CN115298544A - 含有Fc区域的一部分缺失的抗体的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种试剂，其含有Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体。

Description

含有Fc区域的一部分缺失的抗体的试剂
技术领域
本发明广泛地涉及含有Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体的试剂等。
背景技术
在使用免疫学手法的诊断的领域中，为了进行检样中的目标物质的检测·定量而利用基于抗体的抗原抗体反应。利用抗原抗体反应的免疫反应受到检样中存在的、目标物质以外的多种多样的物质的影响，有时会发生非特异性反应。如果发生非特异性反应，则有诊断结果为假阳性、假阴性的担忧。
一直以来，作为减少非特异性反应的手段，已知有除去抗体的整个Fc区域的手段等(专利文献1)。但是，在将F(ab)、F(ab’)2这样的抗体的片段结合于微孔板、胶乳(latex)这样的担载体的情况下，存在较之IgG而言与担载体的结合效率、与抗原的结合活性降低的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭54-119292号公报
发明内容
发明要解决的课题
鉴于上述事实，本发明的目的在于提供含有能使非特异性反应减少的抗体的试剂等。
用于解决课题的手段
本申请发明人发现，仅使抗体中的Fc区域的一部分缺失，即会使抗原抗体反应中的非特异性反应减少，从而完成了本发明。
即，本申请包含以下的发明。
[1]
一种试剂，其含有Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体。
[2]
根据[1]所述的试剂，其中，CH3或CH2的所有部分缺失。
[3]
根据[1]所述的试剂，其中，CH2的所有部分缺失，CH3直接或间接地与抗体的铰链区结合。
[4]
根据[1]～[3]中任一项所述的试剂，其中，抗体为IgG。
[5]
根据[1]～[4]中任一项所述的试剂，其中，通过CH3或CH2的一部分的缺失而使抗体的非特异性反应被抑制。
[6]
根据[5]所述的试剂，其中，非特异性反应通过结合于Fc区域的非特异性反应因子而发生。
[7]
根据[6]所述的试剂，其中，非特异性反应因子为检样中的补体C1q、Fcγ受体或类风湿因子。
[8]
根据[1]～[7]中任一项所述的试剂，其中，抗体和诊断对象的抗原之间的抗原抗体反应与Fc区域未缺失的抗体的抗原抗体反应相比为同等以上。
[9]
根据[1]～[8]中任一项所述的试剂，其中，抗体源自小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、山羊、绵羊或骆驼。
[10]
根据[1]～[9]中任一项所述的试剂，其中，抗体为人类抗体、人源化抗体或人嵌合抗体。
[11]
根据[1]～[9]中任一项所述的试剂，其中，抗体为非人嵌合抗体。
[12]
根据[1]～[11]中任一项所述的试剂，其用于诊断。
[13]
根据[1]～[11]中任一项所述的试剂，其用于研究。
[14]
一种试剂盒，其包含[1]～[11]中任一项所述的试剂。
[15]
一种试剂盒，其包含封闭剂(blocking agent)和[1]～[11]中任一项所述的试剂。
[16]
根据[14]或[15]所述的试剂盒，其包含担载体。
[17]
根据[16]所述的试剂盒，其中，抗体与担载体表面结合。
[18]
根据[16]或[17]所述的试剂盒，其中，担载体为微孔板或胶乳。
[19]
根据[16]～[18]中任一项所述的试剂盒，其中，抗体介由接头而被固定化于担载体。
[20]
一种抑制抗原抗体反应的非特异性反应的方法，其中，使用Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体。
发明效果
根据本发明，能够提供一种试剂，其仅使抗体中的Fc区域的一部分缺失，即能够抑制非特异性反应。另外，Fc区域的一部分缺失的抗体与F(ab’)2相比，与担载体的结合效率、与抗原的结合活性也可以得到提高。
附图说明
[图1]图1为实施例中使用的各ΔCH3的示意图。
[图2]图2为实施例中使用的各ΔCH2的示意图。
[图3]图3示出ΔCH3抗体针对FcγRI的结合结果。
[图4]图4示出ΔCH2抗体针对FcγRI的结合结果。
[图5]图5示出ΔCH3抗体针对FcγRII的结合结果。
[图6]图6示出ΔCH2抗体针对FcγRII的结合结果。
[图7]图7示出ΔCH3抗体针对C1q的结合结果。
[图8]图8示出ΔCH2抗体针对C1q的结合结果。
[图9]图9示出全长抗体针对Rf的结合结果。
[图10]图10示出ΔCH3抗体针对Rf的结合结果。
[图11]图11示出ΔCH2抗体针对Rf的结合结果。
[图12]图12示出测定人检样中所含的IgE浓度的结果。黑点为全长抗体的测定值，白点为CH3缺失抗体的测定值。
