KR20240042137A - 향상된 상보체 결합을 갖는 규칙적으로 다형체화된 면역글로불린 fc 조성물을 생성하기 위한 인간 단백질 단편의 융합 단백질 - Google Patents

향상된 상보체 결합을 갖는 규칙적으로 다형체화된 면역글로불린 fc 조성물을 생성하기 위한 인간 단백질 단편의 융합 단백질 Download PDF

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헨릭 올슨
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Abstract

본 발명은 면역글로불린 Fc의 일련의 완전한 재조합 다형체화 형태에 관한 것으로, 이에 의해 면역 세포 수용체에 다가 면역글로불린 Fc를 제공한다. 융합 단백질은 동종이량체와 스트라도머로 칭해지는 고차 다량체 분획으로서 존재한다. 본 발명은 다량체화를 증가시키고 상보체에 우선적으로 결합하며, 질환의 치료 및 예방에서 유용한 스트라도머에 관한 것이다.

Description

향상된 상보체 결합을 갖는 규칙적으로 다형체화된 면역글로불린 FC 조성물을 생성하기 위한 인간 단백질 단편의 융합 단백질{FUSION PROTEINS OF HUMAN PROTEIN FRAGMENTS TO CREATE ORDERLY MULTIMERIZED IMMUNOGLOBULIN FC COMPOSITIONS WITH ENHANCED COMPLEMENT BINDING}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 7월 24일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/196,478호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
본 명세서와 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그들의 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능한 형식의 사본(파일명: GLIK_015_01WO_SeqList_ST25.txt, 저장일: 2016년 7월 22일, 파일 크기 193 킬로바이트).
본 발명의 기술 분야
본 발명은 일반적으로 면역학, 자가면역, 염증 및 종양 면역학 분야에 관한 것이단. 더 구체적으로는, 본 발명은 변경된 Fc 수용체 결합 및 상보체 시스템의 구성요소에 대한 유지된 또는 향상된 결합을 나타내는 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 생물학적으로 활성인 생체 모방 분자, 이러한 생체 모방체(biomimetics)를 포함하는 조성물, 및 이러한 생체 모방체를 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 병리학적 병태, 예컨대 상보체-매개 질환, 자가면역 질환, 염증 질환, 혈액 장애 및 암을 치료하거나 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
상보체 시스템은 표적 세포 용해 및 항원의 식균작용에 연루된 면역계의 부분이다. 현재 3가지 주요 상보체가 공지되어 있다: 고전적 경로, 대안의 경로 및 렉틴(lectin) 결합 경로. 고전적 상보체 경로는, 단백질 C1q가 무손상 면역글로불린 IgM의 하나 이상의 분자, 또는 무손상 면역글로불린 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 적어도 2개의 분자에 결합하면, 활성화된다(Janeway's Immunobiology, 8th　Ed., Murphy ed., Garland Science, 2012, Chapter 10). 상보체 활성화는 상보체-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)을 야기한다. 단클론성 항체의 Fc 영역 내 변경은 상보체 결합의 친화도를 향상시키거나 또는 감소시키는 것으로 나타났다(Moore et al., MAbs. 2(2): 181-9 (2010). 그러나, 이 작업은 단클론성 항체와 관련하여 행해지며, 따라서 Fab의 표적 특이성에 적어도 부분적으로 의존하였고, 결합 아비디티(avidity)의 내용은 없었다.
과량의 상보체 활성화 및/또는 분해는 해로우며, 중증 근무력증, 용혈성 요독 증후군(HUS) 및 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)을 포함하는 다수 질환과 관련될 수 있다. 뇌의 노화는 상보체 성분 C1q의 극적으로 증가된 수준과 관련된다(Stephan et al., J. Neuroscience, 14 August 2013, 33(33): 13460-13474). 상보체 시스템은 아세틸콜린 수용체 항체-관련 중증 근무력증의 발병에 깊이 연루된다( and Christadoss, Autoimmun Rev. 2013 Jul;12(9):904-11. doi: 10.1016/j.autrev.2013.03.003). 면역학적, 유전적 및 단백질 생화학적 연구로부터의 다수의 발견은 상보체 시스템이 연령-관련 황반 변성의 병인에서 필수적 역할을 한다는 것을 나타낸다(Weber et al., Dtsch Arztebl Int., 2014 Feb; 111(8): 133-138. doi:10.3238/arztebl.2014.0133). 상보체의 고전적 경로와 대안의 경로는 둘 다 류마티스 관절염 동안 뿐만 아니라 류마티스 관절염에 대한 동물 모델에서 병리학적으로 활성화된다는 강한 증거가 있다(Okroj et al., Ann Med. 2007;39(7):517-30).
고전적, 대안적 및 렉틴 경로는 순차적 방식으로 활성화되고, 모두 3가지 경로가 전신 질환에 연루된다. 상보체 시스템의 활성화는 전신 자가면역 질환의 발병에 연루된다. 고전적 경로를 통한 활성화는 면역 복합체-매개 질환, 예컨대 한냉 글로불린증 혈관염 및 전신 홍반 루푸스에서 장기간 인식되었다(Chen et al., Journal of Autoimmunity, 2009; doi:10.1016/j.jaut.2009.11.014). 대안의 경로와 렉틴 경로 둘 다를 통한 상보체 활성화는 헤노흐-쇤라인 자반병() 및 IgA 신장병증을 갖는 환자에서 발견된다(Hisano et al., Am J Kidney Dis 2005;45:295e302). 성인 신증후군의 가장 통상적인 원인 중 하나인 막성 신증에서 상보체의 중요성이 잘 기재되어 있다. 막성 신증은 사구체 상피하 면역 침착에 의해 표시된다. 막성 신증의 실험 모델인 히만신염에서의 연구는 이들 침착이 상보체를 국소적으로 활성화시켜 다리세포 손상, 세포 골격 재구성에서의 정점, 틈새격막의 상실, 및 단백뇨를 야기한다는 것을 입증하였다(Beck et al., The Role of Complement in Membranous Nephropathy. Semin Nephrol 2013 Nov;33(6):531-42).
상보체의 활성화는, 과정이 처음으로 이해되는 것으로 생각되고서 몇 십년 후에, 캐스케이드의 새로운 성분이 여전히 발견 중인 엄청나게 복잡한 과정이다. 고전적 경로 상보체 캐스케이드의 제1 단계는 항체에 대한 C1q의 결합이다. (Nature.　1988 Apr 21;332(6166):738-40; The binding site for C1q on IgG. Duncan AR,　Winter G.).
C3에 대한 또는 C3b에 대한 비응집 항체의 결합은 혈장 중의 상보체 활성화를 통해 생기는 것으로 생각되는 것이 아니라, 활성화 생성물 C3b2와 IgG와의 복합체에 의해 주로 유지될 것으로 생각된다(Mol Immunol.　2006 Jan;43(1-2):2-12. Complement amplification revisited. Lutz HU,　Jelezarova E). 그러나, IgG 항체를 함유하는 면역 응집물에 의한 상보체의 대안의 경로의 활성화 동안, C3b의 알파'-쇄는 IgG의 중쇄의 Fd 부분(즉, Fab 단편에 포함된 중쇄의 부분) 내 1 또는 2개의 부위에서 공유 결합될 수 있다(Biochem J. May 1, 1981; 195(2): 471-480). 항체-항원에 대한 상보체 성분 C3의 결합은 인간 혈청에서 대안의 경로의 활성화 후에 응집한다. 문헌[K J Gadd　and　K B Reid]. 상보체 성분 C4a, C3a, C5a, 및 막 공격 복합체는 조직학적으로 상보체 분열 생성물 또는 아나필라톡신으로서 통상적으로 지칭되었다. 그러나, 문헌은 이제 C4a(Xie et al., International Immunopharmacology 12 (2012) 158-168), C3a(Coulthard and Woodruff, J Immunol 2015; 194:3542-3548), 및 C5a(Nishise et al., Therapeutic Apheresis and Dialysis 13(6):509-514 및 Gerard et al., J. Biol Chem. 280(48):39677-39680, December 2, 2005)가 특정 환경에서 항염증이고, 캐스케이드의 상승과 관련되지 않는다는 것을 분명하게 만든다.
이때에 상보체-매개 질환의 치료를 위한 시장에서의 우세한 요법은 C5에 결합하고 그의 C5a 및 C5b-9로의 절단을 저해하여 하류의 상보체 캐스케이드의 진행 및 관련된 염증 및 혈전 반응을 부분적으로 저해하는 항-C5 항체 에쿨리주맙이다. 그러나, 이는 상류의 상보체 성분, 예컨대 C1q, C1R, C1S, C1-유사 복합체에 대해, 또는 상보체 캐스케이드 성분 C5 상류의 렉틴 경로, 고전적 경로, 및 대안의 경로의 성분이고, 질환을 치료하기 위한 우선적인 표적일 수 있는 C4, C4a, C4b, C2, C1, C4b2, C2b, C4b2a, C3, C3a 또는 C3b에 대해 직접적인 영향을 갖지 않는다. 대조적으로, 정상 면역글로불린 및 단클론성 항체는 C1q에 그리고 C5 상류의 다른 표적에 결합한다. 따라서, 상류의 상보체 캐스케이드 성분의 결합 및 상보체 캐스케이드의 결과적인 조절을 통해 상보체-매개 질환을 치료하기 위한 개선된 방법에 대한 당업계의 필요가 있다. 친화도만이 아니라 아비디티 결합을 갖는 6량체 C1q에 결합하고, 추가로 저 친화도 Fc 수용체에 대한 상당한 아비디티 결합이 없는 면역글로불린 Fc-포함 화합물을 이용하여 상보체-매개 질환을 치료하는 개선된 방법에 대한 당업계의 추가적인 필요가 있다.
천연 면역글로불린 IgG1 Fc는 12개 초과의 리간드에 자연적으로 결합하는데, 이중 하나는 상보체 인자 C1q이다. 제한 없이 다른 IgG1 Fc 리간드는 정규 Fc 수용체, 신생아 수용체 FcRn, 철, 단백질 A, FcRL1-6, TRIM21 및 DC-SIGN을 포함한다. 가용성 동종이량체 IgG1는 기능성이 되기에 너무 낮은 친화도로(CA Diebolder et. al. Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembled at the Cell Surface. Science Mar 2014; 343(6176):1260-1263) 그리고 높은 해리율로(Gaboriaud et. al. The crystal structure of the globular head of complement protein　C1q　provides a basis for its versatile recognition properties. J. Biol. Chem. 2003 Nov 21;278(47):46974-82) C1q에 자연적으로 결합한다. 그러나, IgG1이 그의 Fab를 통해 항원 표적에 고정될 때, 입체 배좌 변화가 일어나고(M. Oda et. al. Evidence of allosteric conformational changes in the antibody constant region upon antigen binding. Int. Immunol.　(2003)　15　(3):　417-426) 및 C1q에 대한 결합 친화도는 증가된다.
게다가, IgG1이 항원 부위에서 축적되기 때문에, 다중 면역글로불린 Fc는 C1q에 제시되어, 항원 결합 부위에서 더 많은 아비디티 결합이 야기된다. C1q은 6개의 Fc 결합 부위를 갖는 6량체이기 때문에(KB Reid. Chemistry and molecular genetics of C1q. Behring Inst Mitt.　1989 Jul;(84):8-19), 응집된 IgG1의 결합은 높은 아비디티를 가진다(Diebolder, 2014). 따라서, 밀집하게 결합된 IgG1은 동종이량체 면역글로불린의 친화도뿐만 아니라 아비디티로 C1q에 결합하여 상보체 의존적 세포독성을 초래하고, 추가로 얻어진 항체 의존적 세포의 세포독성(Antibody Dependent Cell Cytotoxicity: ADCC) 및 항체 의존적 세포의 식균작용(Antibody Dependent Cell Phagocytosis: ADCP)을 갖는 Fc 수용체와 가교를 위해 이용 가능하다. 6량체 C1q에 대한 결합된 Fc의 클러스터 결합의 얻어진 기능적 반응은 C1qC1rC1s의 형성 및 C4 내지 C4a 및 C4b의 절단에 의한 고전적 상보체 경로의 활성화이다. IgG1의 저 친화도 Fc 수용체 및 C1q. 가용성(즉, 결합된 세포가 아님) 응집물을 포함하는, 매우 저농도에서 자연적으로(Soltis and Hasz. Spontaneous aggregation of native immunoglobulins in hypoalbuminemic serum. J Clin Lab Immunol.　1982 Oct;9(1):13-7) 그리고 풀링된 인간 정맥내 면역글로불린(human Intravenous Immunoglobulin: IVIG)(A. Herrera et. al. Immunoglobulin composition of three commercially available intravenous immunoglobulin preparations. J. All Clin Immunol,　84(1):556-561) 둘 다에서 생기는 IgG1의 가용성 응집물은 그의 리간드에 대해 비결합 다가 IgG1 Fc를 제공함으로써, 아비디티를 갖는 6량체 C1q에 결합한다. IgG1의 가용성 응집물(즉, 결합된 세포가 아님)에 대한 가용성 C1q의 결합은 CDC의 저해를 포함하는 상보체 캐스케이드의 하류의 활성화를 저해할 수 있다.
수천 수만의 혈액 공여자로부터 모은 풀링 인간 IVIG는 천연 IgG1의 가용성 응집물의 천연 효과를 모방하는 IgG1 응집물의 매우 작은 그리고 가변 부분(0.1 내지 5%)을 함유한다. IVIG는 C1q에 결합하고, 상보체-매개 질환, 예컨대 중증 근무력증에서 임상적으로 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, IVIG는 모두 혈액 생성물이 되는 모든 수반되는 위험을 가지며, 재조합적으로 생성되지 않고, 불량하게 제어된 양의 IgG1 응집물을 가지며, 상보체-매개 질환을 치료하기 위한 비활성 분획으로 주로 구성된다. 더욱이, IVIG 처리는 또한 종종 저 친화도 Fc 수용체에 대한 결합에 의한 원치않는 전염증 반응을 야기한다(Andresen et. al. Product equivalence study comparing various human immunoglobulin-G formulations. J Clin Pharmacol 2000;40:722-730 및 Ghielmetti et. al. Gene expression profiling of the effects of intravenous immunoglobulin in human whole blood. Mol Immunol 43 (2006) 939-949). 아비디티 결합 C1q에 의한 상보체 침몰(sink)로서 작용하는 응집된 가용성 IgG1 Fc의 천연 과정을 모방하는 한편, 동시에 저 친화도 Fc 수용체를 포함하는 다른 천연 리간드 이상으로 상보체 성분에 우선적으로 결합함으로써 원치않는 전염증 반응을 회피하는 신규하고, 지속적인, 재조합적으로 생성된 요법에 대한 필요가 있다.
본 발명은 하나 이상의 인간 면역글로불린 Fc 도메인 및 하나 이상의 다량체화 도메인을 포함하는 생물학적으로 활성인 융합 단백질 생체모방 분자에 관한 것이며, 융합 단백질의 상기 Fc 도메인 부분은 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 일 양상에서, 생체모방 분자는 정상 비응집 인간 면역글로불린 Fc에 대해 하나 이상의 상보체 성분이 우선적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 상보체 성분에 대한 우선적인 결합은 정상 비응집 면역글로불린 Fc 또는 대안적으로 정상 응집된 면역글로불린 Fc에 대한 정규 Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 갖는 생체모방의 Fc 도메인에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 융합 단백질 생체모방 분자는 스트라도머 단위를 포함한다. 생물학적으로 활성인 융합 단백질 생체 모방체를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 방법이 제공된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 IgG1 Fc 도메인의 위치 267, 268 및/또는 324 중 적어도 하나에 대응하는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 적어도 하나의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 스트라도머(stradomer) 단위를 제공한다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위는 추가로 적어도 하나의 다량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 267에서 아미노산은 세린(Ser; S)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 267에서 아미노산은 글루탐산(Glu; E)으로 돌연변이된다. 일부 실시형태에서, 위치 268에서 아미노산은 히스티딘(His; H)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 268에서 아미노산은 페닐알라닌(Phe; F)으로 돌연변이된다. 일부 실시형태에서, 위치 324에서 아미노산은 세린으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 324에서 아미노산은 트레오닌(Thr; T)으로 돌연변이된다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위는 위치 267, 268 및/또는 324에서의 점 돌연변이를 포함하고, 추가로 위치 233 및/또는 234 및/또는 235 및/또는 236 및/또는 238 및/또는 265 및/또는 297 및/또는 299 및/또는 328에서 적어도 하나 점 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 위치 297에서 아미노산은 아스파라긴(Asn; N)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 297에서 아미노산은 알라닌(Ala; A)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 299에서 아미노산은 트레오닌(T)으로부터 세린 또는 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 299에서 아미노산은 알라닌(Ala; A)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 238에서 아미노산은 프롤린(Pro; P)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 238에서 아미노산은 아스파르트산(Asp; D)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 233에서 아미노산은 글루탐산(Glu; E)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 233에서 아미노산은 프롤린(Pro; P)으로 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 위치 236에서 아미노산은 글리신(Gly; G)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 236에서 아미노산은 알기닌(Arg; R)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 236에서 아미노산은 결실된다. 일 실시형태에서, 위치 234에서 아미노산은 류신(Leu; L)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 234에서 아미노산은 발린(Val; V) 또는 알라닌(Ala; A)으로 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 위치 235에서 아미노산은 류신(Leu; L)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 235에서 아미노산은 알라닌(Ala; A)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 265에서 아미노산은 아스파르트산(Asp; D)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 265에서 아미노산은 알라닌(Ala; A)으로 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 위치 265에서 아미노산은 트립토판(Trp; W)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 297에서 아미노산은 아스파라긴(Asn; N)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 297에서 아미노산은 알라닌(Ala; A)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 297에서 아미노산은 글루타민(Gln; Q)으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 299에서 아미노산은 트레오닌(Thr; T)으로부터 세린(Ser; S) 또는 시스테인(Cys; C) 이외의 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 299에서 아미노산은 알라닌으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 298에서 아미노산은 프롤린 이외의 임의의 아미노산으로 돌연변이된다. 일 실시형태에서, 위치 328에서 아미노산은 류신(Leu; L)으로부터 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 실시형태에서, 위치 328에서 아미노산은 페닐알라닌(Phe; F)으로 돌연변이된다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 S267E, H268F, N297A 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 234, 235, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 L234V, L235A, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 234, 235, 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 L234V, L235A, S267E, H268F, N297A 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 234, 235, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이, 및 위치 236에서 아미노산의 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, L234A, L235A, S267E, H268F 및 S324T, 및 위치 236에서 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 234, 235, 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, L234A, L235A, S267E, H268F, N297A 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 265, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 D265A, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 238, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 P238D, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 238, 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 P238D, S267E, H268F, N297A 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 236, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 G236R, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 236, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, G236R, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 236, 267, 268, 324 및 328에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T 및 L328F를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 238, 265, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 P238D, D265G, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 P238D, D265W, S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 267, 268, 324 및 328에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 S267E, H268F, S324T 및 L328F를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 234, 235, 267, 268, 297, 324 및 328에서의 점 돌연변이, 및 위치 236에서 아미노산의 결실을 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, L234V, L235A, S267E, H268F, N297A, S324T 및 L328F, 및 위치 236에서 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F 및 S324T를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T 및 위치 297에서 N297A 또는 N297Q 이외의 점 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 299 및 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T 및 위치 299에서 T299S 및 T299C 이외의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T 및 T299A를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 324 및 267에서의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T, 및 위치 267에서의 점 돌연변이 S267E 이외의 점 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 324, 267 및 297에서의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T, 위치 267에서의 점 돌연변이 S267E 이외의 점 돌연변이, 및 위치 297에서의 점 돌연변이 N297A 및 N297Q 이외의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 324, 267 및 297에서 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T, 위치 267에서의 점 돌연변이 S267E 이외의 점 돌연변이, 위치 297에서의 점 돌연변이 N297A 및 N297Q 이외의 점 돌연변이, 및 위치 299에서의 점 돌연변이 T299S 및 T299C 이외의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 위치 299에서 돌연변이는 T299A이다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 324, 267 및 236에서의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T, 위치 267에서 S267E 이외의 점 돌연변이, 및 위치 236에서 G236R 이외의 점 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 324, 267, 236 및 297에서의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T, 위치 267에서 S267E 이외의 점 돌연변이, 위치 236에서 G236R 이외의 점 돌연변이, 및 위치 297에서 N297A 및 N297Q 이외의 점 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 233, 268, 324, 267, 236 및 299에서의 점 돌연변이를 포함하되, 위치 299에서의 점 돌연변이는 T299S 및 T299C 이외의 점 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 점 돌연변이 E233P, H268F, S324T, 위치 267에서 S267E 이외의 점 돌연변이, 위치 236에서 G236R 및 T299A 이외의 점 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 267, 268 및/또는 324 중 적어도 하나에서의 점 돌연변이를 포함하고, 추가로 위치 233, 235, 236, 267, 268, 297, 299, 및/또는 324 중 셋 이상에서의 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스트라도머 단위의 Fc 도메인은 위치 267, 268 및/또는 324 중 적어도 하나에서의 점 돌연변이를 포함하고, 추가로 위치 233, L235H 이외의 235, 236R 이외의 236, S267E 이외의 267, 268, N297A 이외의 297, 또는 대안적으로 299, 및/또는 324 중 셋 이상에서의 점 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에서, 스트라도머는 다량체화 도메인을 포함하되, 다량체화 도메인은 IgG2 힌지, 아이소류신 지퍼 및 GPP 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 스트라도머 단위를 다량체화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다량체화 도메인은 상기 스트라도머 단위의 다량체를 생성한다. 추가 실시형태에서, 상기 스트라도머 단위의 다량체는 고차 다량체이다.
일부 실시형태에서, 스트라도머는 아미노로부터 카복시 말단까지, 리더 서열; IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인; 및 IgG2 힌지를 포함하되, 스트라도머는 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 리더 서열은 발현 시 절단된다. 따라서, 다른 실시형태에서, 아미노로부터 카복시 말단까지 IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인; 및 IgG2 힌지를 포함하는 스트라도머가 제공되되, 스트라도머는 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 스트라도머는 서열 번호 10 내지 16, 18 내지 63 및 65 내지 77, 또는 이들의 기능성 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머는 아미노로부터 카복시 말단까지, 리더 서열; IgG2 힌지; 및 IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인을 포함하되, 스트라도머는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 리더 서열은 발현 시 절단된다. 따라서, 다른 실시형태에서, 아미노로부터 카복시 말단까지, IgG2 힌지; 및 IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 스트라도머가 제공되되, 스트라도머는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 스트라도머는 서열번호 17 및 서열번호 64로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이들의 기능성 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스트라도머는 아미노로부터 카복시 말단까지, 리더 서열; IgG2 힌지; 및 IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인을 포함하되, 스트라도머는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 추가 실시형태에서, 리더 서열 발현 시 절단된다. 따라서, 다른 실시형태에서, 아미노로부터 카복시 말단까지, IgG2 힌지; 및 IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 스트라도머가 제공되되, 스트라도머는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에서, 스트라도머 단위는 하나 이상의 아미노산 링커 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시형태에서, 링커는 절단 가능하다. 추가 실시형태에서, 링커는 프로테아제 민감성이다. 일 실시형태에서, 링커는 세포 내에서 우세한 프로테아제에 의해 절단된다. 추가 실시형태에서, 링커는 골지체 및 소포체 내에 우세하게 존재하는 프로테아제에 의해 절단된다. 일 실시형태에서, 링커는 퓨린에 의해 절단된다. 다른 실시형태에서, 링커는 우세하게는 기관 특이적 프로테아제, 예를 들어 뇌-관련 프로테아제 뉴로프신인 프로테아제에 의해 절단된다. 다른 실시형태에서, 링커는 우세하게는 종양 특이적 프로테아제, 예를 들어 메탈로프로테이나제 9 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자인 프로테아제에 의해 절단된다.
일부 실시형태에서, 스트라도머 단위는 FcγRI, FcγRII(FcγRIIa 및/또는 FcγRIIb을 포함), 및/또는 FcγRIII에 비해 상보체에 대한 우선적인 결합을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 스트라도머 단위는 저 친화도 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 스트라도머 단위는 위치 267, 268 및/또는 324 중 하나 이상에서의 점 돌연변이를 포함하지 않는 동일한 구조의 스트라도머에 비해 FcγRI, FcγRII(FcγRIIa 및/또는 FcγRIIb를 포함), 및/또는 FcγRIII에 대해 감소된 결합을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 스트라도머 단위는 297, 298 또는 299에서 돌연변이를 포함하고, C1q에 대한 결합을 보유하며, CDC를 저해하고, FcγRI에 대한 또는 FcγRIIa, FcγRIIb 및/또는 FcγRIII을 포함하는 저 친화도 Fcγ 수용체에 대한 결합을 보유한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같이 2개 이상의 스트라도머 단위를 포함하는 클러스터 스트라도머를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 위치 267, 268 및/또는 324에서의 점 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 2 이상의 스트라도머 단위를 포함하는 클러스터 스트라도머를 제공한다. 추가 실시형태에서, 2 이상의 스트라도머 단위는 위치 233 및/또는 234 및/또는 235 및/또는 236 및/또는 238 및/또는 265 및/또는 297 및/또는 299 및/또는 328에서 적어도 하나 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 2 이상의 스트라도머 단위는 위치 236에서 아미노산의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 상보체-매개 질환, 자가면역 질환, 염증 질환, 알레르기, B-세포 매개 질환, 항체-매개 질환, 신장 장애 및 혈액 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 질환 및 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 항체-매개 질환은 굿페스쳐 질환(Goodpasture's disease); 고형장기 이식 거부; 시신경척수염; 신경근긴장증; 변연계 뇌염; 모반 섬유성 무도병 증후군; 중증 근무력증; 람버트 이튼 근무력 증후군; 자율신경병증; 알츠하이머병; 죽상동맥경화증; 파킨슨병; 강직인간 증후군 또는 병적놀람증; 재발성 자연 유산; 휴즈 증후군; 전신 홍반성 낭창; 자가면역 소뇌성 운동 실조; 피부경화증, 쇼그렌 증후군을 포함하는 결합조직 질환; 다발성 근염; 류마티스 관절염; 결절성 다발동맥염; CREST 증후군; 심내막염; 하시모도 갑상선염; 혼합 결합 조직병; 채널병증; 연쇄상구균 감염과 관련된 소아과 자가면역 신경정신병적 장애 (PANDAS); N-메틸-D-아스파르테이트 수용체, 특히 NR1, 컨택틴(contactin)-결합 단백질 2, AMPAR, GluR1/GluR2, 글루탐산 데카복실라제, GlyR 알파 1a, 아세틸콜린 수용체, VGCC P/Q-형, VGKC, MuSK, GABA(B)R에 대한 항체와 관련된 임상적 병태; 아쿠아포린-4; 및 천포창으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 관절염이다.
일부 실시형태에서, 상보체-매개 질환은 중증 근무력증, 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome: HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome: aHUS), 발작성 야간혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH), 시신경 척수염, 동종이식편의 항체-매개 거부반응, 막성 신증을 포함하는 신장병증 질환 및 막성 증식성 사구체 신염(membranoproliferative glomerulonephritis: MPGN) 및 낭창성 신염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 혈액 장애는 헤모글로빈 SS, 헤모글로빈 SC, 헤모글로빈 Sβ0 지중해 빈혈, 헤모글로빈 Sβ+ 지중해 빈혈, 헤모글로빈 SD 및 헤모글로빈 SE를 포함하는 빈혈, 예컨대 겸상 적혈구병이다. 일부 실시형태에서, 염증 장애는 연령-관련 황반 변성, 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증 또는 파킨슨병이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 이것이 필요한 대상체에게 투여된다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 정맥내, 피하, 경구, 복강내, 설하, 협측, 경피, 피하 이식 또는 근육내로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 자가면역-관련 시력 상실 또는 청력 상실, 예컨대 소음성 또는 연령-관련 청력 상실을 치료하거나 또는 예방하는 데 유용한 스트라도머를 제공한다. 다른 실시형태에서, 제공된 스트라도머는 장치 이식, 예컨대 달팽이관 또는 다른 청각 장치의 이식과 관련된 염증 또는 자가면역 반응을 감소시키는 데 유용하다.
본 명세서에 기재된 화합물을 조절하는 면역에 대한 합리적 분자 설계에 대한 접근은 상보체에 대해 유지되거나, 우선적이거나 또는 향상된 결합을 나타내는 면역학적으로 활성인 생물 모방체(들)의 재조합 및/또는 생물학적 생성을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 Fc 수용체에 대한 결합에 비해 상보체에 대한 결합의 비를 증가시킴으로써 상보체 결합을 향상시킨다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 하나 또는 몇몇의 FcγR에 대해 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 FcRn에 대해 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 상보체에 결합하고, 특정 FcγR뿐만 아니라 FcRn에 대해 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 본 명세서에 제공된 조성물은, 예를 들어, 상보체-매개 질환 및 상보체-관련 질환을 치료하는 데 효용을 가진다. 본 명세서에 제공된 조성물은 또한 다량체화를 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이전에 기재된 생체 모방체에 비해 유지된 또는 향상된 다량체화를 나타낸다.
WO 2008/151088은 자가면역 질환 및 다른 염증 병태를 포함하는 병리학적 병태의 치료를 위한 제한 부위 및 스트라도머의 개개 성분 사이의 친화도 태그를 포함하는 짧은 서열을 포함하는 hIVIG의 규칙적으로 다량체화된 면역글로불린 Fc 생체 모방체(스트라도머로서 알려진 생물학적으로 활성인 규모의 다량체)를 생성하기 위한 연결된 면역글로불린 Fc 도메인을 개시한다. WO 2008/151088 및 미국 특허 제8,680,237호를 참조하며, 이들 각각의 내용은 그들의 전문이 참고로 포함된다. WO 2012/016073은 스트라도머를 개시하되, 개개 성분은 제한 부위 또는 친화도 태그에 의해 분리되기보다는 직접적으로 연결된다. WO 2012/016073 및 미국 특허 출원 공개 제2013/0156765호를 참조하며, 각각의 이들의 내용은 그들의 전문이 참고로 포함된다. WO 2012/016073은 또한 구체적으로는 IgG1Fc 도메인을 그의 C-말단에 직접 연결된 IgG2 힌지 다량체화 도메인과 함께 포함하는 다량체화 스트라도머(GL-2045)를 개시하는데, 이는 N-말단의 연결 작제물(G019, WO2008/151088에 기재됨)에 비해 향상된 다량체화 및 상보체 결합을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 스트라도머 단위는 이전에 기재된 분자에 비해 정규 Fc 감마 수용체 결합에 대해 향상된 상보체 결합 및/또는 선택적 또는 증가된 상보체 결합에서 GL-2045 결과의 Fc 영역에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.
G045c 및 G019는 이전에 기재되었다(WO 2012/016073 참조). G045c의 구조는 IgG1 힌지 - IgG1CH2 IgG1 CH3 - IgG2 힌지이고, G045c는 서열번호 7 및 8로서 제공된다.
용어 "G045c", "GL-2045"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.　 G045c는 하기 구조를 가진다:　 IgG1 힌지 - IgG1CH2 IgG1 CH3 - IgG2 힌지.　 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "G045c 배경 상의 스트라도머" 등은 IgG1 힌지 - IgG1CH2 IgG1 CH3 - IgG2 힌지의 구조를 갖는 스트라도머(서열번호 7 또는 8)를 지칭한다. G019의 구조는 IgG2 힌지 - IgG1 힌지 - IgG1 CH2 - IgG1 CH3이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "G019 배경 상의 스트라도머" 등은 IgG2 힌지 - IgG1 힌지 - IgG1 CH2 - IgG1 CH3의 구조를 갖는 스트라도머를 지칭한다(서열번호 9). 당업자는 GL-2045와 G019 둘 다의 아미노산 서열이 성숙 단백질의 발현 시 절단되는 아미노 말단의 리더 서열(서열번호 1)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
전체 항체 분자의 Fc 영역 내 돌연변이는 항체 특징 및 기능에 대해 예측 가능한 결과를 가진다. 예를 들어, 문헌[Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 276; 6591 (2001)] 참조. 특히, 문헌[Moore et al.]은 단클론성 항체의 Fc 영역 내 삼중 돌연변이 S267E, H268F, 및/또는 S324T는 정규 Fcγ 수용체 또는 FcRn 결합에 대한 단클론성 항체의 상보체 결합의 비를 신뢰 가능하게 증가시킨다는 것이 입증되었다(Mabs 2:2; 18 (2010)). 그러나, 본 명세서에서 본 발명의 발명자들은 삼중 돌연변이 S267E / H268F / S324T를 포함하는 다량체화 스트라도머의 Fc 영역에서 돌연변이 S267E, H268F, 및/또는 S324T가 실제로 그리고 상당히 놀랍게도 C1q에 대한 결합의 결여와 관련되며, 따라서 정규 Fcγ 수용체 결합에 대한 상보체 결합의 비를 증가시키지 않는 화합물을 개시한다(예를 들어, G999, G1024, G1030, G1031, G1040, G1044 및 G1048).
C1q 결합(예컨대, 문헌[Moore et. al.]에 의해 기재된 S267E, H268F, 및/또는 S324T)을 증가시키고, 이에 의해 CDC를 증가시키는 단클론성 항체에 대한 특정 돌연변이는 잘 확립되어 있다(Moore et. al. 2010). 본 명세서에서 본 발명자들은 스트라도머의 다량체화와 관련하여 이들 돌연변이를 혼입함으로써 CDC에서 증가와 관련이 없을 뿐만 아니라 고유 CDC와의 관련이 전혀 없는 수많은 화합물을 기재한다. 게다가, 그리고 충격적으로 이들 돌연변이가 mAb에 대해 증가된 CDC와 관련된다는 것을 고려하면, 본 발명자들은 본 명세서에서 이들 동일한 돌연변이를 혼입하는 본 발명의 화합물이 농도-의존적 방식으로 실제로 CDC를 저해하지 않는다는 것을 입증한다(예를 들어, G994, G998, 및 다수의 기타, 도 61 내지 도 63).
