必要である。
さらに、広範なタイプの多様な病理学的状態が、単球、リンパ球、およびＮＫ細胞に由来する細胞により媒介される。全てではないとしても、多数の、そのような状態における使用のための新たな治療薬および／または予防薬は、いまだ対処されていない重要な医療的必要を満たし、かつ商業的に有用となるであろう。
ｈＩＶＩＧの免疫調節性の特性の多くは、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に存在する。例えば、ＩＴＰのマウスモデルにおいては、無修飾のｈＩＶＩＧおよびＦｃ断片は両方とも単独で、血小板数の回復における治療的有効性を示すが、単離されたｈＩＶＩＧ Ｆａｂ断片には治療効果がない（Samuelsson, A., Towers, T. L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of hIVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001)）。さらにＦｃはまた、小児期および成人の特発性血小板減少性紫斑病の両方の治療において治療的に有効であるが、ｈＩＶＩＧのＦａｂ断片は有効ではない（Follea, G. et al. Intravenous plasmin-treated gamma globulin therapy in idiopathic thrombocytopenic purpura. Nouv Rev Fr Hematol 27, 5-10 (1985); Solal-Celigny, P., Bernard, J., Herrera, A. & Biovin, P. Treatment of adult autoimmune thrombocytopenic purpura with high-dose intravenous plasmin-cleaved gammaglobulins. Scand J Haematol 31, 39-44 (1983); Debre, M. & Bonnet, M.-C. Infusion of Fc gamma fragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura. Lancet 342, 945-49 (1993); Burdach, S.E., Evers, K. & Geurson, R. Treatment of acute idiopathic thrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulin G: Comparative efficacy of 7S and 5S preparations. J Pediatr 109, 770-775 (1986)）。
活性化型および抑制型のメンバーに識別することが出来る古典的なＦｃγ受容体のファミリーに加えて、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）分子のファミリーに属する新生児のＦｃ−受容体（ＦｃＲｎ）、ならびにＣ型レクチンのファミリーに属するＳｉｇｎＲ１／ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＩｇＧ Ｆｃ断片と結合することが出来る（Nimmerjahn and Ravetch, Antibody-mediated modulation of immune responses, 免疫学的 Reviews, 236: 265-275 (2010)。さらに、免疫グロブリンＦｃ分子が結合して生理的な影響を及ぼす、Ｆｃγ受容体様受容体も存在する（Davis RS. “Fc Receptor-like molecules” Annu. Rev. Immunol. 2007. 25:525-60）。ｈＩＶＩＧの治療効果は、初期においてはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）により媒介され、長期の寛容原性効果においては樹状細胞（ＤＣ）−マクロファージのクロストークに依存する。ＩＴＰのマウスモデルにおいては、ＦｃγＲＩＩＩａは開始段階において必須の役割を果たし、ＦｃγＲＩＩｂはエフェクター段階で必要とされる（(Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Anti-inflammatory Activity of hIVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486 (2001); Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fcγ receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)）。同様に、ヒト研究は、抗Ｆｃγ受容体抗体が難治性ＩＴＰの治療において有効であることを示している（Clarkson, S. et al. Treatment of refractory immune thrombocytopenic purpura with an anti-Fc gamma-receptor antibody. N Engl J Med 314, 1236-1239 (1986)）。重要なことに、ｈＩＶＩＧで処理されたＤＣの養子免疫伝達が、ＩＴＰのマウスモデルの治療において有効であるように、長期の寛容原性効果は、細胞間の相互座用により媒介される（Siragam, V. et al. Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fcγ receptors on dendritic cells. Nat Med 12, 688 (2006)）。
ｈＩＶＩＧの免疫調節効果が発揮されるためには、ＦｃγＲの凝集が必要である。ＦｃγＲの凝集は、ｈＩＶＩＧ中に存在するＩｇＧ「二量体」（全ｈＩＶＩＧの５〜１５％）により媒介される（Bleeker, W.K. et al. Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)）。例えば、ＩＶＩＧの、公知の免疫循環の臨床的降圧効果はＩＶＩＧ中の「二量体」の存在と相関する（Kroez M et. al. Hypotension with Intravenous Immunoglobulin Therapy: importance of pH and dimer formation. Biologicals 31 (2003) 277-286.）。例えば、ＩＴＰのマウスモデルにおいて、高含有量の「二量体」（完全ホモ二量体免疫グロブリン分子の二量体）を有するｈＩＶＩＧによる治療は血小板数を増加させたが、ｈＩＶＩＧ「単量体」（全ホモ二量体免疫グロブリン分子）は、有効ではなかった（Teeling, J.L. et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood 98, 1095-1099 (2001)）。さらに、ＩｇＧ凝集体を除去するために、イオン交換樹脂およびポリエチレングリコールの分画が、ｈＩＶＩＧの製造において日常的に使用されているにもかかわらず、ｈＩＶＩＧの臨床的な有効性は、患者の血清中の凝集体の存在と相関する（Augener, W., Friedman, B. & Brittinger, G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut 50, 249-252 (1985)）。重要なことに、二量体の割合（％）は血管作用性の副作用とも相関するが、これはアセチルヒドロラーゼで治療可能である（Bleeker, W.K. et al. Vasoactive side effects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and their treatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydrolase. Blood 95, 1856-1861 (2000)）。
高いタンパク質負荷、不便な患者への投薬、感染リスク、ＩｇＡアナフィラキシー、および限定された入手可能性の問題を解決すると同時に、ＩＶＩＧの凝集画分の有効性を維持および強化する、ＩＶＩＧに代わる選択肢が必要である。本発明は、ヒト免疫グロブリンＦｃおよび単一の天然の多量体化ドメイン、それを含む組成物を含む、生物学的に活性な融合タンパク質の生物模倣型分子、およびその使用方法に関する。これらの生物模倣体は、丁度これらの生物模倣体のモデルとなったｈＩＶＩＧのように、限定されないが、自己免疫疾患を含む、免疫学的および炎症性障害の治療のための広範な用途を有する。さらに、これらの生物模倣体のうちのあるものは、例えば、免疫細胞の機能を試験するための免疫学的アッセイ、疾患の診断、および抗体ベースの免疫測定法でのＦｃの非特異的結合の阻止における使用などの、研究用試薬としての有用性も有する。さらに、本発明の生物模倣体および組成物は、ｈＩＶＩＧの上記の限界、および前駆生物模倣型ストラドマーの多量体化の限界を克服する優位性を有する。
国際公開第２００８／１５１０８８号は、自己免疫疾患および他の炎症性状態を含む病理学的状態の治療のために、結合された免疫グロブリンＦｃ領域を使用して、規則的に多量体化されたｈＩＶＩＧの免疫グロブリンＦｃ生物模倣体（ストラドマーとして知られる、生物学的に活性な規則的な多量体）を作製することを開示している。参照によりその全体が組み入れられる、国際公開第２００８／１５１０８８号を参照のこと。開示される分子は、制限部位および親和性タグを含む、未変性の免疫グロブリンＦｃと比較して外来性である配列を、免疫グロブリンＦｃ単量体中に含むように設計された。これらの外来性の配列は、全体で、ストラドマーのアミノ酸組成物全体のごく一部を占め（約１６の全アミノ酸）、分離可能かつ別個の機能、すなわちＦｃＲ結合機能および多量体化機能を有するドメインの間に配置された。一般に、立体的な制約を避けるため、または隣接するドメインの独立した機能を低下させるために、小さな結合配列を、独立した構造および／または機能を有するドメインの間に含有させることが通常行われている。しかしながら、本明細書に開示される通り、これらの短い区域を除去することにより、多量体の形成、受容体の結合、および／または全体的な生物活性の劇的な向上を提供し得る。
一実施形態において、本発明は、リーダー配列、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、および多量体化ドメインを含むストラドマー単位に関する。本発明のさらなる実施形態において、リーダー配列はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しており、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は多量体化ドメインに直接結合している。
別の実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有するストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、配列番号２のＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、リーダー配列および／または多量体化ドメインに直接結合している。いくつかの実施形態において、本発明のストラドマー単位は、多量体化されると、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＤＣ−ＳＩＧＮ／ＳＩＧＮ−Ｒ１と結合する。
別の実施形態において、本発明は、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有するストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも９５％の相同性を有する、本発明のストラドマー単位。さらなる実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも９９％の相同性を有する、本発明のストラドマー単位。別の実施形態において、多量体化ドメインは、ストラドマー単位を多量体化することが出来る。さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のカルボキシ末端に直接結合している。いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ末端に直接結合している。
別の実施形態において、本発明は、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも８０％の相同性を有する、ストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９５％の相同性を有する、本発明のストラドマー単位。さらなる実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９９％の相同性を有する、本発明のストラドマー単位。別の実施形態において、多量体化ドメインは、ストラドマー単位を多量体化することが出来る。さらなる実施形態において、多量体化ドメインはＩｇＧ１ Ｆｃ領域のカルボキシ末端に直接結合している。いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ末端に直接結合している。
別の実施形態において、本発明は、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも８０％の相同性を有するストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも９５％の相同性を有する、本発明のストラドマー単位。さらなる実施形態において、多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも９９％の相同性を有する、本発明のストラドマー単位。別の実施形態において、多量体化ドメインは、ストラドマー単位を多量体化することが出来る。さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のカルボキシ末端に直接結合している。いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ末端に直接結合している。
一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記ＩｇＧ２ヒンジは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域がイソロイシンジッパー多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記イソロイシンジッパーは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＧＰＰ多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記ＧＰＰ多量体化ドメインは前記トラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２７と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインに直接結合しそのＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記ＩｇＧ２ヒンジは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、イソロイシンジッパー多量体化ドメインに直接結合しそのイソロイシンジッパー多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記イソロイシンジッパーは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、ＧＰＰ多量体化ドメインに直接結合しそのＧＰＰ多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記ＧＰＰ多量体化ドメインは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
別の実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記多量体化ドメインは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、ストラドマー単位の高次多量体を生成する。さらなる実施形態において、得られたストラドマー組成物の少なくとも約３５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態において、得られたストラドマー組成物の少なくとも約５５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態において、得られたストラドマー組成物の少なくとも約６５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態において、得られたストラドマー組成物の少なくとも約７０％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態において、得られたストラドマー組成物の少なくとも約７５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。
さらなる実施形態において、一実施形態において、本発明は、リーダー配列、１つまたは複数の変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域、および多量体化ドメインを含む、ストラドマー単位に関する。本発明のさらなる実施形態において、リーダー配列は、１つまたは複数の変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しており、１つまたは複数の変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、多量体化ドメインに直接結合している。
一実施形態において、本発明は、ストラドマー単位のアミノ酸配列が配列番号２０を含む、ストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２０を含む少なくとも２つのストラドマー単位を含む、クラスターストラドマーに関する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、ストラドマー単位のアミノ酸配列が配列番号２４を含む、ストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２４を含む少なくとも２つのストラドマー単位を含む、クラスターストラドマーに関する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、ストラドマー単位のアミノ酸配列が配列番号２１を含む、ストラドマー単位に関する。さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２１を含む少なくとも２つのストラドマー単位を含む、クラスターストラドマーに関する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ヒンジドメインを欠くＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しており、前記多量体化ドメインは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。別の実施形態において、本発明は、本発明は、多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記多量体化ドメインはＦｃＲと結合することが出来るＩｇＧ１ Ｆｃの一部に直接結合しているか、またはＩｇＧ１ Ｆｃの一部に直接結合している前記多量体化ドメインはともにＦｃＲと結合することが出来る。
一実施形態において、本発明は、多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成るＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記多量体化ドメインは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。
一実施形態において、本発明は、多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成るＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記多量体化ドメインは前記ストラドマー単位の多量体を生成する。
一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ１ ＣＨ２およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに直接結合しているＩｇＧ２ヒンジを含むＦｃ領域に、直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位に関し、前記ＩｇＧ２ヒンジは、前記ストラドマー単位の多量体を生成する。一実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも８０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９０％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９５％の相同性を有する。さらなる別の実施形態において、ストラドマー単位のアミノ酸配列は、配列番号１８と少なくとも９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、リーダー配列（配列番号１）は、成熟タンパク質から切断される。
一実施形態において、本発明は、多量体化ドメインに直接結合しているＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むストラドマー単位に関する。一実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号２と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する。別の実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号１９と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する。さらなる実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、１つまたは複数の変異を含む。一実施形態において、多量体化ドメインは、配列番号３と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する。別の実施形態において、多量体化ドメインは、配列番号５と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する。一実施形態において、多量体化ドメインは、配列番号２６と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する。一実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端に直接結合している。別の実施形態において、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＣ末端に直接結合している。
一実施形態において、本発明は、少なくとも２つのストラドマー単量体を含むクラスターストラドマーに関し、前記ストラドマー単量体はそれぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、クラスターストラドマーはＦｃγＲＩＩＩａと結合する。さらなる実施形態において、クラスターストラドマーはＦｃγＲＩＩｂと結合する。
別の実施形態において、本発明は、対象に対して免疫応答を調節する方法に関し、前記方法は、前記対象に、少なくとも２つのストラドマー単量体を含む有効量のクラスターストラドマーを投与することを含み、前記ストラドマー単量体はそれぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、クラスターストラドマーはＦｃγＲＩＩＩａと結合する。さらなる実施形態において、クラスターストラドマーはＦｃγＲＩＩｂと結合する。さらなる実施形態において、免疫応答の調節は、未成熟の樹状細胞上でのＣＤ８６の誘導を含む。
さらなる実施形態において、免疫応答の調節は、抗体産生の減少を伴う、ある特定のメモリーＢ細胞の選択的アポトーシスに関連する。さらなる実施形態において、調節は、抗体産生の減少を伴う、活性化されたメモリーＢ細胞の選択的アポトーシスに関連する。別の実施形態において、免疫調節は、抗体依存性の細胞傷害活性の増加につながる、ＮＫ細胞の調節であってもよい。さらなる別の実施形態において、免疫応答の調節は、ＣＤ８βおよびＣＤ１１ｃを発現している細胞個体群の増加を招き得る。さらなる別の実施形態において、免疫調節は、炎症誘発性サイトカイン、または自己免疫疾患において一般に上昇するＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカインの減少につながり得る。別の実施形態において、免疫調節は、ＮＫＴ細胞の活性化ならびにＴＧＦ−βの分泌および切断につながり得る。
さらなる実施形態において、本発明は、炎症性疾患または自己免疫疾患を、それを必要とする対象において治療する方法に関し、前記方法は、少なくとも２つのストラドマー単位を含む有効量のストラドマーを投与することを含み、前記ストラドマー単位はそれぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むか、あるいは、多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、炎症性疾患は自己免疫疾患である。さらなる実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性貧血症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、強皮症、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜炎、ＡＮＣＡ陽性脈管炎、セリアック病、天疱瘡、皮膚筋炎（dermatopolymyositis）、グッドパスチャー病、重症筋無力症、グレーブス病、川崎病、鎌状赤血球クリーゼ、およびアトピー性皮膚炎から成る群から選択される。さらなる実施形態において、自己免疫疾患は、提供者から受容者への臓器移植に関連する。さらなる実施形態において、自己免疫疾患は、古典的には自己免疫疾患として特徴づけられてはいないが、免疫系の細胞が重要な役割を果たす疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、骨減少症、および骨粗鬆症である。
さらなる実施形態においては、ストラドマーを、静脈内、皮下、経口、軽鼻、腹腔内、舌下、頬側、経皮、皮下移植により、または筋肉内に投与する。一実施形態において、クラスターストラドマーは静脈内に投与される。本発明のストラドマーの強化された有効性ゆえに、いくつかの実施形態においては、ストラドマーを、前身の分子および／またはＩＶＩＧと比較して低用量で静脈内に投与してもよい。一実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜約１０００ｍｇ／Ｋｇ用量で、静脈内に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．１ｍｇ／Ｋｇ〜約１００ｍｇ／Ｋｇで静脈内に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．５ｍｇ／Ｋｇ〜約５０ｍｇ／Ｋｇで静脈内に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約１ｍｇ／Ｋｇ〜約２５ｍｇ／Ｋｇで静脈内に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約５ｍｇ／Ｋｇ〜約１５ｍｇ／Ｋｇで静脈内に投与する。一実施形態においては、クラスターストラドマーを皮下に投与する。本発明のストラドマーの強化された有効性ゆえに、いくつかの実施形態においては、ストラドマーを、前身の分子および／またはＩＶＩＧと比較して低用量で、皮下に投与してもよい。一実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜約１０００ｍｇ／Ｋｇの用量で、皮下に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．２ｍｇ／Ｋｇ〜約１５０ｍｇ／Ｋｇで皮下に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．５ｍｇ／Ｋｇ〜約８０ｍｇ／Ｋｇで皮下に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約２ｍｇ／Ｋｇ〜約５０ｍｇ／Ｋｇで皮下に投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約５ｍｇ／Ｋｇ〜約３０ｍｇ／Ｋｇで皮下に投与する。
一実施形態においては、クラスターストラドマーを移植可能なデバイスに共有結合的に固定して投与する。一実施形態においては、クラスターストラドマーを縫合糸に固定する。別の実施形態においては、クラスターストラドマーを移植片またはステントに固定する。別の実施形態においては、クラスターストラドマーを心臓弁、整形外科用の関節置換、または埋め込まれた電子リードに固定する。別の実施形態においては、クラスターストラドマーを、移植可能なマトリックスに固定し、およびその内部に埋め込む。好ましい実施形態においては、クラスターストラドマーを、移植可能なハイドロゲルに固定し、およびその内部に埋め込む。一実施形態において、ハイドロゲルは、デキストラン、ポリビニルアルコール、ナトリウムポリアクリレート、またはアクリレートポリマーから成る。さらなる実施形態においては、免疫細胞が流入して固定されたクラスターストラドマーと相互作用し、次いで循環に戻ることを可能にするのに十分大きな孔径を有するハイドロゲルに、クラスターストラドマーを固定して投与する。さらなる実施形態において、ハイドロゲルの孔径は５〜５０ミクロンである。好ましい実施形態において、ハイドロゲルの孔径は２５〜３０ミクロンである。
