ES2846024T3 - Proteínas de fusión de fragmentos de proteína humana para crear composiciones de Fc de inmunoglobulina multimerizada de forma ordenada con unión al complemento aumentada - Google Patents

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Abstract

Un homodímero de péptido que comprende: (a) al menos un dominio Fc de IgG1 que comprende las mutaciones puntuales S267E, H268F y S324T y que comprende además (i) la mutación puntual N297A; (ii) la mutación puntual G236R; o (iii) las mutaciones puntuales G236R y E233P; y (b) al menos un dominio de multimerización capaz de multimerizar el homodímero de péptido; en donde el homodímero de péptido exhibe unión preferencial al complemento con respecto a FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb y/o FcγRIII.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión de fragmentos de proteína humana para crear composiciones de Fc de inmunoglobulina multimerizada de forma ordenada con unión al complemento aumentada
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a los campos de la inmunología, autoinmunidad, inflamación e inmunología tumoral. Más específicamente, la presente invención se refiere a moléculas biomiméticas biológicamente activas que comprenden dominios Fc de inmunoglobulina que exhiben unión al receptor de Fc alterado y unión retenida o aumentada a elementos del sistema de complemento, composiciones que comprenden tales biomiméticos y métodos para elaborar y utilizar tales biomiméticos. La invención se refiere además a tales moléculas para su uso en tratar o evitar condiciones patológicas tales como enfermedades mediadas por complemento, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, trastornos sanguíneos y tipos de cáncer.
Antecedentes de la invención
El sistema de complemento es una parte del sistema inmunitario que está implicado en lisis celular objetivo y fagocitosis de antígenos. Hay tres vías de complemento principales que se conocen actualmente: la vía clásica, la vía alternativa y la vía de unión a la lectina. La vía de complemento clásica se activa una vez que la proteína C1q se une a una o más moléculas de inmunoglobulina IgM intacta, o al menos dos moléculas de inmunoglobulina IgG1, IgG2, o IgG3 intacta (Janeway's Immunobiology, 8a- Ed., Murphy ed., Garland Science, 2012, Capitulo 10). La activación de complemento lleva la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las alteraciones en la región Fc de los anticuerpos monoclonales han demostrado que aumentan o disminuyen la afinidad de la unión al complemento (Moore et ál., MAbs. 2(2): 181-9 (2010). Sin embargo, este trabajo se realizó en el contexto de un anticuerpo monoclonal y fue por lo tanto dependiente, al menos en parte, de la especificidad del objetivo del Fab y fue sin el contexto de la avidez de unión.
El depósito y/o activación del complemento excesivo puede ser perjudicial y está asociado a muchas enfermedades que incluyen miastenia grave, síndrome urémico hemolítico (HUS) y hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH). El cerebro que envejece está asociado a niveles dramáticamente aumentados de componente C1q de complemento (Stephan et ál., J. Neuroscience, 14 de agosto de 2013, 33(33): 13460-13474). El sistema de complemento está implicado profundamente en la patogénesis de la miastenia grave relacionada con el anticuerpo del receptor de acetilcolina (Tüzün y Christadoss, Autoimmun Rev. julio de 2013; 12 (9):904-11. doi: 10.1016/j.autrev.2013.03.003). Una cantidad de descubrimientos de estudios bioquímicos de proteína, inmunológicos y genéticos indican que el sistema de complemento juega un papel esencial en la etiología de la degeneración macular relacionada con la edad (Weber et ál., Dtsch Arztebl Int., 2014 Feb; 111(8): 133138. doi:10.3238/arztebl.2014.0133). Existe una fuerte evidencia de que tanto la vía clásica como la vía alternativa del complemento son activadas patológicamente durante la artritis reumatoide (RA) así como en modelos de animales para la artritis reumatoide (Okroj et ál., Ann Med. 2007; 39(7):517-30).
Las vías clásica, alternativa y de lectina se activan en una manera secuencial y todas las tres vías están implicadas en la enfermedad sistémica. La activación del sistema de complemento está implicado en la patogénesis de las enfermedades autoinmunitarias sistémicas. La activación mediante la vía clásica se ha reconocido por mucho tiempo en enfermedades mediadas por complejo inmunitario tales como vasculitis crioglobulinémica y lupus eritematoso sistémico (Chen et ál., Journal of Autoimmunity, 2009; doi:10.1016/j.jaut.2009.11.014). La activación de complemento a través de las vías alternativa y de lectina se encuentra en pacientes con nefritis por púrpura de Henoch-Schonlein y nefropatía por IgA (Hisano et ál., Am J Kidney Dis 2005;45:295e302). Se describe bien la importancia del complemento en nefropatía membranosa, una de las causas más comunes del síndrome nefrótico adulto. La nefropatía membranosa está marcada por depósitos inmunitarios subepiteliales glomerulares. Los estudios en la nefritis de Heymann, un modelo experimental de nefropatía membranosa, han demostrado que estos depósitos activan localmente el complemento para provocar la lesión de los podocitos, lo que culmina en reorganización citoesqueletal, pérdida de diafragmas de hendidura, y proteinuria (Beck et ál., The Role of Complement in Membranous Nephropathy. Semin Nephrol 2013 Nov;33(6):531-42).
La activación del complemento es un proceso extraordinariamente complejo con nuevos componentes de la cascada que aún se están descubriendo muchas décadas después que se pensó en el inicio que el proceso se entendía. La primera etapa en la cascada de complemento de la vía clásica es la unión de C1q al anticuerpo. (Nature. 21 de abril de 1988; 332(6166):738-40; The binding site for C1q on IgG. Duncan AR, Winter G.).
Binding of non-aggregated antibody to C3 or to C3b is not thought to occur through complement activation in plasma, but is thought to be maintained primarily by complexes of the activation product C3b2 with IgG (Mol Immunol. enero de 2006; 43(1-2):2-12. Complement amplification revisited. Lutz HU, Jelezarova E). Sin embargo, durante la activación de la vía alternativa del complemento por agregados inmunitarios que contienen el anticuerpo IgG, la cadena alfa de C3b puede unirse de forma covalente en uno o dos sitios en la parte Fd de la cadena pesada de IgG (es decir, esa parte de la cadena pesada que está incluida en el fragmento Fab)(Biochem J. 1 mayo, 1981; 195(2): 471-480). La unión del componente C3 del complemento al anticuerpo-antígeno agrega luego de la activación de la vía alternativa en el suero humano. K J Gadd y K B Reid). Históricamente se ha hecho referencia a los componentes del complemento C4a, C3a, C5a y el complejo de ataque de membrana como productos de ruptura de complemento o anafilatoxinas. Sin embargo, la literatura ahora deja en claro que C4a (Xie et ál., International Immunopharmacology 12 (2012) 158­ 168), C3a (Coulthard y Woodruff, J Immunol 2015; 194:3542-3548), y C5a (Nishise et ál., Therapeutic Apheresis and Dialysis 13(6):509- 514 y Gerard et ál., J. Biol Chem. 280(48):39677-39680, 2 de diciembre de 2005) se encuentran en determinadas circunstancias antiinflamatorias y no están asociadas a un aumento de la cascada.
Una terapia predominante en el mercado en este momento para el tratamiento de enfermedades mediadas por complemento es el anticuerpo anti-C5 eculizumab que une C5 e inhibe su escisión a C5a y C5b-9, que inhibe parcialmente la evolución de la cascada de complemento corriente abajo y respuestas trombóticas e inflamatorias asociadas. Sin embargo, no tiene un impacto directo en componentes de complemento corriente arriba tal como C1q, C1R, C1S, complejo de tipo C1, o en C4, C4a, C4b, C2, C1, C4b2, C2b, C4b2a, C3, C3a, o C3b que son componentes de la vía de la lectina, vía clásica, y vía alternativa corriente arriba del componente de la cascada de complemento C5 y que pueden ser objetivos preferenciales para tratar la enfermedad. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales e inmunoglobulinas normales sí unen C1q y otros objetivos corriente arriba de C5. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos mejorados para tratar las enfermedades mediadas por complemento a través de la unión de componentes de cascada de complemento corriente arriba y modulación consecuente de la cascada de complemento. Existe una necesidad adicional en la técnica de métodos mejorados para tratar las enfermedades mediadas por complemento con un compuesto de inmunoglobulina que comprende Fc que une C1q hexamérico con avidez, no solo con afinidad, y además que lo hace sin unión de avidez considerable a receptores de Fc de afinidad baja.
Fc de inmunoglobulina IgG1 natural une más de una docena de ligandos de forma natural, uno de los cuales es el factor del complemento C1q. Otros ligandos de Fc de IgG1 de modo no taxativo incluye los receptores de Fc canónico, receptor neonatal FcRn, hierro, proteína A, FcRL1-6, TRIM21, y DC-SIGN. La IgG1 homodimérica soluble une naturalmente la C1q con afinidad que es demasiado baja para ser funcional (CA Diebolder et. ál. Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembled at the Cell Surface. Science marzo de 2014; 343(6176):1260-1263) y con una velocidad de disociación alta (Gaboriaud et. al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. J. Biol. Chem. 2003 Nov 21;278(47):46974-82). Sin embargo, cuando el IgG1 se fija a un objetivo de antígeno a través de su Fab, ocurre un cambio conformacional (M. Oda et. ál. Evidence of allosteric conformational changes in the antibody constant region upon antigen binding. Int. Immunol. (2003) 15 (3): 417-426) y la afinidad de unión a C1q aumenta.
Además, a medida que la IgG1 se acumula en el sitio de un antígeno, múltiples Fc de inmunoglobulina se presentan a C1q, lo que tiene como resultado más unión ávida en el sitio de unión al antígeno. Dado que C1q es hexamérico con seis sitios de unión de Fc (KB Reid. Chemistry and molecular genetics of C1q. Behring Inst Mitt. julio de 1989;(84):8-19), la unión de IgG1 agregada es de avidez elevada (Diebolder, 2014). Por lo tanto, la IgG1 unida densamente une C1q no solo con la afinidad de una inmunoglobulina homodimérica sino también con la avidez que da como resultado citotoxicidad dependiente del complemento, además de estar disponible para reticular receptores de Fc con citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) resultante y fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés). La respuesta funcional resultante de la unión de agrupaciones de Fc unido a C1q hexamérico es la activación de la vía de complemento clásica con formación de C1qC1rC1 y escisión de C4 a C4a y C4b. Los agregados solubles de IgG1, que ocurren ambos naturalmente a concentraciones muy bajas (Soltis y Hasz. Spontaneous aggregation of native immunoglobulins in hypoalbuminemic serum. J Clin Lab Immunol. octubre de 1982; 9(1):13-7) y en inmunoglobulina intravenosa humana agrupada (IVIG, por sus siglas en inglés) (A. Herrera et. ál. Immunoglobulin composition of three commercially available intravenous immunoglobulin preparations. J. All Clin Immunol, 84(1):556-561), presentan Fc de IgG1 polivalente sin unir a sus ligandos, que incluyen receptores de Fc de afinidad baja y C1q. Los agregados solubles (es decir, no unidos a las células) de IgG1 unen de este modo el C1q hexamérico con avidez. La unión de C1q soluble a agregados solubles de IgG1 (es decir, no unidos a las células) puede inhibir la activación corriente abajo de la cascada de complemento, que incluye la inhibición de CDC.
IVIG humano agrupado, que está agrupado de decenas de miles de donantes de sangre, contiene una parte muy pequeña y variable (0,1 - 5 %) de agregados de IgG1 que imitan el efecto natural de agregados solubles de IgG1 natural. IVIG une C1q y ha demostrado ser clínicamente útil en enfermedades mediadas por complemento tal como miastenia grave. IVIG, sin embargo, tiene todos los riesgos asociados de ser un producto hemoderivado, no se produce de forma recombinante, tiene cantidades mal controladas de agregados de IgG1, y está comprendido principalmente de fracciones inactivas para tratar enfermedades mediadas por complemento. Además, el tratamiento de IVIG también generalmente lleva a una respuesta proinflamatoria no deseada al unirse a receptores de Fc de baja afinidad (Andresen et. ál. Product equivalence study comparing various human immunoglobulin-G formulations. J Clin Pharmacol 2000; 40:722-730 y Ghielmetti et. ál. Gene expression profiling of the effects of intravenous immunoglobulin in human whole blood. Mol Immunol 43 (2006) 939-949). Existe una necesidad de terapias producidas de forma recombinante, nuevas, consistentes que imitan el proceso natural de Fc de IgG1 soluble agregado que actúa como un inmersor de complemento al unir de forma ávida C1q, mientras que al mismo tiempo evita respuestas proinflamatorias no deseadas al unirse preferentemente a componentes de complemento sobre otros ligandos naturales que incluyen receptores de Fc de baja afinidad.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a moléculas biomiméticas de proteína de fusión biológicamente activas que comprenden lo que se denomina en el análisis en el presente documento "unidades de stradomer". La invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona un homodímero de péptido que comprende:
(a) al menos un dominio Fc de IgG1 que comprende las mutaciones puntuales S267E, H268F y S324T y que comprende además
(i) la mutación puntual N297A;
(ii) la mutación puntual G236R; o
(iii) las mutaciones puntuales G236R y E233P; y
(b) al menos un dominio de multimerización capaz de multimerizar el homodímero de péptido;
en donde el homodímero de péptido exhibe unión preferencial al complemento con respecto a FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb y/o FcyRIII.
En una modalidad, el dominio de multimerización que es capaz de multimerizar el homodímero de péptido se selecciona del grupo que consiste en una bisagra de IgG2, una cremallera de isoleucina y un dominio GPP. En algunas modalidades, el dominio de multimerización crea multímeros de dichos homodímeros. En modalidades adicionales, los multímeros de dichos homodímeros son multímeros de alto orden.
En algunas modalidades, el homodímero comprende, del amino-terminal al carboxi, una secuencia líder; un dominio Fc que comprende una bisagra de IgG1, CH2 de IgG1 y CH3 de IgG1; y una bisagra de IgG2. La secuencia líder puede escindirse luego de la expresión.
En algunas modalidades, el homodímero comprende, del amino-terminal al carboxi, una secuencia líder; una bisagra de IgG2; y un dominio Fc que comprende una bisagra de IgG1, CH2 de IgG1 y CH3 de IgG1, donde el homodímero comprende una o más mutaciones puntuales proporcionadas en la presente. La secuencia líder puede escindirse luego de la expresión. En una modalidad, el homodímero comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del SEQ ID NO: 17 y el SEQ ID NO: 64.
El homodímero puede comprender además una secuencia enlazadora de uno o más aminoácidos, cuyo enlazador puede ser escindible o sensible a la proteasa. El enlace puede escindirse por una proteasa que es predominantemente intracelular. El enlazador puede escindirse por una proteasa que está predominantemente presente en el retículo endoplásmico y el Golgi. El enlazador puede escindirse por furina. El enlazador puede escindirse por una proteasa que es predominantemente una proteasa específica del órgano tal como, por ejemplo, la proteasa relacionada con el cerebro neuropsina. El enlazador puede escindirse por una proteasa que es predominantemente una proteasa específica del tumor, tal como, por ejemplo, metaloproteinasa 9 y activador del plasminógeno de urocinasa.
El homodímero puede exhibir unión preferencial al complemento en comparación con FcyRI, FcyRIl que incluye FcyRIIa y/o FcyRIIb, y/o FcyRIII. En determinadas modalidades, la unidad de stradomer exhibe unión reducida a un receptor Fcy de afinidad baja. En otras modalidades, la unidad de stradomer exhibe unión reducida a FcyRI, FcyRII que incluye FcyRIIa y/o FcyRIIb, y/o FcyRIII en comparación con un stradomer de la misma estructura que no comprende una mutación puntual en una o más posiciones 267, 268 y/o 324.
El homodímero puede comprender una mutación en 297, 298 o 299 y retener la unión a C1q, inhibir CDC, y retener la unión a FcyRI o a un receptor Fcy de baja afinidad que incluye FcyRIIa, FcyRIIb y/o FcyRIII.
La invención también proporciona una molécula (denominada en el análisis en la presente un "stradomer de agrupación") que comprende dos o más unidades de stradomer como se desvela en la presente.
Los homodímeros pueden proporcionarse para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de enfermedades mediadas por complemento, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, alergias, enfermedades mediadas por linfocitos B, enfermedades mediadas por anticuerpo, trastornos renales y trastornos sanguíneos.
La enfermedad mediada por anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en enfermedad de Goodpasture; rechazo al trasplante de órganos sólidos; neuromielitis óptica; neuromiotonia; encefalitis límbica; síndrome de corea fibrilar de Morvan; miastenia grave; síndrome miasténico de Lambert Eaton; neuropatía autonómica; enfermedad de Alzheimer; aterosclerosis; enfermedad de Parkinson; síndrome de la persona rígida o hiperplexia; aborto espontáneo recurrente; síndrome de Hughes; lupus eritematoso sistémico; ataxia cerebelar autoinmunitaria; enfermedades del tejido conectivo que incluyen escleroderma, síndrome de Sjogren; polimiositis; artritis reumatoide; poliarteritis nodosa; síndrome de CREST; endocarditis; tiroiditis de Hashimoto; enfermedad de tejido conectivo mezclado; canalopatías; trastornos neuropsiquiátricos autoinmunitarios pediátricos asociados a infecciones de estreptococo (PANDAS, por sus siglas en inglés); afecciones clínicas asociadas a anticuerpos contra receptores de N-metil-D-aspartato especialmente NR1, proteína 2 asociada a contactina, AMPAR, GluR1/GluR2, descarboxilasa de ácido glutámico, GlyR alfa 1a, receptor de acetilcolina, VGCC de tipo P/Q, VGKC, MuSK, GABA(B)R; acuaporina 4; y pénfigo. La enfermedad autoinmunitaria puede ser la artritis.
La enfermedad mediada por complemento puede seleccionarse del grupo que consiste en miastenia grave, síndrome urémico hemolítico (HUS), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), neuromielitis óptica, rechazo de aloinjertos mediado por anticuerpos, nefropatía que incluye nefropatía membranosa, y nefritis que incluye glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN) y nefritis lúpica.
El trastorno sanguíneo puede ser una anemia, tal como enfermedades de células falciformes, que incluyen hemoglobina SS, hemoglobina SC, hemoglobina Sp° talasemia, hemoglobina Sp+ talasemia, hemoglobina s D, y hemoglobina SE. El trastorno inflamatorio puede ser degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Parkinson.
Los homodímeros pueden proporcionarse para su administración a un sujeto que lo necesita. Los homodímeros pueden proporcionarse para administración de forma intravenosa, subcutánea, oral, intraperitoneal, sublingual, bucal, transdérmica, mediante implante subdérmico o intramuscular.
Los homodímeros proporcionados pueden ser útiles para tratar o prevenir pérdida de audición o pérdida de visión relacionada con enfermedades autoinmunitarias, tal como pérdida de audición relacionada con la edad o inducida por ruido, o pueden ser útiles para reducir la inflamación o respuestas autoinmunitarias relacionadas con la implantación del dispositivo, tal como implantación de cocleares u otros dispositivos auditivos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la unión del stradomer GL-2045 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, o FcRn, según se midió por interferometría de biocapa (ForteBio Octet).
La Figura 2 es una gráfica de radar de las unidades de respuesta máxima (RUmax) para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G997. Cada gráfica de radar en estas descripciones ha sido generada de una lectura visual de las curvas de unión que resultan de la salida de la interferometría de biocapa Octet.
La Figura 3 muestra la unión del stradomer G997 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, y FcRn, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 4A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G998. La Figura 4B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y stradomers preferenciales de complemento G997 y G998.
La Figura 5 muestra la unión del stradomer G998 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, y FcRn, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 6A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomers preferenciales del complemento G1022 y G1033. La Figura 6B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y stradomers preferenciales de complemento G1022 y G1033.
La Figura 7A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer generalizado G1032. La Figura 7B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer generalizado G1032. La Figura 8A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer generalizado G1023. La Figura 8B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer generalizado G1023. La Figura 9A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1006. La Figura 9B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1006.
La Figura 10A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1027. La Figura 10B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1027.
La Figura 11A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1003. La Figura 11B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1003.
La Figura 12A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer preferencial del complemento G989. La Figura 12B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G989.
La Figura 13 muestra la unión del stradomer G989 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, y FcRn, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 14A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G990. La Figura 14B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G990.
La Figura 15 muestra la unión del stradomer G990 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, y FcRn, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 16A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G994. La Figura 16B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G994.
La Figura 17 muestra la unión del stradomer G994 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, y FcRn, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 18A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G996. La Figura 18B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G996.
La Figura 19 (fila superior de paneles) muestra la unión del stradomer G996 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa, o FcRn, según se midió por interferometría de biocapa. La Figura 19 (fila inferior de paneles) también muestra la unión de stradomer G996 FcyRIIb, FcyRIII y FcyRIV de ratón.
La Figura 20A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G1042. La Figura 20B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1042.
La Figura 21 muestra la unión del stradomer G1042 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, y FcyRIIa, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 22A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G1043. La Figura 22B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1043.
La Figura 23 muestra la unión del stradomer G1043 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa o FcyRIIa, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 24A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G1046. La Figura 24B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1046.
La Figura 25 muestra la unión del stradomer G1046 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa o FcyRIIa, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 26A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y stradomer preferencial del complemento G1050. La Figura 26B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1050.
La Figura 27 muestra la unión del stradomer G1050 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, y FcyRIIa, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 28A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer generalizado G1049. La Figura 28B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer generalizado G1049.
La Figura 29 muestra la unión del stradomer G1049 a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, y FcyRIIa, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 30A proporciona una gráfica de radar de las RUmax para cada receptor de Fc, ELISA de C1q, y datos de inhibición de CDC para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1025. La Figura 30B proporciona una gráfica de radar de las RU a 300 segundos (RUS300s) para cada receptor de Fc para G045c y el stradomer preferencial del complemento G1025.
La Figura 31A muestra la unión de control negativo G001, stradomer original GL-2045, G993, G997, G998, G996 y G994 a C1q, medida por absorbancia a concentraciones en aumento de stradomer en un ensayo ELISA. La Figura 31B muestra los datos con transformación logarítmica y los valores EC50 para cada uno de los stradomers evaluados. Los valores EC50 se muestran en pg/ml.
La Figura 32 muestra la unión de control negativo G001, stradomer original GL-2045, G994, G996, G997 y G998 al componente C3 de complemento, medida por absorbancia a concentraciones en aumento de stradomer en un ensayo ELISA. El panel superior muestra los datos de absorbancia con datos de absorbancia y el panel inferior muestra los datos de absorbancia sin transformación logarítmica.
La Figura 33 muestra la unión de control negativo G001, stradomer original GL-2045, G997, G998 y G994 al componente C3b de complemento, medida por absorbancia a concentraciones en aumento de stradomer en un ensayo ELISA.
La Figura 34 muestra la unión de control negativo G001, stradomer original GL-2045, G996, G997, G998 y G994 al componente C4 de complemento, medida por absorbancia a concentraciones en aumento de stradomer en un ensayo ELISA.
La Figura 35 muestra la unión de control negativo G001, stradomer original GL-2045, G996, G997, G998 y G994 al componente C5 de complemento, medida por absorbancia a concentraciones en aumento de stradomer en un ensayo ELISA.
Las Figuras 36A y 36B proporcionan las secuencias del IgG1 humano, DEL (Figura 36A; SEQ ID NO: 3) y polimorfos de EEM (Figura 36b ; SEQ ID NO: 2).
La Figura 37 muestra una disminución considerable en proteinuria en animales a los que se les administró stradomers de prueba en un modelo animal de nefritis.
Las Figuras 38A y 38B muestran el análisis histológico de un animal de control de PBS enfermo luego la inducción de la glomerulonefritis mediante un anticuerpo anti-Thy 1 (Fig. 38A) y un animal que recibió 40 mg/kg G998 (Fig. 36B). En la Figura 38A (G) se refiere a los glomérulos con membrana basal engrosada; (B) se refiere a los túbulos basofílicos e infiltrados intersticiales; y las flechas apuntan a túbulos dilatados con fluido proteináceo. La Figura 36B muestra los túbulos y glomérulos no lesionados en el animal tratado con G998.
La Figura 39 proporciona una representación gráfica del análisis histológico de los tejidos de riñón en animales que recibieron PBS como un tratamiento de control (Grupo 2) o 40 mg/kg G0998 (Grupo 4).
La Figura 40 proporciona los niveles de nitrógeno de urea en sangre (BUN, por sus siglas en inglés) en los animales de control con PBS, animales de control no enfermos que no recibieron el anticuerpo anti-Thy 1, y los animales que recibieron G994 (40 mg/kg), G998 (40 mg/kg o 80 mg/kg), o G1033 (40 mg/kg). Los valores P proporcionados en la gráfica son relativos a los animales de control con PBS enfermos.
La Figura 41 muestra la proteinuria (mg/24hr) en animales de control que solo recibieron anti Fx1a, animales que recibieron anti Fx1a y G998 en el día 0, y animales que recibieron anti Fx1a en el día 0 y G998 en el día 1. La Figura 42 muestra los niveles (pg/ml) de G994, G998, o G1033 en ratas luego de una sola dosis del compuesto indicado en el tiempo.
La Figura 43 muestra la actividad de complemento en sangre de rata luego de la dosis individual de G994 (panel izquierdo), G998 (panel del medio) o G1033 (panel de la derecha).
Las Figuras 44A y 44B proporcionan la correlación entre los niveles de fármacos (pg/ml en ejes x) y la actividad del complemento (% en ejes y) para cada uno de G994 (paneles izquierdos), G998 (paneles del medio), y G1033 (paneles de la derecha). La Figura 44A proporciona todos los puntos de datos recolectados en el estudio para cada stradomer preferencial del complemento. La Figura 44 se enfoca en la parte inferior de la curva (concentraciones de fármaco inferiores).
La Figura 45 muestra los niveles de fármacos (pg/ml) de G994, G998 o G1033 en monos cynomolgus luego de una sola dosis del compuesto preferencial del complemento en el momento 0, tal como se midió en 0, 1, 2, 4, 12, 24, 48, 72, 144, 216, y 312 horas luego de la dosis.
La Figura 46 muestra la actividad de complemento (% de muerte celular) en el tiempo luego de la dosis individual de G994 (panel izquierdo), G998 (panel del medio) o G1033 (panel de la derecha).
Las Figuras 47A y 47B muestran la correlación entre el nivel del fármaco y la actividad del complemento para cada uno de los compuestos evaluados en el estudio. La Figura 47A muestra todos los puntos de datos recolectados en el experimento, y la Figura 47B muestra la primera parte de la curva, con concentraciones de fármaco inferiores. Para G994, el valor de intercepción del eje x es 144 y 168 pg/ml para suero al 2 % y 4 %. Los valores R2 para la correlación es 0,866 y 0,835. Para G998 el valor de intercepción x es 425 y 347 pg/ml con valores R2 de 0,925 y 0,743 para suero al 2 % y 4 %. Para G1033 la intercepción x es 346 y 379 <xy/ml con valores R2 de 0,584 y 0,714. Las Figuras 48A-48G son geles que muestran que, como el compuesto original GL-2045 en el que se basó el compuesto de stradomer derivado evaluado (G994 o G998) los compuestos stradomer derivados forman multímeros. Los compuestos GL-2045, G994, G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105, y G1106 se muestran en la Figura 48A. Los compuestos GL-2045, G994, G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109, y G1084 se muestran en la
Figura 48B. Los compuestos GL-2045, G998 y G1107 se muestran en la Figura 48C. Los compuestos GL-2045, G994, G1110, G1111, G1112, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118 y G1119 se muestran en la Figura 48D. Los compuestos GL-2045, G994, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130 y G1131 se muestran en la Figura 48E. Los compuestos GL-2045, G998, G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1093, y G1095 se muestran en la Figura 48F. Los compuestos GL-2045, G998, G1069, G1070, G1132, G1075, y G1075 se muestran en la Figura 48G.
La Figura 49 muestra la unión de control negativo G001, que es Fc de IgG1, stradomer GL-2045, o stradomer preferencial de complemento G994, G998 o G1033 para complementar el componente C3 (panel superior izquierdo), C3b (panel superior derecho), C5 (panel inferior izquierdo), o C4 (panel inferior derecho) medido por absorbancia a concentraciones en aumento de stradomer en un ensayo ELISA.
Las Figuras 50A-50C muestran la unión del stradomer G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105 y G1106 a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, o FcyRIII, medida por interferometría de biocapa (ForteBio Octet).
Las Figuras 51A-51C muestran la unión del stradomer G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109 y G1084 a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, o FcyRIII, medida por interferometría de biocapa (ForteBio Octet).
Las Figuras 52A-52G muestran la unión del stradomer G1100, G1111, G1112, G1113, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130, y G1131 a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, o FcyRMI, medido por interferometría de biocapa (ForteBio Octet).
Las Figuras 53A-53C muestran la unión del stradomer G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1107, G1093 y G1095 a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, o FcyRIII, medido por interferometría de biocapa (ForteBio Octet).
Las Figuras 54A-54b muestran la unión del stradomer G1069, G1070, G1132, g 1074, y G1075 a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, o FcyRIII, medida por interferometría de biocapa (ForteBio Octet).
La Figura 55A muestra la inducción de IL1Ra de PBMC aislado luego de 20 horas de tratamiento con controles de vehículo (0 gg/ml de G019, G994, o G1033) o dosis de G019, G994, y G1033 que varían de 0,02 |jg/ml a 2000 gg/gl. G019, que une todos los receptores canónicos, se utilizaron como un control positivo.