추가로, 항체와 관련하여, Fc 도메인의 위치 297에서 도입된 점 돌연변이는 고친화도 및 저 친화도 정규 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 것으로 보고되었다(Robert L. Shields, et al. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604). 유사하게, 단클론성 항체에 대해, Fc 도메인의 위치 299에서 도입된 점 돌연변이는 FcγR에 대한 결합에 가변적으로 영향을 미치고(예를 들어, FcγRIIIa에 대한 결합을 감소시키고, FcγRIIa 결합을 유지하는), 추가로 C1q에 대한 결합을 저해하는 것으로 나타났다(Sazinsky et al. Aglycosylated immunoglobulin G1　variants productively engage activating Fc receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 23; 105(51): 20167-20172; PCT/US2008/085757). 특정 다량체화 스트라도머와 관련하여, 위치 297에서 또는 Fc 도메인의 점 돌연변이는 저 친화도 정규 Fcγ 수용체에 대한 결합의 감소를 초래하였다. 그러나, 특정 스트라도머에서, 위치 299의 돌연변이는 모든 정규 FcγR에 대한 Fc 결합의 유지 또는 향상보다는 FcγR에 대한 예상되는 감소된 결합을 초래하였다.
추가로, 위치 236 및 328에서의 이중 돌연변이(Tai et al., Blood 119; 2074 (2012)) 또는 위치 233에서의 돌연변이(Shields, et al. J. Biol. Chem., 276(9):6591 (2001)는 정규 FcγR에 대한 항체 또는 면역글로불린 Fc 결합을 감소시킨 것으로 나타났다. 위치 236 및 328에서 이중 돌연변이는 추가로 FcγRI에 대한 항체 또는 면역글로불린을 제거하는 것으로 나타났지만(Tai et al. 2012); 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 위치 267 및/또는 268 및/또는 324에서 스트라도머 및 상보체-향상 돌연변이를 다량체화하는 것과 관련하여, FcγRI 결합이 특정 다량체화 스트라도머에서 예상치 못하게 유지되었다는 것을 발견하였다. 추가로, 위치 233 및 236에서 이중 돌연변이(E233P 및 G236R)는 모든 정규 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 것으로 예상되지만; 그러나, 본 발명자들은 이들 두 위치에서 돌연변이를 포함하는 돌연변이의 몇몇 조합이 비돌연변이 대응 스트라도머에 비해 예상치 못하게 유지 또는 증가된 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합을 초래하였다는 것을 발견하였다. 추가로, 위치 328에서 돌연변이(L328F)는 FcγRIIb 단독에 대한 결합을 증가시키는 것으로 예상되었지만(Chu et al., Molecular Immunology 45; 3926 (2008)); 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 적어도 위치 267, 268 및 324에서 추가적인 돌연변이를 갖는 스트라도머와 관련하여 위치 328에서 돌연변이를 포함하는 스트라도머가 예측 가능하지 않은 방법으로 하나 이상의 다른 정규 FcγR에 대한 증가된 결합을 초래하였다는 것을 발견하였다. 추가로, 위치 238에서 돌연변이는 FcγRIIb에 대한 결합을 증가시키고, FcγRI 및 FcγRIIa에 대한 결합을 감소시키는 것으로 예상된 반면(Mimoto et al., Protein Engineering, Design, and Selection p. 1-10 (2013)), 위치 265에서 돌연변이는 모든 정규 FcγR 결합을 감소시키는 것으로 예상된다. 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 위치 267 및/또는 268 및/또는 324에서 스트라도머 및 상보체-향상 돌연변이를 다량체화하는 것과 관련하여, 위치 238 및 265에서 돌연변이가 특정 다량체화 스트라도머에서 FcγRIIa에 대한 강한 결합을 초래하였다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 항체 기능의 변형을 교시하는 문헌에서의 돌연변이가, 예를 들어 단클론성 항체에서 정규 결합을 감소 또는 제거하기 위해 또는 C1q 결합을 변경시키기 위해, 다량체화 스트라도머와 관련하여 동일한 효과를 갖지 않는다는 것을 발견하였다.
게다가, 스트라도머와 관련해서조차, 돌연변이의 효과는 유사하게 예측 가능하지 않다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 두 스트라도머가 하나 이상의 특정 위치에서 하나 이상의 돌연변이 이외에 서로 동일한 경우에, 심지어 돌연변이가 구조적으로 유사한 아미노산에 대해서인 경우에, 두 스트라도머는 대단히 상이한 기능적 특징을 가질 수 있다. 추가로, WO 2012/016073은 놀랍게도 GL-2045 및 G019가 정확히 동일한 성분을 가진다 것과, 사실 IgG1 Fc 도메인에 대해 IgG2 힌지 영역의 위치 이외의 정확한 동일한 분자라는 사실에도 불구하고, 이들 분자가 상보체 결합에 대해 대단히 상이한 활성을 나타낸다는 것을 개시한다. 분자는 둘 다 다량체화하고 Fc 수용체에 결합한다. 엄격하게는, GL-2045는 모든 Fc 수용체에 대한 강한 결합뿐만 아니라 상보체 결합 및 상보체-의존적 세포독성(CDC) 저해를 나타내는 반면, G019는 상보체에 결합하지 않거나 또는 CDC를 저해한다. 유사하게, 정확한 동일한 돌연변이가 GL-2045 및 G019에 대해 이루어질 때, 결과는 완전히 상이할 수 있으며, 사실 반대일 수 있다. 예로서, 화합물 996과 999는 둘 다 문헌[ Moore, et al.]에 개시된 C1q 결합을 증가시키는 것으로 예상되는 삼중 돌연변이(S267E/H268F/S324T)뿐만 아니라 추가적인 돌연변이인 G236R을 보유한다. 그러나, GL-2045와 관련하여, 이 돌연변이는 정규 Fcγ 수용체(G996) 이상으로 C1q 결합을 우선적으로 유지하는 반면, G019에서, C1q에 대한 결합은 없다(G999). 기능의 이런 이분법은 달리 잘 특성규명된 돌연변이가 다량체화 스트라도머와 관련하여 이루어진 돌연변이의 예측 불가능을 강조하는 것이다.
게다가, 단클론성 항체가 돌연변이를 도입함으로써 상향- 또는 하향 조절될 수 있는 그들의 FcγR 및 상보체 표적에 대해 친화도를 갖는 반면, 스트라도머는 다가 Fc 내지 FcγR 및 상보체를 제공하며, 따라서 그들의 표적에 결합하는 아비디티에 더 심하게 의존한다. 대조적으로, 단클론성 항체는 그들의 Fc 도메인을 통해 아미드 결합을 갖지 않는다. 이들 특징은 스트라도머 및 단클론성 항체가 구조에서 뿐만 아니라 기능 및 효용에서 근본적으로 상이하다는 사실을 강조한다.
따라서, 다량체화 스트라도머의 활성에 대한 분자의 임의의 영역 내에서 임의의 돌연변이 또는 돌연변이 세트의 효과는 단클론성 항체에 관하 문헌에 기반하여 예측될 수 없다. 따라서, 항체의 특정 효과를 갖는 것으로 당업계에 알려진 아미노산 돌연변이, 예컨대 항원 특이성을 갖는 항체와 관련하여 특정 FcγR에 대한 결합을 증가 또는 감소시키는 돌연변이의 효과는 스트라도머에 대해 예측될 수 없었다. 유사하게, 점 돌연변이 L234A 및 L235A는 C1q에 대한 Fc 결합을 감소시키는 것으로 기재되었다(WO 2015/132364; 문헌[Arduin et al, Molecular Immunology, 65(2):456-463 (2015); Boyle et al, Immunity, 42(3):580-590 (2015)] 참조). 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 생체 모방체 내로 이들 돌연변이의 도입은 C1q 결합의 유지 또는 향상을 초래한다는 것을 발견하였다(예를 들어, G1033 및 G1032).
본 발명자들은 면역학적으로 활성인 생체 모방체를 확인하기 위해 제시되되, Fc 수용체 결합에 대한 상보체 결합의 비는, 그들의 모 생체 모방체(예를 들어, GL-2045 또는 G019)에 비해 감소된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 C1q에 대해 유지 또는 향상된 결합을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 C1q, C1r, C1s, C4, C4a, C3, C3a, C4b2a3b, C3b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, 및/또는 C9을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 상보체 시스템의 성분에 결합하며, 이에 의해 "상보체 침몰"로서 작용할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "상보체 침몰"은 상보체 캐스케이드의 C1q 또는 다른 상류 성분에 결합하고, 상보체 시스템의 하류의 활성화를 막는 현상을 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 C5b-9 막 공격 복합체 상류의 상보체 시스템의 성분에 결합한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 C5a 상류의 상보체 시스템의 성분에 결합한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 감소된 C5a 및 막 공격 복합체를 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 감소된 FcγRI 및/또는 FcγRIIa 및/또는 FcγRIIb 및/또는 FcγRIII 결합을 나타내고, 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타낸단. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 감소된 FcRn 결합 및 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타낸다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 유지된 또는 향상된 상보체 결합 및 감소된 정규 FcγR 결합뿐만 아니라 감소된 FcRn 결합을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 하나 이상의 정규 FcγR에 대한 유지된 또는 향상된 상보체 결합 및 선택적 결합(예를 들어, FcγRI에 대한 결합(FcγRIIb는 아님), 또는 FcγRIIb에 대한 결합(그러나 FcγRI은 아님)), 또는 FcRn에 대한 향상된 상보체 결합 및 선택적 결합을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1에 비해 상보체 경로 성분의 향상된 결합의 이점을 가진다. 고유 면역글로불린 IgG1에 비해 상보체 경로 성분의 향상된 결합 정도는 사실 특정 상황하에서 인간에서 생길 수 있는 응집된 IgG1에 대한 상보체 경로 성분의 결합보다 매우 의미있고, 접근성이거나 또는 뛰어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 Fc 수용체 및 기타 리간드의 결합이 감소된 고유 면역글로불린 IgG1에 비해 상보체 경로 성분의 유지된 결합의 이점을 가진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1에 의해 관찰된 정규 Fc 수용체 결합, 정맥내 면역글로불린(IVIG), 면역글로불린 응집물이 풍부한 인간 혈장, 또는 점 돌연변이가 아닌 모 생체모방 조성물에 비해 우선적인 상보체 결합의 이점을 가진다. 이러한 우선적인 결합은 제한 없이 향상된 결합, 감소된 해리, 아비디티의 증거 또는 저농도에서 유사한 결합을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1, 정맥내 면역글로불린(IVIG), 면역글로불린 응집물이 농축된 인간 혈장에 의해 관찰된 정규 Fc 수용체 결합에 비해, 또는 점 돌연변이가 아닌 모 생체모방 조성물에 비해 향상된 상보체 결합의 이점을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 상보체 의존적 세포독성(Complement Dependent Cytotoxicity: CDC)을 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 FcγRI 및/또는 FcγRIIa 및/또는 FcγRIIb 및/또는 FcγRIII에 대한 감소된 결합 또는 기능적으로 부재인 결합으로 CDC를 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 상보체 성분(들) C1q 및/또는 C4 및/또는 C4a 및/또는 C3 및/또는 C3a 및/또는 C5 및/또는 C5a에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 C3b에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 상보체 시스템의 활성화를 방지하거나 감소시키고, 하류의 상보체-매개 기능, 예컨대 세포 용해, 염증 또는 혈전증을 방지하거나 또는 감소시키는 상보체 분자, 예를 들어, C1q, C3 또는 C3b에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 C4a, C3a 및/또는 C5a의 증가된 수준과 관련되고, 이들 증가된 수준은 항-염증 또는 항-혈전증 임상 프로파일과 관련된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 무손상 면역글로불린 및/또는 앞서 기재한 상보체 결합 조성물에 비해 향상된 다량체화의 추가적인 이점을 가진다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 모든 또는 특정 정규 FcγR에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음의 추가적인 이점을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 무손상 면역글로불린과 동일 또는 향상된 상보체 결합, 향상된 다량체화뿐만 아니라 무손상 면역글로불린 또는 비돌연변이 모 화합물에 비해 하나 이상의 정규 FcγR에 대한 감소된 결합의 이점을 가진다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 향상된 상보체 결합, 향상된 다량체화뿐만 아니라 FcγRIIIa에 대한 감소된 결합의 이점을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIII에 대한 결합을 유지한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 유지하지만, 임의의 의미있는 정도로 임의의 다른 정규 저 친화도 FcγR에 대한 결합은 유지하지 않는다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스트라도머 G1033). 일 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, FcRn 및 FcγRI에 대한 결합을 유지하지만, 임의의 의미있는 정도로 저 친화도 정규 FcγR을 임의로 활성화하지 않는다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스트라도머 G994 및 G998). 일 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, FcγRI 및/또는 FcγRIIb에 대한 결합을 유지하지만, 임의의 다른 정규 FcγR(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스트라도머 G994)에 대한 결합은 유지하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, FcRn 및 FcγRI에 대한 결합을 유지하지만, 저 친화도 활성화 수용체 FcγRIIa 및/또는 FcγRIIIa(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스트라도머 G997, G1003 및 G1022)에 대한 감소된 결합을 가진다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, FcγRIIb에 대한 결합은 유지되지만, FcγRI, FcγRIIa 또는 FcγRIIIa를 포함하는 다른 정규 FcγR(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스트라도머 G996 및 G1003)에 대한 결합은 감소되었다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체 및 조성물은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내고, FcγRIIb에 대한 결합을 유지하지만, 임의의 다른 정규 저 친화도 FcγR(예를 들어, G994 및 G998)에 대한 결합은 유지하지 않는다. 따라서, 일 양상에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 FcγR에 대해 상대적으로 감소된 결합을 갖거나 또는 결합이 없는 유지된 또는 향상된 상보체 결합의 이점을 갖거나, 또는 각각의 경우에 천연 비응집 면역글로불린 IgG1에 비해 그리고/또는 모 생체 모방체에 비해 선택된 활성화 또는 저해 FcγR에 결합하는 이점을 가진다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1 또는 모 생체 모방체에 비해 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1 또는 모 생체모방 또는 조성물에 비해 변형된 효과기 기능, 예컨대 상보체 의존적 세포독성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1, IVIG, 또는 모 생체모방 또는 조성물에 비해 상보체 분자에 대해 유지된 또는 향상된 결합을 나타낸다. 추가 실시형태에서, 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1, IVIG, 또는 모 생체모방 또는 조성물에 비해 유지된 또는 향상된 C1q 결합을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 하류의 상보체-매개 기능, 예컨대 상보체 의존적 세포독성 또는 세포 용해를 감소시키거나 또는 막기 위해 C1q, C4, C4a, C3, C3a, C3b, C5 또는 C5a에 결합할 수 있는 생체 모방체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 고유 면역글로불린 IgG1, IVIG, 또는 모 생체 모방체에 비해 변경된 정규 Fc 결합으로 유지된 또는 향상된 C1q 결합뿐만 아니라 동등한 또는 향상된 CDC를 나타내는 생체 모방체를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1 또는 모 생체 모방체에 비해 하나 이상의 정규 Fc 수용체에 대해 감소된 결합과 함께 유지된 또는 향상된 상보체 결합 및 유사한 FcRn을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1 또는 모 생체 모방체에 비해 유지된 또는 향상된 상보체 결합 및 더 긴 반감기를 나타낸다. 일 실시형태에서, 이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명의 생체 모방체는 고유 면역글로불린 IgG1에 비해 더 긴 기능성 반감기 또는 FcRn에 의한 내재화에 의해 가능하게 되는 모 생체 모방체를 갖는데, 이는 이후의 방출 및 생체 모방체의 지연 또는 연장된 생물학적 효과를 허용한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1 또는 모 생체 모방체에 비해 유지된 또는 향상된 상보체 결합 및 더 짧은 반감기를 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체 및 조성물은 고유 면역글로불린 IgG1 또는 모 생체 모방체에 비해 유지된 또는 향상된 상보체의 클리어런스를 나타낸다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 고유 면역글로불린 IgG1, IVIG, 또는 모 생체 모방체에 비해 감소된 반감기를 갖고, 막공격 복합체의 형성 및 하류의 상보체-매개 기능, 예컨대 세포 용해를 감소시키거나 또는 방지하기 위해 C1q 또는 다른 상보체 성분에 추가로 결합할 수 있는 생체 모방체를 제공한다.
콜라겐-유사 줄기에 의해 중심 자루(central stalk)에 연결된, C1q 상의 6개의 헤드가 있으며(Reid K. B. M. & Porter, R. R.　Biochem. J.　155, 19-23 (1976)), 단리된 헤드는 항체의 Fc 부분에 대해 100μM의 친화도로 다소 약하게 결합한다(Hughes-Jones, N. C. & Gardner, B.　Molec Immun.　16, 697-701 (1979)). 항원 표면 상에서 다중 에피토프에 대한 항체의 결합은 항체를 응집시킨다. 이 응집은 C1q 분자의 몇몇 C1q 헤드의 결합을 용이하게 하여, 약 10nM의 향상된 친화도를 야기한다(Burton, D. R.　Molec. Immun.　22, 161-206 (1985)). 대조적으로, 본 발명의 상보체-우선적 결합 다량체화 스트라도머 및 일반화된 다량체화 스트라도머는 C1q에 다가 Fc를 제시함으로써, 하나 이상의 정규 Fc 수용체 이상으로 상보체 성분과 우선적으로 결합하는 Fc와 함께 다량체화된 스트라도머 내에서 스트라도머 단위에 대해 상보체 성분에 탐욕적으로(avidly) 결합한다. 이런 방식으로, 본 발명의 상보체-우선적 다량체화 스트라도머 및 일반화된 스트라도머는, 이들 스트라도머가 Fab가 없고(따라서 Fc의 FD 부분이 없음), 항체가 응집될 때와 같이 항원 표면 상에서 다중 에피토프에 결합할 수 없다고 해도, 상보체 침몰로서 거동하는 C1q에 대해 유지된 또는 향상된 결합 친화도 및/또는 아비디티를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 상보체-우선적 다량체화 스트라도머는 6량체 C1q에 대해 4, 5, 6, 7, 8가지 이상의 기능성 Fc를 제시하여, CDC의 느린 해리 속도 및 기능성 저해를 갖는 아비드 결합을 야기한다. 유사하게, 본 발명의 상보체-우선적 다량체화 스트라도머 및 일반화된 스트라도머는 상보체 침몰로서 거동하는 C4, C4a, C3, C3a, C3b, C5 또는 C5a에 대한 유지된 또는 향상된 결합 친화도 및/또는 아비디티를 나타낼 수 있다. 이런 방식으로, IVIG 내 응집물의 Fc 부분과 또는 응집된 항체와 유사한 본 발명의 생체 모방체는 상보체 성분 C1q, C4, C4a, C3, C3a, C3b, C5 또는 C5a에 결합할 수 있는 반면, 무손상 단리된 면역글로불린의 Fc 부분은 이들 상보체 성분에 대해 낮은 결합 친화도 및 낮은 아비디티를 가진다.
단클론성 항체의 Fc 도메인의 위치 267, 268 및/또는 324에서 특정 단일, 이중 또는 삼중 돌연변이, 및 특히 삼중 돌연변이 S267E / H268F / S324T는 정규 Fcγ 수용체 또는 FcRn 결합에 비해 단클론성 항체의 상보체 결합의 비를 증가시키는 것으로보고되었고(Moore et al., MAbs 2; 181 (2010)), 증가된 상보체 결합은 표적 항원에 대한 항체 Fab의 선행 결합 다음에 C1q 결합에 의존적인 것으로 이전에 생각되었다. 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 다량체화 스트라도머와 관련하여 삼중 돌연변이 S267E / H268F / S324T를 포함하는 위치 S267E, H268F, 및/또는 S324T에서의 돌연변이는 상보체 결합을 예측 가능하게 감소시키거나, 상보체 결합을 증가시키거나, 또는 선택적으로 상보체 결합을 유지시킨 것으로 발견되었는데, 이는 단클론성 항체 내 이들 돌연변이의 기재된 효과가 다량체화 스트라도머와 관련하여 효과를 전혀 예측하지 않는다는 것을 입증한다. 더 나아가, 증가된 상보체 결합이 놀랍게도 본 발명의 다량체화 스트라도머에서 입증된 경우에, 다량체화 스트라도머에서 Fab의 부재에도 불구하고 이것이 일어났다. 일 실시형태에서, 본 발명의 상보체-우선적 다량체화 스트라도머는 Fab 항원 표적화와 독립적으로 C1q에 결합한다. 일 실시형태에서, 단클론성 항체와 대조적으로, 스트라도머가 세포 결합되는 일 없이 본 발명의 상보체-우선적 다량체화 스트라도머는 C1q에 결합한다. 따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 위치 S267E, H268F, 및/또는 S324T에서의 점 돌연변이를 포함하는 다량체화 스트라도머를 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 C1q에 잘 결합하고, CDC(예컨대 1102)를 저해하는 위치 S267E, H268F, 및/또는 S324T에서의 점 돌연변이를 포함하는 다량체화 스트라도머를 제공한다. 그러나, 대조적으로, 본 개시내용은 또한 C1q에 잘 결합하지 않거나 또는 CDC를 잘 저해하는 위치 S267E, H268F, 및/또는 S324T에서의 점 돌연변이(예컨대, G1106. G999, G1024, G1030, G1031, G1040, G1044 및 G1048)를 포함하는 다량체화 스트라도머를 제공한다. 따라서, 단클론성 항체에서 C1q에 대한 결합을 증가시키는 점 돌연변이 S267E, H268F, 및/또는 S324T는 다량체화 스트라도머와 관련하여, 특히 추가적인 돌연변이와 관련하여 예측 불가능한 효과를 가진다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 위치 S267E, H268F 및 S324T에서의 점 돌연변이뿐만 아니라 위치 233, 234, 235, 236, 238, 265, 297, 299, 328 중 하나 이상에서의 점 돌연변이, 및/또는 위치 236에서 아미노산의 결실을 포함하는 다량체화 스트라도머를 추가로 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 유지된 또는 향상된 상보체 결합을 나타내는 생체 모방체를 제공하되, 생체 모방체는 점 돌연변이 위치 267 및/또는 268 및/또는 324에서의 점 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 다음의 점 돌연변이: S267E 및/또는 H268F 및/또는 S324T 중 하나 이상을 포함한다. 추가 실시형태에서, Fc 도메인은 다음의 점 돌연변이 S267E, H268F 및 S324T를 포함한다.
일 실시형태에서, 상보체-결합 생체모방은 Fc 도메인을 포함하고, 상기 Fc 도메인은 점 돌연변이 위치 267에서 및/또는 268 및/또는 324를 포함하되, Fc 도메인은 위치 297, 298, 및/또는 299에서의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 위치 297, 298 및/또는 299에서 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인은 본 명세서에서 "비글리코실화된 돌연변이체" 또는 "비글리코실화 돌연변이체"로서 지칭되는데, 이들 위치에서 돌연변이가 IgG Fc의 정상 글리코실화 패턴을 변경시키기 때문이다. 단클론성 항체와 관련하여, 이들 돌연변이가 처음에 특성규명된 경우, 비글리코실화된 돌연변이체는 변경된 글리코실화 패턴의 결과로서 정규 FcγR에 대한 정상 면역글로불린 Fc의 결합을 감소 또는 제거한다. 그러나, 다량체화 스트라도머와 관련하여, 이들 돌연변이는 예측 가능하지 않다. 특정 다량체화 스트라도머에서, FcγR 결합은 모 생체모방에 비해 감소된다(예를 들어, G998). 그러나, 특정의 다른 다량체화 스트라도머에서, FcγR 결합은 비돌연변이 모 화합물(예를 들어, G1068)에 비해 비글리코실화된 돌연변이체에서 유지 또는 향상된다.
일 실시형태에서, 상보체-결합 생체모방은 Fc 도메인을 포함하고, 상기 Fc 도메인은 점 돌연변이 위치 267 및/또는 268 및/또는 324에서의 점 돌연변이를 포함하되, Fc 도메인은 위치 233 및/또는 234 및/또는 235 및/또는 236 및/또는 238 및/또는 265 및/또는 297 및/또는 299에서의 점 돌연변이를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단수의 단어는 청구범위 및/또는 본 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있을 뿐만 아니라 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "생체 모방체", "생체모방 분자", "생체모방 화합물", 및 관련된 용어는 다른 화합물의 기능을 모방하는 인간이 만든 화합물, 예컨대 풀링된 인간 정맥내 면역글로불린("hIVIG"), 단클론성 항체 또는 항체의 Fc 단편을 지칭한다. "생물학적으로 활성인" 생체 모방체는 그들의 천연 유래 상대와 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 화합물이다. "천연 유래"는 유기체에서 정상적으로 발견되는 분자 또는 이의 부분을 의미한다. 천연 유래는 또한 실질적으로 자연적으로 생긴다는 것을 의미한다. "면역학적으로 활성인" 생체 모방체는 천연 유래의 면역학적으로 활성인 분자, 예컨대 항체, 사이토카인, 인터류킨 및 당업계에 공지된 다른 면역학적 분자와 동일 또는 유사한 면역학적 활성을 나타내는 생체 모방체이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 본 명세서에 나타낸 바와 같은 스트라도머이다. 본 명세서에서 사용되는 "모 생체 모방체"는 본 명세서에 기재된 화합물(예를 들어, GL-2045 및 G019)에 대한 기준으로서 사용되는 비돌연변이 생체 모방체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "상보체"는 때때로 문헌에서 상보체 시스템 또는 상보체 캐스케이드로서 지칭되는 상보체 캐스케이드의 임의의 작은 단백질을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "상보체 결합" 또는 "상보체에 대한 결합"은 상보체 캐스케이드의 임의의 성분의 결합을 지칭한다. 상보체 캐스케이드의 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Janeway's Immunobiology, 8th　Ed., Murphy ed., Garland Science, 2012]에 기재되어 있다. 현재 알려진 3가지 주요 상보체 경로가 있다: 고전적 경로, 대안의 경로 및 렉틴 결합 경로. 일단 단백질 C1q가 무손상 면역글로불린 IgM의 하나 이상의 분자, 또는 무손상 면역글로불린 IgG1, IgG2 또는 IgG3 중 적어도 2개의 분자에 결합한다면, 고전적 상보체 경로는 활성화된다. 상보체 활성화는 상보체-의존성 세포용해를 야기한다. 과량의 상보체 활성화는 해로울 수 있으며, 중증 근무력증, 용혈성 요독 증후군(HUS) 및 발작성 야간혈색소뇨증(PNH)을 포함하는 몇몇 질환과 관련된다. 봉 명세서에서 사용되는 바와 같은 "상보체-우선적"은 다른 수용체(예를 들어, FcγR 또는 FcRn)에 대한 결합에 비해 더 높은 정도로 상보체 캐스케이드의 하나 이상의 성분의 결합을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 상보체 우선적 스트라도머이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 일반화된 스트라도머이다. 본 명세서에서 용어 "일반화된 스트라도머"는 상보체 캐스케이드의 하나 이상의 성분에 결합하고, 또한 각각의 정규 Fc 수용체 및/또는 신생아 수용체 FcRn에 결합하는 스트라도머를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "상보체-매개 질환" 및 "상보체-관련 질환"은 상보체 시스템이 어떤 역할을 하는 질환 및 병태를 지칭한다. 예를 들어, 상보체-매개 질환은 상보체 시스템의 활성화의 이상을 수반하는 질환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상보체-매개 질환은 상보체 캐스케이드의 저해에 의해 치료되거나, 예방되거나 또는 감소될 수 있다. 상보체-관련 질환은 당업계에 공지되어 있으며, 중증 근무력증, 용혈성 요독 증후군(HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), 쉬가독소 이콜라이-관련 용혈성 요독 증후군(Shiga toxin　E. coli-related hemolytic uremic syndrome: STEC-HUS), 전신 혈전증 미세혈관병증(TMA), 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 시신경 척수염, 재발성 시신경 척수염(NMO), 이식물 동종이식편의 항체-매개 거부, 바르라퀘르-시몬스 증후군(Barraquer-Simons Syndrome),　천식,　홍반성 낭창,　 자가면역 심장병, 다발성경화증,　염증성 장 질환,　허혈-재관류 손상, 알츠하이머병,　파킨슨병, 근위축성 측색 경화증, 척수손상, 인자 H(Y402H)-관련 황반변성,　연령-관련 황반변성(AMD),　유전성 혈관부종　및 막성 증식성 사구체 신염(MPGN), 막성 신증, 류마티스 관절염(RA), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 심폐 우회로 조성술 동안의 상보체 활성화, 피부근육염, 천포창, 낭창성 신염, 사구체 신염 및 혈관염, IgA 신장병증, 급성 신부전, 한냉글로불린혈증, 항인지질항체 증후군, 포도막염, 당뇨망막병증, 혈액 투석, 만성 폐색 호흡 곤란 증후군(COPD) 및 흡인성 폐렴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상보체-관련 질환은 또한 다양한 기타 자가면역, 염증, 면역학적, 신경학적, 류머티즘 또는 감염제-관련 질환을 포함할 수 있다.
"직접적으로 연결된"은 개재 또는 외부 서열, 예를 들어, DNA 또는 클로닝 단편 내 제한 효소 인식 부위의 삽입으로부터 유래된 아미노산 서열 없이 서로 연결된 두 서열을 의미한다. 당업자는 다량체화 능력이 실질적으로 영향받지 않는 한, "직접적으로 연결된"이 아미노산의 첨가 또는 제거를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
"상동"은 주어진 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 서열에 걸친 동일성을 의미한다. 예를 들어, "80% 상동"은 주어진 서열이 청구된 서열과 약 80% 동일성을 공유하고, 삽입, 결실, 치환 및 틀 이동(frame shift)을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 당업자는 서열의 전체 길이에 걸쳐 동일성을 결정하기 위해 서열 정렬이 삽입 및 결실을 고려하도록 행해질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서 전체적으로, IgG 중쇄 내 잔기의 넘버링은 본 명세서에 명확하게 참고로 포함된 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서와 같은 EU 지표의 넘버링이다. "카바트(Kabat)에서와 같은 EU 지표"는 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링을 지칭한다. 도 36A 및 도 36B 참조.
DEL 및 EEM 다형체로 지칭되는 IgG1의 2가지의 인간 다형체가 있다. DEL 다형체는 위치 356에서 D 및 위치 358에서 L을 가지며; EEM 다형체는 위치 356에서 E 및 위치 358에서 M을 가진다(카바트 넘버링; 도 36A 및 도 36B 참조). 본 명세서에 제공된 스트라도머는 DEL 또는 EEM IgG1 다형체 중 하나를 포함할 수 있다. 따라서, 특정 돌연변이체에 대한 문장이 DEL 다형성과 관련하여 명확하게 생성된다고 해도, 당업자는 동일한 돌연변이가 동일한 결과를 수득하기 위해 EEM 다형체로 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 화합물 G994 및 G998은 DEM과 EEM 다형성 둘 다에 의해 각각 구성되고, 기능적 차이에 대해 평가되었다. 기능성 차이는 관찰되지 않았다. 구체적으로, C1q에 대한 결합 및 CDC의 저해는 각각의 화합물의 각각의 다형성에 대해 실질적으로 동일하였다.
일 실시형태에서, 본 발명의 면역학적으로 활성인 생체 모방체는 스트라도머이다. 본 발명의 면역학적으로 활성인 화합물은 동종이량체의 다량체이다. 일 실시형태에서, 각각의 동종이량체는 상보체에 결합하는 능력을 가진다. 따라서, 다량체화될 때, 면역학적으로 활성인 생체 모방체는 각각 상보체에 결합하는 능력을 갖는 적어도 2개의 동종이량체를 함유한다.
다음의 단락은 구조적으로 그리고 기능적으로 본 발명의 생체 모방체의 빌딩 블록을 나타내고, 이어서, 생체 모방체 그 자체를 나타낸다. 그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 각각의 본 발명의 생체 모방체가 적어도 하나 Fc 도메인 및 하나의 다량체화 도메인을 가진다는 것을 주목하는 것은 첫 번째로 도움이 된다. 최소로, 각각의 Fc 도메인 및 다량체화 도메인은 얻어진 동종이량체를 최소화할 수 있는 기능성 Fc 수용체 또는 상보체 결합 부위 및 다량체화 도메인을 형성하기 위해 회합하는 2개의 펩타이드 쇄 또는 아암(arm)(단량체)을 포함하는 이량체 폴리펩타이드이다(또는 더 큰 폴리펩타이드의 이량체 영역이다). 따라서, 본 명세서에서 논의되는 개개 단편 및 도메인의 기능성 형태는 일반적으로 이량체(또는 다량체) 형태로 존재한다. 본 명세서에서 논의되는 개개 단편 및 도메인의 단량체는 기능성 이량체 구조를 형성하기 위해 제2 쇄 또는 아암과 회합되어야 하는 단일쇄 또는 아암이다.
Fc 단편
"Fc 단편"은 면역글로불린의 카복시 말단에서 일상적으로 발견되는 단백질 영역 또는 단백질 폴딩 구조를 설명하기 위해 사용되는 당업계의 용어이다. Fc 단편은 불완전 및 결함있는 과정인 효소적 분해, 예를 들어 파파인 분해의 사용을 통해 단클론성 항체의 Fab 단편으로부터 단리될 수 있다(문헌[Mihaesco C and Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431-453 (1968] 참조)). Fab 단편(항원 결합 도메인을 함유)과 함께, Fc 단편은 홀로-항체(holo-antibody)를 구성하는데, 이는 본 명세서에서 완전한 항체를 의미한다. Fc 단편은 항체 중쇄의 카복시 말단 부분으로 이루어진다. Fc 단편에서 각각의 쇄는 길이가 약 220 내지 265개의 아미노산이고, 쇄는 종종 이황화 결합을 통해 연결된다. Fc 단편은 종종 하나 이상의 독립적인 구조적 폴딩 또는 기능적 서브도메인을 함유한다. 특히, Fc 단편은 Fcγ 수용체에 결합하는 최소 구조로서 본 명세서에 나타낸 Fc 도메인을 포함한다. 단리된 Fc 단편은 이량체화되는 2개의 Fc 단편 단량체(예를 들어, 항체 중쇄의 2개의 카복시 말단 부분; 본 명세서에서 추가로 나타냄)를 포함한다. 2개의 Fc 단편 단량체가 회합될 때, 얻어진 Fc 단편은 상보체 및/또는 Fc 수용체 결합 활성을 가진다.