さらなる実施形態においては、１つまたは複数の追加の医薬品および／または治療薬の投与前、投与中、投与後に、ストラドマーを投与する。さらなる実施形態において、追加の薬剤的に活性な薬剤は以下を含む：ステロイド；生物学的抗自己免疫薬、例えば、モノクローナル抗体、融合タンパク質、または抗サイトカイン；非生物学的抗自己免疫薬；免疫抑制剤；抗生物質；および抗ウイルス薬；サイトカイン；または他の方法により免疫調節物質として作用し得る薬剤。さらなる実施形態において、ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、コルチゾン、デキサメタゾン、モメタゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクロメタゾン、アルブテロール、またはレバルブテロール（levalbuterol）である。さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、ＬＹ２１２７３９９、ベリムマブ（belimumab）、ベルツズマブ（veltuzumab）、またはセルトリズマブである。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、エタネルセプト（Etanercept）、またはアバタセプトである。さらなる実施形態において、抗サイトカイン生物製剤は、アナキンラである。さらなる実施形態において、抗リューマチ性の非生物学的薬は、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、ミノサイクリン、有機金化合物、フォスタマチニブ（fostamatinib）、トファシチニブ（tofacitinib）、エトリコキシブ、またはスルファサラジンである。さらなる実施形態において、免疫抑制剤はシクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、エベロリムス、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、バシリキシマブ、ダクリズマブ、またはアレムツズマブである。さらなる実施形態においては、化学療法薬の投与前、投与中、または投与後に、ストラドマーを投与する。さらなる実施形態においては、ストラドマーおよび追加の治療薬は、一緒に投与された場合、治療的相乗効果を示す。一実施形態においては、追加の治療薬の投与前に、ストラドマーを投与する。別の実施形態においては、追加の治療薬の投与と同時に、ストラドマーを投与する。さらなる別の実施形態においては、追加の治療薬の投与後に、ストラドマーを投与する。
さらなる別の実施形態において、本発明は、感染症を、それを必要とする対象において治療する方法に関し、前記方法は、少なくとも２つのストラドマー単位を含む有効量のクラスターストラドマーを投与することを含み、前記ストラドマー単位はそれぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むか、あるいは、多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、感染症は細菌感染症である。さらなる別の実施形態において、感染症はウイルス感染症である。さらなる実施形態において、感染症は細菌性敗血症またはウイルス性敗血症である。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、静脈内、皮下、経口、軽鼻、腹腔内、舌下、頬側、経皮、皮下移植により、または筋肉内に投与する。一実施形態においては、クラスターストラドマーを、静脈内に投与する。一実施形態においては、クラスターストラドマーを、静脈内に投与する。一実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜約１０００ｍｇ／Ｋｇの用量で投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．１ｍｇ／Ｋｇ〜約１００ｍｇ／Ｋｇで投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約０．５ｍｇ／Ｋｇ〜約５０ｍｇ／Ｋｇで投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約１ｍｇ／Ｋｇ〜約２５ｍｇ／Ｋｇで投与する。さらなる実施形態においては、クラスターストラドマーを、約５ｍｇ／Ｋｇ〜約１５ｍｇ／Ｋｇで投与する。
別の実施形態においては、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル、ヒヒ、およびチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、トリ（例えばニワトリ、シチメンチョウ、およびアヒル）、魚、および爬虫類を、種特異的なまたはキメラのストラドマー分子で治療するために、クラスターストラドマーを投与する。さらなる別の実施形態において、ヒトは成人または小児である。さらなる別の実施形態においては、自己免疫疾患を予防するために、クラスターストラドマーを投与する。さらなる実施形態においては、伴侶動物および家畜におけるワクチン関連の自己免疫状態を予防するために、クラスターストラドマーを投与する。
さらなる別の実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいて抗体の非特異的な結合を阻止する方法に関し、前記方法は標的組織または標的細胞を、少なくとも２つのストラドマー単位を含む有効量のクラスターストラドマーを含む組成物とともにインキュベートすることを含み、前記ストラドマー単位はそれぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むか、あるいは、多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含む。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。一実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイは、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、または免疫蛍光アッセイである。さらなる実施形態において、クラスターストラドマーは、標的組織または細胞の種に対して種特異的である。
さらなる別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つのストラドマー単位を含む有効量のクラスターストラドマーで、組成物中の内毒素レベルを減少させる方法に関し、前記ストラドマー単位はそれぞれ、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに直接結合しているリーダー配列を含むか、あるいは、多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインが今度はＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、クラスターストラドマーは組成物中の内毒素と複合する。さらなる実施形態において、方法は、ストラドマーが複合した内毒素を、組成物から除去することを含む。一実施形態においては、ストラドマーが複合した内毒素を、濾過により組成物から除去する。一実施形態において、組成物は医薬組成物である。
一実施形態において、本発明は、以下を含む、クラスターストラドマーの生産方法に関する：ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しそのＩｇＧ１ Ｆｃ領域が今度は多量体化ドメインに結合しているリーダー配列、または多量体化ドメインに直接結合しその多量体化ドメインがＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合しているリーダー配列を含むストラドマー単位を発現させること、ここで前記多量体化ドメインは形質移入された細胞から前記ストラドマー単位の多量体を生成する；配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１８のストラドマーをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングすること；前記発現ベクターを細菌宿主中に形質移入すること；配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１８のストラドマーをコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを細菌培養物から単離すること；配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１８のストラドマーをコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを直線化すること；直線化されたＤＮＡを哺乳類の細胞中に形質移入すること；安定に形質移入された細胞のプールを得るために陽性に形質移入された細胞を増殖させること；培地からストラドマータンパク質を収集すること；およびストラドマータンパク質を精製すること；ここで前記ストラドマータンパク質は外来性配列を含まない。一実施形態において、発現ベクターは、選択可能なマーカーを含む。さらなる実施形態において、選択可能なマーカーは抗生物質耐性遺伝子である。さらなる実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子である。一実施形態において、哺乳類の細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ細胞、またはタンパク質の生産に使用される、他の商業上適切な哺乳類の細胞である。一実施形態においては、アフィニティークロマトグラフィーにより、ストラドマータンパク質を精製する。さらなる実施形態においては、ゲルろ過によりタンパク質をさらに精製する。さらなる実施形態においては、イオン交換クロマトグラフィーにより、タンパク質をさらに精製する。さらなる実施形態においては、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、タンパク質をさらに精製する。
図１は、本発明の好ましいストラドマーの模式図である。図１ａはＧ０４５ｃストラドマーの模式図である。 図１ｂはＧ０４５ｏｌｄストラドマーの模式図である。 図１ｃはＧ０４６ストラドマーの模式図である。 図１ｄはＧ０１９ストラドマーの模式図である。 図１ｅはＧ０２８ストラドマーの模式図である。 図１ｆはＧ０５１ストラドマーの模式図である。 図１ｇはＧ０８９ストラドマーの模式図である。 図１ｈはＧ０９６ストラドマーの模式図である。 図２ａは、第一世代ストラドマー化合物と、本発明の直接天然に結合しているストラドマー化合物の間の多量体化能力の差異を示す、タンパク質ゲルの図である。 図２ｂは、第一世代ストラドマーの化合物と、本発明の直接天然に結合しているストラドマー化合物との、多量体／単量体形成の比較図である。 図３は、コラーゲン誘発関節炎の重症度において、外来性の配列を含む先のストラドマー化合物（Ｍ０４５ｏｌｄ）の効果と比較した、本発明の直接天然に結合しているストラドマー（Ｍ０４５ｃ）の、より大きな効果を示す図である。 図４は、コラーゲン誘発関節炎において、プレドニゾロンとともに投与された際に、本発明の直接天然に結合しているストラドマー化合物が有する相乗効果を示す図である。 図５は、ＩｇＧ２ａ対照と比較した、本発明のＭ０４６、Ｍ０４５、Ｍ０１９およびＭ０２８化合物の、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＳＩＧＮ−Ｒ１に対する強化された結合親和性を示す図である。 同上。 図６は、本発明の化合物の（ａ）ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａ、ならびに（ｂ）ＳＩＧＮ−Ｒ１に対する強化された結合親和性を示す図である。Ｍ０４５ Ｆ１は、ストラドマーのより高い分子量の多量体画分であり、Ｍ０４５ Ｆ２はストラドマーのより低い分子量の多量体画分である。Ｍ０４５ Ｆ３は、ストラドマーのホモ二量体画分である。 同上。 同上。 図７は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の重症度における、直接天然に結合しているストラドマーＭ０４５ｃの効果を示す図である。 図８は、ストラドマーが、ＩｇＧ１ Ｆｃ対照と比較して、抗ＦｃγＲ抗体のＦｃγＲに対する結合をより効果的に阻止することを示す図である。 図９は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルの重症度における、天然に結合しているストラドマーＭ０４５ｃ、Ｍ０１９、Ｍ０２８、Ｍ０４６およびＭ０５１の効果を示す図である。 図１０のＡは、Ｇ０７５ストラドマーのＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した結合、およびＧ０７５ストラドマーのＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する減少した結合を示す図である。図１０のＢは、Ｇ０７６ストラドマーのＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する増加した結合親和性、およびＧ０７６ストラドマーのＦｃγＲＩＩＩａに対する減少した結合を示す図である。 図１１は、ＩＶＩｇおよびアルブミン対照と比較した、以下におけるＭ０５１の効果を示す図である：（Ａ）ラットにおける実験的自己免疫性神経炎（ＥＡＮ）に関連する体重減少；（Ｂ）ＥＡＮラットにおける臨床スコア；（Ｃ）ＥＡＮラットにおける臀部振幅；（Ｄ）ＥＡＮラットにおける足首振幅；および（Ｅ）ＥＡＮラットにおける運動神経伝導速度。 同上。 図１２は、ＩＶＩｇおよびアルブミン対照と比較した、以下におけるＭ０４５ｃの効果を示す図である：（Ａ）ラットにおける実験的自己免疫性神経炎（ＥＡＮ）に関連する体重減少；（Ｂ）ＥＡＮラットにおける臨床スコア；（Ｃ）ＥＡＮラットにおける臀部振幅；（Ｄ）ＥＡＮラットにおける足首振幅；および（Ｅ）ＥＡＮラットにおける運動神経伝導速度。 同上。 図１３は、コラーゲン誘発関節炎の重症度において、ビヒクル対照およびＭ０４５ｃ陽性対照と比較して、天然に結合している本発明のストラドマーＭ０７５（Ａ）、Ｍ０９６（Ｂ）、およびＭ０９８（Ｃ）はより高い効果を示すが、Ｍ０７６（Ａ）は示さないことを表す。
本発明の詳細な説明
本明細書に記載のｈＩＶＩＧ代替化合物の合理的分子設計に対するアプローチには、免疫学的に活性な生物模倣体の組換えおよび／または生化学的創製が含まれる。こうした生物模倣体は、この目標の達成を目的として以前に説明されている分子と比較して、多量体化の効率が驚くほど高く、結果としてＦｃγ受容体への結合効率が高い。こうした代替化合物は、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、敗血症などの治療に対する有用性がある。また、天然の免疫グロブリンと比べてＦｃγ受容体との結合親和性に優れることから、抗体ベースのイムノアッセイ、ならびに医薬組成物および実験用組成物からのエンドトキシン除去において、Ｆｃ阻害試薬としての有用性も有する。以下、具体的な代表的実施形態と併せて各実施形態を詳細に説明する。
本明細書において、特許請求の範囲および／または明細書での「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現とともに「ａ」または「ａｎ」という語を使用する場合、「１つ」を意味することもあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多い」の意味にもなる。
本明細書で使用する場合、「生物模倣型」、「生物模倣型分子」、「生物模倣型化合物」、および関連する用語は、例えばプールｈＩＶＩＧ、モノクローナル抗体、または抗体のＦｃ断片など、他の化合物の機能を模して人間が作製した化合物を指す。「生物学的に活性な」生物模倣体とは、天然に生じる対応物と同一または類似の生物活性を有する化合物をいう。「天然に生じる」とは、生体に通常見られる分子またはその一部分を意味する。また、実質的に自然に発生することも意味する。「免疫学的に活性な」生物模倣体とは、天然に生じる免疫学的に活性な分子、例えば抗体、サイトカイン、インターロイキン、および当技術分野において周知の他の免疫学的な分子と同一または類似の免疫学的活性を示す生物模倣体をいう。好ましい実施形態では、本発明の生物模倣体は、本明細書で定義されるストラドマーである。
「直接結合( する）」とは、制限酵素認識部位、クローニング断片などの介在配列または外来性配列がない状態で、２つの配列が接続することを意味する。当業者であれば、多量体化能力が実質的に影響を受けない限り、「直接結合（する）」はアミノ酸の追加または除去を包含することを理解するであろう。
「相同」とは、所定の核酸配列またはアミノ酸配列の配列全体の同一性を意味する。例えば「８０％相同」とは、所定の配列が、クレームされている配列と約８０％の同一性を共有し、挿入、欠失、置換、およびフレームシフトを含み得ることを意味する。当業者であれば、挿入および欠失を考慮に入れて配列アライメントを行い、ある配列の長さ全体の同一性を決定できることを理解するであろう。
本発明の免疫学的に活性な生物模倣体は、ＩｇＧのFc 領域の１つ以上の免疫調節活性を持つように設計され、少なくとも（ｉ）ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、および／またはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶを含むＦｃγＲに結合できる第１のFc 領域と、（ｉｉ）ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、および／またはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶを含むＦｃγＲに結合できる第２のFc 領域と、を有する。本発明の免疫学的に活性な化合物は、特に、ホモ二量体の多量体である。各ホモ二量体が、ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、および／またはＦＣγＲに結合する能力を有する。したがって、免疫学的に活性な生物模倣体が多量化されると、この生物模倣体は、ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、および／またはＦＣγＲに結合する能力をそれぞれ有する、少なくとも２つのホモ二量体を含む。
以下の段落では、本発明による生物模倣体の構成単位を構造と機能の両面で定義した上で、生物模倣体自体について定義する。しかしながら、上述したように、本発明の生物模倣体が各々少なくとも２つのFc 領域を有する点に留意することが最初に有用となる。Fc 領域は、最低でも、２つのペプチド鎖またはアーム（単量体）を含む二量体ポリペプチド（または、より大きなポリペプチドの二量体領域）であり、この２つのペプチド鎖またはアームが会合して、機能的Ｆｃγ受容体結合部位を形成する。したがって、本明細書で論じる個々の断片およびドメインの機能的形態は、概して、二量体（または多量体）の形で存在する。本明細書で論じる個々の断片およびドメインの単量体は、単一の鎖またはアームであるが、必ず第２の鎖またはアームと会合して機能的な二量体構造を形成する。
Ｆｃ断片
「Ｆｃ断片」とは、免疫グロブリンのカルボキシ末端に定常的に見られるタンパク質領域またはタンパク質の折り畳み構造を表すのに用いられる専門用語である。Ｆｃ断片は、不完全かつ不十分なプロセスであるパパイン消化等の酵素消化を通じて、モノクローナル抗体のＦａｂ断片から単離可能である（Mihaesco C and Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431-453 (1968) を参照のこと）。Ｆｃ断片は、Ｆａｂ断片（抗原結合ドメインを含む）と共にホロ抗体（本明細書では完全抗体を意味する）を構成する。Ｆｃ断片は、抗体重鎖のカルボキシ末端部分からなる。Ｆｃ断片の鎖は各々約２２０〜２６５アミノ酸長であり、鎖同士がジスルフィド結合で連結されることが多い。また、Ｆｃ断片は、１つ以上の独立した折り畳み構造または機能的サブドメインを含むことが多い。特に、Ｆｃ断片はFc 領域を包含する。Fc 領域とは、本明細書ではＦｃγ受容体と結合する最小構造と定義される。単離されたＦｃ断片は、２つのＦｃ断片単量体（例えば、抗体重鎖の２つのカルボキシ末端部分；本明細書でさらに定義する）が二量体化されたもので構成される。２つのＦｃ断片単量体が会合すると、得られるＦｃ断片はＦｃγ受容体結合活性を有する。
Ｆｃ部分断片
「Ｆｃ部分断片」とは、抗体のＦｃ断片全体には満たないが、Ｆｃ断片と同じ活性（Ｆｃγ受容体結合活性を含む）を有するに足る十分な構造を保持したドメインをいう。したがって、Ｆｃ部分断片では、Ｆｃ部分ドメインの派生元の抗体のアイソタイプによって、ヒンジ領域の一部または全部、ＣＨ２ドメインの一部または全部、ＣＨ３ドメインの一部または全部、および／またはＣＨ４ドメインの一部または全部が欠如している場合がある。Ｆｃ部分断片の一例として、ＩｇＧ３の上側、コア、および下側のヒンジ領域およびＣＨ２ドメインを含む分子が挙げられる（Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT and Morrison, SL, Influence of the hinge region on complement activation, CIq binding, and segmental flexibility in chimeric human immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA. 1990 January; 87(1): 162-166 ）。よって、この例のＦｃ部分断片は、ＩｇＧ３のＦｃ断片に存在するＣＨ３ドメインが欠如している。Ｆｃ部分断片の別の例として、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む分子が挙げられる。この例のＦｃ部分断片は、ＩｇＧ1 に存在するヒンジドメインが欠如している。Ｆｃ部分断片は、２つのＦｃ部分断片単量体で構成される。本明細書でさらに定義するように、このような２つのＦｃ部分断片単量体が会合すると、得られるＦｃ部分断片はＦｃγ受容体結合活性を有する。
Fc 領域
本明細書で使用する場合、「Fc 領域」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）と結合可能であるかＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合される、（大型のポリペプチドの場合）最小領域、または（単離されたタンパク質の場合）最小のタンパク質折り畳み構造を表す語である。Ｆｃ断片とＦｃ部分断片のどちらでも、Fc 領域は、Ｆｃ受容体との分子結合を可能にする最小結合領域である。Fc 領域は、Ｆｃ受容体と結合する別個のポリペプチドに限定されることもあるが、Ｆｃ断片の一部または全部となり得ること、またＦｃ部分断片の一部または全部となり得ることも自明であろう。本発明で使用する「Fc 領域」という用語は、当業者であれば、２つ以上のFc 領域を意味することを認識するであろう。Fc 領域は、２つのFc 領域単量体で構成される。本明細書でさらに定義するように、このような２つのFc 領域単量体が会合すると、得られるFc 領域はＦｃ受容体結合活性を有する。このように、Fc 領域は、Ｆｃ受容体と結合できる二量体構造である。
Ｆｃ部分ドメイン
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ部分ドメイン」は、Fc 領域の一部を表す。Ｆｃ部分ドメインは、免疫グロブリンの異なるクラスおよびサブクラスの個々の重鎖定常領域ドメイン（例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン）およびヒンジ領域を含む。よって、本発明のヒトＦｃ部分ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥのＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥのＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥのＣＨ３ドメイン、ＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ４ドメイン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥのヒンジ領域を含む。他の種における対応するＦｃ部分ドメインは、その種に存在する免疫グロブリンおよびその呼称によって異なる。好ましくは、本発明のＦｃ部分ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびヒンジドメイン、ならびにＩｇＧ２のヒンジドメインを含む。本発明のＦｃ部分ドメインは、これらのドメインとヒンジの２つ以上の組み合わせをさらに含むこともできる。しかしながら、本発明の個々のＦｃ部分ドメインおよびその組み合わせは、ＦｃγＲと結合する能力が欠如している。したがって、Ｆｃ部分ドメインとその組み合わせは、Fc 領域に満たない。Ｆｃ部分ドメイン同士が連結して、Ｆｃγ受容体結合活性を有するペプチドを形成し、よってFc 領域となることができる。本発明では、Ｆｃ部分ドメインをFc 領域と共に構成単位として使用して、本明細書で定義される本発明の生物模倣体を創製する。各々のＦｃ部分ドメインは、２つのＦｃ部分ドメイン単量体で構成される。このような２つのＦｃ部分ドメイン単量体が会合すると、Ｆｃ部分ドメインが形成される。
上述したように、Ｆｃ断片、Ｆｃ部分断片、Fc 領域、およびＦｃ部分ドメインの各々は、二量体のタンパク質またはドメインである。したがって、これらの分子の各々は２つの単量体で構成され、この２つの単量体が会合して、二量体のタンパク質またはドメインを形成する。以上で、ホモ二量体の形態の特徴と活性について論じた。以下では、単量体ペプチドについて説明する。
Ｆｃ断片単量体
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ断片単量体」とは、単一鎖のタンパク質であって、別のＦｃ断片単量体と会合しているときにＦｃ断片を含む、単一鎖タンパク質をいう。よって、Ｆｃ断片単量体は、ホロ抗体のＦｃ断片を構成する抗体重鎖のうちの１つのカルボキシ末端部分である（例えば、ＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む重鎖の連続部分など）。一実施形態では、Ｆｃ断片単量体は、少なくとも、ヒンジ領域の１本の鎖（ヒンジ単量体）と、ＣＨ２ドメインの１本の鎖（ＣＨ２ドメイン単量体）と、ＣＨ３ドメインの１本の鎖（ＣＨ３ドメイン単量体）とを含み、これらが連続的に連結してペプチドを形成する。別の実施形態では、Ｆｃ断片単量体は、少なくとも、ヒンジ領域の１本の鎖と、ＣＨ２ドメインの１本の鎖と、ＣＨ３ドメインの１本の鎖と、ＣＨ４ドメインの１本の鎖（ＣＨ４ドメイン単量体）とを含み、これらが一続きに連結してペプチドを形成する。一実施形態では、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジドメインは、異なるアイソタイプに由来する。特定の実施形態では、Ｆｃ断片単量体は、ＩｇＧ２のヒンジドメイン、およびＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。
Fc 領域単量体
本明細書で使用する場合、「Fc 領域単量体」は、単一鎖のタンパク質であって、別のFc 領域単量体と会合しているときにFc 領域を含む、単一鎖タンパク質を表す。２つのFc 領域単量体が会合して、１つのFc 領域が形成される。Fc 領域単量体単独では、Fc 領域の片側しか含まないため、Ｆｃγ受容体と結合できない。以前に説明されているFc 領域単量体（例えば、国際公開第２００８／１５１０８８号の図１７と図１８を参照）と異なり、本発明のＦｃとメイン単量体は外来性配列を含まない。代わりに、本発明のFc 領域単量体（配列番号２）は、一方の末端（例えば、Ｆｃ単量体のＮ末端）でリーダー配列（配列番号１）と直接結合し、他方の末端（例えば、Ｆｃ単量体のＣ末端）で多量体化ドメイン（配列番号３）と直接結合する。得られる配列番号４のストラドマー単量体を、本明細書ではＧ０４５ｃと称する。別の実施形態では、Fc 領域単量体はＩｇＧ２のヒンジドメインを含み、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインは、Ｎ末端でリーダー配列（配列番号１）と直接結合する。得られる配列番号１８のストラドマー単量体を、本明細書ではＧ０５１と称する。あるいは、多量体化ドメイン（配列番号３）をFc 領域単量体（配列番号２）のアミノ末端に配置することができる。得られる配列番号８のストラドマー単量体を、本明細書ではＧ０１９と称する。あるいは、多量体化ドメインは、配列番号３の代わりに配列番号５を含むことができ、この多量体化ドメインをFc 領域単量体のカルボキシ末端に配置して、配列番号１０を得ることができる。または、この多量体化ドメインをFc 領域単量体のアミノ末端に配置して、配列番号９を得ることもできる。これらのストラドマーを、本明細書では、それぞれＧ０４６、Ｇ０２８と称する。
Ｆｃ部分ドメイン単量体
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ部分ドメイン単量体」とは、単一鎖のタンパク質であって、別のＦｃ部分ドメイン単量体と会合しているときにＦｃ部分ドメインを含む、単一鎖タンパク質を表す。２つのＦｃ部分ドメイン単量体が会合して、１つのＦｃ部分ドメインが形成される。
ストラドマー
特定の実施形態では、本発明の生物模倣体はストラドマーを含む。ストラドマーとは、２つ以上のＦｃ受容体、好ましくは２つ以上のＦｃγ受容体と結合できる生物模倣型化合物であり、より好ましくは、Fc 領域と比べて著しく向上した結合を示す生物模倣型化合物であり、最も好ましくは、結合活性の解離が低速な特性を示す生物模倣型化合物である。好ましい実施形態では、本発明のストラドマーは、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞、未成熟樹状細胞、およびその他の単球由来細胞のＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、および／またはＦｃγ受容体と結合するのに用いられる。一実施形態では、Ｆｃγ受容体は低親和性Ｆｃγ受容体である。ストラドマーは、シリアル、クラスター、コア、Ｆｃ断片という、４つの異なる物理的コンホメーションを取り得る。本発明のストラドマーは、好ましくはクラスターストラドマーである。明らかになることであるが、上述したＦｃ断片、Ｆｃ部分断片、Fc 領域、およびＦｃ部分ドメインを利用して、様々なストラドマーコンホメーションが構築される。さらに、同じく上述されている個々のFc 領域単量体およびＦｃ部分ドメイン単量体が最初に生成され、その後自己会合して本発明のストラドマーである二量体構造を形成する。