具体实施方式
(试剂)
在第一实施方式中，本发明提供一种试剂，其含有Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体。
抗体具有如下结构：由2根相同重链和2根相同轻链组成的合计4根多肽链通过二硫键结合而配置为Y字型。在本说明书中使用的情况下，“抗体”是指天然的抗体，或者，整体或部分地由合成而制造的人工的免疫球蛋白或其片段。抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的任一同种型(isotype)。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种亚类(class)(同种型)。优选使IgG抗体缺失。本说明书中的IgG抗体的定义宽泛，包含可在美洲驼(llama)、羊驼等骆驼科的动物中发现的仅由重链构成的重链抗体(HCAb)。
抗体的来源不受限制，可以是任意的哺乳类、例如人或小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、山羊、绵羊、骆驼等非人动物。不仅可以使用人类抗体，还可以使用人源化抗体、嵌合抗体等重组抗体。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。
抗体可大致分为与抗原结合相关的Fab区域、和与非特异性反应等相关的Fc区域。将IgG用木瓜蛋白酶分解后，可以得到2个Fab片段和1个Fc片段。Fc区域可以进一步分为：铰链区的一部分、以及按接近铰链区的顺序依次为CH2区域(也简称为“CH2”)和CH3区域(也简称为“CH3”)。
在本说明书中使用的情况下，“Fc区域中的CH3或CH2的一部分”是指CH2区域或CH3区域中任一区域的至少一部分。Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体(以下总称为“Fc缺失抗体”，另外，也根据缺失区域而称为“CH2缺失抗体”或“CH3缺失抗体”)不会完全缺失CH2区域和CH3区域这两者。因此，Fc缺失抗体不包含F(ab)、F(ab’)2。
本领域技术人员可以利用基因重组技术、基于物理·化学手法的改性等已知的手法来制造期望的Fc缺失抗体。例如，如日本专利第5015012号所记载的，可以在植物体、植物组织或植物细胞中使期望的抗体的基因表达。另外，可以直接制造缺失抗体，也可以最初先制造全长抗体，然后得到缺失抗体。例如，也可以使溶解有全长抗体的缓冲液的pH向酸性·碱性偏移、或进行加温处理，从而使Fc区域的一部分已化学·物理方式改性，将其在柱等进行纯化，由此得到Fc缺失抗体。
优选CH2或CH3中的任一区域实质上全部缺失。在CH2缺失的情况下，CH3与铰链区直接进行结合，或介由接头等而间接地进行结合。接头可以使用已知的接头。例如，可以在铰链区与CH3之间存在5～20残基左右的氨基酸序列。作为这样的氨基酸序列的例子，有由4个连续的甘氨酸和1个丝氨酸构成的肽(GS接头)等。可以重复相同的接头。例如，通过将多个、例如2～5个、优选4个GS接头连接而成的接头配置在铰链区与CH3之间，从而能够增大抗体的表达效率。
进而，抗体只要能发挥期望的效果，则氨基酸序列中的1个或多个、例如1～20个、优选数个、例如1～10个、例如1～5个氨基酸可以缺失或被取代，或者，也可以添加1个或多个、例如1～20个、优选数个、例如1～10个、例如1～5个其它氨基酸。例如，可以在切断区域(CH3缺失的情况下是CH2的C末端侧，CH2缺失的情况下是铰链区与CH3之间)插入1个或多个的氨基酸，也可以自切断区域缺失1个或多个的氨基酸。添加的氨基酸的种类没有特别限定，可以选择位于缺失的部位的N末端侧的氨基酸。缺失等突变优选在能保持抗体的立体结构的范围实施。
Fc缺失抗体可以用抗体检测所必需的标记等进行修饰。对于标记，例如可举出利用荧光物质、荧光蛋白质、酶、或者生物素或链霉亲和素的标记。也可以对Fc缺失抗体进行其他必要的功能上的修饰。
在本说明书中使用的情况下，“试剂”是指广范围的、用于检测·定量Fc缺失抗体所结合的生物体相关物质(以下也称为“被测定物质”)的、免疫学的测定法中使用的试剂，包含体外诊断用药品这样的诊断药、检查药。试剂可以包含用于稳定地保持抗体的缓冲液等。其他的成分可以根据使用的免疫学的测定法而由本领域技术人员适当确定。
作为免疫学的测定法，例如可举出免疫染色法(包含荧光抗体法、酶抗体法、重金属标记抗体法、放射性同位素标记抗体法)，将利用电泳法的分离和利用荧光、酶、放射性同元素等的检测方法组合的方法(包含蛋白质印迹法、荧光二维电泳法)，酶免疫测定吸附法(ELISA)，斑点印迹法，胶乳凝集法(LA：Latex Agglutination-TurbidimetricImmunoassay)，免疫色谱法等。