Fc 부분적 단편
"Fc 부분적 단편"은 Fc 수용체 결합 활성 및/또는 상보체 결합 활성을 포함하는 Fc 단편과 동일한 활성을 갖기에 충분한 구조를 아직 유지하는 항체의 전체 Fc 단편 미만을 포함하는 도메인이다. 따라서 Fc 부분적 단편은 Fc 부분적 도메인이 유래된 항체의 아이소타입에 따라서 힌지 영역의 부분 또는 모두, CH2 도메인의 부분 또는 모두, CH3 도메인의 부분 또는 모두, 및/또는 CH4 도메인의 부분 또는 모두가 없을 수 있다. Fc 부분적 단편의 다른 예는 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. 이 예에서, Fc 부분적 단편은 IgG1에 존재하는 힌지 도메인을 결여한다. Fc 부분적 단편은 2개의 Fc 부분적 단편 단량체를 포함한다. 본 명세서에서 추가로 나타내는 바와 같이, 2개의 이러한 Fc 부분적 단편 단량체가 회합될 때, 얻어진 Fc 부분적 단편은 Fc 수용체 결합 활성 및/또는 상보체 결합 활성을 가진다.
Fc 도메인
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "Fc 도메인"은 Fc 수용체(FcR)에 결합할 수 있거나 또는 Fc 수용체(FcR)에 의해 결합될 수 있는 (더 큰 폴리펩타이드와 관련하여) 최소 영역 또는 (단리된 단백질과 관련하여) 가장 작은 단백질 폴딩 구조를 기재한다. Fc 단편과 Fc 부분적 단편 둘 다에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 분자의 결합을 허용하는 최소 결합 영역이다. Fc 도메인이 Fc 수용체에 의해 결합된 별개의 동종이량체 폴리펩타이드로 제한될 수 있지만, 또한 Fc 도메인이 Fc 단편의 부분 또는 모두뿐만 아니라 Fc 부분적 단편의 부분 또는 모두일 수 있다는 것은 분명할 것이다. 용어 "Fc 도메인"이 본 발명에서 사용될 때, 하나 초과의 Fc 도메인을 의미하는 것으로 당업자에 의해 인식될 것이다. Fc 도메인은 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 본 명세서에서 추가로 나타내는 바와 같이, 2개의 이러한 Fc 도메인 단량체가 회합될 때, 얻어진 Fc 도메인은 Fc 수용체 결합 활성 및/또는 상보체 결합 활성을 가진다. 따라서, Fc 도메인은 상보체 및/또는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 이량체 구조이다. 본 명세서에 기재된 스트라도머는 상보체 및/또는 Fc 수용체에 결합하는 스트라도머의 능력을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다.
Fc 부분적 도메인
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "Fc 부분적 도메인"은 Fc 도메인의 일부를 기재한다. Fc 부분적 도메인은 개개의 중쇄 불변 영역 도메인(예를 들어, CHl, CH2, CH3 및 CH4 도메인) 및 상이한 면역글로불린 부류 및 하위부류의 힌지 영역을 포함한다. 따라서, 본 발명의 인간 Fc 부분적 도메인은 IgG1의 CHl 도메인, IgG1의 CH2 도메인, IgG1의 Ig CH3 도메인 및 IgG1의 힌지 영역, 및 IgG2를 포함한다. 다른 종에서 대응하는 Fc 부분적 도메인은 해당 종에 존재하는 면역글로불린 및 이의 명칭에 의존할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 Fc 부분적 도메인은 IgG1의 CH1, CH2 및 힌지 도메인 및 IgG2의 힌지 도메인을 포함한다. 본 발명의 Fc 부분적 도메인은 추가로 이들 도메인 및 힌지 중 하나 초과의 조합을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 개개 Fc 부분적 도메인 및 이들의 조합은 FcR에 결합하는 능력을 결여한다. 따라서, Fc 부분적 도메인 및 이들의 조합은 Fc 도메인보다 적게 포함한다. Fc 부분적 도메인은 함께 연결되어 상보체 및/또는 Fc 수용체 결합 활성을 갖는 펩타이드를 형성함으로써, Fc 도메인을 형성할 수 있다. 본 발명에서, Fc 부분적 도메인은 본 명세서에 나타낸 바와 같은 본 발명의 생체 모방체를 생성하기 위한 빌딩 블록으로서 Fc 도메인과 함께 사용된다. 각각의 Fc 부분적 도메인은 2개의 Fc 부분적 도메인 단량체를 포함한다. 2개의 이러한 Fc 부분적 도메인 단량체가 회합될 때, Fc 부분적 도메인이 형성된다.
상기 나타낸 바와 같이, 각각의 Fc 단편, Fc 부분적 단편, Fc 도메인 및 Fc 부분적 도메인은 이량체 단백질 또는 도메인이다. 따라서, 각각의 이들 분자는 이량체 단백질 또는 도메인을 형성하기 위해 회합되는 2개의 단량체를 포함한다. 동종이량체 형태의 특징 및 활성은 상기 논의한 바와 같지만, 단량체 펩타이드는 다음과 같이 논의된다.
Fc 단편 단량체
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "Fc 단편 단량체"는 다른 Fc 단편 단량체와 회합될 때, Fc 단편을 포함하는 단일쇄 단백질이다. 따라서 Fc 단편 단량체는 홀로-항체의 Fc 단편을 구성하는 항체 중쇄 중 하나의 카복시 말단 부분(예를 들어, IgG의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄의 인접한 부분)이다. 일 실시형태에서, Fc 단편 단량체는 최소로, 펩타이드를 형성하기 위해 인접하여 연결된 힌지 영역 중 하나의 쇄(힌지 단량체), CH2 도메인 중 하나의 쇄(CH2 도메인 단량체) 및 CH3 도메인 중 하나의 쇄(CH3 도메인 단량체)를 포함한다. 일 실시형태에서, CH2, CH3 및 힌지 도메인은 상이한 아이소타입으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, Fc 단편 단량체는 IgG2 힌지 도메인 및 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 함유한다.
Fc 도메인 단량체
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "Fc 도메인 단량체"는 다른 Fc 도메인 단량체와 회합될 때, 상보체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 포함하는 단일쇄 단백질을 기재한다. 2개의 Fc 도메인 단량체의 회합은 1개의 Fc 도메인을 생성한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 Fc 도메인 단량체는 WO 2008/151088에 기재된 이전에 기재된 Fc 도메인 단량체와 같이 외부 서열을 함유하지 않는다. 대신에, 본 발명의 Fc 도메인 단량체는 하나의 말단(예를 들어, Fc 단량체의 N-말단) 상에서 리더 서열(예를 들어, 서열번호 1)에 그리고 다른 말단(예를 들어, Fc 단량체의 C 말단) 상에서 다량체화 도메인(예를 들어, 서열번호 4, 5 또는 6)에 직접적으로 연결된다. 당업자는 작제물이 리더 서열에 의해 생성되지만, 이 서열은 후속적으로 절단된다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 성숙 단백질은 리더 서열을 함유하지 않을 것이다.
일 실시형태에서, Fc 도메인 단량체는 아미노로부터 카복시 말단까지, IgG1 힌지, IgG1CH2 및 IgG1 CH3 및 IgG2 힌지(G045c 배경)을 포함하는 Fc 도메인을 포함하되, 단량체는 Fc 도메인에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인 단량체는 아미노로부터 카복시 말단까지, IgG2 힌지, IgG1 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3(G019 배경)을 포함하는 Fc 도메인을 포함하고, 상기 Fc 단량체는 Fc 도메인에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 도메인 단량체는 아미노로부터 카복시 말단까지, IgG2 힌지, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3(G051 배경)를 포함하는 Fc 도메인을 포함하며, 상기 Fc 단량체는 Fc 도메인에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.
스트라도머
특정 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 스트라도머를 포함한다. 본 발명의 스트라도머는 상보체에 결합할 수 있는 생체모방 화합물이며, 바람직하게는 상당히 개선된 상보체 결합을 입증한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 스트라도머는 하나 이상의 정규 Fc 수용체의 결합에 대한 상보체 결합의 증가된 비를 나타낸다. 스트라도머는 4가지 상이한 물리적 입체구조: 순차적, 클러스터, 코어 또는 Fc 단편을 가질 수 있다. 명백한 바와 같이, 상기 논의한 Fc 단편, Fc 부분적 단편, Fc 도메인 및 Fc 부분적 도메인은 다양한 스트라도머 입체구조의 구성에서 사용된다. 추가로, 동종이량체 스트라도머 단위를 형성하기 위해 처음 생성되고, 이어서, 본 발명의 클러스터 스트라도머인 다량체 구조를 형성하기 위한 다량체화 도메인(예를 들어, IgG2 힌지)의 포함을 통해 다량체화되는, 또한 상기 논의한 개개의 Fc 도메인 단량체 및 Fc 부분적 도메인 단량체가 있다. 특정 스트라도머는 WO 2008/151088 및 WO 2012/016073에서 매우 상세하기 기재되며, 이들 둘 다의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다. 상보체 결합 대 Fc γ 수용체 및/또는 FcRn 결합의 비는 위치 233 및/또는 234 및/또는 235 및/또는 236 및/또는 238 및/또는 265 및/또는 297 및/또는 299 중 하나 이상에서 추가적인 돌연변이에 의해 추가로 향상될 수 있다.
스트라도머 단위 단량체
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "스트라도머 단위 단량체"는 적어도 제2 스트라도머 단위 단량체와 회합될 때, 적어도 하나 Fc 도메인을 포함하는 동종이량체 스트라도머 단위를 형성하는 단일의 인접한 펩타이드 분자를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 스트라도머 단위는 2개의 회합된 스트라도머 단량체를 포함하지만, 스트라도머는 또한 3개 이상의 스트라도머 단량체를 함유할 수 있다.
스트라도머 단위 단량체는 "스트라도머 단위"를 형성하기 위해 다른 스트라도머 단위 단량체와 회합될 때, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 스트라도머 단위 단량체는 스트라도머 단위를 형성하기 위해 다른 스트라도머 단위 단량체와 회합될 때, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 이상의 Fc 부분적 도메인을 형성할 아미노산 서열을 추가로 가질 수 있다.
스트라도머 단위와 관련하여 Fc 도메인및 Fc 부분적 도메인을 형성할 스트라도머 단위 단량체의 영역은 스트라도머 단위 단량체 분자의 연속적인 영역의 카복시 말단으로부터 아미노 말단까지 단순히 배열될 수 있다. 스트라도머 단위 단량체를 포함하는 특정 Fc 도메인 단량체 및 Fc 부분적 도메인 단량체의 배열은 중요하지 않다. 그러나, 배열은 2개의 스트라도머 단위 단량체의 회합 시 2개의 기능성 Fc 도메인의 형성을 허용하여야 한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트라도머는 IgG1 Fc 단량체의 N-말단과 리더 펩타이드의 C-말단(서열번호 1) 및 IgG1 Fc의 C 말단과 다량체화 도메인 IgG2 힌지의 N 말단(서열번호 4) 사이의 직접적인 연결을 함유한다.
분명한 예로서, 당업자는 표시된 점 돌연변이를 포함하는 본 발명의 스트라도머 분자가 요망되는 점 돌연변이 및 다량체화 영역을 갖는 Fc 도메인 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조함으로써 구성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 분자는 박테리아 집단을 형질전환하기 위해 또는 포유류 세포 집단을 형질감염시키기 위해 사용될 수 있는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이어서, 스트라도머 단위 단량체는 적절한 배양 조건 하에서 형질전환된 박테리아 또는 형질감염된 포유류 세포를 배양시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 안정하게 형질감염된 세포 풀을 지속하는 클론 세포주는 제네테신/G418과 함께 셀렉틴 세포에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 CMV 프로모터의 제어 하에서 본 발명의 스트라도머를 암호화하는 DNA(예를 들어, 서열번호 10 내지 77 중 임의의 하나에 따른 스트라도머를 암호화하는 DNA)에 의해 일시적으로 형질감염될 수 있다. 이어서, 발현된 스트라도머 단량체는 스트라도머 단량체 또는 단위의 자기 응집시 또는 스트라도머간 단량체 연결을 이용하는 스트라도머 단량체의 회합 시 기능성 스트라도머 단위 및 스트라도머를 형성할 수 있다. 이어서, 발현된 스트라도머는, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼을 이용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 당업자는 핵산 작제물에 포함된 리더 펩타이드가 단지 스트라도머 단위 단량체 펩타이드의 생성을 용이하게 하기 위해 사용되고, 성숙 단백질의 발현 시 절단된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 생물학적으로 활성인 본 발명의 생체 모방체는 리더 펩타이드를 포함하지 않는다.
클러스터 스트라도머
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 사용되는 스트라도머는 클러스터 스트라도머이다. "클러스터 스트라도머"는 중앙 모이어티 "헤드" 및 2 이상의 "레그(leg)"와 함께 방사 형태를 갖는 생체 모방체이되, 각각의 레그는 적어도 하나 Fc 감마 수용체 및/또는 상보체에 결합할 수 있는 하나 이상의 Fc 도메인을 포함한다. 클러스터 스트라도머는 또한 스트라도머의 다량체화를 초래하는 다량체화 도메인의 존재 때문에 "다량체화 스트라도머"로서 알려져 있다. 따라서, 하나의 스트라도머 단량체 분자 상에서 다중 Fc 도메인을 함유하는 연속적 스트라도머는 분자가 또한 적어도 하나의 다량체화 도메인을 함유한다면, 클러스터 스트라도머 또는 다량체화 스트라도머로서 여전히 분류될 수 있다. 각각의 클러스터 스트라도머는 각각 "클러스터 스트라도머 단위"로 불리는 하나 초과의 동종이량체 단백질을 포함한다. 각각의 클러스터 스트라도머 단위는 다량체화하는 적어도 하나의 영역 및 적어도 하나의 기능성 Fc 도메인을 포함하는 "레그" 영역을 포함한다. 다량체화 영역은 다른 클러스터 스트라도머 단위와 함께 다량체화된다면, 클러스터 스트라도머 "헤드"를 생성한다. 레그 영역은 각각의 레그 영역에 Fc 도메인이 있기 때문에 다수의 상보체 분자로서 결합할 수 있다. 예를 들어, 레그 영역은 각각의 레그 영역에 Fc 도메인이 있기 때문에 다수의 C1q 분자와 결합할 수 있다. 따라서, 클러스터 스트라도머는 2 이상의 C1q 분자에 결합할 수 있고, 따라서 하류의 상보체-매개 용해를 방지할 수 있는 생체모방 화합물이다. 본 발명의 특히 강력한 생체 모방체는 C1q 분자의 모두 6개의 헤드에 결합할 수 있다.
다량체화 영역은 이량체 단백질이 추가로 다량체화하도록 야기하는 펩타이드 서열일 수 있거나 또는 대안적으로 다량체화 영역은 이량체 단백질의 다량체화를 향상시키는 글리코실화일 수 있다. 펩타이드 다량체화 영역의 예는 IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 아이소류신 지퍼, 콜라겐 글리신-프롤린-프롤린 반복부("GPP") 및 아연 핑거를 포함한다. 아미노산 치환의 결과 또는 클러스터 조건의 결과가 본 발명의 생체 모방체의 다량체화에 또한 영향을 미칠 수 있든 그렇지 않든, 글리코실화는 변화한다. 펩타이드 다량체화에 대한 글리코실화의 영향은 당업계에 잘 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams and Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 80, No. 9, [Part 1 : Biological Sciences] (May 1, 1983), pp. 2771-277 '4; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka and Haruko Ogawa. International Congress Series Volume 1223, December 2001, 페이지 97-101]).
다량체화 영역은 펩타이드가 이량체화 또는 다량체화하도록 야기하고, IgG2 힌지, IgE CH2 도메인, 아이소류신 지퍼, 콜라겐 GPP, 및 아연 핑거를 포함하는 펩타이드 서열일 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 인간 IgG2의 힌지 영역은 공유 이량체를 형성할 수 있다(Yoo, E.M. et al. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). IgG2의 이량체 형성은 C-C 결합에 의한 IgG2 힌지 구조를 통해 잠재적으로 매개되는데 (Yoo et al 2003), 이는 힌지 구조 단독이 이량체 형성을 매개할 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 인간 혈청에서 발견되는 IgG2 이량체의 양은 제한된다. 동종이량체의 이량체로서 존재하는 IgG2의 양은 총 IgG2의 10% 미만이라는 것이 추정된다(Yoo et al. 2003). 더 나아가, 동종이량체의 이량체 이상으로 IgG2의 다량체화의 정량적 증거는 없다. (Yoo et al. 2003). 즉, 천연 IgG2는 인간 혈청 중에서 더 고차 다량체를 형성하는 것으로 발견되지 않았다. IgG2 힌지-함유 스트라도머(즉, WO 2012/016073에 기재된 바와 같은 G045c 및 G019)는 고차 다량체에 존재하며, IgG2 힌지 상호작용이 가변적이고 역학적인 인간 혈청 중의 천연 IgG2와 달리, G045c는 비환원성 SDS-PAGE 겔 상에서, 분석적 초원심분리에 의해 그리고 100% 습도로 37℃에서 3개월 안정성 연구에 의해 증명된 고도로 안정한 다량체를 형성하도록 입증되었다. 더 나아가, 또한 IgG2 힌지-함유 스트라도머 제제는 대략 10%의 이량체보다 상당히 더 높으며, 인간 혈청 중에서 IgG2에 대해 관찰된 다량체가 없다는 것은 놀랍다. 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체 및 동종이량체의 더 고차의 다량체를 포함하는, 다량체인 상보체-우선적 스트라도머의 백분율은 20%를 초과하며, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 심지어 90%를 초과할 수 있다.
인간 IgG2 힌지 단량체의 아미노산 서열은 다음과 같다: ERKCCVECPPCP(서열번호 4). 서열번호 4에서 4개의 시스테인 중 임의의 하나의 돌연변이는 스트라도머의 크게 감소된 다량체화와 관련될 수 있다. IgG2 힌지 단량체의 2개의 C-X-X-C 부분이 있다. 따라서, 본 발명의 스트라도머 단량체는 Fc 도메인 단량체와 함께 IgG2 힌지 단량체의 완전한 12개의 아미노산 서열, 또는 4개의 아미노산 코어 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 코어 구조의 X-X는 임의의 아미노산일 수 있지만, 바람직한 실시형태에서 X-X 서열은 V-E 또는 P-P이다. 당업자는 IgG2 힌지 단량체가 코어 4 아미노산 구조에 추가로 IgG2 힌지 서열 모두 및 IgG2 CH2 및 CH3 도메인 단량체 서열 중 일부 또는 모두를 포함하는, 힌지 서열의 임의의 부분을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, IgG2 힌지 다량체화 도메인은 스트라도머 단량체의 임의의 부분과 상호작용함으로써 다량체를 형성할 수 있다. 즉, 하나의 스트라도머 단량체의 IgG2 힌지는 다른 스트라도머 단량체의 IgG2 힌지에 결합함으로써, 동종이량체의 이량체 또는 더 고차의 다량체를 형성하는 한편, 천연 IgG1 Fc에 비해 Fc 수용체에 대한 증가된 기능성 결합을 유지할 수 있다. 대안적으로, 하나의 스트라도머 단량체의 IgG2 힌지 도메인은 다른 스트라도머 단량체의 IgG1 힌지에 결합함으로써, 동종이량체의 이량체 또는 더 고차의 다량체를 형성하는 한편, 천연 IgG1 Fc에 비해 Fc 수용체에 대한 증가된 기능성 결합을 유지할 수 있다. 또한 하나의 스트라도머 단량체의 IgG2 힌지 도메인은 IgG1 Fc 도메인의 다른 부분, 즉, 다른 스트라도머 단량체의 CH2 또는 CH3 도메인에 결합되어 동종이량체의 이량체 또는 더 고차의 다량체를 형성하는 한편, 천연 IgG1 Fc에 비해 Fc 수용체에 대한 증가된 기능성 결합을 유지하는 것이 가능하다.
류신 및 아이소류신 지퍼는 또한 다량체화 영역으로서 사용될 수 있다. 류신 및 아이소류신 지퍼(또꼬인 나선 도메인)은 단백질 이량체, 삼량체 및 사량체의 형성을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다(Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993); O'Shea et al. Science 243:538 (1989)). 삼량체를 형성하는 아이소류신 지퍼의 자연적 경향의 이점을 취함으로써, 클러스터 스트라도머가 생성될 수 있다.
당업자는 상이한 유형의 류신 및 아이소류신 지퍼가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이지만, 바람직한 실시형태에서 기재한 바와 같이 변형된 GCN4 전사 조절자로부터의 아이소류신 지퍼(Morris et al., Mol. Immunol. 44:3112-3121 (2007); Harbury et al. Science 262:1401-1407 (1993))가 사용된다: GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGG(서열번호 5) 이 아이소류신 지퍼 서열은 Fc 도메인 단량체의 다량체화를 위해 사용될 수 있는 몇몇 가능한 서열 중 단지 하나이다. 서열번호 5에 나타낸 전체 서열이 사용될 수 있지만, 서열의 밑줄 부분은 본 발명의 클러스터 스트라도머에서 사용될 수 있는 아이소류신 지퍼의 코어 서열을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 스트라도머 단량체는 하나 이상의 Fc 도메인 단량체와 함께 아이소류신 지퍼의 완전한 아미노산 서열, 또는 28개의 아미노산 코어 중 하나를 포함할 수 있다. 당업자는 또한 아이소류신 지퍼가 코어 28 아미노산 구조에 추가로 지퍼의 임의의 부분을 포함할 수 있고, 따라서 28개 초과의 아미노산(그러나 전체 서열 미만임)을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
GPP는 콜라겐 단백질: 단백질 결합을 야기하는 인간 콜라겐에서 발견되는 아미노산 서열이다. 당업자는 상이한 유형의 GPP 반복부가 다량체화 도메인으로서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이지만, 바람직한 실시형태에서 기재한 바와 같은 글리신 -프롤린-프롤린 반복부(Fan et al FASEB Journal 3796 vol. 22 2008)가 사용된다: (서열번호 6). 이 글리신-프롤린-프롤린 반복부 서열은 Fc 도메인 단량체의 다량체화를 위해 사용될 수 있는 몇몇 가능한 서열 중 단지 하나이다. 서열번호 6에 나타낸 전체 서열이 사용될 수 있지만, 상이한 길이의 반복부가 또한 Fc 도메인 단량체를 다량체화하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, GPP 반복부 내에서 상이한 아미노산을 함유하는 반복부가 또한 치환될 수 있다.
본 명세서에 개시된 스트라도머 및 다른 생체모방 분자는 인간을 포함하는 임의의 다양한 종으로부터 유래될 수 있다는 것이 이해된다. 게다가, 본 발명의 임의의 하나의 생체모방 분자에서 Fc 도메인 또는 Fc 부분적 도메인은 하나 초과의(예를 들어, 2, 3, 4, 5가지 이상의) 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 그들은 더 통상적으로는 단일 종으로부터 유래될 것이다. 추가로, 본 명세서에 개시된 임의의 방법(예를 들어, 치료 방법)은 임의의 종에 적용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 일반적으로, 관심 대상의 종에 적용된 생체모방 성분은 모두 해당 종으로부터 유래될 것이다. 그러나, 모든 성분이 상이한 종을 갖거나 또는 하나 초과의 종으로부터 유래된(적절한 방법이 적용된 종을 포함하거나 또는 포함하지 않음) 생체 모방체가 또한 사용될 수 있다.
스트라도머 및 기타 본 발명의 생체 모방체의 Fc 도메인 및 Fc 부분적 도메인을 포함하는 특정 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 및 힌지 영역은 면역글로불린 하위 분류에 대해서 뿐만 아니라 그들이 유래된 유기체에서 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 스트라도머 및 기타 생체 모방체는 다양한 면역글로불린 유형, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAl, IgD, IgE 및 IgM, 마우스 IgG2a, 또는 개 IgA 또는 IgB로부터 독립적으로 유래된 Fc 도메인 및 부분적 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 유사하게 각각의 Fc 도메인 및 부분적 Fc 도메인은 종-특이적 또는 키메라 스트라도머 분자를 생성하기 위해 다양한 종, 바람직하게는 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지), 인간, 뮤린, 쥐, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 페럿, 게르빌루스, 기닉픽, 햄스터, 박쥐를 포함하는 포유류 종, 조류(예를 들어, 닭, 칠면조 및 오리), 어류 및 파충류로부터 유래될 수 있다.
개개의 Fc 도메인 및 부분적 Fc 도메인은 또한 인간화될 수 있다. 당업자는 상이한 Fc 도메인 및 부분적 Fc 도메인이 상이한 유형의 기능을 제공할 것이라는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, FcRn은 IgG 면역글로불린에 특이적으로 결합하며, 면역글로불린의 다른 부류에는 잘 결합하지 않는다. 당업자는 또한 다양한 해로운 결과, 예컨대 IgA 주입과 관련된 아나필락시스(anaphylaxis)가 특정 Ig 도메인의 사용과 관련될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 개시된 생체 모방체는 특정 환경에서 이러한 효과가 바람직할 수 있지만, 이러한 효과를 회피하도록 설계되어야 한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 또는 Fc 부분적 도메인의 천연 유래 아미노산 서열과 상이한 아미노산을 갖는 Fc 도메인 및 Fc 부분적 도메인을 포함하는 스트라도머를 포함한다. 본 발명의 생체모방 화합물 중에 포함을 위한 바람직한 Fc 도메인은 상보체에 대해 측정 가능한 특정 결합 친화도를 가진다. 수많은 Fc 도메인 및 Fc 도메인 단량체의 1차 아미노산 서열 및 X선 결정 구조는 당업계에서 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Woof JM, Burton DR. 인간 antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. 2004 Feb;4(2):89-99] 참조. Fcγ 수용체 결합 능력을 갖는 대표적인 Fc 도메인은 인간 IgG1로부터의 Fc 도메인을 포함한다(서열번호 2 또는 3). 이들 천연 서열은 기능서어 서열의 부위 지정 돌연변이유발 맵핑을 포함하는 광범위 구조-기능 분석이 실시되었다. 이들 선행 구조 기능 연구 및 이용 가능한 결정학 데이터에 기반하여, 당업자는 기능성 Fc 도메인 서열 변이체를 설계하는 한편, 상보체 결합 능력을 보존할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 단량체 사이의 이황화 결합을 향상시키기 위해 첨가될 수 있거나 또는 스트라도머 동종이량체 사이의 상호작용을 변경시키기 위해 결실될 수 있다. 추가로, 당업자는 기능성 Fc 도메인 서열 변이체를 설계하는 한편, 향상된 상보체 결합 능력을 보존할 수 있거나 또는 심지어 추가로 향상된 상보체 결합 능력을 갖는 기능성 Fc 도메인 서열 변이체를 설계할 수 있다.
아미노산 변화는 Fc 도메인의 서열 전체적으로 발견될 수 있거나, 또는 Fc 도메인을 포함하는 특정 Fc 부분적 도메인으로 단리될 수 있다. 스트라도머 및 다른 본 발명의 생체 모방체에서 사용되는 Fc 도메인의 기능성 변이체는 천연 Fc 도메인에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다. 유사하게, 스트라도머 및 다른 본 발명의 생체 모방체에서 사용되는 Fc 부분적 도메인의 기능성 변이체는 천연 Fc 부분적 도메인에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
당업자는 본 발명이 본 발명의 Fc 단편 단량체, Fc 부분적 단편 단량체, 스트라도머 단량체 및 다른 단량체의 구성에서 Fc 도메인 단량체의 기능성 변이체의 사용을 추가로 포함한다는 것을 인식할 것이다. Fc 도메인 단량체의 기능성 변이체는 천연 Fc 도메인 단량체 서열에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
유사하게, 본 발명은 또한 본 발명의 Fc 단편 단량체, Fc 부분적 단편 단량체, Fc 도메인 단량체, 스트라도머 단량체 및 다른 단량체의 구성에서 Fc 부분적 도메인 단량체의 기능성 변이체의 사용을 포함한다. Fc 부분적 도메인 단량체의 기능성 변이체는 천연 Fc 부분적 도메인 단량체 서열에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다.
아미노산 변화는 FcRn 또는 정규 Fcγ 수용체에 대한 스트라도머의 결합 친화도를 감소시키거나, 증가시키거나 또는 변경되지 않은 채로 남길 수 있다. 바람직하게는 이러한 아미노산 변화는 보존적 아미노산 치환일 것이지만, 그러나, 이러한 변화는 결실, 첨가 및 다른 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 다음의 군 내에서의 변화를 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 라이신, 히스티딘 및 알기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신. 추가적으로, 아미노산 변화는, 예를 들어 시스테인 잔기의 첨가에 의해 다량체화 강도를 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "기능성 변이체"는 기준 서열(폴리펩타이드)과 동일한 생물학적 효과를 매개할 수 있거나 또는 기준서열(폴리펩타이드)에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 효과를 매개할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 기준 서열에 대한 상동성에 의해 관련된 서열을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 생체 모방체의 기능성 변이체는 전문화된 상동성 또는 동일성을 가지며, 단핵구 또는 DC의 면역 조절을 가능하게 한다. 기능성 서열 변이체는 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드를 둘 다 포함한다. 서열 동일성은 일반적으로 하기 디폴트 매개변수에 의해 작동하는 BLAST 2.0(기본 지역 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool))를 이용하여 평가된다: 필터-온(Filter-On), 스코어링 매트릭스(Scoring Matrix)- BLOSUM62, 단어 크기 -3, E 값 - 10, 갭 코스트(Gap Cost) - 11,1 및 정렬 -50. 일부 실시형태에서, 기능성 변이체는 본 명세서에 제공된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
천연 Fc 도메인의 아미노산 서열 조성물에 추가로, Fc 도메인의 탄수화물 함량은 Fc 도메인 구조 상에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Robert L. Shields, et al. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcγRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Jul 2002; 277: 26733 - 26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright and Sherie L. Morrison. Effect of C2- Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgG1 Antibodies in Glycosylation Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells. J. Immunol, Apr 1998; 160: 3393 - 3402] 참조. 탄수화물 함량은, 예를 들어, 특정 세포주 또는 시험관내 효소 변형을 포함하는 특정 단백질 발현 시스템을 이용하여 제어될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도메인이 얻어지는 홀로-항체의 천연 탄수화물 함량을 갖는 Fc 도메인뿐만 아니라 변경된 탄수화물 함량을 갖는 해당 생체모방 화합물을 포함하는 스트라도머를 포함한다. 다른 실시형태에서, 스트라도머의 다량체 성분은 동일한 스트라도머의 동종이량체 성분에 비해 상이한 글리코실화 패턴을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 상보체-결합 스트라도머는 글리코실화 패턴을 변경시키지 않지만, 정규 Fc 수용체 결합 및/또는 FcRn 수용체 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 돌연변이를 포함한다.
상보체-우선적 스트라도머의 바람직한 실시형태
본 명세서에 기재된 상보체-우선적 스트라도머는 Fc 수용체 결합에 대한 상보체 결합의 증가된 비를 제공한다. 따라서, 상보체-우선적 본 명세서에 제공된 스트라도머는 일부 실시형태에서 "상보체-우선적 스트라도머" 또는 "상보체 결합 스트라도머"로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 상보체 캐스케이드의 하나 이상의 성분에 결합하고, 또한 각각의 FcγR에 결합하는 "일반화된 스트라도머"이다.
위치 267, 268 및 324(서열번호 13)에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G997로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G997은 놀랍게도 FcγRI, 저해 수용체 FcγRII 및 FcRn에 대해 유지된 결합이 유지되고, 활성화 수용체 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대한 결합이 상당히 감소된 강한 C1q 결합 및 CDC 저해를 나타낸다.
위치 267, 268, 297 및 324(서열번호 14 또는 15)에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G998로 칭해진다. Fc 돌연변이 N297A(그러나 위치 267, 268 또는 324에서 돌연변이 없음)를 포함하는 다량체화 스트라도머는 고친화도 및 아비디티 없이 C1q에 결합하고, CDC의 보통의 저해, 및 FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIIIa에 대한 인식 가능한 결합 없음을 입증한다. 대조적으로, 그리고 놀랍게도, 본 발명자들은 돌연변이 N297A를 포함하는 GL-2045 골격 상의 스트라도머(G998로 표기된 스트라도머)에 대해 Fc 돌연변이 S267E, H268F, 및/또는 S324T의 추가적인 도입이 상당하게 C1q 결합 및 CDD의 저해를 추가로 향상시킨다는 것을 발견하였다. 훨씬 더 놀랍게도, 얻어진 화합물은 FcγRIIb에 탐욕적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시형태에서, G998은 놀랍게도 모 스트라도머 G045c보다 훨씬 더 강한 C1q 결합 및 CDC 저해뿐만 아니라 G045c 모체에 비해 완전히 유지된 FcRn 및 대부분 유지된 FcγRI 결합뿐만 아니라 활성화 수용체 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대해 상당히 감소된 결합을 갖는 저해 수용체 FcγRIIb에 대한 결합의 부분적 보유를 나타낸다. 이들 돌연변이의 예측 불가능을 강조하기 위해, 동일한 시리즈의 돌연변이가 C-말단의 다량체화 도메인(GL-2045)을 갖는 스트라도머와 대조적으로 N-말단의 다량체화 도메인(G019)을 갖는 스트라도머에 의해 이루어질 때, C1q에 대한 이런 바람직한 결합은 완전히 폐지된다(화합물 G999 참조). 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 위치 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 갖고, 추가로 위치 253, 310 및 435에서 돌연변이를 포함하는, 스트라도머를 제공한다. 또한 추가 실시형태에서, 본 개시내용은 위치 233, 234, 235, 253, 267, 268, 297, 299, 310, 324 및 435에서 돌연변이, 및 위치 G236에서 아미노산의 결실을 포함하는 스트라도머를 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다음의 돌연변이: I253A, S267E, H268F, N297A, H310A, S324T 및 H435A를 포함하는 스트라도머; 또는 다음의 돌연변이 E233P, L234V, L235A, I253A, S267E, H268F, N297A, T299A, H310A, S324T 및 H435A, 및 G236의 결실을 포함하는 스트라도머를 제공한다. 일부 실시형태에서, 얻어진 스트라도머는 서열번호 14 또는 15에 따른 스트라도머의 C1q 결합 및 CDC 저해를 유지하며, 서열번호 14 또는 15에 따른 스트라도머에 비해 FcγRIIb 및/또는 FcγRI에 대해 더 적은 결합을 입증한다.
