JP7115773B2 - 変性抗体を模倣するポリペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、日本特許出願2018-43505(2018年3月9日出願)に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
[技術分野]
本発明は、変性抗体を模倣するポリペプチドに関する。特に、C末端のアミノ酸が欠失したCH3ドメインであって、変性抗体を特異的に認識するプローブと特異的に結合可能なものに関する。また本発明は、当該ポリペプチドを用いた変性抗体の測定方法および当該ポリペプチドを用いた変性抗体に特異的に相互作用する化合物のスクリーニング方法に関する。
本発明は、変性抗体が有する非天然型立体構造を模したポリペプチドであって、変性抗体の定量的な評価に用いることのできるポリペプチドを提供することを課題とする。
〔1〕 下記(i)または(ii)に記載のC末端欠失CH3ドメイン(C-terminal truncated CH3 domain):
(i)配列番号1~7のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5~20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメイン、または、
(ii)配列番号1~7のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5~20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチド(配列番号9)が特異的に結合するC末端欠失CH3ドメイン。
〔2〕 〔1〕に記載のC末端欠失CH3ドメインであって、AF.2A1ポリペプチドとの解離定数が10μM以下である、C末端欠失CH3ドメイン。
〔3〕 〔1〕または〔2〕に記載のC末端欠失CH3ドメインであって、
(i)’上記(i)に記載のC末端欠失CH3ドメインが、配列番号1~4のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5~20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、
(ii)’上記(ii)に記載のC末端欠失CH3ドメインが、配列番号1~4のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5~20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するものである、C末端欠失CH3ドメイン。
〔4〕 C末端側から5~10残基の範囲内でアミノ酸が欠失している、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン。
〔5〕 C末端側から5残基のアミノ酸が欠失している、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン。
〔6〕 〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント。
〔7〕 〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメインを含む抗体。
〔8〕 〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメインを含むタンパク質。
〔9〕 〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、〔6〕に記載のFc領域フラグメント、〔7〕に記載の抗体を含む、および〔8〕に記載のタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む変性抗体の評価キット。
〔10〕 さらにAF.2A1ポリペプチド(配列番号9)を含む、〔9〕に記載のキット。
〔11〕 試料中に含まれる変性抗体を定量的に測定する方法であって、
AF.2A1ポリペプチド(配列番号9)と前記試料中に含まれる変性抗体との結合量を測定する工程と
AF.2A1ポリペプチドと〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、〔6〕に記載のFc領域フラグメント、〔7〕に記載の抗体、または〔8〕に記載のタンパク質との結合量を測定する工程と、
前記C末端欠失CH3ドメイン、前記Fc領域フラグメント、前記抗体、またはタンパク質とAF.2A1ポリペプチドとの結合量から前記試料中の変性抗体の量を算出する工程と
を含む測定方法。
〔12〕 変性抗体に対する親和性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、〔6〕に記載のFc領域フラグメント、〔7〕に記載の抗体、または〔8〕に記載のタンパク質と試験化合物との相互作用を測定する工程を含む、スクリーニング方法。
〔13〕 〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のC末端欠失CH3ドメイン、または前記C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント、抗体、もしくはタンパク質を参照物質として含有する、変性抗体の定量用参照試薬(参照試薬組成物)。
前記参照試薬において、C末端欠失CH3ドメインや前記C末端欠失ドメインを含む抗体もしくはそのフラグメントは均一であり、安定性を有し、変性抗体の定量的な評価を妨げるような会合・凝集状態にはない。C末端欠失CH3ドメイン、Fc領域フラグメント、または抗体には、参照物質として使用するために、Hisタグなどの有機化合物や無機化合物による修飾を付加してもよい。
ここで、本発明のC末端欠失CH3ドメインが変性抗体のCH3ドメインに生じる非天然型立体構造を模倣するとは、変性抗体の非天然型立体構造を特異的に認識するプローブが、C末端が欠失しているCH3ドメインに特異的に結合することを意味する。
(i)配列番号1~7のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5~20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメイン(C-terminal truncated CH3 domain)、または、
(ii)配列番号1~7のいずれかに示されるアミノ酸配列のうち1又は数個のアミノ酸が置換、欠失(deletion)、挿入、及び/又は、付加したアミノ酸配列において、C末端側から5~20残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなり、かつ、AF.2A1ポリペプチドが特異的に結合するC末端欠失CH3ドメイン。
本実施例では、まずAF.2A1ポリペプチドが認識するドメインを、バイオレイヤー干渉法(BLI法)を使った親和性評価によって特定した。なお、BLI法は生体高分子間の特異的相互作用を測定する手法であり、特に凝集体を形成しうるような試料を安定に評価することのできる優れた方法であることが認識されているものである。