作为用试剂进行检测·定量的被测定物质，有蛋白质、多糖等抗原、包含单糖、寡糖、氨基酸、肽、具有甾体醇骨架的物质等低分子生理活性物质的半抗原、以及由它们构成的细菌、病毒、寄生虫等病原体等，只要是Fc缺失抗体所结合的物质，则没有任何限定。例如，在被测定物质为抗原的情况下，例如可举出CRP(C-反应性蛋白质)、前列腺特异性抗原、铁蛋白、β-2微球蛋白、肌红蛋白、血红蛋白、白蛋白、肌酸酐等蛋白质标志物，IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白，各种肿瘤标志物，LDL、HDL、TG等脂蛋白，A型流感病毒、B型流感病毒、RS病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒、HAV、HBs、HCV、HIV、EBV等病毒抗原；沙眼衣原体、溶血性链球菌、百日咳杆菌、幽门螺杆菌、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、刚地弓形虫、疏螺旋体、军团菌属菌、炭疽杆菌、MRSA等细菌抗原，细菌等产生的毒素，支原体脂质抗原，人绒毛膜促性腺激素等肽激素，甾体激素等甾体，肾上腺素、吗啡等生物活性胺类，维生素B等维生素类，前列腺素类，四环素等抗生素，农药，环境激素等，但不限于这些。作为优选的例子，可举出CRP、前列腺特异性抗原、铁蛋白、β-2微球蛋白和血红蛋白等抗原。
在被测定物质为抗体的情况下，可举出与上述蛋白质标志物、各种肿瘤标志物、脂蛋白、病毒抗原、细菌抗原、细菌等产生的毒素、肽激素、甾体、生物活性胺类、维生素类、抗生素、农药、环境激素等抗原进行特异性反应的抗体等。
试剂被添加至需要确认有无被测定物质等的来自受试者的检样。检样只要包含被测定物质则没有特别限定，可举出血液、血清、血浆、尿、粪便、唾液、组织液、脑脊液、拭子液等体液等或其稀释物，优选为血液、血清、血浆、尿、粪便、脑脊液或它们的稀释物。
(试剂盒)
第二实施方式中，本发明提供一种包含试剂的试剂盒。
试剂盒可用于诊断、研究等。试剂盒根据其使用目的，不仅包含作为试剂的抗体，还可以包含用于将Fc缺失抗体固定化的担载体、二抗。作为这样的担载体，优选为不溶性担载体，例如可举出聚乙烯、聚苯乙烯等的胶乳粒子、氧化铝粒子、二氧化硅粒子、胶体金、磁性粒子等粒子作为其例子。更具体而言，为ELISA法(直接法、间接法、夹心法等)时可以使用微孔板，为胶乳凝集法时可以使用胶乳等作为不溶性担载体。从防止抗体与抗原的非特异性反应的观点出发，优选在试剂盒中包含封闭剂。
Fc缺失抗体可以通过物理吸附等而直接固定化于担载体，也可以介由化学交联、例如接头等而间接进行固定化。
直接法所使用的试剂盒中，例如，包含作为含有Fc缺失抗体的试剂的、与抗原进行结合的酶标记用抗体，用于酶反应的底物，用于在制作校准曲线或对照实验中使用的标准抗原等。
间接法所使用的试剂盒中，例如，包含作为含有Fc缺失抗体的试剂的、与抗原进行结合的一抗，与一抗进行结合的二抗、用于酶反应的底物、用于在制作校准曲线或对照实验中使用的标准抗原等。二抗也可以基于检测目的而进行标记。
夹心法所使用的试剂盒中，例如，包含作为含有Fc缺失抗体的试剂的、结合于固相的抗体、酶标记用抗体、用于酶反应的底物、用于在制作校准曲线或对照实验中使用的标准抗原等。酶标记用抗体可以是Fc缺失抗体。
胶乳凝集法所使用的试剂盒中，例如，包含作为含有Fc缺失抗体的试剂的、进行结合的检测用抗体、用于在制作校准曲线或对照实验中使用的标准抗原、用于防止抗体与抗原的非特异性反应的封闭剂等。
(非特异性反应抑制方法)
在第三实施方式中，本发明提供一种使用Fc缺失抗体的、抑制抗原抗体反应的非特异性反应的方法。
通过使Fc区域的一部分缺失，从而能够抑制由于补体(C1q)、Fc受体、类风湿因子、嗜异性抗体等非特异性反应因子与Fc区域、即CH2和/或CH3结合而发生的非特异性反应。非特异性反应也可能由于其他与期望的抗原抗体反应无关的物质形成抗原抗体反应物、或者显示交叉反应而发生，因此，优选与本领域技术人员已知的非特异性反应抑制方法组合使用。
此处，在Eur J Biochem.，267(24)：7246-57中，研究了针对scFv-Fc、和其CH3缺失的scFv-hCH2的Fcγ受体(FcγR)结合的影响。根据Fig.7的结果，可以认为scFv-hCH2的非特异性反应更高，因此，可以认为，对于单链抗体，使之缺失CH3是更为优选的。
对于Fc缺失抗体的与抗原的结合活性、即与诊断对象的抗原之间的抗原抗体反应、与担载体的结合效率而言，与Fc区域未缺失的抗体相比得以增大。
非特异性反应抑制方法包括使Fc缺失抗体与检样接触的步骤。可以在接触步骤前后包括任意的步骤。
以下，举出实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明不限于此。
实施例
1.载体制作和蛋白质表达