위치 234, 235, 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 21 또는 22) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1033으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1033은 놀랍게도 (예를 들어, N297A 및 L234A/L235A 돌연변이에 비추어) 강한 C1q 결합 및 CDC 저해에 추가로 FcγRI 및 FcγRIIa에 대한 일부 결합을 유지한다.
위치 233, 236, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 10 또는 11) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G994로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G994는 FcγRI 및 FcRn에 대한 강한 결합 및 활성화 수용체 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대해 상당한 결합 없음과 함께 FcγRIIb에 대한 최소 결합을 유지한다. 이들 결과는 위치 233 또는 236에서의 돌연변이가 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcRn에 대해 폐지된 결합을 초래한다는 것을 개시하는 쉴즈(Shields) 등(Shields, et al. J. Biol. Chem., 276(9):6591 (2001))을 고려하여 특히 놀라웠다. 이들 결과는 스트라도머에 대해 주어진 점 돌연변이의 예측 불가능성을 추가로 강조한다. Fc 돌연변이 E233P 및 G236R(그라나 위치 267, 268, 또는 324에서 돌연변이가 없음)을 포함하는 다량체화 스트라도머는 고친화도 및 아비디티 없이 C1q에 결합하지만, CDC의 인식 가능한 저해는 없으며, FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIIIa에 대한 인식 가능한 결합은 없었다. 대조적으로, 그리고 놀랍게도, 본 발명자들은 E233P 및 G236R 돌연변이(G994로 표기된 스트라도머)를 포함하는 스트라도머와 관련하여 Fc 돌연변이 S267E, H268F, 및/또는 S324T의 추가적인 도입은 C1q 결합 및 CDC의 저해를 추가로 향상시키는 한편, FcγRIIb에 대한 일부 결합을 유지한다는 것을 발견하였다.
위치 233, 234, 235, 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 갖고, G236이 결실된 G045c 배경(서열번호 19) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1022로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1022는 놀랍게도 C1q에 결합하고, CDC를 저해하며, FcγRIIa에 대한 강한 결합 및 FcγRIIb에 대한 보통의 결합을 유지하지만, 매우 놀랍게도 고친화도 FcγRI에 대한 결합을 유지하지 않는다.
위치 234, 235, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 63) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1032로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1032는 놀랍게도 C1q에 결합하고, CDC를 저해하는 한편, 또한 모든 정규 Fc 수용체에 대해 강한 결합, 및 FcRn에 대해 보통으로 강한 결합을 유지한다.
위치 233, 234, 235, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖고 G236이 결실된 G045c 배경(서열번호 62) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1023으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1023은 놀랍게도 C1q에 결합하고, CDC를 저해하는 한편, 모든 정규 Fc 수용체에 대해 강한 결합을 유지한다.
위치 265, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 18) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1006으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 모든 정규 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 것으로 예상되는 위치 265에서의 돌연변이에도 불구하고, G1006은 놀랍게도 C1q에 결합하고, CDC를 저해하는 한편, FcγRI 및 FcRn에 대해 강한 결합 및 FcγRIIa에 대해 보통의 결합을 유지한다.
위치 238, 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 20) 상에서 스트라도머는 본 명세서에서 G1027로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1027은 놀랍게도 C1q에 결합하고, CDC를 저해하지만, 위치 238 및 297에서 돌연변이에도 불구하고, 정규 Fc 수용체 결합을 제거하지 않아서, FcγRI 및 FcRn에 대한 강한 결합 및 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 보통의 결합을 유지한다.
위치 236, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 12) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G996로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G996은 놀랍게도 C1q 결합 및 CDC 저해에 추가로 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIb에 결합한다. 또한 놀랍게도, G996은 마우스에서 정규 결합을 나타내지 않아서, 그것을 설치류에서 순수한 CDC 저해를 평가하기 위한 이상적인 화합물로 만든다. G996과 대조적으로, Fc 돌연변이 G236R을 포함하는(그러나 위치 267, 268 또는 324에서 돌연변이 없음) 다량체화 스트라도머는 G990로 표기하고, 고친화도 및 아비디티 없이 C1q에 결합하지만, CDC의 인식 가능한 저해는 없다. G990은 또한 FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIIIa에 대한 인식 가능한 결합이 없다. 놀랍게도, 본 발명자들은 G990와 관련하여 Fc 돌연변이 S267E, H268F, 및/또는 S324T의 추가적인 도입이 C1q 결합 및 CDC의 저해를 추가로 향상시킨다는 것을 발견하였다. 훨씬 더 놀랍게도, G996은 FcγRIIb에 매우 탐욕적으로 결합한다.
위치 233, 236, 267, 268, 324 및 328에서의 점 돌연변이를 갖는 G045c 배경(서열번호 23) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1042로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1042는 놀랍게도 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIb에 강하게 결합한다. 따라서, 위치 328에서 돌연변이가 FcγRIIb 단독에 대한 결합을 증가시키는 것으로 예상되었지만, 위치 328에서 돌연변이의 첨가(G1042를 G994와 비교, 위치 233, 236, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 가짐)는 놀랍게도 FcγRIIa와 FcγRIIb 둘 다에 대한 강한 결합을 초래하였다.
점 돌연변이 P238D, D265G, S267E, H268F 및 S324T를 갖는 G045c 배경(서열번호 24) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1043으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 위치 238 및 265에서 돌연변이가 FcγRIIa 및 FcγRI에 대한 결합을 감소시키는 것으로 예상되었다는 사실에도 불구하고, G1043은 놀랍게도 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRI에 강하게 결합한다.
점 돌연변이 P238D, D265W, S267E, H268F 및 S324T를 갖는 G045c 배경(서열번호 25) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1046으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1046은 놀랍게도 FcγRI에 강하게 결합하고, 또한 FcγRIIa에 대한 결합을 증가시킨다. 이 결과는 위치 238에서 돌연변이가 FcγRIIa 결합보다는 FcγRIIb 결합을 증가시키는 것으로 예상되었기 때문에 놀라웠다.
위치 233, 234, 235, 267, 268, 297, 324 및 328에서의 점 돌연변이, 및 위치 236에서 아미노산의 결실을 갖는 G045c 배경 상의 스트라도머(서열번호 26)는 본 명세서에서 G1050으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1050은 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 강하게 결합한다. 놀랍게도, 저 친화도 FcγRII에 대한 결합은 유지된 반면, 고친화도 FcγRI에 대한 결합은 상실되었다.
점 돌연변이 P238D, S267E, H268F 및 S324T를 갖는 G045c 배경(서열번호 27) 상의 스트라도머는 본 명세서에서 G1025로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1025는 놀랍게도 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIb에 강하게 결합한다. 이 결과는 위치 238에서 돌연변이가 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대한 결합을 감소시키는 것으로 예상될 뿐만 아니라 FcγRIIIa에 대한 결합이 감소되었기 때문에, 놀랍다. 훨씬 더 놀랍게는, 동일한 세트의 돌연변이가 C-말단에 연결된 GL-2045 스트라도머와 반대로 N-연결된 다량체화 도메인(G1024)을 갖는 스트라도머 상에서 이루어질 때, 이 상보체 우선적 결합은 완전히 없어진다. 이는 또한 다량체화 스트라도머와 관련하여 이들 돌연변이의 예측 불가능한 특성을 강조한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 019의 골격을 갖고(IgG2 힌지 - IgG1 힌지 - IgG1 CH2 IgG1 CH3, 아미노로부터 카복시 말단까지) Fc 도메인에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 스트라도머를 제공한다. 위치 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 얻어진 스트라도머(서열번호 17)는 본 명세서에서 G1003으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1003은 놀랍게도 모 스트라도머가 최소 C1q 결합을 나타내고 CDC 저해 없음을 나타낸다는 사실에도 불구하고, 수용체와의 아비디티 기반 상소작용을 가능하게 하는 더 고차의 다량체를 형성하는 모 화합물 G019과 상관없이, C1q에 대한 결합 및 CDC의 강한 저해를 나타내었다.
점 돌연변이 위치 267, 268, 324 및 328에서의 점 돌연변이를 갖는 G019 배경 상의 스트라도머(서열번호 64)는 본 명세서에서 G1049로 지칭된다. 일부 실시형태에서, G1049는 놀랍게도 상보체 저해 및 C1q 결합 활성과 함께 모든 정규 FcγR에 대해 강한 결합을 나타낸다.
놀라운 발견에서, 본 발명자들은 단클론성 항체에 대한 증가된 상보체 친화도로서 기재된 특정 Fc 돌연변이가 FcγRIIb에 대한 인식 가능한 결합이 없는 다량체화 스트라도머의 Fc 영역에 첨가될 때, 얻어진 화합물이 FcγRIIb에 대한 결합을 되찾는다는 것을 발견하였다. 예를 들어, S267E, H268F 및 S324T 돌연변이의 결여를 제외하고 동일한 돌연변이를 갖는 대응하는 스트라도머가 아비드 FcγRIIb 결합을 나타내지 않는다는 사실에도 불구하고, G994, G996 및 G998은 각각 FcγRIIb에 때때로 탐욕스럽게 결합한다.
추가적인 스트라도머는 상보체-우선적 스트라도머 G994 및 G998 중 하나에 기반하여 생성되었다. G994로부터 유래된 스트라도머의 제1 세트에서, G994 돌연변이 E233P, H268F 및 S324T는 유지되며, 위치 267은 야생형(세린)이고, 다양한 돌연변이가 위치 236에서(알기닌(G994에서와 같음), 또는 아르기닌과 유사한 아미노산에서) 이루어졌다. 이들 스트라도머는 G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105 및 G1106으로 지칭되었다. 이들 스트라도머가 FcγR 및 상보체 C1q에 결합한 정도는 극적으로 그리고 예상치 못하게 변하였는데, 이는 G994 스트라도머와 관련하여 위치 236에서 돌연변이가 예측 불가능한 효과를 가진다는 것을 나타낸다. G994로부터 유래된 스트라도머의 제2 세트에서, G994 돌연변이 E233P, H268F 및 S324T는 유지되었고, 위치 236은 야생형(글리신)이며, 다양한 돌연변이가 위치 267에서(글루탐산(G994에서와 같음), 또는 글루탐산과 유사한 아미노산 중 하나에서) 이루어졌다. 이들 스트라도머는 G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109 및 G1084로 지칭된다. 또한, 스트라도머가 FcγR 및 상보체 C1q에 결합된 정도는 극적으로 그리고 예측 불가능하게 변하는데, 이는 위치 236과 같이, G994 스트라도머와 관련하여 위치 267에서의 돌연변이가 예측 불가능한 효과를 가진다는 것을 나타낸다. G994-기반 스트라도머의 다음 세트에서, 위치 236 및 267에서 돌연변이의 조합을 시험하였고, G1110, G1111, G1112, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130 및 G1131로 지칭된다. 이들 스트라도머의 FcγR 및 상보체 결합 프로파일은 또한 예측 불가능하였다.
G998의 유도체가 또한 제조되고, 시험되었다. G998 유도체의 제1 세트에서, G998 돌연변이 H268F 및 S324T는 유지되었고, 위치 267은 야생형(세린)이거나 또는 세린과 유사한 아미노산으로 돌연변이되었고, 위치 299에서 돌연변이가 첨가되었다(T299A). 이들 화합물은 G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1107, G1093 및 G1095로 지칭되었다. T299A 돌연변이는 탈글리코실화 부위를 파괴하도록 설계되었다. 이 돌연변이가 FcγR 결합을 감소시킨 정도는 스트라도머 구조 및 다른 돌연변이에 대해 예측 불가능하였다. 추가로, G998의 H268F, S324T 및 N297A(비글리코실화에 대해) 돌연변이를 갖는 G998의 유도체가(그러나 위치 267에서 상이한 돌연변이) 생성되었다. 이들 화합물은 G1069, G1070, G1132, G1074 및 G1075로 지칭되며, 또한 예측 불가능한 FcγR 및 상보체 결합 프로파일을 나타내었다. 두드러지게는, 이 그룹의 화합물 중 하나 만이(G1069) 상보체 결합을 유지한 한편, FcγR 결합을 제거하였다. 따라서 이 화합물은 상보체-우선적 스트라도머였다.
일부 실시형태에서, G994, G998, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 또는 다른 상보체-우선적 다량체화 스트라도머는 급성 병태, 예를 들어, 급성 용혈(예를 들어, 신생아의 용혈병에서), 자가면역성 용혈성 빈혈, 약물 유발 용혈성 빈혈, 후천성 용혈성 빈혈, 수혈 반응 / 동종면역 용혈성 빈혈, 감염 용혈성 빈혈(예를 들어, 박테리아를 포함하는 진드기 매개 질환과 관련된 것(라임병, 티푸스, 록키산 홍반열, 야토병, 엘리히증), 바이러스(수막뇌염 및 출혈열), 및 원생동물(바베시아 감염증) 진드기 매개 질환; 또는 흑수열, 뎅기열 치군군야, 지카 또는 에볼라 바이러스를 포함하는 모기 매개 질환, 예컨대 말라리아와 관련된 것), 독소-관련 용혈성 빈혈(예를 들어, 뱀독, 독성 화학물질 또는 진드기 독소로부터 유래), 악성 고혈압, 화상 또는 라이 증후군을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, G998, G994, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 상보체 우선적 다량체화 스트라도머는 정맥내 투여를 통해 이것이 필요한 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, G998, G994, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 상보체 우선적 다량체화 스트라도머는 만성 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여된다. 만성 질환 및 병태는, 예를 들어, 신장 병태, 황반변성, 만성 용혈(예를 들어, 발작성 야간혈색소뇨증), 기계적 용혈(예를 들어, 인공 심장 판막, 인공 심폐기, 또는 혈관 내에서 사용되는 장치, 셀로판막을 이용하거나 또는 셀로판막이 없는 혈액 투석, 전자간증 또는 자간, 또는 혈전증 혈소판 감소성 자반병으로부터 유래), 유전성 구상 적혈구증, 타원적혈구증, 초성포도산염 키나제 결핍증, G6PD 결핍증, 겸상 적혈구 빈혈, 지중해 빈혈, 유전 구형 빈혈, 용혈성 요독 증후군, 상보체 소모가 있는 면역 복합체 장애(예를 들어, B형 간염, C형 간염, 혼합 한량 글로불린혈증, 나종형나병, 및 균혈증 쇼크), 원발성 담즙성 간경변, 셀리악병, 다발성 골수종, 및 두드러기성 혈관염을 포함한다. 일부 실시형태에서, G994는 피하 투여를 통해 이들이 필요한 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, G998, G994, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 상보체 우선적 다량체화 스트라도머는 신장 병태를 갖는 대상체에게 투여된다. 신장 병태는 막성 증식성 사구체 신염, 사구체간질 증식성 사구체 신염, 특발성 증식성 사구체 신염, 국소 경화성 사구체 신염, 국소 분절성 사구체경화증, 박사구체 기저막 질환, 신장염, 낭창성 신염, 원섬유성 사구체 신염, 이뮤노탁토이드(immunotactoid) 사구체 신염,　브라이트병, 버거스씨병/IgA 신장병증, 신경화증, 신장증, 신증후군, 막성 신증, 막성 신장염, 감염후 사구체 신염, 요세관괴사, 약물 유발성 신독성, 및 굿페스쳐 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명자들은 개개의 스트라도머가 천연 Fc 도메인 서열을 갖는 모 스트라도머에 비해 FcγR에 대해 강한 C1q 결합 및 감소된 결합을 나타냄으로써 상보체 우선적 활성을 나타내는 개개의 스트라도머가 생성될 수 있지만, C1q 결합에 대해 그리고 FcγR 결합에 대해 각각의 개개 스트라도머가 갖는 활성은 돌연변이가 단클론성 항체에서 갖는 효과에 기반하여 전체적으로 예측 불가능하다는 것을 발견하였다.
본 개시내용에 의해 포함된 예시적인 스트라도머의 아미노산 서열은 표 1에 제공된다. 돌연변이된 아미노산은 표에 나타낸다(회색으로 강조된 텍스트).
상보체-결합 단백질, 예컨대 단클론성 항체 에쿨리주맙(항-C5 항체)는 상보체-매개 질환에 대한 치료로서 상보체 경로를 차단하는 시도에서 당업계에서 사용되었다. 본 발명의 생체 모방체는 특정 Fc 도메인 돌연변이를 통해 상보체 성분, 예를 들어, C1q에 대해 증가된 결합을 달성한다. 예를 들어, 본 발명의 생체 모방체는 IgG1 Fc 도메인의 점 돌연변이 위치 267 및/또는 268 및/또는 324에서의 점 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 상보체-결합 생체 모방체는 본 발명의 종종 생체 모방체에 포함된 돌연변이를 기재하는 문헌에 의해 예측되지 않는 방법으로 야생형 IgG1 Fc 도메인에 비해 FcRn, FcγRI, FcγRII, 및/또는 FcγRIII에 대해 변경된 결합을 추가로 나타낸다. 따라서, 일 실시형태에서, 다량체화할 수 있고, 본 발명의 생체 모방체는 하나 이상의 정규 FcγR 및/또는 FcRn 결합에 대한 정상 비응집 면역글로불린에 비해 상보체 결합의 증가된 비를 나타내는 상보체-우선적 스트라도머이다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 다량체화할 수 있고, 정상 응집된 면역글로불린에 비해 하나 이상의 정규 FcγR 및/또는 FcRn 결합에 대한 상보체 결합의 증가된 비를 나타내는 상보체-우선적 스트라도머이다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 다량체화할 수 있고, Fc 도메인 내에 동일한 돌연변이를 포함하는 단클론성 항체에 비해 하나 이상의 정규 FcγR 및/또는 FcRn 결합에 대한 상보체 결합의 증가된 비를 나타내는 상보체-우선적 스트라도머이다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 천연 IgG, IVIG, 또는 모 스트라도머에 비해 변경된 반감기를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "FcγR" 및 Fcγ 수용체"는 Fc 감마 RI, RII 및 RIII 패밀리의 모든 구성원을 포함한다. Fcγ 수용체는 FcγRI(CD64); FcγRII(CD32) 및 그의 아이소타입 및 알로타입(allotype) FcγRIIa LR, FcγRIIa HR, FcγRIIb 및 FcγRIIc; FcγRIII(CD 16) 및 그의 아이소타입 FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 포함하지만, 인간에서 이들로 제한되지 않는 저친화도 및 고친화도 Fcγ 수용체를 포함한다. 당업자는 문헌[Davis, et al. (2004) "Differential B cell expression of mouse Fc receptor homologs," Int. Immunol., 16(9):1343-1353]에 기재된 것과 같은 FcγR 및 FcγR 상동체에 관해 본 명세서에 제공된 개시내용이 아직 발견되지 않았을 수도 있는 장래의 FcγR 및 관련된 아이소타입 및 알로타입에 적용될 것임을 인식할 것이다.
특이적 결합은 일반적으로 결합 분석에서 후속적인 과량의 비표지 리간드에 의해 옮길 수 있는 표지 리간드의 양으로서 정의된다. 그러나, 이는 당업계에 잘 확립된 특이적 결합을 평가하는 다른 수단을 제외하지 않는다(예를 들어, Mendel CM, Mendel DB, 'Non-specific' binding. The problem, and a solution. Biochem J. 1985 May 15;228(l):269-72). 특이적 결합은 면역학적으로 활성인 생체 모방체의 결합 상수와 해리 상수를 둘 다 특성규명하기 위해 당업계에 잘 알려진 다양한 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기법(비아코어(BIACORE)(등록상표)를 통해 상업적으로 입수 가능) 또는 생물학적 보호막 간섭측정법(포르테바이오(ForteBio)(등록상표)를 통해 상업적으로 입수 가능)으로 측정될 수 있다(Asian K, Lakowicz JR, Geddes C. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:538-544).
"응집된 천연 IgG의 면역학적 활성"은 IgG 응집물에 대한 면역계의 노출 시 면역계의 기능에 영향을 미치는 다량체화된 IgG의 특성을 지칭한다. 천연 다량체화된 IgG의 특이적 특성은 FcγR에 대한 변경된 특이적 결합, 면역 세포 표면 상에서 FcγR의 가교, 또는 다량체화된 IgG의 효과기 기능, 예컨대 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 식균작용(ADCP) 또는 상보체 고정을 포함한다(예를 들어, 문헌[Nimmerjahn F, Ravetch JV. The anti-inflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 2007; 204:11-15; Augener W, Friedman B, Brittinger G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) Blut. 1985;50:249-252; Arase N, Arase H, Park SY, Ohno H, Ra C, Saito T. Association with FcRgamma is essential for activation signal through NKR-Pl (CD161) in natural killer (NK) cells and NKl.1+ T cells. J Exp Med. 1997;186:1957-1963; Teeling JL, Jansen- Hendriks T, Kuijpers TW, et al. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood. 2001;98: 1095-1099; Anderson CF, Mosser DM. Cutting edge: biasing immune responses by directing antigen to macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 2002; 168:3697-3701; Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for FcγR: current models. Immunology Letters. 2002;82:57; Banki Z, Kacani L, Mullauer B, et al. Cross-Linking of CD32 Induces Maturation of Human Monocyte - Derived Dendritic Cells Via NF- {kappa} B Signaling Pathway. J Immunol. 2003;170:3963-3970; Siragam V, Brine D, Crow AR, Song S, Freedman J, Lazarus AH. Can antibodies with specificity for soluble antigens mimic the therapeutic effects of intravenous IgG in the treatment of autoimmune disease? J Clin Invest. 2005;l 15:155-160] 참조). 이들 특성은 일반적으로 동종이량체 IgG의 특성에 대한 비교에 의해 평가된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 반응을 변경함에 있어서 더 고차 다량체가 효과적인 것으로 발견되었지만, 동종이량체는 또한 효과적인 면역 조절제였다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 동종이량체는 시간에 따라 더 고차 다량체의 아비드 결합을 조절하고, 시험관내에서 더 고차의 다량체를 형성할 수 있는 것으로 여겨진다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 또한 본 발명의 다량체는 결합된 표적으로부터 서서히 해리되고, 해당 표적을 발현시키는 면역 세포에서 내재화되어 장기간 동안 또는 가능하게는 영원히 해당 면역 세포의 활성화 상태 또는 성숙 속도를 가능하게 변경시키는 것으로 여겨진다. 본 명세서에 기재된 다량체화 실험은 동종이량체의 다른 순수한 집단이 저수준의 혈액 또는 소태아 혈청의 존재 하에 다량체화할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 면역 반응을 조절함에 있어서 더 고차의 다량체는 동종이량체 분획보다 더 효과적이지만, 본 발명의 자연적으로 연결된 스트라도머의 동종이량체 분획은 또한 저수준의 혈액 또는 혈청의 존재 하에서 부분적으로 동종이량체의 다량체화를 통해 효과적인 면역 조절제일 수 있다. 따라서, "더 고차의 다량체"는 대상체에 주사 전에 용액 중에서 형성된 동종이량체 이상의 다량체뿐만 아니라 시험관내에서 형성된 동종이량체 이상의 다량체를 의미한다.
"면역 조절 활성", "면역 반응을 조절하는", "면역계를 조절하는" 및 "면역 조절"은 그의 세포 유형 내에서 또는 다른 세포 유형으로 세포 유형의 성숙을 포함하는, 하나 이상의 세포의 활성, 능력 및 상대적 수를 변화시킴으로써 면역계를 변경시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 면역 조절은 면역 반응의 억제 또는 활성화일 수 있다. 예를 들어, 일 양상에서, 면역 조절은 T 세포 또는 B 세포에서 비반응 또는 관용(tolerance)의 유도를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "관용"은 T 세포 또는 B 세포에서의 상태 또는 전체로서 면역 반응에서의 상태를 지칭하되, T 세포 또는 B 세포 또는 다른 면역 세포는 그의 동족 항원에 또는 그것이 정상적으로 반응하는 항원, 에피토프 또는 다른 신호에 반응하지 않는다. 다른 예로서, 기억 B 세포의 면역 조절은 특정 항체의 생성에서 수반되는 감소와 함께 특정 기억 B 세포의 선택적 세포자멸사를 야기할 수 있다. 다른 예로서, 면역 조절 활성은 자가면역 질환에서 통상적으로 상승되는 전염증 사이토카인 또는 사이토카인, 예컨대 IL-6 및 IL-8의 감소를 야기할 수 있다. 다른 예로서, 면역 조절 활성은 TGF-베타의 후속적 분비 및 절단과 함께 NKT 세포의 활성화를 야기할 수 있다. 수용체 활성화를 막기 위해 면역 세포 수용체를 차단하는 것은 또한 "면역 조절" 내에 포함되며, 별개로 "저해 면역 조절"로서 지칭될 수 있다. 다른 양상에서, 면역 조절은 면역 반응의 향상 또는 활성화일 수 있다. 예를 들어, 면역 조절은 T 세포 또는 B 세포의 활성화를 의미할 수 있다. 다른 예로서, 미숙 단핵구의 면역 조절은 더 성숙한 단핵구, 수지상 세포, 대식세포 또는 파골세포의 더 큰 지비단을 야기할 수 있는데, 이들 모두는 미숙 단핵구로부터 유래된다. 다른 예로서, NK 세포의 면역 조절은 향상된 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 야기할 수 있다. 다른 예로서, 면역 조절 활성은 달리 고수준으로 발현되지 않을 수도 있는 표현형을 갖는 세포, 예컨대 CD8β+/CD11c+ 세포의 증가된 집단을 야기할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포 수용체는 면역학적으로 활성인 생체 모방체에 의해 결합될 수 있고, "활성화 면역 조절"로서 별도로 지칭되는 다양한 면역 세포 변화를 유도하기 위해 세포내 신호전달을 활성화시킬 수 있다.
수지상 세포의 조절은, 예를 들어 수지상 세포의 표면 상에서 CD86 및/또는 CD1a의 발현의 유도에 의해 T 세포에 대한 항원 항원 제시를 촉진시키거나 또는 저해할 수 있다. CD1a는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포의 표면 상에서 발현된 MHC-클래스 I-관련 당단백질이다. CD1a는 T 세포에 대한 지질 항원의 제시에 수반된다. CD86은 또한 항원 제시 세포의 표면 상에서 발현되고, T 세포에 대한 공동자극을 제공한다. CD86은 각각 활성화 및 저해 신호를 보내기 위한 T 세포의 표면 상에서 CD28과 CTLA-4 둘 다에 대한 리간드이다. 따라서, CD86 및 그의 동족 수용체읠 발현 수준은 관용 또는 특정 면역 반응이 유도될 지의 여부를 결정한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 스트라도머는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포의 표면 상에서 CD86 및 CD1a의 발현을 부분적으로 유도함으로써 면역 반응을 조절할 수 있다. 일 실시형태에서, 조절된 수지상 세포는 항원-특이적 스트라도머의 항원에 특이적인 면역 세포와 상호작용한다.
단핵구의 성숙 조절은 단핵구의 성숙 DC, 대식세포 또는 파골세포로의 분화를 지칭한다. 분화는 성숙의 속도 또는 방향을 가속화시키기 위해 그리고/또는 분화를 겪는 단핵구의 수를 증가시키기 위해 조절될 수 있다. 대안적으로, 분화는 분화 속도 및/또는 분화를 겪는 세포의 수에 대해 감소될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단리된" 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 천연 유래 상대가 없거나 또는, 예를 들어 조직, 예컨대 췌장, 간, 비장, 난소, 고환, 근육, 관절 조직, 신경 조직, 위장 조직 또는 유방 조직 또는 종양 조직(예를 들어 유방암 조직) 또는 체액, 예컨대 혈액, 혈청 또는 소변에서 그것을 자연적으로 수반하는 성분으로부터 분리 또는 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 그것과 자연적으로 관련된 단백질 및 다른 천연 유래 유기 분자가 없이 건조 중량으로 적어도 70%일때 "단리된" 것으로 고려된다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드(또는 펩타이드)의 제조는 본 발명의 폴리펩타이드(펩타이드)의 건조 중량으로 각각 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 화학적으로 합성된 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 그의 특성에 의해 그것을 자연적으로 수반하는 성분으로부터 분리되고, 합성 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 "단리된다".
본 발명의 단리된 폴리펩타이드(또는 펩타이드)는, 예를 들어, 천연 공급원으로부터(예를 들어 조직 또는 체액으로부터) 추출에 의해; 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 자연적으로 유래되는 공급원과 상이한 세포계에서 생성된 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 "단리"되는데, 필연적으로 그것을 자연적으로 수반하는 성분이 없을 것이기 때문이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 IgG1 Fc 단량체 및 IgG2 힌지 다량체화 도메인(서열번호 4), 아이소류신 다량체화 도메인(서열번호 5) 또는 GPP 다량체화 도메인(서열번호 6)에 대응하는 서열만을 함유하며, 클로닝 또는 단백질의 정제에 도움을 줄 수 있는 추가적인 서열(즉, 도입된 제한 효소 인식 부위 또는 정제 태그)은 함유하지 않는다. 단리 정도 또는 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 스트라도머 조성물의 투여는 임의의 통상적인 경로를 통해, 경구, 비경구 또는 국소일 것이다. 예시적인 경로는 경구, 비강, 협측, 직장, 질, 안구, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 동맥내, 종양내, 척추, 초내, 관절내, 동맥내, 지주막하, 설하, 경구 점막, 기관지, 림프, 자궁내, 피하, 종양내, 이식 가능한 장치 상에서 통합, 예컨대 봉합 또는 이식 가능하 장치 내, 예컨대 이식 가능한 중합체, 경막내, 피질내 또는 진피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 조성물로서 정상적으로 투여된다. 바람직한 실시형태에서, 단리된 스트라도머는 정맥내 또는 피하로 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본 발명의 벡터 또는 세포에 부적합하다는 것을 제외하고, 치료적 조성물에서 그의 사용이 상정된다. 보충적 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
본 발명의 스트라도머 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산부가 염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성)을 포함하고, 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성될 수 있다. 유리 카복실기에 의해 형성된 염은 또한 무기염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철, 및 유기 염기, 예컨대 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요하다면 상기 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 스트라도머를 혼입한 다음에, 멸균 여과에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 멸균 주사용 용액은 근육내, 피하 또는 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적으로 하는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.
추가로, 일 실시형태는 경구 투여에 적합한 스트라도머 조성물이며, 비활성 희석제와 함께 또는 비활성 희석제 없이 약제학적으로 허용 가능한 담체에서 제공된다. 담체는 동화 가능하거나 또는 식용이어야 하고, 액체, 반고체, 즉, 페이스트 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수용인에게 또는 그 안에 함유된 스트라도머 제제의 치료적 유효성에 대해 해로운 경우를 제외하고, 본 발명의 방법을 실행함에 있어서 사용하기 위한 경구 투여 가능한 스트라도머 조성물에서 그의 사용은 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수, 용액, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 필터 등 또는 이들의 조합물을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "경구 투여"는 경구, 협측, 장 또는 위내 투여를 포함한다.
일 실시형태에서, 스트라도머 조성물은 임의의 편리한 그리고 실행적인 방식으로, 즉, 용액, 현탁액, 에멀전화, 혼합, 캡슐화, 마이크로캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이러한 절차는 당업자에 대해 일상적이다.
특정 실시형태에서, 분말 형태로 스트라도머 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 조합되거나 또는 철저히 혼합된다. 혼합은 임의의 편리한 방식, 예컨대 분쇄로 수행될 수 있다. 안정제는 또한 위 내에서의 변성을 통한 치료적 활성의 상실로부터 조성물을 보호하기 위해 혼합 과정에 첨가될 수 있다. 경구 투여 가능한 조성물 중에서 사용하기 위한 안정제의 예는 완충제, 위산의 분비에 대한 길항제, 아밈노산, 예컨대 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예컨대 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 솔비톨, 만니톨 등, 단백질 분해 효소 저해제 등을 포함한다. 더 바람직하게는, 경투 투여 조성물에 대해, 안정제는 또한 위산의 분비에 대한 길항제를 포함할 수 있다.
추가로, 반고체 또는 고체 담체와 조합되는 경구 투여를 위한 스트라도머 조성물은 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐, 정제 또는 알약으로 추가로 제형화될 수 있다. 더 바람직하게는, 젤라틴 캡슐, 정제 또는 알약은 장용 코팅된다. 장용 코팅은 pH가 산성인 위 또는 상부 장에서 조성물의 변성을 방지한다. 즉, 미국 특허 제5,629,001호 참조. 소장에 도달 시, 그 안의 염기성 pH는 코팅을 용해시키며, 조성물이 장 세포, 예를 들어 파이어반 M 세포(Peyer's patch M cells)와 상호작용하도록 방출되게 한다.
다른 실시형태에서, 분말 형태로 스트라도머 조성물은 면역학적으로 활성인 생체 모방체를 캡슐화하거나 또는 면역학적으로 활성인 생체 모방체가 부착된 나노입자를 생성하는 물질과 조합되거나 또는 혼합된다. 각각의 나노입자는 100 마이크론 이하의 크기를 가질 것이다. 나노입자는 다르게는 경구로 생체 이용가능하지 않은 면역학적으로 활성인 생체 모방체의 위장 흡수를 허용하는 점막부착 특성을 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, 분말 조성물은 안정제와 함께 또는 안정제 없이 액체 담체, 예컨대, 즉, 물 또는 식염수 용액과 조합된다.
사용될 수 있는 특정 스트라도머 제형은 완충제의 조성이 다음과 같은 경우에 칼륨이 없는 저장성 인산염계 완충제 중의 면역학적으로 활성인 생체 모방체 단백질 용액이다: 6mM 인산나트륨 일염기성 1수화물, 9mM 인산나트륨 이염기성 6수화물, 50mM 염화나트륨, pH 7.0 +/- 0.1. 저장성 완충제 중의 면역학적으로 활성인 생체모방 단백질의 농도는 10 마이크로그램/㎖ 내지 100 밀리그램/㎖의 범위일 수 있다. 이 제형은 임의의 투여 경로를 통해, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 정맥내 투여를 통해 투여될 수 있다.
