CN114478741B - contactin 6蛋白突变体及其编码基因、表达载体与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种contactin 6蛋白突变体及其编码基因、表达载体与应用，本发明的contactin 6突变体在鉴定介导contactin 6同源性相互作用的结构域及该结构域功能中，在筛选并鉴定可识别contactin 6IgG2结构域、IgG3结构域、及IgG2‑3结构域的contactin 6单克隆抗体中，具有表达效率高、表达稳定、转染效率高等优点，具有良好的应用价值。可用于筛选精确阻断contactin 6同源性相互作用、促进脊髓损伤后轴突再生及功能修复的特异性单克隆抗体或小分子药物的研究。

Description

contactin 6蛋白突变体及其编码基因、表达载体与应用
技术领域
本发明涉及一种contactin 6蛋白突变体及其编码基因、表达载体与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
由各种疾病和创伤(车祸、暴力、摔伤等)所致的脊髓损伤，在不同程度上损伤了脊髓上、下行的感觉运动神经通路，造成脊髓损伤平面以下的重要感觉、运动神经功能严重障碍，甚至功能完全丧失出现截瘫。脊髓损伤后，受损的神经轴突难以穿过损伤处的瘢痕组织与损伤平面以下的靶神经元重新建立突触联系，因此无法重建感觉运动神经环路。目前对于脊髓损伤治疗的基础和临床研究，在基因调控改善损伤环境、提高神经元内在的再生能力、移植具有较强再生能力的神经干细胞或移植组织工程支架等方面均取得了重要进展，但目前国内外尚缺乏有效的治疗脊髓损伤后截瘫的技术手段或药物。因此如何有效促进脊髓损伤后的轴突再生，重建脊髓感觉运动神经环路，帮助脊髓损伤患者摆脱感觉运动功能缺失的困境，是目前亟需攻克的医学难题。
申请人前期研究发现，脊髓损伤后神经识别分子contactin 6在脊髓损伤区域的表达量显著增加，受损神经轴突与形成胶质瘢痕的星形胶质细胞之间通过contactin 6的同源性相互作用，介导了皮质脊髓神经元中抑制再生的信号，从而抑制皮质脊髓束轴突的再生(Huang et al,2016.EMBO J)。Contactin 6由6个免疫球蛋白样结构域(IgG结构域)和4个纤连蛋白III结构域(FN III结构域)构成，识别介导contactin 6同源性相互作用的结构域，对于发现脊髓损伤中基于contactin 6的精确靶点并进行精准干预具有指导性意义。但是目前缺乏contactin 6结构域突变体，无法用于直接鉴定介导contactin 6同源性相互作用的结构域并研究该结构域功能；同时缺少可应用于筛选特异性识别contactin 6特定结构域的单克隆抗体的突变体，不便于单克隆抗体的筛选和鉴定。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种contactin 6蛋白突变体，可用于筛选精确阻断contactin 6同源性相互作用、促进脊髓损伤后轴突再生及功能修复的特异性单克隆抗体或小分子药物的研究。
本发明的第一个目的是提供一种contactin 6蛋白突变体，所述的突变体是缺失contactin 6蛋白中的IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域。
进一步地，所述的缺失contactin 6蛋白中的IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域是将编码contactin 6蛋白中的IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域的核苷酸缺失。
进一步地，编码所述的contactin 6蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，编码IgG2结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，编码IgG3结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，编码IgG2-3结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供一种所述的contactin 6蛋白突变体的编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述的编码基因的重组表达载体。
进一步地，所述的重组表达载体是以pcDNA3.1为表达质粒。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述的contactin 6蛋白突变体的转化体。
进一步地，所述的转化体是以大肠杆菌DH5α为宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供所述的contactin 6蛋白突变体的应用，所述的应用包括：