La Figura 55B muestra la inducción de TNFDDde PBMC aislado luego de 4 horas de tratamiento con controles de vehículo (0 gg/ml de G019, G994, o G1033) o dosis de G019, G994, y G1033 que varían de 0,02 gg/ml a 2000 gg/gl. G019, que une todos los receptores canónicos, se utilizaron como un control positivo.
La Figura 56 muestra la unión de C1q de stradomers preferenciales de complemento medidos por ELISA.
La Figura 57 muestra el diámetro de tobillo promedio de las ratas Lewis en un modelo CIA de artritis tratadas con G994, G998, G1033, controles con PBS, dexametasona o controles sin tratar.
La Figura 58A-58B muestra los datos de unión de C1q para seleccionar los compuestos preferenciales del complemento mostrados en la Figura 56, G1088, G1129, G1082, G1092, y G1102 (Figura 58A), y G1069, G1114, y G1075 (Figura 58B).
La Figura 59 muestra la unión del stradomer G999 y G996 a FcyRI, FcyRIIb, y FcyRIIIa, según se midió por interferometría de biocapa.
La Figura 60 muestra los datos de inhibición de CDC para G999 y G996. El CD20 indica la adición del anticuerpo CD20. "6%" indica la adición de complemento de suero al 6 %. Los controles incluyen células más adición de G996 solo (50 y 100 gg/ml), células más suero ("+ 6 %"), y células más suero más anticuerpo ("células CD20 6 %"). La Figura 61 muestra los datos de inhibición de CDC para G994. El CD20 indica la adición del anticuerpo CD20. "6%" indica la adición de complemento de suero al 6 %. Los controles incluyen células más adición de G996 solo (50 y 100 pg/ml), células más suero ("+ 6 %"), y células más suero más anticuerpo ("células CD20 6 %"). La Figura 62 muestra los datos de inhibición de CDC para G998. El CD20 indica la adición del anticuerpo CD20. "6%" indica la adición de complemento de suero al 6 %. Los controles incluyen células más adición de G996 solo (50 y 100 pg/ml), células más suero ("+ 6 %"), y células más suero más anticuerpo ("células CD20 6 %"). La Figura 63 muestra los datos de inhibición de CDC para G1033. El CD20 indica la adición del anticuerpo CD20. "6%" indica la adición de complemento de suero al 6 %. Los controles incluyen células más adición de G996 solo (50 y 100 pg/ml), células más suero ("+ 6 %"), y células más suero más anticuerpo ("células CD20 6 %").
Descripción detallada de la invención
El enfoque hacia el diseño molecular racional para los compuestos de modulación inmunitaria descritos en la presente incluye la creación recombinante y/o bioquímica de biomiméticos inmunológicamente activos que exhiben unión retenida, preferencial o aumentada al complemento.
WO 2008/151088 revela haber utilizado dominios de Fc de inmunoglobulina unida para crear biomiméticos de Fc de inmunoglobulina multimerizada de forma ordenada de hIVIG (multímeros ordenados biológicamente activos conocidos como stradomers), que incluyen secuencias cortas que incluyen sitios de restricción y etiquetas de afinidad entre los componentes individuales del stradomer, para el tratamiento de condiciones patológicas que incluyen enfermedades autoinmunitarias y otras afecciones inflamatorias. Ver WO 2008/151088 y la patente estadounidense n.° 8.680.237. WO 2012/016073 describe stradomers donde los componentes individuales están directamente unidos, en vez de separados por sitios de restricción o etiquetas de afinidad. Ver WO 2012/016073 y la patente estadounidense n.° 2013/0156765. WO 2012/016073 también describe específicamente un stradomer multimerizante (GL-2045) que comprende un dominio IgG1Fc con un dominio de multimerización bisagra de IgG2 unido directamente a su C-terminal, que exhibe unión al complemento y multimerización aumentada respecto a la construcción unida al N-terminal (G019, descrito en WO2008/151088). Las unidades de stradomer descritas en la presente comprenden una o más mutaciones puntuales en la región Fc de GL-2045 tienen como resultado unión al complemento aumentado y/o unión al complemento aumentado o selectivo respecto a la unión al receptor gamma Fc canónico en comparación con las moléculas previamente descritas. Los homodímeros de péptido de la invención son como se define en las reivindicaciones.
G045c y G019 se han descrito previamente (Ver WO 2012/016073). La estructura de G045c es: bisagra de IgG1 -CH3 de IgG1 de IgG1CH2 - bisagra de IgG2 y G045c se proporciona como el SEQ ID NO: 7 y 8.
Los términos "G045c", "GL-2045", se usan de manera intercambiable en la presente. G045c tiene la estructura: bisagra de IgG1 - CH3 de IgG1 de IgG1CH2 - bisagra de IgG2. Tal como se usa en la presente, el término "stradomer en el fondo G045c" y similares se refiere a un stradomer que tiene la estructura de bisagra de IgG1 - CH3 de IgG1 de IgG1CH2 - bisagra de IgG2 (SEQ ID NO: 7 o 8). La estructura de G019 es: bisagra de IgG2 - bisagra de IgG1 - CH2 de IgG1- CH3 de IgG1. Tal como se usa en la presente, el término "stradomer en el fondo G019" y similares se refiere a un stradomer que tiene la estructura de bisagra de IgG2 - bisagra de IgG1 - CH2 de IgG1 - c H3 de IgG1 (SEQ ID NO: 9). Un experto en la técnica entenderá que las secuencias de aminoácidos de ambos GL-2045 y G019 comprenden una secuencia líder de amino-terminal (SEQ ID NO: 1) que se escinde luego de la expresión de la proteína madura.
Las mutaciones en las regiones Fc de moléculas de anticuerpo completas tienen resultados predecibles con respecto a las características y función del anticuerpo. Ver, por ejemplo, Shields et ál., Journal of Biological Chemistry, 276; 6591 (2001). En particular, Moore et ál. han demostrado que la mutación triple S267E, H268F y/o S324T en la región Fc de un anticuerpo monoclonal aumenta de forma fiable la relación de la unión del complemento de un anticuerpo monoclonal relativo al receptor de Fcy canónico o unión a FcRn (Mabs 2:2; 18 (2010)). Véase también WO2011/091078. Sin embargo, los inventores de la presente describen aquí compuestos en los que las mutaciones S267E, H268F, y/o S324T en la región Fc de un stradomer multimerizante, que incluye la mutación triple S267E / H268F / S324T, de hecho y de forma sorprendente están asociadas a la falta de unión a C1q y por lo tanto NO aumentan la relación de unión al complemento respecto a la unión al receptor de Fcy canónico (por ejemplo, G999, G1024, G1030, G1031, G1040, G1044 y G1048).
Es un hecho establecido que las mutaciones específicas de anticuerpos monoclonales que aumentan la unión a C1q (tal como S267E, H268F, y/o S324T descritos por Moore et. ál.) aumentan por lo tanto la CDC (Moore et. ál. 2010). Los presentes inventores en la presente describen compuestos numerosos que, al incorporar estas mismas mutaciones en el contexto de un stradomer multimerizante están asociados no solo sin aumento en CDC pero también sin CDC inherente en absoluto. Además, y de forma sorprendente dado que estas mutaciones están asociadas a CDC aumentado en el contexto de un mAb, los inventores demuestran en la presente que los compuestos de la presente invención que incorporan estas mismas mutaciones de hecho inhiben la CDC en una manera dependiente de la concentración (por ejemplo, G994, G998, y muchas otras, Figuras 61-63).
Además, en el contexto de un anticuerpo, una mutación puntual introducida en la posición 297 del dominio Fc se ha informado que disminuye la unión a los receptores Fcy canónicos de afinidad elevada y afinidad baja (Robert L. Shields, et ál. High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for Fc©RI, Fc©RII, Fc©RIII, and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the Fc©R. J. Biol. Chem., Feb 2001; 276: 6591 - 6604). De manera similar, en el contexto de un anticuerpo monoclonal, una mutación puntual introducida en la posición 299 del dominio Fc ha demostrado afectar de forma variable la unión a FcyRs (por ejemplo, reduce la unión a FcyRIIIa y mantiene la unión a FcyRIIa) e inhibe adicionalmente la unión a C1q (Sazinsky et ál. Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 23 de diciembre de 2008; 105(51): 2016720172; PCT/US2008/085757). En el contexto de stradomers multimerizantes específicos, una mutación puntual en la posición 297 o del dominio Fc tuvo como resultado una disminución en la unión a receptores Fcy canónicos de baja afinidad. Sin embargo, en determinados stradomers, la mutación de la posición 299 tuvo como resultado la esperada unión disminuida a FcyRs, pero preferiblemente en la retención o aumento de la unión de Fc a todos los FcyRs canónicos.
Además, una doble mutación en las posiciones 236 y 328 (Tai et ál., Blood 119; 2074 (2012)) o una mutación en la posición 233 (Shields, et ál. J. Biol. Chem., 276(9):6591 (2001) han demostrado reducir unión Fc de anticuerpo o inmunoglobulina a FcyRs canónicos. La doble mutación en las posiciones 236 y 328 han demostrado que eliminan la unión a anticuerpo o inmunoglobulina a FcyRI (Tai et ál. 2012); sin embargo, los inventores de la presente hallaron sorprendentemente que en el contexto de un stradomer multimerizante y una mutación que aumenta el complemento en la posición 267 y/o 268 y/o 324, la unión a FcyRI se retuvo de forma impredecible en determinados stradomers multimerizantes. Además, se espera que la doble mutación en las posiciones 233 y 236 (E233P y G236R) reduzca la unión a todos los receptores Fc canónicos; sin embargo, los inventores de la presente hallaron que varias combinaciones de mutaciones que incluyen mutaciones en estas dos posiciones tuvieron como resultado la unión de uno o más receptores Fc que fueron retenidos o aumentados de forma impredecible respecto al stradomer correspondiente no mutado. Además, se esperaba que una mutación en la posición 328 (L328F) aumentara la unión a FcyRIIb solo (Chu et ál., Molecular Immunology 45; 3926 (2008)); sin embargo, los inventores de la presente hallaron sorprendentemente que un stradomer que comprende una mutación en la posición 328 en el contexto de un stradomer que tiene mutaciones adicionales al menos en las posiciones 267, 268 y 324 tuvo como resultado unión aumentada a uno o más de otros FcyRs canónicos en formas impredecibles. Además, una mutación en la posición 238 se espera que aumente la unión a FcyRIIb y disminuya la unión a FcyRI y FcyRIIa (Mimoto et ál., Protein Engineering, Design, and Selection p. 1-10 (2013)), mientras se espera que una mutación en la posición 265 reduzca toda la unión a FcyR canónico. Sin embargo, los inventores de la presente hallaron sorprendentemente que en el contexto de un stradomer multimerizante y una mutación que aumenta el complemento en la posición 267 y/o 268 y/o 324, mutaciones en las posiciones 238 y 265 tuvieron como resultado la unión resistente a FcyRIIa en determinados stradomers multimerizantes. Por lo tanto, los inventores han descubierto sorprendentemente que las mutaciones en la literatura que enseñan la modificación de la función del anticuerpo, por ejemplo para reducir o eliminar la unión canónica en un anticuerpo monoclonal o para alterar la unión a C1q, no tienen el mismo efecto en el contexto de un stradomer multimerizante.
Además, incluso dentro del contexto de un stradomer, los efectos de las mutaciones son similarmente impredecibles. Por ejemplo, tal como se describe en la presente, donde dos stradomers son idénticos entre sí en vez de una o más mutaciones en una o más posiciones particulares, incluso donde las mutaciones son para aminoácidos estructuralmente similares, los dos stradomers pueden tener características funcionales sumamente diferentes. Además, WO 2012/016073 describe que sorprendentemente, a pesar del hecho que GL-2045 y G019 tienen exactamente los mismos componentes, y de hecho son exactamente la misma molécula solo que en la posición de la región bisagra de IgG2 respecto al dominio Fc IgG1, estas moléculas exhiben de gran forma diferentes actividades con respecto a la unión del complemento. Ambas moléculas multimerizan y unen los receptores Fc. De forma sorprendente, GL-2045 exhibe unión resistente a todos los receptores Fc así como unión de complemento e inhibición de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), mientras que G019 no une el complemento o inhibe CDC. De manera similar, cuando exactamente las mismas mutaciones se realizan a GL-2045 y G019, el resultado puede ser completamente diferente y, de hecho, opuesto. A modo de ejemplo, los compuestos 996 y 999 ambos albergan la triple mutación descrita en Moore, et ál. que se espera que aumente la unión a C1q (S267E/H268F/S324T), así como una mutación adicional, G236R. Sin embargo, en el contexto de GL-2045 esta mutación retiene preferencialmente la unión a C1q sobre los receptores Fcy canónicos (G996), mientras que en G019, no hay unión a C1q (G999). Esta dicotomía de función en lo que de otro modo es una mutación bien caracterizada subraya la impredecibilidad de las mutaciones hechas en el contexto de un stradomer multimerizante.
Además, mientras que los anticuerpos monoclonales tienen afinidad por sus objetivos FcyR y de complemento, que pueden ser regulados por aumento o por disminución al introducir mutaciones, los stradomers presentan Fc polivalentes a FcyRs y de complemento, y por lo tanto confían más profundamente en la avidez para unir sus objetivos. En contraste, los anticuerpos monoclonales no tienen unión ávida a través de sus dominios Fc. Estas características destacan el hecho de que los stradomers y anticuerpos monoclonales son fundamentalmente diferentes, no solo en estructura, pero en función y utilidad.
Por lo tanto, el efecto de cualquier mutación o conjunto de mutaciones dentro de cualquier región de la molécula en la actividad de un stradomer multimerizante no se puede predecir basándose en la literatura respecto a los anticuerpos monoclonales. Por consiguiente, el efecto de las mutaciones de aminoácidos que son conocidas en la técnica por tener efectos particulares en los anticuerpos, tal como mutaciones que, por ejemplo, aumentarán o disminuirán la unión a un FcyR particular en el contexto de un anticuerpo que tiene especificidad de antígeno, no se puede predecir en el contexto de stradomers. De manera similar, se ha descrito que las mutaciones puntuales L234A y L235A disminuyen la unión de Fc a C1q (Ver WO 2015/132364; Arduin et ál, Molecular Immunology, 65(2):456-463 (2015); Boyle et ál, Immunity, 42(3):580-590 (2015)). Sin embargo, los inventores de la presente descubrieron sorprendentemente que la introducción de estas mutaciones en los biomiméticos de la presente invención tuvo como resultado la retención o aumento de la unión a C1q (por ejemplo, G1033 y G1032). Los inventores de la presente dispuestos a identificar los biomiméticos inmunológicamente activos donde la relación de la unión del complemento respecto a la unión del receptor Fc, en comparación con su biomimético original (por ejemplo, GL-2045 o G019), aumenta. Los biomiméticos pueden exhibir unión retenida o aumentada a C1q. Los biomiméticos pueden unir componentes del sistema de complemento, que de modo no taxativo incluye C1q, C1r, C1s, C4, C4a, C3, C3a, C4b2a3b, C3b, C5, C5a, C5b, C6 , C7, C8, y/o C9, y puede por lo tanto actuar como un "inmersor de complemento". "Inmersor de complemento" tal como se usa en la presente se refiere al fenómeno de unir C1q u otro componente corriente arriba de la cascada de complemento y evitar la activación corriente abajo de los sistemas de complemento. Los biomiméticos pueden unir componentes del sistema de complemento corriente arriba del complejo de ataque a la membrana C5b-9. Los biomiméticos pueden unir componentes del sistema de complemento corriente arriba de C5a. Los biomiméticos pueden exhibir C5a disminuido y complejo de ataque a la membrana. Los biomiméticos pueden exhibir unión reducida de FcyRI y/o FcyRIIa y/o FcyRIIb y/o FcyRIII y unión al complemento retenida o aumentada. Los biomiméticos pueden exhibir unión reducida de FcRn y unión al complemento retenida o aumentada. Los biomiméticos pueden exhibir unión al complemento retenido o aumentado y unión de FcyR canónica reducida así como unión de FcRn reducida. Los biomiméticos pueden exhibir unión al complemento retenido o aumentado y la unión selectiva a uno o más FcyRs canónicos (por ejemplo, unión a FcyRI, pero no FcyRIIb, o unión a FcyRIIb pero no FcyRI), o unión al complemento aumentado y unión selectiva a FcRn.
Los biomiméticos y las composiciones pueden tener la ventaja de unión aumentada de componentes de la vía del complemento en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata. El grado de unión aumentada de componentes de la vía del complemento en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata puede, de hecho, ser bastante considerable, acercándose o sobrepasando la unión de componentes de la vía de complemento a IgG1 agregada que puede ocurrir en humanos bajo determinadas circunstancias. Los biomiméticos y las composiciones pueden tener la ventaja de unión retenida de componentes de la vía del complemento en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata con unión disminuida de receptores de Fc y otros ligandos.
Los biomiméticos y composiciones pueden tener la ventaja de unión al complemento preferencial en comparación con la unión del receptor Fc canónico observado con la inmunoglobulina IgG1 innata, inmunoglobulina intravenosa (IVIG), plasma humano enriquecido para agregados de inmunoglobulina, o a la composición de biomimético original que no tiene mutaciones puntuales. Tal unión preferencial se puede caracterizar, de modo no taxativo, por asociación aumentada, disociación disminuida, evidencia de avidez o unión similar a concentración más baja. Los biomiméticos y composiciones pueden tener la ventaja de unión al complemento aumentada en comparación con la unión del receptor Fc canónico observado con la inmunoglobulina IgG1 innata, inmunoglobulina intravenosa (IVIG), plasma humano enriquecido para agregados de inmunoglobulina, o a la composición de biomimético original que no tiene mutaciones puntuales. El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden inhibir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden inhibir CDC con unión reducida o funcionalmente ausente a FcyRI y/o FcyRIIa y/o FcyRIIb y/o FcyRIII. El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden unir componentes del complemento C1q y/o C4 y/o C4a y/o C3 y/o C3a y/o C5 y/o C5a. El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden unir C3b. Los biomiméticos y las composiciones pueden unir una molécula de complemento, por ejemplo, C1q, C3, o C3b, evitando o reduciendo la activación del sistema del complemento y evitando o reduciendo las funciones mediadas por complemento corriente abajo tal como lisis celular, inflamación o trombosis. Los biomiméticos y composiciones pueden estar asociados a niveles aumentados de C4a, C3a, y/o C5a y estos niveles aumentados están asociados a perfiles clínicos antiinflamatorios o antitrombóticos.
El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden tener la ventaja adicional de multimerización aumentada en comparación con las inmunoglobulinas intactas y/o composiciones de unión al complemento descritas previamente. Los biomiméticos y las composiciones pueden tener la ventaja adicional o unión reducida o ausente a todos o determinados FcyRs canónicos. El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden tener la ventaja de la misma unión al complemento, o aumentada, como inmunoglobulinas intactas, multimerización aumentada así como unión disminuida a uno o más FcyRs canónicos relativos a inmunoglobulinas intactas o el compuesto original no mutado. El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden tener la ventaja de unión al complemento aumentada, multimerización aumentada así como unión disminuida a FcyRIIIa. El biomimético de unión al complemento y composiciones pueden exhibir unión al complemento retenido o aumentado y retienen la unión a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb o FcyRIII. El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y retienen la unión al receptor Fc neonatal (FcRn) pero no a cualquier otro FcyR canónico de afinidad baja a cualquier grado considerable (por ejemplo, el stradomer G1033 descrito en la presente). El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden exhibir al complemento retenida o aumentada y retienen la unión a FcRn y FcyRI pero no a cualquier FcyR canónico de afinidad baja de activación a cualquier grado considerable (por ejemplo, los stradomer G994 y G998 descritos en la presente). El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y retienen la unión a FcyRI y/o FcyRIIb pero no a cualquier otro FcyR canónico (por ejemplo, el stradomer G994 descrito en la presente). El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y retienen la unión a FcRn y FcyRI pero tienen unión disminuida a los receptores de activación de afinidad baja FcyRIIa y/o FcyRIIIa (por ejemplo, los stradomers G997, G1003, y G1022 descritos en la presente). El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y retienen la unión a FcyRIIb pero tienen unión disminuida a otros FcyRs canónicos, que comprenden FcyRI, FcyRIIa, o FcyRIIIa (por ejemplo, los stradomers G996 y G1003 descritos en la presente).
El biomimético de unión al complemento y las composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y retienen la unión a FcyRIIb pero no a cualquier otro FcyR canónico de baja afinidad (por ejemplo, G994 y G998). Por lo tanto, los biomiméticos y las composiciones pueden tener la ventaja de unión al complemento retenida o aumentada con unión relativamente disminuida o ausente a FcyRs, o tienen la ventaja de unión a FcyRs de activación o inhibidora seleccionada, en cada caso relativo a inmunoglobulina IgG1 no agregada natural y/o en comparación con el biomimético original. Por lo tanto, los biomiméticos y composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata o el biomimético original.
Los biomiméticos y las composiciones pueden tener funciones efectoras modificadas, tal como citotoxicidad dependiente del complemento, en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata o la composición o biomimético original. El biomimético y composiciones pueden exhibir unión retenida o aumentada a las moléculas del complemento relativas a la inmunoglobulina IgG1 innata, IVIG, o la composición o biomimético original. El biomimético y las composiciones pueden exhibir unión a C1q retenida o aumentada en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata, IVIG, o la composición o biomimético original. Los biomiméticos pueden ser capaces de unir C1q, C4, C4a, C3, C3a, C3b, C5 o C5a para reducir o evitar las funciones mediadas por complemento corriente abajo tal como citotoxicidad dependiente del complemento o lisis celular. Los biomiméticos pueden exhibir unión a C1q retenida o aumentada así como CDC equivalente o aumentada con unión a Fc canónica alterada en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata, IVIG o el biomimético original.
Los biomiméticos y las composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y unión similar a FcRn con unión disminuida a uno o más receptores de Fc canónicos relativos a la inmunoglobulina IgG1 innata o el biomimético original. Los biomiméticos y composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y una semivida más larga en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata o el biomimético original. Sin limitarse a la teoría, los biomiméticos pueden tener una semivida funcional más larga en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata o el biomimético original que es posible por la internalización mediante FcRn, que permite una liberación más tardía y un efecto biológico demorado o prolongado del biomimético. Los biomiméticos y composiciones pueden exhibir unión al complemento retenida o aumentada y una semivida más corta en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata o el biomimético original. Los biomiméticos y composiciones pueden exhibir retiro del complemento retenido o aumentado en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata o el biomimético original. Por lo tanto, los biomiméticos pueden tener una semivida disminuida en comparación con la inmunoglobulina IgG1 innata, IVIG o biomiméticos originales y que son capaces adicionalmente de unir C1q u otros componentes de complemento para reducir o evitar la formación de complejo de ataque a la membrana y funciones mediadas por complemento corriente abajo tal como lisis celular.
Existen seis cabezas en C1q, conectadas por tallos de tipo colágeno a un tallo central (Reid K. B. M. & Porter, R. R. Biochem. J. 155, 19-23 (1976)), y las cabezas aisladas se unen a la parte Fc del anticuerpo de forma bastante débil, con una afinidad de 100 microM (Hughes-Jones, N. C. & Gardner, B. Molec Immun. 16, 697-701 (1979)). La unión del anticuerpo a múltiples epítopos en una superficie antigénica agrega el anticuerpo. Este agregado facilita la unión de varias de las cabezas de C1q de una molécula C1q, que lleva a una afinidad aumentada de alrededor de 10 nM (Burton, D. R. Molec. Immun. 22, 161-206 (1985)). Por el contrario, los stradomers multimerizantes de unión preferencial del complemento y stradomers multimerizantes generalizados presentan Fc polivalente a C1q, uniendo de forma ávida de este modo los componentes del complemento a una unidad de stradomer dentro del stradomer multimerizado, con un Fc que une preferencialmente los componentes del complemento sobre uno o más receptores Fc canónicos. De esta manera, los stradomers multimerizantes preferenciales del complemento y stradomers generalizados de la presente invención pueden mostrar afinidad de unión retenida o aumentada y/o avidez a C1q, que se comportan como un inmersor de complemento, incluso aunque estos stradomers no tengan Fab (y por lo tanto ninguna parte Fd del Fc) y no pueden unir múltiples epítopos en una superficie antigénica como lo harían los anticuerpos agregados. Los stradomers multimerizantes preferenciales del complemento de la actual invención pueden presentar 4, 5, 6, 7, 8 o más Fc funcionales respecto a C1q hexamérico, lo cual provoca la unión ávida con una velocidad de disociación lenta e inhibición funcional de CDC. De manera similar, los stradomers multimerizantes preferenciales de complemento y stradomers generalizados pueden mostrar afinidad de unión retenida o aumentada y/o avidez a C4, C4a, C3, C3a, C3b, C5, o C5a, que se comportan como un inmersor de complemento. De esta manera, los biomiméticos, de manera similar a la parte Fc de los agregados en IVIG o para anticuerpos agregados, pueden unir los componentes de complemento C1q, C4, C4a, C3, C3a, C3b, C5 o C5a donde la parte Fc de una inmunoglobulina aislada intacta tiene afinidad de unión baja y no tiene avidez para estos componentes de complemento.
Se ha informado que las mutaciones individuales, dobles o triples específicas en la posición 267, 268 y/o 324 del dominio Fc de anticuerpos monoclonales, y en particular la mutación triple S267E / H268F / S324T, aumentan la relación de unión al complemento de un anticuerpo monoclonal en comparación con el receptor Fcy canónico o unión a FcRn (Moore et ál., MAbs 2; 181 (2010)), y se ha pensado previamente que la unión al complemento aumentada depende de la unión previa del anticuerpo Fab al antígeno objetivo seguido por unión a C1q. Sin embargo, los presentes inventores encontraron de forma sorprendente que una mutación en la posición S267E, H268F, y/o S324T, que incluye la mutación triple S267E / H268F / S324T, en el contexto de un stradomer multimerizante disminuyó de forma impredecible la unión al complemento, aumentó la unión al complemento, o retuvo de forma selectiva la unión al complemento, demostrando que no todos los efectos descritos de estas mutaciones en un anticuerpo monoclonal predicen el efecto en el contexto de un stradomer multimerizante. Además, donde la unión al complemento aumentado se demostró de forma sorprendente en los stradomers multimerizantes de la actual invención, esto ocurrió a pesar de la ausencia de un Fab en el stradomer multimerizante. Un stradomer multimerizante preferencial del complemento puede unirse a C1q independientemente del direccionamiento del antígeno Fab. En contraste con un anticuerpo monoclonal, un stradomer multimerizante preferencial del complemento puede unirse a C1q sin que el stradomer esté unido a la célula. La presente descripción describe stradomers multimerizantes que comprenden mutaciones puntuales en las posiciones S267E, H268F, y/o S324T. Por lo tanto, la presente descripción proporciona stradomers multimerizantes que comprenden mutaciones puntuales en las posiciones S267E, H268F, y/o S324T que se unen bien a C1q e inhiben CDC (tal como 1102). Sin embargo, por el contrario, la presente descripción también describe stradomers multimerizantes que comprenden mutaciones puntuales en las posiciones S267E, H268F, y/o S324T que no se unen bien a C1q o inhiben bien la CDC (tal como 1106). G999, G1024, G1030, G1031, G1040, G1044, y G1048). Por lo tanto, las mutaciones puntuales S267E, H268F y/o S324T que aumentan la unión a C1q en un anticuerpo monoclonal tienen un efecto impredecible en el contexto de un stradomer multimerizante, particularmente en el contexto de mutaciones adicionales.
La presente invención es como se define en las reivindicaciones.
La descripción técnica detallada expuesta a continuación puede en algunos respectos ir más allá de la descripción de la invención en sí misma y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no pretenden definir la invención como tal (que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien colocarla en un contexto técnico más amplio. Los diversos elementos de los antecedentes técnicos adicionales no pretenden definirse como parte de la materia objeto de la invención y no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Los dominios Fc que comprenden una mutación en la posición 297, 298, y/o 299 son denominados en la presente como "mutantes aglicosilados" o "mutantes de aglicosilación" dado que las mutaciones en estas posiciones alteran el patrón de glicosilación normal de Fc de IgG. En el contexto de un anticuerpo monoclonal, donde estas mutaciones se caracterizaron primero, los mutantes aglicosilados disminuyen o eliminan la unión de Fc de inmunoglobulina normal a FcyRs canónicas como un resultado del patrón de glicosilación alterado. Sin embargo, en el contexto de un stradomer multimerizante, estas mutaciones no son predecibles. En determinados stradomers multimerizantes, la unión de FcyR disminuye en comparación con el biomimético original (por ejemplo, G998). Sin embargo, en determinados otros stradomers multimerizantes, la unión de FcyR está retenida o aumentada en mutantes aglicosilados respecto a los compuestos originales no mutados (por ejemplo, G1068).
Según se emplea aquí, el uso de los términos "un" o "una", cuando se utilizan junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o descripción, pueden referirse a "uno", pero también concuerdan con la definición de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".
Según se utilizan aquí, los términos "biomimético", "molécula biomimética", "compuesto biomimético" y términos relacionados, se refieren a un compuesto realizado por el hombre que imita la función de otro compuesto, como la inmunoglobulina intravenosa humana agrupada ("hIVIG"), un anticuerpo monoclonal o el fragmento Fc de un anticuerpo. Los biomiméticos "biológicamente activos" son compuestos que poseen actividades biológicas que son iguales o similares a las de sus contrapartes de origen natural. "De origen natural" significa una molécula, o una parte de esta, que se encuentra, normalmente, en un organismo. De origen natural también significa sustancialmente de origen natural. Los biomiméticos "inmunológicamente activos" son biomiméticos que presentan actividad inmunológica igual o similar a las moléculas inmunológicamente activas de origen natural, como los anticuerpos, citocinas, interleucinas y otras moléculas inmunológicas conocidas en la técnica. Los biomiméticos de la presente invención son homodímeros de péptidos como se definen en las reivindicaciones, también llamados stradomers, como se definen en la presente. "Biomimético original" tal como se usa en la presente se refiere a biomiméticos no mutados utilizados como la base para los compuestos descritos en la presente (por ejemplo, GL-2045 y G019).