추가로, 반고체 담체와 조합되는 국소 투여를 위한 스트라도머 조성물은 크림 또는 겔 연고로 추가로 제형화될 수 있다. 겔 연구의 형성을 위한 바람직한 담체는 겔 중합체이다. 본 발명의 겔 조성물을 제조하기 위해 사용되는 바람직한 중합체는 카보폴, 카복시메틸-셀룰로스 및 플루로닉 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구체적으로는, 분말 Fc 다량체 조성물은 질환의 치료를 위해 피부에 또는 피부 아래에 적용하기 위한 0.5% 내지 5% 중량/용적의 강도로 중합 제제, 예컨대 카보폴 980을 함유하는 수성겔과 조합된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "국소 투여"는 진피, 상피, 피하 또는 점막면에 대한 적용을 포함한다.
추가로, 스트라도머 조성물은 피하 또는 피하 이식을 위해 중합체로 제형화될 수 있다. 이식 가능한 약물 주입 중합체에 대하나 바람직한 제형은 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 제제이며, 예를 들어, 가교 덱스트린(Samantha Hart, Master of Science Thesis, "Elution of Antibiotics from a Novel Cross-Linked 덱스트란 Gel: Quantification" Virginia Polytechnic Institute and State University, June 8, 2009) 덱스트란-티라민(Jin, et al. (2010) Tissue Eng. Part A. 16(8):2429-40), 덱스트란-폴리에틸렌 글리콜(Jukes, et al. (2010) Tissue Eng. Part A., 16(2):565-73), 또는 덱스트란-글루테르알데하이드(Brondsted, et al. (1998) J. Controlled Release, 53:7-13)를 포함할 수 있다. 당업자는 중합체 또는 하이드로겔 내에서 고종된 스트라도머를 혼입시키고 기공 크기를 목적으로 하는 직경으로 제어하여 다수의 유사한 중합체 및 하이드로겔이 형성될 수 있게 하는 방법을 알 것이다.
제형화 시, 용액은 투약 제형에 적합한 방식으로 그리고 증상의 개선 또는 치유를 초래하는 데 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 제형은 삼킬 수 있는 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 용이하게 투여된다. 투약량의 일부 변화는 치료 중인 대상체의 병태에 따라서 일어날 수 있다. 투여에 책임이 있는 사람은 아무튼 개개의 대상체에 대해 적절한 용량을 결정할 수 있다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제제는 생물학 평가 및 연구 표준을 위한 FDA 센터(FDA Center for Biologics Evaluation and Research standards)에 의해 요구되는 멸균, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시킨다.
투여 경로는 치료 중인 질환의 위치 및 특성에 따라 자연적으로 다를 것이며, 예를 들어 피내, 경피, 피하, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경피, 기관내, 복강내, 점막내, 관류, 세척, 직접 주사 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 스트라도머는 정맥내, 피하, 경구, 복강내, 설하, 협측, 경피, 직장내, 피하 이식 또는 근육내로 투여된다. 특정 실시형태에서, 스트라도머는 정맥내, 피하 또는 근육내로 투여된다. 일 실시형태에서, 스트라도머는 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 1000㎎/㎏의 용량으로 투여된다. 추가 실시형태에서, 스트라도머는 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏으로 투여된다. 또한 추가 실시형태에서, 스트라도머는 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏으로 투여된다. 또한 추가 실시형태에서, 스트라도머는 약 1㎎/㎏ 내지 약 25㎎/㎏으로 투여된다. 또한 추가 실시형태에서, 스트라도머는 약 5㎎/㎏ 내지 약 15㎎/㎏으로 투여된다. 스트라도머는 1일마다, 1주마다, 2주마다 또는 1개월마다 적어도 1회로 투여될 수 있다. 2상 투약 요법이 사용될 수 있되, 제1 투약 상은 제2 투약 상의 약 0.1% 내지 약 300%를 포함한다.
추가 실시형태에서, 스트라도머는 1종 이상의 추가적인 약제학적 제제 및/또는 치료적 제제의 투여 전에, 동안에 또는 후에 투여된다. 추가적인 실시형태에서, 추가적이니 약제학적 활성제는 스테로이드; 생물학적 항-자가면역 약물, 예컨대 단클론성 항체, 융합 단백질 또는 항-사이토카인; 비생물학적 항-자가면역 약물; 면역억제제; 항생제; 및 항-바이러스제; 사이토카인; 또는 다르게 면역 조절제로서 작용할 수 있는 제제를 포함한다. 또한 추가 실시형태에서, 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 코티손, 덱사메타손, 모메타손 테스토스테론, 에스트로겐, 옥산드롤론, 플루티카손, 부데소나이드, 베클라메타손, 알부테롤 또는 레발부테롤이다. 또한 추가 실시형태에서, 단클론성 항체는 에쿨리주맙, 인플릭시맙, 아달리무맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 골리무맙, 오파투무맙, LY2127399, 벨리무맙, 벨투주맙, 메폴리주맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 디누툭시맙, 세쿠키누맙, 에볼로쿠맙, 블리나투모맙, 펨브롤리주맙, 라무시루맙, 베돌리주맙, 실툭시맙, 오비누투주맙, 아도트라스투주맙, 락시바쿠맙, 퍼투주맙, 브렌툭시맙, 이플리루무맙, 데노수맙, 카나키누맙, 우스테키누맙, 카투막소맙, 라니비주맙, 파니투무맙, 나탈리주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 에팔리주맙, 오말리주맙, 토이투모맙-I131, 알렘투주맙, 겜투주맙, 트라스투주맙, 팔비주맙, 바실릭수맙, 다클리주맙, 아브식시맙, 무로노노맙 또는 세르톨리주맙이다. 또한 추가 실시형태에서, 융합 단백질은 에타네르셉트 또는 아바타셉트이다. 또한 추가 실시형태에서, 항-사이토카인 생물제제는 아나킨라이다. 또한 추가 실시형태에서, 항-류마티스 비생물제제 약물은 사이클로포스파마이드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 하이드록시클로로퀸, 레플루노마이드, 미노사이클린, 유기 금 화합물, 포스타마티닙, 토파시티닙, 에토리콕십 또는 설파살라진이다. 또한 추가 실시형태에서, 면역억제제는 사이클로스포린 A, 타크롤리무스, 시롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 에베롤리무스, OKT3, 항흉선세포성 글로불린, 바실릭시맙, 다클리주무맙 또는 알렘투주맙이다. 또한 추가 실시형태에서, 스트라도머는 화학치료제의 투여 전에, 동안에 또는 후에 투여된다. 또한 추가 실시형태에서, 스트라도머 및 추가적인 치료제는 함께 투여될 때 치료적 상승효과를 나타낸다. 일 실시형태에서, 스트라도머는 추가적인 치료제의 투여 전에 투여된다. 다른 실시형태에서, 스트라도머는 추가적인 치료제의 투여와 동시에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 스트라도머는 추가적인 치료제에 의한 투여 후에 투여된다.
일 실시형태에서, 이식 가능한 장치에 공유적으로 고정된 스트라도머가 투여된다. 일 실시형태에서, 스트라도머는 봉합에 고정된다. 다른 실시형태에서, 스트라도머는 이식편 또는 스텐트에 고정된다. 다른 실시형태에서, 스트라도머는 심장 판막, 정형외과적 관절 치환술 또는 이식된 전자적 리드(electronic lead)에 고정된다. 다른 실시형태에서, 스트라도머는 이식 가능한 기질에 고정되고, 이식 가능한 기질 내에 함입된다. 바람직한 실시형태에서, 스트라도머는 이식 가능한 하이드로겔에 고정되고, 이식 가능한 하이드로겔 내에 함입된다. 일 실시형태에서, 하이드로겔은 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴산나트륨 또는 아크릴레이트 중합체를 포함한다. 추가 실시형태에서, 면역 세포의 유입이 고정된 스트라도머와 상호작용하고, 이어서 순환으로 되돌아 가기에 충분히 큰 기공 크기를 갖는 하이드로겔 내에서 고정된 스트라도머가 투여된다. 추가 실시형태에서, 하이드로겔의 기공 크기는 5 내지 50 마이크론이다. 바람직한 실시형태에서, 하이드로겔의 기공 크기는 25 내지 30 마이크론이다.
다른 실시형태에서, 스트라도머는 종 특이적 또는 키메라 스트라도머 분자를 이용하여 인간, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지), 마우스, 래트, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 페럿, 게르빌루스쥐, 기닉픽, 햄스터, 박쥐, 조류(예를 들어, 닭, 칠면조 및 오리), 어류 및 파충류를 치료하기 위해 투여된다. 다른 실시형태에서, 인간은 성인 또는 아동이다. 또 다른 실시형태에서, 스트라도머는 상보체-매개 질환을 예방하기 위해 투여된다. 추가 실시형태에서, 스트라도머는 반려 동물 및 가축에서 백신 관련 자가면역 병태를 예방하기 위해 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구 투여"는 장을 통한 흡수를 수반하는 일 없이 화합물이 대상체에게 흡수되는 임의의 투여 형태를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 예시적인 비경구 투여는 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 안구내, 비강 또는 관절내를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
추가로, 본 발명의 스트라도머는 선택적으로 다른 약제학적 제제 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 놀랍게도 본 발명의 스트라도머 및 프레드니솔론의 동시 투여는 스트라도머 조성물 또는 프레드니솔론 단독 중 하나에 의해 관찰된 것보다 상승적으로 더 우수한 결과를 달성한다는 것을 발견하였다(WO 2012/016073).
이하는 특정 예시적 질환에 대해 나타낸 바와 같은 다양한 약제학적 제형 범주 및 바람직한 투여 경로의 구체적 예이다:
협측 또는 설하 용해성 정제: 앙기나, 결절성 다발동맥염.
정맥내, 근육내 또는 피하: 중증 근무력증, 용혈성 요독 증후군(HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 막성 신증, 시신경 척수염, 동종이식편의 항체-매개 거부반응, 막성 증식성 사구체 신염(MPGN), 낭창성 신염, 특발성 혈소판 감소성 자반병병, 파라단백혈증 IgM 탈수초성 다발성 신경병증, 괴사성 근막염, 천포창, 괴저, 피부근육염, 육아종, 림프종, 패혈증, 재생불량성 빈혈, 다발성 장기 부전, 다발성 골수종 및 미결정의 단클론 감마병증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증, 염증성 근병증, 혈전증 혈소판 감소성 자반병, 근육염, 빈혈, 신생물 형성, 용혈성 빈혈, 뇌염, 척수염, 인간 T-세포 림프친화 바이러스-1과 특히 관련된 척수병증, 백혈병, 다발성경화증 및 시신경염, 천식, 상피 괴사 용해, 람베르트 이튼 근무력 증후군, 중증 근무력증, 신경병증, 포도막염, 길랑-바레 증후군, 이식편대 숙주질환, 근강직 증후군, 항-Yo 항체에 의한 방종양성 소뇌 변성, 방종양성 뇌 척수염 및 항-Hu 항체에 의한 감각 신경병증, 전신 혈관염, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 당뇨병성 신경병증, 급성 특발성 자율신경병증, 보그트-고야나기 하라다 증후군, 다초점 운동 신경병증, 항-/GMl과 관련된 아래운동 신경원증후군, 탈수, 막성증식성 사구체 신염, 심근증, 가와사키병, 류마티스성 관절염, 및 에반 증후군 IM - ITP, CIDP, MS, 피부근육염, 중증 근무력증, 근육성 이영양증. 본 명세서에서 사용되는 용어 "정맥내 투여"는 정맥내 주사 또는 주입을 통해 전신 순환으로 본 발명의 화합물 또는 조성물을 전달하는 모든 기법을 포함한다.
진피 겔, 로션, 크림 또는 패치: 백반증, 대상포진, 여드름, 구순염.
직장 좌약, 겔 또는 주입: 궤양성 대장염, 치질성 염증.
알약, 트로키, 캡슐로서 또는 장용 코팅에 의한 경구: 크론병, 셀리악 스프루(celiac sprue), 과민성 장 증후군, 염증성 간 질환, 바렛 식도.
피층내: 뇌전증, 알츠하이머병, 다발성경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병.
복강내 주입 또는 이식물: 자궁내막증.
질내 겔 또는 좌약: 박테리아, 백선균 또는 진균 질염.
의료 장치: 관상동맥 스텐트, 보철 관절 상에 코팅.
상보체-우선적 스트라도머의 치료적 적용
일 실시형태에서, 상보체-매개 질환 또는 병태의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 IgG1 Fc 도메인 및 다량체화 도메인을 포함하는 스트라도머를 투여하는 단계를 포함하는 상보체-매개 질환 또는 병태와 같은 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법이 제공되되, 스트라도머는 Fc 수용체 결합에 대한 상보체 결합의 증가된 비를 나타낸다. 추가 실시형태에서, 스트라도머는 FcγR에 대해 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타내고/내거나 FcRn 결합에 대해 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타내며, 상보체에 대한 향상된 또는 우선적인 결합을 나타낸다. 추가 실시형태에서, 스트라도머는 C1q에 대해 향상된 또는 우선적인 결합을 나타낸다.
합리적 설계 및 시험관내 또는 생체내 검증에 기반하여, 본 발명의 스트라도머는 염증 질환 및 장애, 특히 상보체-매개 질환 및 장애를 치료하기 위해서뿐만 아니라; 알레르기, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 및 염증 질환에 대해 생체면역요법과 같은 다양한 다른 내용에서 면역 기능을 변경시키기 위한 중요한 생물 약제로서 작용할 것이다. 본 명세서에 개시된 면역학적으로 활성인 상보체-우선적 생체 모방체에 의한 치료에 적합한 의학적 병태는 증가된 또는 부적절한 상보체 활성을 포함하는 상보체 활성화 또는 상보체-매개 효과기 기능에 의해 야기되거나 또는 관련된 임의의 질환을 포함한다. 이러한 의학적 병태는 상보체 결합 약물, 예컨대 에쿨리주맙에 의해 현재 또는 이전에 치료된 것을 포함한다. 에쿨리주맙은 상보체 단백질 C5(고전적 상보체 경로에서 C1 및 C1q 하류의 상보체 단백질)에 결합하여, 그의 절단 및 후속적 상보체 매개 세포 용해를 저해한다. 본 발명의 생체 모방체는 당업계에 공지된 다른 상보체 결합 약물에 대한 안전하고 효과적인 대안을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 생체 모방체는 고전적 상보체 경로의 C1 복합체 내 첫 번째 서브유닛인 C1q에 결합한다. 면역학적으로 활성인 상보체-우선적 생체 모방체에 의한 치료에 적합한 의학적 병태는 중증 근무력증, 용혈성 요독 증후군(HUS), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 시신경 척수염, 동종이식편의 항체-매개 거부반응, 황반변성, 겸상 적혈구병 및 막성 증식성 사구체 신염(MPGN)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 면역학적으로 활성인 상보체-우선적 생체 모방체에 의한 치료에 적합한 추가적인 의학적 병태는 hIVIG를 포함하는 광범위 면역 억제성 요법에 의해 현재 일상적으로 치료되는 것 또는 hIVIG가 임상적으로 유용한 것으로 발견된 것, 예컨대 자가면역 혈구감소증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 길랑 바레 증후군, 중증 근무력증, 항-인자 VIII 자가면역 질환, 피부근육염, 혈관염 및 포도막염(문헌[F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, G1123 (1992); P. Gajdos et al, Lancet i, 406 (1984); Y. Sultan, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas et al., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993); D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000)] 참조) 및 단클론성 항체가 사용될 수 있거나 또는 이미 임상 사용 중인 해당 암 또는 염증 질환 병태를 포함한다. 본 발명의 대상인 화합물에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 것에 포함되는 병태는 사이토카인 네트워크 불균형에 의한 염증 질환, 병원성 자가항체 또는 자가공격 T 세포에 의해 매개되는 자가면역 장애, 또는 만성 재발성 자가면역, 염증 또는 감염성 질환 또는 과정의 급성 또는 만성기를 포함한다.
추가로, 상보체를 수반하는 염증 성분을 갖는 다른 의학적 병태, 예컨대 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 심근경색증, 뇌졸중, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍증 바이러스 관련 염증, 부신백질 이영양증, 및 간질의 장애, 특히 라스머센 증후군, 웨스트 증후군 및 레녹스 가스토 증후군을 포함하는 바이러스 감염 후 뇌염과 관련되는 것으로 여겨지는 것은 스트라도머에 의한 치료가 유리할 것이다.
본 명세서에 기재된 단리된 스트라도머를 이용하는 요법에 대한 일반적 접근은 치료를 달성하기 위해 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 치료적 유효량의 단리된 면역학적으로 활성인 생체 모방체를 투여하는 것이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 사이토카인 네트워크에서 불균형을 갖는 염증 질환, 병원성 자가항체 또는 자가공격 T 세포에 의해 매개되는 자가면역 장애, 또는 만성 재발성 질환 또는 과정의 급성 또는 만성기로서 크게 범주화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상체가 질환 또는 병태에서 또는 질환 또는 병태의 증상의 개선을 갖도록, 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명의 스트라도머를 투여하는 것을 지칭한다. 개선은 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태 증상의 임의의 개선 또는 치료이다. 개선은 관찰 가능하거나 또는 측정 가능한 개선이거나, 또는 대상체의 웰빙의 일반적 느낌의 개선일 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질환 병태를 개선시킬 수 있지만, 질환에 대한 완전한 치유이지 않을 수도 있다는 것을 인식한다. 구체적으로, 대상체에서의 개선은 감소된 염증; 감소된 염증 실험적 마커, 예컨대 C-반응성 단백질; 자가면역 마커의 개선, 예컨대 자가항체 또는 혈수판 수, 백혈구 수 또는 적혈구 수, 감소된 발진 또는 자반, 쇠약의 감소, 무감각 또는 아린감, 고혈당증을 갖는 환자에서 증가된 글루코스 수준, 감소된 관절통, 염증, 부종 또는 저하, 경련 및 설사 빈도 및 양의 감소, 감소된 앙기나, 감소된 조직 염증, 또는 발작 빈도의 감소 중 하나 이상에 의해 증명되는 감소된 자가면역; 암 종양 부담의 감소, 종양 진행에 대한 증가된 시간, 감소된 암 통증, 증가된 생존 또는 삶의 질의 개선; 또는 골다공증의 진행 지연 또는 개선 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료적 유효량"은 질환 또는 병태의 증상의 개선 또는 치료를 초래하는 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "예방"은 질환 증상의 완전한 예방, 질환 증상 개시의 지연, 또는 후속적으로 발생되는 질환 증상의 중증도 감소를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 본 발명의 스트라도머가 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여되는 임의의 포유류 대상체를 의미하기 위해 취해진다. 구체적 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 인간 대상체를 치료하기 위해 사용된다. 본 개시내용의 방법은 또한 종 특이적 또는 키메라 스트라도머 분자를 생성하기 위해 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지), 마우스, 래트, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 토끼, 염소, 사슴, 양, 페럿, 게르빌루스, 기닉픽, 햄스터, 박쥐, 조류(예를 들어, 닭, 칠면조 및 오리), 어류 및 파충류를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트라도머는 다른 상보체 결합 분자에 비해 우수한 안전성 및 효율을 제공한다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 스트라도머는 항-C5 항체 에쿨리주맙에 비해 우수한 안전성 및 효능을 나타낸다.
상보체 저해는 항체-매개 질환을 감소시키는 것으로 입증되었다(예를 들어, 문헌[Stegall et al. Terminal Complement Inhibition Decreases Antibody-Mediated Rejection in Sensitized Renal Transplant Recipients. American Journal of Transplantation 2011 Nov; 11(1):2405-2413-Epub 2011 Sept 22; DOI:　10.1111/j.1600-6143.2011.03757.x] 참조).　 본 발명의 스트라도머는 또한 항체-매개인 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 자가-항체는 다수의 공지된 자가면역 질환을 매개하고, 수많은 다른 자가면역 질환에서 어떤 역할을 할 가능성이 있다. 본 발명의 스트라도머가 사용될 수 있는 인식된 항체 매개 질환은 굿페스쳐를 포함하는 항-사구체 기저막 항체 매개 신장염; 고형 기과나 이식에서 항-공여자 항체(공여자 특이적 동종항체); 시신경척수염에서 항-아쿠아포린-4 항체; 신경근긴장증, 변연계 뇌염 및 모반 증후군에서 항-VGKC 항체; 중증 근무력증에서 항-니코틴 아세틸콜린 수용체 및 항-MuSK 항체; 람버트 이튼 근무력 증후군에서 항-VGCC 항체; 종종 종양과 관련된 변연계 뇌염에서 항-AMPAR 및 항-GABA(B)R 항체; 강직인간 증후군 또는 병적놀람증에서 항-GlyR 항체; 재발성 자연 유산, 휴즈 증후군 및 전신 홍반성 낭창에서 항-인지질, 항-카디오리핀 및 항-β2 당단백질 I 항체; 강직인간 증후군, 자가면역 소뇌성 운동 실조 또는 변연계 뇌염에서 항-글루탐산 데카복실라제 항체; 종종 난소성 기형종과 관련되지만, 비방종양성일 수 있는 청년 및 아동에서 종종 우세한 운동 장애와 함께 대뇌변연계와 피질 하부 특징을 둘 다 포함하는 새로 기재된 증후군에서 항-NMDA 수용체 항체; 전신 홍반성 낭창에서 안티-이중 가닥 DNA, 안티-단일 가닥 DNA, 항-RNA, 항-SM 및 항-C1q 항체; 항-Ro, 항-La, 항-Scl 70, 항-Jo-1을 포함하는, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 및 다발성 근염을 포함하는, 결합조직 질환에서 항-핵 및 항-핵소체 항체; 류마티스 관절염에서의 항-류마티스성 인자 항체; 결절성 다발동맥염에서 항-B형 간염 표면 항원 항체; CREST 증후군에서 항-동원체 항체; 심내막염에서 또는 심내막염에 대한 위험으로서 항-스트렙토코커스 항체; 하시모도 갑상선염에서 항-티로글로불린, 항-갑상선 페록시다제, 및 항-TSH 수용체 항체; 혼합 결합 조직병 및 전신 홍반성 낭창에서 항-U1 RNP 항체; 및 천포창에서 항-데스모글레인 및 항-각질세포 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 스트라도머는 울혈성 심부전(CHF), 혈관염, 주사, 여드름, 습진, 심근염 및 심근의 다른 병태, 전신 홍반 루푸스, 당뇨병, 척추병증, 활막섬유모세포, 및 골수 간질; 골손실; 파제트병, 파골세포종; 다발성 골수종; 유방암; 불용성 골감소증; 영양실조, 치주질환, 고셰병, 랑게르한스 세포조직구증, 척수손상, 급성 패혈성 관절염, 골연화증, 쿠싱 증후군, 단일골성 섬유골 이형성증, 다골성 섬유성골 이형성증, 치주 복원, 및 골절; 유육종증; 용골성 골암, 폐암, 신장암 및 직장암; 골 전이, 뼈 통증 관리 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염 및 기타 척추관절병증; 이식거부, 바이러스 감염, 혈액학적 종양형성 및 신생물 유사 병태, 예를 들어, 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종(버킷 림프종, 작은 림프구성 림프종/만성 림프성 백혈병, 균상식육종, 외투세포 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 모양 세포성 백혈병 및 림프형질 세포성 백혈병), B-세포 급성 림프 아구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프 아구성 백혈병/림프종을 포함하는 림프구 전구체 세포의 종양, 흉선종, 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 대형 과립 림프성 백혈병을 포함하는 성숙 T 및 NK 세포의 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 골수성 종양 형성, 예컨대 성숙이 있는 AML, 분화 없는 AML, 급성 전골수구 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 및 급성 단핵구 백혈병을 포함하는 급성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수 증식성 장애, 중추 신경계의 종양, 예를 들어, 뇌 종양(신경교종, 신경아세포종, 성상세포종, 수모세포종, 상의세포종 및 망막아세포종), 고형 종양(비인두암, 기저세포암, 췌장암, 답관암, 카포씨 육종, 고환암, 자궁, 질 또는 자궁경부암, 난소암, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 혈관계의 종양(혈관육종 및 혈관주위세포종)) 또는 기타 암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서의 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 병태를 지칭하거나 또는 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종(지방육종, 골육종, 혈관육종, 내피육종, 평활근육종, 척삭종, 림프혈관육종, 림프관내피육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종 연골육종을 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 활막종, 신경초종, 뇌수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프 악성종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 구체적인 예는 편평세포암(예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 소세포 폐 암종을 포함하는 폐암, 배막의 암, 간세포암, 위장암을 포함하는 위 또는 복부암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 신세포암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 쓸개관의 종양, 유잉 종양, 기저세포암, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 고환종양, 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종양, 희소돌기신경교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 골수이형성 질환, 중쇄병, 신경내분비 종양, 신경초종 및 기타 암종뿐만 아니라 두경부암을 포함한다.
본 발명의 스트라도머는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "자가면역 질환"은 80가지 초과의 질환 및 병태의 다양한 군을 지칭한다. 모든 이들 질환 및 병태에서, 근본적인 문제는 신체의 면역계가 신체 그 자체를 공격한다는 것이다. 자가면역 질환은 결합조직, 신경, 근육, 내분비계, 피부, 혈액 및 호흡계 및 위장계를 포함하는 모든 주요 신체계에 영향을 미친다. 자가면역 질환은, 예를 들어, 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 다발성경화증, 중증 근무력증, 및 1형 당뇨병을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 치료 가능한 질환 또는 병태는 겸상적혈구병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 동종면역/자가면역 혈소판 감소증, 후천성 면역 혈소판 감소증, 자가면역성 호중구 감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 파보바이러스 B19-연관 적혈구 무형성증, 후천성 항인자(antifactor) VIII 자가면역, 후천성 폰빌레브란트병, 다발성 골수종 및 미결정의 단클론 감마병증, 패혈증, 재생불량성 빈혈, 순수한 적혈구 무형성증, 다이아몬드-블랙팬(Diamond-Blackfan) 빈혈, 신생아의 용혈성 질환, 면역-매개 백혈구 감소증, 혈소판 수혈에 대한 내화성, 신생아, 수혈후 자반병, 용혈성 요독 증후군, 전신 혈관염, 혈전증 혈소판 감소성 자반병 또는 에반 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액면역학적 과정일 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 길랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증, 파라단백혈증 IgM 탈수초성 다발성 신경병증, 람베르트 이튼 근무력 증후군, 중증 근무력증, 다초점 운동 신경병증, 항-/GMl과 관련된 아래운동 신경원 증후군, 탈수, 다발성경화증 및 시신경염, 근강직 증후군, 항-Yo 항체에 의한 방종양성 소뇌 변성, 방종양성 뇌 척수염, 항-Hu 항체에 의한 감각 신경병증, 뇌전증, 뇌염, 척수염, 특히 인간 T-세포 림프친화 바이러스-1과 관련된 척수병증, 자가면역 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 또는 급성 특발성 자율신경성 신경병증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 신경면역학적 과정일 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 청력 상실 또는 시력 상실과 관련된 염증 또는 자가면역일 수 있다. 예를 들어, 질환 또는 병태는 자가면역-관련 청력 상실, 예컨대 소음성 청력 상실 또는 연령-관련 청력 상실일 수 있거나, 또는 청력 장치와 같은 장치의 이식물(예를 들어, 달팽이관 이식물)과 관련될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 장치의 이식 전에, 동시에 또는 후속적으로 투여될 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 가와사키병, 류마티스성 관절염, 펠티증후군, ANCA-양성 혈관염, 자발적 다발성 근염, 피부근육염, 항인지질 증후군, 재발성 자연 유산, 전신 홍반성 낭창, 소아 특발성 관절염, 레이노, CREST 증후군 또는 포도막염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 류마티스성 질환 과정일 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 독성 상피 괴사성 용해, 괴저, 육아종, 자가면역 피부 물집 질환(심상성 천포창, 수포성 유사 천포창, 낙엽상 천포창을 포함), 백반증, 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군, 피부경화증, 미만성 및 국한성 전신 경화증을 포함하는 전신 경화증, 또는 아토피 피부염(특히, 스테로이드 의존성)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 피부면역학적 질환 과정일 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 봉입체 근육염, 괴사성 근막염, 염증성 근병증, 근육염, 항-데코린(BJ 항원) 근육병, 방종양성 괴사성 근육병, X-연관 공포성 근육병, 페나실라민-유도 다발성 근염, 죽상동맥경화증, 관상동맥질환 또는 심근증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 근골격 면역학적 질환 과정일 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 치명적 빈혈, 자가면역 만성 활동성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 셀리악병, 포진형 피부염, 잠복성 간경화증, 반응성 관절염, 크론병, 휘플씨병, 궤양성 대장염 또는 경화성 담관염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 위장 면역학적 질환 과정일 수 있다.
질환 또는 병태는 또한 이식편대 숙주질환, 이식편의 항체-매개 거부, 골수 이식 후 거부, 질환 감염 후 염증, 림프종, 백혈병, 신생물 형성, 천식, 항-베타 세포 항체에 의한 1형 진성 당뇨병, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직병, 애디슨병, 보그트-고야나기 하라다 증후군, 막성증식성 사구체 신염, 굿페스쳐 증후군, 그래브스병, 하시모도 갑상선염, 베게너 육아종증, 미세다발성 동맥염, 쳐그-스트라우스 증후군, 결절성 다발동맥염 또는 다발성 장기 부전일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "알레르기"는 IgE에 의해 매개되는 모든 면역 반응뿐만 아니라 IgE-매개 반응을 모방하는 해당 반응을 포함한다. 알레르기는 IgE 또는 IgE-유사 면역 반응을 촉발시키는 단백질, 펩타이드, 탄수화물 및 이들의 조합물을 포함하는 알레르겐에 의해 유도된다. 예시적인 알레르기는 땅콩 알레르기, 꽃가루 알레르기, 및 곤충 쏘임 알레르기를 포함한다. 예시적인 알레르겐은 포이즌 아이비 및 오크에서의 우루시올; 집먼지 항원; 꽃가루 성분 Bet v 1 및 Bet v 2; 셀러리 내 15kd 항원; 사과 항원 Mal d 1; 복숭아 내 Pru p3; 티모시 그라스 꽃가루 알레르겐 Phl p 1; 독보리 내 Lol p 3, Lol p I, 또는 Lol p V; 버뮤다 그라스 내 Cyn d 1; 집먼지 진드기 알레르겐 집먼지 진드기 der p1, der p2, 또는 der f1; 글루텐 내 α-글리아딘 및 γ-글리아딘 에피토프; 꿀벌 독 포스포리파제 A2; 땅콩 내 Ara h 1, Ara h 2, 및 Ara h 3 에피토프를 포함한다.
질환 또는 병태는 사구체 질환 및/또는 신장염일 수 있다. 사구체 간질 증식은 IgA 신장병증, 사구체 신염 감염 후 분해 및 다수의 2차 사구체 질환, 예컨대 낭창성 신염, 쇤라인-헤노흐 자반병, 류마티스 관절염, 간경변, 알포트 증후군 및 당뇨병성 신장병증을 포함하는 다수의 인간 사구체 질환의 통상적인 특징이다. 상기 질환은 사구체 간질 과세포성 및 사구체 간질 기질 확장 정도를 변화시키는 것을 특징으로 한다. 진행성 경우에서, 이들 세포 변화는 다양한 면역학적, 독성, 대사, 기계적 및 염증 매개체에 의한 손상의 결과로서 관절낭 접착을 야기할 수 있다. 몇몇 실험 모델이 개발되었지만, 사구체 간질 증식의 연구를 위한 대부분의 널리 사용되는 모델은 항-흉선세포(항-Thy-1) 모델이었다(Yamamoto and Wilson, "Quantitative and qualitative studies of antibody-induced mesangial cell damage in the rat." Kidney International 32; 514-24 (1987); Jefferson JA et al, "Experimental mesangial proliferative glomerulonephritis (the anti Thy-1.1 model)." J. Nephrol 12; 297-307 (1999)). 신장병증에 대한 다른 모델은 근위 관 상피 분획(Fx1A)(텍사스 산안토니오에 소재한 프로베텍스(Probetex))에 의한 동물의 면역화를 수반한다. Fx1A에 의한 래트의 면역화는 인간 질환에 대한 분명한 유사함과 함께 상피하 면역 침착물 및 단백뇨를 특징으로 하는 면역 복합체 "막성" 신장염을 유도한다(Heymann W. et al., Proc Soc. Exp. Biol. Med. 100:660-64 (1959); Edgington TS et al., J Exp. Med. 127; 555 (1968)). Fx1A는 사구체 상피 세포에 의해 생성된 신염유발성 항원인 거대 당단백질 gp330(메갈린)을 함유한다. 항-Fx1A 항체의 투여는 2기로 나타내는 신장염을 생성한다: 1) 외인성으로 투여된 항체에 의해 유도된 급성 신장염을 나타내는 이종성 기, 및 2) 사구체 구조 내에 심어진 외인성(이종성) 양 면역글로불린에 대한 숙주 자체의 반응의 생성을 특징으로 하는 만성 자가 유래 기. 항 Fx1A 막성 신증 모델은 상피하 침착물 및 단백뇨를 생성한다. 수동 히만 신염 모델 및 이 모델에서의 상보체 개선은 다른 곳에서 검토되었다(Jefferson et al. "Experimental Models of Membranous Nephropathy," Drug Discov. Today Dis. Models 7(1-2): 27-33 (2010).