作为Fc区域缺失的抗体，选择抗H5N1血凝素(hemagglutinin)抗体(Xueyong Zhu等，"A unique and conserved neutralization epitope in H5N1 influenza virusesidentified by an antibody against the A/Goose/Guangdong/1/96hemagglutinin",Journal of virology.2013；87(23):12619？35.PMID:24049169)和抗丁酰胆碱酯酶抗体(Peng H.等，"Comparison of 5monoclonal antibodies for immunopurification ofhuman butyrylcholinesterase on Dynabeads:KD values,binding pairs,and aminoacid sequences",Chemico-Biological Interactions.2015；240:336-345.DOI:10.1016/j.cbi.2015.08.024；PMID:26343001)。
抗H5N1血凝素抗体
轻链
DIVLTQSPGSLTVSLGQRATISCRASESVDNFGKSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNREFGIPARFNGSGSGTDFALTINPVEADDVATYFCQQSNEDPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(序列号1：GenBank,KF499999)
重链
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号2：GenBank,KF500000)
抗丁酰胆碱酯酶抗体
轻链
DILLTQSPAILSVSPGERVRLSCRASQSCGTSIYWYQQRTNGSPRLLIMYASEPFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPWTFGGGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(序列号3：GenBank,KT189148)
重链
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号4：GenBank,KT189147)
模仿日本专利第5015012号中的实施例4的方法，将各IgG的轻链和重链(其一部分缺失的序列)分别使用不同的载体进行表达。
1.3.ΔCH3
ΔCH3表示各抗体的重链的CH3缺失的抗体。CH3是以EU编号标记为341～447的区域。因此，对应的构建体也可以说是由以EU编号标记为118～340的氨基酸组成的恒定区(Fc区域)所构成的蛋白质。作为反映它们的特征的名称，将ΔCH3称为Δ341-447或Fc118-340。以下，对于其他缺失抗体，也按同样的规则赋予名称。应予说明，在ΔCH3的C末端连接有GS接头(GGGGS)和His标签(HHHHHH)。
1.3.1.ΔCH3＝Δ341-447＝Fc118-340：
1.3.1.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGGGGSHHHHHH(序列号5)
1.3.1.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGGGGSHHHHHH(序列号6)
为了确认缺失的效果，制作4种不同的ΔCH3，即，自图1所示的切断部位删除或追加5个氨基酸而得的ΔCH3、和删除或追加10个氨基酸而得的ΔCH3。
具体的序列如下所示。
1.3.2.Δ331-447＝Fc118-330(-10氨基酸)：
1.3.2.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAGGGGSHHHHHH(序列号7)
1.3.2.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAGGGGSHHHHHH(序列号8)
1.3.3.Δ336-447＝Fc118-335(-5氨基酸)：
1.3.3.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTGGGGSHHHHHH(序列号9)
1.3.3.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTGGGGSHHHHHH(序列号10)
1.3.4.Δ346-447＝Fc118-345(+5氨基酸)：
1.3.4.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAGGGGSHHHHHH(序列号11)
1.3.4.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAGGGGSHHHHHH(序列号12)
1.3.5.Δ351-447＝Fc118-350(+10氨基酸)：