在介导contactin 6蛋白同源性相互作用引起的接触性抑制中的应用；
在鉴定可识别contactin 6蛋白IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域的单克隆抗体中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体可识别所述的contactin6蛋白突变体。
本发明的第七个目的是提供所述的单克隆抗体的应用，所述的应用包括：
在抑制contactin 6同源性相互作用中的应用；
在制备促进脊髓损伤后神经轴突再生及功能修复的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的contactin 6突变体在鉴定介导contactin 6同源性相互作用的结构域及该结构域功能中，在筛选并鉴定可识别contactin 6IgG2结构域、IgG3结构域、及IgG2-3结构域的contactin 6单克隆抗体中，具有表达效率高、表达稳定、转染效率高等优点，具有良好的应用价值。可用于筛选精确阻断contactin 6同源性相互作用、促进脊髓损伤后轴突再生及功能修复的特异性单克隆抗体或小分子药物的研究。
附图说明：
图1是本发明实施例1中采用无缝克隆法构建重组表达载体pcDNA3.1-contactin6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin6ΔIgG3-Myc及pcDNA3.1-contactin6ΔIgG2-3-Myc的模式图。
图2是本发明实施例1中无缝克隆构建成功后pcDNA3.1-contactin6-Myc、pcDNA3.1-contactin6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin6ΔIgG3-Myc、pcDNA3.1-contactin6ΔIgG2-3-Myc重组表达载体及经Xho I单酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是本发明实施例1中Western blot检测contactin 6蛋白及contactin 6ΔIgG2、contactin6ΔIgG3及contactin 6ΔIgG2-3突变体表达的结果。
图4是本发明实施例2中检测介导contactin 6同源性相互作用的结构域的免疫共沉淀实验结果。
图5是本发明实施例2中表达vector、contactin 6、contactin 6ΔIgG2-Myc突变体的星形胶质细胞与神经元共培养的免疫荧光染色及其神经元轴突长度的统计分析结果。
图6是本发明实施例3的Western blot鉴定可识别contactin 6IgG2、IgG3、IgG2-3结构域的contactin 6单克隆抗体的结果。
图7是本发明实施例4中的cell-based ELISA鉴定可识别contactin 6IgG2、IgG3、IgG2-3结构域的contactin 6单克隆抗体的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
溶液配制：
1×PBS溶液配制：分别称取0.335g NaH2PO4·2H2O，2.902g Na2HPO4·12H2O，8gNaCl以及0.2g KCl，加入600ml超纯水溶解，溶解后用超纯水定容至1L，高压灭菌后使用。
1×blocking buffer溶液配制：在500mL 1×PBS中加入500μL的Tween 20，混匀。
10％SDS溶液配制：在通风橱中称取十二烷基硫酸钠(SDS)粉末50g，加入超纯水溶解定容至500ml。
5％脱脂牛奶配制：称取2.5g的脱脂奶粉，用1×blocking buffer溶解并定容至50ml。
10×running buffer溶液配制：称取三(羟甲基)氨基甲烷30.2g、甘氨酸144g，超纯水溶解定容至1L。
电泳缓冲液配制：在烧杯中倒入50mL的10×running buffer、5mL10％SDS溶液，超纯水定容至500mL，混匀。
转膜液配制：在烧杯中倒入100ml的10×running buffer、100ml无水甲醇，超纯水定容至1L，混匀。
1×PBST溶液配制：在500ml 1×PBS中加入250μL的Tween 20，混匀。
RIPA裂解液：称取7.9gTris-HCl粉末溶解于750mL超纯水中溶解，加入9g的NaCl粉末继续混匀后调节溶液PH至7.4，向溶液中加入5mL TritonX-100、2.5g Na-deaxycholate以及2mL 0.5M EDTA溶解，超纯水定容至1L，4℃保存。使用前加入蛋白酶抑制剂。
实施例1：重组表达载体的构建
一、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-Myc载体构建
1、PCR引物设计及目的片段扩增、回收