Tal como se usa en la presente, el término "complemento" se refiere a cualquiera de las pequeñas proteínas de la cascada de complemento, a veces denominado en la literatura como el sistema del complemento o cascada de complemento. Tal como se usa en la presente, los términos "unión al complemento" o "unirse al complemento" se refieren a la unión de cualquiera de los componentes de la cascada del complemento. Los componentes de la cascada de complemento son conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en Janeway's Immunobiology, 8a Ed., Murphy ed., Garland Science, 2012. Hay tres vías de complemento principales que se conocen actualmente: la vía clásica, la vía alternativa y la vía de unión a la lectina. La vía de complemento clásica se activa una vez que la proteína C1q se une a una o más moléculas de inmunoglobulina IgM intacta, o al menos dos moléculas de inmunoglobulina IgG1, IgG2, o IgG3 intacta. La activación de complemento lleva a la citolisis dependiente del complemento. La activación excesiva del complemento puede ser perjudicial y está asociada a varias enfermedades que incluyen miastenia grave, síndrome urémico hemolítico (HUS) y hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH). "Preferencial de complemento" tal como se utiliza en la presente, se refiere a la unión de uno o más componentes de la cascada de complemento a un grado mayor en comparación con la unión a otros receptores (por ejemplo, FcyRs o FcRn).
Tal como se usa en la presente, los términos "enfermedad mediada por complemento" y "enfermedad asociada al complemento" se refiere a enfermedades y afecciones en los que el sistema de complemento juega un papel. Por ejemplo, las enfermedades mediadas por complemento incluyen enfermedades que implican anormalidades de la activación del sistema de complemento. Las enfermedades mediadas por complemento pueden ser tratadas, prevenidas o reducidas por inhibición de la cascada de complemento. Las enfermedades asociadas al complemento son conocidas en la técnica e incluyen, de modo no taxativo, miastenia grave, síndrome urémico hemolítico (HUS), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), síndrome urémico hemolítico relacionado con E. coli y la toxina Shiga (STEC- HUS), microangiopatía trombótica sistémica (TMA) , hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), neuromielitis óptica, neuromielitis óptica recidivante (NMO, por sus siglas en inglés), rechazo mediado por anticuerpo de aloinjertos de trasplante, Síndrome de Barraquer-Simons , asma, lupus eritematoso, enfermedad cardíaca autoinmunitaria, esclerosis múltiple, enfermedad intestinal inflamatoria, heridas por isquemia-reperfusión , enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, lesiones en la espina dorsal, degeneración macular asociada al factor H (Y402H) , degeneración macular relacionada con la edad (AMD), angioedema hereditaria, y glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN), nefropatía membranosa, artritis reumatoide (RA), síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS) , activación de complemento durante la cirugía de derivación cardiopulmonar, dermatomiositis, pénfigo, nefritis lúpica, glomerulonefritis y vasculitis, nefropatía de IgA, falla renal aguda, crioglobulemia, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, uveítis, retinopatía diabética, hemodiálisis, síndrome de distrés pulmonar oclusivo crónico (COPD, por sus siglas en inglés) , y neumonía por aspiración. Enfermedades asociadas al complemento también pueden incluir varias otras enfermedades autoinmunitarias, inflamatorias, inmunológicas, neurológicas, reumáticas o infecciosas asociadas al agente.
"Unido directamente" significa dos secuencias conectadas entre sí sin secuencias de intervención o externas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos derivadas de la inserción de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción en el ADN o fragmentos de clonación. Un experto en la técnica entenderá que "unido directamente" abarca la adición o eliminación de aminoácidos siempre y cuando la capacidad de multimerización se vea sustancialmente no afectada.
"Homólogo" significa con identidad en la totalidad de la secuencia de una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos determinada. Por ejemplo, "80 % homólogo" significa que determinada secuencia comparte aproximadamente el 80 % de identidad con la secuencia reivindicada y que puede incluir inserciones, eliminaciones, sustituciones y cambios de marco. El entendido en la técnica comprenderá que las alineaciones de secuencias se pueden realizar para considerar inserciones y eliminaciones para determinar la identidad en la longitud total de una secuencia.
A través de la presente descripción, la numeración de los residuos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU como se establece en Kabat et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). El "índice EU de acuerdo con Kabat” hace referencia a la enumeración del anticuerpo EU de IgG1 humana. Ver las Figuras 36A y 36B.
Hay dos polimorfos humanos de IgG1, denominados polimorfos DEL y EEM. El polimorfo DEL tiene una D en la posición 356 y una L en la posición 358; el polimorfo EEM tiene una E en la posición 356 y una M en la posición 358 (numeración de Kabat; ver las Figuras 36A y 36B). Los stradomers proporcionados en la presente pueden comprender ya sea el polimorfo de IgG1 DEL o el EEM. Por lo tanto, incluso si una oración para un mutante particular se produce explícitamente en el contexto del polimorfismo DEL, un experto en la técnica entenderá que las mismas mutaciones se pueden realizar al polimorfo EEM para proporcionar los mismos resultados. Por ejemplo, los compuestos G994 y G998 fueron cada uno construidos con ambos los polimorfismos DEM y EEM y se evaluó su diferencia funcional. No se observaron diferencias funcionales. Específicamente, la unión a C1q y la inhibición de CDC eran sustancialmente las mismas para cada polimorfismo de los compuestos respectivos.
Las biomiméticas inmunológicamente activas de la invención actual también se llaman stradomers. Los compuestos inmunológicamente activos de la actual invención son multímeros de homodímeros. Los homodímeros y multímeros de la invención son como se definen en las reivindicaciones. Cada homodímero posee la capacidad de unirse al complemento. Por lo tanto, cuando se multimeriza, los biomiméticos inmunológicamente activos contienen al menos dos homodímeros donde cada uno posee la capacidad de unirse al complemento.
Los siguientes párrafos definen los componentes básicos de los biomiméticos, estructural y funcionalmente, y después definen a los biomiméticos en sí. Sin embargo, en primer lugar, resulta útil advertir que, como se indicó anteriormente, cada uno de los biomiméticos de la presente invención tienen al menos un dominio Fc y un dominio de multimerización como se reivindica. A un mínimo, en cada uno del dominio Fc y el dominio de multimerización se encuentran los polipéptidos diméricos (o son regiones diméricas de un polipéptido más grande) que comprende dos cadenas de péptidos o brazos (monómeros) que se asocian para formar un receptor Fc funcional o sitio de unión al complemento y dominio de multimerización capaz de multimerizar el homodímero resultante. Por lo tanto, la forma funcional de los fragmentos individuales y los dominios planteados en la presente existen, en general, en forma dimérica (o multimérica). Los monómeros de los fragmentos individuales y los dominios planteados en la presente son las cadenas simples o brazos que se deben asociar con una segunda cadena o brazo para formar una estructura dimérica funcional.
Fragmento Fc
El "fragmento Fc" es un término de la técnica que se emplea para describir la región de proteínas o la estructura plegada de proteínas que se encuentra rutinariamente en el Carboxi-terminal de las inmunoglobulinas. El fragmento Fc se puede aislar del fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal mediante el uso de la digestión enzimática, por ejemplo la digestión de papaína, que es un proceso incompleto e imperfecto (véase Mihaesco C y Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine, Vol 127, 431-453 (1968)). Junto con el fragmento Fab (que contiene el dominio de unión al antígeno) el fragmento Fc constituye el holo anticuerpo, que significa aquí el anticuerpo completo. El fragmento Fc consiste en las porciones del Carboxi-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo. Cada una de las cadenas en un fragmento Fc tiene entre 220-265 aminoácidos de longitud y las cadenas se suelen conectar a través de un enlace disulfuro. El fragmento Fc suele contener uno o más pliegues estructurales independientes o subdominios funcionales. En particular, el fragmento Fc abarca un dominio Fc, definido en la presente como la estructura mínima que se une a un receptor Fcy. Un fragmento Fc aislado está compuesto por dos monómeros del fragmento Fc (por ejemplo, las dos porciones del Carboxi-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo; que se definen adicionalmente en la presente) que están dimerizados. Cuando dos monómeros del fragmento Fc se asocian, el fragmento Fc resultante tiene actividad de unión al receptor Fc y/o de complemento.
Fragmento parcial de Fc
Un "fragmento Fc parcial" es un dominio que comprende menos del fragmento Fc completo de un anticuerpo, y que aun así retiene una estructura suficiente como para tener la misma actividad que el fragmento Fc, incluida la actividad de unión al receptor Fc y/o actividad de unión al complemento. Un fragmento Fc parcial puede, por lo tanto, carecer de parte o de la totalidad de una región bisagra, parte o la totalidad de un dominio CH2, parte o la totalidad de un dominio CH3 y/o parte o la totalidad de un dominio CH4, según el isotipo del anticuerpo del cual se deriva el dominio Fc parcial. Otro ejemplo de un fragmento Fc parcial incluye una molécula que comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1. En el presente ejemplo, el fragmento Fc parcial carece del dominio bisagra presente en IgG1. Los fragmentos Fc parciales están compuestos por dos monómeros del fragmento Fc parcial. Como se define adicionalmente en la presente, cuando dos de tales monómeros del fragmento Fc parcial se asocian, el fragmento Fc parcial resultante tiene actividad de unión al receptor Fc y/o actividad de unión al complemento.
Dominio Fc
Según se utiliza en la presente, "dominio Fc" describe la región mínima (en el contexto de un polipéptido mayor) o la estructura plegada de la proteína más pequeña (en el contexto de una proteína aislada) que se puede unirse a un receptor Fc (FcR) o estar unido por este. En un fragmento Fc y en un fragmento Fc parcial, el dominio Fc es la región de unión mínima que permite la unión de la molécula a un receptor Fc. Mientras que un dominio Fc se puede limitar a un polipéptido homodimérico discreto que se une a un receptor Fc, también está claro que un dominio Fc puede formar una parte o la totalidad de un fragmento Fc, así como parte o la totalidad de un fragmento Fc parcial. Cuando se utilice el término "dominios Fc” en la presente invención, los entendidos en la técnica reconocerán que significa más de un dominio Fc. Un dominio Fc está compuesto por dos monómeros del dominio Fc. Como se define adicionalmente en la presente, cuando dos de tales monómeros de dominios Fc se asocian, el dominio Fc parcial resultante tiene actividad de unión al receptor Fc y/o actividad de unión al complemento. Por lo tanto, un dominio Fc es una estructura dimérica que puede unir el complemento y/o un receptor Fc. Los stradomers descritos en la presente comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que alteran la capacidad del stradomer para unir al complemento y/o un receptor Fc.
Dominio parcial de Fc
Según se utiliza en la presente, "dominio Fc parcial" describe una parte de un dominio Fc. Los dominios Fc parciales incluyen los dominios de región constante de cadena pesada individuales (por ejemplo, dominios CH1, CH2, CH3 y CH4) y las regiones bisagra de las diferentes clases y subclases de inmunoglobulina. Por lo tanto, los dominios parciales de Fc humano de la presente invención incluyen el dominio CH1 de IgG1, el dominio CH2 de IgG1, Ig el dominio CH3 de IgG1 y las regiones bisagra de IgG1 e IgG2. Los dominios Fc parciales correspondientes en otra especie dependerán de las inmunoglobulinas presentes en la especie y de su denominación. Preferentemente, los dominios parciales Fc de la presente invención incluyen los dominios CH1, CH2 y bisagra de IgG1 y el dominio bisagra de IgG2. El dominio Fc parcial de la presente invención puede comprender además una combinación de más de uno de estos dominios y bisagras. Sin embargo, los dominios Fc parciales individuales de la presente invención y sus combinaciones carecen de la capacidad de unirse a FcR. Por ende, los dominios Fc parciales y sus combinaciones comprenden menos de un dominio Fc. Los dominios Fc parciales se pueden conectar para formar un péptido que tiene complemento y/o actividad de unión al receptor Fc, formando así un dominio Fc. En la presente invención, los dominios Fc parciales se utilizan con dominios Fc como los componentes básicos para crear los biomiméticos de la presente invención, según se describen en la presente. Cada dominio Fc parcial está compuesto por dos monómeros de dominios Fc parciales. Cuando dos de los monómeros del dominio Fc parcial se asocian, se forma un dominio Fc parcial.
Como se indicó anteriormente, cada uno de los fragmentos Fc, los fragmentos Fc parciales, los dominios Fc y los dominios Fc parciales son dominios o proteínas diméricas. Por ende, cada una de estas moléculas está compuesta por dos monómeros que se asocian para formar el dominio o la proteína dimérica. Aunque las características y la actividad de las formas homodiméricas se planteó anteriormente, los péptidos monoméricos se plantean a continuación.
Monómero de fragmento Fc
Según se utiliza en la presente, un "monómero de fragmento Fc” es una proteína de cadena simple que, cuando se asocia a otro monómero de fragmento Fc, comprende un fragmento Fc. El monómero de fragmento Fc es, por lo tanto, la parte del Carboxi- terminal de una de las cadenas pesadas del anticuerpo que conforman el fragmento Fc de un holo-anticuerpo (por ejemplo, la parte contigua de la cadena pesada que incluye la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de IgG). El monómero de fragmento Fc puede comprender, como mínimo, una cadena de una región bisagra (un monómero bisagra), una cadena de un dominio CH2 (un monómero de dominio CH2) y una cadena de un dominio CH3 (un monómero de dominio CH3) unidas de forma contigua para formar un péptido. Los dominios CH2, CH3 y bisagra pueden ser de isotipos diferentes. El monómero de fragmento Fc puede contener un dominio bisagra de IgG2 y dominios CH2 y CH3 de IgG1.
Monómeros de Dominio Fc
Según se utiliza en la presente, "monómero de dominio Fc" describe la proteína de cadena simple que, cuando se asocia a otro monómero de dominio Fc, comprende un dominio Fc que se puede unir al complemento. La asociación de dos monómeros de dominio Fc crea un dominio Fc.
Los monómeros de dominio Fc pueden no contener secuencias externas como si las tenían los monómeros de dominio Fc descritos previamente en WO 2008/151088. En cambio, los monómeros de dominio Fc pueden estar unidos directamente a la secuencia líder (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) en un extremo (por ejemplo, el N-terminal del monómero Fc) y hacia el dominio de multimerización (por ejemplo, SEQ ID NO: 4, 5 o 6) en el otro extremo (por ejemplo, el C-terminal del monómero Fc). Un experto en la técnica reconocerá que mientras que las construcciones son producidas con una secuencia líder, esta secuencia es escindida posteriormente. Por lo tanto, a proteína madura no contendrá la secuencia líder.
El monómero de dominio Fc puede comprender, del amino-terminal al carboxi, un dominio Fc que comprende una bisagra de IgG1, CH2 de IgG1 y CH3 de IgG1 y una bisagra de IgG2 (G045c de fondo), donde el monómero comprende una o más mutaciones puntuales en el dominio Fc. El monómero de dominio Fc puede comprender, del amino-terminal al carboxi, un dominio Fc que comprende una bisagra de IgG2, bisagra de IgG1, CH2 de IgG1 y CH3 de IgG1 (G019 de fondo), donde el monómero Fc comprende una o más mutaciones puntuales en el dominio Fc. El monómero de dominio Fc puede comprender, del amino-terminal al carboxi, un dominio Fc que comprende una bisagra de IgG2, CH2 de IgG1 y CH3 de IgG1 (G051 de fondo), donde el monómero Fc comprende una o más mutaciones puntuales en el dominio Fc.
Stradomers
Los biomiméticos de la presente invención son como se definen en las reivindicaciones, y también se llaman stradomers. Los stradomers de son compuestos biomiméticos capaces de unir el complemento. Un stradomer puede tener cuatro conformaciones físicas diferentes: en serie, agrupación, núcleo o fragmento Fc. Como resultará evidente, los fragmentos Fc, fragmentos Fc parciales, dominios Fc y dominios Fc parciales planteados anteriormente se utilizan en la construcción de las diversas conformaciones de stradomeros. Además, son los monómeros de dominio Fc individual y los monómeros de dominio parcial Fc, también discutidos anteriormente, que se producen primero para formar unidades de stradomer homodiméricas, y que luego se multimerizan a través de la inclusión de un dominio de multimerización (por ejemplo, una bisagra de IgG2) para formar las estructuras multiméricas que son los stradomers de agrupación de la presente invención. Los stradomers específicos se describen en gran detalle en WO 2008/151088 y WO 2012/016073. La proporción de unión del complemento al receptor Fcy y/o unión a FcRn se puede aumentar más con mutaciones adicionales en una o más posiciones 233 y/o 234 y/o 235 y/o 236 y/o 238 y/o 265 y/o 297 y/o 299.
Monómero de unidad de stradomer
Tal como se utiliza en la presente, el término "monómero de unidad de stradomer" se refiere a una molécula de péptidos contiguos individual que, cuando se asocia a al menos un segundo monómero de unidad de stradomer, forma una unidad de stradomer homodimérica que comprende al menos un dominio Fc. Mientras que las unidades de stradomer pueden estar comprendidas de dos monómeros de stradomer asociados, un stradomer también puede contener tres o más monómeros de stradomer.
Un monómero de unidad de stradomer puede tener una secuencia de aminoácidos que formará uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más dominios Fc cuando se asocian con otro monómero de unidad de stradomer para formar una "unidad de stradomer". Un monómero de unidad de stradomer puede tener además una secuencia de aminoácidos que formará uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más dominios parciales Fc cuando se asocian con otro monómero de unidad de stradomer para formar una unidad de stradomer.
Las regiones de los monómeros de unidad de stradomer que formarán dominios Fc y dominios Fc parciales en el contexto de una unidad de stradomer se pueden disponer simplemente del Carboxi-terminal al amino-terminal de regiones sucesivas de la molécula de monómero de unidad de stradomer. La disposición de los monómeros de dominio Fc particular y monómeros de dominio parcial Fc que comprende un monómero de unidad de stradomer que comprende un monómero de unidad de stradomer no es crítico. Sin embargo, la disposición debe permitir la formación de dos dominios Fc funcionales al asociar dos monómeros de unidad de stradomer. El stradomer puede contener un enlace directo entre el N-terminal del monómero Fc de IgG1 y el C-terminal de un péptido líder (SEQ ID NO:1) y el C-terminal del Fc de IgG1 y el N-terminal de la bisagra de IgG2 de dominio de multimerización (SEQ ID NO:4).
A modo de un ejemplo aclaratorio, el experto en la técnica entenderá que las moléculas de stradomer de la presente invención que comprenden las mutaciones puntuales indicadas se pueden construir al preparar una molécula de polinucleótido que codifica un monómero de dominio Fc con las mutaciones puntuales deseadas y una región multimerizante. Tal molécula de polinucleótido se puede insertar en un vector de expresión, que se puede utilizar para transformar una población de bacterias o transfectar una población de células de mamífero. Los monómeros de unidad de stradomer luego se pueden producir al cultivar las bacterias transformadas o células de mamífero transfectadas en condiciones de cultivo apropiadas. Por ejemplo, una línea celular clonal que continúa un grupo de células establemente transfectadas se puede lograr al seleccionar células con genetecina/G418. De manera alternativa, las células se pueden transfectar de forma transitoria con ADN que codifica el stradomer de la actual invención (por ejemplo, ADN que codifica el stradomer de acuerdo con cualquiera de los SEQ ID NO. 10-77) bajo el control del promotor CMV. Los monómeros de stradomer expresados pueden entonces formar unidades de stradomer funcionales y stradomers ya sea por autoagregación de los monómeros de stradomer o unidades o asociación de monómeros de stradomer utilizando enlaces de monómero interstradomer. Los stradomers expresados pueden entonces purificarse del medio de cultivo celular mediante cromatografía por afinidad utilizando, por ejemplo, columnas de Proteína A o Proteína G. Un experto en la técnica entenderá que el péptido líder incluido en la construcción de ácido nucleico se utiliza solo para facilitar la producción de los péptidos de monómero de unidad de stradomer y se escinde al expresarse la proteína madura. Por lo tanto, la biomimética biológicamente activa de la presente invención no comprende un péptido líder.
Stradomer de agrupación
El stradomer utilizado de acuerdo con la presente descripción puede ser un stradomer de agrupación. Un "stradomer de agrupación” es un biomimético que tiene una forma radial con una "cabeza" de resto central y dos o más "piernas", donde cada pierna comprende uno o más dominios Fc que es capaz de unir al menos un receptor gamma Fc y/o complemento. Un stradomer de agrupación también es conocido como un "stradomer multimerizante" en virtud de la presencia de un dominio de multimerización que tiene como resultado la multimerización del stradomer. Por lo tanto, stradomers en serie que contienen múltiples dominios Fc en una molécula de monómero de stradomer puede aún estar clasificada como un stradomer de agrupación o stradomer multimerizante siempre y cuando la molécula también contenga al menos un dominio de multimerización. Cada stradomer de agrupación comprende más de una proteína homodimérica, cada una llamada una "unidad de stradomer de agrupación". Cada unidad de stradomer de agrupación comprende al menos una región que se multimeriza y una región "pierna" que comprende al menos un dominio Fc funcional. La región multimerizante crea una "cabeza" de stradomer de agrupación luego de ser multimerizado con otra unidad de stradomer de agrupación. La región de pierna puede ser capaz de unir tantas moléculas de complemento como hay dominios Fc en cada región de pierna. Por ejemplo, la región de pierna puede unir tantas moléculas C1q como hay dominios Fc en cada región de pierna. Por lo tanto, un stradomer de agrupación es un compuesto biomimético capaz de unir dos o más moléculas C1q, previniendo de este modo lisis mediada por complemento corriente abajo. Un biomimético particularmente potente de la actual invención puede unir todas las seis cabezas de la molécula C1q.
La región multimerizante puede ser una secuencia péptido que hace que las proteínas diméricas multimericen adicionalmente o, de manera alternativa, la región multimerizante puede ser una glicosilación que aumenta la multimerización de proteínas diméricas. Ejemplos de regiones que multimerizan péptidos incluyen la bisagra de IgG2, dominio CH2 de IgE, cremallera de isoleucina, repetición glicina- prolina-prolina de colágeno ("GPP") y dedos de zinc. Los cambios de glicosilación, ya sean un resultado de sustituciones de aminoácidos o de condiciones de cultivo, también pueden afectar multimerización de los biomiméticos de la invención actual. La influencia de la glicosilación en la multimerización de péptidos se describe en la técnica (por ejemplo, Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein). Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams y Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 80, N.° 9, [Parte 1: Biological Sciences] (1 de mayo de 1983), pp. 2771-277 '4; Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka y Haruko Ogawa. International Congress Series Volumen 1223, diciembre de 2001, Páginas 97-101).
La región multimerizante puede ser una secuencia de péptidos que hace que los péptidos se dimericen o multimericen e incluyen la bisagra de IgG2, el dominio CH2 de IgE, una cremallera de isoleucina, GPP de colágeno y un dedo de cinc. Tal como se conoce en la técnica, la región bisagra de IgG2 humana puede formar dímeros covalentes (Yoo, E.M. et ál. J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003); Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007)). La formación de dímeros de IgG2 está mediada potencialmente a través de la estructura de bisagra de IgG2 mediante enlaces C-C (Yoo et al 2003), lo que sugiere que la estructura bisagra sola puede mediar la formación de dímeros. La cantidad de dímeros de IgG2 que se encuentran en el suero humano, sin embargo, es limitada. Se estima que la cantidad de IgG2 que existe como un dímero del homodímero es menor que 10 % del IgG2 total (Yoo et ál. 2003). Además, no existen pruebas cuantitativas de la multimerización de IgG2 más allá del dímero del homodímero. (Yoo et ál. 2003). Es decir, no se ha descubierto que la IgG2 nativa forme multímeros de orden superior en el suero humano. Los stradomers que contienen bisagra de IgG2 (es decir, G045c y G019 tal como se describe en WO 2012/016073) están presentes en multímeros de alto orden y a diferencia del IgG2 natural en suero humano en el que las interacciones bisagra de IgG2 son variables y dinámicas, G045c ha demostrado formar multímeros altamente estables evidenciados en geles de SDS-PAGE no reductores, mediante ultracentrifugación analítica y mediante estudios de estabilidad de 3 meses a 100 % de humedad a 37 °C. Además, también es sorprendente que la cantidad de multímeros en las preparaciones de stradomer que contienen bisagra de IgG2 mayores que el aproximadamente 10 % de dímeros y sin multímeros observados para IgG2 en suero humano. Por ejemplo, el porcentaje de stradomers preferenciales de complemento que es multímeros, que incluyen dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros de mayor orden del homodímero, excede 20 % y puede exceder 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o incluso 90 %.
La secuencia de aminoácidos del monómero de bisagra de IgG2 humana es del siguiente modo: ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 4). La mutación de cualquiera de las 4 cisteínas en el SEQ ID NO: 4 se puede asociar con multimerización muy disminuida del stradomer. Existen dos partes C-X-X-C del monómero de bisagra de IgG2. Por ende, los monómeros de stradomer pueden comprender la secuencia de 12 aminoácidos completa del monómero de bisagra de IgG2 o uno o ambos de los núcleos de cuatro aminoácidos, junto con los monómeros de dominio Fc. Aunque el X­ X de las estructuras del núcleo puede ser cualquier aminoácido, en una opción preferida, la secuencia X-X es V-E o P-P. El entendido en la técnica comprenderá que el monómero de bisagra de IgG2 puede estar compuesto de cualquier parte de la secuencia bisagra además de la estructura de cuatro aminoácidos nuclear, incluida la totalidad de la secuencia bisagra de IgG2 y la totalidad o parte de las secuencias de monómeros de los dominios CH2 y CH3 de IgG2. Sin limitarse por la teoría, el dominio de multimerización de bisagra de IgG2 puede formar multímeros mediante la interacción con cualquier parte del monómero de stradomer. Esto es, la bisagra de IgG2 de un monómero de stradomer puede unir la bisagra de IgG2 de otro monómero de stradomer, formando así un dímero del homodímero, o multímeros de orden superior manteniendo a su vez una unión funcional aumentada con los receptores Fc con respecto al Fc de IgG1 natural. De manera alternativa, el dominio bisagra de IgG2 de un monómero de stradomer puede unir la bisagra de IgG1 de otro monómero de stradomer, formando así un dímero del homodímero, o multímeros de orden superior manteniendo a su vez una unión funcional aumentada con los receptores Fc con respecto al Fc de IgG1 natural. También es posible que el dominio bisagra de IgG2 de un monómero de stradomer se una a otra parte del dominio Fc de IgG1, es decir el dominio CH2 o CH3 de otro monómero de stradomer para formar el dímero del homodímero, o multímeros de orden superior manteniendo a su vez una unión funcional aumentada con los receptores Fc con respecto al Fc de IgG1 natural.
Las cremalleras de leucina e isoleucina también se pueden utilizar como la región multimerizante. Las cremalleras de leucina e isoleucina (dominios de hélice superenrollada) son conocidas por facilitar la formación de dímeros de proteína, trímeros y tetrámeros (Harbury et ál. Science 262:1401-1407 (1993); O'Shea et ál. Science 243:538 (1989)). Aprovechando la tendencia natural de una cremallera de isoleucina para formar un trímero, se pueden producir stradomers.
Mientras que el experto en la técnica entenderá que se pueden utilizar diferentes tipos de cremalleras de leucina e isoleucina, en un enfoque preferido se utiliza la cremallera de isoleucina del regulador transcripcional de GCN4 modificado tal como se describe (Morris et ál., Mol. Immunol. 44:3112- 3121 (2007); Harbury et ál. Science 262:1401-1407 (1993)): GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGG (SEQ ID NO: 5) Esta secuencia de cremallera de isoleucina es solo una de diversas secuencias posibles que se pueden utilizar para la multimerización de los monómeros de dominio Fc. Mientras que toda la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 5 se puede utilizar, la parte subrayada de la secuencia representa la secuencia de núcleo de la cremallera de isoleucina que se puede utilizar en los stradomers de agrupación. Por ende, los monómeros de stradomer pueden comprender la secuencia de aminoácidos completa de la cremallera de isoleucina, o el núcleo de 28 aminoácidos, junto con uno o más monómeros del dominio Fc. El experto en la técnica también comprenderá que la cremallera de isoleucina puede estar compuesta por cualquier parte de la cremallera además de la estructura de 28 aminoácidos nuclear y, por lo tanto, puede estar compuesta por más de 28 aminoácidos, pero menos que la secuencia completa.
GPP es una secuencia de aminoácidos que se encuentra en el colágeno humano que provoca la unión proteína de colágeno: proteína. Aunque el experto en la técnica comprenderá que se pueden utilizar diferentes tipos de repeticiones de GPP como un dominio de multimerización, en una opción preferida, se utilizan las repeticiones de glicina-prolina-prolina según se describen (Fan et ál FASEB Journal 3796 vol. 222008): (SEQ ID NO: 6) La secuencia de la repetición glicina-prolina-prolina es solo una de diversas secuencias posibles que se pueden utilizar para la multimerización de los monómeros de dominio Fc. Mientras que toda la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 6 , también es posible utilizar repeticiones de diferente longitud para multimerizar los monómeros de dominio Fc. Asimismo, las repeticiones que contienen diferentes aminoácidos dentro de las repeticiones de GPP también se pueden sustituir.