1.3.5.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTGGGGSHHHHHH(序列号13)
1.3.5.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTF(序列号14)
1.4.ΔCH2
ΔCH2表示抗IgE抗体的重链的CH2缺失、前后的铰链区与CH3连接。CH2是以EU编号标记为231～340的区域。因此，构建体也可以说是将以EU编号标记为118～230的氨基酸、和341～447的氨基酸连接的恒定区(Fc区域)所构成的蛋白质。
考虑到CH2缺失会带来某些影响，也制作了将GS接头(GGGGS)插入连接部的构建体。GS接头使用重复1～4次的接头。具体的氨基酸序列为1)无接头、2)GGGGS(序列号15)、3)GGGGSGGGGS(序列号16)、4)GGGGSGGGGSGGGGS(序列号17)、5)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列号18)。在取得非特异性反应的评价等数据时，使用5)的将GS接头重复4次的接头。具体的序列如下所示。
1.4.1.ΔCH2＝Δ231-340＝Fc118-230+341-447(无接头)：
1.4.1.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号19)
1.4.1.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号20)
1.4.2.ΔCH2＝Δ231-340＝Fc118-230+341-447(1×GS接头)：
1.4.2.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号21)
1.4.2.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号22)
1.4.3.ΔCH2＝Δ231-340＝Fc118-230+341-447(2×GS接头)：
1.4.3.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号23)
1.4.3.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号24)
1.4.4.ΔCH2＝Δ231-340＝Fc118-230+341-447(3×GS接头)：
1.4.4.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号25)
1.4.4.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号26)
1.4.5.ΔCH2＝Δ231-340＝Fc118-230+341-447(4×GS接头)：
1.4.5.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号27)
1.4.5.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGGSHHHHHH(序列号28)
为了确认缺失的效果，制作4种不同的ΔCH2，即，自图2所示的C末端侧的切断部位删除或追加5个氨基酸而得的ΔCH3、和删除或追加10个氨基酸而得的ΔCH2。具体的序列如下所示。
1.4.6.ΔCH2＝Δ231-330＝Fc118-230+331-447(4×GS接头)(-10氨基酸)：
1.4.6.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号29)
1.4.6.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号30)
1.4.7.ΔCH2＝Δ231-335＝Fc118-230+336-447(4×GS接头)(-5氨基酸)：
1.4.7.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号31)
1.4.7.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号32)
1.4.8.ΔCH2＝Δ231-345＝Fc118-230+346-447(4×GS接头)(+5氨基酸)：
1.4.8.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号33)
1.4.8.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号34)
1.4.9.ΔCH2＝Δ231-350＝Fc118-230+351-447(4×GS接头)(+10氨基酸)：
1.4.9.1.抗H5N1血凝素抗体
EVHLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYTIHWMKQSHGKSLEWIGGIFPNNGDTTYNQKFKVRATLTVGRSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCVRNYGSSYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号35)
1.4.9.2.抗丁酰胆碱酯酶抗体
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSQWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLTNLAPEDSAVYYCARSSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(序列号36)
IgG的轻链克隆至烟草花叶病毒(TMV)载体(Icon Genetics公司制)，各重链(包含CH3缺失体或CH2缺失体)克隆至马铃薯病毒X(PVX)载体(Icon Genetics公司制)。将这些载体分别导入不同的农杆菌进行转化并培养，然后将培养液的混合液浸润本生烟(Nicotianabenthamiana)的叶，在1周左右收获。将收获的叶(感染叶)冷冻。
2.纯化
量取冷冻的感染叶500g，用切割混合机粉碎。将粉碎物添加到萃取溶液(100mMTris、250mM NaCl、40mM抗坏血酸钠)250mL，重复粉碎感染叶。
将从切割混合机回收的经粉碎的感染叶、以及用新的萃取溶液250mL冲洗混合机内而得到的经粉碎的感染叶混合。一部分采样，以12000×g进行5分钟离心分离，回收上清液(萃取步骤组分)。
调整萃取步骤组分的pH后，将其用0.45μm过滤器过滤，继而用0.22μm过滤器过滤。使滤液经过镍柱色谱(GE Healthcare公司制，HisPrep FF 16/10柱、目录号28936551)和HAP柱色谱，从而除去来自植物的杂质和来自抗体的杂质。
3.表达试验
向感染叶加入3倍量的萃取缓冲液(100mM Tris，250mM NaCl，5mM EDTA)，用珠磨机破碎，在冰上放置30分钟后，进行离心分离(8000xg，4℃、10分钟)，回收上清液，用SDS-PAGE和蛋白质印迹法进行分析。
通过使用了经HRP标记的抗His标签抗体的蛋白质印迹法，评价表1和2记载的抗体的表达。任一抗体均确认到表达。
[表1]
Figure BDA0003850238530000221
[表2]
Figure BDA0003850238530000231
对于骆驼ΔCH3抗体，也确认到表达。
4.非特异性评价
利用表面等离子共振(SPR)法，评价经纯化的抗体与非特异性因子的相互作用。装置使用BIAcore X-100(Biacore公司制)。作为非特异性因子，使用Fc受体(Fcγ受体I、Fcγ受体II)、C1q、类风湿因子。
＜Fc受体＞
将经生物素标记的源自人的FcγRI或FcγRII(Sino Biological公司制。均为纯化品)用Sensor Chip CAP(GE Healthcare公司制)捕获，观察伴随与抗体的相互作用的信号(共振单元(resonance unit)：RU)的上升。运行缓冲液(running buffer)使用0.01MHEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％吐温20，在25℃以30μL/分钟的流速测定。测定全部以n＝3实施(以下同样)。将抗体针对FcγRI的结合结果示于图3和图4，将抗体针对FcγRII的结合结果示于图5和图6。
在添加1μM的抗体1分钟的情况下，显示全长抗体中信号上升，可观察到相互作用，而ΔCH3中未见信号变化，无相互作用(图3和图5)。另外，在ΔCH2抗体中也是同样，在添加0.25μM的抗体1分钟的情况下，显示全长抗体中可观察到相互作用，而ΔCH2抗体中未见信号变化，无相互作用。(图4和图6)。
＜C1q＞
用Sensor chip Protein L(GE Healthcare公司制)捕获抗体，观察伴随与源自人的C1q(Abcam公司制ab96363。纯化品)的相互作用的信号(共振单元：RU)的上升。运行缓冲液使用0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％吐温20，在25℃以30μL/分钟的流速测定。抗体针对C1q的结合结果示于图7和图8。
添加以运行缓冲液稀释100倍的源自人的C1q 1分钟，其结果是，确认到ΔCH3和ΔCH2均与C1q没有相互作用。
＜Rf＞
利用胺偶联法，使抗体与Sensor chip CM5(GE Healthcare公司制)结合，观察伴随与Rf阳性的人血清或血浆的相互作用的信号(共振单元：RU)的上升。运行缓冲液使用0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％吐温20，在25℃以30μL/分钟的流速测定。