通过Primer5.0软件设计引物F2a、R2a、F2b、R2b，F3a、R3a、F3b、R3b及F2-3a、R2-3a、F2-3b、R2-3b引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。原理：在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15～25bp同源序列(如图1所示)。
contactin 6-F2a(SEQ ID NO.5所示)；
contactin 6-R2a(SEQ ID NO.6所示)；
contactin 6-F2b(SEQ ID NO.7所示)；
contactin 6-R2b(SEQ ID NO.8所示)；
contactin 6-F3a(SEQ ID NO.9所示)；
contactin 6-R3a(SEQ ID NO.10所示)；
contactin 6-F3b(SEQ ID NO.11所示)；
contactin 6-R3b(SEQ ID NO.12所示)；
contactin 6-F2-3a(SEQ ID NO.13所示)；
contactin 6-R2-3a(SEQ ID NO.14所示)；
contactin 6-F2-3b(SEQ ID NO.15所示)；
contactin 6-R2-3b(SEQ ID NO.16所示)；
以含有全长contactin 6编码序列的质粒(来源于首都医科大学叶海虹教授；Yeet al,2011.J.Biol.Chem.)作为模板，进行PCR扩增，反应体系(NEB)如下：
Figure BDA0003450496560000041
Figure BDA0003450496560000051
a片段反应条件：
(1)98℃，30sec
(2)98℃，10sec；72℃，21sec
(3)循环25周期
(4)72℃，10min
(5)4℃保存
b片段反应条件：
(1)98℃，30sec
(2)98℃，10sec；72℃，76sec
(3)循环25周期
(4)72℃，10min
(5)4℃保存
二、PCR产物琼脂糖凝胶电泳及目的基因切胶回收
1、扩增产物凝胶电泳
(1)称取琼脂糖0.6g；
(2)溶于50mL的1×TAE溶液，微波炉加热沸腾至琼脂糖完全溶解；
(3)待溶液冷却至60℃，加入5μL的EB，混匀后倒入凹槽中，立即插入上样孔梳子，静置等待冷却凝固；
(4)冷却凝固后，拔出梳子，将凹槽置入电泳槽，1×TAE溶液作为电泳缓冲液。每孔加入PCR产物20μL以及上样缓冲液2μL，在120V的电压下电泳30min即可。
2、目的基因切胶回收
采用胶回收试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)，具体步骤如下：
(1)紫外光照射下，干净刀片将PCR产物中目的条带由琼脂糖凝胶中小心切下。
(2)凝胶称重，置入1.5mL EP管中，加入等倍体积Buffer GDP(100mg凝胶等同于100μL体积)。50-55℃水浴7-10min，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。
(3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2mL收集管中，把<700μL溶胶液转移至吸附柱中，13,400×g离心30-60sec。
(4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL Buffer GDP至吸附柱中。静置1min后13,400×g离心30-60sec。
(5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μL Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。13,400×g离心30-60sec。
(6)重复步骤5。
(7)弃滤液，把吸附柱置回收集管中。13,400×g离心2min。
(8)将吸附柱置于在1.5mL灭菌的离心管中，加入20-30μL Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。13,400×g离心1min。弃去吸附柱，保存DNA。
(9)进行浓度测定。
三、pcDNA3.1-contactin 6-Myc载体的单酶切，获得线性化pcDNA3.1载体
Xho I酶切(TakaRa)，快速CIP去磷酸化(NEB)，反应体系如下：
Figure BDA0003450496560000061
无菌水至20μL
反应条件：37℃，水浴1h，添加10×loading buffer终止反应。将全部酶切产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳，从胶上切取目的基因片段，放入EP管称重，进行胶回收(具体步骤如上所示)。
四、无缝克隆连接目的片段和载体片段，构建pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG3-Myc及pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-3-Myc表达载体并进行琼脂糖凝胶电泳(如图2A所示)