본 발명은 감염성 제제에 의해 야기되는 질환의 치료에 효과적인 방법 및 조성물을 추가로 포함한다. 감염성 제제는 박테리아, 균류, 기생충 및 바이러스제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 감염성 제제의 예는 다음을 포함한다: 스타필로코커스(staphylococcus), 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스트렙토코카세애(streptococcaceae), 네이세리아세애(neisseriaaceae), 콕시(cocci), 엔테로박테리아세애(enterobacteriaceae), 엔테로코커스(enterococcus), 반코마이신-내성엔테로코커스(enterococcus), 크립코코커스(cryptococcus), 히스토플라스모시스(histoplasmosis), 아스페르길루스(aspergillus), 슈도모나다세애(pseudomonadaceae), 비브리오나세애(vibrionaceae), 캄필로박터(campylobacter), 파스테우렐라세애(pasteurellaceae), 보르데텔라(bordetella), 프란시셀라(francisella), 브루셀라(brucella), 레지오넬라세애(legionellaceae), 박테로이대세애(bacteroidaceae), 그램-음성 바실리(gram-negative bacilli), 클로스트리듐(clostridium), 코리네박테리움(corynebacterium), 프로피온박테리움(propionibacterium), 그램-양성 바실리(gram-positive bacilli), 안트락스(anthrax), 악티노마이세스(actinomyces), 노카르디아(nocardia), 마이코박테리움(mycobacterium), 트레포네마(treponema), 보렐리아(borrelia), 렙토스피라(leptospira), 마이코플라스마(mycoplasma), 우레아플라스마(ureaplasma), 리케챠(rickettsia), 클라마이디애(chlamydiae), 칸디다(candida), 전신 진균증, 기회감염 진균증, 원생동물, 선충, 흡충, 촌충, 아데노바이러스(adenoviruses), 헤르페스바이러스(herpesviruses)(예를 들어, 단순포진바이러스 및 엡스타인 바르 바이러스 및 대상포진 바이러스를 포함), 수두바이러스, 파모바바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스를 포함), 유두종 바이러스, 오쏘믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C를 포함), 파라믹소바이러스, 코로나바이러스, 피코르나바이러스, 레오바이러스, 토가바이러스, 플라리바이러스, 부니아바이러스과, 랍도바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 및 레트로바이러스. 예시적인 감염성 질환은 칸디다증, 칸디다혈증, 아스페르길루스증, 연쇄 구균 폐렴, 연쇄 구균 피부 및 구강인두 병태, 그람 음성 패혈증, 결핵, 전염성 단핵증, 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스에 의해 야기되는 호흡기 질환, 말라리아, 주혈흡충증 및 트리파노소마증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명은 박테리아, 균류, 기생충 및 바이러스제에 의해 야기되는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 감염성 질환의 치료에 효과적인 방법 및 조성물을 포함한다. 예시적인 감염성 질환은 칸디다증, 칸디다혈증, 아스페르길루스증, 연쇄 구균 폐렴, 연쇄 구균 피부 및 구강인두 병태, 그람 음성 패혈증, 결핵, 전염성 단핵증, 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스에 의해 야기되는 호흡기 질환, 말라리아, 주혈흡충증, 및 트리파노소마증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 스트라도머는 프라이밍 시스템에서 이용될 수 있되, 혈액은 환자로부터 인출되고, 환자에게 다시 도입되기 약 30분 내지 약 3시간 전의 시간 기간 동안 스트라도머(들)와 일시적으로 접촉된다. 세포 요법의 이런 형태에서, 환자 자신의 효과기 세포는 스트라도머에 대한 효과기 세포의 노출을 통해 효과기 세포를 조절하기 위해 생체밖 기질 상에 고정되는 스트라도머에 노출된다. 이어서, 조절된 효과기 세포를 포함하는 혈액은 환자에게 다시 주입된다. 이러한 프라이밍 시스템은 수많은 임상 및 치료적 적용을 가질 수 있었다.
본 명세서에 개시된 스트라도머는 또한 면역 반응 프로파일에서 특정 변화에 영향을 미치는 다양한 내용에서 면역계 반응을 변경하도록 용이하게 적용될 수 있다. 대상체에서 면역 반응을 변경 또는 조절하는 것은 면역 반응의 비 또는 성분을 증가시키거나, 감소시키거나 또는 변경하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 사이토카인 생성 또는 분비 수준은 상보체에 결합하고 해당 수용체와 상호작용하도록 설계된 스트라도머와 FcγR의 적절한 조합과 함께 상보체를 표적화함으로써 원하는 대로 증가 또는 감소될 수 있다. 항체 생성은 또한 증가되거나 또는 감소될 수 있고; 2 이상의 사이토카인 또는 면역 세포 수용체의 비는 변화될 수 있거나; 또는 사이토카인 또는 항체의 추가적인 유형이 생성되도록 야기될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 자가면역 또는 염증 질환을 갖는 대상체는 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 스트라도머를 투여하는 단계를 포함하는 변경된 그들의 면역 반응을 갖되, 치료적 유효량의 스트라도머는 대상체에서 면역 반응을 변경시킨다. 이상적으로, 이런 개입은 대상체에서 질환 또는 병태를 치료한다. 변경된 면역 반응은 증가되거나 또는 감소된 반응일 수 있고, 임의의 IL-6, IL-10, IL-8, IL-23, IL-7, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, TNF-알파 및 IFN-알파 수준을 포함하는 변경된 사이토카인 수준을 수반할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Il-6 또는 IL-8은 요법에 대한 반응에서 감소된다. 특히 바람직한 실시형태에서, IL-6 및 IL-8은 요법에 대한 반응에서 감소된다. 그러나 본 발명은 기재된 생체 모방체의 임의의 특정 작용 메커니즘에 의해 제한되지 않는다. 변경된 면역 반응은 대상체에서 변경된 자가항체일 수 있다. 변경된 면역 반응은 대상체에서 변경된 자가공격 T 세포 수준일 수 있다.
예를 들어, 자가면역 질환에서 TNF-알파 생성의 양을 감소시키는 것은 치료적 효과를 가질 수 있다. 이의 실행적 적용은 판상형 건선증, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염 및 강직성 척추염을 치료하는 것으로 임상적으로 증명된 항-TNF-알파 항체 요법(예를 들어, 레미케이드(REMICADE)(등록상표))이다. 이들 자가면역 질환은 별개의 병인을 갖지만, 염증 및 면역 세포 활성과 관련된 질환 과정의 중요한 면역학적 성분을 공유한다. TNF-알파 생성을 감소시키도록 설계된 스트라도머는 마찬가지로 이들 및 다수의 다른 자가면역 질환에서 효과적일 것이다. 변경된 면역 반응 프로파일은 또한 항체 생성, 예를 들어 대상체 자신의 조직을 표적화하는 자가항체 또는 대상체에서 변경된 자가공격 T 세포 수준에서 감소를 달성하기 위한 직접적 또는 간접적 조절일 수 있다. 예를 들어, 다발성경화증은 인터페론 베타 요법에 의해 치료될 수 있는 자가반응성 T 세포를 수반하는 자가면역 장애이다. 예를 들어, 문헌[Zafranskaya M, et al., Interferon-beta therapy reduces CD4+ and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis, Immunology 2007 May;121(l):29-39-Epub 2006 Dec 18] 참조. 자가반응성 T-세포 수준을 감소시키는 스트라도머 설계는 마찬가지로 다발성경화증에서 효과적일 것이며, 자가반응성 T-세포를 수반하는 다른 자가면역 질환일 수 있다.
본 명세서에 기재된 스트라도머는 수지상 세포, 대식세포, 파골세포, 단핵구, 또는 NK 세포를 포함하는 면역 세포로부터 공자극 분자의 발현을 조절하기 위해 또는 이들 동일한 면역 세포의 분화, 성숙 또는 인터류킨-12(IL- 12)을 포함하는 사이토카인 분비를 저해하기 위해 또는 인터류킨-10(IL- 10), 또는 인터류킨-6(IL-6) 또는 IL1-RA을 포함하는 사이토카인 분비를 증가시키기 위해 면역 세포로부터 공자극 분자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 또한 면역학적으로 활성인 생체 모방체에 면역 세포를 노출시킴으로써 그리고 면역 세포 기능의 조절을 측정함으로써 면역학적으로 활성인 생체 모방체의 효능을 입증할 수 있되, 면역 세포는 수지상 세포, 대식세포, 파골세포, 또는 단핵구이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 시험관내에서 면역학적으로 활성인 생체모방에 노출되고, 세포 표면 수용체의 또는 사이토카인 생성의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하되, 세포 표면 수용체 또는 사이토카인 생성의 양의 변화는 면역 세포 기능의 조절을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 면역 세포는 자가면역 질환에 대한 모델 동물에서 생체내에서 면역학적으로 활성인 생체모방에 노출되며, 자가면역 질환에서 개선 정도를 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 스트라도머는 또한 장치 성분으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 스트라도머는 장치, 예컨대 의학적 이식물 상에 코팅될 수 있다. 예를 들어, 스트라도머는 침투를 향상시키고, 예를 들어 포도막염 또는 황반변성에서 안구내 사용을 위해 약물 방출을 연장시키기 위해 관상동맥 스텐트 상에 또는 나노입자 요법의 부분으로서 코팅될 수 있다. 본 명세서에 기재된 스트라도머는 또한 진단제의 성분으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 당업자는 스트라도머의 환자 사용이 특히 유리할 수 있다는 것을 결정함으로써 요법을 개인화할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 면역학적으로 활성인 생체 모방체에 환자의 면역 세포를 노출시킬 수 있고, 고 반응자를 확인하기 위해 유세포분석 또는 사이토카인 프로파일에 의한 면역 세포의 활성화 또는 성숙의 조절을 측정한다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함된다.
본 발명은 면역글로불린 Fc의 일련의 완전한 재조합 다형체화 형태에 관한 것으로, 이에 의해 면역 세포 수용체에 다가 면역글로불린 Fc를 제공한다. 융합 단백질은 동종이량체와 스트라도머로 칭해지는 고차 다량체 분획으로서 존재한다. 본 발명은 다량체화를 증가시키고 상보체에 우선적으로 결합하며, 질환의 치료 및 예방에서 유용한 스트라도머를 제공한다.
도 1은 생물학적 보호막 간섭측정법(biolayer interferometry)(포르테바이오 옥텟(ForteBio Octet))에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 또는 FcRn에 대한 스트라도머 GL-2045의 결합을 도시한 도면.
도 2는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G997에 대한 각각의 Fc 수용체, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터에 대한 최대 반응 단위(RUmax)의 레이더 그래프(radar graph)를 도시한 도면. 이들 설명에서 각각의 레이더 그래프는 옥텟 생물학적 보호막 간섭측정법의 결과로부터 초래된 결합 곡선의 시각적 판독으로부터 생성되었다.
도 3은 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 및 FcRn에 대한 스트라도머 G997의 결합을 도시한 도면.
도 4A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G998에 대한 각각의 Fc 수용체, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터에 대한 RUmax의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 4B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G997 및 G998에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 5는 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 및 FcRn에 대한 스트라도머 G998의 결합을 도시한 도면.
도 6A는 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 G045c에 대한 CDC 저해 데이터 및 상보체-우선적 스트라도머 G1022 및 G1033의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 6B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1022 및 G1033에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 7A는 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 G045c에 대한 CDC 저해 데이터 및 일반화된 스트라도머 G1032의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 7B는 G045c 및 일반화된 스트라도머 G1032에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 8A는 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 G045c에 대한 CDC 저해 데이터 및 일반화된 스트라도머 G1023의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 8B는 G045c 및 일반화된 스트라도머 G1023에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 9A는 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 G045c에 대한 CDC 저해 데이터 및 상보체-우선적 스트라도머 G1006의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 9B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1006에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 10A 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1027에 대한 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 10B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1027에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초(RU300s)에서의 RU의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 11A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1003에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 11B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1003에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면 .
도 12A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G989에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터에 대한 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 12B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G989에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 13은 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 및 FcRn에 대한 스트라도머 G989의 결합을 도시한 도면.
도 14A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G990에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 14B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G990에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 15는 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 및 FcRn에 대한 스트라도머 G990의 결합을 도시한 도면.
도 16A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G994에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 16B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G994에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 17은 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 및 FcRn에 대한 스트라도머 G994의 결합을 도시한 도면.
도 18A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G996에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 18B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G996에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 19(상부 행의 패널)는 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 또는 FcRn에 대한 스트라도머 G996의 결합을 도시한 도면. 도 19(하부 행의 패널)는 마우스 FcγRIIb, FcγRIII 및 FcγRIV에 대한 스트라도머 G996의 결합을 도시한 도면.
도 20A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1042에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 20B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1042에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 21은 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcγRIIa에 대한 스트라도머 G1042의 결합을 도시한 도면.
도 22A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1043에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA, 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 22B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1043에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 23은 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, 또는 FcγRIIa에 대한 스트라도머 G1043의 결합을 도시한 도면.
도 24A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1046에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 24B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1046에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 25는 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa 또는 FcγRIIa에 대한 스트라도머 G1046의 결합을 도시한 도면.
도 26A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1050에 대한 각각의 Fc 수용체, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터에 대한 RUmax의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 26B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1050에 대한 각각의 Fc 수용체에 대해 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 27은 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, 및 FcγRIIa에 대한 스트라도머 G1050의 결합을 도시한 도면.
도 28A는 G045c 및 일반화된 스트라도머 G1049에 대한 각각의 Fc 수용체, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터에 대한 RUmax의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 28B는 G045c 및 일반화된 스트라도머 G1049에 대한 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 29는 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, 및 FcγRIIa에 대한 스트라도머 G1049의 결합을 도시한 도면.
도 30A는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1025에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 RUmax, C1q ELISA 및 CDC 저해 데이터의 레이더 그래프를 제공한 도면. 도 30B는 G045c 및 상보체-우선적 스트라도머 G1025에 대해 각각의 Fc 수용체에 대한 300초에서의 RU(RU300s)의 레이더 그래프를 제공한 도면.
도 31A는 ELISA 분석에서 증가하는 농도의 스트라도머에서 흡광도에 의해 측정한 바와 같은, C1q에 대한 음성 대조군 G001, 모 스트라도머 GL-2045, G993, G997, G998, G996 및 G994의 결합을 도시한 도면. 도 31B는 각각의 시험 스트라도머에 대한 log-전환된 데이터 및 EC50 값을 도시한 도면. EC50 값은 ㎍/㎖로 나타낸다.
도 32는 ELISA 분석에서 증가하는 농도의 스트라도머에서 흡광도에 의해 측정한 바와 같은 상보체 성분 C3에 대한 음성 대조군 G001, 모 스트라도머 GL-2045, G994, G996, G997 및 G998의 결합을 도시한 도면. 상부 패널은 log-전환된 흡광도 데이터를 나타내고, 하부 패널은 비-log 전환 흡광도 데이터를 나타낸다.
도 33은 ELISA 분석에서 증가하는 농도의 스트라도머에서 흡광도에 의해 측정한 바와 같은 상보체 성분 C3b에 대한 음성 대조군 G001, 모 스트라도머 GL-2045, G997, G998 및 G994의 결합을 도시한 도면.
도 34는 ELISA 분석에서 증가하는 농도의 스트라도머에서 흡광도에 의해 측정한 바와 같은 상보체 성분 C4에 대한 음성 대조군 G001, 모 스트라도머 GL-2045, G996, G997, G998 및 G994의 결합을 도시한 도면.
도 35는 ELISA 분석에서 증가하는 농도의 스트라도머에서 흡광도에 의해 측정한 바와 같은 상보체 성분 C5에 대한 음성 대조군 G001, 모 스트라도머 GL-2045, G996, G997, G998 및 G994의 결합을 도시한 도면.
도 36A 및 도 36B은 인간 IgG1, DEL(도 36A; 서열번호 3) 및 EEM(도 36B; 서열번호 2) 다형체의 서열을 제공한 도면.
도 37은 신장염의 동물 모델에서 동물 투여된 시험 스트라도머에서 단백뇨의 상당한 감소를 도시한 도면.
도 38A 및 도 38B는 항-Thy 1 항체를 통한 사구체 신염의 유도 후 병에 걸린 PBS 대조군 동물(도 38A) 및 40㎎/㎏ G998을 받은 동물(도 36B)의 조직학적 분석을 도시한 도면. 도 38A에서, (G)는 두꺼워진 기저막 사구체를 지칭하고; (B)는 호염기성 세관 및 간질 침윤물을 지칭하며; 화살표는 단백질성 유체를 갖는 팽창된 세관을 표시한다. 도 36B는 G998 치료 동물에서 비병변 사구체 및 세관을 도시한 도면.
도 39는 대조군 치료(그룹 2) 또는 40㎎/㎏ G0998(그룹 4)로서 PBS를 받은 동물에서 신장 조직의 조직학적 분석의 그래프 표현을 제공한 도면.
도 40은 PBS 대조군 동물, 항-Thy 1 항체를 받지 않은 비질환 대조군 동물, 및 G994(40㎎/㎏), G998(40㎎/㎏ 또는 80㎎/㎏) 또는 G1033(40㎎/㎏)을 받은 동물에서 혈액 요소성 질소(blood urea nitrogen: BUN) 수준을 제공한 도면. 그래프 상에서 제공된 P 값은 대조군 질환 PBS 동물에 대한 것이다.
도 41은 항 Fx1a 단독을 받은 대조군 동물, 제0일에 항 Fx1a 및 G998을 받은 동물, 및 제0일에 항 Fx1a 및 제1일에 G998을 받은 동물에서 단백뇨(㎎/24hr)를 도시한 도면.
도 42는 시간에 표시된 화합물의 단일 투약 후에 래트에서 G994, G998 또는 G1033의 수준(㎍/㎖)을 도시한 도면.
도 43은 G994(좌측 패널), G998(중간 패널) 또는 G1033(우측 패널)의 단일 투약 후에 래트 혈액에서 상보체 활성을 도시한 도면.
도 44a 및 도 44b는 각각의 G994(좌측 패널), G998(중간 패널) 및 G1033(우측 패널)에 대한 약물 수준(x 축 상에서 ㎍/㎖)과 상보체 활성(y축 상에서 %) 사이의 상관관계를 제공하는 도면. 도 44a는 각각의 상보체 우선적 스트라도머에 대한 연구에서 수집한 모든 데이터 지점을 제공한다. 도 44는 곡선의 하부 부분(더 낮은 약물 농도)에 중점을 둔다.
도 45는 투약 후 0, 1, 2, 4, 12, 24, 48, 72, 144, 216 및 312시간에 측정하여, 0시간에 상보체 우선적 화합물의 단일 투약 후에 사이노몰거스 원숭이에서 G994, G998 또는 G1033의 약물 수준(㎍/㎖)의 약물 수준을 도시한 도면.
도 46은 G994(좌측 패널), G998(중간 패널) 또는 G1033(우측 패널)의 단일 투약 후 시간에 따른 상보체 활성(세포사%)을 도시한 도면.
도 47a 및 도 47b는 연구에서 각각의 시험 화합물에 대한 약물 수준과 상보체 활성 사이의 상관관계를 도시한 도면. 도 47a는 실험에서 수집된 모든 데이터 지점을 나타내고, 도 47b는 더 낮은 약물 농도로 곡선의 제1 부분을 나타낸다. G994에 대해, x-축 절편값은 2% 및 4% 혈청에 대해 144 및 168㎍/㎖이다. 상관관계에 대한 R2 값은 0.866 및 0.835이다. G998에 대해, x 절편값은 425 및 347㎍/㎖이고, 2% 및 4% 혈청에 대해 R2 값은 0.925 및 0.743이다. G1033에 대해, x 절편은 346 및 379㎍/㎖이고, R2 값은 0.584 및 0.714이다.
도 48a 내지 도 48g는 시험한 유도체 스트라도머 화합물에 기반한(G994 또는 G998) 모 화합물 GL-2045과 같이, 유도체 스트라도머 화합물이 다량체를 형성한다는 것을 나타내는 겔이다. 화합물 GL-2045, G994, G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105 및 G1106은 도 48a에 나타낸다. 화합물 GL-2045, G994, G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109 및 G1084는 도 48b에 나타낸다. 화합물 GL-2045, G998 및 G1107은 도 48c에 나타낸다. 화합물 GL-2045, G994, G1110, G1111, G1112, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118 및 G1119는 도 48d에 나타낸다. 화합물 GL-2045, G994, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130 및 G1131은 도 48E에 나타낸다. 화합물 GL-2045, G998, G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1093 및 G1095는 도 48f에 나타낸다. 화합물 GL-2045, G998, G1069, G1070, G1132, G1075 및 G1075는 도 48g에 나타낸다.
도 49는 ELISA 분석에서 증가하는 농도의 스트라도머에서 흡광도에 의해 측정되는 바와 같은 상보체 성분 C3(상부 좌측 패널), C3b(상부 우측 패널), C5(하부 좌측 패널) 또는 C4(하부 우측 패널)에 대한 IgG1 Fc인 음성 대조군 G001, 스트라도머 GL-2045, 또는 상보체 우선적 스트라도머 G994, G998 또는 G1033의 결합을 도시한 도면.
도 50a 내지 도 50c는 생물학적 보호막 간섭측정법(포르테바이오 옥텟)에 의해 측정한 바와 같은, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII에 대한 스트라도머 G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105 및 G1106의 결합을 도시한 도면.
도 51a 내지 도 51c는 생물학적 보호막 간섭측정법(포르테바이오 옥텟)에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII에 대한 스트라도머 G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109 및 G1084의 결합을 도시한 도면.
도 52a 내지 도 52g는 생물학적 보호막 간섭측정법(포르테바이오 옥텟)에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII에 대한 스트라도머 G1100, G1111, G1112, G1113, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130 및 G1131의 결합을 도시한 도면.
도 53a 내지 도 53c는 생물학적 보호막 간섭측정법(포르테바이오 옥텟)에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII에 대한 스트라도머 G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1107, G1093 및 G1095의 결합을 도시한 도면.
도 54a 내지 도 54b는 생물학적 보호막 간섭측정법(포르테바이오 옥텟)에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII에 대한 스트라도머 G1069, G1070, G1132, G1074 및 G1075의 결합을 도시한 도면.
도 55a는 비히클 대조군(0㎍/㎖의 G019, G994 또는 G1033) 또는 0.02㎍/㎖ 내지 2000㎍/㎕ 범위의 G019, G994 및 G1033의 용량으로 치료 20시간 후에 단리된 PBMC로부터의 IL1Rα 유도를 도시한 도면. 모든 정규 수용체에 결합하는 G019는 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 55b는 비히클 대조군(0㎍/㎖의 G019, G994 또는 G1033) 또는 0.02㎍/㎖ 내지 2000㎍/㎕ 범위의 G019, G994 및 G1033의 용량으로 치료 4시간 후에 단리된 PBMC로부터의 TNFα 유도를 도시한 도면. 모든 정규 수용체에 결합하는 G019는 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 56은 ELISA에 의해 측정되는 바와 같은 상보체-우선적 스트라도머의 C1q 결합을 도시한 도면.
도 57은 G994, G998, G1033, PBS 대조군, 덱사메타손, 또는 비처리 대조군으로 치료한 관절염의 CIA 모델에서 루이스 래트의 평균 발목 직경을 도시한 도면.
도 58a 내지 도 58b는 도 56에서 나타낸 상보체 우선적 화합물, G1088, G1129, G1082, G1092 및 G1102(도 58a), 및 G1069, G1114 및 G1075(도 58b)를 선택하기 위한 C1q 결합 데이터를 도시한 도면.
도 59는 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 측정한 바와 같은 FcγRI, FcγRIIb 및 FcγRIIIa에 대한 스트라도머 G999 및 G996의 결합을 도시한 도면.
도 60은 G999 및 G996에 대한 CDC 저해 데이터를 도시한 도면. CD20은 CD20 항체의 첨가를 나타낸다. "6%"은 6% 혈청 상보체의 첨가를 나타낸다. 대조군은 세포 + G996 단독(50 및 100㎍/㎖)의 첨가, 세포 + 혈청("+ 6%"), 및 세포 + 혈청 + 항체("세포+CD20+6%")를 포함한다.
도 61은 G994에 대한 CDC 저해 데이터를 도시한 도면. CD20은 CD20 항체의 첨가를 나타낸다. "6%"는 6% 혈청 상보체의 첨가를 나타낸다. 대조군은 세포 + G996 단독(50 및 100㎍/㎖)의 첨가, 세포 + 혈청("+ 6%"), 및 세포 + 혈청 + 항체("세포+CD20+6%")를 포함한다.
도 62은 G998에 대한 CDC 저해 데이터를 도시한 도면. CD20은 CD20 항체의 첨가를 나타낸다. "6%"는 6% 혈청 상보체의 첨가를 나타낸다. 대조군은 세포 + G996 단독(50 및 100㎍/㎖)의 첨가, 세포 + 혈청("+ 6%"), 및 세포 + 혈청 + 항체("세포+CD20+6%")를 포함한다.
도 63은 G1033에 대한 CDC 저해 데이터를 나타낸다. CD20은 CD20 항체의 첨가를 나타낸다. "6%"는 6% 혈청 상보체의 첨가를 나타낸다. 대조군은 세포 + G996 단독(50 및 100㎍/㎖)의 첨가, 세포 + 혈청("+ 6%"), 및 세포 + 혈청 + 항체("세포+CD20+6%")를 포함한다.
실시예 1 - 상보체-우선적 스트라도머
상보체-우선적 결합 스트라도머를 생성하기 위해 다양한 접근을 취하였다. 적어도 하나 점 돌연변이가 Fc 도메인 내로 도입된 스트라도머를 생성하되, 돌연변이는 상보체 결합을 향상시켰다. 구체적으로, 다음의 돌연변이는 WO 2012/016073에 기재된 GL-2045 스트라도머의 Fc 도메인의 위치 267, 268 및 324에서 이루어졌다: S267E, H268F 및 S324T. 일부 스트라도머에서, 추가적인 돌연변이는 FcγR 결합 및/또는 FcRn 결합을 변경시킴으로써 정규 FcγR 결합에 대한 상보체 결합의 비를 추가로 증가시켰다. 예시적인 스트라도머의 아미노산 서열을 상기에서 표 1 및 표 2에 나타낸다.
생성된 각각의 스트라도머에 대해, 정규 FcγR 결합, pH 7.4에서 FcRn 결합, 상보체 C1q 결합 및 CDC 저해의 수준을 결정하고, 모 스트라도머, G045c(IgG1 힌지 - IgG1CH2 IgG1 CH3 - IgG2 힌지)와 비교하였다. 추가로, 일부 화합물을 다른 다른 상보체 캐스케이드 성분에 대한 결합에 대해 평가하였다.
FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIa 또는 FcRn에 대한 상보체-우선적 스트라도머 또는 모 스트라도머 G045c의 결합을 평가하였다. 포르테바이오 옥텟 기기를 이용하여 생물학적 보호막 간섭측정법에 의해 해리의 RU 값을 측정하였다. His-태그된 수용체 단백질을 포르테바이오(ForteBio)로부터의 1X 역학 분석 완충제 중에서 센서 팁에 결합시키고, 이 후에 선택의 정제된 스트라도머를 함유하는 1x 역학 완충제에 센서 팁을 옮김으로써 수용체/단백질의 온(on) 속도를 측정하였다. 1X 역학 완충제에 센서 팁을 옮김으로써 오프(Off) 속도를 측정하고, 포르테바이오 소프트웨어를 이용하여 측정된 최대 결합으로부터 RU 값을 계산하였다. 생물학적 보호막 간섭측정법은 바이오센서 팁 표면 상에 고정된 리간드와 용액 중의 분석물 사이의 결합을 검출한다. 결합이 일어날 때, 파동 이동을 초래하는("RU"의 반응 단위로서 검출) 바이오센서 팁에서 광학 두께의 증가를 생성한다. 최대 결합 수준(RU max)은 센서 표면 상에서 리간드 양을 포화시키는 평행상태에서 샘플 결합의 최대 가능한 양이다. RU 300는 해리 300초 후에 잔여 샘플 결합이며, 시험 리간드로부터 시험 항목의 해리 속도를 특성규명하는데 유용하다.
화합물을 특성규명하기 위해, 5 Fc 수용체에 대한 생물학적 보호막 간섭측정법(RU max)에 의한 최대 결합, C1q에 대한 ELISA 결합, 및 CDC의 저해를 본 명세서에 제공된 데이터에서 제시한다. 해리 속도의 차이를 제공하기 위해, 300초에 RU는 또한 5 Fc 수용체에 대한 화합물에 대해 제공된다. RU max와 RU 300 둘 다에 대해, 각각의 경우에, 결합 및 해리의 포르테바이오생성 플롯으로부터 절대 값을 시각적으로 판독하고, 이어서, 반응을 0 내지 10 규모로 정규화하며, 여기서 0은 반응 없음이고, 10은 해당 시점, RU max 또는 RU 300 각각에서 모든 시험 화합물에 대한 해당 수용체 또는 리간드에 대해 관찰한 최대 반응이다.
C1q 결합에 대해, 96 웰 플레이트를 PBS 중에서 밤새 C1q(시그마(Sigma) 카탈로그#: C1740 1㎍/㎖)로 코팅하였다. 코팅 후에, 표준 세척 완충제(1XPBS+0.05% 트윈 20)로 3회 세척하고 나서, 2시간 동안 RT에서 차단 완충제(1%BSA+1XPBS+0.05% 트윈 20)로 차단시켰다. 차단 후에, 플레이트를 차단 완충제 100㎕/웰 중에서 희석시킨 화합물과 함께 인큐베이션시키고, 표준 세척 완충제로 3회 세척하였다. C1q-결합 화합물을 1시간 동안 실온에서 1:5000 바이오틴일화된 마우스 항-인간 IgG1(카탈로그#555869, BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 및 스트렙타비딘-HRP(카탈로그#: 7100-05 사우던 바이오테크(Southern Biotech))(100㎕/웰)과 함께 인큐베이션시킴으로써 검출한 다음에, 세척 완충제로 3회 세척하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 15분 동안 표준 TMB 방법을 이용하여 이의 색을 전개시켰다. 흡광도를 450㎚에서 판독하였다.
G045c에 대한 예시적인 Fc 수용체 결합 데이터를 도 1에 제공한다.
G997은 G045c 골격 내로 삽입된 3개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T)를 갖는 스트라도머이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 얻어진 스트라도머는 모 G045c에 대한 증가된 C1q 결합뿐만 아니라 G045c에 대한 약간 감소된 FcγRIIa 및 FcγRIIIa 결합을 나타내고, CDC 저해에 대한 효과는 나타내지 않았다. G997에 대한 Fc 수용체 결합 데이터를 또한 도 3에 제공한다.
다음에, G998을 구성하였다. G998은 G997에 대해 아미노산 위치 297에서 추가적인 돌연변이를 함유한다. 구체적으로, G998은 G045c 골격 내로 삽입된 4개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/N297A)를 가진다. G998에서 삼중 돌연변이는 강한 C1q 결합 및 CDC 저해를 회복하였고; 활성화 수용체 FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대한 결합을 제거하고, FcγRIIb를 제거한 한편, FcRn 결합은 모 스트라도머 G045c에 대해 감소되지 않았다(도 4A). 또한, 놀랍게도, FcγRI에 대한 결합은 N297A 돌연변이에도 불구하고 G998에서 완전히 유지되었다. G997, G998 및 G045c의 정규 FcγR 및 FcRn 결합에 대한 RU300의 비교를 도 4B에 제공한다. N297A 돌연변이가 생긴 비글리코실화를 고려하여, G997에 의한 저해 수용체 FcγRIIb에 대한 결합 유지는 놀라웠다. FcγRIIb 결합은 G997에 비해 G998에 대해 RU max에서 상당히 감소되었지만, G998은 RU300 데이터에서 나타낸 바와 같이 FcγRIIb로부터 매우 서서히 해리한다(도 4B). G998에 대한 Fc 수용체 결합 데이터를 또한 도 5에 제공한다.
특정 화합물 G1033 및 G1022를 또한 생성하였다. 구체적으로, G1033은 G045c 골격 내로 삽입된 6개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/N297A/L234A/L235A)를 가지며; G1022는 G045c 골격 내에 삽입된 7개의 돌연변이 (S267E/H268F/S324T/N297A/E233P/L234V/L235A 및 결실된 G236)를 가진다. G1033 및 G1022에 대한 정규 FcγR 및 FcRn RUmax 데이터, C1q 결합 및 CDC 저해를 도 6A에 제공한다. G1033은 C1q 및 FcRn에 결합하고, FcγRIIb 또는 FcγRIIIa에 대한 인식 가능한 결합 없이 CDC를 저해한다. 놀랍게도, N297A 돌연변이에 기인하는 이 화합물의 탈글리코실화에도 불구하고, 일부 결합은 FcγRI 및 FcγRIIa에 대해 유지된다. G1022는 C1q에 결합하고, FcγRI 또는 FcγRIIIa에 대한 임의의 인식 가능한 결합 없이 CDC를 저해하며; 약간의 결합이 FcγRIIb에 대해 유지되고, 보통의 결합이 이 화합물에서 FcγRIIa 및 FcRn에 대해 유지된다. G1022에서 FcγRI 결합의 제거는 고친화도 FcγRI 수용체에 대한 스트라도머의 저 치화도에서조차 본래의 아비디티 때문에 놀랍다. 따라서, G1022에서 돌연변이의 조합을 통한 FcγRI 결합의 제거는 이들 돌연변이를 함유하는 다른 스트라도머에서 유지된 FcγRI 결합에 기반하여 예상되지 않았다. 예를 들어, G998 내 돌연변이(S267E/H268F/S324T/N297A)의 조합은 FcγRI 결합의 상실을 초래하지 않았다. 저 친화도 Fc 수용체 및 CDC 저해에 대한 결합이 유지되는 스트라도머에서 FcγRI에 대한 결합이 제거될 수 있다는 것은 특히 놀라웠다. G045c, G1022 및 G1033에 대한 정규 FcγR 및 FcRn RU300 데이터의 비교를 도 6B에 제공한다.
G1032는 G045c 골격 내로 삽입된 5개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/L234A/L235A)를 가진다. FcγR 결합 RUmax, FcRn 결합 RUmax, C1q 결합 및 CDC 저해를 도 7A에 나타내고, FcR RU300 데이터를 도 7B에 나타낸다. 놀랍게도, G1032는 C1q에 결합되고, CDC를 저해하였지만, L234A 및 L235A 돌연변이에도 불구하고 강한 결합이 모든 정규 Fc 수용체에 대해 유지되었고; 보통으로 강한 결합이 FcRn에 대해 유지되었다.