本明細書で使用する場合、「ストラドマー二量体」は、２つのストラドマー単量体だけで構成される特定の形態のストラドマーをいう。一実施形態では、ストラドマー二量体は、関連するストラドマー単量体の自己凝集によって形成される分子である。別の実施形態では、ストラドマー二量体中のストラドマー単量体は、本明細書に定義されるストラドマー単量体間結合を介して物理的に連結される。「多量体ストラドマー」は、ストラドマー単量体の自己凝集により形成されるか、あるいは、本明細書に定義されるストラドマー単量体間結合を介して形成される、３つ以上のストラドマーで構成される。
ストラドマー単量体
本明細書で使用する場合、「ストラドマー単量体」あるいは「ストラドマー単位」という用語は、少なくとも第２のストラドマー単量体と会合しているとき、少なくとも２つのFc 領域を含むポリペプチドを形成する、単一の連続的ペプチド分子を指す。好ましい実施形態では、会合した２つのストラドマー単量体でクラスターストラドマーが構成される。しかしながら、クラスターストラドマーは、３つ以上のストラドマー単量体を含んでいてもよい。ストラドマー単量体は、ストラドマー単量体間結合で会合してストラドマーを形成することもあれば、自己凝集でストラドマーを形成することもある。
ストラドマー単量体は、別のストラドマー単量体と会合してストラドマーを形成すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれより多くのFc 領域を形成するアミノ酸配列を有することができる。ストラドマー単量体はさらに、別のストラドマー単量体と会合してストラドマーを形成すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれより多くのＦｃ部分ドメインを形成するアミノ酸配列を有することができる。
ストラドマーにおいてFc 領域およびＦｃ部分ドメインを形成するストラドマー単量体の領域は、ストラドマー単量体分子の連続した領域がカルボキシ末端からアミノ末端に並んでいるだけでよい。ストラドマー単量体を含む特定のFc 領域単量体やＦｃ部分ドメイン単量体の配置は、重要ではないが、２つのストラドマー単量体の会合時に２つの機能的Fc 領域が形成される配置でなければならない。好ましい実施形態では、本発明のストラドマーは、ＩｇＧ１のＦｃ単量体（配列番号２）のＮ末端とリーダー配列（配列番号１）のＣ末端の間に直接的な結合を含み、かつ、ＩｇＧ１のＦｃ（配列番号２）のＣ末端と、多量体化ドメインＩｇＧ２ヒンジ（配列番号３）、イソロイシンジッパー（配列番号５）、またはＧＰＰドメイン（配列番号２６）との間に直接的な結合を含み、それぞれ、配列番号４のＧ０４５ｃストラドマー、配列番号１０のＧ０４６ストラドマー、配列番号２７のＧ０８９ストラドマーを形成する（表１）。別の好ましい実施形態では、本発明のストラドマーは、リーダー配列（配列番号１）のＣ末端と、多量体化ドメインＩｇＧ２ヒンジ（配列番号３）、イソロイシンジッパー（配列番号５）、またはＧＰＰドメイン（配列番号２６）のＮ末端との間に直接的な結合を含み、かつ、多量体化ドメイン（配列番号３、５、または２６）とＩｇＧ１のＦｃのＮ末端との間に直接的な結合を含み、それぞれ、配列番号８のＧ０１９ストラドマー、配列番号９のＧ０２８ストラドマー、配列番号２８のＧ０９６ストラドマーを形成する（表１）。あるいは、リーダー配列（配列番号１）と多量体化ドメイン（配列番号３）のＮ末端の間に直接的な結合を含み、かつ、多量体化ドメイン（配列番号３）のＣ末端とＩｇＧ１のＦｃ部分ドメイン（ＩｇＧ１のＣＨ２部分とＣＨ３部分を含む）のＮ末端との間に直接的な結合を含み、配列番号１８のＧ０５１ストラドマーを形成する（表１）。









明確にするための一例として、当業者であれば、本発明のストラドマー分子を、それぞれ選択点突然変異を伴うか伴わずに、Fc 領域単量体とＦｃ部分ドメイン単量体の様々な組み合わせ（ただし、少なくとも２つのFc 領域単量体を形成する組み合わせ）をコードするポリヌクレオチド分子を調製することで構築できることを理解するであろう。このようなポリヌクレオチド分子（例えば、配列番号４，８、９、１０、または１８のストラドマーをコードするポリヌクレオチド）を、発現ベクターに挿入してもよく、この発現ベクターを用いて細菌の個体群を形質転換し、あるいは哺乳類細胞の個体群をトランスフェクトすることができる。次いで、形質転換した細菌またはトランスフェクトした哺乳類細胞を適当な培養条件下で培養することにより、ストラドマー単量体を生成できる。例えば、ジェネテシン／Ｇ４１８を用いて細胞を選択することにより、安定的にトランスフェクトされた細胞プールを存続するクローン細胞株を樹立できる。あるいは、例えばＧ０４５ｃ（配列番号４）、Ｇ０１９（配列番号８）、Ｇ０２８（配列番号９）、Ｇ０４６（配列番号１０）、またはＧ０５１（配列番号１８）などの本発明のストラドマーをコードするＤＮＡを用いて、ＣＭＶプロモーターの制御下で、細胞を一時的にトランスフェクトすることもできる。その後、発現したストラドマー単量体は、ストラドマー単量体の自己凝集時、またはストラドマー単量体間結合を用いたストラドマー単量体の会合時に、機能的ストラドマーを形成できる。次いで、例えばタンパク質Ａカラムまたはタンパク質Ｇカラムを用いた親和性カラムクロマトグラフィーにより、発現したストラドマーを細胞培養液から精製できる。本発明は、同一のアミノ酸配列を有するストラドマー単量体同士、実質的に類似のアミノ酸配列を有するストラドマー単量体同士、または異なる配列を有するストラドマー単量体同士の会合を通じて形成されるストラドマーの両方を包含する。後者の実施形態では、ストラドマーをなす複数のストラドマー単量体のアミノ酸配列は、２つ以上の機能的ＦｃγＲ結合部位が形成されるような類似度であればよい。
本発明の方法で作製したＧ０４５ｃ（配列番号４）は、クレームされているリーダー配列（配列番号１）の配列がＩｇＧ１のＦｃ（配列番号２）のＮ末端と直接結合し、このＩｇＧ１のＦｃの末端を介してさらに、ＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメイン（配列番号３）と直接結合したものを含むものであるが、配列番号６、７に示すＩｇＧ１のＦｃ単量体の制限部位のような外来性配列（以前は機能的に重要とは考えられていなかった配列）を含む以前の分子に見られた多量体形成と比較して、このＧ０４５ｃは、驚くべきことに、より高次の多量体形成をもたらした。実際、得られたＧ０４５ｃストラドマー調製物の約７４％が多量体を含むのに対し、単量体を含んでいるのは、この組成物のわずか２６％であった。このことは、外来性配列を有する分子を含む調製物と対照的である。外来性配列を含む調製物の場合、組成物のわずか約２７％が多量体を含み、７２％は単量体として存在する。さらに、配列番号４のストラドマー単量体で生成された高次の多量体は、以前に説明されているストラドマーを含む以前の外来性配列と比較して、驚くほど優れた効力を有していた。したがって、本発明の一実施形態では、多量体化ドメインは、ストラドマー単位の高次多量体を生成する。さらなる実施形態では、得られるストラドマー組成物の少なくとも約３５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態では、得られるストラドマー組成物の少なくとも約５５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態では、得られるストラドマー組成物の少なくとも約６５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態では、得られるストラドマー組成物の少なくとも約７０％は、ストラドマー単位の多量体を含む。さらなる実施形態では、得られるストラドマー組成物の少なくとも約７５％は、ストラドマー単位の多量体を含む。
上記で示したように、Fc 領域は、ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１、および／またはＦｃγ受容体に結合する能力により機能の面から定義できる。本発明の化合物は、ＩｇＧ２ａ対照群よりはるかに高い親和性で、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、および／またはＳＩＧＮ−Ｒ１を含む同族受容体に結合する（図５および図６）。結果として、Fc 領域をなすＦｃ部分ドメインに応じて、Fc 領域の特定のアミノ酸配列が変化する。しかしながら、本発明の一実施形態では、Fc 領域は、免疫グロブリン分子のヒンジ領域とＣＨ２ドメインを含む。さらなる好ましい実施形態では、Fc 領域は、免疫グロブリン分子のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。さらなる実施形態では、Fc 領域は、免疫グロブリン分子のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメインを含む。さらに別の実施形態では、Fc 領域は、免疫グロブリン分子のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ４ドメインを含む。さらなる好ましい実施形態では、Fc 領域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。好ましい実施形態では、Fc 領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む（配列番号２）。別の好ましい実施形態では、Fc 領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む（配列番号１９）。
ストラドマー単量体間結合
本発明の生物模倣型化合物に見られる別個の結合として、本発明のストラドマーをなす２つ以上の個々のストラドマー単量体間に発生する「ストラドマー単量体間結合」がある。ドメイン結合が、生物模倣型化合物の個々のストラドマー単量体を含むFc 領域単量体同士や部分Fc 領域単量体同士を連結する働きをする短いアミノ酸配列であるのに対し、ストラドマー単量体間結合は、生物模倣型化合物をなす２つ以上の個々のストラドマー単量体を連結する働きをする。ストラドマー単量体間結合は、個々のストラドマー単量体を安定して会合できるのであれば、任意の結合でよい。いくつかの実施形態では、ストラドマー単量体間結合は、ストラドマー単量体間の共有結合であり得る。あるいは、ストラドマー単量体間のストラドマー単量体間結合は、直接的な化学的架橋による結合であり得る。好ましい実施形態では、ストラドマー単量体構造は、Fc 領域単量体間の自然な自己凝集特性を利用して、自己会合性ストラドマーを生成する。このような実施形態の一部では、この自己凝集は、自然の中で通常見られるジスルフィド共有結合なしで発生する。理論に拘束されるものではないが、例えば無傷のＩｇＧ１は、ヒンジ領域に２つのシステイン結合を有するのに対し（Dorai H. Role of inter-heavy and light chain disulfide bonds in the effector functions of human immunoglobulin IgG1. Molecular Immunology. 29;12, 1992,1487-1491; Meulenbroek AJ and Zeijlemaker WP. Human IgG Subclasses: Useful diagnostic markers for immunocompetence. ISBN 90-5267-011-0 ）、Ｇ０４５のＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１のＣＨ３ドメインは、単量体間結合を示さない。すなわちＧ０４５では、すべての単量体間結合はＩｇＧ２ヒンジドメインのＣ末端で発生する。他の実施形態では、個々のストラドマー単量体間にジスルフィド結合が形成されて、ストラドマーが形成される。ジスルフィド結合は、天然のFc 領域単量体配列に生じるシステイン残基、または部位特異的突然変異誘発によってFc 領域単量体に取り込まれたシステイン残基のいずれかを利用して、生物模倣型分子をなすFc 領域単量体のシステイン残基間に形成される。また、このような自然の自己凝集特性を利用して、ストラドマー多量体の個々のストラドマー単量体間にストラドマー単量体間結合を形成することもできる。好ましい実施形態では、ストラドマー単量体間結合を形成するシステイン残基は、Ｇ０４５の成熟タンパク質のＩｇＧ２ヒンジドメインの位置２３６、２３７、２４０、および２４３にある。好ましい実施形態では、ストラドマー単量体間結合を形成するシステイン残基は、Ｇ０５１の成熟タンパク質のＩｇＧ２ヒンジドメインの位置４、５、８、および１１にある。別の実施形態に含まれるストラドマー単量体間結合では、個々のストラドマー単量体をなすアミノ酸配列に部位特異的突然変異誘発により導入されたシステイン残基間に、ジスルフィド結合が形成される。
上述したように、好ましい実施形態では、ストラドマーを形成するストラドマー単量体間結合は、ストラドマー単量体の自己凝集によって生じる結合である。一実施形態では、ストラドマーをなす２つのストラドマー単量体は同一のペプチドであるため、ストラドマーをなす２つの個々のストラドマー単量体は、配列が同一である。しかしながら、当業者であれば、他の実施形態に含まれるストラドマーでは、ストラドマー単量体のアミノ酸配列が互いに異なることを理解するであろう。
２つのストラドマー単量体は、例えば、ストラドマー単量体における同一のＦｃ部分ドメイン単量体間に対合が生じるように平行に整列配置させることで、ストラドマーを形成することができる。しかしながら、本発明はまた、同一でないＦｃ部分ドメイン単量体間で対合が生じる実施形態や、ストラドマー単量体の同一のＦｃ部分ドメイン単量体間で対合が生じるが、２つのストラドマー単量体のアライメントがずれている実施形態も含む。
クラスターストラドマー
「クラスターストラドマー」とは、中心部分である「頭部」と２つ以上の「脚部」とを有する放射状の形態をした生物模倣体であり、それぞれの脚部が、少なくとも１つのＦｃγ受容体を結合できる１つ以上のFc 領域を含むため、２つ以上のＦｃγ受容体に結合できる生物模倣体が形成される。それぞれのクラスターストラドマーは、各々「クラスターストラドマー単位」と呼ばれる複数の二量体タンパク質で構成される。各クラスターストラドマー単位は、多量体化領域と、少なくとも１つの機能的Fc 領域を含む「脚部」領域とで構成される。多量体化領域は、別のクラスターストラドマー単位と多量体化すると、クラスターストラドマー単位の「頭部」となる。脚部領域は、各脚部領域のFc 領域と同じ数のＦｃγ受容体と結合できる。このように、クラスターストラドマーは、２つ以上のＦｃγ受容体と結合して、結合親和性と結合活性を増加させることのできる生物模倣型化合物である。
多量体化領域は、二量体タンパク質をさらに多量体化させるペプチド配列であってもよく、あるいは、二量体タンパク質の多量体化を促進するグリコシル化であってもよい。ペプチドの多量体化領域の例として、ＩｇＧ２のヒンジ、ＩｇＥのＣＨ２ドメイン、イソロイシンジッパー、コラーゲンのグリシン−プロリン−プロリン繰返し（「ＧＰＰ」）、およびジンクフィンガーが挙げられる。グリコシル化がペプチドの多量体化に及ぼす影響については、当技術分野において詳細に説明されている（例えば、Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams and Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 80, No. 9, [Part 1 : Biological Sciences] (May 1, 1983), pp. 2771-277 '4; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka and Haruko Ogawa. International Congress Series Volume 1223, December 2001, Pages 97-101 ）。
多量体化領域は、ペプチドを二量体化または多量体化させるペプチド配列であってもよく、ＩｇＧ２のヒンジ、ＩｇＥのＣＨ２ドメイン、イソロイシンジッパー、コラーゲンＧＰＰ、およびジンクフィンガーを含む。当技術分野で知られているように、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域は共有結合二量体を形成できる（Yoo, E.M. et al. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007) ）。ＩｇＧ２の二量体形成は、Ｃ−Ｃ結合によるＩｇＧ２のヒンジ構造を介してなされる可能性がある（Yoo. et al., 2003 ）。このことは、ヒンジ構造が単独で二量体形成を介在できることを示唆している。しかし、ヒト血清に見られるＩｇＧ２二量体は、量に限りがある。ホモ二量体の二量体として存在するＩｇＧ２の量は、ＩｇＧ２全体の１０％未満と概算されている（Yoo et al. 2003 ）。さらに、ホモ二量体の二量体を超えたＩｇＧ２の多量体化ドメインの定量的証拠は存在しない（Yoo et al. 2003 ）。すなわち、天然のＩｇＧ２がヒト血清において高次の多量体を形成したという発見はなされていない。したがって、本明細書に提示する結果は、ＩｇＧ２ヒンジを含むストラドマー（すなわちＧ０４５ｃ、Ｇ０１９、およびＧ０５１）が高次の多量体に存在するという点で、特に驚くべきことである。また、ＩｇＧ２ヒンジが可変かつ動的であるヒト血清中の天然ＩｇＧ２とは異なり、Ｇ０４５ｃは、より安定度の高い多量体を形成することが示され、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、分析超遠心、および湿度１００％、温度３７℃での３ヶ月間の安定性実験により証明された。さらに、ＩｇＧ２ヒンジを含むストラドマー調製物の量が、ヒト血清のＩｇＧ２に見られる１０％という数字より著しく多いことも、驚くべきことである。例えば、Ｇ０４５ｃの調製物において、ホモ二量体の二量体を含む多量体の量は約６７％である。
ヒトＩｇＧ２のヒンジ単量体のアミノ酸配列は、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号３）である。配列番号３の４つのシステインのいずれか１つの突然変異が、ストラドマーの多量体化の大幅減少と関連している可能性がある。ＩｇＧ２ヒンジ単量体のＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃ部分が２つある。よって、本発明のストラドマー単量体は、ＩｇＧ２のヒンジ単量体の１２のアミノ酸からなる完全な配列を含むこともあれば、４つのアミノ酸からなるコアとFc 領域単量体のどちらか一方または両方を含むこともある。コア構造のＸ−Ｘは任意のアミノ酸でよいが、好ましい実施形態では、Ｘ−Ｘ配列はＶ−ＥまたはＰ−Ｐである。当業者であれば、ＩｇＧ２のヒンジ単量体は、コアの４つのアミノ酸からなる構造に加えて、ヒンジ配列の任意の部分（ＩｇＧ２のヒンジ配列全部と、ＩｇＧ２のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン単量体配列の一部または全部を含む）で構成されてよいことを理解するであろう。理論に拘束されるものではないが、ＩｇＧ２のヒンジ多量体化ドメインは、ストラドマー単量体の任意の部分と相互作用することにより多量体を形成できる。すなわち、あるストラドマー単量体のＩｇＧ２ヒンジが、天然ＩｇＧ１のＦｃと比べてＦｃ受容体との機能的結合が大きい状態を保持しながら、別のストラドマー単量体のＩｇＧ２ヒンジと結合して、ホモ二量体の二量体、またはより高次の多量体を形成できる。あるいは、あるストラドマー単量体のＩｇＧ２ヒンジドメインが、天然ＩｇＧ１のＦｃと比べてＦｃ受容体との機能的結合が大きい状態を保持しながら、別のストラドマー単量体のＩｇＧ１ヒンジと結合して、ホモ二量体の二量体、またはより高次の多量体を形成できる。また、あるストラドマー単量体のＩｇＧ２ヒンジドメインが、天然ＩｇＧ１のＦｃと比べてＦｃ受容体との機能的結合が大きい状態のまま、ＩｇＧ１のFc 領域の別の部分、すなわち別のストラドマー単量体のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインと結合して、ホモ二量体の二量体、またはより高次の多量体を形成することも可能である。
ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパーを、多量体化領域として使用することもできる。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパー（コイルドコイルドメイン）は、タンパク質の二量体、三量体、および四量体の形成を促進することが知られている（Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993); O'Shea et al. Science 243 :538 (1989) ）。イソロイシンジッパーが三量体を形成する生来の傾向を利用して、クラスターストラドマーを生成できる。
当業者であれば、様々なタイプのロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパーを利用できることを理解するであろうが、好ましい実施形態では、説明されている通り（Morris et al., Mol. Immunol. 44:3112-3121 (2007) ；Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993) ）に改変されたＧＣＮ４転写調節因子由来のイソロイシンジッパーを使用する：ＧＧＧＳＩＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬ ＩＧＥＲＧＨＧＧＧ（配列番号５）。このイソロイシンジッパー配列は、Fc 領域単量体の多量体化に使用可能ないくつかの配列のうちの１つにすぎない。配列番号５に示す配列全体を用いてもよいが、この配列の下線を付した部分が、本発明のクラスターストラドマーで使用できるイソロイシンジッパーのコア配列を表している。このように、本発明のストラドマー単量体は、イソロイシンジッパーのアミノ酸からなる完全な配列を含むものでよく、または、２８のアミノ酸からなるコアおよび１つ以上のFc 領域単量体を含むものでもよい。また、当業者であれば、イソロイシンジッパーは、２８のアミノ酸からなるコア構造と、ジッパーの任意の部分とで構成されていてよく、よって２８以上のアミノ酸で構成されるが、完全な配列未満であってもよいことを理解するであろう。
ＧＰＰは、ヒトコラーゲンに見られるアミノ酸配列であり、コラーゲンタンパク質：タンパク質結合を発生させる。当業者であれば、多量体化ドメインとして様々なタイプのＧＰＰ繰返しを使用できることを理解するであろうが、好ましい実施形態では、（Fan et al FASEB Journal 3796 vol 22 2008 に記載されている）グリシン−プロリン−プロリンの繰返しを使用する（配列番号２６）。このグリシン−プロリン−プロリン繰返し配列は、Fc 領域単量体の多量体化に利用可能ないくつかの配列のうちの１つにすぎない。配列番号２６に示す配列全体を使用できるが、長さの異なる繰返しを用いてFc 領域単量体を多量体化することも可能である。同様に、ＧＰＰ繰り返しの中に異なるアミノ酸を含む繰返しで置き換えてもよい。
本明細書に開示されるストラドマーおよび他の生物模倣型分子は、様々な種のいずれに由来していてもよいと理解される。実際、本発明の任意の１種類の生物模倣型分子におけるFc 領域またはＦｃ部分ドメインを、複数の（例えば、２、３、４、５、またはそれよりも多くの）種の免疫グロブリンから誘導できる。しかしながら、単一の種から誘導するのがより一般的である。また、本明細書に開示の方法（例えば、治療方法）のいずれも、任意の種に適用できることが理解されるであろう。一般に、対象となっている種に適用される生物模倣体の構成要素はすべて、その種に由来する。しかしながら、すべての成分の種が異なる生物模倣体、または、すべての成分が（該当する方法の適用対象である種を含む、もしくは含まない）複数の種に由来する生物模倣体を使用することも可能である。
本発明によるストラドマーおよび他の生物模倣体のFc 領域およびＦｃ部分ドメインをなす特定のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン、およびヒンジ領域は、免疫グロブリンのサブクラス、およびその派生元である生物の両方について、独立して選択できる。したがって、本明細書に開示されるストラドマーおよび他の生物模倣体は、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、ＩｇＡｌ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、またはイヌＩｇＡもしくはＩｇＢなどの様々な免疫グロブリンタイプに独立して由来するFc 領域および部分Fc 領域を含むことができる。好ましくは、ヒトの治療法の場合、本発明のFc 領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプのドメインである。同様に、種特異的またはキメラのストラドマー分子を生成するためには、各Fc 領域および部分Fc 領域は、様々な種に由来するものであってよく、好ましくは、非ヒト霊長類（例えばサル、ヒヒ、チンパンジーなど）、ヒト、ネズミ、クマネズミ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒルなど）を含む哺乳類の種、魚類、および爬虫類に由来する。
個々のFc 領域および部分Fc 領域は、ヒト化されていてもよい。当業者であれば、様々なFc 領域および部分Fc 領域から、様々なタイプの機能が得られることを理解するであろう。例えば、ＦｃγＲはＩｇＧ免疫グロブリンと特異的に結合し、他のクラスの免疫グロブリンとはあまり結合しない。このため、複数のＦｃγ受容体との結合能を有するストラドマーを設計しようとする当業者であれば、ＩｇＧの十分に特徴付けされたＦｃγ受容体結合配列（下側のＩｇＧヒンジ領域および／またはＩｇＧのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの結合配列を含む）を少なくとも組み込んだストラドマーFc 領域を設計するであろう。また、当業者であれば、特定のＩｇドメインを用いることは、ＩｇＡの点滴に付随するアナフィラキシーなどの様々な有害な結果を伴い得ることも理解するであろう。本明細書に開示する生物模倣体は、一般に、このような影響を回避するように設計すべきであるが、特定の状況では、このような影響が望ましい場合もある。
また、本発明は、天然に生じるFc 領域またはＦｃ部分ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸を有するFc 領域およびＦｃ部分ドメインを含むストラドマーも包含する。本発明の生物模倣型化合物に含めるのに好ましいFc 領域は、ホロＦｃγ受容体、またはＦｃγＲの可溶性細胞外ドメイン部分のどちらかに対して測定可能な特異的結合親和性を有する。多数のFc 領域およびFc 領域単量体の一次アミノ酸配列およびＸ線結晶学的構造を、当技術分野において利用できる。例えば、Woof JM, Burton DR. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. 2004 Feb;4(2):89-99 を参照のこと。Ｆｃγ受容体結合能のある代表的なFc 領域として、ヒトＩｇＧ１由来のFc 領域（配列番号２）が挙げられる。これらの天然配列については、機能的配列の部位特異的突然変異マッピングを含め、詳しい構造機能解析がなされている。当業者であれば、これらの過去の構造機能研究および利用可能な結晶学データに基づき、Fc 領域のＦｃγＲ受容体結合能を保ちつつ、機能的Fc 領域配列変異体を設計できる。例えば、システイン残基を付加して単量体間のジスルフィド結合を増強したり、これを欠失させてストラドマーのホモ二量体間の相互作用を変化させたりできる。
アミノ酸の変化は、Fc 領域の配列全体に見られてよく、あるいは、Fc 領域を含む特定のＦｃ部分ドメインに分離されていてもよい。本発明のストラドマーおよび他の生物模倣体に用いられるFc 領域の機能的変異体は、天然のFc 領域と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。同様に、本発明のストラドマーおよび他の生物模倣体に用いられるＦｃ部分ドメインの機能的変異体は、天然のＦｃ部分ドメインと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
本発明のＦｃ断片単量体、Ｆｃ部分断片単量体、ストラドマー単量体、および他の単量体の作製に際してFc 領域単量体の機能的変異体を使用することも、本発明に包含され、当業者であればこれを理解するであろう。Fc 領域単量体の機能的変異体は、天然のFc 領域単量体配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
同様に、本発明のＦｃ断片単量体、Ｆｃ部分断片単量体、Fc 領域単量体、ストラドマー単量体、および他の単量体の作製に際してＦｃ部分ドメイン単量体の機能的変異体を使用することも、本発明に包含される。Ｆｃ部分ドメイン単量体の機能的変異体は、天然のＦｃ部分ドメイン単量体配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
アミノ酸が変化することにより、Ｆｃγ受容体に対するストラドマーの結合親和性が増減することもあれば、変化しないこともある。好ましくは、このようなアミノ酸の変化は保存的アミノ酸置換であるが、このような変化には、欠失、付加、および他の置換が含まれる。保存的アミノ酸置換は一般に、以下の群内での変化を含む。グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニン；リジン、ヒスチジン、およびアルギニン；フェニルアラニンおよびチロシン。加えて、アミノ酸が変化すること、例えばシステイン残基を付加することにより、多量体化の強度を増強できる。