Se entiende que los stradomers y otras moléculas biomiméticas descritas en la presente se pueden derivar de cualquiera de diversas especies incluyendo seres humanos. De hecho, los dominios Fc, o los dominios Fc parciales, en cualquier molécula biomimética de la presente invención se pueden derivar de la inmunoglobulina de más de una (por ejemplo, de dos, tres, cuatro, cinco o más) especie. Sin embargo, se derivarán, más comúnmente, de una única especie. Además, se apreciará que cualquiera de los métodos descritos en la presente (por ejemplo, los métodos de tratamiento) se pueden aplicar a cualquier especie. En general, todos los componentes de un biomimético aplicado a una especie de interés se derivarán de la especie. Sin embargo, también se pueden utilizar biomiméticos en los cuales todos los componentes son de especies diferentes o son de más de una especie (incluida o no la especie a la cual se aplica el método pertinente).
Los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4 específicos y las regiones bisagra que comprenden los dominios Fc y los dominios Fc parciales de los stradomers y otros biomiméticos se pueden seleccionar independientemente, tanto en términos de la subclase de inmunoglobulina, como en el organismo del cual se derivan. En consecuencia, los stradomers y otros biomiméticos descritos en la presente pueden comprender dominios Fc y dominios Fc parciales que son, independientemente, de diversos tipos de inmunoglobulina como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgD, IgE e IgM humana, IgG2a de ratón o IgA o IgB de perro. De forma similar, cada dominio Fc y dominio Fc parcial se puede derivar de diversas especies, preferentemente una especie mamífera, que incluye primates no humanos (por ejemplo, monos, babuinos y chimpancés), seres humanos, murinos, rattus, bovinos, equinos, felinos, caninos, porcinos, conejos, cabras, ciervos, ovejas, hurones, jerbos, conejillos de indias, hámsters, murciélagos, aves (por ejemplo, pollos, pavos y patos) , peces y reptiles para producir moléculas de stradomer quiméricas o específicas de la especie.
Los dominios Fc individuales y los dominios Fc parciales individuales también pueden ser humanizados. Los entendidos en la técnica notarán que diferentes dominios Fc y dominios Fc parciales proporcionarán diferentes tipos de funcionalidades. Por ejemplo, FcRn se une específicamente a las inmunoglobulinas IgG y no se unen bien a otras clases de inmunoglobulinas. Los entendidos en la técnica también comprenderán que diversas consecuencias perjudiciales se pueden asociar con el uso de dominios de Ig particulares, como la anafilaxis asociada a las infusiones de IgA. Los biomiméticos descritos en la presente se deben diseñar, en general, para evitar los efectos, aunque en circunstancias particulares los efectos pueden ser deseables.
Los stradomers pueden comprender dominios Fc y dominios Fc parciales que tienen aminoácidos que difieren de las secuencias de aminoácidos de origen natural del dominio Fc o del dominio Fc parcial. Los dominios Fc preferidos para incluir en los compuestos biomiméticos tienen una afinidad de unión específica medible respecto al complemento. Las secuencias de aminoácidos primarias y las estructuras de cristalografía de rayos X de múltiples dominios Fc y monómeros de dominios Fc están disponibles en la técnica. Véase, por ejemplo, Woof JM, Burton DR. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nat Rev Immunol. febrero de 2004; 4(2):89-99. Los dominios Fc representativos con capacidad de unión al receptor Fcy incluyen los dominios Fc de la IgG1 humana (SEQ ID NO: 2 o 3). Estas secuencias nativas se han sometido a análisis de estructura- función extensos incluido el mapeo de mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias funcionales. Basándose en estos estudios anteriores de estructura-función y en los datos de cristalografía disponibles, los entendidos en la técnica pueden diseñar variantes de secuencia de dominio Fc funcionales, conservando a su vez la capacidad de unión al complemento. Por ejemplo, se pueden añadir residuos de cisteína para mejorar la unión de disulfuro entre los monómeros o se pueden eliminar para alterar la interacción entre los homodímeros de stradomer. Además, un experto en la técnica puede diseñar las variantes de secuencia de dominio Fc funcional mientras se conserva la capacidad de unión del complemento aumentado o puede diseñar variantes de secuencia de dominio Fc funcional con capacidad de unión al complemento incluso más aumentada.
Los cambios de aminoácidos se pueden encontrar a través de la secuencia del dominio Fc, o pueden estar aislados en dominios parciales de Fc particulares que comprenden el dominio Fc. Las variantes funcionales del dominio Fc utilizadas en los stradomers y otras biomiméticas tendrán al menos alrededor de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un dominio Fc natural. De manera similar, las variantes funcionales de los dominios parciales de Fc utilizadas en los stradomers y otras biomiméticas tendrán al menos alrededor de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un dominio parcial Fc natural.
El experto apreciará el uso de variantes funcionales de monómeros de dominio Fc en la construcción de monómeros de fragmento Fc, monómeros de fragmento parcial Fc, monómeros de stradomer y los otros monómeros. Las variantes funcionales de los monómeros de dominio Fc tendrán al menos alrededor de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de monómero de dominio Fc natural.
De manera similar, pueden usarse variantes funcionales de monómeros de dominio parcial de Fc en la construcción de monómeros de fragmento Fc, monómeros de fragmento parcial Fc, monómeros de dominios Fc, monómeros de stradomer y los otros monómeros. Las variantes funcionales de los monómeros de dominio parcial de Fc tendrán al menos alrededor de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de monómero de dominio Fc natural.
Los cambios de aminoácidos pueden disminuir, aumentar o dejar inalterada la afinidad de unión del stradomer con el FcRn o los receptores Fcy canónicos. Preferentemente, los cambios de aminoácidos serán sustituciones de aminoácidos conservadoras, sin embargo, los cambios incluyen eliminaciones, adiciones y otras sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, normalmente, cambios dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Además, el cambio de aminoácidos puede mejorar la fuerza de multimerización, por ejemplo, mediante el añadido de residuos de cisteína.
El término "variante funcional" tal como se usa en la presente se refiere a una secuencia relacionada por homología con una secuencia de referencia que es capaz de mediar los mismos efectos biológicos que la secuencia de referencia (cuando es un polipéptido), o que codifica un polipéptido que es capaz de mediar los mismos efectos biológicos que un polipéptido codificado por la secuencia de referencia (cuando es un polinucleótido). Por ejemplo, una variante funcional de cualquiera de las biomiméticas de la presente descritas tendrían una homología especificada o identidad y serían capaces de modulación inmunitaria de monocitos o DC. Las variantes de secuencia funcional incluyen ambos polinucleótidos y polipéptidos. La identidad de secuencia se evalúa generalmente utilizando BLAST 2.0 (Basic Local Alignment Search Tool [Herramienta de búsqueda de alineamiento local básica]), que opera con los parámetros predeterminados: Filtro- encendido, matriz de puntaje- BLOSUM62, tamaño de palabra- 3, Valor E- 10, Costos de espacio-11,1 y alineamientos- 50. Una variante funcional puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos proporcionados en la presente.
Además de la composición de la secuencia de aminoácidos de dominios de Fc naturales, se sabe que el contenido de carbohidratos del dominio Fc cumple una función importante sobre la estructura del dominio Fc. Ver, por ejemplo, Robert L. Shields, et ál. Lack of Fucose on Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcyRIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity. J. Biol. Chem., Jul 2002; 277: 26733 -26740 (doi:10.1074/jbc.M202069200); Ann Wright y Sherie L. Morrison. Effect of C2- Associated Carbohydrate Structure on Ig Effector Function: Studies with Chimeric Mouse-Human IgG1 Antibodies in Glycosylation Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells. J. Immunol, Apr 1998; 160: 3393 - 3402. El contenido de carbohidratos se puede controlar utilizando, por ejemplo, sistemas de expresión de proteínas particulares incluido líneas celulares particulares o modificación enzimática in vitro. Por ende, los stradomers pueden comprender dominios Fc con el contenido de carbohidratos nativos de holo- anticuerpo de los cuales se obtuvieron los dominios, así como aquellos compuestos biomiméticos con un contenido de carbohidratos modificado. Los componentes de multímero del stradomer pueden caracterizarse por un patrón de glicosilación diferente en comparación con el componente de homodímero del mismo stradomer. El stradomer de unión al complemento puede comprender mutaciones que no alteran el patrón de glicosilación pero reducen o eliminan la unión al receptor de Fc canónico y/o la unión al receptor de FcRn.
Stradomers preferenciales de complemento preferidos
Los stradomers preferenciales de complemento descritos en la presente proporcionan una relación aumentada de unión al complemento respecto a la unión del receptor de Fc. Por lo tanto, los stradomers preferenciales de complemento proporcionados en la presente pueden denominarse "stradomers preferenciales de complemento" o "stradomers de unión de complemento". Los stradomers pueden ser "stradomers generalizados" que unen uno o más componentes de la cascada de complemento y también unen cada uno de los FcyRs.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 267, 268 y 324 (SEQ ID NO: 13) es denominado G997 en la presente. G997 exhibe sorprendentemente unión C1q fuerte e inhibición de CDC con unión retenida a FcyRI, receptor inhibidor FcyRII y FcRn y unión considerablemente disminuida a receptores de activación FcyRIIa y FcyRIIIa.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 267, 268, 297 y 324 (SEQ ID NO: 14 o 15) es denominado G998 en la presente. Un stradomer multimerizante que comprende la mutación Fc N297A (pero ninguna mutación en la posición 267, 268 o 324) une C1q, sin avidez y afinidad elevada, y demuestra la inhibición modesta de CDC y ninguna unión apreciable a FcyRIIa, FcyRIIb, o FcyRIIIa. Por el contrario, y de manera sorprendente, los inventores han descubierto que la introducción adicional de mutaciones Fc S267E, H268F, y/o S324T en el contexto de un stradomer en la estructura GL-2045 que comprende la mutación N297A (stradomer denominado G998) aumenta además la unión de C1q considerablemente y la inhibición de CDC. Incluso más sorprendentemente, el compuesto resultante une FcyRIIb ávidamente. G998 exhibe sorprendentemente una unión de C1q incluso más fuerte e inhibición de CDC que el stradomer original G045c, así como FcRn completamente retenido y unión de FcyRI mayormente retenida al G045c original, así como retención parcial de unión al receptor inhibidor FcyRIIb con unión considerablemente disminuida a los receptores de activación FcyRIIa y FcyRIIIa. Para subrayar la impredecibilidad de estas mutaciones, cuando se realizan las mismas series de mutaciones a un stradomer con un dominio de multimerización de N-terminal (G019) en contraste un stradomer con un dominio de multimerización de C-terminal (GL-2045), esta unión preferencial a C1q está completamente abrogada (ver el compuesto G999). Un stradomer puede comprender las siguientes mutaciones: I253A, S267E, H268F, N297a , H310A, S324T y H435A; o un stradomer que comprende las siguientes mutaciones: E233P, L234V, L235A, I253A, S267E, H268f , N297A, T299A, H310A, S324T, y H435A, y una eliminación de G236. Los stradomers resultantes pueden retener unión a C1q y la inhibición de CDC de un stradomer de acuerdo con el SEQ ID NO: 14 o 15, y demuestran menos unión a FcyRIIb y/o FcyRI relativa al stradomer de acuerdo con el SEQ ID NO: 14 o 15.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 234, 235, 267, 268, 297 y 324 (SEQ ID NO: 21 o 22) es denominado G1033 en la presente. G1033 sorprendentemente (por ejemplo, ante el N297A y las mutaciones L234A/L235A) retiene algo de unión a FcyRI y FcyRIIa además de unión fuerte a C1q e inhibición de CDC.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 233, 236, 267, 268 y 324 (SEQ ID NO: 10 o 11) es denominado G994 en la presente. G994 retiene unión resistente a FcyRI y FcRn y unión mínima a FcyRIIb sin unión considerable a receptores de activación FcyRIIa y FcyRIIIa. Estos resultados fueron particularmente sorprendentes según Shields et ál. (Shields, et ál. J. Biol. Chem., 276(9):6591 (2001)), que describe que las mutaciones en las posiciones 233 o 236 tuvieron como resultado unión abrogada a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcRn. Estos resultados destacan la imprevisibilidad de una mutación puntual dada en el contexto de un stradomer. Un stradomer multimerizante que comprende las mutaciones Fc E233P y G236R (pero sin una mutación en la posición 267, 268 o 324) une C1q, sin avidez y afinidad elevada, pero no tiene inhibición apreciable de CDC y ninguna unión apreciable a FcyRIIa, FcyRIIb o FcyRIIIa. Por el contrario, y sorprendentemente, los inventores descubrieron que la introducción adicional de las mutaciones Fc S267E, H268F y/o S324T en el contexto de un stradomer que comprende mutaciones E233P y G236R (stradomer denominado G994) aumenta además la unión a C1q e inhibe CDC mientras retiene algo de unión a FcyRIIb.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 233, 234, 235, 267, 268, 297 y 324 y G236 eliminadas (SEQ ID nO: 19) es denominado G1022 en la presente. G1022 une sorprendentemente C1q, inhibe CDC y retiene la unión fuerte a FcyRIIa y la unión modesta a FcyRIIb pero muy sorprendentemente no retiene la unión a la afinidad elevada de FcyRI.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 234, 235, 267, 268 y 324 (SEQ ID NO: 63) es denominado G1032 en la presente. G1032 une sorprendentemente C1q e inhibe CDC mientras también retiene la unión resistente a todos los receptores Fc canónicos, y la unión moderadamente resistente a FcRn.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 233, 234, 235, 267, 268 y 324 y G236 eliminadas (SEQ ID NO: 62) es denominado G1023 en la presente. G1023 une sorprendentemente C1q e inhibe CDC mientras retiene la unión resistente a todos los receptores Fc canónicos.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 265, 267, 268 y 324 (SEQ ID NO:18) es denominado G1006 en la presente. G1006 une sorprendentemente C1q e inhibe CDC mientras retiene unión resistente a FcyRI y FcRn y unión moderada a FcyRIIa a pesar de la mutación en la posición 265 que se esperaría para reducir la unión a todos los receptores Fc canónicos.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 238, 267, 268, 297 y 324 (SEQ ID NO: 20) es denominado G1027 en la presente. G1027 une sorprendentemente C1q e inhibe CDC pero no elimina la unión al receptor Fc canónico a pesar de las mutaciones en las posiciones 238 y 297, reteniendo la unión resistente a FcyRI y FcRn y la unión modesta a FcyRIIa y FcyRIIb.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 236, 267, 268 y 324 (SEQ ID NO: 12) es denominado G996 en la presente. G996 se une sorprendentemente a FcyRI, FcyRIIa y FcyRIIb además de la unión de C1q y la inhibición de CDC. También sorprendentemente, G996 no exhibió unión canónica en un ratón, lo cual lo vuelve un compuesto ideal con el cual evaluar la inhibición de CDC pura en roedores. En contraste con G996, un stradomer multimerizante que comprende la mutación Fc G236R (pero ninguna mutación en la posición 267, 268 o 324) es denominada G990 y une C1q, sin afinidad superior y avidez, pero no tiene inhibición de CDC apreciable. G990 tampoco tiene unión apreciable a FcyRIIa, FcyRIIb o FcyRIIIa. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que la introducción adicional de mutaciones de Fc S267E, H268F, y/o S324T en el contexto de G990 aumenta además la unión de C1q y la inhibición de CDC. Incluso más sorprendentemente, G996 une FcyRIIb muy ávidamente.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 233, 236, 267, 268, 324 y 328 (SEQ ID NO: 23) es denominado G1042 en la presente. G1042 sorprendentemente une de forma resistente FcyRI, FcyRIIa y FcyRIIb. Por lo tanto, la adición de la mutación en la posición 328 (comparar G1042 a G994, que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 233, 236, 267, 268 y 324) sorprendentemente tuvo como resultado la unión resistente a ambos FcyRIIa y FcyRIIb, a pesar del hecho de que se esperaba que la mutación en la posición 328 aumentara la unión a FcyRIIb solo.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales P238D, D265G, S267E, H268F, y S324T (SEQ ID NO: 24) es denominado G1043 en la presente. G1043 sorprendentemente se une de forma resistente a FcyRIIa, FcyRIIb y FcyRI, a pesar del hecho de que se esperaba que las mutaciones en las posiciones 238 y 265 redujeran a FcyRIIa y FcyRI.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales P238D, D265W, S267E, H268F, y S324T (SEQ ID NO: 25) es denominado G1046 en la presente. G1046 sorprendentemente se une de forma resistente a FcyRI y también aumenta la unión a FcyRIIa. Este resultado fue sorprendente porque se esperaba que la mutación en la posición 238 aumentara la unión a FcyRIIb, en vez de la unión a FcyRIIa.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 233, 234, 235, 267, 268, 297, 324 y 328 y una eliminación del aminoácido en la posición 236, (SEQ ID NO: 26) es denominado G1050 en la presente. G1050 se une de forma resistente a FcyRIIa y FcyRIIb. De manera sorprendente, la unión a FcyRII de baja afinidad se retuvo mientras la unión a FcyRI de alta afinidad se perdió.
Un stradomer en el fondo G045c que tiene mutaciones puntuales P238D, S267E, H268F, y S324T (SEQ ID NO: 27) es denominado G1025 en la presente. G1025 sorprendentemente une de forma resistente FcyRI, FcyRIIa y FcyRIIb. Este resultado fue sorprendente porque se esperaba que la mutación en la posición 238 disminuyera la unión a FcyRI, FcyRIIa y FcyRIIIa, pero solo la unión a FcyRIIIa disminuyó. Incluso más sorprendentemente, cuando el mismo conjunto de mutaciones se hace en un stradomer con un dominio de multimerización unido a N (G1024) en oposición al stradomer GL-2045 unido en el C-terminal, esta unión preferencial de complemento se anula completamente. Esto, una vez más, hace hincapié en la naturaleza impredecible de esta mutación en el contexto de un stradomer multimerizante. Los stradomers pueden tener la estructura de G019 (bisagra de IgG2 - bisagra de IgG1 - CH2 de IgG1, CH3 de IgG1, de amino-terminal a carboxi) y comprender una o más mutaciones puntuales en el dominio Fc. El stradomer resultante que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 267, 268 y 324 (SEQ ID NO: 17) es denominado G1003 en la presente. G1003 sorprendentemente exhibió la unión a C1q e inhibición resistente a C1q de CDC a pesar del hecho de que el stradomer original exhibe unión a C1q mínima y no exhibe inhibición a CDC, a pesar de que el compuesto G019 original forma multímeros de mayor orden capaces de interacción basada en avidez con receptores.
Un stradomer en el fondo G019 que tiene mutaciones puntuales en las posiciones 267, 268, 324 y 328 (SEQ ID NO: 64) es denominado G1049 en la presente. G1049 exhibe sorprendentemente unión resistente a todos los FcyR canónicos junto con inhibición al complemento y actividad de unión a C1q.
En un hallazgo sorprendente, los inventores actuales han descubierto que cuando determinadas mutaciones de Fc que se describen como afinidad de complemento en aumento respecto a un anticuerpo monoclonal se agregan a la región Fc de un stradomer multimerizante que no tiene unión apreciable a FcyRIIb, el compuesto resultante retoma la unión a FcyRIIb. Por ejemplo, G994, G996 y G998 cada uno une FcyRIIb, a veces de forma ávida, a pesar del hecho que los stradomers correspondientes que tienen la misma mutación excepto por una falta de las mutaciones S267E, H268F, y S324T no exhibieron unión ávida a FcyRIlb.
Se generaron stradomers adicionales basándose en stradomers preferenciales de complemento G994 y G998. En un primer conjunto de stradomers derivados de G994, las mutaciones de G994 E233P, H268F y S324T se retuvieron, la posición 267 era de tipo salvaje (serina), y varias mutaciones se realizaron en la posición 236: ya sea arginina (como en G994), o un aminoácido similar a la arginina. Estos stradomers fueron denominados G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105 y G1106. El alcance al que estos stradomers se unen a FcyRs y a C1q de complemento variaron drásticamente y de forma impredecible, lo que indica que una mutación en la posición 236 en el contexto del stradomer G994 tiene efectos impredecibles. En un segundo conjunto de stradomers derivados de G994, las mutaciones de G994 E233P, H268F y S324T se retuvieron, la posición 236 era de tipo salvaje (glicina), y varias mutaciones se realizaron en la posición 267: ya sea ácido glutámico (como en G994), o un aminoácido similar al ácido glutámico. Estos stradomers se denominaron G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109 y G1084. Una vez más, el alcance al que los stradomers se unen a FcyRs y a C1q de complemento variaron drásticamente y de forma impredecible, lo que indica que como la posición 236, una mutación en la posición 267 en el contexto del stradomer G994 tiene efectos impredecibles. En el próximo conjunto de stradomers a base de G994, las combinaciones de mutaciones en las posiciones 236 y 267 se evaluaron y se denominaron G1110, G1111, G1112, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130 y G1131. Los perfiles de unión al complemento y FcyR de estos stradomers también eran impredecibles.
Los derivados de G998 también fueron preparados y evaluados. En un primer conjunto de derivado de G998, las mutaciones de G998 H268F y S324T se retuvieron, la posición 267 era o de tipo salvaje (serina) o mutaba a un aminoácido similar a la serina, y se agregó una mutación en la posición 299 (T299A). Estos compuestos se denominaron G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1107, G1093 y G1095. La mutación T299A se diseñó para destruir el sitio de deglicosilación. El alcance al que esta mutación redujo la unión a FcyR fue impredecible en el contexto de la estructura del stradomer y las otras mutaciones. Además, se generaron los derivados de G998 con las mutaciones H268F, S324T, y N297A (para la aglicosilación) de G998, pero diferentes mutaciones en la posición 267. Estos compuestos se denominaron G1069, G1070, G1132, G1074 y G1075, y también exhibieron FcyR impredecible y perfiles de unión al complemento. Notablemente, solo uno de los compuestos en este grupo (G1019) retuvo la unión al complemento mientras se eliminó la unión a FcyR. Este compuesto fue por lo tanto un stradomer preferencial de complemento.
En algunas modalidades, G994, G998, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 u otro stradomer multimerizante preferencial de complemento puede administrarse a un sujeto que tiene una afección grave, tal como, por ejemplo, hemolisis aguda (por ejemplo, en enfermedad hemolítica de los recién nacidos), anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica inducida por fármacos, anemias hemolíticas adquiridas, reacciones por transfusiones / anemia hemolítica aloinmunitaria, anemias hemolíticas infecciosas (por ejemplo, aquellas asociadas a enfermedades transmitidas por garrapatas que incluyen enfermedades bacterianas (enfermedad de Lyme, Tifus, fiebre de las montañas rocosas, Tularemia, Erliquiosis), virales (fiebres meningoencefalitis y hemorrágicas), y enfermedades transmitidas por garrapatas por protozoos (Babesiosis) ; o aquellas asociadas a enfermedades transmitidas por mosquitos tales como malaria que incluye fiebre de aguas negras, fiebre por Dengue, Chikungunya, Zika, o el virus del Ébola), anemias hemolíticas asociadas a toxinas (por ejemplo, de veneno de víbora, químicos tóxicos o toxinas de garrapatas), hipertensión maligna, quemaduras o síndrome de Reye. Los stradomer multimerizantes preferenciales de complemento G998, G994, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 pueden administrarse a un sujeto que lo necesita mediante administración por vía intravenosa.
Los stradomer multimerizantes preferenciales de complemento G998, G994, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 pueden administrarse a un sujeto que tiene una afección o enfermedad crónica. Las afecciones y enfermedades crónicas incluyen, por ejemplo, afecciones renales, degeneración macular, hemolisis crónica (por ejemplo, hemoglobinuria paroxística nocturna), hemolisis mecánica (por ejemplo, de una válvula de corazón artificial, máquina de derivación cardiopulmonar u otro dispositivo utilizado en los vasos sanguíneos, hemodiálisis con o sin membranas de celofán, preeclampsia o eclampsia, o púrpura trombocitopénica trombótica), esferocitosis hereditaria, ovalocitosis, deficiencia de piruvato cinasa, deficiencia de G6PD, anemia de células falciformes, talasemias, anemias hemolíticas heredadas, síndrome urémico hemolítico, trastornos de complejo inmunitario con consumo de complemento (por ejemplo, hepatitis B, hepatitis C, crioglobulinemia mezclada, lepra lepromatosa, y shock bacterémico), cirrosis biliar principal, enfermedad celíaca, mieloma múltiple y vasculitis urticaria. G994 puede administrarse a un sujeto que lo necesita mediante administración por vía subcutánea.
Los stradomer multimerizantes preferenciales de complemento G998, G994, G1033, G1022, G1032, G1023, G1006, G1027, G996 pueden administrarse a un sujeto que tiene una afección renal. Las afecciones renales incluyen, de modo no taxativo, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis mesangioproliferativa, glomerulonefritis proliferativa idiopática, glomerulonefritis esclerosante focal, glomerulonefritis segmental focal, enfermedad de membrana basal delgada, nefritis lúpica, glomerulonefritis fibrilar, glomerulonefritis inmunotactoide, enfermedad de Bright, enfermedad de Berger/nefropatía de IgA, nefroesclerosis, nefrosis, síndrome nefrótico, nefropatía membranosa, nefritis membranosa, glomerulonefritis postinfecciosa, necrosis tubular, nefrotoxicidad inducida por fármacos, y síndrome de Goodpasture.
Por lo tanto, los presentes inventores han descubierto que se pueden generar stradomers individuales que exhiben actividad preferencial al exhibir unión a C1q resistente y unión reducida a FcyRs respecto a un stradomer original que tiene una secuencia de dominio Fc natural, pero que la actividad que cada stradomer individual tiene con respecto a la unión a C1q y a la unión de FcyR es totalmente impredecible basándose en el efecto que la mutación tendría en un anticuerpo monoclonal.
Las secuencias de aminoácidos de stradomers de ejemplo abarcados por la presente descripción se proporcionan en la Tabla 1. Los aminoácidos mutados están indicados en la Tabla (texto resaltado en gris).
T l 1. r m r ni n l m l m n m l
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Tabla 2: Stradomers enerales
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Las proteínas de unión al complemento tales como el anticuerpo monoclonal eculizumab (anticuerpo anti-C5) han sido utilizadas en la técnica en intentos para bloquear la vía del complemento como un tratamiento para enfermedades mediadas por complemento. Los biomiméticos de la presente invención logran unión aumentada a componentes del complemento, por ejemplo, C1q, a través de mutaciones de dominio Fc particulares. Los biomiméticos de la presente invención comprenden una mutación puntual en la posición 267 y/o 268 y/o 324 del dominio Fc de IgG1. La biomimética de unión al complemento de la presente invención exhibe además unión alterada a FcRn, FcyRI, FcyRII, y/o FcyRIII en comparación con los dominios Fc de IgG1 de tipo salvaje, generalmente en maneras que no hubiesen sido previstas por la literatura que describe las mutaciones comprendidas en los biomiméticos de la actual invención. Los stradomers preferenciales de complemento que son capaces de multimerización pueden exhibir una relación aumentada de unión al complemento a uno o más FcyRs canónicos y/o unión de FcRn en comparación con una inmunoglobulina no agregada normal. Los stradomers preferenciales de complemento que son capaces de multimerización pueden exhibir una relación aumentada de unión al complemento a uno o más FcyRs canónicos y/o unión de FcRn en comparación con una inmunoglobulina agregada normal. Los stradomers preferenciales de complemento que son capaces de multimerización pueden exhibir una relación aumentada de unión al complemento a uno o más FcyRs canónicos y/o unión de FcRn en comparación con un anticuerpo monoclonal que comprende las mismas mutaciones dentro de su dominio Fc. Los biomiméticos pueden tener una semivida alterada respecto a IgG natural, IVIG o un stradomer original.
Los términos "FcyR" y "receptor de Fcy" tal como se usa en la presente abarca todos los miembros de las familias RI, RII y RIII gamma de Fc. El receptor Fcy incluye receptores Fcy de baja afinidad y alta afinidad, que incluyen, de modo no taxativo en humanos, a FcyRI (CD64); FcyRII (CD32) y sus isotipos y los alotipos FcyRIIa LR, FcyRIIa HR, FcyRIIb y FcyRIIc; FcyRIII (CD 16) y sus isotipos FcyRIIIa y FcyRIIIb. Un experto en la técnica reconocerá que la descripción proporcionada en la presente respecto a homólogos FcyR y FcyR tal como aquellos descritos en Davis, et ál. (2004) "Differential B cell expression of mouse Fc receptor homologs," Int. Immunol., 16(9):1343-1353, aplicarán a futuros FcyRs e isotipos y alotipos asociados que puede que aún no hayan sido descubiertos.
La unión específica es definida generalmente como la cantidad de ligando etiquetado que se puede desplazar mediante un exceso posterior de ligando no etiquetado en un ensayo de unión. Sin embargo, esto no excluye otros medios de evaluación de unión específica que están bien establecidos en la técnica (por ejemplo, Mendel CM, Mendel DB, 'Non-specific' binding. The problem, and a solution. Biochem J. 1985 May 15;228(l):269- 72). La unión específica se puede medir en varias maneras conocidas en la técnica tal como tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) (comercialmente disponible a través de BIACORE®) o interferometría de biocapa (comercialmente disponible a través de ForteBio®) para caracterizar ambas constantes de asociación y disociación de los biomiméticos inmunológicamente activos (Asian K, Lakowicz JR, Geddes C. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. Current Opinion in Chemical Biology 2005, 9:538- 544).