G1023은 6개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/E233P/L234V/L235A) 및 위치 236에서 G의 결실을 가진다. FcγR 결합 RUmax, FcRn 결합 RUmax, C1q 결합 및 CDC 저해를 도 8A에 나타내고, FcR RU300 데이터를 도 8B에 나타낸다. G1023은 C1q에 결합하고, CDC를 저해하였고, 모든 정규 Fc 수용체에 대해 강한 결합이 유지되며, FcRn에 대해 보통으로 강한 결합이 유지되었다. 놀랍게도, G1023은 C1q에 결합되었고, CDC를 저해하였지만, E223, L234V 및 L235A 돌연변이 및 G236의 결실에도 불구하고(그리고 N297A 돌연변이를 통한 탈글리코실화의 부재 하에서), 강한 결합이 모든 정규 Fc 수용체에 대해 유지되었다.
G1006은 4개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/D265A)를 가진다. FcγR 결합 RUmax, FcRn 결합 RUmax, C1q 결합 및 CDC 저해를 도 9A에 나타내고, FcR RU300 데이터를 도 9B에 나타낸다. 이 스트라도머는 C1q에 결합되고, CDC를 저해하였으며, FcγRI, FcγRIIa에 대해, 그리고 더 적은 정도로, FcγRIIb에 대해 유지되었다. 결과는 D265A가 모든 정규 Fc 수용체에 대해 감소된 결합으로서 기재되지만, 강한 결합이 FcγRI에 대해 유지되고, 보통의 결합이 FcγRIIa에 대해 유지되기 때문에, 놀라웠다. FcγRIIIa 결합은 제거되며, 보통으로 강한 결합이 FcRn에 대해 유지되었다(도 9A).
G1027은 5개의 돌연변이(P238D/S267E/H268F/S324T/N297A)를 가진다. FcγR 결합 RUmax, FcRn 결합 RUmax, C1q 결합 및 CDC 저해를 도 10A에 나타내고, FcR RU300 데이터를 G1027에 대해 도 10B에 나타낸다. 이 스트라도머는 C1q에 결합되고, CDC를 저해하였으며, FcγRI에 대한 강한 결합을 유지하였고, FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대해 감소된 결합 및 FcRn에 대한 보통의 결합, 및 제거된 FcγRIIIa 결합을 나타내었다. 사실은 P238D 및 N297A 돌연변이가 놀라운 결과임에도 불구하고 정규 Fc 수용체 결합은 이 스트라도머에서 제거되지 않았다는 것이다.
G1003은 G019 배경(IgG2 힌지 - IgG1 힌지 - IgG1 CH2 IgG1 CH3) 상에서 구성되며, 3개의 돌연변이를 가진다: S267E/H268F/S324T. 이 스트라도머에 대한 결과를 도 11A 및 도 11B에서 제공한다. 이 스트라도머를 C1q에 결합하고, CDC를 저해하였다. 추가로, 스트라도머는 FcγRI 및 FcγRIIb에 대한 강한 결합; FcγRIIa에 대한 감소된 결합; 및 FcRn에 대한 보통으로 강한 결합을 나타내었다. G019 모 스트라도머는 최소 C1q 결합 및 CDC의 상당한 저해 없음을 나타낸다. 따라서, 이 모 스트라도머 내로 삼중 돌연변이의 혼입이 모 G019와 동일한 일반적 구조 및 다량체화 패턴을 갖지만, C1q에 대한 결합 및 CDC의 강한 저해가 있는 화합물에서 초래되었다는 사실은 특히 놀랍다. 훨씬 더 놀라운 것은 GL-2045 골격(G998을 수득) 내로 혼입된 동일한 돌연변이(S267E/H268F/S324T)가 실질적으로 상이한 결합 활성을 입증하였다는 사실이다. G997 및 G1003은 동일한 돌연변이를 갖는 동일한 도메인을 가지며, 모 화합물(각각 G045c 및 G019)이 C1q 결합 및 CDC 저해에서 상당히 상이하지만, 일반적으로 동일한 결합 속성을 제공한다. 이들 비교는 다량체화 스트라도머와 관련하여 주어진 돌연변이 세트의 예측 불가능성을 추가로 강조한다.
G989는 G045c 배경 상에 있고, 2개의 돌연변이(E233P/G236R)를 함유하며, 정규 결합을 감소시키기 위해 생성되었다. 그러나, 놀랍게도, 이 스트라도머는 감소된 정규 결합뿐만 아니라 C1q 결합 및 CDC의 상실을 나타내었다(도 12A, 도 12B 및 도 13).
따라서, 또한 G045c 배경 상에 있지만, 단일 돌연변이(G236R)만을 함유하는 G990를 생성하였다. 놀랍게도, G236R 돌연변이는 단독으로 정규 결합을 감소시키고, 최소 C1q 결합을 유지하였다(도 14A, 도 14B 및 도 15).
이들 결과에 기반하여, C1q 결합을 추가로 증가시키기 위한 시도를 위해, G994를 생성하였다. G994는 G045c 배경 상에서 만들어지며, 5개의 돌연변이: E233P/G236R/S267E/H268F/S324T를 가진다. 그러나, 놀랍게도, G994가 그것이 기반하는 G989 스트라도머의 상실된 상보체 결합 및 CDC 저해를 유지하였지만, S267E/H268F/S324T 삼중 돌연변이의 첨가는 FcγRI 및 FcγRIIb의 회복된 결합을 초래하였다(도 16A, 도 16B 및 도 17). 따라서, 상보체 결합을 증가시키는 것으로 보고된 삼중 돌연변이의 첨가는 또한 스트라도머와 관련하여 정규 Fc 수용체 결합에서 증가를 초래하였다.
따라서, G994는 다음에 C1q 결합 및 CDC 저해를 유지하고, 정규 결합 이상으로 상보체 결합에 대한 특이성을 획득하는 시도에서 플랫폼으로서 사용하였다. 구체적으로, G045c 배경 상에 있고 4개의 돌연변이(G236R/S267E/H268F/S324T)를 갖는 G996을 생성하였다. 예상치 못하게, G996은 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 추가적인 결합을 획득하였지만, 활성화 수용체 FcγRIIIa에 대해 결합을 획득하지 못하였다. 따라서, G996은 C1q에 결합하고, CDC를 저해하며, FcγRIIIa을 제외한 모든 Fc 수용체에 결합한다(도 18A, 도 18B 및 도 19, 상부 패널). 그러나, 또한 놀랍게도, G996는 마우스에서 정규 결합을 나타내지 않았고, 이는 그것을 설치류에서 순수한 CDC 저해를 평가하기 위한 이상적인 화합물로 만든다(도 19, 하부 3개의 패널).
G1042는 G045c 배경 상에 있으며, 6개의 돌연변이를 가진다(E233P, G236R, S267E, H268F, S324T 및 L328F). 따라서, G1042는 그것이 FcγRIIb에 대한 결합을 증가시키는 것으로 예상되는 돌연변이 L328F를 포함한다는 점에서 G994와 상이하다. 놀랍게도, G1042는 FcγRIIb에 대해서뿐만 아니라 FcγRI 및 FcγRIIa에 대한 강한 결합을 초래하였다(도 20A, 도 20B 및 도 21).
G1043 및 G1046은 각각 G045c 배경 상에 있고, 각각 5개의 돌연변이: 각각 P238D/D265G/S267E/H268F/S324T 및 P238D/D265W/S267E/H268F/S324T를 가진다. 이들 스트라도머 둘 다에 대해, 다른 돌연변이에 대한 P238D 돌연변이의 첨가는 놀랍게도 FcγRIIa에 대한 결합을 초래하였다(도 22 내지 도 25). 스트라도머는 둘 다 위치 238에서 돌연변이에 기인하여 FcγRIIb에 대해 증가된 결합 및 FcγRIIa에 대해 감소된 결합을 갖는 것으로 예상되었지만; 그러나, 놀랍게도, G1043은 FcγRIIa와 FcγRIIb 둘 다에 대해 결합을 나타내고(도 22A, 도 22B 및 도 23), G1046은 FcγRIIa에 대해(그러나 FcγRIIb에 대해서는 아님) 결합을 나타내었다(도 24A, 도 24B 및 도 25 참조).
G1050은 G045c 배경 상에 있으며, 8개의 돌연변이 및 위치 236에서 결실 (E233P/L234V/L235A/S267E/H268F/N297A/S324T/S328F, 및 위치 236에서 결실)을 가진다. 이들 돌연변이는 (E233P/L234V/L235A에서 돌연변이 및 236에서 결실에 기인하여) FcγRIIa 및 FcγRIII에 대한 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 것으로 예상되었지만, (위치 328에서 돌연변이에 기인하여) FcγRIIb에 대해 결합을 유지하였고; 그러나, 놀랍게도, G1050는 FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 결합을 나타내었지만, FcγRI 또는 FcγRIII에 대한 결합을 나타내지 않았다(도 26A, 도 26B 및 도 27 참조).
G1049는 G019 배경 상에 있으며, 4개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/L328F)를 가진다. 따라서, G1003에 비해, G1049는 FcγRIIb만에 대해 결합을 증가시키는 것으로 예상된 L328F에서의 추가적인 돌연변이를 가진다. 그러나, 놀랍게도, G1049는 모든 정규 FcγR에 대해 강한 결합을 나타내며(도 28A, 도 28B 및 도 29), 매우 놀랍게도 C1q에 대한 강한 결합 및 CDC의 저해를 입증하는 반면, G019는 그렇지 않다. 따라서, C1q에 대한 강한 결합 및 CDC의 저해는 G019 배경 구조를 갖는 스트라도머에서의 점 돌연변이를 통해 달성될 수 있었다는 것은 특히 놀라웠다.
G1025는 G045c 배경 상에 있으며, 4개의 돌연변이 (P238D/S267E/H268F/S324T)를 가진다. 위치 238에서 돌연변이는 FγRIIb에 대한 결합을 증가시키고, FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIIa에 대한 결합을 감소시키는 것으로 예상되지만; 그러나, 놀랍게도, FcγRIIIa에 대한 결합만이 감소되었고, 스트라도머는 FcγRIIb, FcγRI 및 FcγRIIa에 대한 강한 결합을 유지하였다(도 30A 및 도 30B).
연구 결과의 전체 요약을 표 3에 제공한다.
상보체-우선적 스트라도머 활성의 요약
FcγRI 결합 FcγRIIa
결합		 FcγRIIb
결합		 FcγRIIIa
결합		 FcRn
결합		 C1q
결합		 CDC 저해
G994 *** - * - *** *** *
G996 *** *** *** - *** *** *
G997 *** ** *** *** *** *** *
G998 *** - * - *** *** *
G1003 *** * *** ** *** *** *
G1006 *** ** * - *** *** *
G1023 *** *** *** *** *** *** *
G1022 - ** * - *** *** *
G1025 *** *** *** - *** *** *
G1027 *** * * - *** *** *
G1032 *** *** *** *** *** *** *
G1033 * * - - *** *** *
G1042 *** *** *** - *** *** *
G1043 *** * ** - *** *** *
G1046 *** * * - *** *** (*)
G1049 *** *** *** ** *** *** *
G1050 - *** *** - *** *** *
(*)는 미미한 활성을 나타냄
(-) 결합 없음을 나타냄
실시예 2 - 상보체-우선적 스트라도머는 C1q에 대한 유지된 또는 향상된 결합을 나타낸다
모 GL-2045에 대한 또는 Fc 음성 대조군 G001에 대한 비교에서 스트라도머 G994, G996, G997 및 G998 중에서의 C1q 결합의 비교를 도 31에 제공한다. 도 31A는 증가하는 농도의 표시된 스트라도머에서 흡광도를 나타내고, 도 31B는 각각의 시험 스트라도머에 대한 log-전환 데이터 및 EC50 값을 나타낸다. Ec50 값을 ㎍/㎖로 나타낸다. 종합하면, 상기 데이터는 스트라도머 G997, G998, G996 및 G994가 G001에 비해 우수한 C1q 결합(IgG1 Fc 대조군)뿐만 아니라 모 스트라도머 GL-2045에 비해 우수한 Clq 결합을 나타낸다는 것을 입증한다.
종합하면, 연구 결과는 본 명세서에 제공된 스트라도머가 C1q에 대한 결합 및 FcγRI, FcγRII, 및/또는 FcγRIII에 대한 최소 결합 또는 결합 없음을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 3 - 상보체-우선적 스트라도머의 C3 결합
C3에 대한 상보체-우선적 스트라도머의 결합을 평가하기 위해 연구를 수행하였다.
96 웰 플레이트를 C3 상보체 성분(퀴델(Quidel), #A401; PBS 중에서 1㎍/㎖)으로 밤새 4℃에서 코팅한 다음, 300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20을 이용하여 3x 세척하였다. 플레이트를 PBS 1X + 2% BSA + 0.05% 트윈 20을 이용하여, 2시간 동안 실온에서 차단시켰다. 시험할 화합물(GL-2045, G001, G997, G998, G994 또는 G996)를 결합된 C3과 함께 인큐베이션시켜, 2시간 동안 실온에서 100㎍/㎖에서 시작해서 차단 완충제 중에서 1:1로 0.78125㎍/㎖까지 희석시키고), 다음에 3 x(300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20) 세척하였다. C3과 상호작용하는 화합물을 PBS-BSA-T 1:10 및 1:50 100㎕/웰 중에서 1시간 동안 실온에서 바이오틴 마우스 항-인간 IgG1, (BD# 555 869) + 스트렙타비딘-HRP(카탈로그#: 7100-05 사우던 바이오테크) 1/5 000(ea.)에 의해 검출 한 다음, 4 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20) 세척하였다. 20분 당 웰 당 TMB 기질 시약 100㎕로 색을 전개시키고, 50㎕ H2SO4 1M을 이용하여 반응을 중단시키고 나서, 흡광도를 450/650㎚에서 판독한다.
연구 결과를 도 32에 나타낸다. 음성 대조군 G001 및 스트라도머 G996은 C3에 결합하지 않는다. G997은 음성 대조군 및 모 GL-2045 스트라도머에 비한 C3 결합의 중간체 수준을 나타내었다. G994, GL-2045 및 G998은 가장 높은 C3 결합을 나타내었다.
실시예 4 - 상보체-우선적 스트라도머의 C3b, C4 및 C5 결합
C3b, C4 및 C5에 대한 상보체-우선적 스트라도머의 결합을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
C3b 결합에 대해, 96 웰 플레이트를 C3b 상보체 성분(겐웨이 바이오테크(GenWay Biotech) #GWB-8BA994; PBS 중에서 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 100㎕ C3b 상보체 성분을 웰 당 첨가하고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션 시킨 다음, 3 x(300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20) 세척하였다. 플레이트를 차단 완충제(PBS 1X + 2% BSA + 0.05% 트윈 20) 중에서 2시간 동안 실온에서 차단시킨 다음, 3x(300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20) 세척하였다. 시험될 화합물(G001, GL-2045, G997, G998 또는 G994)을 C3b과 4시간 동안 실온에서 반응시키고, 100㎍/㎖에서 시작해서 희석시키고, 1:1로 희석하여 차단 완충제 중에서 0.78125㎍/㎖까지 희석시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 결합된 화합물을 차단 완충제 100㎕ 중에서 1시간 동안 실온에서 바이오틴일화된 마우스 항-인간 IgG1(BD# 555 869) + 스트렙타비딘-HRP(카탈로그#: 7100-05 사우던 바이오테크) 1/5000(ea.)을 이용하여 검출하였다. TMB 기질 시약을 이용하여 20분 동안 실온에서 색을 전개시키고, 50㎕ H2SO4 1M을 이용하여 반응을 중단시켰다. 흡광도를 450/650㎚에서 판독하였다.
C4 결합을 위해, 96 웰 플레이트를 C4 상보체 성분(퀴델(Quidel) #A402, PBS 중에서 1㎍/㎖)로 코팅하였다. 100㎕ C4 상보체 성분을 웰마다 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 플레이트를 차단 완충제(PBS 1X + 2% BSA + 0.05% 트윈 20) 중에서 2시간 동안 실온에서 차단시킨 다음, 3x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 시험할 화합물(G001, GL-2045, G996, G997, G998 또는 G994)을 4시간 동안 실온에서 C4와 반응시키고, 희석을 100㎍/㎖에서 시작해서 1:1로 차단 완충제 중에서 0.78125㎍/㎖로 희석시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 결합 화합물을 1시간 동안 실온에서 차단 완충제 100㎕ 중에서 바이오틴일화된 마우스 항-인간 IgG1 (BD# 555 869) + 스트렙타비딘-HRP(카탈로그#: 7100-05 사우던 바이오테크) 1/ 5000(ea.)로 검출하였다. TMB 기질 시약을 이용하여 20분 동안 실온에서 색을 전개시키고, 50㎕ H2SO4 1M을 이용하여 반응을 중단시켰다. 450/650㎚에서 흡광도를 판독하였다.
C5 결합에 대해, 96 웰 플레이트를 C5 상보체 성분(퀴델 #A403, PBS 중에서 1㎍/㎖)으로 코팅하였다. 웰마다 100㎕의 C5 상보체 성분을 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 플레이트를 차단 완충제(PBS 1X + 2% BSA + 0.05% 트윈 20) 중에서 2시간 동안 실온에서 차단시킨 다음, 3x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20) 세척하였다. 시험할 화합물(G001, GL-2045, G996, G997, G998 또는 G994)을 C5와 4시간 동안 실온에서 반응시키고, 희석을 100㎍/㎖에서 시작해서 1:1로 차단 완충제 중에서 0.78125㎍/㎖로 희석시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 결합된 화합물을 차단 완충제 100㎕ 중에서 1시간 동안 실온에서 바이오틴일화된 마우스 항-인간 IgG1(BD# 555 869) + 스트렙타비딘-HRP(카탈로그#: 7100-05 사우던 바이오테크) 1/5000 (ea.)로 검출하였다. TMB 기질 시약을 이용하여 20분 동안 실온에서 색을 전개시키고, 50㎕ H2SO4 1M을 이용하여 반응을 중단시켰다. 450/650㎚에서 흡광도를 판독하였다.
연구 결과를 도 33(C3b 상보체 성분), 도 34(C4 상보체 성분) 및 도 35(C5 상보체 성분)에 나타낸다. 음성 대조군 G001은 C3b, C4 또는 C5에 결합하지 않는다. 모 스트라도머 GL-2045는 C5에 결합하지 않지만, C3b 또는 C4에 대한 결합을 나타내지 않는다. 대조적으로, 상보체-우선적 스트라도머 G994, G997 및 G998은 각각 C4뿐만 아니라 C5에 결합되었다.
실시예 5 - 항-Thy 1 모델에서 신장염에 대한 상보체 우선적 스트라도머 치료
상보체 우선적 스트라도머를 Thy-1 신장염 모델(항 Thy-1 유도 사구체간질 증식성 사구체 신염)에서 평가하였다. 이 모델에서, 흉선세포에 대한 항체(ATS)는 래트 사구체 간질 세포 상에 존재하는 표면 Thy-1 항원에 반응성이다(Yamamoto 1987 및 Jefferson 1999). ATS의 투여는 상보체-의존적 사구체간질융해 다음에, 주사 후 5일 내에 최대인 빠른 사구체 간질 증식성 사구체 신염을 유도하고, 이어서, 시간에 따라 용해한다.
사구체 신염을 유도하기 위해 위스터 래트(n=8)에서 마우스 항-래트 CD90(Thy1.1)(세다 레인(Cedar Lane)) 주사의 제0일에 질환을 유도하였다. 제0일, 제2일, 제4일 및 제6일에, 동물에 40㎎/㎏ G998, 80㎎/㎏ G998, 80㎎/㎏ G994 또는 80㎎/㎏ G1033을 투여하였다. 대조군, 비질환 동물은 항-Thy 1 항체 또는 다른 치료를 받지 않았다. 양성 대조군 타크롤리무스에 항혈청 주사 전 -제9일에 시작해서 매일 근육내로 1㎎/㎏으로 투약하였다. 제0일 투약은 항혈청 주사 4시간 전이다. 투약 전 및 항혈청 주사 후 제3일, 제5일, 제7일 및 제9일에 소변을 수집하였다. 연구의 마지막에 래트로부터 신장을 수집하고 나서, 조직 분석을 위해 10% 포말린 중에 고정시켰다. 혈청 BUN 분석을 위해 혈청을 수집하였다.
연구 결과를 도 37, 도 38A, 도 38B, 도 39 및 도 40; 및 표 4에서 제공한다. 도 37, 이하의 표에서, 그래프는 PBS 대조군 마우스에 대한 P값을 제공한다. 각각 3가지의 시험 화합물 G994, G998 및 G1033은 단백뇨를 상당히 감소시켰다. 도 38A 및 도 38B는 병에 걸린 PBS 대조군(도 38A) 및 40㎎/㎏ G998로 처리한 마우스(도 38B)의 조직학적 분석을 나타낸다. 표 4 및 도 39는 PBS 대조군(표 3의 그룹 2로서 제시함) 및 40㎎/㎏ G998 그룹(표 3의 그룹 4에서 제시함)에서 각각의 동물의 조직학적 분석의 정량화를 제공한다. 표 4에 제시한 결과를 도 39에서 그래프로 제공한다.
제9일에, 각각의 동물로부터 혈청을 수집하고 나서, 혈액 요소성 질소(BUN)에 대해 분석하였다. 상보체 우선적 스트라도머에 의한 치료를 받은 각각의 동물에서, BUN은 병에 걸린 PBS 대조군 동물에 비해 상당히 감소되었는데, 이는 개선된 사구체 여과율을 나타내고, 따라서 개선된 질환을 나타낸다(도 40).
실시예 6 - 수동 히만 신염 모델에서 신장염에 대한 상보체 우선적 스트라도머 치료
항 Fx1a 혈청(프로베텍스(Probetex) 카탈로그# PTX-002S)의 주사에 의해 제0일에 래트에서 질환을 유도하였다. G998을 제0일 항혈청 주사 전 2시간(투약 제0일) 또는 제1일 항혈청 주사 전 1일에(투약 1일)에 60㎎/㎏로 투약하고, 3주 동안 2회/주로 투약을 계속하였다. 비히클 대조군 마우스는 항 Fx1a 혈청만을 받았다. 투약 전 그리고 항혈청 주사 후 제1주, 제2주 및 제3주에 소변을 수집하고 나서, 단백뇨에 대해 평가하였다.
연구 결과를 도 41에 제공한다. 제21일까지, G998 그룹은 둘 다 대조군 동물에 대해 단백뇨의 상당한 감소를 나타내었다(제0일 G998 그룹에 대해 p=0.0220 및 제1일 G998 그룹에 대해 p=0.0145).
실시예 7 - 래트에서 상보체 우선적 화합물의 약물 수준 및 기능성 반감기
단일 투약 후에 래트에서 상보체 우선적 스트라도머 G994, G998 및 G1033의 반감기를 측정하기 위한 연구를 취하였다. 상이한 시점에 취한 혈액 샘플 중에서 상보체 활성을 평가함으로써 기능성 반감기를 측정하였다. 혈액 샘플을 또한 약물 표적, 상보체 인자 c1q의 수준에 대해 측정하였고, 약물 및 C1q의 분획이 결합되는 것을 평가하였다.
스프레그-돌리 래트(그룹 당 4마리 동물)에 60㎎/㎏으로 화합물 G994, G998 또는 G1033의 정맥내 단일 투약을 제공하였다. 사전 투약, 시험 화합물 투여 후 1, 4 및 8시간에 사전 냉장시킨 헤파린 처리 관에서 안구 뒤 출혈에 의해 각각의 동물로부터 혈액 샘플(1.2 내지 1.4㎖)을 수집하였다. 또한 혈액 샘플을 제1일, 제2일, 제4일, 제7일 및 제10일에 수집하였다.
ELISA에 의해 혈장 샘플 중에서 약물 수준을 측정하였다. 이 ELISA 분석에서, 화합물 G994, G998, G1033 중의 IgG1 Fc는 플레이트 표면에 흡착된 항-인간 IgG Fc 항체(써모(Thermo) #MA1-83240)와 반응되었다. 세척에 의해 비결합 샘플 단백질의 제거 후에, 스트렙타비딘 겨자무과산화효소(HRP, 사우던 바이오테크 #7100-05)와 접합된 바이오틴일화된 항-인간 IgG1(BD #555869)을 첨가하였다. HRP-접합 항체는 이전에 결합된 IgG1과 함께 복합체를 형성한다. 색원체 기질(TMB, BD #555214)의 첨가에 의해 복합체를 분석하였다. 혈청 샘플 중의 G994, G998 및 G1033의 양은 원숭이 혈청 중에서 혼합된 동일한 화합물로부터 만들어진 표준 곡선으로부터 보간되었고, 샘플 희석을 위해 보정하였다.
시험관내 상보체 의존적 세포 사멸 분석을 이용하여 래트 혈장 샘플에서 상보체 활성을 측정하였다. 간략하게, CD-20 발현 Will2 세포를 37에서 CD-20 단클론성 항체와 함께 20분 동안 세포 배지에서 인큐베이션시켰고, 이후에, 세포를 교반시키고 나서, 새로운 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에 분포시키고, 이후에 상이한 시점으로부터의 래트 혈장을 세포 현탁액에 첨가하고 나서, 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 웰에 세포독소 분석 시약(Cytotox Assay Reagent)(프로메가(Promega))을 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 15분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 프로메가 글로맥스 루미노미터(Promega GloMax luminometer) 상에서 발광을 판독하였고, 세포사를 계산하였다. 분석에서 상보체 활성을 상이한 혈장 수준에서 측정하고, 2% 및 4% 혈장에 대한 값을 분석을 위해 사용하였다.
항체 대조군 샘플을 차감하지 않은 후에 투약 전 샘플 중의 상보체 활성에 대해 각각의 샘플에서 상보체 활성 백분율을 계산하였다.
연구 결과를 도 42 내지 도 45에 제공한다. 도 42는 G994, G998 및 G1033의 반감기를 제공한다. G994는 이 실험에서 시험한 다른 2가지의 화합물보다 상당히 더 긴 반감기를 가졌다. 화합물 G994는 장기간 시간 기간 동안 래트 혈액 중에서 상보체 활성을 제거하였다. G994를 투약한 후 상보체 활성은 96시간(4일)까지 낮게 남아있었고, 제10일에 정상 수준의 대략 50%였다. 화합물 G998 및 G1033은 래트에서 다소 더 짧은 반감기를 나타내었다. 화합물 G998에 대해, 투약 전 상보체 수준의 대략 50%는 제2일에 존재하였다. 화합물 G1033에 대해, 기능성 반감기는 2 내지 4일이었다.
도 43은 G994, G998 또는 G1033의 단일 투약 후에 래트 혈액에서 상보체 활성을 제공한다. 상보체 활성은 분석에서 2% 또는 4% 혈장 수준에서 측정한 바와 같은 세포사의 백분율로서 표현한다. 도 44a 및 도 44b는 각각의 상보체 우선적 화합물 G994, G998 및 G1033에 대한 약물 수준과 상보체 활성 사이의 상관관계를 제공한다. 도 44a는 연구에서 수집한 모든 데이터 지점을 제공하고, 도 44b는 더 나은 약물 농도 데이터 지점에 중점을 둔다(G994 및 G998에 대해 0 내지 250㎍/㎖, 및 G1033에 대해 0 내지 150㎍/㎖). 래트 혈액에서 상보체 활성을 제거하는 데 필요한 약물 수준은 추정 수준 x 절편값으로부터 추정하였다. G994에 대해 x 절편값은 2% 및 4% 혈청에 대해 164 및 170㎍/㎖이다. 상관관계에 대한 R2 값은 0.696 및 0.558이다. G998에 대해 x 절편값은 158 및 193㎍/㎖이고, 2% 및 4% 혈청에 대해 R2 값은 0.519 및 0.560이다. G1033에 대해, x 절편은 88 및 109 ㎍/㎖이고, R2 값은 0.612 및 0.648이다.
추정된 x 절편 수준으로부터, 대략 100 내지 200㎍/㎖의 화합물 G994 및 G998이 상보체 활성을 제거하는 데 필요하다. 화합물 G1033에 대해, 상보체 활성을 제거하는데 필요한 적절한 양은 100㎍/㎖이다.
실시예 8 - 사이노몰거스 원숭이에서 약동학적 연구
상보체 우선적 화합물의 단일 투약 후에 사이노몰거스 원숭이에서 G994, G998 또는 G1033의 반감기를 측정하기 위한 연구에 착수하였다.
사이노몰거스 원숭이(그룹 당 3마리 동물)에 28㎎/㎏의 용량으로 화합물 G994 G998 또는 G1033의 단일 투약을 피하로 제공하였다. 투약 전 혈액 샘플(대략 3㎖)을 투약 전에 그리고 투약 후 1, 2, 4, 12, 24, 48, 72, 144, 216 및 312시간에 각각의 동물로부터 혈청 분리기 관에 수집하였다. ELISA에 의해 혈청 샘플 중에서 약물 수준을 측정하였다. 이 ELISA 분석에서, 화합물 G994, G998, G1033 중의 IgG1 Fc는 플레이트 표면에 흡착된 항-인간 IgG Fc 항체(써모 #MA1-83240)와 반응한다. 세척에 의해 비결합 샘플 단백질의 제거 후에, 스트렙타비딘 겨자무과산화효소(HRP, 사우던 바이오테크 #7100-05)에 접합된 바이오틴일화된 항-인간 IgG1(BD #555869)을 첨가하였다. HRP-컨쥬게이트된 항체는 이전에 결합된 IgG1과 함께 복합체를 형성한다. 색원체 기질(TMB, BD #555214)의 첨가에 의해 복합체를 분석하였다. 혈청 샘플 중의 G994, G998 및 G1033의 양은 원숭이 혈청 중에서 혼합된 동일한 화합물로부터 만들어진 표준 곡선으로부터 보간되었고, 샘플 희석을 위해 보정하였다.
시험관내 상보체 의존적 세포 사멸 분석을 이용하여 사이노몰거스 혈청 샘플에서 상보체 활성을 측정하였다. 간략하게, CD-20 발현 Will2 세포를 37℃에서 세포 배지에서 20분 동안 CD-20 단클론성 항체와 함께 인큐베이션시키고, 이후에, 세포를 교반시키고 나서, 새로운 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에 분포시키고, 이후에 상이한 시점으로부터의 혈청을 세포 현탁액에 첨가하고 나서, 플레이트를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포독소 분석 시약(프로메가)를 각각의 웰에 첨가하고 나서, 플레이트를 실온에서 15분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 프로메가 글로맥스 루미노미터 상에서 발광을 판독하였고, 세포사를 계산하였다. 분석에서 상보체 활성을 상이한 혈장 수준에서 측정하고, 2% 및 4% 혈장에 대한 값을 분석을 위해 사용하였다.
항체 대조군 샘플을 차감하지 않은 후에 투약 전 샘플 중의 상보체 활성에 대한 샘플 중의 상보체 활성 백분율을 계산하였다.
연구 결과를 도 45 내지 도 47에 제공한다. 도 45는 화합물의 단일 투약 후 시험한 각각의 상보체 우선적 스트라도머의 약물 수준을 나타낸다. G994는 화합물 G998 및 G1033보다 상당히 더 낮은 피크 농도에 도달하였지만, 상당히 더 긴 반감기를 가졌다. 도 46은 G994(좌측 패널), G998(중간 패널) 또는 G1033(우측 패널)의 단일 투약 후에 시간에 따른 상보체 활성(세포사%)을 나타낸다. 도 47a 및 도 47b는 연구에서 약물 수준과 시험한 화합물의 상보체 활성 사이의 상관관계를 나타낸다. 도 47a는 실험에서 수집한 모든 데이터 지점을 나타내고, 도 47b는 더 낮은 약물 농도로, 곡선의 첫 번째 부분을 나타낸다.
화합물 G994, G998 및 G1033의 단일 투약 후에 상보체 활성화를 나타내는 C4a, C3a 및 C5a의 수준을 결정하기 위한 연구를 또한 수행하였다. 각각의 C4a, C3a 및 C5a의 농도를 상업적으로 입수 가능한 ELISA를 이용하여 상기 기재한 바와 같이 수집한 혈청으로부터 결정할 것이다. 이들 연구 결과는 C4a, C3a, 및/또는 C5a의 농도 감소에 의해 결정되는, G994, G998 또는 G1033 중 하나의 단일 투야 후에 시간에 따라 상보체 활성화의 감소를 나타낼 것이다.
상보체 우선적 화합물의 단일 투약 후에 남아있는 상보체 활성 분석은 화합물 G994는 장기간의 시간 기간 동안 사이노몰거스 혈액 중의 상보체 활성을 제거한다는 것을 나타낸다. G994와 함께 투약 후에 상보체 활성은 312시간(13일)까지 낮게 남아있었다. 화합물 G998 및 G1033은 사이노몰거스 원숭이에서 다소 더 짧은 반감기를 나타내었다. 화합물 G998에 대해, 투약 전 상보체 수준의 대략 50%는 제6일에 존재하였다. 화합물 G1033에 대해, 기능성 반감기는 9 내지 13일이 되는 것으로 여겨진다. 모든 화합물에 대해, 상보체 활성은 대략 4시간 동안 혈액 중에 남아있었다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이는 피하 투약 화합물의 상대적으로 느린 흡수에 기인할 수 있다.
사이노몰거스 혈액 중에서 상보체 활성을 제거하는 데 필요한 약물 수준을 추정하기 위해 약물 수준과 상보체 활성 사이의 상관관계 분석(도 47b)을 사용하였다. 추정된 x 절편 수준으로부터, 대략 150㎍/㎖의 화합물 G994은 상보체 활성을 제거하는 데 필요하다. 화합물 G998 및 G1033에 대해, 대략의 값은 300 내지 400㎍/㎖이다.