アミノ酸の変化は、Fc 領域多型をもたらす天然由来のアミノ酸変化であってよい。あるいは、例えば部位特異的突然変異によりアミノ酸変化を導入してもよい。Fc 領域がその受容体結合機能と生物活性を保持する限り、アミノ酸変化はFc 領域内のどこで発生してもよい。好ましい実施形態では、多型または突然変異の結果として、受容体結合が亢進され、かつ／または多量体化もしくは生物学的機能が亢進される。この多型／突然変異は、好ましくは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) に示されるＥＵインデックスによるアミノ酸位置２３３〜４３５の１つ以上で発生する。これらのアミノ酸位置における具体的な多型／突然変異は当技術分野でよく知られており、例えばShields, et al. (2001) “High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for Fc γRI, Fc γRII, Fc γRIII and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the Fc γR, ” J. Biol. Chem., 276(9):6591-6601 （この文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記述されている。
好ましい実施形態では、この多型／突然変異は、ＩｇＧ１のＦｃの位置２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２８０、２８５、２８６、２８８、２９０、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１５、３１７、３２２、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３９２、４１４、４１５、４２４、４３０、４３３、４３４、４３５、および／または４３６の１つ以上のアミノ酸置換を含む。さらなる実施形態では、この多型／突然変異は、ＩｇＧ１のＦｃの位置２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２８０、２８５、２８６、２８８、２９０、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１５、３１７、３２２、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３９２、４１４、４１５、４２４、４３０、４３３、４３４、４３５、および／または４３６の２つ以上のアミノ酸置換を含む。さらなる実施形態では、この多型／突然変異は、ＩｇＧ１のＦｃの位置２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２８０、２８５、２８６、２８８、２９０、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１５、３１７、３２２、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３９２、４１４、４１５、４２４、４３０、４３３、４３４、４３５、および／または４３６の３つ以上のアミノ酸置換を含む。さらなる実施形態では、この多型／突然変異は、ＩｇＧ１のＦｃの位置２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２８０、２８５、２８６、２８８、２９０、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１５、３１７、３２２、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３９２、４１４、４１５、４２４、４３０、４３３、４３４、４３５、および／または４３６の３つより多いアミノ酸置換を含む。
「機能的変異体」という用語は、本明細書で使用する場合、参照配列と同じ生物学的効果を介在できる（ポリペプチドの場合）か、参照配列がコードするポリペプチドと同じ生物学的効果を介在できるポリペプチドをコードする（ポリヌクレオチドの場合）、相同性に関して参照配列と関連する配列を指す。例えば、本明細書に記載のいずれの生物模倣体の機能的変異体も、指定の相同性または同一性を有し、単球またはＤＣの免疫調節ができると考えられる。機能的配列変異体には、ポリヌクレオチドとポリペプチドの両方が含まれる。配列同一性は通常、ＢＬＡＳＴ ２．０（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）をデフォルトのパラメータ、すなわちフィルタ−オン、スコア行列−ＢＬＯＳＵＭ６２、ワードサイズ−３、Ｅ値−１０、ギャップコスト−１１，１、およびアライメント−５０で用いて評価される。
上記から、本発明のストラドマーには、（ａ）天然に生じるFc 領域のみを有するストラドマー、（ｂ）天然に生じるFc 領域と、アミノ酸配列が変化したFc 領域との混合物を有するストラドマー、および（ｃ）アミノ酸配列が変化したFc 領域のみを有するストラドマー、が含まれることが理解されるであろう。アミノ酸配列の変化したストラドマーに唯一必要とされることは、天然に生じる配列を有するFc 領域を含む対応するストラドマーが２つ以上のＦｃγＲ受容体と結合する能力の、少なくとも２５％；３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；８０％；９０％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％；９９．５％；もしくは１００％、またはそれより多くを有することである。
本発明のストラドマーに生じる上述のＦｃγ受容体結合部位の配列を遺伝子操作により変化させ、天然配列と比べて親和性と結合能が変化した結合部位を、予測に従って誘導することができる。例えば、ＦｃγＲＩＩｂに対する生物模倣型化合物のFc 領域結合を低減する一方で、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合を増大させるように、特定の残基を変化させることができる。ｈＩｇＧのＦｃγ受容体結合配列に関する突然変異誘発ベースの広範な構造機能解析の一例が、Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for Fc γRI, Fc γRII, Fc γRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the Fc γR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591-6604 である。マウスＩｇＧのＦｃ（ｍＩｇＧのＦｃ）でも同様の研究が行われている。当業者であれば、種ごとの天然ＩｇＧのFc 領域の構造相同性と一次配列相同性に基づき、ヒトＩｇＧのＦｃおよびマウスＩｇＧのＦｃの構造−機能に関する広範な知識を、本発明の生物模倣型化合物におけるすべての天然Ｆｃγ受容体結合部位配列の合理的な突然変異誘発に適用して、特定のＦｃγ受容体特異性および結合親和性を有する結合部位を設計するであろう。
天然Fc 領域のアミノ酸配列の組成に加えて、Fc 領域の糖質含有量も、Fc 領域の構造およびＦｃγＲとの結合相互作用に重要な役割を果たすことが知られている。例えば、Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc γRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., JuI 2002; 277: 26733-26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright and Sherie L. Morrison. Effect of C2- Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgGl Antibodies in Glycosylation Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells. J. Immunol, Apr 1998; 160: 3393-3402 を参照のこと。糖質含有量は、例えば、特定の細胞系を含む特定のタンパク質発現系を用いるか、またはインビトロの酵素修飾を用いて制御できる。したがって、本発明は、ドメインの取得元のホロ抗体本来の糖質含有量を有するFc 領域を含むストラドマー、および、糖質含有量が変化した生物模倣型化合物を含む。別の実施形態では、ストラドマーの多量体成分は、同じストラドマーのホモ二量体成分とはグリコシル化パターンが異なるという特徴を有する。好ましい実施形態では、多量体に含まれるグリコシル化パターンがＦｃ受容体結合を亢進するように、ストラドマーを濃縮する。
Ｆｃ部分ドメインのポリペプチド鎖に加えて、多量体化領域、あるいはグリコシル化変化により、Fc 領域のコンホメーションの変化が生じ、Ｆｃγ受容体へのFc 領域の結合が亢進され得る。よって、ポリペプチドに対する変更が非常に小さく見えても、複数のＦｃγ受容体の結合を増強できるストラドマー、あるいは、複数のＦｃγ受容体との結合能が低下したストラドマーを作製することもできる。
部分ドメインおよび部分断片
当業者はさらに、本発明の実施形態で用いられるFc 領域およびＦｃ部分ドメインが全長バージョンでなくてもよいことを認識するであろう。すなわち、本発明は、本発明のストラドマーおよび他の生物模倣体をなす特定のFc 領域単量体およびＦｃ部分ドメイン単量体のアミノ末端、カルボキシ末端、または中程からアミノ酸が欠如した、Fc 領域単量体およびＦｃ部分ドメイン単量体の使用を包含する。
例えば、Ｆｃγ受容体に対するヒトＩｇＧ免疫グロブリンの結合部位が説明されている（例えばRadaev, S., Sun, P., 2001. Recognition of Immunoglobulins by Fc γ Receptors. Molecular Immunology 38, 1073-1083; Shields, R.L. et. al., 2001. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgGl for Fc γRI, Fc γRII, Fc γRIII, and FcRn and Design of IgGl Variants with Improved Binding to the Fc γR. J. Biol. Chem. 276 (9), 6591-6604 など）。こうした知識に基づき、これらの免疫グロブリンのFc 領域からアミノ酸を除去して、Fc 領域と受容体の間の結合相互作用に及ぼす影響を判断できる。よって、本発明は、Radaev, S., Sun, P., 2001 に定義されている下側ヒンジおよびＣＨ２の位置２３３〜３３８を包含するアミノ酸の、少なくとも約９０％を有するＩｇＧのFc 領域を包含する。
本発明のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分ドメインは、ヒンジ領域の全部または一部、ＣＨ２ドメインの全部または一部、およびＣＨ３ドメインの全部または一部を含む。
ヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメインの一部、またはＣＨ３ドメインの一部のみを有するＩｇＧのＦｃ部分ドメインは、Ｆｃ部分ドメイン単量体から構築される。よって、本発明は、ヒンジ領域のＮ末端またはヒンジ領域のＣ末端に由来するＩｇＧのヒンジ領域単量体を含む。これらの単量体は、例えば、ヒンジ領域の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２個のアミノ酸（ＩｇＧ１では最大１５、ＩｇＧ２では最大１２、ＩｇＧ３では最大６２、ＩｇＧ４では最大１２）を含み得る。
また、本発明は、ＣＨ２ドメインのＮ末端またはＣＨ２ドメインのＣ末端に由来するＩｇＧのＣＨ２ドメイン単量体も含む。よって、これらの単量体は、例えば、ＣＨ２ドメインの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１１０個のアミノ酸（ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の場合は最大１１０、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では最大１０９）を含み得る。
本発明はさらに、ＣＨ３ドメインのＮ末端またはＣＨ３ドメインのＣ末端に由来するＩｇＧのＣＨ３ドメイン単量体を含む。よって、これらの単量体は、例えば、ＣＨ３ドメインの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、または１０７個のアミノ酸（ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の場合は最大１０６、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では最大１０７）を含み得る。
上記から、本発明の様々な実施形態が、（ａ）全長Fc 領域を含有するストラドマー、（ｂ）全長Fc 領域とＦｃ部分ドメインの混合物を含有するストラドマー、および（ｃ）Ｆｃ部分ドメインを含有するストラドマー、を含むことが理解されるであろう。これらの実施形態の各々において、ストラドマーはさらにＣＨ１ドメインを含むことができる。本明細書で説明するように、本発明のストラドマーの各実施形態において、ストラドマーは２つ以上のＦｃγ受容体と結合する能力を有する。
ストラドマーおよびストラドマー単量体の好ましい実施形態
「ＦｃγＲ」および「Ｆｃγ受容体」という用語は、本明細書で使用する場合、Nimmerjahn F and Ravetch JV. Fcgamma receptors: old friends and new family members. Immunity. 2006 Jan; 24(1):19-28 で説明され、または下記に定義されるように、免疫細胞表面に発現するタンパク質のＦｃγ受容体ファミリーの各メンバーを含む。本明細書に記載の「ＦｃγＲ」という用語は、ＦｃγＲＩ、ＲＩＩ、およびＲＩＩＩファミリーのすべてのメンバーを包含することを意図している。Ｆｃγ受容体は、低親和性のＦｃγ受容体と高親和性のＦｃγ受容体とを含み、ヒトにおける例として、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびそのアイソタイプおよびアロタイプであるＦｃγＲＩＩａ ＬＲ、ＦｃγＲＩＩａ ＨＲ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩｃ；ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびそのアイソタイプであるＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、本発明が、例えばDavis, et al. (2004) “Differential B cell expression of mouse Fc receptor homologs, ” Int. Immunol., 16(9):1343-1353 に説明されているようなＦｃγＲおよびＦｃγＲ相同体と結合する化合物を含み、本発明が、まだ発見されていないと考えられる未来のＦｃγＲおよび関連のイソタイプとアロタイプに適用されることを認識するであろう。
ｈＩＶＩＧが新生児Ｆｃ受容体（「ＦｃＲｎ」）と結合し、これを完全に飽和させることや、ＦｃＲｎのこのような競合的阻害がｈＩＶＩＧの生物活性で重要な役割を果たす可能性があることは、すでに説明されている（Mechanisms of Intravenous Immunoglobulin Action in Immune Thrombocytopenic Purpura. F. Jin, J. Balthasar. Human Immunology, 2005, Volume 66, Issue 4, Pages 403-410 など）。Ｆｃγ受容体と強く結合する免疫グロブリンは、少なくともある程度はＦｃＲｎとも結合するため、当業者であれば、複数のＦｃγ受容体と結合できるストラドマーはＦｃＲｎとも結合し、ＦｃＲｎを完全に飽和し得ることを認識するであろう。
「ＦｃγＲｘに特異的に結合できる」とは、本明細書で使用する場合、ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）への結合をいう。特異的な結合とは、一般に、後に結合アッセイにおいて過剰量の未標識リガンドで置換可能な標識リガンドの量と定義される。しかしながら、このことは、当技術分野において十分に確立された他の特異的結合の評価手段を除外するものではない（例えば、Mendel CM, Mendel DB, ‘Non-specific ’ binding. The problem, and a solution. Biochem J. 1985 May 15;228(1):269-72 ）。当技術分野でよく知られている様々な方法、例えば、（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を通じて市販されている）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術や、（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）を通じて市販されている）バイオレイヤー干渉法により、特異的結合を測定して、免疫学的に活性な生物模倣体の会合定数と解離定数の両方を特徴付けすることができる（Asian K, Lakowicz JR, Geddes C. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:538-544 ）。
「凝集した天然ＩｇＧの免疫学的活性」とは、免疫系がＩｇＧ凝集体に曝露したときに、免疫系の機能に影響を及ぼす多量体化ＩｇＧの特性をいう。天然の多量体化ＩｇＧの具体的な特性としては、ＦｃγＲに対する特異的結合の変化、免疫細胞表面でのＦｃγＲの架橋、または、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食（ＡＤＣＰ）、補体結合といった多量体化ＩｇＧのエフェクター機能が挙げられる（例えば、Nimmerjahn F, Ravetch JV. The anti-inflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 2007; 204:11-15; Augener W, Friedman B, Brittinger G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)? Blut. 1985;50:249-252; Arase N, Arase H, Park SY, Ohno H, Ra C, Saito T. Association with FcRgamma is essential for activation signal through NKR-Pl (CD161) in natural killer (NK) cells and NKl.1+ T cells. J Exp Med. 1997;186:1957-1963; Teeling JL, Jansen- Hendriks T, Kuijpers TW, et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood. 2001;98: 1095- 1099; Anderson CF, Mosser DM. Cutting edge: biasing immune responses by directing antigen to macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 2002; 168:3697-3701; Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for Fc γR: current models. Immunology Letters. 2002;82:57; Banki Z, Kacani L, Mullauer B, et al. Cross-Linking of CD32 Induces Maturation of Human Monocyte - Derived Dendritic Cells Via NF- {kappa} B Signaling Pathway. J Immunol. 2003;170:3963-3970; Siragam V, Brine D, Crow AR, Song S, Freedman J, Lazarus AH. Can antibodies with specificity for soluble antigens mimic the therapeutic effects of intravenous IgG in the treatment of autoimmune disease? J Clin Invest. 2005;l 15:155-160 を参照のこと）。これらの特性は通常、ホモ二量体ＩｇＧの特性と比較することにより評価される。
「天然に生じる複数の凝集ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃγ受容体架橋またはエフェクター機能に匹敵するか、これよりも優れている」とは、本明細書で使用する場合、ストラドマーのＦｃγ受容体架橋アッセイ値が、ｈＩＶＩＧの類似の用量または濃度を用いて達成される値の約７０％以上であることを意味する。いくつかの実施形態では、このアッセイ値は、ｈＩＶＩＧを用いて達成されるアッセイ値の少なくとも標準誤差の範囲内である。他の実施形態では、このアッセイ値は、同用量のｈＩＶＩＧの値の１１０％以上である。ＦｃγＲ架橋に関するアッセイは当業者によく知られている（例えば、Nimmerjahn and Ravetch, (2008) “Fc γ receptors as regulators of immune responses, ” Nature Reviews Immunology, 8:34-47 を参照のこと）。
高次の多量体が免疫応答の調節において有効であることが判明したが、本発明者らは、驚くべきことに、ホモ二量体も有効な免疫調節因子であることを発見した。理論に拘束されるものではないが、ホモ二量体は、インビボで高次の多量体を形成できると確信される。本発明者らは、本来は純粋なホモ二量体の集団が、低レベルの血液またはウシ胎仔血清の存在下で多量体化できることを多量体化実験により発見した。したがって、ホモ二量体画分より高次多量体の方が、免疫応答の調節における効果が大きいが、本発明の天然に連結したストラドマーのホモ二量体画分も、低レベルの血液または血清の存在下でのホモ二量体の多量体化に部分的に起因して、有効な免疫調節因子となる可能性がある。したがって、本発明者らのいう「高次の多量体」とは、被検体に注入される前に溶液中でホモ二量体を超えて形成される多量体だけでなく、インビボでホモ二量体を超えて形成される多量体も意味する。
「免疫調節活性」、「免疫応答の調節」、「免疫系の調節」および「免疫調節」とは、ある細胞型内での細胞型の成熟、または他の細胞型への細胞型の成熟を含め、１つ以上の免疫細胞の活性、能力、および相対数を変えることで免疫系を変化させることを意味する。例えば、未成熟単球の免疫調節によって、成熟単球、樹状細胞、マクロファージ、または破骨細胞（いずれも未成熟単球に由来する）が増加した、大きな個体群が得られることがある。別の例では、メモリーＢ細胞の免疫調節により、特定のメモリーＢ細胞の選択的アポトーシスが得られ、それに付随して特定の抗体の産生が減少することがある。別の例では、ＮＫ細胞の免疫調節により、抗体依存性細胞障害が亢進されることがある。別の例では、免疫調節活性により、本来は高レベルで発現しない表現型の細胞、例えばＣＤ８β＋／ＣＤ１１ｃ＋細胞の個体群が増大することがある。別の例では、免疫調節活性により、炎症促進性のサイトカインや通常は自己免疫疾患で増加するサイトカイン、例えばＩＬ−６、ＩＬ−８が減少することがある。別の例では、免疫調節活性により、ＮＫＴ細胞が活性化し、続いてＴＧＦ−βの分泌と切断が生じることがある。例えば、免疫細胞受容体は、免疫学的に活性な生物模倣体による結合を受けて、細胞内シグナル伝達を活性化し、別途「活性化免疫調節」と呼ばれる様々な免疫細胞変化を誘導することがある。受容体の活性化を防ぐ封鎖免疫細胞受容体も「免疫調節」の範囲に包含されるが、これらの封鎖免疫受容体は、別途「阻害免疫調節」と呼ばれることもある。
樹状細胞の調節では、例えば樹状細胞の表面にＣＤ８６および／またはＣＤ１ａの発現を誘導することにより、Ｔ細胞に対する抗原提示を促進または阻害することができる。ＣＤ１ａはＭＨＣ−クラスＩ関連の糖タンパク質であり、抗原提示細胞（特に樹状細胞）の表面に発現する。ＣＤ１ａは、Ｔ細胞に対する脂質抗原の提示に関与する。ＣＤ８６も抗原提示細胞の表面に発現し、Ｔ細胞に共刺激を与える。ＣＤ８６は、Ｔ細胞表面のＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４双方に対するリガンドであり、それぞれに活性化シグナルと阻害シグナルを送る。したがって、ＣＤ８６とその同族受容体の発現レベルにより、寛容または特定の免疫応答を誘発するかどうかが決まる。好ましい実施形態では、本発明のストラドマーは、抗原提示細胞（特に樹状細胞）の表面にＣＤ８６およびＣＤ１ａの発現を誘導することに部分的に起因して、免疫応答を調節することができる。
単球の成熟の調節とは、単球から成熟ＤＣ、マクロファージ、または破骨細胞への分化をいう。分化を調節することにより、成熟の速度または方向付けを加速し、かつ／または分化中の単球数を増加させることができる。あるいは、分化速度および／または分化中の細胞数に関して、分化を縮小させることもできる。
「単離された」ポリペプチドまたはペプチドという語は、本明細書で使用する場合、天然に生じる対応物を持たないかポリペプチドもしくはペプチド、または、膵臓、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、筋肉、関節組織、神経組織、胃腸組織、乳房組織、もしくは腫瘍組織（乳癌組織など）などの組織、あるいは血液、血清または尿などの体液において、自然な状態でこれに付随する成分から分離もしくは精製されたポリペプチドもしくはペプチドを指す。一般に、ポリペプチドまたはペプチドは、自然に会合しているタンパク質および他の天然に生じる有機分子が乾燥重量で少なくとも７０％欠如している場合に、「単離された」とみなされる。好ましくは、本発明のポリペプチド（またはペプチド）の調製物は、乾燥重量で本発明のポリペプチド（ペプチド）の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％である。化学的に合成されるポリペプチドまたはペプチドは、その本質上、自然な状態でこれに付随する成分から分離されるため、合成ポリペプチドまたはペプチドは「単離された」ものである。
本発明の単離されたポリペプチド（またはペプチド）は、例えば、天然源からの（例えば組織または体液からの）抽出；このポリペプチドまたはペプチドをコードする組換え核酸の発現；または化学合成によって得られる。天然発生の源とは異なる細胞系から産生されたポリペプチドまたはペプチドは、天然の状態でこれに付随する成分を必然的に欠いているため、「単離された」ものである。好ましい実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、リーダーペプチド（配列番号１）、ＩｇＧ１のＦｃ単量体（配列番号２もしくは配列番号１９）およびＩｇＧ２のヒンジ多量体化ドメイン（配列番号３）、イソロイシン多量体化ドメイン（配列番号５）、またはＧＰＰ多量体化ドメイン（配列番号２６）に対応する配列のみを含み、タンパク質のクローニングまたは精製に役立つ可能性のあるさらなる配列（すなわち、誘導された制限酵素認識部位または精製タグ）を一切含まない。単離の度合いまたは純度については、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などの任意の適当な方法で測定できる。
医薬組成物
本明細書に記載のストラドマー組成物の投与は、一般的な任意の経路、すなわち経口的、非経口的、または局所的になされる。代表的な経路として、経口、経鼻、頬側、直腸内、膣内、点眼、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、腫瘍内、脊髄、くも膜下腔内、関節内、動脈内、くも膜下、舌下、口腔粘膜、経気管支、リンパ管、子宮内、皮下、腫瘍内、植込み型デバイス上（縫合糸など）もしくは植込み型デバイス内（植込み型ポリマーなど）に統合、硬膜内、皮質内、または経皮が挙げられるが、これらに限定されない。このような組成物は通常、本明細書に記載の薬剤的に許容可能な組成物として投与される。好ましい実施形態では、単離されたストラドマーを静脈内投与または皮下投与する。
「薬剤的に許容可能な担体」という語は、本明細書で使用する場合、あらゆる溶媒、分散媒、皮膜剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬剤的活性物質にこのような媒体や作用剤を用いることは、当技術分野において周知である。従来の媒体または作用剤の使用については、本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除き、従来の任意の媒体または作用剤を治療用組成物に使用することが企図されている。補助的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
本発明のストラドマー組成物は、中性または塩の形態で製剤してよい。薬剤的に許容可能な塩の例として、塩酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基との間で形成）が挙げられる。遊離カルボキシル基との間で形成される塩も、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導できる。
必要量のストラドマーを上に列記した他の様々な成分と一緒に適当な溶媒に入れた後、濾過滅菌することで、無菌注射剤が調製される。通常、ベースとなる基本分散媒や上に列挙した他の必要な成分を含有する滅菌媒体に様々な滅菌有効成分を組み込むことにより、分散液が調製される。無菌注射剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分に所望の成分を加えたものを事前に滅菌濾過溶液とし、その溶液から粉末を得る真空乾燥法および凍結乾燥法である。
さらに、ある実施形態は、経口投与に適したストラドマー組成物であり、不活性希釈剤を伴うか伴わずに、薬剤的に許容可能な担体で提供される。この担体は、吸収可能または食用であるべきであり、液体、半固体すなわちペースト、または固体の担体を含む。従来の媒体、作用剤、希釈剤、または担体の使用については、それに含まれるストラドマー調製物のレシピエントまたは治療効果にとって有害である場合を除き、本発明の方法を実施する際に使用する経口投与可能なストラドマーに用いることは適正である。担体または希釈剤の例として、脂、油、水、生理食塩溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、注入剤など、またはこれらの組み合わせが挙げられる。「経口投与」という用語は、本明細書で使用する場合、経口投与、頬側投与、経腸投与、胃内投与を含む。