将上述PCR产物与载体进行无缝克隆连接，反应体系(汉恒生物科技(上海)有限公司)如下：
Figure BDA0003450496560000062
反应条件：50℃孵育20min。
五、pcDNA3.1-contactin6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin6ΔIgG3-Myc及pcDNA3.1-contactin6ΔIgG2-3-Myc表达载体的单酶切鉴定(如图2B所示)
Xho I酶切(TakaRa)，反应体系如下：
Figure BDA0003450496560000063
Figure BDA0003450496560000071
反应条件：37℃，水浴1h，添加10×loading buffer终止反应。将全部酶切产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳(如图2B所示)。
六、转化感受态细菌
琼脂糖凝胶电泳验证后进行转化实验，实验步骤如下：
1.从-80℃冰箱中取出100mL DH5α感受态细菌悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
2.将10μL连接产物全部加入，轻轻摇匀，冰上放置30min。
3.放入42℃水浴锅中热休克90sec，后迅速置于冰上冷却5min。
4.向管中加入800μL预温的无抗生素的LB液体培养基，轻柔混匀，37℃中100rpm振荡培养1h。
5.将上述菌液4000rpm离心5min后吸去850μL上清，将剩余液体混匀后涂板，倒置培养皿于37℃生化培养箱培养12-16h。同时做2个对照，对照组A：用同体积的无菌水代替连接产物进行转化实验，涂布于不含抗生素的平板上，以确定感受态大肠杆菌是否有问题；对照组B：用同体积的无菌ddH2O代替连接产物进行转化实验，涂布于含抗生素的平板上，以确定含抗生素的平板是否有问题以及大肠杆菌是否污染。
七、小量提取质粒DNA
取经菌落PCR鉴定阳性的菌液5μL加入到5mL含抗生素的LB液体培养基中，在37℃以及200rpm条件下振荡培养12-16h，即可进行质粒的小量提取，将剩余菌液加入甘油至20％的浓度，-80℃保存备用。质粒小提试剂盒使用步骤如下：
1.柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5.向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。
6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
7.向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
8.重复操作步骤7。
9.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
11.测定浓度。
八、重组质粒的序列分析鉴定
小提质粒经苏州金唯智生物科技有限公司测序鉴定，序列完全正确，获得了contactin 6IgG2结构域缺失的重组表达质粒(pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG3-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-3-Myc)。
九、细胞瞬时转染
准备培养293T细胞：
1.转染前24h，接种适量细胞(接种数量可参考附表)。至转染时细胞密度以40-60％为宜(80-90％亦可)。
2.转染前1h，更换新鲜的完全培养液(体积可参考附表)，置于37℃，5％CO2中培养。
配制转染工作液：(6孔板或35mm平皿，2mL培养液)
3.取5-8μg DNA(起始用量5μg)，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置。
4.取VigoFect(购自威格拉斯)1-4μL(起始用量2μL)，加入稀释液中至总体积为100μL，轻轻混匀，室温放置5min。
5.将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15min。
6.将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2mL培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5％CO2条件下培养。细胞后续处理：
7.24-48h后，观察或收取细胞。
十、Western blot检测contactin 6蛋白及contactin 6ΔIgG2 contactin 6ΔIgG3、contactin 6ΔIgG2-3突变体表达