상기 기재한 바와 같이 G994, G998 또는 G1033으로 처리한 사이노몰거스 원숭이로부터의 혈청 샘플 중에서 C1q 수준을 측정한다. C1q ELISA를 통해 정량적 측정을 평가한다. 화합물에 의해 결합된 C1q에 대한 분획을 결정하기 위해 공동-면역침전을 통해 혈청 샘플을 또한 분석한다. 약물에 결합된 C1q 분획을 결정하기 위해, C1q에 대한 포획 항체를 이용한 다음, 상보체 우선적 약물의 인간 IgG1 부분에 대한 항체를 검출하여 C1q ELISA를 수행하였다. 이는 약물-C1q 복합체를 포획하고, 정량화할 것이다. 이 다음에, 샘플 중의 비결합 C1q를 정량화하기 위한 포획 및 검출 항체로서 C1q 항체를 이용하여 C1q ELISA에서 상기 동일한 ELISA로부터 상청액을 시험할 것이다.
실시예 9 - 상보체-우선적 스트라도머 G994, G996 및 G1033의 C3, C3b, C4 및 C5 결합
상보체-우선적 스트라도머 to C3, C3b, C4 및 C5의 결합을 평가하기 위해 추가적인 연구를 수행하였다. 96 웰 플레이트를 밤새 4℃에서 웰 마다 PBS 100㎕ 중의 상보체 성분(퀴델 #A401, C3에 대해 1㎍/㎖; 겐웨이 바이오테크(GenWay Biotech) #GWB-8BA994, C3b에 대해 1㎍/㎖; 퀴델 #A402, C4에 대해 1㎍/㎖; 및 퀴델 A403, C5에 대해 1㎍/㎖)으로 코팅한 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 플레이트를 차단 완충제(PBS 1X + 2% BSA + 0.05% 트윈 20) 중에서 2시간 동안 실온에서 차단시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20)로 세척하였다. 화합물을 실온에서 2시간 동안 상보체 성분과 반응시키고, 100㎍/㎖에서 시작해서 차단 완충제 중에서 1:1로 희석시킨 다음, 3 x (300㎕ PBS 1X 0.1% 트윈 20) 세척하였다. 결합된 화합물을 차단 완충제 100 ㎕ 중에서 1시간 동안 실온에서 각각 바이오틴일화된 마우스 항-인간 IgG1 (BD# 555 869) + 스트렙타비딘-HRP(카탈로그#: 7100-05 사우던 바이오테크) 1/ 5000으로 검출하였다. TMB 기질 시약 20분 동안 실온에서 색을 전개시키고 나서, 반응을 50㎕ H2SO4 1M을 이용하여 중단시키고, 450/650㎚에서 흡광도를 판독하였다.
연구 결과를 도 49에 제공한다. 모든 상보체-우선적 스트라도머 G994, G998 및 G1033은 각각의 상보체 인자 C3, C3b, C4 및 C5에 결합되었다. 추가로, G1033은 GL-2045에 대해 또는 다른 상보체-우선적 스트라도머 G994 및 G998에 비해 직접적 결합 분석에서 이들 상보체 인자에 대해 상당히 더 높은 결합을 나타내었다.
실시예 10. 상보체-우선적 스트라도머 G994, G996 및 G1033의 사이토카인 유도
단리된 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)로부터 G994 및 G1033의 사이토카인 유도를 평가하기 위해 추가적인 연구를 수행하였다. 헤파린-코팅 혈액 수집관에서 100㎖의 인간 혈액을 수집하였다. 10㎖의 혈액 분취액을 50㎖ 원뿔형 관에 옮기고, 10㎖ PBS로 희석시킨 후에, 부드럽게 혼합한다. 50㎖ 원뿔형 관에서 희석 혈액의 20㎖ 샘플을 15㎖ 피콜-플라크 플러스(Ficoll-Paque PLUS) 상에서 층상화하고, 30 내지 40분 동안 18 내지 20℃에서 400 x g로 원심분리하였다. 원심분리 후에, 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여 상부층을 제거하고, 계면에서 방해되지 않은 림프구 층을 남겼다. 림프구 층을 깨끗한 50㎖ 원뿔형 관에 옮기고 나서, 30 ㎖의 PBS를 첨가하였다. 희석시킨 림프구 층을 18 내지 20℃에서 10분 동안 60 내지 100 x g로 원심분리시켰다. 원심분리 후에, 상청액을 제거하고 나서, 세포를 30 ㎖의 PBS 중에서 세척하고, 다시 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충한 1 내지 2㎖의 RPMI 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 계수화하고 나서, a5 x 106개 세포/관으로 관 내로 분취시키고, 4 또는 24시간 동안 시험 물질(G019, G994 또는 G1033)과 함께 인큐베이션시켰다. 4 및 20시간에 사이토카인 수준을 상업적 ELISA 키트에 의해 결정하였다.
이 연구 결과를 도 55a 및 도 55b에 나타낸다. G1033도 또는 G994도 전염증 사이토카인, TNFα을 유도하지 않았다(도 55b). 유사하게, 두 화합물 중 어떤 것도 항-염증 사이토카인, IL-1Rα를 유도하지 않았다(도 55a). 이는 G019(정규 수용체에 결합하지만 상보체에 결합하지 않음)가 사이토카인을 둘 다 유도하기 때문에, 정규 FcγR에 결합하는 G1033 및 G994의 불능에 기인할 가능성이 있다.
실시예 11 - 확립된 관절염의 치료를 위한 상보체-우선적 스트라도머
암컷 루이스 래트에서 확립된 II형 콜라겐 관절염에서 생기는 부종의 저해에서 G994, G998 및 G1033의 효능을 결정하기 위해 콜라겐-유도 관절염(CIA) 연구를 수행하였다. 관절염을 유도하기 위해 래트에 돼지 II형 콜라겐으로 진피내/피하(ID/SC)로 주사하였다. 이어서, 래트에 제11일, 제13일 및 제14일에 인산염 완충 식염수(PBS 대조군), G994(40㎎/래트), G998 (40㎎/래트) 또는 G1033(40㎎/래트)로 정맥내(IV)로 투약하였다. 양성 대조군에 기준 화합물 덱사메타손(Dex, 0.075㎎/㎏)으로 제11일 내지 제16일에 경구(PO) 경로로 매일(QD) 처리하였다. 연구 완료후까지 맹검처리하였다. 효능 평가는 발목 캘리퍼 측정에 기반하였다(도 57).
이들 연구는 상보체-우선적 화합물, G994, G998 및 G1033이 관절염의 루이스 래트 CIA 모델에서 염증을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 12 - G994 또는 G998로부터 유래된 스트라 도머
특정 잔기에서 돌연변이 기능을 평가할 뿐만 아니라 추가적인 상보체 우선적 스트라도머를 동정 및 시험하기 위해 염기 서열로서 G994를 이용하여 추가적인 스트라도머를 생성하였다. G994(서열번호 10 또는 11)은 G045c 배경 및 위치 233, 236, 267, 268 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 스트라도머이다. 구체적으로, G994는 다음의 돌연변이를 가진다: E223P, G236R, S267E, H268F 및 S324T.
236 위치에서 돌연변이 기능을 분석하기 위해, 야생형 아미노산(세린)이 267 위치에 존재하는 스트라도머를 생성하였고, 236 위치를 알기닌(G994에서와 같음)으로 또는 알기닌과 유사한 잔기 중 하나로 돌연변이 시키고, 남아있는 G994 돌연변이(E233P, H268F 및 S324T)를 제공한다. 생성된 화합물을 이하의 표 5에 제공한다:
위치 236에서 G994 염기 및 추가적인 돌연변이를 갖는 상보체 우선적 스트라도머
스트라도머 서열번호 돌연변이된 아미노산
1103 65 E233P, G236E, 267S, H268F, S324T
1088 28 E233P, G236Q, 267S, H268F, S324T
1089 29 E233P, G236R, 267S, H268F, S324T
1104 66 E233P, G236D, 267S, H268F, S324T
1082 30 E233P, G236H, 267S, H268F, S324T
1105 31 E233P, G236N, 267S, H268F, S324T
1106 32 E233P, G236K, 267S, H268F, S324T
놀랍게도, 위치 236의 알기닌, 또는 알기닌과 유사한 아미노산으로의 돌연변이는 G994에 대해 정규 결합 및 상보체 결합을 변경시켰다. 위치 236의 글루탐산 또는 아스파르트산(각각 G1103 및 1104)으로의 돌연변이는 정규 FcγR에 대한 높은 결합을 초래하였고, C1q에 대한 높은 결합을 유지하며, CDC를 저해하였다. 따라서 화합물 G1103 및 G1104는 일반적 스트라도머로 고려될 수 있으며, 모 스트라도머(G045c)에 비해 정규 및 C1q 결합이 증가되었다. 대조적으로, 위치 236의 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴(각각 G1088, 1082 및 1105)으로의 돌연변이는 감소된 정규 결합을 초래한 한편, CDC의 높은 C1q 결합 및 저해를 유지하였다. 따라서 화합물 1088, 1082 및 1105는 G994, G998 및 G1033과 유사한 치료적 적용 가능성을 갖는 상보체-우선적 스트라도머로 고려될 수 있다. 위치 236의 라이신(G1106)으로의 돌연변이는 FcγRI 결합을 제외하고 C1q와 정규를 둘 다 제거하였고, CDC를 저해하는 것의 불능을 초래하였다.267 위치에서 돌연변이 기능을 분석하기 위해, 야생형 아미노산(글리신)이 236 위치에서 존재하는 스트라도머를 생성하였고, 236 위치는 글루탐산(G994에서와 같음) 또는 글루탐산과 유사한 잔기 중 하나로 돌연변이되며, 남아있는 G994 돌연변이(E233P, H268F 및 S324T)가 존재한다. 생성된 화합물을 이하의 표 6에 제공한다:
위치 267에서 G994 염기 및 추가적인 돌연변이를 갖는 상보체 우선적 스트라도머
스트라도머 서열번호 돌연변이된 아미노산
1102 67 E233P 236G, S267Q, H268F, S324T
1100 33 E233P 236G, S267R, H268F, S324T
1101 68 E233P 236G, S267D, H268F, S324T
1125 69 E233P 236G, S267H, H268F, S324T
1108 34 E233P 236G, S267N, H268F, S324T
1109 70 E233P 236G, S267E, H268F, S324T
1084 35 E233P 236G, S267K, H268F, S324T
위치 267의 아스파라긴(G1108)으로의 돌연변이는 감소된 정규 결합을 초래하는 한편, 높은 정도의 C1q 결합 및 CDC 저해를 유지하였다. 따라서 G1108은 G994, G998 및 G1033과 유사한 치료적 적용 가능성을 갖는 상보체-우선적 스트라도머로 고려될 수 있다. 그러나, 위치 267의 글루타민, 아스파르트산, 히스티딘 또는 글루탐산으로의 돌연변이(각각 G1102, 1101, 1125 및 1109)는 향상된 정규 결합을 초래한 한편, 높은 C1q 결합 및 CDC 저해를 유지하였다. 따라서, G1102, 1101, 1125 및 1109는 일반적 스트라도머로 고려될 수 있으며, 모체에 비해 C1q 결합은 증가되었다. 대안적으로, 위치 267의 알기닌 또는 라이신(각각 1100 및 1084)으로의 돌연변이는 감소된 정규 결합, 감소된 C1q 결합 및 CDC를 저해하는 것의 불능을 초래하였다. 236 및 267 위치에서 조합해서 돌연변이 기능을 분석하기 위해, 236 위치가 알기닌(G994에서와 같음) 또는 알기닌과 구조적으로 유사한 아미노산으로 돌연변이된 스트라도머를 생성하였고, 267 위치은 글루탐산(G994에서와 같음) 또는 글루탐산과 구고적으로 유사한 아미노산으로 돌연변이되었고, 남아있는 G994 돌연변이(E233P, H268F 및 S324T)가 존재한다. 생성된 화합물을 이하의 표 7에 제공한다:
위치 236 및 267에서 G994 염기 및 추가적인 돌연변이를 갖는 상보체 우선적 스트라도머
스트라도머 서열번호 돌연변이된 아미노산
G1110 36 E233P, G236D, S267R, H268F, S324T
G1111 71 E233P, G236D, S267Q, H268F, S324T
G1112 37 E233P, G236R, S267R, H268F, S324T
G1113 38 E233P, G236R, S267D, H268F, S324T
G1114 72 E233P, G236Q, S267D, H268F, S324T
G1115 39 E233P, G236E, S267R, H268F, S324T
G1116 40 E233P, G236H, S267K, H268F, S324T
G1117 73 E233P, G236D, S267D, H268F, S324T
G1118 41 E233P, G236Q, S267Q, H268F, S324T
G1119 42 E233P, G236R, S267K, H268F, S324T
G1120 43 E233P, G236R, S267Q, H268F, S324T
G1121 44 E233P, G236D, S267K, H268F, S324T
G1122 45 E233P, G236H, S267Q, H268F S324T
G1123 46 E233P, G236Q, S267R, H268F, S324T
G1124 47 E233P, G236K, S267K, H268F, S324T
G1128 48 E233P, G236K, S267N, H268F, S324T
G1129 49 E233P, G236N, S267E, H268F, S324T
G1130 50 E233P, G236N, S267K, H268F, S324T
G1131 51 E233P, G236R, S267N, H268F, S324T
놀랍게도, 위치 236과 267 둘 다에서 동시 돌연변이는 독립적으로 위치 중 하나의 돌연변이에 비해 별개의 효과를 가졌다. E233P/H268F/S324T(G1129)와 관련하여 G263N/S267E의 조합은 FcγRIIIa에 대한 감소된 결합 및 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIb에 대한 결합의 보유 또는 향상을 초래하였다. 따라서 G1129는 상보체-우선적 스트라도머로 고려할 수 있다. G236D/S267Q, G236Q/S267D와 G236D/S267D 점 돌연변이(각각 G1111, G1114 및 G1117)의 조합은 모 스트라도머 또는 G994에 비해 증가된 정규 결합을 초래하였고, 또한 높은 C1q 결합 및 CDC 저해의 유지를 초래하였다. 따라서, G1111, G1114 및 G1117은 모 스트라도머인 G045c에 비해 향상된 치료적 효능에 대한 잠재력를 갖는 일반적 스트라도머로 고려될 수 있다. 대안적으로, G236D/S267R, G236R/S267R, G236E/S267R, G236H/S267K, G236R/S267K, G236R/S267Q, G236D/S267K, G236H/S267Q, G236Q/S267R, G236N/S267K 또는 G236R/S267N(각각 G1110, G1112, G1115, G1116, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1130 및 G1131)의 조합은 모두 감소된 정규 결합 및 C1q에 대한 감소된 결합과 감소된 CDC 저해를 둘 다 초래하였다. 일부 예에서, 예컨대 G236K/S267K와 G236K/S267N(각각 G1124 및 G1128)의 조합인 점 돌연변이는 향상된 정규 결합 및 C1q에 대한 감소된 결합을 초래하였다. 본 내용에서 특정 잔기에서의 돌연변이 기능을 평가하기 위해 염기 서열로서 G998의 서열 및 위치 299에서의 돌연변이(T299A)를 이용하여 추가적인 스트라도머를 생성하였다. G998(서열번호 14 또는 15)은 G045c 배경 및 위치 267, 268, 297 및 324에서의 점 돌연변이를 갖는 스트라도머이다. 구체적으로, G998은 다음의 돌연변이를 가진다: S267E, H268F, N297A 및 S324T. 공통 글리코실화 부위는 NXT이되, N은 잔기 297이다. 297 잔기는 당 잔기를 공유적으로 연결한다. 본 명세서에 기재된 추가적인 스트라도머의 T299A 돌연변이는 비글리코실화된 단백질을 제공하는 것으로 의도되며; 단백질이 비글리코실화되지 않지만, 잔기 무손상을 연결하는 297을 남기도록 공통 글리코실화 부위를 파괴하기 위한 위치 299에서의 아미노산 돌연변이를 설계한다. 따라서, 이하의 표 8에 제공하는 화합물(위치 267에서 아미노산은 글루탐산(G998에서와 같음) 또는 글루탐산과 유사한 아미노산 서열로 돌연변이되거나, 야생형 세린 잔기로부터 돌연변이되지 않고; 위치 268 및 324에서 아미노산은 G998에서와 같이 돌연변이되고; 위치 297에서 아미노산은 돌연변이되지 않으며; 트레오닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이는 위치 299에서 첨가됨)을 생성하고, 시험하였다.
G998 염기, 위치 299에서 돌연변이 및 위치 267에서 추가적인 돌연변이를 갖는 스트라도머
스트라도머 서열번호 돌연변이된 아미노산
1071d2 52 267S, H268F, S324T, T299A
1068 74 S267E, H268F, S324T, T299A
1094 75 S267Q, H268F, S324T, T299A
1092 76 S267D, H268F, S324T, T299A
1096 53 S267R, H268F, S324T, T299A
1107 77 S267H, H268F, S324T, T299A
1093 54 S267K, H268F, S324T, T299A
1095 55 S267N, H268F, S324T, T299A
놀랍게도, 없어지는 정규 결합을 초래하여야 하는 T299A 돌연변이의 포함만이 S267R(G1096) 또는 S267K(G1093) 돌연변이 중 하나와 관련하여 FcγR 결합에 영향을 미쳤다. G1096와 G1093 둘 다에서, C1q에 대한 결합은 또한 감소되었고, 화합물 중 어떤 것도 CDC를 저해할 수 없었는데, 이는 C1q 결합의 결여에 기인할 가능성이 있다. T299A 돌연변이를 함유하는 다른 화합물(1071d2, G1068, G1094, G1092 및 G1107)은 FcγR와 C1q 둘 다에 대해 향상된 결합을 입증하였다. 따라서, G1068, G1094, G1092 및 G1107은 모 스트라도머인 G045c에 비해 향상된 치료적 효능에 대한 잠재력을 갖는 일반적인 스트라도머로 고려될 수 있다. 놀랍게도, C1q에 대한 강한 결합은 반드시 CDC의 저해와 상관관계가 있지는 않은데, 1712d2가 CDC를 저해할 수 없기 때문이다. G1095는 T299A 및 S267N 돌연변이를 함유하고, 이들의 조합은 약간 감소된 정규 결합을 초래하는 한편, C1q 결합 및 CDC 저해를 유지하였다. 따라서, G1095는 G994, G998 및 G1033과 유사한 치료적 적용 가능성을 갖는 상보체-우선적 스트라도머로 고려될 수 있다.추가적인 G998-기반 스트라도머를 생성하고, 이 내용에서 267 돌연변이의 기능을 추가로 평가하기 위해 시험하였다. 이들 돌연변이체는 G998에서와 같이 위치 268, 324 및 297에서 돌연변이를 함유하고, 이하의 표 9에서 나타내는 바와 같이 위치 267에서 야생형 세린 또는 아미노산 치환 중 하나를 가진다. 이들 스트라도머는 위치 299에서 돌연변이를 갖지 않는다.
G998 염기, 위치 299에서 돌연변이 및 위치 267에서 추가 돌연변이를 갖는 스트라도머
스트라도머 서열번호 돌연변이된 아미노산
1069 56 S267S, H268F, S324T, N297A
1070 57 S267K, H268F, S324T, N297A
1132 58 S267R, H268F, S324T, N297A
1074 59 S267D, H268F, S324T, N297A
1075 60 S267Q, H268F, S324T, N297A
예상한 바와 같이, 표 9의 스트라도머는 N297A 비글리코실화 돌연변이에 기인하여 감소된 정규 결합을 입증하였다. 놀랍게도, 위치 267에서 야생형 세린(G1069), S267D 또는 S267Q 점 돌연변이(각각 G1074 및 G1075)는 또한 향상된 C1q 결합 및 감소된 정규 결합을 초래하였다. 따라서 G1069, G1074 및 G1075는 G994, G998 및 G1033과 유사한 치료적 적용 가능성을 갖는 상보체-우선적 스트라도머를 고려할 수 있다. S267K(G1070) 및 S267R(1132) 돌연변이는 감소된 FcγR 결합뿐만 아니라 감소된 C1q 결합 및 CDC의 저해하는 것의 불능을 초래하였다.G994 및 G998로부터 유래된 화합물을 다량체화를 평가하기 위해 겔 상에서 실행하였다. 3㎍의 각각의 샘플을 150V에서 대략 1.2시간 동안 실행하였다. 20mM 요오도아세트아마이드를 첨가하고, 이어서, 샘플을 겔 상에 장입하기 전에 10분 동안 인큐베이션시켰다. 결과를 도 48a 내지 도 48g에 제공하는데, 이는 G994 및 G998과 같이, 화합물 G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105, G1106, G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109, G1084, G1107, G1110, G1111, G1112, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130, G1131, G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1093, G1095, G1069, G1070, G1132, G1075 및 G1075가 다량체를 형성한다는 것을 나타낸다.
표 5 내지 표 9에서 각각의 스트라도머에 대해, 정규 FcγR 결합, 상보체 C1q 결합, 및 CDC 저해 수준을 실시예 1에 기재한 방법에 따라 결정하였다. 이들 결과를 표 10에 요약한다.
G994 또는 G998로부터 유래된 스트라도머의 활성 요약
FcγRI 결합 FcγRIIa 결합 FcγRIIb 결합 FcγRIIIa 결합 C1q 결합 CDC 저해 (EC50, ㎍/㎖)
G1103 *** *** *** *** 높음 5
G1088 *** ** * ** 높음 5
G1089 ** - * - 낮음 100
G1104 *** *** *** *** 높음 5
G1082 *** ** - *** 높음 5
G1105 *** ** ** ** 높음 5
G1106 *** - - - 낮음 100
G1102 *** *** *** *** 높음 7.5
G1100 *** - - *** 낮음 NI
G1101 *** *** *** *** 높음 5
G1125 *** ** ** ** 높음 5
G1108 *** * * *** 높음 5
G1109 *** *** *** *** 높음 ND
G1084 *** - - * 낮음 NI
G1110 *** - - - 낮음 25
G1111 *** *** *** *** 높음 5
G1112 * - - - 낮음 NI
G1113 ND ND ND ND ND ND
G1114 *** *** *** *** 높음 5
G1115 *** - - *** 낮음 50
G1116 ** - - - 낮음 NI
G1117 *** *** *** *** 높음 5
G1118 *** ** ** ** 낮음 10
G1119 * - - - 낮음 NI
G1120 ** - - - 낮음 100
G1121 ** - - - 낮음 100
G1122 *** *** ** ** 낮음 5
G1123 ** - - * 낮음 NI
G1124 *** *** *** *** 낮음 10
G1128 *** *** *** *** 낮음 10
G1129 *** *** *** * 높음 5
G1130 *** *** *** - 낮음 10
G1131 *** - - *** 낮음 15
G1071d2 *** *** *** *** 높음 NI
G1068 *** *** *** * 높음 10
G1094 *** *** *** *** 높음 12.5
G1092 *** *** *** *** 높음 10
G1096 ** - - ** 낮음 NI
G1107 *** *** *** ** 높음 12.5
G1093 *** - - - 낮음 NI
G1095 *** ** ** ** 높음 15
G1069 *** - - * 높음 10
G1070 *** - - - 낮음 NI
G1132 *** - - - 낮음 NI
G1074 *** ** ** * 높음 10
G1075 *** - - - 높음 15
NI= 저해 없음
ND = 데이터 없음
실시예 13 - 감소된 C1q 및 정규 FcγR 결합을 갖는 스트라도머 추가적인 상보체-우선적 돌연변이체를 생성하기 위해 S267E/H268F/S324T 삼중 돌연변이를 포함하는 추가적인 화합물을 생성하였다.
G1001(서열번호 78)은 G019 배경 상에 있고, 4개의 돌연변이(S267E/H268F/S324T/N297A)를 함유한다. 놀랍게도, G019 모 화합물과 관련하여, G1001에 도달하도록 N297A 돌연변이를 G1003에 도입하는 것에 의한 글리코실화의 제거는 삼중 돌연변이 S267E/H268F/S324T의 존재 하에서 조차 정규 결합의 예상된 상실에 추가로 C1q 결합의 상실과 예상치 못하게 관련된다(Moore et. al.). 이 놀라운 발견은 G045c 모 화합물에 대해 반복되지 않는데, 이에 의해 G998에 도달하도록 G997에 N297A 돌연변이를 도입하는 것에 의한 글리코실화의 제거가 정규 결합의 예상된 상실과 관련되지만, 완전한 C1q 결합 및 CDC 저해는 유지된다. 따라서, G998 및 G1001이 동일한 돌연변이를 갖는 동일한 도메인을 갖고, IgG2 힌지의 위치에서만 상이함에도 불구하고, 그들은 실질적으로 동일한 정규 Fc 수용체 결합을 입증하지만, 상당히 상이한 C1q 결합 및 CDC 저해를 입증한다. 이들 비교는 다량체화 스트라도머와 관련하여 주어진 돌연변이 세트의 예측 불가능성을 추가로 강조한다.
G999(서열번호 79)는 4개의 점 돌연변이(G236R, S267E, H268F 및 S324T)를 포함하는 G019 배경 상의 스트라도머이며, 감소된 C1q 결합 및 CDC를 저해하는 것의 불능을 입증하였다. 이는 상기 기재한 바와 같이 G999가 Fc 도메인에 비해 IgG2 힌지의 위치에서만 G996과 상이하다는 점에서 놀랍다. 또한, 이들 두 화합물은 C1q에 결합하고 CDC를 저해하는 반대되는 능력을 나타낸다(G999는 둘 중 어느 것도 아닐 수 있는 반면, G996은 높은 C1q 결합을 나타내고, CDC를 저해한다). 이 비교는 다량체화 스트라도머와 관련하여 주어진 돌연변이 세트의 예측 불가능성을 추가로 강조한다.
G1024(서열번호 80)는 4개의 점 돌연변이(P238D, S267E, H268F, S324T)를 포함하는 G019 배경 상의 스트라도머이다.
G1030(서열번호 81)은 7개의 점 돌연변이 및 236에서 결실(E233P, L234V, L235A, G236Del, N297A, S267E, H268F, S324T)을 포함하는 GL-2045 배경 상의 스트라도머이다.
G1031(서열번호 82)은 6개의 점 돌연변이(E233P, G236R, D265A, S267E, H268F, S324T, N297A)를 포함하는 GL-2045 배경 상의 스트라도머이다.
G1040(서열번호83)은 8개의 점 돌연변이 및 위치 236에서 결실(E233P, L234V, L235A, G236Del, S267E, H268F, S324T, L328F, N297A)을 포함하는 GL-2045 배경 상의 스트라도머이다.
G1044(서열번호 84)는 5개의 점 돌연변이(P238D, D265C, S267E, H268F, S324T)를 포함하는 GL-2045 배경 상의 스트라도머이다.
G1045(서열번호 85)는 5개의 점 돌연변이(P238D, D265P, S267E, H268F, S324T)를 포함하는 GL-2045 배경 상의 스트라도머이다.
G1048(서열번호 86)은 5개의 점 돌연변이(G236R, L328F, S267E, H268F, S324T)를 포함하는 G019 배경 상의 스트라도머이다.
G1047(서열번호 87)은 5개의 점 돌연변이(P238D, L328F, S267E, H268F, S324T)를 포함하는 GL-2045 배경 상의 스트라도머이다.
감소된 C1q 및 정규 FcγR 결합을 갖는 스트라도머
스트라도머 서열번호 돌연변이된 아미노산
G1001 78 S267E, H268F, S324T, N297A
G999 79 G236R, S267E, H268F, S324T
G1024 80 P238D, S267E, H268F, S324T
G1030 81 E233P, L234V, L235A, G236Del, N297A, S267E, H268F, S324T
G1031 82 E233P, G236R, S267E, H268F, S324T, N297A
G1040 83 E233P, L234V, L235A, G236Del, S267E, H268F, S324T, L328F, N297A
G1044 84 P238D, D265C, S267E, H268F, S324T
G1045 85 P238D, D265P, S267E, H268F, S324T
G1048 86 G236R, L328F, S267E, H268F, S324T
G1047 87 P238D, L328F, S267E, H268F, S324T
놀랍게도, S267E/H268F/S324T 삼중 돌연변이를 포함하는 것에도 불구하고, 표 11에 열거된 스트라도머는 C1q에 결합하지 않았고, CDC를 저해하지 않았으며, 따라서, 다량체화 스트라도머와 관련하여 주어진 점 돌연변이 세트의 예측 불가능성을 추가로 강조한다. FcγR 및 FcRn에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 및 CDC의 저해를 결정하는 실험 결과를 표 12에서 요약한다.
감소된 C1q 및 정규 FcγR 결합을 갖는 스트라도머의 활성 요약
FcγRI
결합		 FcγRIIa 결합 FcγRIIb 결합 FcγRIIIa 결합 FcRn
결합 (pH 7.4)		 C1q*
결합		 CDC
저해
G1001 *** ** - - *** ND (*)
G999 *** - ** - *** ND -
G1024 *** *** *** - *** - -
G1030 - - - - *** - -
G1031 - - - - ** - -
G1040 *** *** *** - *** ND -
G1044 *** (*) - - *** ND -
G1045 *** - - - *** - -
G1048 *** *** *** *** *** ND -
G1047 *** *** *** * *** ND -
ND= 데이터 없음
실시예 14 - 겸상 적혈구병에 대한 상보체 우선적 스트라도머 치료
상보체 우선적 스트라도머 G994, G998, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027 및 G996을 문헌[Turhan et all (2004) Blood 103:2397 및 Chang et al (2008) Blood 111:915]에서 상세하게 기재하는 겸상적혈구병의 마우스 모델에서 평가한다. 간략하게, 12 내지 16주량 수컷 SCD 마우스(타운스(Townes) SS 마우스, 동형 접합적 Hbatm1(HBA)Tow 및 동형 접합적 Hbbtm2(HBG1,HBB*)Tow(M21 유전자형)을 그룹에 무작위로 할당하고, 수술 준비 20분 전에 식염수, IVIG(400㎎/㎏), hIgG1(400㎎/㎏), 알부민(400㎎/㎏) 또는 스트라도머(G045c, G994, G998 G1003, 및 G1033, 60㎎/㎏)를 (정맥내로) 투약하였다. 호중구 접착, 롤링 및 혈소판 호중구 응집물을 고환 거근 작은 정맥에서 분석할 것이다. sE-셀렉틴, sP-셀렉틴, sVCAM-1 및 sICAM-1을 포함하는 마커를 분석하기 위해 최종 혈액 인출 후에 혈장을 수집하였다.
연구 결과는 G994, G998, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027 및 G996이 SSRBC-WBC 상호작용/WBC/분을 상당히 감소시키고, WBC/분에 의해 또는 분획%에 의해 롤링 유동을 상당히 증가시키며, 대조군에 비해 처리군에 대해 누적 생존을 상당히 개선시킨다는 것을 나타낼 것이다. 따라서, 상보체 우선적 스트라도머는 겸상 적혈구병을 효과적으로 치료한다.
SEQUENCE LISTING <110> Gliknik Inc. <120> FUSION PROTEINS OF HUMAN PROTEIN FRAGMENTS TO CREATE ORDERLY MULTIMERIZED IMMUNOGLOBULIN FC COMPOSITIONS WITH ENHANCED COMPLEMENT BINDING <130> IPA171456-US-D1 <150> US 62/196,478 <151> 2015-07-24 <160> 87 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Sequence <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 3 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu 1 5 10 15 Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu 20 25 30 Ile Gly Glu Arg Gly His Gly Gly Gly 35 40 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPP multimerization domain <400> 6 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 145 150 155 160 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys 245 250 255 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 <210> 8 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 145 150 155 160 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys 245 250 255 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 <210> 9 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Val 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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 225 230 235 240 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 245 250 255 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 <210> 10 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125 Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 145 150 155 160 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 165 170 175 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 180 185 190 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys 245 250 255 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 <210> 11 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 65 70 75 80 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95 Arg Glu 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Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 210 215 220 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Arg Lys Cys 245 250 255 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 260 <210> 86 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Val Pro Gly 1 5 10 15 Ser Thr Gly Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 35 40 45 Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 50 55 60 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 65 70 75 80 Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 85 90 95 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 100 105 110 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 115 120 125 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn Lys Ala Phe 130 135 140 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 145 150 155 160 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 165 170 175 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 180 185 190 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 195 200 205 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 210 215 220 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 225 230 235 240 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 245 250 255 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 <210> 87 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60 Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu 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Claims (16)

  1. (a) 점 돌연변이 S267E, H268F, 및 S324T를 포함하는 적어도 하나의 IgG1 Fc 도메인 단량체; 및
    (b) IgG2 힌지, 아이소류신 지퍼, 및 GPP 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다량체화 도메인
    을 포함하는 펩타이드 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 펩타이드 단량체가 제2 펩타이드 단량체와 회합하여(associate) IgG1 Fc 도메인 및 다량체화 도메인을 포함하는 펩타이드 동종이량체를 형성하는, 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 점 돌연변이 S267E, H268F, N297A 및 S324T를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 점 돌연변이 G236R, S267E, H268F, 및 S324T를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항에 있어서, Fc 도메인이 점 돌연변이 E233P, G236R, S267E, H268F, 및 S324T를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 IgG1의 EEM 또는 DEL 다형성 중 하나를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 도메인이 상기 동종이량체의 다량체를 생성하는, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항에 있어서, 암호화된 단량체가, 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지, 리더 서열; IgG1 힌지 단량체, IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인 단량체; 및 IgG2 힌지 단량체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제7항에 있어서, 암호화된 단량체가 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항에 있어서, 암호화된 단량체가, 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지, 리더 서열; IgG2 힌지 단량체; IgG1 힌지 단량체; 및 IgG1 CH2 및 IgG1 CH3을 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 단량체가 서열번호 17 및 64에 따른 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 세포가 포유류 세포 또는 박테리아 세포인, 숙주 세포.
  14. 펩타이드 동종이량체를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계,
    암호화된 펩타이드 단량체의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계로, 펩타이드 단량체가 자기-응집되어(self-aggregate) 펩타이드 동종이량체를 형성하는 단계; 및
    상기 펩타이드 동종이량체를 배양 상청액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 펩타이드 다량체를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 단계,
    암호화된 펩타이드 단량체의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계로, 펩타이드 단량체가 자기-응집되어 펩타이드 동종이량체를 형성하고, 펩타이드 동종이량체가 자기-응집되어 펩타이드 다량체를 형성하는 단계; 및
    상기 펩타이드 다량체를 배양 상청액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 펩타이드 다량체가 2, 3, 4, 5, 또는 6개 이상의 펩타이드 동종이량체를 포함하는, 방법.
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