"Actividad inmunológica de IgG natural agregada” se refiere a las propiedades de IgG multimerizada que impacta el funcionamiento de un sistema inmunitario al exponer el sistema inmunitario a los agregados de IgG. Propiedades específicas de IgG multimerizada natural incluyen unión específica alterada a FcyRs, reticulación de FcyRs en las superficies de las células inmunitarias, o una funcionalidad efectora de IgG multimerizada tal como citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), fagocitosis (ADCP, por sus siglas en inglés), o fijación de complemento (Ver, por ejemplo Nimmerjahn F, Ravetch JV. The anti- inflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 2007; 204:11-15; Augener W, Friedman B, Brittinger G. Are aggregates of IgG the effective part of high-dose immunoglobulin therapy in adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) Blut.
1985;50:249-252; Arase N, Arase H, Park SY, Ohno H, Ra C, Saito T. Association with FcRgamma is essential for activation signal through NKR-Pl (CD161) in natural killer (NK) cells and NKl.1+ T cells. J Exp Med. 1997;186:1957-1963; Teeling JL, Jansen- Hendriks T, Kuijpers TW, et ál. Therapeutic efficacy of intravenous immunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies in experimental immune thrombocytopenia. Blood.
2001,"98: 10951099; Anderson CF, Mosser DM. Cutting edge: biasing immune responses by directing antigen to macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 2002; 168:3697-3701; Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG-Fc for FcyR: current models. Immunology Letters. 2002;82:57; Banki Z, Kacani L, Mullauer B, et ál. Cross-Linking of CD32 Induces Maturation of Human Monocyte - Derived Dendritic Cells Via NF- {kappa} B Signaling Pathway. J Immunol. 2003;170:3963-3970; Siragam V, Brine D, Crow AR, Song S, Freedman J, Lazarus AH. Can antibodies with specificity for soluble antigens mimic the therapeutic effects of intravenous IgG in the treatment of autoimmune disease? J Clin Invest. 2005; 11 15:155- 160). Estas propiedades son generalmente evaluadas por comparación con las propiedades de IgG homodimérica.
Mientras que se ha descubierto que multímeros de orden más alto son eficaces para alterar la respuesta inmunitaria, tal como se describe en la presente, los homodímeros también fueron moduladores inmunitarios eficaces. Sin limitarse a la teoría, se cree que los homodímeros modulan la unión ávida de los multímeros de mayor orden en el tiempo y pueden ser capaces de formar multímeros de mayor orden in vivo. Sin limitarse a la teoría, se cree que los multímeros de la presente invención se disocian lentamente del objetivo unido y se internalizan en células inmunitarias que expresan aquellos objetivos, alternado posiblemente el estado de activación o velocidad de maduración de esa célula inmunitaria durante un período prolongado o posiblemente por siempre. Los experimentos de multimerización descritos en la presente muestran que una población de homodímeros que de otro modo sería pura es capaz de multimerizarse en presencia de niveles bajos de sangre o suero fetal bovino. Por lo tanto, mientras que multímeros de mayor orden son más eficaces que la fracción de homodímero para modular la respuesta inmunitaria, la fracción de homodímero de los stradomers unidos de forma natural de la actual invención también pueden ser moduladores inmunitarios eficaces, en parte a través de multimerización del homodímero en la presencia de niveles bajos de sangre o suero. Por lo tanto, "multímeros de mayor orden" significa multímeros más allá del homodímero que se forman en solución antes de la inyección en un sujeto así como multímeros más allá del homodímero que se forman in vivo.
"Actividades moduladoras inmunitarias", "respuesta inmunitaria moduladora", "que modula el sistema inmunitario" y "modulación inmunitaria" significan la modificación de los sistemas inmunitarios mediante el cambio de las actividades, capacidades y cantidades relativas de una o más células inmunes, incluida la maduración de un tipo de célula dentro de su tipo de célula o en otros tipos de células. Por ejemplo, la modulación inmunitaria puede ser una supresión o una activación de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la modulación inmunitaria puede significar la inducción de falta de respuesta o tolerancia en un linfocito T o un linfocito B. El término "tolerancia", tal como se usa en la presente, se refiere a un estado en un linfocito T o un linfocito B, o en la respuesta inmunitaria como un total, donde el linfocito T o linfocito B u otra célula inmunitaria no responde a su antígeno cognado o a un antígeno, epítopo u otra señal a la que normalmente respondería. Como otro ejemplo, la modulación inmunitaria de los linfocitos B de la memoria puede producir apoptosis selectiva de determinados linfocitos B de memoria con disminuciones concomitantes de la producción de anticuerpos específicos. Como otro ejemplo, las actividades de modulación inmunitaria pueden producir disminuciones de las citocinas proinflamatorias o de las citocinas que se elevan comúnmente en las enfermedades autoinmunitarias como IL-6 e IL-8. Como otro ejemplo, las actividades de modulación inmunitaria pueden producir la activación de las células NKT con posterior secreción y escisión de TGF-beta. El bloqueo de los receptores de células inmunes para evitar la activación del receptor también está comprendido dentro de la "modulación inmunitaria” y también se puede denominar, separadamente, como "modulación inmunitaria inhibidora". La modulación inmunitaria puede ser una mejora o una activación de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la modulación inmunitaria puede significar la activación de los linfocitos T o los linfocitos B. A modo de otro ejemplo, la modulación inmunitaria de los monocitos inmaduros puede producir mayores poblaciones de monocitos más maduros, células dendríticas, macrófagos u osteoclastos, los cuales se derivan de los monocitos inmaduros. Como otro ejemplo, la modulación inmunitaria de las células NK puede llevar a una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada. Como otro ejemplo, las actividades de modulación inmunitaria pueden llevar a poblaciones de células aumentadas con fenotipos que de otro modo no se expresarían en niveles altos, como células CD8P+/CD11c+ Por ejemplo, los receptores de células inmunes se pueden unir a los biomiméticos inmunológicamente activos y activar la señalización intracelular para inducir diversos cambios de las células inmunes, denominados, separadamente, como "modulación inmunitaria activadora".
La modulación de las células dendríticas puede promover o inhibir la presentación de antígenos a linfocitos T, por ejemplo, mediante la inducción de expresión de CD86 y/o CD1a en la superficie de células dendríticas. CD1a es una glicoproteína relacionada con la MHC de clase I que se expresa en la superficie de células que presentan antígenos, particularmente las células dendríticas. La CD1a está implicada en la presentación de antígenos lipídicos a linfocitos T. CD86 también se expresa en la superficie de células que presentan antígenos y proporciona coestimulación a los linfocitos T. CD86 es un ligando a ambas CD28 y CTLA-4 en la superficie de los linfocitos T para enviar señales inhibidoras y de activación, respectivamente. Por lo tanto, el nivel de expresión de CD86 y sus receptores cognados, determina si la tolerancia o una respuesta inmunitaria específica será inducida. Los stradomers pueden ser capaces de modular la respuesta inmunitaria, en parte al inducir la expresión de Cd86 y CD1 en la superficie de las células que presentan antígenos, particularmente células dendríticas. La célula dendrítica modulada puede interactuar con células inmunitarias específicas para el antígeno del stradomer específico del antígeno.
La modulación de la maduración de un monocito se refiere a la diferenciación de un monocito en un DC maduro, un macrófago o un osteoclasto. La diferenciación se puede modular para acelerar la velocidad o dirección de la maduración y/o para aumentar la cantidad de monocitos que son sometidos a la diferenciación. De manera alternativa, la diferenciación se puede reducir en términos de velocidad de diferenciación y/o cantidad de células que son sometidas a la diferenciación.
El término polipéptido o péptido "aislado", según se emplea en la presente, se refiere a un polipéptido o a un péptido que, o bien no tiene una contraparte de origen natural o que se ha separado o purificado de los componentes que lo acompañan naturalmente, por ejemplo, en tejidos como el páncreas, hígado, bazo, ovarios, testículos, músculos, tejido de las articulaciones, tejido neuronal, tejido gastrointestinal o tejido mamario o tejido tumoral (por ejemplo, tejido de cáncer de mama) o fluidos corporales como sangre, suero u orina. Normalmente, el polipéptido o péptido se considera "aislado" cuanto está al menos el 70 % libre, en peso seco, de las proteínas y otras moléculas orgánicas de origen natural con las cuales se asocia naturalmente. Preferentemente, una preparación de un polipéptido (o péptido) es al menos el 80 %, más preferentemente, al menos el 90 % y, más preferentemente, al menos el 99 %, en peso seco, el polipéptido (péptido), respectivamente. Como un polipéptido o péptido que se sintetiza químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que naturalmente lo acompañan, el polipéptido o péptido sintético está "aislado".
Un polipéptido (o péptido) aislado se puede obtener, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural (por ejemplo, de tejidos o fluidos corporales); mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido o péptido; o mediante síntesis química. Un polipéptido o péptido que se produce en un sistema celular diferente de la fuente de la cual se origina naturalmente está "aislado" porque necesariamente carecerá de los componentes que lo acompañan naturalmente. Un polipéptido aislado puede contener solo las secuencias correspondientes al monómero de Fc de IgG1 y el dominio de multimerización bisagra IgG2 (SEQ ID NO: 4), el dominio de multimerización de isoleucina (SEQ ID NO: 5), o el dominio de multimerización de GPP (SEQ ID NO: 6) y ninguna secuencia adicional que pueda ayudar con la clonación o purificación de la proteína (es decir, sitios de reconocimiento de enzima de restricción introducida o etiquetas de purificación). El grado de aislamiento o pureza se puede medir a través de cualquier método adecuado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis HPLC.
Composiciones farmacéuticas
La administración de las composiciones de stradomer descritas en la presente se realizará a través de cualquier vía común, por vía oral, parenteral o tópica. Las vías a modo de ejemplo incluyen, entre otras, oral, nasal, bucal, rectal, vaginal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intratumoral, espinal, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoidea, sublingual, mucosa oral, bronquial, linfática, intrauterina, subcutánea, intratumoral, integrada en un dispositivo implantable como una sutura o en un dispositivo implantable como un polímero implantable, intradural, intracortical o dérmica. Las composiciones se administrarán normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables, tal como se describe en la presente. En una opción preferida, el stradomer aislado se administra por vía intravenosa o subcutánea.
El término "portador farmacéuticamente aceptable", según se emplea en la presente, incluye cualesquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retardan la absorción y similares. El uso de los medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células, su uso en composiciones terapéuticas se considera. También se pueden incorporar ingrediente activos complementarios en las composiciones.
Las composiciones de stradomer se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de las bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el stradomer en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los ingredientes adicionales enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización filtrada. Las soluciones inyectables estériles pueden estar formuladas para la administración intramuscular, subcutánea o intravenosa. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada en condiciones estériles de esta.
Además, una composición de stradomer puede ser adecuada para la administración oral y puede proporcionarse en un portador farmacéuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El portador debe ser asimilable o comestible e incluye portadores líquidos, semisólidos, es decir, pastas o sólidos. Salvo que algún medio, agente, diluyente o portador convencional sea perjudicial para el receptor o para la eficacia terapéutica de una preparación de stradomer contenida allí, su uso en una composición de stradomer administrable por vía oral es adecuado. Algunos ejemplos de portadores o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, lípidos, liposomas, resinas, aglutinantes, rellenos y similares, o combinaciones de estos. El término "administración oral", según se emplea en la presente, incluye la administración oral, bucal, enteral o intragástrica.
La composición de stradomer puede combinarse con el portador de cualquier manera conveniente y práctica, es decir, mediante solución, suspensión, emulsificación, mezcla, encapsulamiento, microencapsulamiento, absorción y similares. Estos procedimientos son de rutina para los entendidos en la técnica.
La composición de stradomer en forma de polvo puede combinarse o mezclarse bien con un portador semisólido o sólido. La mezcla se puede realizar de cualquier manera adecuada, como la molienda. También se pueden añadir agentes estabilizadores en el proceso de mezcla para proteger la composición de la pérdida de la actividad terapéutica, es decir, la desnaturalización en el estómago. Algunos ejemplos de estabilizadores para utilizar en una composición administrable por vía oral incluyen amortiguadores, antagonistas de la secreción de ácidos estomacales, aminoácidos como glicina y lisina, carbohidratos como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc., inhibidores de la enzima proteolítica y similares. Más preferentemente, para una composición administrada por vía oral, el estabilizador también puede incluir antagonistas de la secreción de ácidos estomacales. Además, la composición de stradomer para administración oral que se combina con un portador semisólido o sólido se puede formular, adicionalmente, en cápsulas de gelatina duras o blandas, comprimidos o píldoras. Más preferentemente, las cápsulas de gelatina, los comprimidos o las píldoras tienen recubrimiento entérico. Los recubrimientos entéricos impiden la desnaturalización de la composición en el estómago o en el intestino superior cuando el pH es ácido. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.629.001. Al llegar al intestino delgado, el pH básico disuelve el recubrimiento y permite que la composición se libere para interactuar con las células intestinales, por ejemplo, células M de parche de Peyer.
La composición de stradomer en forma de polvo puede combinarse o mezclarse bien con materiales que crean una nanopartícula que encapsulan el biomimético inmunológicamente activo o a los cuales el biomimético inmunológicamente activo está unido. Cada nanopartícula tendrá un tamaño igual o inferior a 100 micrones. La nanopartícula puede tener propiedades mucoadhesivas que permiten la absorción gastrointestinal de un biomimético inmunológicamente activo que de otro modo no estaría biodisponible en forma oral.
Puede combinarse una composición en polvo con un portador líquido como, por ejemplo, agua o una solución salina, con o sin un agente estabilizador.
Una formulación de stradomer especifica que se puede utilizar es una solución de proteína biomimética inmunológicamente activa en un amortiguador basado en fosfato hipotónico que carece de potasio en donde la composición del amortiguador es la siguiente: 6 mM de fosfato de sodio monobásico monohidrato, 9 mM de fosfato de sodio dibásico heptahidrato, 50 mM de cloruro de sodio, pH 7,0 /- 0,1. La concentración de proteína biomimética inmunológicamente activa en un amortiguador hipotónico puede oscilar entre 10 microgramos/ml y 100 miligramos/ml. Esta formulación se puede administrar a través de cualquier vía de administración, por ejemplo, de modo no taxativo, administración intravenosa.
Además, una composición de stradomer para administración tópica que se combina con un portador semisólido se puede formular adicionalmente en una crema o ungüento en gel. Un portador preferido para la formación de un ungüento en gel es un polímero en gel. Los polímeros preferidos que se utilizan para fabricar una composición de gel de la presente invención incluyen, entre otros, carbopol, carboximetilcelulosa y polímeros plurónicos. Específicamente, se combina una composición de multímero de Fc en polvo con un gel acuoso que contiene un agente de polimerización como Carbopol 980 en concentraciones de entre 0,5 % y 5 % p/volumen para la aplicación a la piel para el tratamiento de enfermedades en la piel o debajo de esta. El término "administración tópica”, según se emplea en la presente, incluye la aplicación a una superficie dérmica, epidérmica, subcutánea o de la mucosa.
Además, una composición de stradomer se puede formular en un polímero para implante subcutáneo o subdérmico. Una formulación preferida para el polímero impregnado en fármaco implantable es un agente generalmente visto como seguro y puede incluir, por ejemplo, dextrano reticulado (Samantha Hart, Master of Science Thesis, "Elution of Antibiotics from a Novel Cross-Linked Dextran Gel: Quantification" Virginia Polytechnic Institute and State University, 8 de junio de 2009) dextrano- tiramina (Jin, et ál. (2010) Tissue Eng. Part A. 16(8):2429- 40), dextrano-polietilenglicol (Jukes, et ál. (2010) Tissue Eng. Part A. 16(2):565-73), o dextrano-gluteraldehido (Brondsted, et ál. (1998) J. Controlled Release, 53:7-13). Los entendidos en la técnica sabrán que se pueden formar muchos polímeros e hidrogeles similares mediante la incorporación del stradomer fijado dentro del polímero o el hidrogel y el control del tamaño del poro hasta el diámetro deseado.
Tras la formulación, las soluciones se administran de un modo compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que resulte terapéuticamente eficaz para producir una mejora o alivio de los síntomas. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación como soluciones ingeribles, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Se puede producir algo de variación en la dosificación según la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración puede, en cualquier caso, determinar la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para la administración a seres humanos, las preparaciones cumplirán con los estándares de esterilidad, seguridad y pureza general, como lo requieren los estándares del Centro para la Evaluación e Investigación Biológica de la FDA.
La vía de administración variará, naturalmente, según la ubicación y la naturaleza de la enfermedad que se esté tratando, y puede incluir, por ejemplo, administración intradérmica, transdérmica, subdérmica, parenteral, nasal, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, perfusión, lavado, inyección directa y oral.
El stradomer puede administrarse de forma intravenosa, subcutánea, oral, intraperitoneal, sublingual, bucal, transdérmica, rectal, mediante implante subdérmico o intramuscular. El stradomer puede administrarse de forma intravenosa, subcutánea o intramuscular. El stradomer puede administrarse a una dosis de alrededor de 0,01 mg/Kg a alrededor de 1000 mg/Kg. El stradomer puede administrarse a alrededor de 0,1 mg/Kg a alrededor de 100 mg/Kg. El stradomer puede administrarse a alrededor de 0,5 mg/Kg a alrededor de 50 mg/Kg. El stradomer puede administrarse a alrededor de 1 mg/Kg a alrededor de 25 mg/Kg. El stradomer puede administrarse a alrededor de 5 mg/Kg a alrededor de 15 mg/Kg. El stradomer se puede administrar al menos una vez al día, una vez por semana, cada dos semanas o una vez al mes. Se puede utilizar un régimen de dosificación bifásica en donde la primera fase de dosificación comprende entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 300 % de la segunda fase de dosificación.
El stradomer puede administrarse antes, durante o después de la administración de uno o más agentes farmacéuticos y/o terapéuticos adicionales. El agente farmacéuticamente activo adicional puede comprender un esteroide; un fármaco anti-autoinmune biológico como un anticuerpo monoclonal, una proteína de fusión o una anti- citocina; un fármaco anti-autoinmune no biológico; un inmunosupresor; un antibiótico; y una agente anti-viral; una citocina; o un agente de otro modo capaz de actuar como un modulador inmunitario. El esteroide puede ser prednisona, prednisolona, cortisona, dexametasona, mometasona testosterona, estrógeno, oxandrolona, fluticasona, budesónida, beclametasona, albuterol o levalbuterol. El anticuerpo monoclonal puede ser eculizumab, infliximab, adalimumab, rituximab, tocilizumab, golimumab, ofatumumab, LY2127399, belimumab, veltuzumab, mepolizumab, necitumumab, nivolumab, dinutuximab, secukinumab, evolocumab, blinatumomab, pembrolizumab, ramucirumab, vedolizumab, siltuximab, obinutuzumab, adotrastuzumab, raxibacumab, pertuzumab, brentuximab, ipilumumab, denosumab, canakinumab, ustekinumab, catumaxomab, ranibizumab, panitumumab, natalizumab, bevacizumab, cetuximab, efalizumab, omalizumab, toitumomab- I131, alemtuzumab, gemtuzumab, trastuzumab, palivizumab, basilixumab, daclizumab, abciximab, murononomab o certolizumab. La proteína de fusión puede ser etanercept o abatacept. El biológico anti-citocina puede ser anakinra. El fármaco no biológico antirreumático puede ser ciclofosfamida, metotrexato, azatioprina, hidroxicloroquina, leflunomida, minociclina, compuestos de oro orgánico, fostamatinib, tofacitinib, etoricoxib o sulfasalazina. El inmunosupresor puede ser la ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, micofenolato mofetil, everolimus, OKT3, antitimocito globulina, basiliximab, daclizumumab o alemtuzumab. El stradomer puede administrarse antes, durante o después de la administración de un agente quimioterapéutico. El stradomer y el agente terapéutico adicional pueden presentar sinergia terapéutica cuando se administran juntos. El stradomer puede administrarse antes de la administración del agente terapéutico adicional. El stradomer puede administrarse al mismo tiempo que la administración del agente terapéutico adicional. El stradomer puede administrarse después de la administración del agente terapéutico adicional.
El stradomer puede administrarse fijo de forma covalente a un dispositivo implantable. El stradomer puede estar fijo a una sutura. El stradomer puede estar fijo a un injerto o stent. El stradomer puede fijarse a una válvula de corazón, un reemplazo de articulación ortopédica, o conector electrónico implantado. El stradomer puede estar fijo e incrustado dentro de una matriz implantable. El stradomer puede estar fijo e incrustado dentro de un hidrogel implantable. El hidrogel puede comprender dextrano, alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio o polímeros de acrilato. El stradomer puede administrarse fijo en un hidrogel con tamaños de poro lo suficientemente grandes para permitir la entrada de células inmunitarias para que interactúen con el stradomer fijo y luego regresen a circulación. El tamaño del poro del hidrogel puede ser 5 a 50 micrones, preferentemente 25 - 30 micrones.
El stradomer puede administrarse para tratar seres humanos, primates no humanos ( por ejemplo, monos, babuinos y chimpancés), ratones, ratas, bovinos, caballos, gatos, perros, cerdos, conejos, cabras, ciervos, ovejas, hurones, jerbos, conejillos de indias, hámsters, murciélagos, aves (por ejemplo, pollos, pavos y patos), peces y reptiles con moléculas de stradobodies quiméricas o específicas de la especie. El ser humano puede ser un adulto o un niño. El stradomer puede administrarse para prevenir una enfermedad mediada por complemento. El stradomer puede administrarse para prevenir afecciones autoinmunitarias asociadas a vacunas en animales de compañía y en el ganado.
El término "administración parenteral", según se emplea en la presente, incluye cualquier forma de administración en la cual el compuesto sea absorbido por el sujeto, excepto la absorción a través de los intestinos. Algunas vías de administración parenteral a modo de ejemplo incluyen, entre otras, la administración intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intraocular, nasal o intraarticular.
Además, el stradomer se puede administrar, opcionalmente, antes, durante o después de otro agente farmacéutico. Por ejemplo, se ha descubierto de manera sorprendente que la administración concomitante de stradomer y prednisolona logra resultados sinérgicamente superiores que aquel observado con la composición de stradomer o la prednisolona sola (WO 2012/016073).
A continuación se presentan ejemplos específicos de diversas categorías de formulaciones farmacéuticas y las vías de administración preferidas, según se indican, para algunas enfermedades a modo de ejemplo específicas:
Comprimido soluble sublingual o bucal: angina, poliarteritis nodosa.
Intravenosa, intramuscular, o subcutánea: miastenia gravis, síndrome urémico hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH, por sus siglas en inglés), nefropatía membranosa, neuromielitis óptica, rechazo mediado por anticuerpos de aloinjertos, glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN, por sus siglas en inglés) , nefritis lúpica, púrpura trombocitopénica idiopática, miositis con cuerpos de inclusión, polineuropatía desmielinizante de IgM paraproteinémica, fascitis necrotizante, pénfigo, gangrena, dermatomiositis, granuloma, linfoma, sepsis, anemia aplástica, falla orgánica multisistémica, mieloma múltiple y gammapatía monoclonal de significado incierto, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, miopatías inflamatorias, púrpura trombocitopénica trombótica, miositis, anemia, neoplasia, anemia hemolítica, encefalitis, mielitis, mielopatía especialmente asociada a virus 1 linfotrópico de linfocitos T humanos, leucemia, esclerosis múltiple y neuritis óptica, asma, necrólisis epidérmica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatía, uveítis, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome del hombre rígido, degeneración cerebelosa paraneoplásica con anticuerpos anti- Yo, encefalomielitis paraneoplásica y neuropatía sensorial con anticuerpos anti-Hu, vasculitis sistémica, lupus eritematoso sistémico, neuropatía diabética autoinmune, neuropatía disautonómica idiopática aguda, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, neuropatía motora multifocal, síndrome de la neurona motora inferior asociado a anti-/GMl, desmielinización, glomerulonefritis membranoproliferativa, miocardiopatía, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoidea y síndrome de Evan IM - ITP, CIDP, MS, dermatomiositis, miastenia gravis, distrofia muscular. El término "administración intravenosa”, según se emplea en la presente, incluye todas las técnicas para suministrar un compuesto o composición a la circulación sistémica a través de una inyección o infusión intravenosa.
Gel, loción, crema o parche dérmico: vitíligo, herpes zoster, acné, quelitis.
Supositorio, gel o infusión rectal: colitis ulcerativa, inflamación hemorroidal.
Oral como píldora, pastilla, encapsulada o con recubrimiento entérico: enfermedad de Crohn, esprúe celíaco, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del hígado, esófago de Barrett.
Intracortical: epilepsia, Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington.
Infusión o implante intraabdominal: endometriosis.
Gel o supositorio intravaginal: vaginitis bacteriana, tricomonal o fúngica.
Dispositivos médicos: recubiertos sobre un stent de arteria coronaria, articulaciones prostéticas.
Aplicaciones terapéuticas de stradomers preferenciales de complemento
Basándose en el diseño racional y en las validaciones in vitro e in vivo, los stradomers de la presente invención actuarán como biofarmacéuticos importantes para el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios, particularmente enfermedades y trastornos mediados por complemento; así como para alterar la función inmunitaria en otros varios contextos como la bioinmunoterapia para las alergias, cáncer, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas y enfermedades inflamatorias. Las condiciones médicas adecuadas para el tratamiento con la biomimética preferencial del complemento inmunológicamente activa descrita en la presente incluye cualquier enfermedad causada o asociada a activación de complemento o funciones efectoras mediadas por complemento, que incluyen actividad de complemento aumentada o inapropiada. Tales condiciones médicas incluyen aquellas que están actualmente o han sido previamente tratadas con los fármacos de unión al complemento tal como eculizumab. El eculizumab se une a la proteína de complemento C5 (una proteína de complemento que está posterior a C1 y C1q en la vía de complemento clásica), inhibiendo su escisión y posterior lisis celular mediada por complemento. La biomimética proporciona una alternativa segura y eficaz a otros fármacos de unión al complemento conocidos en la técnica. Por ejemplo, alguna biomimética se une a C1q, la primera subunidad en el complejo C1 de la vía de complemento clásica. Las condiciones médicas adecuadas para el tratamiento con la biomimética preferencial de complemento inmunológicamente activa incluye, de modo no taxativo, miastenia grave, síndrome urémico hemolítico (HUS), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), hemoglobinuria paroxística noctura (PNH), neuromielitis óptica, rechazo mediado por anticuerpos de aloinjertos, degeneración macular, enfermedad de células falciformes y glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGn ). De manera adicional a las condiciones médicas adecuadas para el tratamiento con la biomimética preferencial de complemento inmunológicamente activo descrito en la presente incluye aquellos tratados actualmente de forma rutinaria con amplias terapias inmunosupresoras que incluyen hIVIG, o en el que hIVIG se ha descubierto que es clínicamente útil como cipotenias autoinmuntarias, demielinación inflamatoria crónica, polineuropatía, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, enfermedad autoinmunitaria anti-Factor VIII, dermatomiositis, vasculitis y uveítis (Ver, F. G. van der Meche, P. I. Schmitz, N. Engl. J. Med. 326, G1123 (1992); P.
Gajdos et ál, Lancet i, 406 (1984); Y. Sultán, M. D. Kazatchkine, P. Maisonneuve, U. E. Nydegger, Lancet ii, 765 (1984); M. C. Dalakas et ál., N. Engl. J. Med. 329, 1993 (1993); D. R. Jayne, M. J. Davies, C. J. Fox, C. M. Black, C. M. Lockwood, Lancet 337, 1137 (1991); P. LeHoang, N. Cassoux, F. George, N. Kullmann, M. D. Kazatchkine, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49 (2000)) y aquellos cánceres o afecciones de enfermedad inflamatoria en la que un anticuerpo monoclonal se puede utilizar o ya se encuentra en uso clínico. Las condiciones incluidas entre aquellas que pueden ser eficazmente tratadas por los compuestos que son el objetivo de esta invención incluyen una enfermedad inflamatoria con un desequilibrio en las redes de citocina, un trastorno autoinmunitario mediado por autoanticuerpos patogénicos o linfocitos T autoagresivos, o una fase aguda o crónica de una enfermedad o proceso crónico recidivante autoinmunitario, inflamatorio o infeccioso.
Además, otras afecciones médicas que tienen un componente inflamatorio que implican el complemento se beneficiarán del tratamiento con los stradomers tales como la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, mal de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, infarto de miocardio, apoplejía, hepatitis B, hepatitis C, inflamación asociada a el virus de inmunodeficiencia humana, adrenoleucodistrofia y trastornos epilépticos especialmente aquellos que se cree que están asociados a la encefalitis posviral incluido el síndrome de Rasmussen, síndrome de West y síndrome de Lennox-Gastaut.
El enfoque general de la terapia que utiliza los stradomers aislados descritos en la presente es administrarle a un sujeto que tiene una enfermedad o afección, una cantidad terapéuticamente eficaz del biomimético inmunológicamente activo aislado para efectuar un tratamiento. Algunas enfermedades o afecciones se pueden categorizar ampliamente como enfermedades inflamatorias con un desequilibrio de las redes de citocinas, un trastorno autoinmune mediado por autoanticuerpos patogénicos o linfocitos T autoagresivos o una fase aguda o crónica de una enfermedad o proceso recidivante crónico.