次に、CH3ドメインの非天然型立体構造を模倣するためには、C末端を適当な長さだけ欠失させる変異を加えることが有効であると推察した。そこで、ヒトIgG1のCH3ドメインのN末端側から106番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から448番目以降に相当)のアミノ酸を2残基、105番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から447番目以降に相当)のアミノ酸を3残基、104番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から446番目以降に相当)のアミノ酸を4残基、103番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から445番目以降に相当)のアミノ酸を5残基、98番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から440番目以降に相当)のアミノ酸を10残基、93番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から435番目以降に相当)のアミノ酸を15残基、または、88番目以降(重鎖のアミノ酸配列N末端側から430番目以降に相当)のアミノ酸を20残基欠失させた改変体(以下、例えば、CH3ドメインの428番目以降5残基欠失させた改変体を5残基欠失CH3ドメインという)を調製し、各C末端欠失改変体とAF.2A1ポリペプチドとの相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した(図2)。
5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドの親和性をSPR法により評価した。
SPRの測定にはBiacore T200 (GE Health care)を使用した。まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルにアミドカップリング法を用いて5残基欠失CH3ドメインを固定化した。比較対象として、実施例1に記載の酸処理と同じ条件で酸ストレスを与えたFc領域を調整し、当該酸ストレスFc領域を固定化したセンサーチップを作製した。ランニング緩衝液には、HBS-P(10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)を使用し、反応温度25℃で測定した。
5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1を低温条件(4℃)で保管し、AF.2A1ポリペプチドに対する親和性の経時的変化をSPR法により評価した。
5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1を低温条件(4℃)で保管し、分子サイズの経時的変化をDLSにより評価した。
なおDLSはタンパク質の単量体(1~10nm)から凝集体(<1000nm)までのサイズの分子を測定可できる優れた方法であることが認識されているものである。
DLSの測定にはZetaSizer Nano S (Malvern)を使用した。測定温度30℃で測定した。5残基欠失CH3ドメインと酸ストレスIgG1を1mg/mLのまま実験に供した。解析結果の解析にはZetaSizer softwear version 7.02を使用して自己相関関数を算出した(図6)。その結果、5残基欠失CH3 ドメインの分子サイズは保管した5日間で著しい変化は観察されなかった。一方で、酸ストレスIgG1は、1日保管した試料において著しい分子サイズの増大が観察された。5残基欠失CH3ドメインは、酸ストレスIgG1と比較して、分子サイズにおける保存安定性が高いことが示された。
5残基欠失CH3ドメイン、または酸ストレスIgG1を参照物質として、横軸に参照物質濃度、縦軸にAF.2A1ポリペプチドに対する結合レスポンスをとった検量線を作製して、試料中に含まれる変性抗体濃度を定量する例を以下に示す。
5残基欠失CH3ドメインとAF.2A1ポリペプチドの親和性を等温滴定型熱量測定(ITC)法により評価した。
ITCの測定にはNano ITC (TA Instruments)を使用した。5残基欠失CH3ドメイン1mLを、HBS(10mM HEPES-NaOH pH7.4、150mM NaCl) 100mLを外液とする一晩の透析によって溶媒置換した。その後、外液のHBSを用いて200μmol/Lに濃度を調製した。AF.2A1ポリペプチドは、外液のHBSを用いて30μmol/Lになるように溶解した。シリンジに充填した5残基欠失CH3ドメインを、セルに充填したAF.2A1ポリペプチドに対して段階的に滴下し、結合に伴う反応熱を測定した。反応温度25℃で測定した。AF.2A1ポリペプチドの代わりにHBSを充填したセルを使った測定により、5残基欠失CH3ドメインの希釈熱を測定した。希釈熱を差し引いた結合に伴う反応熱を分析に用いた。
配列番号10:化学合成
配列番号11:化学合成
配列番号12:化学合成
配列番号13:化学合成
配列番号14:化学合成
配列番号15:化学合成
配列番号16:化学合成
配列番号17:化学合成
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配列番号19:化学合成
配列番号20:化学合成
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配列番号22:化学合成
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配列番号24:化学合成
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配列番号28:化学合成
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配列番号30:化学合成
配列番号31:化学合成
配列番号32:化学合成
配列番号33:化学合成
配列番号34:化学合成
配列番号35:化学合成
Claims (5)
- 変性抗体の定量用参照試薬であって、ヒトIgGのC末端欠失CH3ドメイン、または前記C末端欠失CH3ドメインを含むFc領域フラグメント、もしくは抗体を含有し、
前記C末端欠失CH3ドメインが、配列番号1~4のいずれかに示されるアミノ酸配列において、C末端側から5~10残基の範囲内でアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列からなるC末端欠失CH3ドメインであり、前記変性抗体がヒトIgGの変性抗体である、変性抗体の定量用参照試薬。 - C末端欠失CH3ドメインが、AF.2A1ポリペプチド(配列番号9)との解離定数が10μM以下である、請求項1に記載の参照試薬。
- C末端欠失CH3ドメインがC末端側から5残基のアミノ酸が欠失している、請求項1または2に記載の参照試薬。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の参照試薬と、AF.2A1ポリペプチド(配列番号9)を含む、変性抗体の評価キットであって、前記変性抗体がヒトIgGの変性抗体である、キット。
- 試料中に含まれる変性抗体を定量的に測定する方法であって、
AF.2A1ポリペプチド(配列番号9)と前記試料中に含まれる変性抗体との結合量を測定する工程と
AF.2A1ポリペプチドと請求項1~3のいずれか一項に記載の参照試薬との結合量を測定する工程と、
前記参照試薬とAF.2A1ポリペプチドとの結合量から前記試料中の変性抗体の量を算出する工程と
を含み、前記変性抗体がヒトIgGの変性抗体である、測定方法。
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