一実施形態では、簡便かつ実際的な任意の方法、すなわち溶液、懸濁液、乳化、混合、カプセル化、マイクロカプセル化、吸収などによって、ストラドマー組成物と担体を組み合わせる。このような手法は、当業者にとっては常法である。
特定の実施形態では、粉末状のストラドマー組成物を、半固体または固体の担体と組み合わせるか十分に混合する。混合は、粉砕などの簡便な任意の方法で実施できる。組成物が治療活性を失う（すなわち胃で変性する）のを防ぐ目的で、混合過程で安定化剤を加えることも可能である。経口投与可能な組成物に使用する安定剤の例として、緩衝液、胃酸分泌に対するアンタゴニスト、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの糖質、タンパク分解酵素阻害剤などが挙げられる。より好ましくは、経口投与する組成物の場合、安定剤に、胃酸分泌に対するアンタゴニストを含めることもできる。
さらに、半固体または固体の担体と組み合わせた経口投与用のストラドマー組成物をさらに、ハードもしくはソフトゼラチンカプセル、錠剤、または丸剤に製剤することも可能である。より好ましくは、ゼラチンカプセル、錠剤、または丸剤を腸溶コーティングする。腸溶コーティングは、ｐＨが酸性の胃内または小腸上部での組成物の変性を防止する。米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に到達すると、小腸内の塩基性ｐＨによってコーティングが溶解し、組成物が放出されて、パイエル板Ｍ細胞などの腸細胞と相互作用できるようになる。
別の実施形態では、粉末状のストラドマー組成物を、内部に免疫学的に活性な生物模倣体を封入するナノ粒子、あるいは免疫学的に活性な生物模倣体が結合するナノ粒子を作り出す材料と組み合わせるか十分に混合する。各ナノ粒子のサイズは１００ミクロン以下である。ナノ粒子は、免疫学的に活性な生物模倣体の胃腸吸収を可能にし、経口的に生物が利用できるようにするのに必要な粘膜付着特性を有していてよい。
別の実施形態では、粉末状の組成物を、安定化剤を使用するか使用せずに、液体担体すなわち水または生理食塩溶液と組み合わせる。
使用できる特定のストラドマー製剤は、免疫学的に活性な生物模倣型タンパク質を、カリウムを含有しない低張リン酸緩衝液に加えた溶液であり、この緩衝液の組成は以下のとおりである。６ｍＭのリン酸二水素ナトリウム一水和物、９ｍＭのリン酸水素ナトリウム七水和物、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０± ０．１。低張緩衝液中の免疫学的に活性な生物模倣型タンパク質の濃度は、１０マイクログラム／ｍｌ〜１００ミリグラム／ｍｌの範囲にあってよい。この製剤は、任意の投与経路、例えば静脈内などの経路で投与できるが、これに限定されない。
さらに、半固体の担体と組み合わされる局所投与用のストラドマー組成物を、さらにクリームまたはゲル軟膏に製剤することも可能である。ゲル軟膏を形成するのに好ましい担体は、ゲルポリマーである。本発明のゲル組成物の製造に使用する好ましいポリマーとして、カーボポール、カルボキシメチルセルロース、プルロニックポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、皮膚表面または皮下の疾患を治療するための皮膚への塗布用に、０．５％〜５％ｗｔ／容量の強度で、粉末状Ｆｃ多量体組成物と、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９８０などの重合剤を含有する水性ゲルとを組み合わせる。「局所投与」という用語は、本明細書で使用する場合、皮膚、表皮、皮下、または粘膜表面への塗布を含む。
さらに、ストラドマー組成物を、皮下または真皮下植込み用のポリマーに製剤することもできる。植込み可能な薬剤注入ポリマー用の好ましい製剤は、一般に安全と認められている薬剤であり、例として架橋デキストラン（Samantha Hart, Master of Science Thesis, “Elution of Antibiotics from a Novel Cross-Linked Dextran Gel: Quantification ” Virginial Polytechnic Insitute and State University, june 8, 2009 ）、デキストラン−チラミン（Jin, et al. (2010) Tissue Eng. Part A. 16(8):2429-40 ）、デキストラン−ポリエチレングリコール（Jukes, et al. (2010) Tissue Eng. Part A., 16(2):565-73 ）、デキストラン−グルタルアルデヒド（Brondsted, et al. (1998) J. Controlled Release, 53:7-13 ）が挙げられる。当業者であれば、ポリマー内またはヒドロゲル内にストラドマーを組み込んで固定し、細孔サイズを所望の直径に調節することにより、多くの類似のポリマーおよびヒドロゲルを形成できることを認識するであろう。
製剤後、投与製剤に適合する方法で、かつ症候の改善または矯正につながる治療有効量で、溶液を投与する。製剤は、体内摂取可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。治療する被検体の状態に応じて、投与量がいくらか変動する可能性がある。投与の責任者は、いかなる場合でも、個々の被検体に適切な用量を判断することができる。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ生物学的製剤評価研究センターの基準が要求する滅菌性、一般的安全性、および純度の基準を満たす。
投与経路は、治療対象の疾患の性質と部位によって必然的に変化し、例えば、皮内投与、経皮投与、真皮下投与、非経口投与、経鼻投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、灌流投与、洗浄投与、直接注射、および経口投与が投与経路に含まれ得る。
「非経口投与」という用語は、本明細書で使用する場合、腸からの吸収を伴わずに化合物が被検体に吸収される、あらゆる投与形態を含む。本発明に用いられる代表的な非経口投与として、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、眼内投与、経鼻投与、または関節内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
加えて、別の医薬品の投与前、投与中、または投与後に、本発明のストラドマーを任意に投与してもよい。例えば、本発明のストラドマー組成物とプレドニゾロンを同時投与したところ、驚くべきことに、ストラドマー組成物またはプレドニゾロンを単独で投与した場合と比べて、相乗的に優れた結果を達成することが判明した（図３を参照）。
以下、様々な医薬製剤カテゴリーと、適応があれば代表的な具体的疾患に対する好ましい投与経路の具体例を挙げる。
頬側または舌下崩壊錠：狭心症、結節性多発動脈炎。
静脈内：特発性血小板減少性紫斑病、封入体筋炎、ＩｇＭ−Ｍ蛋白血症を伴う脱髄性ニューロパチー、壊疽性筋膜炎、天疱瘡、脱疽、皮膚筋炎、肉芽腫、リンパ腫、敗血症、再生不良性貧血、多臓器不全、多発性骨髄腫および意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、炎症性ミオパチー、血栓性血小板減少性紫斑病、筋炎、貧血、腫瘍症、溶血性貧血、脳炎、脊髄炎、特にヒトＴ細胞性白血病ウイルス１型関連の脊髄症、白血病、多発性硬化症および視神経炎、喘息、表皮壊死融解症、ランバート・イートン症候群、重症筋無力症、神経障害、ブドウ膜炎、ギラン・バレー症候群、移植片対宿主病、全身硬直症候群、抗Ｙｏ抗体陽性傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴脳脊髄症および抗Ｈｕ抗体陽性感覚性ニューロパチー、全身性血管炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性糖尿病性ニューロパチー、急性特発性自律神経ニューロパチー、フォークト・小柳・原田症候群、多巣性運動ニューロパチー、抗／ＧＭ１を伴う下位運動ニューロン症候群、脱髄、膜性増殖性糸球体腎炎、心筋症、川崎病、関節リウマチおよびエバンス症候群ＩＭ−ＩＴＰ、ＣＩＤＰ、ＭＳ、皮膚筋炎、重症筋無力症、筋ジストロフィー。「静脈内投与」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明の化合物または組成物を静脈注射または点滴によって体循環に送達するためのあらゆる手法を含む。
皮膚用のゲル、ローション、クリーム、またはパッチ：尋常性白斑、帯状疱疹、ざ瘡、口唇炎。
直腸坐薬、ゲル、または点滴：潰瘍性大腸炎、痔の炎症。
丸剤、トローチ、カプセルとして、または腸溶コーティングでの経口：クローン病、セリアック病、過敏性腸症候群、炎症性肝疾患、バレット食道。
皮質内：てんかん、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病。
腹腔内注入またはインプラント：子宮内膜症。
膣用ゲルまたは坐薬：細菌性膣症、トリコモナス膣炎、または膣真菌症。
医療器具：冠動脈ステント、人工関節に塗布。
本明細書に記載のストラドマーは、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約３００ｍｇ、特に体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇの投与量で投与でき、少なくとも１日に１回、１週間に１回、２週間に１回、または１ヶ月に１回投与できる。第１の投与段階が、第２の投与段階の約０．１％〜約３００％を含む二相性の投与計画を用いてよい。
ストラドマーの治療応用
合理的設計ならびにインビトロおよびインビボでの検証結果に基づき、本発明のストラドマーは、自己免疫疾患を治療するための重要な生物薬剤として機能し、また、癌、炎症性疾患の生物免疫療法などの他の様々な状況で免疫機能を調節するための重要な生物製剤として機能する。本明細書に記載の免疫学的に活性な生物模倣体を用いた治療に適した病態としては、自己免疫性血球減少症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎、およびブドウ膜炎など、現在の常法でｈＩＶＩＧによって治療されている病態またはｈＩＶＩＧが臨床的に有用であることが見出されている病態（F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, 1123 (1992); P. Gajdos et al, Lancet i, 406 (1984); Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas et al., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993); D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000) を参照）、ならびに、モノクローナル抗体が使用可能であるか、すでにモノクローナル抗体が臨床利用されている癌または炎症性疾患の病態が挙げられる。本発明の主題である化合物によって有効に治療できる状態に含まれるものとして、サイトカインネットワークのバランスが崩れた炎症性疾患、病原性自己抗体または自己攻撃性Ｔ細胞による自己免疫障害、慢性再発性の自己免疫性、炎症性、または感染性疾患もしくは感染過程の急性期または慢性期が挙げられる。
加えて、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス関連炎症、副腎白質ジストロフィー、および、てんかん疾患（特にラスムッセン症候群、ウエスト症候群、およびレノックス・ガストー症候群を含むウイルス感染後脳炎と関連すると考えられている病態）などの炎症性要素を持つ他の病態でも、ストラドマーを用いた治療の恩恵が得られる。
本明細書に記載の単離されたストラドマーを用いる治療法への一般的なアプローチは、何らかの疾患または状態を有する被検体に、単離された免疫学的に活性な生物模倣体の有効量を投与して治療を実施することである。いくつかの実施形態では、疾患または状態を、サイトカインネットワークのバランスが崩れた炎症性疾患、病原性自己抗体または自己攻撃性Ｔ細胞による自己免疫障害、慢性再発性の疾患または過程の急性期または慢性期、という大まかなカテゴリーに分けることができる。
「治療する」および「治療」という語は、本明細書で使用する場合、被検体の疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症候が改善するように、本発明のストラドマーの治療有効量を被検体に投与することをいう。改善とは、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症候が改善または矯正されることである。改善は、観察可能または測定可能な改善であってよく、あるいは、被検体が健康な状態であるという全体的な感覚の改善であってもよい。よって、当業者であれば、治療によって病状が改善することはあるが、完全に治癒するわけではないことを認識する。具体的には、被検体の改善は、以下のうちの１つ以上を含む場合がある。炎症の減少；Ｃ反応性タンパク質などの炎症性検査マーカーの減少；自己抗体などの自己免疫マーカー、血小板数、白血球数、もしくは赤血球数の改善、発疹もしくは紫斑の減少、脱力感、しびれ、もしくは刺痛の減少、高血糖症患者での血糖値の上昇、関節痛、炎症、腫脹、もしくは壊変の減少、腹痛および下痢の頻度と量の低下、狭心症の減少、組織炎症の減少、または発作頻度の低下のうちの１つ以上に該当することから明らかな自己免疫の減少；癌腫瘍量の低下、腫瘍が進行するまでの時間の増大、癌疼痛の減少、生存率の増加もしくは生活の質の改善；または骨粗鬆症の進行の遅滞もしくは改善。
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、疾患または状態の症候の改善または矯正をもたらす量をいう。
「予防」とは、本明細書で使用する場合、疾患の症候の完全な予防、疾患の症候の発症遅延、または後に発症する疾患の症候の重篤度の低下を意味し得る。
「被検体」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載の方法に従って本発明のストラドマーを投与する対象である、任意の哺乳類の被検体を意味するものとする。特定の実施形態では、本開示の方法は、ヒト被検体の治療に用いられる。また、本開示の方法を、非ヒト霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、鳥類（ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルなど）、魚類および爬虫類の治療に用いて、種特異的またはキメラのストラドマー分子を生成することもできる。
特に、本発明のストラドマーを使用して治療し得る状態の例として、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および他の心筋症状、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、および骨髄間質；骨減少症；パジェット病、骨巨細胞腫；多発性骨髄腫；乳癌；廃用性骨減少症；栄養不良、歯周病、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、歯周組織再建、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性の骨癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌；骨転移、骨疼痛管理、および腫瘍随伴体液性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、および他の脊椎関節症；移植拒絶、ウイルス感染、造血器腫瘍および腫瘍様症状、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢性Ｔ細胞白血病や成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、急性骨髄性白血病（成熟型ＡＭＬ、未分化型ＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む）、骨髄異形成症候群、慢性骨髄増殖性疾患（慢性骨髄性白血病を含む）などの骨髄性腫瘍、中枢神経系の腫瘍、例えば、脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固体腫瘍（上咽頭癌、基底細胞癌、膵臓癌、胆管の癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌または子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌または子宮体癌、脈管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮腫））、または他の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書における「癌」とは、無秩序な細胞成長を典型的特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または、こうした状態を表す。癌の例として、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、脊索腫、滑膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、および白血病、またはリンパ系腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のさらに特定の例として、扁平上皮癌（上皮の扁平上皮癌など）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌、小細胞肺癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃の癌または胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫、および他の癌腫ならびに頭頸部癌が挙げられる。
本発明のストラドマーは、自己免疫疾患の治療に使用できる。「自己免疫疾患」という用語は、本明細書で使用する場合、８０を超える疾患および状態からなる多様な群を指す。これらの疾患および状態はいずれも、背景にある問題は、身体の免疫系がその身体自身を攻撃することである。自己免疫疾患は、結合組織、神経、筋肉、内分泌系、皮膚、血液、呼吸器系、および消化器系を含む、あらゆる主要な体組織に影響を及ぼす。自己免疫疾患の例として、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖尿病が挙げられる。
本発明の組成物および方法を用いて治療可能な疾患または状態として、血液免疫学的プロセスが挙げられ、これには、特発性血小板減少性紫斑病、同種免疫性／自己免疫性血小板減少症、後天性免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、パルボウイルスＢ１９関連赤血球形成不全、後天性抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患、後天性フォンウィルブランド病、多発性骨髄腫および意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、敗血症、再生不良性貧血、赤芽球痺、ダイアモンド・ブラックファン貧血、新生児溶血性疾患、免疫介在性好中球減少症、血小板輸血不応状態、新生児輸血後紫斑病、溶血性尿毒症症候群、全身性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病、またはエバンス症候群が含まれるが、これらに限定されない。
また、上記の疾患または状態として神経免疫学的プロセスが挙げられ、これには、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ＩｇＭ−Ｍ蛋白血症を伴う脱髄性ニューロパチー、ランバート・イートン症候群、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、抗／ＧＭ１抗体を伴う下位運動ニューロン症候群、脱髄、多発性硬化症および視神経炎、全身硬直症候群、抗体Ｙｏ抗体陽性傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴脳脊髄症、抗Ｈｕ抗体陽性感覚性ニューロパチー、てんかん、脳炎、脊髄炎、特にヒトＴ細胞性白血病ウイルス１型関連の脊髄症、自己免疫性糖尿病性ニューロパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または急性特発性自律神経ニューロパチーが含まれるが、これらに限定されない。
また、上記の疾患または状態として、リウマチ性疾患プロセスが挙げられ、これには、川崎病、関節リウマチ、フェルティ症候群、ＡＮＣＡ陽性血管炎、特発性多発性筋炎、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、再発性自然流産、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、またはブドウ膜炎が含まれるが、これらに限定されない。
また、上記の疾患または状態として、皮膚免疫学的疾患プロセスが挙げられ、これには、中毒性表皮壊死融解症、脱疽、肉芽腫、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、落葉状天疱瘡を含む自己免疫性で皮膚水疱を呈する疾患、尋常性白斑、連鎖球菌毒素ショック症候群、強皮症、びまん性皮膚硬化型強皮症および限局皮膚硬化型強皮症を含む全身性強皮症またはアトピー性皮膚炎（特にステロイド依存性）を含むが、これらに限定されない。
また、上記の疾患または状態として、筋骨格免疫学的疾患プロセスが挙げられ、これには、封入体筋炎、壊疽性筋膜炎、炎症性ミオパチー、筋炎、抗デコリン（ＢＪ抗原）ミオパチー、傍腫瘍性壊死性ミオパチー、Ｘ連鎖性空胞性ミオパチー、ペナシラミン誘導多発性筋炎、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、または心筋症が含まれるが、これらに限定されない。
また、上記の疾患または状態として、胃腸免疫学的疾患プロセスが挙げられ、これには、悪性貧血、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病、疱疹状皮膚炎、原因不明肝硬変、反応性関節炎、クローン病、ホイップル病、潰瘍性大腸炎、または硬化性胆管炎が含まれるが、これらに限定されない。
上記の疾患または状態として、移植片対宿主病、抗体による移植片拒絶、骨髄移植後拒絶、感染症後の炎症、リンパ腫、白血病、腫瘍症、喘息、抗β細胞抗体の存在する１型糖尿病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、アジソン病、フォークト・小柳・原田症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎、または多臓器不全も挙げられる。
別の実施形態では、本明細書に記載のストラドマーを体外循環回路（ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に利用して、患者から血液を抜き、約半時間から約３時間の時間をかけて一時的にストラドマーと接触させた上で、患者の体内に戻すこともできると考えられる。この形態の細胞療法では、患者自身のエフェクター細胞を、エキソビボで固定されたストラドマーに曝露する。これにより、エフェクター細胞のストラドマーへの曝露を通じてエフェクター細胞を調節する。その後、調節後のエフェクター細胞を含む血液を点滴で患者に戻す。このような体外循環回路は、臨床および治療上の多くの応用を有すると考えられる。
本明細書に開示のストラドマーは、多様な状況下で免疫系応答の変更に容易に適用して、免疫応答プロファイルの特定の変化に影響を与えることができる。被検体における免疫応答の変更または調節とは、免疫応答の比または構成要素を増加、減少、または変化させることをいう。例えば、ＦｃＲと相互作用するように設計されたストラドマーとＦｃＲの適切な組み合わせを標的することにより、サイトカインの産生または分泌レベルの増減を所望の通りに行うことができる。また、抗体の産生量の増減、２つ以上のサイトカインまたは免疫細胞受容体の比の変更、あるいは別のタイプのサイトカインまたは抗体の産生もできる。また、免疫応答は、ＦｃγＲを発現する免疫細胞のエフェクター機能でもあり、これには、本明細書に開示される免疫学的に活性な生物模倣体では調節されない免疫応答と比較した場合の、単球マクロファージ系細胞の潜在的な食作用の増加または減少、破骨細胞の機能の亢進または低減、抗原提示細胞（ＤＣなど）による抗原提示の増加または減少、ＮＫ細胞の機能の亢進または低減、Ｂ細胞の機能の亢進または低減が含まれる。
好ましい実施形態では、癌、自己免疫疾患、または炎症性疾患を有する被検体の免疫応答が変更される。この実施形態は、被検体の免疫応答を変更する治療有効量の、本明細書に記載のストラドマーを投与するステップを含む。理想的には、この介入によって、被検体の疾患または状態を治療する。変更される免疫応答は、応答の増減であってよく、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−αのいずれかのレベルを含むサイトカインレベルの変更を伴ってよい。好ましい実施形態では、治療に応答してＩｌ−６またはＩＬ−８が減少する。特に好ましい実施形態では、治療に応答してＩｌ−６とＩＬ−８が減少する。しかしながら、本発明は、説明されている生物模倣体の特定の作用機序に限定されない。変更される免疫応答が、被検体における自己抗体レベルの変更であってもよい。また、変更される免疫応答が、被検体における自己攻撃性Ｔ細胞レベルの変更であってもよい。
例えば、自己免疫疾患でＴＮＦ−αの産生量を低下させると、治療効果が得られる場合がある。これを実用化したものに、抗ＴＮＦ−α抗体療法（例えばＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））があり、尋常性乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および強直性脊椎炎を治療できることが臨床的に証明されている。これらの自己免疫疾患にはそれぞれ異なる原因があるが、炎症および免疫細胞活性に関連する疾患過程の鍵になる免疫学的要素は共通している。ＴＮＦ−αの産生を低減するように設計されたストラドマーは、これらの自己免疫疾患でも同様に有効であり、他の自己免疫疾患でも同様に有効であり得る。また、変更される免疫応答プロファイルは、被検体自身の組織を標的している自己抗体などの抗体の産生を低減する直接または間接的な調節であってよく、あるいは被検体における自己攻撃性Ｔ細胞レベルの変更であってもよい。例えば、多発性硬化症は、インターフェロンβ療法で治療され得る自己反応性Ｔ細胞が関係する自己免疫障害である。例えば、Zafranskaya M, et al., Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis, Immunology 2007 May;121(l):29-39-Epub 2006 Dec 18 を参照のこと。自己反応性Ｔ細胞レベルを低下させるストラドマー設計も同様に多発性硬化症に有効であり、自己反応性Ｔ細胞が関係する他の自己免疫疾患にも有効であり得る。
本明細書に記載のストラドマーを使用して、樹状細胞、マクロファージ、破骨細胞、単球、もしくはＮＫ細胞を含む免疫細胞由来の共刺激分子の発現を調節でき、または、これらの同じ免疫細胞で分化、成熟を阻害し、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を含むサイトカイン分泌を阻害でき、あるいは、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）もしくはインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むサイトカイン分泌を亢進できる。当業者であれば、免疫学的に活性な生物模倣体に免疫細胞を曝露し、免疫細胞（樹状細胞、マクロファージ、破骨細胞、または単球）の機能の調節を測定することにより、免疫学的に活性な生物模倣体の効力を確認できるであろう。一実施形態では、免疫細胞を免疫学的に活性な生物模倣体にインビトロで曝露し、細胞表面受容体の量またはサイトカイン産生量を測定するステップをさらに含む。ここでは、細胞表面受容体の量またはサイトカイン産生量の変化が、免疫細胞機能の調節を表す。別の実施形態では、自己免疫疾患のモデル動物において、免疫細胞を免疫学的に活性な生物模倣体にインビボで曝露し、自己免疫疾患の改善の度合いを評価するステップをさらに含む。
固定（ｆｉｘｅｄ）Ｆｃを用いる方法
Ｆｃ：Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲすなわちＩｇＧのＦｃに対するＦｃ受容体）相互作用の役割と、そのＦｃが免疫グロブリン内で生物学的に固定化されることのｈＩＶＩＧの機能に対する重要性を理解するため、本発明者らは、固定状態の組換えＩｇＧ１のＦｃ断片（ｒＦＣＦ）と、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む可溶状態の組換えＩｇＧ１のＦｃ断片（ｓＦｃ）の両方で、単球が未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）に分化する過程でｈＩＶＩＧが単球の機能におよぼす影響を比較した。
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）にて培養した単球を、固定化ｒＦＣＦおよび固定化ｈＩＶＩＧに曝露し、低用量の可溶性ｈＩＶＩＧには曝露せずにおいたところ、細胞表面でのＣＤ８６の発現が亢進され、ＣＤ１ Ｉｃの発現が遅延し、ＣＤＩａの発現が抑制された。さらに、これらの変化は、プラスチック表面のｒＦＣＦの非特異的タンパク質固定化に続発するものではないと予想される。その理由は、可溶性熱凝集（ｓＨＡ）ｈＩＶＩＧ、ｓＨＡ ｒＦＣＦ、あるいは高用量ｈＩＶＩＧ（多量体Ｆを含有することが認められている）が、固定化ｒＦＣＦで観察された変化に似た変化を誘発したからである。