Los términos "tratar" y "tratamiento", según se emplean en la presente, se refieren a la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un stradomer de la presente invención de modo que el sujeto tenga una mejora en una enfermedad o afección, o en un síntoma de la enfermedad o afección. La mejora es cualquier mejora o alivio de la enfermedad o afección, o de los síntomas de la enfermedad o afección. La mejora es una mejora observable o medible, o puede ser una mejora en la sensación general de bienestar del sujeto. Por ende, los entendidos en la técnica advierten que un tratamiento puede mejorar la condición de enfermedad, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad. Específicamente, las mejoras en los sujetos pueden incluir uno o más de: disminución de la inflamación; disminución de marcadores inflamatorios de laboratorio como la proteína C reactiva; disminución de la autoinmunidad comprobada por uno o más de: mejoras en los marcadores autoinmunitarios como el recuento de autoanticuerpos o plaquetas, recuento de glóbulos blancos o recuento de glóbulos rojos, disminución del sarpullido o púrpura, disminución de la debilidad, entumecimiento u hormigueo, aumento de los niveles de glucosa en los pacientes con hiperglicemia, disminución del dolor, inflamación, hinchazón o degradación de las articulaciones, disminución de la frecuencia y el volumen de cólicos y diarreas, disminución de la angina, disminución de la inflamación de los tejidos o disminución de la frecuencia de las apoplejías; disminuciones de la carga tumoral cancerosa, aumento del tiempo para el avance del tumor, disminución del dolor por cáncer, aumento de la supervivencia o mejoras en la calidad de vida; o retraso del avance o mejora de la osteoporosis.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz” tal como se usa en la presente, se refiere a una cantidad que produce una mejora o alivio de los síntomas de la enfermedad o afección.
Según se emplea en la presente, "profilaxis" puede significar la prevención completa de los síntomas de una enfermedad, un retraso en la aparición de los síntomas de una enfermedad o una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad desarrollados posteriormente.
El término "sujeto" tal como se usa en la presente, significa cualquier sujeto mamífero al cual se le han de administran stradomers de acuerdo con los métodos descritos en la presente, que puede ser un sujeto humano. Los métodos de la presente descripción también se pueden utilizar para tratar a primates no humanos (p. ej., monos, babuinos y chimpancés), ratones, ratas, bovinos, caballos, gatos, perros, cerdos, conejos, cabras, ciervos, ovejas, hurones, jerbos, conejillos de indias, hámsters, murciélagos, aves (por ejemplo, pollos, pavos y patos), peces y reptiles para producir moléculas de stradomer quiméricas o específicas de las especies.
Los stradomers pueden proporcionar seguridad y eficacia superior con respecto a otras moléculas de unión al complemento. Los stradomers pueden exhibir seguridad y eficacia superior con respecto al anticuerpo anti-C5 eculizumab.
La inhibición del complemento ha demostrado que aumenta las enfermedades mediadas por anticuerpo (ver, por ejemplo, Stegall et ál. Terminal Complement Inhibition Decreases Antibody-Mediated Rejection in Sensitized Renal Transplant Recipients. American Journal of Transplantation noviembre de 2011; 11 (1) : 2405-2413-Epub 22 de setiembre de 2011; DOI: 10.1111/j.1600-6143.2011.03757.x). Los stradomers de la presente invención también pueden ser útiles para tratar una enfermedad o afección que es mediada por anticuerpo. Los autoanticuerpos median muchas enfermedades autoinmunitarias conocidas y probablemente juegan un papel en numerosas otras enfermedades autoinmunitarias. Enfermedades mediadas por anticuerpos reconocidos en las que se pueden utilizar stradomers de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, nefritis mediada por anticuerpo de membrana basal antiglomerular que incluye Goodpasture; anticuerpos antidonantes (aloanticuerpos específicos de donantes) en trasplantes de órganos sólidos; anticuerpo anti-Aquaporin-4 en neuromielitis óptica; anticuerpo anti-VGKC en neuromiotonia, encefalitis límbica, y síndrome de Morvan; receptor de acetilcolina anti-nicotínico y anticuerpos anti-MuSK en miastenia grave; anticuerpos anti-VGCC en síndrome miasténico de Lambert Eaton; anticuerpos anti-AMPAR y anti-GABA(B)R en encefalitis límbica generalmente asociada a tumores; anticuerpos anti-GlyR en síndrome de la persona rígida o hiperplexia; anticuerpos antifosfolípidos, anticardiolipina, y anti-p2 glicoproteína I en aborto espontáneo recurrente, síndrome de Hughes, y lupus eritematoso sistémico; anticuerpos de ácido antiglutámico descarboxilasa en el síndrome de la persona rígida, ataxia cerebelar autoinmunitaria o encefalitis límbica; anticuerpos de receptor anti-NMDA en un síndrome nuevamente descrito que incluye las características límbicas y subcorticales con trastornos de movimiento prominente generalmente en adultos jóvenes y niños que generalmente se asocia a teratoma de ovarios pero puede ser no paraneoplásica; anticuerpos anti-ADN de doble cadena, anti-ADN de cadena simple, anti-ARN, anti-SM y anti-C1q en lupus eritematoso sistémico; anticuerpos anti-nucleares y anti- nucleolares en enfermedades del tejido conectivo que incluyen escleroderma, síndrome de Sjogren, y Polimiositis que incluyen anti­ Ro, anti-La, anti-Scl 70, anti-Jo-1; anticuerpos de factor anti-reumatoide en artritis reumatoidea; anticuerpos de antígeno de superficie anti-Hepatitis B en Poliarteritis Nodosa; anticuerpos anti-Centromere en síndrome de CREST; anticuerpos anti-estreptococo en o como un riesgo de endocarditis; anti-tiroglobulina, peroxidasa antitiroideo, y anticuerpos de receptor anti-TSH en tiroiditis de Hashimoto; anticuerpos anti-U1 RNP en enfermedad de tejido conectivo mezclado y lupus eritematoso sistémico; y anticuerpos anti- desmogleina and anti-queratinocitos en pénfigo.
Los stradomers de la presente invención se pueden utilizar para tratar afecciones que incluyen, de modo no taxativo, insuficiencia cardíaca congestiva (CHF), vasculitis, rosácea, acné, eccema, miocarditis y otras afecciones del miocardio, lupus eritematoso sistémico, diabetes, espondilopatías, fibroblastos sinoviales y estroma de médula ósea; pérdida ósea; enfermedad de Paget, osteoclastoma; mieloma múltiple; cáncer de mama; osteopenia por desuso; desnutrición, enfermedad periodontal, enfermedad de Gaucher, histiocitosis celular de Langerhans, lesión de la médula espinal, artritis séptica aguda, osteomalacia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrucción periodontal y fracturas óseas; sarcoidosis; cánceres óseos osteolíticos, cáncer de pulmón, cáncer de riñón y cáncer rectal; metástasis ósea, tratamiento del dolor de hueso, hipercalcemia maligna humoral, espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías; rechazo de trasplantes, infecciones virales, neoplasias hematológicas y afecciones tipo neoplásicas, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; linfomas no Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos pequeños/leucemia linfocitica crónica, micosis fungoide, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de la zona marginal, leucemia de células pilosas y leucemia linfoplasmacítica), tumores de células precursoras de linfocitos, incluido linfoma/leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B y linfoma/leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, timoma, tumores de linfocitos T y células NK maduras, incluido leucemias de linfocitos T periféricas, leucemia de linfocitos T adultas/linfomas de linfocitos T y leucemia linfocítica granular grande, histiocitosis de células de Langerhans, neoplasias mieloides como leucemias mielógenas agudas, incluida AML con maduración, AML sin diferenciación, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloproliferativos crónicos, incluido leucemia mielógena crónica, tumores del sistema nervioso central, por ejemplo, tumores cerebrales (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma y retinoblastoma) , tumores sólidos (cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células basales, cáncer de páncreas, cáncer de la vía biliar, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, cánceres uterino, vaginal o del cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado primario o cáncer endometrial, tumores del sistema vascular (angiosarcoma y hemangiopericitoma)) u otro cáncer.
"Cáncer" en la presente se refiere o describe la afección fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por un crecimiento celular sin regular. Algunos ejemplos de cánceres incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluido liposarcoma, sarcoma osteogénico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, leiomiosarcoma, cordoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, rabdomiosarcoma, fibrosarcoma, miosarcoma, condrosarcoma), tumores neuroendócrinos, mesotelioma, sinovioma, schwannoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Ejemplos más particulares de tales tipos de cáncer incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, carcinoma del pulmón microcítico, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, gástrico o cáncer de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores del tracto biliar, tumor de Ewing, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad mielodisplásica, enfermedad de cadena pesada, tumores neuroendócrinos, Schwannoma, y otros carcinomas, así como cáncer de cabeza y cuello.
Los stradomers de la presente invención se pueden utilizar para tratar enfermedades autoinmunitarias. El término "enfermedad autoinmunitaria", según se emplea en la presente, se refiere a un grupo variado de más de 80 enfermedades y afecciones. En todas estas enfermedades y afecciones, el problema subyacente es que el sistema inmunitario del cuerpo ataca al propio cuerpo. Las enfermedades autoinmunitarias afectan a todos los sistemas principales del cuerpo incluido el tejido conectivo, los nervios, los músculos, el sistema endocrino, la piel, la sangre y los sistemas respiratorio y gastrointestinal. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoidea, la esclerosis múltiple, la miastenia grave y la diabetes tipo 1.
La enfermedad o afección tratable utilizando las composiciones y los métodos de la presente invención puede ser un proceso hematoinmunológico, que incluye, de modo no taxativo, enfermedad de células falciformes, púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia aloinmune/autoinmune, trombocitopenia inmune adquirida, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, aplasia eritrocitaria asociada a parvovirus B19, autoinmunidad antifactor VIII adquirida, enfermedad de von Willebrand adquirida, mieloma múltiple y gammapatía monoclonal de significado incierto, sepsis, anemia aplásica, aplasia pura de glóbulos rojos, anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad hemolítica del recién nacido, neutropenia mediada por el sistema inmunitario, refractariedad a la transfusión de plaquetas, púrpura postransfusión neonatal, síndrome urémico hemolítico, vasculitis sistémica, púrpura trombocitopénica trombótica o síndrome de Evans.
La enfermedad o afección también puede ser un proceso neuroinmunológico, incluido, entre otros, síndrome de Guillain-Barré, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante de IgM paraproteinémica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, miastenia gravis, neuropatía motora multifocal, síndrome de la neurona motora inferior asociado a anti-/GMl, desmielinización, esclerosis múltiple, neuritis óptica, síndrome del hombre rígido, degeneración cerebelosa paraneoplásica con anticuerpos anti-Yo, encefalomielitis paraneoplásica, neuropatía sensorial con anticuerpos anti-Hu, epilepsia, encefalitis, mielitis, mielopatía especialmente asociada a virus 1 linfotrópico de linfocitos T humanos, neuropatía diabética autoinmune, mal de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntingdon o neuropatía disautonómicos idiopática aguda.
La enfermedad o afección también puede ser inflamación o autoinmunidad asociada a pérdida de audición o pérdida de visión. Por ejemplo, la enfermedad o afección puede ser pérdida de audición relacionada con autoinmunidad tal como pérdida de audición inducida por ruido o pérdida de audición relacionada con la edad, o puede estar asociado a la implantación de dispositivos tal como dispositivos de audición (por ejemplo, implantes cocleares). Las composiciones proporcionadas en la presente se pueden administrar a un sujeto antes de, conjuntamente con, o posteriormente al implante de un dispositivo.
La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad reumática, incluido, entre otros, enfermedad de Kawasaki, artritis reumatoidea, síndrome de Felty, vasculitis ANCA positiva, polimiositis espontánea, dermatomiositis, síndrome antifosfolípido, abortos espontáneos recurrentes, lupus eritematoso sistémico, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST o uveítis.
La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad dermatoinmunológica, incluido, entre otros, necrólisis epidérmica tóxica, gangrena, granuloma, enfermedades ampollosas de la piel autoinmunes incluido pénfigo vulgar, penfigoide bulloso y pénfigo foliáceo, vitíligo, síndrome de shock tóxico estreptocócico, esclerodermia, esclerosis sistémica incluido esclerosis sistémica difusa y cutánea limitada, dermatitis atópica (especialmente dependientes de esteroides).
La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad inmunológica musculoesquelética, incluido, entre otros, miositis con cuerpos de inclusión, fascitis necrotizante, miopatías inflamatorias, miositis, miopatía anti-Decorin (antígeno BJ), miopatía necrótica paraneoplásica, miopatía vacuolada vinculada a X, polimiositis inducida por penicilamina, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria o miocardiopatía.
La enfermedad o afección también puede ser un proceso de enfermedad inmunológica gastrointestinal, incluido, entre otros, anemia perniciosa, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, enfermedad celiaca, dermatitis herpetiforme, cirrosis criptogénica, artritis reactiva, enfermedad de Crohn, enfermedad de Whipple, colitis ulcerosa o colangitis esclerosante.
La enfermedad o afección también puede ser enfermedad de injerto contra huésped, rechazo del injerto mediado por anticuerpos, rechazo de médula ósea después del trasplante, inflamación de la enfermedad posinfecciosa, linfoma, leucemia, neoplasia, asma, diabetes mellitus tipo 1 con anticuerpos de células anti-beta, síndrome de Sjogren, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison, síndrome de Vogt- Koyanagi-Harada, glomerulonefritis membranoproliferativa, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, micropoliarteritis, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa e insuficiencia multisistema orgánica. "Alergia", tal como se utiliza en la presente, incluye todas las reacciones inmunitarias mediadas por IgE así como aquellas reacciones que imitan las reacciones mediadas por IgE. Las alergias son inducidas por alérgenos, que incluyen proteínas, péptidos, carbohidratos, y combinaciones de estos, que desencadenan una respuesta inmunitaria IgE o de tipo IgE. Las alergias de ejemplo incluyen alergias a las nueces, alergias al polen y alergias a las picaduras de insectos. Los alérgenos de ejemplo incluyen urushiol en roble y hiedra venenosa; antígeno de polvo de la casa; componentes del polen del abedul Bet v 1 y Bet v 2; el antígeno de 15 kd en apio; antígeno de manzana Mal d 1; Pru p3 en durazno; alérgeno de polen de Timothy grass Phl p 1; Lol p 3, Lol p I, o Lol p V en Rye grass; Cyn d 1 en Bermuda grass; alérgenos de ácaros del polvo, ácaros del polvo der p1, der p2, o der f1; epitopos a- gliadina y ygliadina en gluten; fosfolipasa de veneno de abeja A2; epítopos Ara h 1, Ara h 2, y Ara h 3 en maníes.
La enfermedad o afección puede ser una enfermedad glomerular y/o nefritis. La proliferación mesangial es una característica común de muchas enfermedades glomerulares humanas que incluyen nefropatía de IgA, que resuelve la glomerulonefritis postinfecciosa y una cantidad de enfermedades glomerulares secundarias tales como nefritis lúpica, púrpura de Schonlein-Henoch, artritis reumatoidea, cirrosis hepática, síndrome de Alport, y nefropatía diabética. La enfermedad se caracteriza por grados variados de hipercelularidad mesangial y expansión de matriz mesangial. En casos progresivos estos cambios celulares pueden llevar a un estrechamiento capilar glomerular, esclerosis y adhesiones capsulares como un resultado de lesión por varios mediadores inmunológicos, tóxicos, metabólicos, mecánicos e inflamatorios. Aunque se han desarrollado varios modelos experimentales, el modelo más ampliamente utilizado para el estudio de proliferación mesangial ha sido el modelo antitimocito (anti-Thy-1) (Yamamoto y Wilson, "Quantitative and qualitative studies of antibody-induced mesangial cell damage in the rat." Kidney International 32; 514-24 (1987); Jefferson JA et ál, "Experimental mesangial proliferative glomerulonephritis (the anti Thy-1.1 model)". J. Nephrol 12; 297-307 (1999)). Otro modelo en nefropatía implica la inmunización de animales con una fracción epitelial tubular proximal (Fx1A) (Probetex, San Antonio Texas). La inmunización de ratas con Fx1A induce una nefritis "membranosa" de complejo inmunitario caracterizada por los depósitos inmunitarios subepiteliales y proteinuria con una clara similitud a la enfermedad humana (Heymann W. et ál., Proc Soc. Exp. Biol. Med. 100:660-64 (1959); Edgington TS et ál., J Exp. Med. 127; 555 (1968)). Fx1A contiene una glucoproteína grande gp330 (megalina) un antígeno nefritogénico producido por células epiteliales glomerulares. La administración del anticuerpo anti-Fx1A produce una nefritis definida por dos fases: 1) una fase heteróloga que representa una nefritis aguda inducida por un anticuerpo administrado de forma exógena, y 2) una fase autóloga crónica caracterizada por la producción de la propia respuesta de los hospedadores a la inmunoglobulina de oveja exógena (heteróloga) plantada dentro de las estructuras glomerulares. El modelo de nefropatía membranosa anti Fx1A produce depósitos subepiteliales y proteinuria. El modelo pasivo de la nefritis de Heymann y la participación del complemento en este modelo se ha tratado en otra parte (Jefferson et ál. "Experimental Models of Membranous Nephropathy", Drug Discov. Today Dis. Models 7(1-2) : 27-33 (2010).
También se proporcionan composiciones eficaces para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por agentes infecciosos. Los agentes infecciosos incluyen, entre otros, agentes bacterianos, micológicos, parasitarios y virales. Algunos ejemplos de tales agentes infecciosos incluyen los siguientes: staphylococcus, staphylococcus aureus resistente a meticilina, Escherichia coli, streptococcaceae, neisseriaaceae, cocci, enterobacteriaceae, enterococcus, enterococcus resistente a la vancomicina, cryptococcus, histoplasmosis, aspergillus, pseudomonadaceae, vibrionaceae, campylobacter, pasteurellaceae, bordetella, francisella, brucella, legionellaceae, bacteroidaceae, bacilos gram-negativos, clostridium, corynebacterium, propionibacterium, bacilos gram- positivos, ántrax, actinomyces, nocardia, mycobacterium, treponema, borrelia, leptospira, mycoplasma, ureaplasma, rickettsia, chlamydiae, candia, micosis sistémica, micosis oportunista, protozoos, nematodos, trematodos, cestodos, adenovirus, virus del herpes (incluido, por ejemplo, virus del herpes simple y virus de Epstein Barr y virus del herpes zóster), poxvirus, papovavirus, virus de la hepatitis, (incluso, por ejemplo, virus de hepatitis B y virus de hepatitis C), virus del papiloma, ortomixovirus (incluido, por ejemplo, influenza A, influenza B e influenza C) , paramixovirus, coronavirus, picornavirus, reovirus, togavirus, flavivirus, bunyaviridae, rhabdovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana y retrovirus. Algunas enfermedades infecciosas a modo de ejemplo incluyen, entre otras, candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía por estreptococos, afecciones de la piel y de la orofaringe por estreptococos, sepsis gram negativa, tuberculosis, mononucleosis, influenza, enfermedad respiratoria causada por el virus sincitial respiratorio, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis. La presente invención comprende métodos y composiciones eficaces para el tratamiento de enfermedades infecciosas, que incluyen de modo no taxativo, aquellas causadas por agentes bacterianos, micológicos, parasitarios y virales. Algunas enfermedades infecciosas a modo de ejemplo incluyen, entre otras, candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía por estreptococos, afecciones de la piel y de la orofaringe por estreptococos, sepsis gram negativa, tuberculosis, mononucleosis, influenza, enfermedad respiratoria causada por el virus sincitial respiratorio, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis.
Los stradomers descritos en la presente se pueden utilizar en un sistema de cebado donde se extrae sangre de un paciente y se pone en contacto transitoriamente con los stradomers durante un período de tiempo de alrededor de media hora y alrededor de tres horas antes de ser introducidos nuevamente en el paciente. En esta forma de terapia celular, las propias células efectoras del paciente se exponen al stradomer que se fija en una matriz ex vivo para modular las células efectoras a través de la exposición de las células efectoras al stradomer. La sangre que incluye las células efectoras moduladas se infunde nuevamente en el paciente. El sistema de cebado puede tener numerosas aplicaciones clínicas y terapéuticas.
Los stradomers descritos en la presente también se pueden aplicar fácilmente para alterar las respuestas del sistema inmunitario en diversos contextos para afectar los cambios específicos en los perfiles de respuesta inmunitaria. La modificación o modulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto se refiere a aumentar, disminuir o cambiar la proporción o los componentes de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede aumentar o disminuir la producción de citocinas o los niveles de secreción según se desee al dirigirse al complemento junto con la combinación adecuada de FcyR con un stradomer diseñado para unir el complemento e interactuar con esos receptores. La producción de anticuerpos también se puede aumentar o disminuir; la proporción de dos o más citocinas o receptores de células inmunes se puede cambiar; o se puede provocar la producción de tipos adicionales de citocinas o anticuerpos. Un sujeto con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria puede tener su respuesta inmunitaria modificada mediante un método que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un stradomer descrito en la presente a un sujeto, donde la cantidad terapéuticamente eficaz del stradomer modifica la respuesta inmunitaria en el sujeto. Idealmente, esta intervención trata la enfermedad o la afección en el sujeto. La respuesta inmunitaria modificada puede ser un aumento o una disminución de la respuesta y puede comprender la modificación de los niveles de citocinas incluido los niveles de cualquiera de IL-6 , IL-10, IL-8, iL-23, IL-7, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, TNF-alfa y IFN-alfa. Il-6 o IL-8 pueden disminuir en respuesta a la terapia, o preferentemente IL-6 e IL-8 disminuyen como respuesta a la terapia. Sin embargo, la invención no se limita por ningún mecanismo de acción particular de los biomiméticos descritos. La respuesta inmunitaria modificada puede ser un nivel de autoanticuerpos modificado en el sujeto. La respuesta inmunitaria modificada puede ser un nivel de linfocitos T autoagresivos modificado en el sujeto. Por ejemplo, la reducción de la cantidad de producción de TNF-alfa en las enfermedades autoinmunitarias puede tener efectos terapéuticos. Una aplicación práctica de esto es la terapia con anticuerpos anti-TNF-alfa (por ejemplo, REMICADE®) comprobada clínicamente para tratar la psoriasis en placa, artritis reumatoidea, artritis psoriásica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y espondilitis anquilosante. Estas enfermedades autoinmunitarias tienen diferentes etiologías pero comparten componentes inmunológicos clave de los procesos de enfermedad relacionados con la inflamación y la actividad de las células inmunes. Un stradomer diseñado para reducir la producción de TNF-alfa será igualmente eficaz en estas y muchas otras enfermedades autoinmunitarias. El perfil de respuesta inmunitaria modificado también puede ser la modulación directa o indirecta para efectuar una reducción en la producción de anticuerpos, por ejemplo autoanticuerpos dirigidos a los tejidos del propio sujeto o niveles de linfocitos T autoagresivos modificados en el sujeto. Por ejemplo, la esclerosis múltiple es un trastorno autoinmunitario que comprende linfocitos T autorreactivos que se pueden tratar mediante terapia con interferón beta. Ver, por ejemplo, Zafranskaya M, et ál., Interferon-beta therapy reduces CD4 and CD8+ T-cell reactivity in multiple sclerosis, Immunology 2007 May;121(l):29-39-Epub 18 dic 2006. Un diseño de stradomer para reducir los niveles de linfocitos T autorreactivas será igualmente eficaz en la esclerosis múltiple y en muchas otras enfermedades autoinmunitarias que comprenden los linfocitos T autorreactivos.
Los stradomers descritos en la presente se pueden utilizar para modular la expresión de las moléculas coestimuladoras de una célula inmunitaria, que incluye una célula dendrítica, un macrófago, un osteoclasto, un monocito o una célula NK o para inhibir en estas mismas células inmunes la diferenciación, maduración o secreción de citocinas, que incluye la interleucina-12 (IL-12) o aumentar la secreción de citocinas, que incluye la interleucina-10 (IL-10) o interleucina-6 (IL- 6) , o IL1-RA. Los entendidos en la técnica también pueden validar la eficacia de un biomimético inmunológicamente activo mediante la exposición de una célula inmunitaria al biomimético inmunológicamente activo y la medición de la modulación de la función de la célula inmunitaria, en donde la célula inmunitaria es una célula dendrítica, un macrófago, un osteoclasto o un monocito. La célula inmunitaria puede exponerse al biomimético inmunológicamente activo in vitro y que además comprende la etapa de determinar la cantidad de un receptor de superficie de células o de una producción de citocinas, en donde un cambio en la cantidad de receptor de superficie de células o en la producción de citocinas indica una modulación de la función de las células inmunes. La célula inmunitaria puede exponerse al biomimético inmunológicamente activo in vivo en un animal modelo para una enfermedad autoinmunitaria que además comprende una etapa de evaluar un grado de mejora en la enfermedad autoinmunitaria.
Los stradomers descritos en la presente pueden también ser utilizados como un componente de un dispositivo. Por ejemplo, los stradomers proporcionados en la presente pueden estar recubiertos en un dispositivo, tal como un implante médico. Por ejemplo, los stradomers pueden estar recubiertos en un stent coronario o como parte de terapia de nanopartículas para aumentar la penetración y prolongar la liberación del fármaco, por ejemplo para el uso intraoftálmico en uveítis o degeneración macular. Los stradomers descritos en la presente pueden también ser utilizados como un componente de un diagnóstico. Un experto en la técnica puede personalizar la terapia al determinar en qué pacientes el uso de un stradomer puede ser particularmente beneficioso. Por ejemplo, el experto en la técnica puede exponer las células inmunitarias de un paciente al biomimético inmunológicamente activo y medir la modulación de la activación de la célula inmunitaria o maduración mediante citometría de flujo o perfil de citocina para identificar los que muestran una respuesta elevada.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 - Stradomers preferenciales de complemento
Se tomaron varios enfoques para generar stradomers de unión preferenciales de complemento. Se generaron stradomers en los que al menos una mutación puntual se introdujo en el dominio Fc, donde la mutación aumentó la unión al complemento. Específicamente, las siguientes mutaciones se realizaron en las posiciones 267, 268 y 324 del dominio Fc del stradomer GL- 2045 descrito en WO 2012/016073: S267E, H268F y S324T. En algunos stradomers, las mutaciones adicionales se realizaron para aumentar adicionalmente la relación de la unión del complemento a la unión de FcyR canónica al alterar la unión de FcyR y/o la unión de FcRn. Las secuencias de aminoácidos de los stradomers de ejemplo se muestran anteriormente en la Tabla 1 y la Tabla 2.
Para cada stradomer generado, se determinó el nivel de unión de FcyR canónica, unión de FcRn a pH 7,4, unión de C1q de complemento e inhibición de CDC y se comparó con el stradomer original, G045c (bisagra de IgG1 - CH3 de IgG1CH2 IgG1 - bisagra de IgG2). Además, algunos compuestos se evaluaron para unirse con otros componentes de cascada de complemento.
Se evaluó la unión de stradomers preferenciales de complemento o stradomer original G045c a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIa o FcRn. Los valores RU de disociación se midieron mediante interferometría de biocapa utilizando un instrumento ForteBio Octet. Las proteínas del receptor etiquetado con His estaban unidas a la punta del sensor en amortiguador de análisis cinético 1X de ForteBio luego del cual la constante de asociación del receptor/proteína se midió al transferir la punta del sensor a un amortiguador de cinética 1x que contiene el stradomer purificado de elección. La constante de disociación se midió al transferir la punta del sensor a un amortiguador de cinética 1X, y el valor RU se calculó de la unión máxima medida utilizando el software ForteBio. La interferometría de biocapa detecta la unión entre un ligando inmovilizado en la superficie de la punta del biosensor y un analito en solución. Cuando ocurre la unión, se produce un aumento en el grosor óptico en la punta del biosensor, que tiene como resultado un cambio en la longitud de onda (detectado como una unidad de respuesta de "RU"). El nivel de unión máximo (RU max) es la cantidad máxima posible de unión de muestra en el equilibrio que satura la cantidad de ligando en la superficie del sensor. El RU 300 es la unión de muestra residual luego de 300 segundos de disociación y es útil para caracterizar la velocidad de disociación del artículo de prueba del ligando de prueba.
Para caracterizar los compuestos, la unión máxima mediante interferometría de biocapa (RU max) contra los 5 receptores Fc, la unión de ELISA a C1q, y la inhibición de CDC se presentan en los datos proporcionados en la presente. Para presentar diferencias en la velocidad de disociación, el RU a 300 segundos también se proporciona para los compuestos contra los % receptores Fc. Para ambos el RU max y el RU 300, en cada caso se realizó una lectura visual del valor absoluto de una gráfica generada por ForteBio de asociación y disociación y luego la respuesta se normalizó en una escala de 0 - 10 donde 0 es sin respuesta y 10 es la respuesta máxima observada para ese receptor o ligando a través de todos los compuestos evaluados en ese punto temporal, RU max o RU 300 respectivamente.
Para la unión de C1q, placas de 96 pocillos se recubrieron con C1q (Sigma Cat#:C1740 1 pg/ml) durante la noche en PBS. Luego del recubrimiento, las placas se lavaron 3 veces con amortiguador de lavado estándar (1X PBS Tween 20 al 0,05 %) y se bloqueó con amortiguador de bloqueo (BSA al 1 % 1X PBS Tween 20 al 0,05 %) durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego del bloqueo, las placas se incubaron con compuesto diluido en amortiguador de bloqueo 100 pl/pocillo y se lavaron 3 veces con amortiguador de lavado estándar. El compuesto unido a C1q se detectó mediante incubación con 1:5000 IgG1 antihumana de ratón biotinilada (Cat#555869, BD Biosciences) y estreptavidina-HRP (n.° de cat.: 7100-05 Southern Biotech) (100 pl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por lavado 3 veces con amortiguador de lavado, luego de lo cual se desarrolló el color utilizando el método TMB estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante durante 15 minutos. La absorbancia se leyó a 450 nm.
Los datos de unión del receptor Fc de ejemplo para G045c se proporcionan en la Figura 1.