1.蛋白样品裂解及提取：293T细胞分别转染pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG3-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-3-Myc 48h后，吸去细胞培养皿中的培养基，加入1×PBS溶液后轻轻摇晃洗去细胞表面残留的培养基，吸干培养皿中残留的1×PBS溶液，加入含蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司)的RIPA裂解液，冰上静置裂解5min后，用细胞刮铲将培养皿中的细胞全部刮下，移至离心管，将离心管置于混匀仪上4℃下保持30min，使细胞充分裂解，预冷的4℃的离心机中离心13000rpm，30min。离心后吸取上清，加入5×loading buffer，金属浴5-10min后冰上冷却。
2.SDS-PAGE电泳及Western blot检测：配制浓度8％的分离胶及6％的浓缩胶，上样并垂直电泳(浓缩胶：80V，分离胶：120V)，转膜(从上到下依次为滤纸、胶、膜、滤纸)，5％脱脂牛奶室温封闭1h，一抗4℃过夜，用含0.1％Tween-20的PBS(即PBS-T)洗膜3次，每次10min，加入二抗，室温反应1h，用PBS-T洗膜3次，每次10min，最后ECL显色(如图3)。
如图3所示，293T细胞中表达的contactin 6全长蛋白分子量在130-170kDa之间，contactin 6-ΔIgG3突变体蛋白分子量略低于contactin 6全长，而contactin 6-ΔIgG2及contactin6-ΔIgG2-3突变体蛋白分子量约为130kDa。
实施例2：应用于鉴定介导contactin 6同源性相互作用的结构域
一、免疫共沉淀
1.在293T细胞中分别共转染以下质粒(10cm培养皿)：
(1)19.2μg空载质粒(Vector)；9.6μg Vector+9.6μg contactin 6-HA；9.6μgVector+9.6μg contactin 6-Myc质粒；9.6μg contactin 6-HA+9.6μg contactin 6-Myc质粒；
(2)19.2μg空载质粒(Vector)；9.6μg Vector+9.6μg contactin 6-HA；9.6μgVector+9.6μg contactin 6-ΔIgG2-Myc重组质粒；9.6μg contactin 6-HA+9.6μgcontactin 6-ΔIgG2-Myc重组质粒；
(3)19.2μg空载质粒(Vector)；9.6μg Vector+9.6μg contactin 6-HA；9.6μgVector+9.6μg contactin 6-ΔIgG3-Myc重组质粒；9.6μg contactin 6-HA+9.6μgcontactin 6-ΔIgG3-Myc重组质粒；
(4)19.2μg空载质粒(Vector)；9.6μg Vector+9.6μg contactin 6-HA；9.6μgVector+9.6μg contactin 6-ΔIgG2-3-Myc重组质粒；9.6μg contactin 6-HA+9.6μgcontactin6-ΔIgG2-3-Myc重组质粒。
2.293T细胞转染两天后裂解细胞：加入1mL的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，4℃裂解30min。
3.16,400rpm，4℃离心15min后取上清。
4.取100μL裂解液，加入100μL蛋白上样缓冲液，加入20μL的5×loading buffer，95℃煮沸10min，作为input，以备Western blot分析。
5.剩余裂解液中加入10-20μL anti-Myc Affinity Gel或anti-HA Affinity Gel(上海翊圣科技有限公司)中，4℃缓慢摇晃孵育2h以上，1×PBS清洗3次凝胶，每次10min。
6.加入50μL的2×loading buffer，95℃金属浴10min，冰上冷却后-20℃保存。
7.Western blot检测免疫共沉淀样品
如图4所示，在293T细胞中共表达contactin 6-HA和contactin 6-Myc全长蛋白或共表达contactin 6-HA全长蛋白和contactin 6-ΔIgG2-Myc/contactin 6-ΔIgG3-Myc/contactin6-ΔIgG2-3-Myc突变体，通过anti-Myc Affinity Gel进行免疫沉淀，通过HA抗体检测显示contactin 6-HA可与contactin 6-Myc全长共沉淀，不能与contactin 6-ΔIgG2-Myc、contactin6-ΔIgG3-Myc及contactin 6-ΔIgG2-3-Myc共沉淀；利用anti-HAAffinity Gel进行免疫沉淀后，通过Myc抗体检测显示contactin 6-Myc可与contactin 6-HA共沉淀，而contactin6-ΔIgG2-Myc、contactin 6-ΔIgG3-Myc及contactin 6-ΔIgG2-3-Myc不能与contactin 6-HA共沉淀。表明contactin 6蛋白IgG2、IgG3结构域缺失破坏了contactin 6之间的同源性相互作用，因此IgG2、IgG3结构域是介导contactin 6同源性相互作用的重要结构域。