これと一致して、本発明者らのデータは、固体、半固体、またはゼラチン状の支持体の表面に固定化したｈＩＶＩＧにｉＤＣを曝露した場合に、免疫寛容を調整できるＤＣの独特な個体群（高ＣＤ８６、低ＣＤＩａ）が得られ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片の機能的部分を含む固定化分子が、ｈＩＶＩＧの模倣薬として、局所的炎症および全身性炎症、ならびにｉＤＣなどの単球由来細胞（ＭＤＣ）が直接的または間接的に介在している多種多様な他の病態の治療に有用となり得ることを示している。さらに、動物（ヒト患者など）の体内に移植されるか体に付着され、本明細書では「コーティング装置」と表される装置に、ＩｇＧのＦｃ断片の機能的部分を含む分子を用いてＩｇＧのＦｃの機能的部分を固定化すると、このような装置に対する炎症反応を（予防できないにしても）減少させることが可能である。あるいは、移植された装置の表面または内部に塗布された固定ストラドマーと免疫細胞が接触して、免疫細胞が変化してから体循環に入るように免疫細胞に影響を及ぼすことにより、全身性疾患を治療することも可能である。
本発明は、単球由来細胞（ＭＤＣ）の活性を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を、Ｆｃ試薬が結合した支持体を含む組成物と接触させることを含む。接触は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで可能である。あるいは、細胞は、動物内にあってよい。この動物は、単球由来細胞介在性状態（ＭＤＣＭＣ）に羅患しているか、これを発症するリスクのある動物であり得る。ＭＤＣは、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、または破骨細胞であり得る。［００２６０］また、本発明は、治療方法または予防方法を提供する。本方法は、Ｆｃ試薬が結合した支持体を含有する組成物を、ＭＤＣＭＣに羅患しているか発症リスクのある動物に投与することを含む。
本発明のストラドマーが、インビボで固定されたＦｃ試薬となることも可能である。本発明者らがいう「インビボで固定されたＦｃ試薬」とは、細胞、すなわち血小板の表面にインビボで固定されたＦｃを意味する。本発明のストラドマーは、ＦｃγＲを発現する血小板に効率よく塗布され、塗布後の血小板は、除去されるまで生体に寛容を誘発することが観察されている。驚くべきことに、本発明のストラドマーは、ＦｃγＲを発現する血小板の割合に対して効率的に結合することが観察された。ＩＴＰにおいて、ｏｖａ：抗ｏｖａ凝集複合体およびＲＢＣ：抗ＲＢＣ凝集複合体が寛容を誘発し、血小板破壊を防止することから、ストラドマーが塗布されたこのような血小板は、生体において寛容を誘発し得る。このことは、本発明のストラドマーが免疫調節機能を発揮する別の作用機序となり得る。
ストラドマー内に含まれる天然の免疫グロブリンＦｃと比較して、Ｆｃγ受容体に対するストラドマーの結合親和性がはるかに高いことから、本発明のストラドマーが、インビボで固定された免疫グロブリンＦｃ対照試薬となることも可能である。本発明者らがいう「インビボで固定された免疫グロブリンＦｃ対照試薬」とは、細胞の表面にインビボで固定されたストラドマーを意味し、この細胞には単球、樹状細胞、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、γδＴ細胞、および血小板が含まれるが、これらに限定されない。ストラドマーは、Ｆｃγ受容体などの細胞表面受容体に結合することにより、他の免疫グロブリンがこれらの受容体に結合するのを阻止する。フローサイトメトリーなどの研究アッセイおよび臨床診断では、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が使われている。本発明の重要な側面は、免疫グロブリンＦｃと結合し得るＦｃγ受容体および他の細胞表面受容体に対して、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のＦｃ成分が非特異的に結合するのを防止することである。
本明細書で使用する場合、「単球由来細胞介在性状態（ＭＤＣＭＣ）」という用語は、単球由来細胞の活性に直接的または間接的に、部分的または全体的に起因する、あるいは単球由来細胞によって産生された因子に直接的または間接的に、部分的または全体的に起因する病態を指す。単球由来細胞の例として、単球、マクロファージ、指状嵌入樹状細胞（本明細書では広義に、樹状突起様細胞および濾胞樹状様細胞を含む「樹状細胞」と呼ぶ）（成熟および未成熟）、破骨細胞、小膠様細胞、単球由来インスリン産生膵島様細胞、単球由来未成熟肥満細胞、および単球由来微小粒子があげられるが、これらに限定されない。
固定Ｆｃを用いる方法に関して、「Ｆｃ試薬」という用語は、免疫グロブリンＩｇ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片の機能的部分を１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０個、またはそれより多く）含む分子または分子複合体を指す。ＩｇＧのＦｃ断片は、ＩｇＧ分子の互いに結合した２つのＩｇＧ重鎖のＣ末端部分からなり、互いに結合した両方の重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインからなる。「ＩｇＧのＦｃ断片の機能的部分」は、互いに結合した両方の重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、および任意で、ＣＨ３ドメインの（Ｎ末端から）最初の５０個のアミノ酸のうちの全部または一部（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９個）からなる。ヒトでは、（ａ）ＩｇＧ１のヒンジ領域は１５個のアミノ酸を含み、ＣＨ２ドメインは１１０個のアミノ酸を含み、ＣＨ３ドメインは１０６個のアミノ酸を含む；（ｂ）ＩｇＧ２のヒンジ領域は１２個のアミノ酸を含み、ＣＨ２ドメインは１０９個のアミノ酸を含み、ＣＨ３ドメインは１０７個のアミノ酸を含む；（ｃ）ＩｇＧ３のヒンジ領域は６２個のアミノ酸を含み、ＣＨ２ドメインは１０４個のアミノ酸を含み、ＣＨ３ドメインは１０６個のアミノ酸を含む；（ｄ）ＩｇＧ４のヒンジ領域は１２個のアミノ酸を含み、ＣＨ２ドメインは１０９個のアミノ酸を含み、ＣＨ３ドメインは１０７個のアミノ酸を含む。
野生型ＩｇＧ分子と同様に、上記のＦｃ試薬では、ＩｇＧ重鎖由来の２つのポリペプチド鎖は通常同一であるが、必ずしも同一でなくてよい。このため、Ｆｃ試薬は、ＩｇＧ分子全体、非免疫グロブリン由来ポリペプチドに結合したＩｇＧ分子全体、ＩｇＧのＦｃ断片、非免疫グロブリン由来ポリペプチドに結合したＩｇＧのＦｃ断片、ＩｇＧのＦｃ断片の機能的部分、非免疫グロブリン由来ポリペプチドに結合したＩｇＧのＦｃ断片の機能的部分、またはこれらのいずれかの多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体）であり得るが、これらに限定されない。また、上記のＦｃ試薬の定義に含まれる限り、Ｆｃ試薬は、上記のストラドマーおよびストラドボディであってもよい。
固定Ｆｃでは、Ｆｃ試薬の免疫グロブリン重鎖成分は、野生型アミノ酸配列を有してもよく、あるいは、野生型アミノ酸配列であるが、アミノ酸置換は２０個以下（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下）とすることもできる。このような置換は、好ましくは保存的置換であるが、必ずしも保存的置換でなくてよい。保存的変化は、一般に、以下の群内での変化を含む。グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；フェニルアラニンおよびチロシン。
本発明の「Ｆｃ試薬」は、Ｆｃ試薬のＩｇＧ重鎖成分の派生元のＩｇＧ分子（基準ＩｇＧ分子）が対象Ｆｃ受容体と結合する能力の、少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；８０％；９０％；９５％；９８％；９９％；９９．５％；もしくは１００％またはそれ以上）を有する。「Ｆｃ試薬」が２タイプ以上のＩｇＧ分子に由来する重鎖成分を有する場合、基準ＩｇＧ分子は、対象の関連Ｆｃ受容体に最大の結合活性で結合するＩｇＧ分子である。
本明細書で使用する場合、「固定Ｆｃ」とは、以下で定義される「支持体」に結合したＦｃ試薬をいう。「固定Ｆｃ」、「結合Ｆｃ」および「安定化Ｆｃ」は、同義語である。固定Ｆｃは、支持体に付着したＦｃの機能的部分（Ｆｃの機能的部分を含むポリペプチドを含むが、これに限定されない）で構成される。固定Ｆｃの例として、支持体へのＦｃの直接結合およびポリマーを介した間接結合；単離されたＩｇＧ Ｆｃ全体の取り込み；ＩｇＧ Ｆｃの機能ドメインのみの取り込み；あるいは、抗体、ストラドマー、またはストラドボディなどの大きなポリペプチドの一部としてのＩｇＧ Ｆｃ全体またはＩｇＧ Ｆｃの機能ドメイン全体の取り込みが挙げられる。［００２６７］固定Ｆｃに適用される場合、「支持体」という用語は、固体、半固体、またはゼラチン状の物質を指す。支持体は、動物の体内に埋め込むか、または動物の体表面に付着（もしくは接着）させることができる。支持体には、例えば液体またはガス状の成分が含まれるが、支持体の少なくとも一部は、固体、半固体、またはゼラチン状である。したがって、支持体は、水性溶媒には実質的に不溶であるが、非水性溶媒には可溶の物質であってよい。このような物質の例として、脂質（リン脂質など）、脂肪酸、および他の脂溶性で水性溶媒不溶性の化合物が挙げられる。このことから、支持体にリポソームが含まれることは明らかであろう。支持体は多孔性であっても非多孔性であってもよい。特定の実施形態では、支持体は、支持体が埋め込まれているか付着もしくは接着されている表面および／または身体に対して不活性である。
支持体は、例えば、ナイロン、テフロン（登録商標）、ダクロン、ポリ塩化ビニル、ＰＥＵ（ポリ（エステルウレタン））、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、ＰＭＭＡ（メタクリル酸メチル）ＰＥＥＫ、熱可塑性エラストマー、Ｘ線不透過性ポリマー、ポリエーテルスルホン、シリコン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリイソブチレンおよびその共重合体、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイソブチレン、エチレン−αオレフィン共重合体、アクリルポリマーおよび共重合体、ビニルハライドポリマーおよび共重合体（ポリ塩化ビニル、ポリビニルエーテル、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニリデンハライド、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデンなど）、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン、ポリビニル芳香族、ポリスチレン、ポリビニルエステル、ポリ酢酸ビニル、ビニル単量体の共重合体、ビニル単量体とオレフィンの共重合体、エチレン−メタクリル酸メチル共重合体、アクリロニトリル−スチレン共重合体、ＡＢＳ樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、ナイロン６６、ポリカプロラクトン、アルキド樹脂、ポリオキシエチレン、ポリイミド、ポリエーテル、エポキシ樹脂、レーヨン−トリアセテート、セルロース、酢酸セルロース、セルロースブチレート、セルロースアセテートブチレート、セロファン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、キチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシド共重合体、ポリシロキサン、置換ポリシロキサン、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリオレフィンエラストマー、ＥＰＤＭゴム、およびこれらの組み合わせなどの合成ポリマーを含有してよく、これらの合成ポリマーで作製されていてもよい。
また、支持体は、ステンレス鋼、白金、イリジウム、チタン、タンタル、ニッケル−チタン合金、もしくはコバルトクロム合金などの金属または金属合金を含有してよく、これらで作製されていてもよい。さらに、支持体は、動物組織または動物組織産物（例えば、組織または臓器の移植片）を含むか、こうした組織または組織産物自体であってよい。この動物組織は、例えば骨（骨化骨（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｂｏｎｅ）など）または軟骨であり得る。さらに、支持体は、コラーゲンやケラチンなどのタンパク質を含むことができる。また、支持体は、無細胞組織マトリックスなどの組織マトリックスであってよく、またはこれを含有してよい。微粒子および非微粒子の無細胞マトリックスについては、例えば米国特許第５，３３６，６１６号および第６，９３３，３２６号（この開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）に詳細に説明されている。また、支持体は、動物細胞（例えば、線維芽細胞、間葉系幹細胞などの組織修復細胞）であっても、こうした動物細胞を含んでいてもよく、例えば植毛プラグであり得る。支持体は、アガロースなどの多糖を含有でき、あるいは多糖自体であり得る。さらに、支持体は塩であるか、または塩を含有してもよく、好ましくは、比較的不溶性の塩（例えば硫酸カルシウム）であるか、これを含有する。支持体は、ゲルまたはクリームであってもよい。さらに、支持体はシリコンまたはシラスティックを含有してよい。また、支持体は、絹、綿、羊毛などの天然繊維を含有してもよい。
加えて、支持体は植込み型の医療器具であり得る。例えば、ステント（例えば、冠動脈ステントなどの血管ステント；気管内ステントまたは経鼻ステントなどの気道ステント；胆管ステントまたは膵管ステントなどの消化管ステント；尿管ステントなどの尿道ステント）、あるいは外科用縫合糸（例えば、絹縫合糸、腸線縫合糸、ナイロン、プラスチック、もしくは金属の縫合糸）または止血鉗子（例えば、動脈瘤クリップ）であり得る。支持体は、例えば、人工股、人工股関節、人工膝、人工膝関節、人工肩、人工肩関節、人工指関節もしくは足趾関節、骨接合板、骨釘、骨癒合不全用インプラント、椎間板インプラント、骨セメント、または骨セメントスペーサであり得る。また、動静脈シャント、植込み型リード、ペースメーカー、人工心臓、心臓補助装置、人工内耳、植込み型除細動器、脊髄神経刺激装置、中枢神経系刺激装置、または末梢神経移植片であってもよい。他の支持体として、義歯または歯冠がある。
他の実施形態では、支持体は、大血管血栓フィルタ装置もしくはケージ、経皮装置、皮膚パッチもしくは粘膜下パッチ、または植込み型薬剤送達装置であり得る。また、支持体は、大血管グラフトであり得、この場合の血管は、例えば、頸動脈、大腿動脈、または大動脈である。さらに、支持体は、皮下インプラント、角膜移植片、眼内レンズ、またはコンタクトレンズであり得る。
支持体は、シート、ビーズ、メッシュ、粉末粒子、撚糸、ビーズ、または繊維の形態であり得る。また、支持体は、固体、半固体、またはゼラチン状物質を含有でき、あるいは、こうした物質自体であり得る。
また、支持体は、ＦｃγＲを発現する細胞であり得る。好ましくは、支持体は血小板である。
本発明において有用なポリマーは、好ましくは、特に体内への装置の挿入時または植込み時に、生体安定性および生体適合性があり、体組織への刺激のないポリマーである。
Ｆｃ試薬は、様々な方法で支持体に塗布（すなわち固定または安定化）できる。例えば、疎水性相互作用などによりＦｃ試薬を付着した状態に維持する支持体の表面に、Ｆｃ試薬を直接塗布することができる。以下、ポリマーの使用を伴う他のいくつかの方法論（（ａ）〜（ｅ））を挙げる：
（ａ）Ｆｃ試薬を混和性ポリマーブレンドと混合し、続いてこれを植込み型の合成材料の表面に積層することで、Ｆｃ試薬を安定させる。ポリマーブレンドを生成するのに当技術分野で日常的に用いられている単量体として、ＰＬＭＡ［ポリ（メタクリル酸ラウリル）］；ＰＥＧ［ポリエチレングリコール］、ＰＥＯ［ポリエチレンオキシド］；アルキル官能化メタクリレートポリマーＰＭＭＡ、ＰＥＭＡ、ＰＰＭＡ、およびＰＢＭＡ；イタコン酸塩；フマル酸塩；およびスチレン系樹脂が挙げられる。
（ｂ）ポリマーアンダーコート層またはナノメートル寸法のフィルムを支持体表面に付着させた後、Ｆｃ試薬をポリマーアンダーコート層またはナノメートル寸法のフィルムに付着させることで、Ｆ試薬を安定させる。
（ｃ）ポリマー単量体の薄膜を植込み型の支持体表面に貼り付けた後、単量体を重合させる。このような単量体の例として、メタン、テトラフルオロエチレン、ベンゼン、メタノール、エチレンオキシド、テトラグリム、アクリル酸、アリルアミン、メタクリル酸ヒドロキシエチル、Ｎ−ビニルピロリジノン、メルカプトエタノールが挙げられる。続いて、得られた単量体にＦｃ試薬を付着させる。
（ｄ）Ｆｃ試薬に付着するタンパク質、例えばタンパク質Ａまたはアルブミンを支持体に塗布することで、Ｆｃを支持体の表面で安定させる。
（ｅ）植込み型の合成材料に結合して、安定化したＦｃを均一に配向させる疎水性アミノ酸の鎖を、Ｆｃ試薬にタグ付けすることが可能である。
本発明の方法は、任意の動物種に適用可能であり、作製するＦｃ試薬のＩｇＧ由来部分の派生元であるＩｇＧ分子も、任意の動物種に由来していてよい。当然、関連の動物種は、ＩｇＧ分子またはＩｇＧ様分子が発生する動物種である。通常、本方法が適用される種と、本方法で使われるＦｃ試薬のＩｇＧ由来部分の元となる動物種は、同じである。しかしながら、これらは必ずしも同じでなくてよい。関連の動物種は、好ましくは哺乳動物であり、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、チンパンジー）、ウマ、ウシ科の動物（例えば、去勢されていない雄牛、雌牛、去勢された雄牛）、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、アレチネズミ、ハムスター、ラット、マウスが含まれるが、これらに限定されない。哺乳類以外の種の例として、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル）および魚類が挙げられる。
「治療する」、「治療」、および「予防」という用語は、固定Ｆｃを使用した場合の、ストラドマーに関する上記の意味と同じ意味を有する。
固定ＦｃがＦｃ試薬を塗布した植込み型装置である場合、当技術分野において周知の方法を用いて、該当する被検体の関連の臓器または組織または体表面への装置の植込み、付着、または接着を行うことができる。また、固定Ｆｃが、例えば懸濁液や粉末として製剤される場合、ストラドマーの場合について上述されているように製剤し投与することができる。
本発明の固定Ｆｃ試薬は、以下を含む状態の治療または予防に使用できる。癌、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、ざ瘡、湿疹、心筋炎、および他の心筋症状、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、および骨髄間質；骨減少症；パジェット病、肥大性骨形成；廃用性骨減少症；栄養不良、歯周病、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、歯周組織再建および骨折、骨疼痛管理、および腫瘍随伴体液性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、および他の脊椎関節症；移植拒絶およびウイルス感染。ただし、これらに限定されない。
すべての自己免疫疾患は、一部または全体がＭＤＣＭＤであり得る。「自己免疫疾患」という用語は、本明細書で使用する場合、８０を超える慢性病からなる多様な群を指す。これらの疾患はいずれも、背景にある問題は、身体の免疫系がその身体自身を攻撃することである。自己免疫疾患は、結合組織、神経、筋肉、内分泌系、皮膚、血液、呼吸器系、および消化器系を含む、あらゆる主要な体組織に影響を及ぼす。
上記の自己免疫疾患または状態として、血液免疫学的プロセスが挙げられ、これには、特発性血小板減少性紫斑病、同種免疫性／自己免疫性血小板減少症、後天性免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、パルボウイルスＢ１９関連赤血球形成不全、後天性抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患、後天性フォンウィルブランド病、多発性骨髄腫および意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、敗血症、再生不良性貧血、赤芽球痺、ダイアモンド・ブラックファン貧血、新生児溶血性疾患、免疫介在性好中球減少症、血小板輸血不応状態、新生児輸血後紫斑病、溶血性尿毒症症候群、全身性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病、またはエバンス症候群が含まれるが、これらに限定されない。
上記の自己免疫疾患または状態として、神経免疫学的プロセスが挙げられ、これには、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ＩｇＭ−Ｍ蛋白血症を伴う脱髄性ニューロパチー、ランバート・イートン症候群、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、抗／ＧＭ１抗体を伴う下位運動ニューロン症候群、脱髄、多発性硬化症および視神経炎、全身硬直症候群、抗体Ｙｏ抗体陽性傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴脳脊髄症、抗Ｈｕ抗体陽性感覚性ニューロパチー、てんかん、脳炎、脊髄炎、特にヒトＴ細胞性白血病ウイルス１型関連の脊髄症、自己免疫性糖尿病性ニューロパチー、または急性特発性自律神経ニューロパチーが含まれるが、これらに限定されない。
上記の自己免疫疾患または状態として、リウマチ性疾患プロセスが挙げられ、これには、川崎病、関節リウマチ、フェルティ症候群、ＡＮＣＡ陽性血管炎、特発性多発性筋炎、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、再発性自然流産、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、またはブドウ膜炎が含まれるが、これらに限定されない。
上記の自己免疫疾患または状態として、皮膚免疫学的疾患プロセスが挙げられ、これには、中毒性表皮壊死融解症、脱疽、肉芽腫、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および落葉状天疱瘡を含む自己免疫性で皮膚水疱を呈する疾患、尋常性白斑、連鎖球菌毒素ショック症候群、強皮症、びまん性皮膚硬化型強皮症および限局皮膚硬化型強皮症を含む全身性強皮症またはアトピー性皮膚炎（特にステロイド依存性）を含むが、これらに限定されない。
上記の自己免疫疾患または状態として、筋骨格免疫学的疾患プロセスが挙げられ、これには、封入体筋炎、壊疽性筋膜炎、炎症性ミオパチー、筋炎、抗デコリン（ＢＪ抗原）ミオパチー、傍腫瘍性壊死性ミオパチー、Ｘ連鎖性空胞性ミオパチー、ペナシラミン誘導多発性筋炎、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、または心筋症が含まれるが、これらに限定されない。
上記の自己免疫疾患または状態として、胃腸免疫学的疾患プロセスが挙げられ、これには、悪性貧血、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病、疱疹状皮膚炎、原因不明肝硬変、反応性関節炎、クローン病、ホイップル病、潰瘍性大腸炎、または硬化性胆管炎が含まれるが、これらに限定されない。
上記の自己免疫疾患または状態として、移植片対宿主病、抗体による移植片拒絶、骨髄移植後拒絶、感染症後の炎症、リンパ腫、白血病、腫瘍症、喘息、抗β細胞抗体の存在する１型糖尿病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、アジソン病、フォークト・小柳・原田症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎、または多臓器不全が挙げられる。
本明細書における「癌」とは、無秩序な細胞成長を典型的特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または、こうした状態を表す。癌の例として、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、骨巨細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、脊索腫、滑膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、および白血病、またはリンパ系腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のさらに特定の例として、扁平上皮癌（上皮の扁平上皮癌など）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌、小細胞肺癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃の癌または胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫および他の癌腫、頭頸部癌、急性骨髄性白血病（成熟型ＡＭＬ、未分化型ＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む）、骨髄異形成症候群、慢性骨髄増殖性疾患（慢性骨髄性白血病を含む）などの骨髄性腫瘍、中枢神経系の腫瘍、例えば、脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固体腫瘍（上咽頭癌、基底細胞癌、膵臓癌、胆管の癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌または子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌または子宮体癌、脈管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮腫）、造血器腫瘍および腫瘍様症状、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢性Ｔ細胞白血病や成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、溶骨性の骨癌、および骨転移が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「単球由来細胞介在性疾患（ＭＤＣＭＤ）を発症するリスクのある」被検体とは、ＭＤＣＭＤを発症する素因、すなわちＭＤＣＭＤを発症する遺伝的素因を有する被検体、あるいはＭＤＣＭＤにつながり得る条件に曝露された被検体である。「ＭＤＣＭＤに羅患している疑いのある」被検体とは、ＭＤＣＭＤの１つ以上の症候を有する被検体である。上記から、「ＭＤＣＭＤを発症するリスクのある」被検体と、「ＭＤＣＭＤに羅患している疑いのある」被検体はいずれも、関心の対象である種に含まれる個体ではないことは明らかであろう。
上記の方法のいずれにおいても、ＭＤＣＭＣは支持体によって引き起こされるものである可能性があり、Ｆｃ試薬がＭＤＣＭＣを防止または寛解する働きをする。
免疫学的アッセイでの応用
本明細書に開示されている免疫学的に活性な生物模倣体を用いて免疫学的アッセイを実施し、免疫学的に活性な生物模倣体の設計時の調節の対象である免疫細胞の機能を試験することができる。
低親和性Ｆｃγ受容体経路を通じたシグナル伝達では、細胞表面での受容体の凝集と架橋が必要とされる。こうした凝集および架橋のパラメータに適合するには、抗原特異的標的とのＦａｂ結合が生じ、続いて応答細胞の表面上でＦｃ領域と低親和性ＦｃγＲ間の相互作用が生じることが前提にされている。この状況において、抗体は、１．エピトープ特異的標的とのＦａｂ相互作用／エピトープ特異的標的の遮断、２．ＦｃとＦｃＲとの相互作用、という２通りの経路で細胞応答を誘発する可能性を有する。こうした知見にもかかわらず、インビボで使用されるモノクローナル抗体を用いた大多数の治療研究に対する現在の対照は、観察される機能的効果に対する寄与因子としてのＦｃ：Ｆｃγ受容体間の相互作用の可能性に十分に対処できていない。現在、交絡変数としてのＦｃ：ＦｃＲ相互作用を排除するための複数の戦略が使用されている。例えば、一部の研究では、エピトープ特異性は保持するがＦｃ領域は欠如しているＳｃｖ（単一鎖可変領域）またはＦａｂ断片を使用している。このアプローチは、試薬の半減期が短く、シグナル伝達を誘導する可能性に限りがあるという点で制約がある。他の研究では、Ｆｃ断片に融合する受容体またはリガンドで構成される融合タンパク質を使用している。この種のアプローチは、Ｆａｂ特異的な作用を、受容体リガンド相互作用を有する場合に観察される作用と区別するのには役立つが、Ｆｃが介在する作用を効果的に制御するものではない。動物モデルにおける抗体ベースの治療法の評価でも、無関係のＦａｂ結合部位を有するアイソタイプ対照抗体を使用する場合がある。このような選択は、同じアイソタイプの抗体同士では、Ｆａｂ結合特異性や親和性にかかわらず機能が類似していると推定されることを論理的根拠としている。しかしながら、こうした無関係のアイソタイプ対照を用いることには、次のような根本的な欠陥がいくつかある。
１．これらの抗体のＦａｂ断片がリガンドまたは抗原エピトープと結合できない場合、Ｆｃγ受容体の架橋が欠如するため、Ｆｃ断片は低親和性ＦｃＲ相互作用を通じたシグナル伝達を刺激しないことが予想される。したがって、観察される実験抗体と対照抗体の間の機能的差異の原因が、ＦｃγＲを架橋する手段を欠いたエピトープ特異的標的とのＦａｂ相互作用にあると正確に判断することはできない。
２．これらのアイソタイプが、親抗体とは糖型が異なるか、または個々の糖型の相対比率が異なる細胞で産生される場合、Ｆａｂ親和性が同じでも、低親和性ＦｃＲと高親和性ＦｃＲの両方に対する結合が変化する。
この問題を克服する完璧な対照は存在しないが、１つの選択肢として、親抗体と同じ細胞で産生されるアイソタイプ特異的ストラドマーを、実験抗体が標的とするエピトープの発現レベルに比例した用量で投与することが挙げられる。例えば、ラットにおいて産生されるエピトープ特異的抗体の適切な対照は、エフェクター細胞の表面でＦｃγ受容体を凝集できるラットアイソタイプ特異的なストラドマーであると考えられる。
一般に、免疫学的に活性な有効量の生物模倣体に免疫細胞を曝露して、公知の方法で免疫細胞の活性を調節し、この免疫調節を試験化合物または試験分子と比較して、試験化合物に類似の免疫調節活性があるか否かを判断する。
別の実施形態では、本明細書に記載され、また当業者に知られている様々な免疫学的アッセイにおいて、熱凝集ストラドマーおよび凝集免疫グロブリンを実験室対照用の試薬として使用することができる。