G997 es un stradomer que tiene tres mutaciones (S267E/H268F/S324T) insertadas en la estructura G045c. Tal como se muestra en la Figura 2, el stradomer resultante exhibió unión a C1q aumentada en comparación con el G045c original, así como unión a FcyRIIa y FcyRIIIa apenas disminuida en comparación con G045c, y sin efecto en la inhibición de CDC. Los datos de unión del receptor Fc para G997 también se proporcionan en la Figura 3.
Luego, se construyó G998. G998 contiene una mutación adicional en la posición 297 del aminoácido respecto a G997. Específicamente, G998 tiene cuatro mutaciones (S267E/H268F/S324T/N297A) insertadas en la estructura G045c. La mutación triple en G998 restauró la fuerte unión de C1q e inhibición de CDC; la unión a los receptores de activación FcyRIIa y FcyRIIIa se eliminó y FcyRIIb se redujo, mientras que la unión a FcRn no se redujo en comparación con el stradomer original G045c (Figura 4A). Además, sorprendentemente, la unión a FcyRI se retuvo completamente en G998 a pesar de la mutación N297A. Una comparación del RU300 para la unión de FcyR y FcRn canónica de G997, G998 y G045c se proporciona en la Figura 4B. Dada la aglicosilación que ocurre con la mutación N297A, la retención de la unión al receptor inhibidor FcyRIIb mediante G997 fue sorprendente. Aunque la unión de FcyRIIb se redujo considerablemente en RU max para G998 en comparación con G997, G998 se disocia muy lentamente de FcyRIIb, tal como se muestra en los datos RU300 (Figura 4B). Los datos de unión del receptor Fc para G998 también se proporcionan en la Figura 5.
Los compuestos específicos G1033 y G1022 también se generaron. Específicamente, G1033 tiene 6 mutaciones (S267E/H2 68F/S32 4T/N2 97A/L2 34A/L2 35A) insertadas en la estructura G045c; y G1022 tiene 7 mutaciones (S267E/H2 68F/S32 4T/N2 97A/E2 33P/L2 34V/L2 35A y G236 eliminado) insertadas en la estructura G045c. Los datos RUmax FcyR y FcRn canónicos, unión de C1q e inhibición de CDC para G1033 y G1022 se proporcionan en la Figura 6A. G1033 une C1q y FcRn, e inhibe CDC, sin unión apreciable a FcyRIIb o FcyRIIIa. De manera sorprendente, a pesar de la deglicosilación de este compuesto debido a la mutación N297A, algo de unión se retiene para FcyRI y FcyRIIa. G1022 une C1q e inhibe CDC sin ninguna unión apreciable a FcyRI o FcyRIIIa; se retiene unión leve a FcyRIIb y se retiene unión modesta para FcyRIIa y FcRn en este compuesto. La eliminación de la unión de FcyRI en G1022 fue sorprendente debido a la avidez inherente, incluso a afinidad baja, de los stradomers al receptor FcyRI de alta afinidad. Por lo tanto, la eliminación de la unión de FcyRI a través de la combinación de mutaciones en G1022 fue inesperada basándose en la unión a FcyRI retenida en otros stradomers que contienen estas mutaciones. Por ejemplo, la combinación de las mutaciones en G998 (S267E/H268F/S324T/N297A) no tuvo como resultado una pérdida de unión de FcyRI. Fue particularmente sorprendente que la unión a FcyRI pudo ser eliminada en un stradomer en el que la unión a receptores Fc de afinidad baja y la inhibición de CDC estaba retenida. Una comparación de los datos RU300 de FcyR y FcRn canónicos para G045c, G1022 y G1033 se proporciona en la Figura 6B.
G1032 tiene 5 mutaciones (S267E/H268F/S324T/L234A/L235A) insertadas en la estructura G045c. El RUmax de unión de FcyR, RUmax de unión de FcRn, unión de C1q, e inhibición de CDC se muestran en la Figura 7A, y datos RU300 de FcR se muestran en la Figura 7B. Sorprendentemente, mientras que G1032 unió C1q e inhibió CDC, la unión resistente se retuvo para todos los receptores Fc canónicos, a pesar de las mutaciones L234A y L235A; unión moderadamente resistente se retuvo para FcRn.
G1023 tiene 6 mutaciones (S267E/H268F/S324T/E233P/L234V/L235A) y una eliminación del G en la posición 236. El RUmax de unión de FcyR, RUmax de unión de FcRn, unión de C1q, e inhibición de CDC se muestran en la Figura 8A, y datos RU300 de FcR se muestran en la Figura 8B. G1023 se unió a C1q e inhibió CDC con unión resistente retenida para todos los receptores Fc canónicos, y la unión moderadamente resistente se retuvo en FcRn. Sorprendentemente, mientras que G1023 se unió a C1q e inhibió CDC, a pesar de las mutaciones E223, L234V y L235A y la eliminación de G236 (y en la ausencia de desglicosilación mediante una mutación N297A), la unión resistente se retuvo para todos los receptores Fc canónicos.
G1006 tiene 4 mutaciones (S267E/H268F/S324T/D265A). El RUmax de unión de FcyR, RUmax de unión de FcRn, unión de C1q, e inhibición de CDC se muestran en la Figura 9A, y datos RU300 de FcR se muestran en la Figura 9B. Este stradomer se unió a C1q e inhibió CDC, con unión retenida a FcyRI, FcyRIIa y, en un menor grado, FcyRIIb. Los resultados fueron sorprendentes porque aunque D265A se describe como que reduce la unión a todos los receptores Fc canónicos, la unión resistente se retuvo para FcyRI y la unión moderada se retuvo para FcyRIIa. La unión FcyRIIIa se eliminó, y la unión moderadamente resistente se retuvo para FcRn (Figura 9A).
G1027 tiene 5 mutaciones (P238D/S267E/H268F/S324T/N297A). El RUmax de unión de FcyR, RUmax de unión de FcRn, unión de C1q, e inhibición de CDC se muestran en la Figura 10A, y los datos RU300 de FcR se muestran en la Figura 10B para G1027. Este stradomer se unió a C1q e inhibió CDC, retuvo unión resistente para FcyRI, exhibió unión disminuida a FcyRIIa y FcyRIIb y unión moderada a FcRn, y eliminó la unión de FcyRIIIa. El hecho de que la unión del receptor Fc canónico no se eliminó en este stradomer a pesar de las mutaciones P238D y N297A fue un resultado sorprendente.
G1003 se construyó en el antecedente G019 (bisagra de IgG2 - bisagra de IgG1 - CH3 de IgG1 CH2 de IgG1) y tiene 3 mutaciones: S267E/H268F/S324T. Los resultados para este stradomer se proporcionan en las Figuras 11A y 11B. Este stradomer se unió a C1q e inhibió CDC. Además, el stradomer exhibió unión resistente a FcyRI y FcyRIIb; unión disminuida a FcyRIIa; y unión moderadamente resistente a FcRn. El stradomer original G019 exhibe unión de C1q mínima y no presenta inhibición de CDC considerable. Por lo tanto, el hecho de que la incorporación de la mutación triple en este stradomer original tuviera como resultado un compuesto con la misma estructura general y patrón de multimerización como el G019 original, pero con unión a C1q e inhibición resistente de CDC, fue particularmente sorprendente. Incluso más sorprendente es el hecho de que las mismas mutaciones (S267E/H268F/S324T) incorporadas en la estructura de GL-2045 (que proporcionan G998) demostraron actividad de unión sustancialmente diferente. G997 y G1003 posee los mismos dominios con las mutaciones idénticas y presentan generalmente los mismos atributos de unión aunque los compuestos originales (G045c y G019 respectivamente) difieren considerablemente en la unión de C1q y la inhibición de CDC. Estas comparaciones destacan adicionalmente la imprevisibilidad de un conjunto dado de mutaciones en el contexto de un stradomer multimerizante.
G989 está en el antecedente G045c y contiene 2 mutaciones (E233P/G236R), y se generó para reducir la unión canónica. Sin embargo, de manera sorprendente, este stradomer no solo exhibió unión canónica reducida sino también una pérdida de unión de C1q y CDC (Figuras 12A, 12B y 13).
Por lo tanto, se generó G990, que también está en el antecedente G045c pero contiene solo una mutación individual (G236R). De manera sorprendente, la mutación G236R sola disminuyó la unión canónica y retuvo unión de C1q mínima (Figuras 14A, 14B y 15).
Basándose en estos resultados sorprendentes, para intentar aumentar adicionalmente la unión de C1q, se generó G994. G994 se realizó en el antecedente G045c y tiene 5 mutaciones: E233P/G236R/S267E/H268F/S324T. Sin embargo, sorprendentemente, mientras que G994 recuperaba la unión al complemento perdida y la inhibición de CDC del stradomer G989 en la que se basaba, la adición de la mutación triple S267E/H268F/S324T tuvo como resultado la unión recuperada de FcyRI y FcyRIIb (Figuras 16A, 16B y 17). Por lo tanto, la adición de la mutación triple que se informó aumentaba la unión al complemento también tuvo como resultado un aumento en la unión al receptor de Fc canónico en el contexto de un stradomer.
Por lo tanto, G994 se utilizó luego como una plataforma en un intento de retener la unión de C1q y la inhibición de CDC, y ganar especificidad para la unión al complemento por sobre la unión canónica. Específicamente, se generó G996, que se encuentra en el antecedente G045 y tiene 4 mutaciones (G236R/S267E/h268F/S324T). De manera inesperada, G996 ganó unión adicional a FcyRIIa y FcyRIIb pero no ganó unión al receptor de activación FcyRIIIa. Por lo tanto, G996 une C1q, inhibe CDC, y une todos los receptores Fc excepto FcyRIIIa (Figuras 18A, 18B, y 19, paneles superiores). Sin embargo, también sorprendentemente, G996 no exhibió unión canónica en un ratón, lo cual lo vuelve un compuesto ideal con el cual evaluar la inhibición de CDC pura en roedores (Figura 19, tres paneles inferiores). G1042 se encuentra en el antecedente G045c y tiene 6 mutaciones (E233P, G236R, S267E, H268F, S324T y L328F). Por lo tanto, G1042 difiere de G994 en que incluye la mutación L328F, que se espera que aumente la unión a FcyRIIb. Sorprendentemente, G1042 tuvo como resultado no solo unión fuerte a FcyRIIb sino también a FcyRI y FcyRIIa (Figuras 20A, 20B y 21).
G1043 y G1046 cada uno está en el antecedente G045c y cada uno tiene 5 mutaciones: P238D/D265G/S267E/H268F/S324T and P238D/D265W/S267E/H268F/S324T, respectivamente. Para ambos de estos stradomers, la adición de la mutación P238D a las otras mutaciones sorprendentemente tuvo como resultado la unión a FcyRIIa (Figuras 22-25). Se esperaba que ambos stradomers tuvieran unión aumentada a FcyRIIb y unión disminuida a FcyRIIa debido a la mutación en la posición 238; sin embargo, sorprendentemente, G1043 mostró unión a ambos FcyRIIa y FcyRIIb (Figuras 22A, 22B y 23), y G1046 mostró unión a FcyRIIa pero no a FcyRIIb (Figuras 24A, 24B y 25).
G1050 se encuentra en el antecedente G045c y tiene 8 mutaciones y una eliminación en la posición 236 (E233P/L234V/L235A/S267E/H268F/N297A/S324T/S328F, y una eliminación en la posición 236). Se esperaba que estas mutaciones redujeran o eliminaran la unión a FcyRIIa y FcyRIII (debido a las mutaciones en E233P/L234V/L235A y la eliminación en 236) pero retienen la unión a FcyRIIb (debido a la mutación en la posición 328); sin embargo, sorprendentemente, G1050 muestra unión a FcyRIIa y FcyRIIb, pero no muestra unión a FcyRI o FcyRIII (Figuras 26A, 26B y 27).
G1049 se encuentra en el antecedente G019 y tiene 4 mutaciones (S267E/H268F/S324T/L328F). Por lo tanto, respecto a G1003, G1049 tiene una mutación adicional en L328F, que se espera que aumente la unión a FcyRIIb solo. Sin embargo, sorprendentemente, G1049 exhibe unión fuerte a todos los FcyR canónicos (Figuras 28A, 28B y 29) y muy sorprendentemente demuestra la unión fuerte a C1q y la inhibición de CDC mientras que G019 no lo hace. Por lo tanto, fue particularmente sorprendente que la unión fuerte a C1q y la inhibición de CDC se podría lograr mediante mutaciones puntuales en un stradomer que tiene la estructura de fondo G019.
G1025 se encuentra en el fondo G045c y tiene 4 mutaciones (P238D/S267E/H268F/S324T). Se esperaba que la mutación en la posición 238 aumentara la unión a FyRIIb y disminuyera la unión a FcyRI, FcyRIIa y FcyRIIIa; sin embargo, sorprendentemente solo la unión a FcyRIIIa disminuyó, y el stradomer retuvo al unión resistente a FcyRIIb, FcyRI y FcyRIIa (Figuras 30A y 30B).
Un resumen general de los resultados del estudio se proporciona en la Tabla 3.
T l . R m n l ivi r m r r f r n i l l^ m l m n
Figure imgf000046_0001
continuación
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EJEMPLO 2 - Los stradomers preferenciales de complemento exhiben unión retenida o aumentada a C1q Se proporciona una comparación de unión de C1q entre los stradomers G994, G996, G997 y G998, en comparación con GL-2045 original o con el control negativo de Fc G001 en la Figura 31. La Figura 31A muestra la absorbancia a concentraciones en aumento de los stradomers indicados, y la Figura 31B muestra los datos con transformación logarítmica y los valores EC50 para cada uno de los stradomers evaluados. Los valores EC50 se muestran en pg/ml. Juntos, los datos demuestran que los stradomers G997, G998, G996 y G994 exhiben unión superior a C1q en comparación con G001 (control de Fc de IgG1), así como unión superior de C1q respecto al stradomer original GL-2045.
Tomados juntos, los resultados del estudio demuestran que los stradomers proporcionados en la presente exhiben unión a C1q y unión mínima o ausente a FcyRI, FcyRII, y/o FcyRIII.
EJEMPLO 3 - Unión de C3 de stradomers preferenciales de complemento
Un estudio se llevó a cabo para evaluar la unión de los stradomers preferenciales de complemento a C3.
96 placas de pocillos se recubrieron con componente de complemento de C3 (Quidel, #A401; 1 pg/ml en PBS) durante la noche a 4°C, seguido por lavado 3 x con PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %. Las placas se bloquearon con PBS 1X BSA al 2 % Tween 20 al 0,05 %, durante 2 horas a temperatura ambiente. El compuesto que se va a evaluar (GL-2045, G001, G997, G998, G994 o G996) se incubó con C3 unido, comenzando a 100 pg/ml y 1:1 disminuyendo hasta 0,78125 pg/ml en amortiguador de bloqueo) durante 2 horas a temperatura ambiente seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). La interacción del compuesto con C3 fue detectada por IgG1 antihumana de ratón de biotina, (BD# 555869) estreptavidina-HRP (n.° de cat.: 7100-05 Southern Biotech) 1/ 5000 (cada uno) en PBS-BSA-T 1:10 y 1:50100 pl/pocillo 1H a temperatura ambiente seguido por lavado 4 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). El color se desarrolló con reactivo de sustrato TMB 100 pl por pocillo durante 20 minutos y la reacción se detuvo con 50 pl H2SO4 1M y la absorbancia se lee a 450/650nm.
Los resultados del estudio se muestran en la figura 32. El control negativo G001 y el stradomer G996 no se unió a C3. G997 exhibió un nivel intermedio de unión de C3 en comparación con el control negativo y el stradomer GL-2045 original. G994, GL-2045 y G998 mostraron la unión a C3 más alta.
EJEMPLO 4 - Unión de C3b, C4 y C5 de los stradomers preferenciales de complemento
Se realizaron estudios para evaluar la unión de los stradomers preferenciales de complemento a C3b, C4 y C5. Para la unión de C3b, placas de 96 pocillos se recubrieron con componente de complemento de C3b (GenWay Biotech #GWB- 8BA994; 1 pg/ml en PBS). Se agregó 100 pl de componente de complemento de C3b por pocillo y se incubó durante la noche a 4°C seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se bloquearon las placas en amortiguador de bloqueo (PBS 1X BSA al 2 % tween 20 al 0,05 %) 2H a temperatura ambiente, seguido por lavado 3x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). El compuesto que se va a evaluar (G001, GL-2045, G997, G998 o G994) se hizo reaccionar con C3b durante 4 horas a temperatura ambiente, con diluciones que comienzan a 100 pg/ml y diluidas 1:1 disminuyendo hasta 0,78125 pg/ml en amortiguador de bloqueo seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se detectó el compuesto unido con IgG1 antihumana de ratón biotinilada, (BD# 555869) estreptavidina-HRP (n.° de cat.: 7100-05 Southern Biotech) 1/ 5000 (cada uno) en amortiguador de bloqueo 100 pl durante 1 hora a temperatura ambiente. El color se desarrolla con reactivo de sustrato TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con 50 pl H2SO4 1M. La absorbancia se leyó a 450/650nm.
Para la unión de C4, placas de 96 pocilios se recubrieron con componente de complemento de C4 (Quidel #A402, 1 pg/ml en PBS). Se agregó 100 pl de componente de complemento de C4 por pocillo y se incubó durante la noche a 4°C seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se bloquearon las placas en amortiguador de bloqueo (PBS 1X BSA al 2 % tween 20 al 0,05 %) 2H a temperatura ambiente, seguido por lavado 3x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). El compuesto que se va a evaluar (G001, GL-2045, G996, G997, g 998 o G994) se hizo reaccionar con C4 durante 4 horas a temperatura ambiente, con diluciones que comienzan a 100 pg/ml y diluidas 1:1 disminuyendo hasta 0,78125 pg/ml en amortiguador de bloqueo seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se detectó el compuesto unido con IgG1 antihumana de ratón biotinilada, (BD# 555869) estreptavidina-HRP (n.° de cat7100-05 Southern Biotech) 1/ 5000 (cada uno) en amortiguador de bloqueo 100 pl durante 1 hora a temperatura ambiente. El color se desarrolla con reactivo de sustrato TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con 50 pl H2SO4 1M. La absorbancia se leyó a 450/650nm.
Para la unión de C5, placas de 96 pocillos se recubrieron con componente de complemento de C5 (Quidel #A403, 1 pg/ml en PBS). Se agregó 100 pl de componente de complemento de C5 por pocillo y se incubó durante la noche a 4°C seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se bloquearon las placas en amortiguador de bloqueo (PBS 1X BSA al 2 % tween 20 al 0,05 %) 2H a temperatura ambiente, seguido por lavado 3x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). El compuesto que se va a evaluar (G001, GL-2045, G996, G997, g 998 o G994) se hizo reaccionar con C5 durante 4 horas a temperatura ambiente, con diluciones que comienzan a 100 pg/ml y diluidas 1:1 disminuyendo hasta 0,78125 pg/ml en amortiguador de bloqueo seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se detectó el compuesto unido con IgG1 antihumana de ratón biotinilada, (BD# 555869) estreptavidina-HRP (n.° de cat.: 7100-05 Southern Biotech) 1/ 5000 (cada uno) en amortiguador de bloqueo 100 pl durante 1 hora a temperatura ambiente. El color se desarrolla con reactivo de sustrato TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con 50 pl H2SO4 1M. La absorbancia se leyó a 450/650nm.
Los resultados de los estudios se muestran en la Figura 33 (componente de complemento de C3b), Figura 34 (componente de complemento de C4) y Figura 35 (componente de complemento de C5). El control negativo G001 no se unió a C3b, C4 o C5. El stradomer original GL-2045 se unió a C5, pero no exhibió unión a C3b o C4. Por el contrario, los stradomers preferenciales de complemento G994, G997 y G998 se unieron cada uno a C4 así como a C5.
EJEMPLO 5 - Tratamiento de stradomer preferencial de complemento para nefritis en el modelo anti-Thy 1
Se evaluaron stradomers preferenciales de complemento en el modelo de nefritis Thy-1 (glomerulonefritis mesangioproliferativa inducida anti Thy-1). En este modelo, el anticuerpo respecto a timocitos (ATS) es reactivo al antígeno Thy-1 de superficie presente en las células mesangiales de rata (Yamamoto 1987 y Jefferson 1999). La administración de ATS induce una mesangiolisis dependiente del complemento seguido por una glomerulonefritis proliferativa mesangial rápida que llega a pico dentro de 5 días luego de la inyección, y luego se resuelve en el tiempo.
La enfermedad se indujo en el día 0 mediante inyección de CD90 anti-rata de ratón (Thy1.1) (Cedar Lane) en ratas Wistar (n=8) para inducir la glomerulonefritis. En los días 0, 2, 4 y 6 , se les administró a los animales 40 mg/kg de G998, 80 mg/kg de G998, 80 mg/kg de G994, o 80 mg/kg de G1033. Los animales no enfermos de control no recibieron anticuerpo anti-Thy 1 u otro tratamiento. El tacrolimus de control positivo se dosificó a 1 mg/kg dosificado de forma intramuscular a diario comenzando en el día -9 antes de la inyección antisueros. La dosificación del día 0 fue 4 horas antes de la inyección antisueros. La orina se recolectó antes de la dosificación y en el día 3, 5, 7 y 9 luego de la inyección antisueros. Se recolectaron riñones de ratas al final del estudio y se fijaron en formalina al 10 % durante el análisis de histología. Se recolectó suero para el análisis BUN de suero.
Los resultados del estudio se proporcionan en las Figuras 37, 38A, 38B, 39 y 40; y la Tabla 4. En la Figura 37, la tabla debajo de la gráfica proporciona los valores P respecto a los ratones de control con PBS. Cada uno de los tres compuestos de prueba G994, G998 y G1033 disminuyeron de forma considerable la proteinuria. Las Figuras 38A y 38B muestran el análisis histológico de un ratón de control con PBS enfermo (Fig. 38A) y un ratón tratado con 40 mg/kg de G998 (Fig. 38B). La Tabla 4 y la Figura 39 proporcionan la cuantificación de los análisis histológicos de cada uno de los animales en el grupo de control de PBS (presentado como el Grupo 2 en la Tabla 3) y el grupo G99840 mg/kg (presentado en el Grupo 4 en la Tabla 3). Los resultados presentados en la Tabla 4 se proporcionan gráficamente en la Figura 39.
Tabla 4: Resultados histológicos cuantitativos del modelo de nefritis Thy-1
CKD-G LI-1
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En el día 9, el suero se recolectó de cada animal y se analizó en busca de nitrógeno de urea en sangre (BUN). En cada uno de los animales que recibió tratamiento con stradomers preferenciales de complemento, BUN disminuyó considerablemente en comparación con animales de control con PBS enfermos, lo que indica una velocidad de filtración glomerular mejorada y por lo tanto una enfermedad mejorada (Figura 40).
EJEMPLO 6 - Tratamiento de stradomer preferencial de complemento para nefritis en el modelo pasivo de la nefritis de Heymann
La enfermedad se indujo en ratas en el día 0 mediante inyección de suero anti Fx1a (Probetex n.° de cat PTX-002S). G998 se dosificó a 60 mg/kg en el día 0 dos horas antes de la inyección de antisueros (día de dosificación 0) o en el día 1 un día después de la inyección de antisueros (día de dosis 1) y la dosificación continuó 2 veces /semana durante 3 semanas. Los ratones de control de vehículo recibieron suero anti Fx1a solo. La orina se recolectó antes de la dosificación y en la semana 1, 2 y 3 luego de la inyección antisueros y fue evaluada por proteinuria.
Los resultados del estudio se proporcionan en la Figura 41. Para el día 21, ambos grupos G998 exhibieron reducciones considerables en proteinuria respecto a los animales de control (p=0,0220 para el día 0 grupo G998 y p=0,0145 para el día 1 grupo G998).
EJEMPLO 7 - Niveles de fármacos y semivida funcional de compuestos preferenciales de complemento en ratas
Se realizó un estudio para medir la semivida de stradomers preferenciales de complemento G994, G998 y G1033 en ratas luego de una sola dosis. La semivida funcional se midió al evaluar la actividad de complemento en muestras de sangre tomadas en diferentes puntos temporales. Las muestras de sangre también se midieron en busca de niveles del objetivo del fármaco, factor de complemento c1q, y para evaluar qué fracción del fármaco y C1q está unida. Se administró a ratas Sprague-Dawley (4 animales por grupo) una sola dosis de forma intravenosa del compuesto G994, G998 o G1033 a 60 mg/kg. Las muestras de sangre (1,2-1,4 ml) fueron recolectadas de cada animal mediante sangrado retro- orbital en tubos heparinizados previamente enfriados previo a la dosis, 1, 4 y 8 horas luego de la administración del compuesto de prueba. Las muestras de sangre también se recolectaron en los días 1, 2, 4, 7 y 10. Se midieron los niveles de fármaco en las muestras de plasma mediante ELISA. En este ensayo de ELISA el Fc de IgG1 en los compuestos G994, G998, G1033 reaccionaron con el anticuerpo Fc de IgG antihumano (Thermo #MA1-83240) que había sido adsorbido a la superficie de la placa. Luego de la eliminación de las proteínas de muestra no unidas mediante lavado, se agregó IgG1 antihumana biotinilada (BD #555869) conjugada con peroxidasa de rábano picante y estreptavidina (HRP, Southern Biotech #7100-05). El anticuerpo conjugado con HRP forma un complejo con la IgG1 previamente unida. El complejo se ensayó mediante la adición de un sustrato cromogénico (TMB, BD #555214). La cantidad de G994, G998 y G1033 en muestras de suero se interpolaron de una curva estándar hecha del mismo compuesto mezclado en suero de mono y corregido para la dilución en la muestra.
La actividad del complemento se midió en muestras de plasma de rata utilizando un ensayo de destrucción de células dependientes del complemento in vitro. Brevemente, las células Will2 que expresan CD-20 se incubaron a 37 °C con anticuerpo monoclonal CD-20 durante 20 minutos en medio celular luego del cual las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en medio recién preparado. Las células se distribuyeron en placas de 96 pocillos luego de lo cual el plasma de rata de diferentes momentos temporales se agregó a suspensión celular y las placas se incubaron a 37 °C durante 3 horas. El reactivo de ensayo Cytotox (Promega) se agregó a cada pocillo y las placas se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La luminiscencia se leyó en un luminómetro GloMax Promega y se calculó la muerte celular. La actividad de complemento se midió en diferentes niveles de plasma en el ensayo, y los valores para el plasma al 2 % y 4 % se utilizaron para análisis.
El porcentaje de la actividad de complemento en cada muestra se calculó en comparación con la actividad de complemento en muestras previas a la dosis luego de la sustracción de la muestra de control sin anticuerpo.
Los resultados del estudio se proporcionan en las Figuras 42-45. La Figura 42 proporciona las semividas de G994, G998 y G1033. G994 tiene una semivida considerablemente más larga que los otros dos compuestos evaluados en este experimento. El compuesto G994 eliminó la actividad del complemento en sangre de rata durante un período de tiempo extendido. La actividad de complemento luego de la dosificación con G994 permaneció baja hasta 96 horas (4 días) y estuvo a aproximadamente 50 % de los niveles normales en el día 10. El compuesto G998 y G1033 exhibió una semivida algo más corta en la rata. Para el compuesto G998, aproximadamente 50 % de los niveles de complemento previo a la dosis estaban presentes en el día 2. Para el compuesto G1033, la semivida funcional fue entre 2 y 4 días.
La Figura 43 proporciona la actividad de complemento en sangre de rata luego de la dosis individual de G994, G998 o G1033. La actividad de complemento se expresa como el porcentaje de muerte celular medida a niveles de plasma al 2 % o a 4 % en el ensayo. Las Figuras 44A y 44B proporcionan la correlación entre los niveles del fármaco y la actividad del complemento para cada uno de los compuestos preferenciales de complemento G994, G998 y G1033. La Figura 44A proporciona todos los puntos de datos recolectados en el estudio, y la Figura 44B se enfoca en los puntos de datos de concentración de fármaco inferiores (0-250 pg/ml para G994 y G998, y 0-150 pg/ml para G1033). Los niveles de fármaco necesarios para eliminar la actividad de complemento en sangre de rata se estimaron de los niveles de intercepción x estimados. Para G994, el valor de intercepción x es 164 y 170 pg/ml para suero al 2 % y 4 %. Los valores R2 para la correlación es 0,696 y 0,558. Para G998 el valor de intercepción x es 158 y 193 pg/ml con valores R2 de 0,519 y 0,560 para suero al 2 % y 4 %. Para G1033 la intercepción x es 88 y 109 pg/ml con valores R2 de 0,612 y 0,648.
De los niveles de intercepción x estimados, se necesita aproximadamente 100-200 pg/ml del compuesto G994 y G998 para eliminar la actividad del complemento. Para el compuesto G1033, la cantidad aproximada necesaria para eliminar la actividad del complemento es 100 pg/ml.
EJEMPLO 8 - Estudio farmacocinético en monos cynomolgus
Se realizó un estudio para medir la semivida de G994, G998, o G1033 en monos cynomolgus luego de una sola dosis del compuesto preferencial de complemento.