二、在原代神经元与星形胶质细胞共培养体系中，研究由IgG2结构域介导的contactin 6同源性相互作用引起的神经元轴突接触性抑制作用
1.原代星形胶质细胞的提取及培养
(1)1×PDL包被10cm培养皿3h后，1×PBS洗3遍；
(2)CD1品系P1-P3小鼠酒精消毒后提取大脑皮层，1×PBS洗一遍；
(3)0.125％TE，37℃水浴消化10min；
(4)加1mL培养基(DMEM+10％FBS+5％PS)终止消化，轻柔吹散组织块；
(5)70μm滤筛过滤收集上清，1000rpm离心5min，离心后弃滤液；
(6)重悬细胞，70μm滤筛过滤，接种细胞至10cm皿中；
(7)每隔3天剧烈摇晃去除小胶质细胞，换液培养7-10天后传代。
2.原代星形胶质细胞的电转
(1)进行电转的细胞密度需达到106以上；
(2)0.125％TE，37℃水浴消化10min；
(3)加1mL培养基(DMEM+10％FBS+5％PS)终止消化，离心1000rpm，5min；
(4)将离心所得细胞加入200μL电转液重悬，分别将100μL重悬的细胞加入到10μg实验组质粒和对照组质粒的离心管中混匀；
(5)将与质粒混匀的细胞加入到电转杯中，放入电转仪中电转，电转成功之后将所得细胞用neurobasal培养基培养12h。
3.原代皮层神经元培养
(1)1×PDL包被24孔板3h后，1×PBS洗3遍；
(2)CD1品系E18.5胎鼠酒精消毒后取大脑感觉运动皮层，1×PBS洗一遍；
(3)0.125％TE，37℃水浴消化10min；
(4)加1mL培养基(Neurobasal+5％FBS+1％PS+1％B27+1％谷氨酰胺)终止消化，轻柔吹散组织块；
(5)70μm滤筛过滤收集上清，1000rpm离心5min，弃滤液；
(6)重悬细胞，70μm滤筛过滤，计数板计数，与星形胶质细胞培养。
如图5所示，原代皮层神经元分别与电转空载质粒(vector)、pcDNA3.1-contactin6-HA和pcDNA3.1-contactin 6-△IgG2-Myc质粒的星形胶质细胞共培养12h后，采用GFAP/contactin6/Tuj1抗体进行免疫荧光染色。通过ImageJ分别测量皮层神经元轴突的总长度及延伸至星形胶质细胞表面的轴突长度，计算与星形胶质细胞重叠的皮层神经元轴突长度与该皮层神经元轴突总长度的百分比，通过One-way ANOVA比较各组数据之间的差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.无统计学意义。统计数据来自3次独立的实验，每次每组统计不少于30个神经元。该实验显示，表达contactin 6的皮层神经元轴突在接触到表达contactin 6的星形胶质细胞后，不再向其表面生长、延伸，提示contactin 6介导了二者之间的接触性抑制作用。而表达contactin 6的皮层神经元轴突在接触到contactin 6ΔIgG2的星形胶质细胞后，倾向于向其表面生长、延伸，提示IgG2结构域缺失破坏了contactin 6之间的同源性相互作用，解除了contactin 6介导的接触性抑制作用。
实施例3：Western blot鉴定可识别contactin 6蛋白IgG2及IgG3结构域的单克隆抗体
1.293T细胞瞬时转染pcDNA3.1-contactin 6-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-Myc、pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG3-Myc及pcDNA3.1-contactin 6ΔIgG2-3-Myc质粒，48h后，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，裂解后离心取上清。
2.蛋白样品经BCA法定量后，上样至SDS-PAGE胶电泳，通过western blot进行分析。一抗采用通过contactin 6蛋白免疫小鼠、杂交瘤技术制备的两个单克隆抗体(编号分别20H9和23F8)进行孵育，二抗采用HRP anti-mouse IgG孵育。如图6所示，单克隆抗体20H9既能够识别全长的contactin 6蛋白，又能够识别contactin 6ΔIgG2、contactin 6ΔIgG3、contactin6ΔIgG2-3突变体，表明该单克隆抗体表位位于contactin 6的IgG2、IgG3、IgG2-3结构域以外的区域；单克隆抗体23F8能够识别全长的contactin 6蛋白，不能识别contactin 6ΔIgG2、contactin 6ΔIgG3、contactin 6ΔIgG2-3突变体，表明该抗体表位位于IgG2、IgG3、IgG2-3结构域，可特异性识别contactin 6IgG2、IgG3、IgG2-3结构域。由此，利用contactin 6ΔIgG2、contactin 6ΔIgG3、contactin 6ΔIgG2-3突变体的重组表达载体，可进一步筛选出更多的特异性识别contactin 6IgG2、IgG3结构域的单克隆抗体，用以阻断contactin 6同源性相互作用介导的生物学功能。