免疫学的アッセイは、インビトロのアッセイでもインビボのアッセイでもよく、種が同一または同一ではないストラドマーを使用し、ヒト免疫細胞または非ヒト免疫細胞を用いて実施できる。一実施形態では、免疫学的に活性な有効量の生物模倣体を用いて免疫細胞の活性を調節し、この調節と、試験化合物による免疫細胞の調節とを比較することにより、免疫学的アッセイを実施する。ストラドマーは、他の化合物の免疫学的作用を試験するアッセイにおいて、陽性対照試薬として機能することができる。このアッセイでは、混合リンパ球反応を使用するなどして受容体発現レベル、サイトカイン放出、および機能の変化を測定することにより、エフェクター細胞のＦｃγ受容体結合および機能的応答に関して、ストラドマーとの比較により対象のモノクローナル抗体の作用を比較できる。このようにして、モノクローナル抗体と部分的に類似した応答が（Ｆａｂが欠如した）ストラドマーから得られる場合、モノクローナル抗体の作用は、ある部分では、そのＦａｂの特異性によるものではなく、エフェクター細胞上の複数のＦｃγ受容体の結合および架橋の一般的作用によるものであることが分かる。
種特異的かつアイソタイプ特異的抗体の生物活性の一部または全部が、種特異的かつアイソタイプ特異的ストラドマーによって複製されれば、観察される生物活性のうち、種特異的かつアイソタイプ特異的ストラドマーに起因する部分を、Ｆｃ−Ｆｃγ受容体活性が担っていることは明らかである。よって、種特異的かつアイソタイプ特異的ストラドマーは、観察される生物活性が、試験抗体のＦａｂ部分と、複数のＦｃγ受容体と結合し架橋する分子のＦｃ部分の非特異的作用のどちらかに起因しているか否か、起因している場合はどの程度なのかを判断する目的で、潜在的な治療抗体を評価する上で有用である。
本発明のストラドマーは、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫組織化学検査、免疫蛍光アッセイといった抗体ベースのイムノアッセイの実施中に、Ｆｃ受容体の非特異的結合を阻止する上でも有用である。従来、このようなアッセイでは、試験抗体と同じ種の非特異的抗体を用いて、Ｆｃ受容体への非特異的結合を阻止している。本発明のストラドマーは、各々が複数のＦｃＲ結合部位を持つため、使用するストラドマーを大幅に減らせるという点で、従来のＦｃ阻止手段に優る利点を提供する。加えて、例えば、種の一致したＩｇＧ対照では、死滅細胞と非特異的に結合することがよくあるが、本発明のストラドマーは抗体のＦａｂ抗原結合部分がないため、このような結合は見られない。
本発明のストラドマーは、驚くべきことに、非常に高い親和性でエンドトキシンと結合することが見出された。標準のエンドトキシン除去キットおよびカラムでは、密に結合したエンドトキシンの有意な割合をストラドマーから除去することができない。したがって、クレームされている組成物は、エンドトキシンの結合プールとして機能する上で有用であり、医薬調製物と実験調製物の双方で、有用なエンドトキシン除去ツールとなり得る。このことは、エンドトキシンとストラドマーの間で形成される複合体が、医薬調製物または医薬組成物から効率的にエンドトキシンを除去するに足る十分に高い親和性を持つという点で、有益である。一実施形態では、エンドトキシン−ストラドマー複合体を、ろ過により組成物から除去する。
本明細書に引用されているすべての参考文献は、参照によりその全体が組み入れられる。
実施例１ ストラドマーの生成および精製
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州、カールスバッド）またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、Ｇ０４５／Ｍ０４５およびＧ０５１の安定な発現のために使用した。ＨＥＫ２９３ＦまたはＣＨＯ細胞を、タンパク質発現のスケールアップのために懸濁液中で増殖させた。
Ｇ０４５ｃ（配列番号４）、Ｇ０４５ｏｌｄ（配列番号７）、Ｇ０５１（配列番号１８）、Ｇ０１９（配列番号８）、Ｇ０２８（配列番号９）、Ｇ０４６（配列番号１０）、Ｇ０７５（配列番号２０）、Ｇ０７６（配列番号２１）、Ｇ０９６（配列番号２８）、Ｇ０９８（配列番号２４）、Ｇ０８９（配列番号２７）、または前述のストラドマーの対応するマウス配列をコードする遺伝子を、Ｇ０４５またはＧ０５１の高レベルの発現を促進するためのＣＭＶプロモーターの転写制御下で、ネオマイシン耐性遺伝子、例えばインビトロジェン社（Invitrogen）（カリフォルニア州、カールスバッド）製のｐｃＤＮＡ３．３を含むベクター中にクローニングした。形質移入のためのプラスミドＤＮＡを、内毒素非含有プラスミドＤＮＡ単離キット（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ、マシェレイ−ナゲル社（Macherey-Nagel））を使用して、細菌培養物から単離した。プラスミドＤＮＡをコードするＧ０４５ｃ／Ｇ０４５ｏｌｄ、およびＧ０５１を制限酵素で直線化し、２９３−Ｆ細胞またはＣＨＯ細胞中に形質移入した。形質移入後、Ｇ０４５ｃ、Ｇ０４５ｏｌｄまたはＧ０５１を発現している陽性細胞をジェネテシン／Ｇ４１８で選択し、形質移入された細胞のプールを得た。クローンの細胞株を得るため、安定に形質移入された細胞のプールを、９６ウェルプレート中、１〜２細胞／ウェルまで希釈し、そこから安定な細胞株の単細胞クローンを得た。単細胞クローンをＥＬＩＳＡにより、タンパク質発現に対してスクリーニングした。単細胞クローンを成長させ、Ｇ０４５ｃ、Ｇ０４５ｏｌｄ、Ｇ０５１、Ｇ０１９、Ｇ０２８、Ｇ０４６、Ｇ０７５、Ｇ０７６、Ｇ０９６、Ｇ０９８、またはＧ０８９タンパク質を、分泌タンパク質として培地から収集した
一過性形質移入により、Ｇ０４５ｃ、Ｇ０４５ｏｌｄ、Ｇ０５１ Ｇ０１９、Ｇ０２８、Ｇ０４６、Ｇ０７５、Ｇ０７６、Ｇ０９６、Ｇ０９８、またはＧ０８９タンパク質を生産するために、タンパク質の高レベルの発現を確実にするためのＣＭＶプロモーターの制御下で、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞を、Ｇ０４５ｃ、Ｇ０４５ｏｌｄ、Ｇ０５１、Ｇ０１９、Ｇ０２８、Ｇ０４６、Ｇ０７５、Ｇ０７６、Ｇ０９６、Ｇ０９８、またはＧ０８９タンパク質をコードするＤＮＡで形質移入した。形質移入はいくつかの市販されている形質移入試薬のうちの１つで実施した。Ｇ０４５ｃ、Ｇ０４５ｏｌｄ、Ｇ０５１、Ｇ０１９、Ｇ０２８、Ｇ０４６、Ｇ０７５、Ｇ０７６、Ｇ０９６、Ｇ０９８、またはＧ０８９分泌タンパク質を、細胞培養培地から、形質移入の４〜５日後に収集した。
一過性に形質移入された細胞または安定な細胞株のどちらか由来の細胞培養培地を、０．２２μｍフィルターを使用して濾過し、１容量の結合緩衝剤（２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）でｐＨ７．２まで調節し、ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔタンパク質Ａ親和性カラム上で、ＡＫＴＡＸｐｒｅｓｓ精製システム（ジーイーライフサイエンス社（GE life sciences））を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウム ｐＨ３．３中での溶出後、緩衝剤交換のために、ＨｉＰｒｅｐ２６／２０脱塩カラム上で、タンパク質を精製した。
さらなる精製のために、Ｇ０４５ｃ、Ｇ０４５ｏｌｄ、Ｇ０５１、Ｇ０１９、Ｇ０２８、Ｇ０４６、Ｇ０７５、Ｇ０７６、Ｇ０９６、Ｇ０９８、またはＧ０８９タンパク質を、５０ｍＭ トリス−ＨＣＬ ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（ジーイーライフサイエンス社（GE Lifesciences））上でのゲルろ過により精製し、続いてＭｏｎｏ Ｓイオン交換カラム（ジーイーライフサイエンス社（GE Lifesciences））上で精製した。イオン交換精製は、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝剤 ｐＨ６中、０〜１ＭのＮａＣｌの濃度勾配で実施した。クロマトグラフィーの後、透析によりタンパク質をＰＢＳに調整した。得られたＧ０４５ｃストラドマーの模式図を図１に示す。
得られたＧ０４５ｃタンパク質の多量体化能力を試験するために、同一濃度の、上述の方法により生成されたＧ０４５ｃ、および国際公開第２００８／１５１０８８号に前述される方法により生成され、かつ外来性のクローニング配列を含むＧ０４５ｏｌｄを含む、１０％ポリアクリルアミドゲルを泳動した。驚くべきことに、外来性断片の除去は、Ｇ０４５ｏｌｄと比較して、Ｇ０４５ｃにおける多量体化の劇的な増加をもたらし、Ｇ０４５ｃは、Ｇ０４５ｏｌｄと比較して、非常により高い濃度のより高次の多量体を示した。（図２Ａを参照のこと）。
Ｇ０４５ｃと比較したＧ０４５ｏｌｄにおける多量体形成を、Ｇｅｌ−ＤｏｃＩＴ画像化システムを使用して分析した。ゲル写真の密度走査に続き、各ゲルバンド中のタンパク質の量を評価した。驚くべきことに、Ｇ０４５ｏｌｄ試料中の多量体形成は約２７．９％と推定されたのに対し、天然に結合しているストラドマーを生成するための外来性断片の除去は、総タンパク質量の約７３．８％と推定される、有意により高い、Ｇ０４５ｃ試料中の多量体形成をもたらした。（図２Ｂを参照のこと）。
実施例２：関節炎のマウスモデルにおける、Ｍ０４５ｏｌｄと比較したＭ０４５ｃの強化された有効性
コラーゲン誘発関節炎における、Ｍ０４５ｏｌｄの有効性と比較したＭ０４５ｃの有効性の評価を実施した。０日目および２１日目に、ＤＢＡ１／Ｊマウスを、フロイント不完全アジュバント（シグマ社（Sigma）、Ｃａｔ＃５５０６）で乳化した４ｍｇ／ｍｌ溶液と合わせたＴｙｐｅＩＩウシコラーゲン（コンドレックス社（Chondrex, Inc.）、Ｃａｔ．２００２１）で免疫した。マウスの体重を毎週計測し、関節炎の徴候を毎日点数化した。各足を点数化し、全ての４つのスコアの合計を関節炎指標（ＡＩ）として記録した。最大の可能なＡＩは、以下の通り１６であった：０＝目に見える関節炎の影響なし、１＝１つの指の浮腫および／または紅斑、２＝２つの関節の浮腫および／または紅斑、３＝２を超える関節の浮腫および／または紅斑４＝四肢変型および関節の強直を含む、足および指全体の重症な関節炎。２２日目（治療０日目）から開始し、コラーゲン免疫マウスのうちの１０匹を、平均ＡＩ（３．３）に基づいて治療群に分類し、１０匹の無病マウスを無病群と指定した。関節炎指標を１４治療日の間測定し、その後マウスを安楽死させた。陽性対照群として、マウスのうち１０匹を平均ＡＩ（３．３）に基づいて治療群に分類し、１０ｍｌ／ｋｇのプレドニゾロンを、毎日経口で投与した。Ｍ０４５ｃまたはＭ０４５ｏｌｄの治療群として、マウスのうち２０匹を平均ＡＩ（３．３）に基づいて治療群に分類し、４日ごとに（０日目、４日目、８日目、および１２日目）、４００μｇのＭ０４５ｃまたはＭ０４５ｏｌｄ（１７．４ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
Ｍ０４５ｃで治療したマウスは、Ｍ０４５ｏｌｄで治療したマウスと比較して、ほぼすべての試験点において、統計的により低い重症度の疾患を有した。（図３を参照のこと）。従って、リーダー配列とＩｇＧ１ Ｆｃの間の１６アミノ酸クローニング断片の除去は、より多くの多量体形成のみならず、炎症性疾患に対する有効性の増加をももたらす。
コラーゲン誘発関節炎における、Ｍ０４５ｃ、Ｍ０１９、Ｍ０２８、Ｍ０４６およびＭ０５１の有効性の評価を同様に実施し、プレドニゾロンの有効性と比較した。上述のとおり、マウスにおいてＣＩＡを誘導し、ＣＩＡ誘導後２２日目から、４００μｇのＭ０４５、Ｍ０１９、Ｍ０２８、Ｍ０４６またはＭ０５１の毎週２回の静脈内投与、または毎日１０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンによるマウスの治療を開始し、上述のとおりＡＩを２週間計測した。試験されるストラドマーのうちの各々を投与されたマウスは、ＰＢＳで治療した対照よりも、統計的により低い重症度の疾患を有した（図９を参照のこと）。
実施例３：関節炎のマウスモデルにおけるＭ０４５およびプレドニゾロンの相乗効果
コラーゲン誘発関節炎モデルにおける、低用量プレドニゾロンと組み合わせたＭ０４５ｃの有効性の評価を実施した。簡単に説明すると、０日目および２１日目に、ＤＢＡ１／Ｊマウスを、フロイント不完全アジュバント（シグマ社（Sigma）、Ｃａｔ＃５５０６）で乳化した４ｍｇ／ｍｌ溶液と合わせたＴｙｐｅＩＩウシコラーゲン（コンドレックス社（Chondrex, Inc.）、Ｃａｔ．２００２１）で免疫した。マウスの体重を毎週計測し、関節炎の徴候を毎日点数化した。各足を点数化し、全ての４つのスコアの合計を関節炎指標（ＡＩ）として記録した。最大の可能なＡＩは、以下の通り１６であった：０＝目に見える関節炎の影響なし、１＝１つの指の浮腫および／または紅斑、２＝２つの関節の浮腫および／または紅斑、３＝２を超える関節の浮腫および／または紅斑４＝四肢変型および関節の強直を含む、足および指全体の重症な関節炎。２２日目（治療０日目）から開始し、コラーゲン免疫マウスのうちの１０匹を、平均ＡＩ（３．３）に基づいて治療群に分類し、１０匹の無病マウスを無病群と指定した。関節炎指標を１４治療日の間測定し、その後マウスを安楽死させた。陽性対照群として、マウスのうち１０匹を平均ＡＩ（３．３）に基づいて治療群に分類し、１０ｍｌ／ｋｇのプレドニゾロンを、毎日経口で投与した。Ｍ０４５ｃ治療群として、マウスのうち１０匹を平均ＡＩ（３．３）に基づいて治療群に分類し、４日ごとに（０日目、４日目、８日目、および１２日目）、４００μｇのＭ０４５ｃまたはＭ０４５ｏｌｄ（１７．４ｍｇ／ｋｇ）を投与した。プレドニゾロンおよびＭ０４５ｃ間の相乗効果を測定するために、１つの群は２ｍｇ／ｋｇの低用量プレドニゾロンで毎日治療し、１つの群は２００μｇ／容量の低用量Ｍ０４５ｃの４日ごとの投与で治療し、および１つの群には、２ｍｇ／ｋｇの低用量プレドニゾロン＋２００μｇ／用量の低用量Ｍ０４５ｃを４日ごとに投与した。
高用量プレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ）は、単一の薬剤として、コラーゲン誘発関節炎の改善において有効であったが、低用量プレドニゾロン（２ｍｇ／ｋｇ）は、ごくわずかに有効なだけであった。さらに、低用量Ｍ０４５ｃ（２００μｇ／容量、または９．１ｍｇ／ｋｇ）もまた、治療していない対照と比較して、疾患重症度の低減において有効ではなかった。しかしながら、驚くべきことに、低用量Ｍ０４５ｃと組み合わせた低用量プレドニゾロンで治療したマウスは、プレドニゾロンおよびＭ０４５ｃ単独の治療群と比較して、相乗効果的な（追加的、という以上の）疾患重症度の低下を示した。（図４を参照のこと）。
実施例４：マウス受容体に対するＩｇＧ２Ａ、Ｍ０４５、Ｍ０４６、Ｍ０２８、Ｍ０１９およびＧ０５１の結合分析
ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＳＩＧＮ−Ｒ1受容体を、それぞれ５６０、５００、および１０００ＲＵまで、アミン固定化を使用してＣＭ４チップ上に固定化し、タンパク質のサイズを補った。Ｍ０４５ｃ（配列番号１１）、Ｍ０４６（配列番号１５）、Ｍ０１９（配列番号１３）およびＭ０２８（配列番号１４）を、ＨＢＳＳ−ＥＰ泳動用緩衝液中、５００ｎＭから１．９ｎＭまで連続的に希釈し、２０μｌ／分で１８０秒、注入した。１ＭのＭｇＣｌを１００μｌ／分で１０秒間注入することにより、再生を達成し、続いて泳動用緩衝液で短時間洗浄した。Ｔ１００評価用ソフトウェアを使用してＫＤを算出した。
マウスＦｃγＲ３ＡおよびＦｃγＲ２ｂに対して、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃホモ二量体は、試験されるストラドマーのうちの各々と比較して、より低い親和性およびより速い解離速度で結合する。マウスＳＩＧＮ−Ｒ１に対して、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃホモ二量体は、感知できるほどには結合しないのに対し、選択的ストラドマーは、様々な程度まで会合し、ゆっくり解離する。（図５を参照のこと）。
Ｍ０４５ｃ画分をこのモデルにおいて評価した。ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓタンパク質精製システムおよびＧＥ ＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅカラムを使用して、最初にＭ０４５Ｆをゲル分画した。画分１（Ｍ０４５ Ｆ１）は、サイズに基づく多量体の分離後、Ｍ０４５多量体の最も高い分子量の成分を含む。Ｍ０４５ Ｆ２はより低い分子量を有する多量体成分であり、Ｍ０４５ Ｆ３はストラドマーのホモ二量体画分である。他の画分またはＩｇＧ２ａ Ｆｃ対照と比較して、マウスＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ（図６ａを参照）、およびＳＩＧＮ−Ｒ１（図６ｂを参照）に対する結合親和性は最も高く、Ｍ０４５ Ｆ１に対する解離速度は遅い。
Ｇ０５１の結合を評価するために、Ｏｃｔｅｔ９６ Ｒｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（フォルテバイオ社（ForteBio）、カリフォルニア州、メンローパーク）上で、製造者の指示（Data Acquisition User Guide 6.4 ForteBio）に従って、バイオレイヤー干渉法（biolayer Interferometry）アッセイを実施した。マウスタンパク質の結合分析のために、ＨｉｓタグされたマウスＦｃγＲＩＩ（アールアンドディーシステム社（R&D system）、ｃａｔ＃１４６０−ＣＤ）およびＦｃγＲＩＩＩ（アールアンドディーシステム社（R&D system）、ｃａｔ＃１９６０）を、１Ｘ動態解析緩衝剤（kinetic analysis buffer）（フォルテバイオ社（ForteBio）、ｃａｔ＃１８−５０３２）中、１０ｕｇ／ｍｌで、抗ペンタＨｉｓバイオセンサー（フォルテバイオ社（ForteBio）、ｃａｔ＃１８−５０７７）に、別々にロードした。ヒトタンパク質の結合分析のために、ＨｉｓタグされたヒトＦｃγＲＩＩｂ（アールアンドディーシステム社（R&D system）、ｃａｔ＃１８７５−ＣＤ）およびＦｃγＲＩＩＩａ（アールアンドディーシステム社（R&D system）、ｃａｔ＃４３２５−Ｆｃ）を、１Ｘ動態解析緩衝剤（kinetic analysis buffer）（フォルテバイオ社（ForteBio）、ｃａｔ＃１８−５０３２）中、１０ｕｇ／ｍｌで、抗ペンタＨｉｓバイオセンサー（フォルテバイオ社（ForteBio）、ｃａｔ＃１８−５０７７）に、別々にロードした。センサーチップのロード後、１Ｘ動態解析緩衝剤（kinetics analysis buffer）中の、単量体の画分（多様な濃度にわたる）または多量体の画分（多様な濃度にわたる）のどちらかの配合物にチップを移動することによりタンパク質の会合を測定し、センサーチップを１Ｘ動態緩衝剤（kinetics buffer）に移動することにより解離を測定した。分析結果は記載される通りであった（Data Analysis User Guide 6.4ForteBio)）。分析結果を上述のとおり標準化し、ホモ二量体に５０ｋＤの分子量を割り当て、すべての他のタンパク質配合物に１５０ｋＤを割り当てた。
表２は、Ｍ０５１のより大きなストラドマー多量体画分は、より小さな多量体画分よりも、より高い親和性および結合活性で結合しかつより遅く解離し、より小さな多量体画分は、ホモ二量体画分よりも、より高い親和性および結合活性で結合しかつより遅く解離することを示す。
Ｇ００１（陰性ＩｇＧ１ Ｆｃ）と比較したＧ０４５またはＧ０５１の結合動態を評価するために、上述のとおり、Ｏｃｔｅｔ９６ Ｒｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上で、バイオレイヤー干渉法（biolayer Interferometry）アッセイを実施した。Ｇ０４５およびＧ００１の、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＦおよびＶ変異体の両方）、カニクイザルＦｃγＲＩＩＩａ、カニクイザルＦｃγＲＩＩＩｂおよびカニクイザルＦｃγＲＩＩＩに対する結合を測定した。Ｇ０４５は、Ｇ００１と比較して、試験される受容体のうちの各々に対する、有意により高い結合親和性を有し、より遅い解離、および結合活性の証拠を伴う。（表３および４を参照のこと）。

同様にして、Ｇ０５１およびＧ００１の、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を測定した。Ｇ０５１は、Ｇ００１と比較して、試験される受容体のうちの各々に対する、有意により高い結合親和性を有し、より遅い解離および結合活性の証拠を伴う。（表５を参照のこと）。
表５
実施例５：天然に結合しているストラドマー化合物はＩＴＰの治療／予防において有効である
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）におけるストラドマーの効果を解明するために、ＩＴＰの予防的マウスモデルにおいて、ストラドマーを試験した。血小板上のインテグリン受容体を覆う、マウスインテグリン抗ＩＩｂ抗体に暴露した後、低血小板数を誘導した。簡単に説明すると、１日目に、採血および血小板数測定に続き、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー社（Charles River））に、ストラドマーまたは対照を尾静脈注射した。２日目に、採血および血小板数測定に続き、血小板の減少を誘導するために、２００μｌのリン酸緩衝食塩水中２μｇの抗体の濃度で腹腔内注射により投与することを前提として、マウスをＭＷＲｅｇ３０（ＢＤファーミンジェン社（BD Pharmingen）、ｃａｔ＃５５３８４７）で治療した。血小板数測定のための採血およびＭＷＲｅｇ３０の注射を、３日目、４日目、および５日目にも継続した。ＩＶＩＧ陽性対照を、２日目から５日目に毎日投与した。血小板数は、Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｅｍａｖｅｔ９５０血球計数器で測定した。Ｍ０４５ｃおよびその画分を、２日目に一回投与した。血液は、尾静脈に切れ目を入れることにより採取し、凝固を防ぐためにクエン酸塩緩衝剤と混合した。
薬剤治療なしのＩＴＰ対照およびＩｇＧ２ａ Ｆｃ対照の両方と比較して、Ｍ０４５ｃはこのモデルにおいて有意に防御的であり、ＩＶＩＧ予防的治療、およびＭＷＲｅｇ３０の注射（insult）を受けなかったマウスの両方と競合する（図７を参照のこと）。Ｍ０４５ｃ画分を、実施例４に記載される通りに作製した。Ｍ０４５画分１は、このモデルにおいて、薬剤治療なしのＩＴＰ対照と比較して有意に防御的であるのに対し、Ｍ０４５画分３は防御的ではない。
実施例６：天然に結合しているストラドマー複合体による内毒素複合体の除去
内毒素を除去するために、目的のタンパク質を含む内毒素含有タンパク質溶液を、内毒素結合性ストラドマーを溶液に混合した後に、１容量の結合緩衝剤（２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）でｐＨ７．２に調整した。内毒素を除去するために、タンパク質を含む溶液を、アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ プロテインＡ親和性カラム、ＧＥライフサイエンシズ社（GE Life Sciences））に適用する。ストラドマーが結合した内毒素は親和性カラムに結合し、精製された、内毒素を含まないタンパク質が、素通り画分に溶出する。
内毒素を捕捉するための、ストラドマー使用に代替するアプローチにおいては、タンパク質Ａでコーティングされた磁気ビーズ（ニューイングランドバイオラブス社（New England BioLabs）、マサチューセッツ州）を、内毒素含有タンパク質溶液中に、内毒素結合性ストラドマーとともに混合し、ストラドマーが結合した内毒素は、磁気分離により除去される。
実施例７：免疫学的アッセイにおけるＦｃブロッキングのための、天然に結合しているストラドマー複合体の使用
抗体ベースの研究ツールおよび臨床検査薬の感受性および特異性の改善。抗体の研究および臨床検査薬の有用性は、非特異的結合性により限定される。これは、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のＦｃ部分の、免疫細胞および腫瘍を含む細胞上の高親和性Ｆｃγ受容体および他のＦｃ結合受容体に対する結合により、または抗体で覆われた抗体凝集体または細胞凝集体の、低親和性Ｆｃγ受容体に対する結合により、起こり得る。
Ｆｃγ受容体の、特異的な抗Ｆｃγ受容体抗体との相互座用を阻止するストラドマーの能力を実証するために、フローサイトメトリーを実施し、徐々に用量を増加したヒトストラドマーＧ０４５ｃを、特異的な細胞上に存在することが知られているＦｃγＲに対する抗ＦｃγＲ抗体の結合を阻止する能力に関して、ＩｇＧ１ Ｆｃのホモ二量体の単量体であるＧ００１と比較した。ストラドマーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ対照と比較して、抗ＦｃγＲ抗体のＦｃγＲに対する結合を効果的に阻止し、そのためには濃度に依存するということが判明した。（図８を参照のこと）。
Ｆｃγ受容体および免疫グロブリンＦｃ領域に結合する他の受容体に対するその非常に高い結合親和性ゆえに、ストラドマーは、特異的な抗Ｆｃγ受容体モノクローナル抗体の結合および相互座用の阻止においてさえ、驚くほど有効である。従ってストラドマーは、研究ツール環境および臨床検査薬環境の両方において、投与された抗体の非特異的な抗体結合を減少させるために、対照試薬として有用である。
実施例８：天然に結合しているストラドマー化合物は、実験的自己免疫性神経炎の治療において有効である
Ｍ０４５ｃおよびＭ０５１の、それぞれの場合においてＩＶＩＧおよびアルブミンに対するものと比較した有効性の評価を、実験的自己免疫性神経炎（ＥＡＮ）ラットモデルにおいて実施した。マウスＥＡＮモデルは、ヒト急性炎症性脱髄性多発ニューロパチーの、広範に使用されている動物モデルである。簡単に説明すると、４５匹のＬｅｗｉｓラットを完全なウシ末梢神経ミエリンで免疫し、３つの群にランダムに分類した。一般的には９日目または１０日目に始まる体重減少である、臨床的欠陥の発症時に、治療群あたり１５匹のラットを、ＩＶＩｇ（１ｇｍ／体重１Ｋｇ）、Ｍ０４５（２０ｍｇ／Ｋｇ）またはＭ０５１（１７．５ｍｇ／Ｋｇ）、もしくはアルブミンで治療し、全てのラットに、連続して２日間、２用量を静脈投与した。すべての薬剤を、尾静脈注射により、静脈内に投与した。
ＥＡＮラットを、臨床的、電気生理学的、および組織学的に評価した。臨床的な疾患重症度を、毎日の臨床的な格付けおよび体重変化により評価した。電気生理学的研究には、複合筋活動電位（ＣＭＡＰｓ）の振幅および運動神経伝導速度（ＭＣＶ）の検査も含まれた。疾患のピークの１５日目に、各郡から５匹のラットを屠殺し、坐骨神経を収集し、病理組織学的変化を分析した。治療の有効性を、ＩＶＩｇおよびアルブミン群、ならびに組換え型Ｍ０４５ｃまたはＭ０５１およびアルブミン群の間で比較した。
試験されるストラドマーＭ０４５ｃを投与されたラットは、アルブミンで治療された対照よりも、有意的により重症度の低い疾患を有した（図１２を参照のこと）。アルブミンで治療されたＥＡＮラットは、ＩＶＩｇで治療されたラット（１５匹中１匹）、およびＭ０４５ｃで治療されたラット（１５匹中０匹）と比較して、より高い死亡率（１５匹中４匹）を呈した。Ｍ０４５ｃおよびＩＶＩｇによる治療を受けた動物は、有意に、より顕著ではない体重減少を示した。ＩＶＩｇおよびＭ０４５ｃで治療されたラットには、運動神経伝導速度（ＭＣＶ）および末梢部および基部のＣＭＡＰ振幅の両方において、アルブミンで治療されたラットと比較して、統計的に有意な改善があった。アルブミンで治療されたラットは、ＩＶＩｇまたはＭ０４５ｃで治療されたラットと比較して、坐骨神経におけるより重症な軸索の欠陥および活性な軸索変性を示した。従って、ストラドマーＭ０４５ｃは、アルブミンと比較して、臨床のゴールドスタンダードであるＩＶＩｇが示す有効性と競合する、死亡率、体重、臨床的、電気生理学的および病理組織学的な有効性を、ＩＶＩｇの用量の約２％で実証した。
試験群あたり１１匹のラットで行った別の実験において、試験されるストラドマーＭ０５１を投与されたラットは、アルブミンで治療された対照よりも、統計的により重症度の低い疾患を有した。（図１１を参照のこと）。この研究において、Ｍ０５１群での４匹に対して、対照（アルブミン）群では１１匹中７匹の動物が死亡した。ＩＶＩｇまたはＭ０５１のどちらかを投与されたラットは、アルブミン対照を投与されたラットと比較して、有意により少ない体重減少を示した。ＩＶＩｇまたはＭ０５１のどちらかを投与されたラットは、アルブミン対照を投与されたラットと比較して、臨床スコアにおける有意な改善を示した。ＩＶＩｇまたはＭ０５１による治療後、ＭＣＶおよびＣＭＡＰ振幅の両方において、統計的に有意な改善があった。従って、ストラドマーＭ０５１は、アルブミンと比較して、臨床のゴールドスタンダードであるＩＶＩｇが示す有効性と競合する、有意な、死亡率、体重、臨床的、および電気生理学的有効性を、ＩＶＩｇの用量の約２％で実証した。
実施例９：Ｆｃ変異を含む天然に結合しているストラドマー化合物は、ＦｃγＲに対する強化された結合を示し、関節炎のマウスモデルの治療において有効である。
Ｆｃ変異体含有ストラドマーである、Ｇ０７５（配列番号２０）およびＧ０７６（配列番号２１）の、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａに対する結合を、実施例４において上述されるとおり、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより実施した。Ｇ０７５は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加、およびＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する結合の減少を示し、一方Ｇ０７６は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の減少、およびＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する結合の増加を示した。（図１０ＡおよびＢを参照のこと）。
次に、Ｆｃ変異体含有ストラドマー、Ｍ０７５（配列番号２２）、Ｍ０７６（配列番号２３）およびＭ０９８（配列番号２５）の関節炎のマウスモデルにおける有効性の評価を、上述の実施例３で実施された通りに決定した。Ｆｃ変異体含有ストラドマーを、ビヒクルおよびＭ０４５ｃと比較した。Ｍ０９８およびＭ０７５の両方が、ＣＩＡの進行の阻害において有意により有効であり、一方、Ｍ０７６ストラドマーは有効ではなかった。（図１３ＡおよびＢを参照のこと）。個々のＦｃ−ＦｃＲ結合を変化させることが知られている、または補体依存性細胞傷害を変化させる、免疫グロブリンＦｃの他の変異が、ＩｇＧ１ Ｆｃを含み、Ｆｃ受容体に多価のＩｇＧ１ Ｆｃを提示するストラドマーに対して、同様に相補的であることが期待される。