对为Rf阳性、且明确了含有与全长抗体相互作用的因子的10种人血清或血浆进行评价，其结果是，在添加以运行缓冲液稀释30倍的血清或血浆1分钟的情况下，全长抗体中信号上升且可观察到相互作用(图9)，而ΔCH3和ΔCH2均未确认到相互作用(图10和图11)。
5.胶乳凝集试验
按照以下步骤，评价得到的抗体针对胶乳的结合效率。
(1)试剂的制备
使用针对IgE的抗体，如下所述地制备基于免疫凝集法的测定试剂。
i)将相对于平均粒径200nm的聚苯乙烯胶乳悬浮液1mL担载抗体0.1mg而成的致敏粒子以成为0.1％的方式在缓冲液(甘氨酸、pH7.3)中悬浮，制备胶乳悬浮液。
ii)准备缓冲液(甘氨酸、pH8.3)。
(2)利用自动分析装置的测定
自动分析装置使用日立公司制7180型自动分析装置，以端点(endpoint)法进行自动测定。使用在上述(1)的i)中制备的试剂，对已知会由于非特异性反应而显示假阳性反应的4个人检样、和不发生非特异性反应的15个检样进行测定。对于检样溶液3.5μL，添加上述(1)的ii)中制备的缓冲液140μL，将该混合液在37℃搅拌混合。在放置5分钟后，添加胶乳悬浮液70μL，进一步在37℃搅拌混合。就约5分钟的凝集反应以吸光度变化量的形式进行测定，利用校准曲线算出各检样的IgE浓度。
(3)假阳性检样的测定值比较
将上述(2)中测定的结果示于图12和表3。
[表3]
Figure BDA0003850238530000251
(单位：IU/mL)
如果没有假阳性、假阴性，则检样中的IgE浓度与测定值应为同等的值，而对于检样No.1、5、9、18，在使用全长抗体的试剂的情况下，可见明确的假阳性。另一方面，使用CH3缺失抗体的试剂整体上显示与IgE浓度相同程度的测定值，未确认到明确的假阳性。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供一种试剂，其仅使抗体中的Fc区域的一部分缺失即能够抑制非特异性反应。
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Claims (20)

1.一种试剂，其含有Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中，CH3或CH2的所有部分缺失。
3.根据权利要求1所述的试剂，其中，CH2的所有部分缺失，CH3直接或间接地与抗体的铰链区结合。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂，其中，抗体为IgG。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的试剂，其中，通过CH3或CH2的一部分的缺失而使抗体的非特异性反应被抑制。
6.根据权利要求5所述的试剂，其中，非特异性反应通过结合于Fc区域的非特异性反应因子而发生。
7.根据权利要求6所述的试剂，其中，非特异性反应因子为检样中的补体C1q、Fcγ受体或类风湿因子。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的试剂，其中，抗体和诊断对象的抗原之间的抗原抗体反应与Fc区域未缺失的抗体的抗原抗体反应相比为同等以上。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的试剂，其中，抗体源自小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、山羊、绵羊或骆驼。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的试剂，其中，抗体为人类抗体、人源化抗体或人嵌合抗体。
11.根据权利要求1～9中任一项所述的试剂，其中，抗体为非人嵌合抗体。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的试剂，其用于诊断。
13.根据权利要求1～11中任一项所述的试剂，其用于研究。
14.一种试剂盒，其包含权利要求1～11中任一项所述的试剂。
15.一种试剂盒，其包含封闭剂和权利要求1～11中任一项所述的试剂。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其包含担载体。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，抗体与担载体表面结合。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中，担载体为微孔板或胶乳。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的试剂盒，其中，抗体介由接头而被固定化于担载体。
20.一种抑制抗原抗体反应的非特异性反应的方法，其中，使用Fc区域中的CH3或CH2的一部分缺失的抗体。
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