实施例4：Cell-based ELISA鉴定可识别contactin 6蛋白IgG2及IgG3结构域的单克隆抗体
在96孔板中接种293T细胞，每孔约5000个细胞，分别瞬时转染人源全长NB-3(h-NB-3)、鼠源全长NB-3(m-NB-3)、IgG2结构域缺失突变体(NB-3△IgG2-Myc)、IgG3结构域缺失突变体(NB-3△IgG3-Myc)及IgG2-3结构域共缺失突变体(NB-3△IgG2-3-Myc)质粒，以转染空载(vector)质粒及不转染质粒孔作为阴性对照，转染后37℃、5％CO2条件下培养细胞。当细胞密度至90％，4％多聚甲醛溶液室温固定30min后室温封闭2h，依次加入一抗(待检测的单克隆抗体)及二抗工作液室温敷育1h，加入ELISA显色液显色反应5-10min，加入ELISA显色终止液终止反应。酶标仪读取450nm处吸光值(OD450)并进行量化比较(图7)。Cell-based ELISA结果显示，23F8、24C11、1C8、9B2和36A6共5株杂交瘤细胞分泌的抗体可特异性识别人源全长NB-3蛋白及鼠源全长NB-3蛋白，而均不能识别NB-3蛋白IgG2缺失突变体(NB-3△IgG2)、IgG3缺失突变体(NB-3△IgG3)及IgG2-3共缺失突变体(NB-3△IgG2-3)，提示上述单克隆抗体识别表位位于NB-3蛋白IgG2、IgG3结构域。由此，利用contactin 6ΔIgG2、contactin 6ΔIgG3、contactin6ΔIgG2-3突变体的重组表达载体，可进一步筛选出更多的特异性识别contactin 6IgG2、IgG3结构域的单克隆抗体，用以阻断contactin 6同源性相互作用介导的生物学功能。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州大学
<120> contactin 6蛋白突变体及其编码基因、表达载体与应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3117
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgaggttgc tatggaaact ggtaattctg ctgccactca taaactcttg tgcaggtgag 60
ggtcgtttca gccgtcctat ttttatccag gagccacaag atgtcatttt tcctttggat 120
ttatctagat ctgaaattat tctgacttgt actgcaaatg gatacccttc tccccattac 180
aggtggaaac agaatggtac agatattgac ttcggcatga cttatcacta taggttggat 240
ggaggcagtt tggccatcag cagccccaga acagatcaag atattggcat ataccagtgt 300
ctggccacca atcctgtggg caccattctg agtagaaaag ccaagctaca gtttgcatat 360
attgaagact ttgaaaccaa aaccagaagc acagtatctg tccgagaagg tcaaggagtg 420
gtactactct gtggcccacc accacatttt ggagaattat catatgcctg gaccttcaat 480
gatagccctt tgtatgttca agaggacaag cgaagatttg tatctcaaga cacagggaac 540
ttgtactttg ccaaagtaga accatctgat gtgggcaatt atacttgctt tgtcacaaac 600
aaagaggccc atagaagtgt ccaaggtcca cctacgcctt tagtgctgcg cactgatggt 660
gtcatggggg aatatgagcc aaagattgaa gtgcgttttc ctgaaacaat acaagctgca 720
aaggattcat ctataaaact ggaatgcttt gcccttggaa atccagtccc tgatattagt 780
tggaaaaggt tggatggaag cccgatgcca gggaaaatca agtacagcaa atcccaagct 840
atccttgaaa tccccaagtt ccaacaagag gatgaaggct tctatgaatg catcgcaggt 900