Claims (156)

  1. （ａ）リーダー配列；
    （ｂ）ＩｇＧ１ Ｆｃ領域；および
    （ｃ）多量体化ドメイン；
    を含むストラドマー単位であって、前記リーダー配列が前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合し、および前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が前記多量体化ドメインに直接結合しているか、または前記リーダー配列が前記多量体化ドメインに結合し、および前記多量体化ドメインが前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に直接結合している、ストラドマー単位。
  2. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１に記載のストラドマー単位。
  3. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する、請求項１に記載のストラドマー単位。
  4. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１に記載のストラドマー単位。
  5. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも９９％の相同性を有する、請求項１に記載のストラドマー単位。
  6. 前記多量体化ドメインが、ＩｇＧ２ａヒンジ、イソロイシンジッパー、およびＧＰＰドメインから成る群から選択され、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することが出来る、請求項１に記載のストラドマー単位。
  7. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  8. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  9. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも９５％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  10. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも９９％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  11. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  12. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  13. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９５％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  14. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９９％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  15. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  16. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  17. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも９５％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  18. 前記多量体化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２６と少なくとも９９％の相同性を有し、かつ前記ストラドマー単位を多量体化することができる、請求項６に記載のストラドマー単位。
  19. 前記多量体化ドメインが、前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のカルボキシ末端に直接結合している、請求項１に記載のストラドマー単位。
  20. 前記多量体化ドメインが、前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ末端に直接結合している、請求項１に記載のストラドマー単位。
  21. 前記ストラドマー単位が配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２７、または配列番号２８を含む、請求項１に記載のストラドマー単位。
  22. 前記多量体化ドメインが、前記ストラドマー単位の多量体を生成する、請求項１に記載のストラドマー単位。
  23. 前記ストラドマー単位の多量体が高次多量体である、請求項２２に記載のストラドマー単位。
  24. 前記多量体が、全ストラドマー組成物の少なくとも約４５％の割合で存在する、請求項２３に記載のストラドマー単位を含むストラドマー組成物。
  25. 前記多量体が、全ストラドマー組成物の少なくとも約５５％の割合で存在する、請求項２３に記載のストラドマー単位を含むストラドマー組成物。
  26. 前記多量体が、全ストラドマー組成物の少なくとも約６５％の割合で存在する、請求項２３に記載のストラドマー単位を含むストラドマー組成物。
  27. 前記多量体が、全ストラドマー組成物の少なくとも約７０％の割合で存在する、請求項２３に記載のストラドマー単位を含むストラドマー組成物。
  28. 前記多量体が、全ストラドマー組成物の少なくとも約７３％の割合で存在する、請求項２３に記載のストラドマー単位を含むストラドマー組成物。
  29. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域がＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１またはＦｃγＲに結合することが出来る、請求項１に記載のストラドマー単位。
  30. 前記ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１に記載のストラドマー単位。
  31. 少なくとも２つの請求項１に記載のストラドマー単位を含む、クラスターストラドマー。
  32. 前記ストラドマーがＦｃγＲＩＩＩａに結合する、請求項３１に記載のクラスターストラドマー。
  33. 免疫応答を対象において調節する方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の請求項３１に記載のクラスターストラドマーを投与することを含む、方法。
  34. 前記調節が樹状細胞上でのＣＤ８６の誘導を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記調節が樹状細胞上でのＣＤ１ａ発現の阻害を含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 炎症性疾患を、それを必要とする対象において治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１に記載のクラスターストラドマーを投与することを含む、方法。
  37. 前記炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記自己免疫疾患が、関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発神経炎、強皮症、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、およびアトピー性皮膚炎から成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記自己免疫疾患が、提供者から受容者への臓器移植に関連する、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記炎症性疾患が感染症である、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記感染症が細菌感染症である、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記感染症がウイルス感染症である、請求項３６に記載の方法。
  43. 前記クラスターストラドマーを、静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、頬側、経皮、皮下移植により、または筋肉内に投与する、請求項３６に記載の方法。
  44. 前記クラスターストラドマーを静脈内に投与する、請求項３６に記載の方法。
  45. 前記クラスターストラドマーを、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項３６に記載の方法。
  46. 前記クラスターストラドマーを、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項３６に記載の方法。
  47. ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいて抗体の非特異的結合を阻止する方法であって、前記方法が、標的組織または標的細胞を、有効量の請求項３１に記載のクラスターストラドマーを含む組成物とともにインキュベートすることを含む、方法。
  48. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイが、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、または免疫蛍光アッセイである、請求項４７に記載の方法。
  51. 組成物中の内毒素レベルを減少させる方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１に記載のクラスターストラドマーで、組成物を処理することを含む、方法。
  52. 前記クラスターストラドマーが、前記組成物中の前記内毒素と複合する、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記組成物から前記ストラドマーが複合した内毒素を除去することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記ストラドマーが複合した内毒素を、前記組成物から濾過により除去する、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記組成物が医薬組成物である、請求項５３に記載の方法。
  56. クラスターストラドマーの生産方法であって、前記方法が、配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２４、および配列番号２７から成る群から選択される配列を、宿主中で発現させることを含む、方法。
  57. 請求項５６に記載の方法であって、以下をさらに含む、方法：
    配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２４、および配列番号２７から成る群から選択されるストラドマーをコードするＤＮＡを、発現ベクター中にクローニングすること；
    （ｂ）前記発現ベクターを細菌宿主中に形質移入すること；
    （ｃ）クローン化されたＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを細菌培養物から単離すること；
    （ｄ）前記クローン化されたＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを直線化すること；
    （ｅ）直線化されたＤＮＡを哺乳類の細胞中に形質移入すること；
    （ｆ）安定に形質移入された細胞のプールを得るために、陽性に形質移入された細胞を増殖させること；
    （ｇ）ストラドマータンパク質を培地から収集すること；
    （ｈ）前記ストラドマータンパク質を精製すること；ここで前記ストラドマータンパク質は外来性配列を含まない。
  58. 前記発現ベクターが選択可能なマーカーを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記選択可能なマーカーが、抗生物質耐性遺伝子である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記哺乳類の細胞がＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項５７に記載の方法。
  62. 前記ストラドマータンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーにより精製される、請求項５７に記載の方法。
  63. 前記ストラドマーを、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する、請求項６２に記載の方法。
  64. 追加の薬剤的に活性な薬剤を投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  65. 前記追加の薬剤的に活性な薬剤が、ステロイド、モノクローナル抗体、抗生物質、および抗ウイルス薬、サイトカイン、または他の方法により免疫調節物質として作用し得る薬剤を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ステロイドが、プレドニゾロン、コルチゾン、モメタゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクロメタゾン、アルブテロール、またはレバルブテロール（levalbuterol）である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記追加の薬剤的に活性な薬剤および前記クラスターストラドマーが、治療的相乗効果を示す、請求項６４〜６６のうちのいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ヒンジドメインを欠く、請求項１に記載のストラドマー単位。
  69. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃが、配列番号１９のＩｇＧ１ ＣＨ２およびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインから成る、請求項１に記載のストラドマー単位。
  70. 以下を含む、ストラドマー単位：
    （ａ）リーダー配列；および
    （ｂ）以下を含むＦｃ領域：
    （１）配列番号３のＩｇＧ２ヒンジドメイン；および
    （２）配列番号１９のＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。
  71. 前記ＩｇＧ２ヒンジドメインが、前記ストラドマー単位の多量体を生成する、請求項７０に記載のストラドマー単位。
  72. 配列番号１８と、少なくとも８０％の相同性を有する、請求項７０に記載のストラドマー単位。
  73. 配列番号１８と、少なくとも９０％の相同性を有する、請求項７０に記載のストラドマー単位。
  74. 配列番号１８と、少なくとも９５％の相同性を有する、請求項７０に記載のストラドマー単位。
  75. 配列番号１８と、少なくとも９９％の相同性を有する、請求項７０に記載のストラドマー単位。
  76. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１またはＦｃγＲと結合することが出来る、請求項６９に記載のストラドマー単位。
  77. 前記ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩａである、請求項７６に記載のストラドマー単位。
  78. 少なくとも２つの、請求項７０に記載のストラドマー単位を含む、クラスターストラドマー。
  79. 前記ストラドマーがＦｃγＲＩＩＩａと結合する、請求項７８に記載のクラスターストラドマー。
  80. 免疫応答を対象において調節する方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の請求項７８に記載のクラスターストラドマーを投与することを含む、方法。
  81. 前記調節が、樹状細胞上でのＣＤ８６の誘導を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記調節が、樹状細胞上でのＣＤ１ａ発現の阻害を含む、請求項８０に記載の方法。
  83. 炎症性疾患を、それを必要とする対象において治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３１に記載のクラスターストラドマーを投与することを含む、方法。
  84. 前記炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記自己免疫疾患が、関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発神経炎、強皮症、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、およびアトピー性皮膚炎から成る群から選択される、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記自己免疫疾患が、提供者から受容者への臓器移植に関連する、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記炎症性疾患が感染症である、請求項８３に記載の方法。
  88. 前記感染症が細菌感染症である、請求項８３に記載の方法。
  89. 前記感染症がウイルス感染症である、請求項８３に記載の方法。
  90. 前記クラスターストラドマーを、静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、頬側、経皮、皮下移植により、または筋肉内に投与する、請求項８３に記載の方法。
  91. 前記クラスターストラドマーを静脈内に投与する、請求項８３に記載の方法。
  92. 前記クラスターストラドマーを、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項８３に記載の方法。
  93. 前記クラスターストラドマーを、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項８３の方法。
  94. ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいて抗体の非特異的結合を阻止する方法であって、前記方法が、標的組織または標的細胞を、有効量の請求項７８に記載のクラスターストラドマーを含む組成物とともに、インキュベートすることを含む、方法。
  95. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項９４に記載の方法。
  97. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイが、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、または免疫蛍光アッセイである、請求項９４に記載の方法。
  98. 組成物中の内毒素レべルを減少させる方法であって、前記方法が、有効量の請求項７８に記載のクラスターストラドマーで、前記組成物を処理することを含む、方法。
  99. 前記クラスターストラドマーが、前記組成物中の前記内毒素と複合する、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記ストラドマーが複合した内毒素を、前記組成物から除去することをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
  101. 前記ストラドマーが複合した内毒素を、前記組成物から濾過により除去する、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記組成物が医薬組成物である、請求項１００に記載の方法。
  103. 追加の薬剤的に活性な薬剤を投与することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
  104. 前記追加の薬剤的に活性な薬剤が、ステロイド、モノクローナル抗体、抗生物質、および抗ウイルス薬、サイトカイン、または他の方法により免疫調節物質として作用し得る薬剤を含む、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記ステロイドが、プレドニゾロン、コルチゾン、モメタゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクロメタゾン、アルブテロール、またはレバルブテロール（levalbuterol）である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、１つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載のストラドマー単位。
  107. 配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載のストラドマー単位。
  108. 配列番号２０と少なくとも約８０％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  109. 配列番号２０と少なくとも約９０％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  110. 配列番号２０と少なくとも約９５％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  111. 配列番号２０と少なくとも約９９％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  112. 配列番号２１と少なくとも約８０％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  113. 配列番号２１と少なくとも約９０％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  114. 配列番号２１と少なくとも約９５％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  115. 配列番号２１と少なくとも約９９％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  116. 配列番号２４と少なくとも約８０％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  117. 配列番号２４と少なくとも約９０％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  118. 配列番号２４と少なくとも約９５％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  119. 配列番号２４と少なくとも約９９％の相同性を有する、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  120. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、ＦｃＲｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１またはＦｃγＲと結合することが出来る、請求項１０７に記載のストラドマー単位。
  121. 前記ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１２０に記載のストラドマー単位。
  122. 少なくとも２つの請求項１０７に記載のストラドマー単位を含む、クラスターストラドマー。
  123. 前記ストラドマーがＦｃγＲＩＩＩａと結合する、請求項１２２に記載のクラスターストラドマー。
  124. 免疫応答を対象において調節する方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の請求項１２２に記載のクラスターストラドマーを投与することを含む、方法。
  125. 前記調節が、樹状細胞上でのＣＤ８６の誘導を含む、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記調節が、樹状細胞上でのＣＤ１ａ発現の阻害を含む、請求項１２４に記載の方法。
  127. 炎症性疾患を、それを必要とする対象において治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１２２に記載のクラスターストラドマーを投与することを含む、方法。
  128. 前記炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記自己免疫疾患が、関節炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発神経炎、強皮症、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、およびアトピー性皮膚炎から成る群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記自己免疫疾患が、提供者から受容者への臓器移植に関連する、請求項１２８に記載の方法。
  131. 前記炎症性疾患が感染症である、請求項１２７に記載の方法。
  132. 前記感染症が細菌感染症である、請求項１２７に記載の方法。
  133. 前記感染症がウイルス感染症である、請求項１２７に記載の方法。
  134. 前記クラスターストラドマーを、静脈内、皮下、経口、腹腔内、舌下、頬側、経皮、皮下移植により、または筋肉内に投与する、請求項１２７に記載の方法。
  135. 前記クラスターストラドマーを、静脈内に投与する、請求項１２７に記載の方法。
  136. 前記クラスターストラドマーを、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項１２７に記載の方法。
  137. 前記クラスターストラドマーを、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項１２７に記載の方法。
  138. ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいて抗体の非特異的結合を阻止する方法であって、前記方法が、標的組織または標的細胞を、有効量の請求項１２２に記載のクラスターストラドマーを含む組成物とともにインキュベートすることを含む、方法。
  139. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１３８に記載の方法。
  141. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイが、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、または免疫蛍光アッセイである、請求項１３８に記載の方法。
  142. 組成物中の内毒素レベルを減少させる方法であって、前記方法が、有効量の請求項１２２に記載のクラスターストラドマーで、前記組成物を処理することを含む、方法。
  143. 前記クラスターストラドマーが、前記組成物中の前記内毒素と複合する、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記ストラドマーが複合した内毒素を前記組成物から除去することをさらに含む、請求項１４２に記載の方法。
  145. 前記ストラドマーが複合した内毒素を、前記組成物から濾過により除去する、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記組成物が医薬組成物である、請求項１４４に記載の方法。
  147. 追加の薬剤的に活性な薬剤を投与することをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
  148. 前記追加の薬剤的に活性な薬剤が、ステロイド、モノクローナル抗体、抗生物質、および抗ウイルス薬、サイトカイン、または他の方法により免疫調節物質として作用し得る薬剤を含む、請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記ステロイドが、プレドニゾロン、コルチゾン、モメタゾン、テストステロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクロメタゾン、アルブテロール、またはレバルブテロール（levalbuterol）である、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記リーダー配列が切断されている、請求項１、６９または１０６のうちのいずれか１項に記載のストラドマー単位。
  151. 以下を含むストラドマー単位：（ａ）ＩｇＧ１ Ｆｃ領域；および（ｂ）多量体化ドメイン；ここで前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、前記多量体化ドメインに直接結合している。
  152. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、配列番号２または配列番号１９を含む、請求項１５１に記載のストラドマー単位。
  153. 前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項１５１に記載のストラドマー単位。
  154. 前記多量体化ドメインが、配列番号３、配列番号５、および配列番号２６から成る群から選択される、請求項１５１に記載のストラドマー単位。
  155. 少なくとも２つの、請求項１５１〜１５４のうちのいずれか１項に記載のストラドマー単位を含む、クラスターストラドマー。
  156. 配列番号４、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２４、および配列番号２７のストラドマー単位をコードする核酸。
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