Se administró a monos cynomolgus (3 animales por grupo) una sola dosis de forma subcutánea del compuesto G994, G998 o G1033 a una dosis de 28 mg/kg. Las muestras de sangre (aproximadamente 3 ml) se recolectaron en tubos separadores de suero de cada animal previo a la dosis y a 1, 2, 4, 12, 24, 48, 72, 144, 216 y 312 horas luego de la dosis. Se midieron los niveles de fármaco en las muestras de suero mediante ELISA. En este ensayo de ELISA el Fc de IgG1 en los compuestos G994, G998, G1033 reacciona con el anticuerpo Fc de IgG antihumano (Thermo #MA1-83240) que ha sido adsorbido a la superficie de la placa. Luego de la eliminación de las proteínas de muestra no unidas mediante lavado, se agregó IgG1 antihumana biotinilada (BD #555869) conjugada con peroxidasa de rábano picante y estreptavidina (HRP, Southern Biotech #7100-05). El anticuerpo conjugado con HRP forma un complejo con la IgG1 previamente unida. El complejo se ensayó mediante la adición de un sustrato cromogénico (TMB, BD #555214). La cantidad de G994, G998 y G1033 en muestras de suero se interpolaron de una curva estándar hecha del mismo compuesto mezclado en suero de mono y corregido para la dilución en la muestra.
La actividad del complemento se midió en muestras de suero de cynomolgus utilizando un ensayo de destrucción de células dependientes del complemento in vitro. Brevemente, las células Will2 que expresan CD-20 se incubaron a 37 °C con anticuerpo monoclonal CD-20 durante 20 minutos en medio celular luego del cual las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en medio recién preparado. Las células se distribuyeron en placas de 96 pocillos luego de lo cual el suero de diferentes momentos temporales se agregó a suspensión celular y las placas se incubaron a 37 °C durante 3 horas. El reactivo de ensayo Cytotox (Promega) se agregó a cada pocillo y las placas se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La luminiscencia se leyó en un luminómetro GloMax Promega y se calculó la muerte celular. La actividad de complemento se midió en diferentes niveles de plasma en el ensayo, y los valores para el suero al 2 % y 4 % se utilizaron para análisis.
El porcentaje de la actividad de complemento en la muestra se calculó en comparación con la actividad de complemento en muestras previas a la dosis luego de la sustracción de la muestra de control sin anticuerpo.
Los resultados del estudio se proporcionan en las Figuras 45-47. La Figura 45 muestra el nivel de fármaco de cada uno de los stradomers preferenciales de complemento evaluados luego de una sola dosis del compuesto. G994 alcanzó concentraciones pico considerablemente menores, pero que tenían una semivida considerablemente más larga, que los compuestos G998 y G1033. La Figura 46 muestra la actividad de complemento (% de muerte celular) en el tiempo luego de la dosis individual de G994 (panel izquierdo), G998 (panel del medio) o G1033 (panel de la derecha). Las Figuras 47A y 47B muestran la correlación entre los niveles del fármaco y la actividad del complemento para cada uno de los compuestos evaluados en el estudio. La Figura 47A muestra todos los puntos de datos recolectados en el experimento, y la Figura 47B muestra la primera parte de la curva, con concentraciones de fármaco inferiores.
Los estudios también se realizaron para determinar los niveles de C4a, C3a y C5a, que indican la activación del complemento, luego de una sola dosis de los compuestos G994, G998, y G1033. Las concentraciones de cada uno de C4a, C3a y C5a se determinarán de las muestras de suero recolectadas tal como se describe anteriormente utilizando ELISA comercialmente disponibles. Los resultados de estos estudios mostrarán una disminución en la activación del complemento en el tiempo luego de una sola administración de ya sea G994, G998, o G1033, determinado por una disminución en la concentración de C4a, C3a y/o C5a.
Los análisis de la actividad del complemento que permanece luego de una sola dosis del compuesto preferencial de complemento indicaron que el compuesto G994 elimina la actividad del complemento en sangre de cynomolgus durante un período de tiempo extendido. La actividad de complemento luego de la dosificación con G994 permaneció baja hasta 312 horas (13 días). El compuesto G998 y G1033 exhibió una semivida algo más corta en los monos cynomolgus. Para el compuesto G998, aproximadamente 50 % de los niveles de complemento previo a la dosis estaban presentes en el día 6. Para el compuesto G1033, la semivida funcional parecía ser entre 9 y 13 días. Para todos los compuestos, la actividad de complemento permaneció en la sangre durante aproximadamente 4 horas. Sin limitarse a la teoría, esto puede deberse a la absorción relativamente lenta de los compuestos dosificados de forma subcutánea.
Se utilizó análisis de la correlación entre los niveles de fármaco y la actividad del complemento (Figura 47B) para estimar los niveles de fármaco necesarios para eliminar la actividad del complemento en la sangre de cynomolgus. De los niveles de intercepción x estimados, se necesita aproximadamente 150 pg/ml del compuesto G994 para eliminar la actividad del complemento. Para el compuesto G998 y G1033, el valor aproximado es 300-400 pg/ml.
Los niveles de C1q se miden en muestras de suero de monos cynomolgus tratados con G994, G998 o G1033 tal como se describe anteriormente. Las mediciones cuantitativas se evalúan mediante un ELISA de C1q. Las muestras de suero también se analizan mediante la inmunoprecipitación conjunta para determinar la fracción de C1q que está unida por los compuestos. Para determinar la fracción de C1q unido al fármaco, se realizó un ELISA de C1q utilizando un anticuerpo de captura a C1q seguido por una unión de anticuerpo de detección a la parte de IgG1 humana de los fármacos preferenciales de complemento. Esto capturará y cuantificará el complejo fármaco-C1q. Esto será seguido por la evaluación del sobrenadante del mismo ELISA anterior en un ELISA de C1q utilizando un anticuerpo C1q como anticuerpo de captura y detección para cuantificar el C1q sin unir en las muestras.
EJEMPLO 9 - Unión de C3, C3b, C4 y C5 de los stradomers preferenciales de complemento G994, G996 y G1033 Se realizaron estudios adicionales para evaluar la unión de los stradomers preferenciales de complemento a C3, C3b, C4 y C5. Placas de noventa y seis pocillos se recubrieron con componente de complemento (Quidel #A401, 1 pg/ml para C3; GenWay Biotech #Gw B-8BA994, 1 pg/ml para C3b; Quidel #A402, 1 pg/ml para C4; y Quidel A403, 1 pg/ml para C5) en PBS 100 pl por pocillo durante la noche a 4 °C seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se bloquearon las placas en amortiguador de bloqueo (PBS 1X BSA al 2 % tween 20 al 0,05 %) 2 horas a temperatura ambiente, seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). El compuesto se reaccionó con el componente del complemento durante 2 horas a temperatura ambiente comenzando a 100 pg/ml y se diluyó hasta bajar a 1:1 en amortiguador de bloqueo seguido por lavado 3 x (PBS 300 pl 1X Tween 20 al 0,1 %). Se detectó el compuesto unido con IgG1 antihumana de ratón biotinilada, (BD# 555 869) estreptavidina-HRP (n.° de cat.: 7100­ 05 Southern Biotech) 1/ 5000 cada uno en amortiguador de bloqueo 100 pl durante 1 hora a temperatura ambiente. El color se desarrolló con reactivo de sustrato TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con 50 pl H2SO4 1M y la absorbancia se leyó a 450/650nm.
Los resultados del estudio se proporcionan en la Figura 49. Todos los stradomers preferenciales de complemento G994, G998 y G1033 se unieron cada uno de factores de complemento C3, C3b, c 4 y C5. Además, G1033 exhibió unión considerablemente mayor a estos factores de complemento en un ensayo de unión directa, en comparación con GL-2045 o los otros stradomers preferenciales de complemento G994 y G998.
EJEMPLO 10. Inducción de citocina de stradomers preferenciales de complemento G994, G996 y G1033 Estudios adicionales se llevaron a cabo para evaluar la inducción de citocina de G994 y G1033 de células mononucleares de sangre periférica asiladas (PBMC). 100 ml de sangre humana se recolectó en tubos de recolección de sangre recubiertos con heparina. Alícuotas de 10 ml de sangre se transfirieron en tubos cónicos de 50 ml y se diluyeron con PBS 10 ml seguido por mezclado suave. La muestra de 20 ml de sangre diluida se colocó en capas sobre 15 ml Ficoll-Paque PLUS en tubos cónicos de 50 ml y centrífugas a 400 x g durante 30-40 minutos a 1820° C. Luego de la centrifugación, la capa superior se quitó utilizando una pipeta de Pasteur, dejando la capa de linfocitos sin alterar en la interfaz. La capa de linfocitos se transfirió a un tubo cónico limpio de 50 ml y se agregó 30 ml de PBS. La capa diluida de linfocitos se centrifugó a 60-100 x g durante 10 minutos a 18-20° C. Luego de la centrifugación, el sobrenadante se quita y las células se lavaron en 30 ml de PBS y se centrifugaron otra vez. El sedimento celular se volvió a suspender en 1-2 ml de medio RPMI complementado con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) al 10 %. Las células se contaron y se separaron en partes alícuotas en tubos a 5 x 106 células/tubo y se incubaron con material de prueba (G019, G994 o G1033) durante 4 o 24 horas. Los niveles de citocina a 4 y 20 horas se determinaron mediante kits ELISA comerciales.
Los resultados de este estudio se muestran en las Figuras 55A y 55B. Ni G1033 ni G994 indujeron la citocina proinflamatoria, TNFa (Figura 55B). De manera similar, ninguno de los dos compuestos indujeron la citocina antiinflamatoria IL-1Ra (Figura 55A). Esto probablemente se deba a la incapacidad de G1033 y G994 de unir FcyRs canónicos, ya que G019 (que une los receptores canónicos pero no el complemento) indujo ambas citocinas.
EJEMPLO 11 - Stradomers preferenciales de complemento para el tratamiento de artritis establecida Un estudio de artritis inducida por colágeno (CIA) se llevó a cabo para determinar la eficacia de G994, G998 y G1033 en la inhibición de inflamación que ocurre en la artritis de colágeno de tipo II establecida en ratas Lewis hembras. Las ratas fueron inyectadas de forma intradérmica/subcutánea (ID/SC) con colágeno porcino de tipo II para inducir la artritis. Las ratas luego se dosificaron de forma intravenosa (IV) en los días 11, 13 y 14 con solución salina amortiguada con fosfato (control con PBS), G994 (40 mg/rata), G998 (40 mg/rata), o G1033 (40 mg/rata). Los controles positivos fueron tratados a diario (QD) por vía oral (PO) en los días 11-16 con el compuesto de referencia dexametasona (Dex, 0,075 mg/kg). Los tratamientos eran a ciegas hasta que terminó el estudio. La evaluación de eficacia se basó en las mediciones de tobillo con calibrador (Figura 57).
Estos estudios muestran que los compuestos preferenciales del complemento, G994, G998 y G1033 reducen la inflamación en un modelo CIA de rata Lewis o artritis.
EJEMPLO 12 - Stradomers derivados de G994 o G998
Se generaron stradomers adicionales utilizando la secuencia de G994 como una secuencia base para evaluar la función de las mutaciones en residuos particulares así como para identificar y evaluar los stradomers preferenciales de complemento adicionales. G994 (SEQ ID NO: 10 u 11) es un stradomer que tiene un fondo G045c y mutaciones puntuales en las posiciones 233, 236, 267, 268, y 324. Específicamente, G994 tiene las siguientes mutaciones: E223P, G236R, S267E, H268F y S324T.
Para analizar la función de las mutaciones en la posición 236, se generaron stradomers en los que el aminoácido de tipo salvaje (serina) estaba presente en la posición 267, la posición 236 se mutó a arginina (como en G994) o a un residuo similar a la arginina, y el resto de las mutaciones G994 (E233P, H268F y S324T) estaban presentes. Los compuestos generados se proporcionan en la Tabla 5:
Tabla 5. Stradomers preferenciales del complemento que tienen una base G994 y mutaciones adicionales en la osición 236
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Sorprendentemente, la mutación de la posición 236 a la arginina, o un aminoácido similar a la arginina, alteró la unión canónica y la unión al complemento en comparación con G994. La mutación de la posición 236 a ácido glutámico o ácido aspártico (G1103 y 1104, respectivamente) tuvo como resultado unión elevada a FcyR canónicos, retuvo unión elevada a C1q, e inhibió CDC. Los compuestos G1103 y G1104 puede por lo tanto ser considerados stradomers generales, con unión a C1q y canónica aumentada en comparación con el stradomer original (G045c). En cambio, la mutación de la posición 236 a glutamina, histidina o asparagina (G1088, 1082 y 1105, respectivamente) tuvo como resultado unión canónica reducida, mientras retenía unión a C1q elevada e inhibición de CDC. Los compuestos 1088, 1082 y 1105 pueden por lo tanto considerarse stradomers preferenciales de complemento con aplicabilidad terapéutica similar como G994, G998 y G1033. La mutación de la posición 236 a lisina (G1106) extirpó la unión de C1q y la canónica excepto la unión de FcyRI y tuvo como resultado una incapacidad de inhibir CDC.
Para analizar la función de las mutaciones en la posición 267, se generaron stradomers en los que el aminoácido de tipo salvaje (glicina) estaba presente en la posición 236, la posición 236 se mutó a ácido glutámico (como en G994) o a un residuo similar al ácido glutámico, y el resto de las mutaciones G994 (E233P, H268F y S324T) estaban presentes. Los compuestos generados se proporcionan en la Tabla 6 :
Tabla 6. Stradomers preferenciales del complemento que tienen una base G994 y mutaciones adicionales en
Figure imgf000053_0002
La mutación de la posición 267 a asparagina (G1108) tuvo como resultado unión canónica disminuida mientras mantiene un alto grado de unión de C1q e inhibición de CDC. G1108 puede por lo tanto considerarse un stradomer preferencial de complemento con aplicabilidad terapéutica similar como G994, G998 y G1033. Sin embargo, la mutación de la posición 267 a glutamina, ácido aspártico, histidina o ácido glutámico (G1102, 1101, 1125 y 1109, respectivamente) tuvo como resultado unión canónica aumentada, mientras retenía unión a C1q elevada e inhibición de CDC. G1102, 1101, 1125 y 1109 pueden por lo tanto ser considerados stradomers generales, con unión a C1q aumentada en comparación con el original. De manera alternativa, la mutación de la posición 267 a arginina o lisina (1100 y 1084 respectivamente) tuvo como resultado unión canónica reducida, unión a C1q reducida, y una incapacidad de inhibir CDC.
Para analizar la función de las mutaciones en las posiciones 236 y 267 en combinación, se generaron stradomers en los que la posición 236 se mutó en arginina (como en G994) o un aminoácido estructuralmente similar a la arginina y la posición 267 mutó a ácido glutámico (como en G994) o a un aminoácido estructuralmente similar al ácido glutámico, y el resto de las mutaciones G994 (E233P, H268F y S324T) estaban presentes. Los compuestos generados se proporcionan en la Tabla 7:
Tabla 7. Stradomers preferenciales del complemento que tienen una base G994 y mutaciones adicionales en l i i n 2 2 7
Figure imgf000053_0001
continuación
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De manera sorprendente, las mutaciones simultáneas en las posiciones 236 y 267 tenían diferentes efectos en comparación con las mutaciones de cualquiera de las posiciones independientemente. La combinación de G263N/S267E en el contexto de E233P/H268F/S324T (G1129) tuvo como resultado unión reducida a FcyRIIIa y retención o aumento de unión a FcyRI, FcyRIIa y FcyRIIb. G1129 puede por lo tanto ser considerado un stradomer preferencial de complemento. La combinación de las mutaciones puntuales G236D/S267Q, G236Q/S267D y G236D/S267D (G1111, G1114 y G1117, respectivamente) tuvo como resultado la unión canónica aumentada respecto al stradomer original o G994, y también tuvo como resultado el mantenimiento de unión de C1q elevado e inhibición de CDC. G1111, G1114 y G1117 pueden por lo tanto ser considerados stradomers generales, con el potencial para eficacia terapéutica aumentada en comparación con el stradomer original, G045c. De manera alternativa, la combinación de G236D/S267R, G236R/S267R, G236E/S267R, G236H/S267K, G236R/S267K, G236R/S267Q, G236D/S267K, G236H/S267Q, G236Q/S267R, G236N/S267K, o G236R/S267N (G1110, G1112, G1115, G1116, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1130, y G1131, respectivamente) todos tuvieron como resultado en unión canónica disminuida y unión disminuida a C1q e inhibición de CDC reducida. En algunas instancias, tal como la combinación de G236K/S267K y G236K/S267N (G1124 y G1128, respectivamente), las mutaciones puntuales tuvieron como resultado unión canónica aumentada y unión disminuida a C1q.
Los stradomers adicionales también se generaron utilizando la secuencia de G998 como una secuencia base y una mutación en la posición 299 (T299A) para evaluar la función de las mutaciones en residuos particulares en este contexto. G998 (SEQ ID NO: 14 o 15) es un stradomer que tiene un fondo G045c y mutaciones puntuales en las posiciones 267, 268, 297, y 324. Específicamente, G998 tiene las siguientes mutaciones: S267E, H268F, N297A y S324T. El sitio de glicosilación de consenso es NXT, donde N es el residuo 297. El residuo 297 une de forma covalente los residuos de azúcar. La mutación T299A de los stradomers adicionales descritos en la presente pretendía proporcionar una proteína aglicosilada; la mutación de aminoácido en la posición 299 está diseñada para destruir el sitio de glicosilación de consenso de modo que la proteína no se glicosile, sino que deje el residuo de enlace 297 intacto. Por consiguiente, los compuestos proporcionados en la Tabla 8 más adelante (en el que el aminoácido en la posición 267 se mutó a ácido glutámico (como en G998) o una secuencia de aminoácidos similar al ácido glutámico o no se mutó del residuo de serina de tipo salvaje; los aminoácidos en las posiciones 268 y 324 se mutaron como en G998; el aminoácido en la posición 297 no se mutó; y se generó y evaluó una mutación de treonina a alanina se agregó en la posición 299).
Tabla 8. Stradomers que tienen una base G998, una mutación en la posición 299, y mutaciones adicionales n l i i n 2 7.
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De manera sorprendente, la inclusión de la mutación T299A, que debería tener como resultado la unión canónica abrogada, solo afectó el FcyR que une el contexto de la mutación S267R (G1096) o la S267K (G1093). En ambas G1096 y G1093, la unión a C1q también se redujo y ningún compuesto fue capaz de inhibir la CDC, probablemente debido a la falta de unión a C1q. Otros compuestos que contienen la mutación T299A (1071d2, G1068, G1094, G1092 y G1107) demostraron unión aumentada a ambos FcyRs y C1q. G1068, G1094, G1092 y G1107 pueden por lo tanto ser considerados stradomers generales, con el potencial para eficacia terapéutica aumentada en comparación con el stradomer original, G045c. De manera sorprendente, la unión fuerte a C1q no se correlacionó necesariamente con la inhibición de CDC, ya que 1712d2 no pudo inhibir la CDC. G1095 contiene el T299A y las mutaciones S267N, cuya combinación tuvo como resultado la unión canónica apenas disminuida, mientras que retuvo la unión a C1q y la inhibición de CDC. G1095 puede por lo tanto considerarse un stradomer preferencial de complemento con aplicabilidad terapéutica similar como G994, G998 y G1033.
Se generaron stradomers basados en G998 adicionales y se sometieron a prueba para evaluar adicionalmente la función de las 267 mutaciones en este contexto. Estos mutantes contienen las mutaciones en las posiciones 268, 324 y 297, como en G998, y tienen serina de tipo salvaje o una sustitución de aminoácido en la posición 267, tal como se muestra en la Tabla 9 más adelante. Estos stradomers no tienen una mutación en la posición 299.
Tabla 9. Stradomers que tienen una base G998, una mutación en la posición 299, y mutaciones adicionales n l i i n 2 7
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Tal como se esperaba, los stradomers en la Tabla 9 demostraron unión canónica reducida, debido a la mutación de aglicosilación N297A. De manera sorprendente, la serina de tipo salvaje en la posición 267 (G1069), las mutaciones puntuales S267D o S267Q (G1074 y G1075 respectivamente) también tuvo como resultado unión a C1q aumentada y unión canónica reducida. G1069, G1074 y G1075 pueden por lo tanto considerarse stradomers preferenciales de complemento con aplicabilidad terapéutica similar como G994, G998 y G1033. Las mutaciones S267K (G1070) y S267R (1132) tuvieron como resultado no solo unión de FcyR reducida, sino también unión de C1q reducida y una incapacidad de inhibir la CDC.
Los compuestos derivados de G994 y G998 se utilizaron en un gel para evaluar la multimerización. 3 pg de cada una de las muestras se utilizó a 150V durante aproximadamente 1,2 horas. Se agregó 20 mM yodoacetamida, y luego las muestras se incubaron durante 10 minutos antes de ser cargadas en el gel. Los resultados se proporcionan en las Figuras 48A-G, que muestran que como G994 y G998, los compuestos G1103, G1088, G1089, G1104, G1082, G1105, G1106, G1102, G1100, G1101, G1125, G1108, G1109, G1084, G1107, G1110, G1111, G1112, G1114, G1115, G1116, G1117, G1118, G1119, G1120, G1121, G1122, G1123, G1124, G1128, G1129, G1130, G1131, G1071d2, G1068, G1094, G1092, G1096, G1093, G1095, G1069, G1070, G1132, G1075 y G1075 forman multímeros.
Para cada stradomer en las Tablas 5-9, el nivel de unión FcyR canónica, la unión de C1q de complemento, y la inhibición de CDC se determinó de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Estos resultados se resumen en la Tabla 10.
Tabla 10: Resumen de actividad de stradomers derivados de G994 o G998
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continuación
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EJEMPLO 13 - Stradomers con C1q disminuido y unión de FcyR canónico
Se generaron los compuestos adicionales que comprenden la mutación triple S267E/H268F/S324T para generar mutantes preferenciales de complemento adicionales.
G1001 (SEQ ID: 78) se encuentra en el antecedente G019 y contiene cuatro mutaciones (S267E/H268F/S324T/N297A). De manera sorprendente, en el contexto del compuesto original G019, la eliminación de la glicosilación al introducir la mutación N297A a G1003 para llegar a G1001 se asocia de forma inesperada con la pérdida de unión de C1q además de la pérdida esperada de unión canónica, incluso en la presencia de la mutación triple S267E/H268F/S324T (Moore et. ál. ). Este descubrimiento sorprendente no está replicado en el contexto del compuesto original G045c, donde la eliminación de la glicosilación al introducir la mutación N297A a G997 para llegar a G998 se asocia a la pérdida esperada de unión canónica pero se retiene la unión de C1q e inhibición de CDC. Por lo tanto, aunque G998 y G1001 poseen los mismos dominios con las mutaciones idénticas y difieren solo en la posición de la bisagra IgG2, demuestran sustancialmente la misma unión al receptor Fc canónico pero una inhibición de CDC y unión de C1q considerablemente diferente. Estas comparaciones destacan adicionalmente la imprevisibilidad de un conjunto dado de mutaciones en el contexto de un stradomer multimerizante.
G999 (SEQ ID NO: 79) es un stradomer en el fondo G019 que comprende cuatro mutaciones puntuales (G236R, S267E, H268F y S324T) y demostró una unión de C1q reducida y una incapacidad de inhibir CDC. Esto es sorprendente en que, tal como se describe anteriormente, G999 difiere de G996 solo en la ubicación de la bisagra de IgG2 respecto al dominio Fc. Aun así, estos dos compuestos exhiben capacidades opuestas para la unión de C1q e inhibición de CDC (G999 no puede hacer ninguna, mientras que G996 exhibe unión de C1q elevada e inhibe CDC). Esta comparación destaca adicionalmente la imprevisibilidad de un conjunto dado de mutaciones en el contexto de un stradomer multimerizante.
G1024 (SEQ ID NO: 80) es un stradomer en el fondo G019 que comprende 4 mutaciones puntuales (P238D, S267E, H268F, S324T).
G1030 (SEQ ID NO: 81) es un stradomer en el fondo GL-2045 que comprende 7 mutaciones puntuales y una eliminación en 236 (E233P, L234V, L235A, G236Del, N297A, S267E, H268F, S324T).
G1031 (SEQ ID NO: 82) es un stradomer en el fondo GL-2045 que comprende 6 mutaciones puntuales (E233P, G236R, D265A, S267E, H268F, S324T, N297A).
G1040 (SEQ ID NO: 83) es un stradomer en el fondo GL-2045 que comprende 8 mutaciones puntuales y una eliminación en la posición 236 (E233P, L234V, L235A, G236Del, S267E, H268F, S324T, L328F, N297A).
G1044 (SEQ ID NO: 84) es un stradomer en el fondo GL-2045 que comprende 5 mutaciones puntuales (P238D, D265C, S267E, H268F, S324T).
G1045 (SEQ ID NO: 85) es un stradomer en el fondo GL-2045 que comprende 5 mutaciones puntuales (P238D, D265P, S267E, H268F, S324T).
G1048 (SEQ ID NO: 86) es un stradomer en el fondo G019 que comprende 5 mutaciones puntuales (G236R, L328F, S267E, H268F, S324T).
G1047 (SEQ ID NO: 87) es un stradomer en el fondo GL-2045 que comprende 5 mutaciones puntuales (P238D, L328F, S267E, H268F, S324T).
T l 11: r m r n 1 i min i ni n F R n ni
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De manera sorprendente, a pesar de comprender la mutación triple S267E/H268F/S324T, los stradomers enumerados en la Tabla 11 no unieron C1q y no inhibieron CDC, destacando de este modo adicionalmente la imprevisibilidad de

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un homodímero de péptido que comprende:
(a) al menos un dominio Fc de IgG1 que comprende las mutaciones puntuales S267E, H268F y S324T y que comprende además
(i) la mutación puntual N297A;
(ii) la mutación puntual G236R; o
(iii) las mutaciones puntuales G236R y E233P; y
(b) al menos un dominio de multimerización capaz de multimerizar el homodímero de péptido;
en donde el homodímero de péptido exhibe unión preferencial al complemento con respecto a FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb y/o FcyRIII.
2. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el dominio Fc comprende los polimorfismos EEM o DEL de IgG1.
3. El homodímero de la reivindicación 1 en donde el dominio de multimerización se selecciona del grupo que consiste en una bisagra de IgG2, una cremallera de isoleucina y un dominio GPP.
4. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el dominio de multimerización crea multímeros de dichos homodímeros.
5. El homodímero de la reivindicación 4, en donde los multímeros de dichos homodímeros son multímeros de alto orden.
6. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el homodímero exhibe unión reducida a un receptor de Fcy de baja afinidad.
7. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el homodímero comprende una mutación en 298 o 299 y se une a C1q, inhibe CDC y retiene la unión a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb y/o FcyRIII.
8. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el homodímero exhibe unión reducida a FcyRI, FcyRII y/o FcyRIII en comparación con un homodímero de la misma estructura que no comprende una mutación puntual en una o más de las posiciones 267, 268 y/o 324.
9. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el homodímero comprende, del extremo amino al extremo carboxi, una secuencia líder; un dominio Fc que comprende una bisagra de IgG1, IgG1CH2, y CH3 de IgG1; y una bisagra de IgG2.
10. El homodímero de la reivindicación 9, en donde el homodímero comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14 y 15.
11. El homodímero de la reivindicación 1, en donde el homodímero comprende, del extremo amino al extremo carboxi, una secuencia líder, una bisagra de IgG2, una bisagra de IgG1 y un dominio Fc que comprende un CH2 de IgG1 y un CH3 de IgG1.
12. El homodímero de la reivindicación 11, en donde el homodímero comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo de acuerdo con los SEQ ID NO: 17 y 64.
13. Una molécula que comprende dos o más homodímeros de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un homodímero de la reivindicación 1, para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad mediada por complemento, una enfermedad mediada por anticuerpo, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una alergia o un trastorno sanguíneo.
15. El homodímero para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde:
(a) la enfermedad mediada por anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Goodpasture; rechazo al trasplante de órganos sólidos; neuromielitis óptica; neuromiotonia; encefalitis límbica; síndrome de Morvan; miastenia grave; síndrome miasténico de Lambert Eaton; neuropatía autonómica; enfermedad de Alzheimer; aterosclerosis; enfermedad de Parkinson; síndrome de la persona rígida o hiperplexia; aborto espontáneo recurrente; síndrome de Hughes; lupus eritematoso sistémico; ataxia cerebelar autoimmunitaria; enfermedades del tejido conectivo que incluyen escleroderma, síndrome de Sjogren; polimiositis; artritis reumatoidea; poliarteritis nodosa; síndrome de CREST; endocarditis; tiroiditis de Hashimoto; enfermedad de tejido conectivo mezclado; canalopatías; trastornos neuropsiquiátricos autoinmuntarios pediátricos asociados a infecciones de estreptococo (PANDAS, por sus siglas en inglés); afecciones clínicas asociadas a anticuerpos contra receptores de N-metil-D-aspartato especialmente NR1, proteína 2 asociada a contactina, AMPAR, GluR1/GluR2, descarboxilasa de ácido glutámico, GlyR alfa 1a, receptor de acetilcolina, VGCC de tipo P/Q, VGKC, MuSK, GABA(B)R; acuaporina 4; y pénfigo;
(b) la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, pérdida de visión relacionada con un mal autoinmunitario y pérdida de audición relacionada con un mal autoinmunitario;
(c) la enfermedad mediada por complemento se selecciona del grupo que consiste en miastenia grave, síndrome urémico hemolítico (HUS), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), neuromielitis óptica, rechazo de aloinjertos mediado por anticuerpos, enfermedad nefropática que incluye nefropatía membranosa, y enfermedades nefríticas que incluyen glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN) y nefritis lúpica
(d) el trastorno sanguíneo es enfermedad de células falciformes.
16. El homodímero para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde en el método el homodímero se administra de forma intravenosa, subcutánea, oral, intraperitoneal, sublingual, bucal, transdérmica, mediante implante subdérmico o por vía intramuscular.
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