aaccttcgag gaagaaacct tgcaaagggt caactaattt tctatgctcc cccagaatgg 960
gaacagaaaa tccaaaacac atacctttct atctatgaca gcttgttttg ggaatgcaaa 1020
gctagtggaa atccaaatcc ttcgtacacg tggctaaaga atggtcaacg tctcaacaca 1080
gaagaaagaa ttcagattga aaatgggact cttatcatca ccatgctgaa catttcagac 1140
tctgggatct accagtgtgc tgcagaaaac aaatatcaga caatttatgc aaatgcagaa 1200
ttgagagttt tagcctcagc tccagatttc tccaaaaatc ccattaaaaa aatttcagtt 1260
gttcaagttg gtggtgatat ttctattgaa tgcaaaccaa atgctttccc caaagcatcg 1320
atttcctgga aaagaggaac agagaacctg aaacaaagta aaagagttct tttcttggag 1380
gatggcagcc ttaagatatg caatgttacc agagcagatg ctgggtctta cacctgtgta 1440
gctacaaatc aatttggcaa tgggaaaagc agtggaggtc tcgtcgtgaa agagagaacg 1500
atcattacag taccaccatc taaaatggat gttacagttg gagagagcat cgtcttaccc 1560
tgccaagtgt ctcatgaccc caccatggaa gttctatttg tttggtactt taatggagat 1620
attatagatt taaagaaagg agtagcccat tttgaacgaa ttgggggaga atctgttggg 1680
gatttgatga taaggaatat tcaattaggc cattcgggaa aatatctatg cacagtacaa 1740
acaacactag aacgcttgtc tgctgtagct gatatcattg tgagaggtcc cccagggccc 1800
ccagaggatg taaaagtgga gcacatctct agtacgacct cccagctcag ctggagacca 1860
ggtcctgata ataacagccc cattcaaatt tttactattc aaactcggac acccttttct 1920
gtgggctggc aagcggttgc tacagtccct gaaattctca atggacagac atacaatgca 1980
acagtcgttg gtttgagtcc ttgggtggaa tacgaatttc gtgttgttgc tgggaacaac 2040
attggaattg gagagccaag caaaccatca gagctgctga gaaccaaagc atcagtcccc 2100
aatgtggcac caggaaatat caatggaggc ggtggaagca gatcggaact tgtcattacg 2160
tgggaggcca ttcctgaaga actacagaat ggagaggggt ttggatatat cgtcatgttt 2220
cggccagtag gcacaaccgc ctggatgaaa gaaagggtgg ctcttgtaga atcatccaag 2280
ttcatctata gaaatgaaag catcatgcct ctgtctccct ttgaagtcaa agtgggagtg 2340
tacaataatg aaggagaggg atccctgagt actgtgacca ttgtctactc tggggaagat 2400
gagcctcagc tggccccaag aggaacttct gtccagagtt tttctgcttc tgaaatggag 2460
gtttcctgga atgctattgc ttggaataga aacactggaa gagtgctagg ctatgaggtc 2520
ttatactgga cagacaactc caaagaatct atgattggta aaattagagt cagtggaaat 2580
gtcacaacca agaacatcac aggactaaga gctaatacga tttactttgc ctctgtgaga 2640
gcctataaca ctgcagggac tggaccctca agtctgccag ttaatgtcac caccaaaaag 2700
tcccctccta gccaaccacc agcaaacatt gcctggaagc tgtcaaattc taaattatgc 2760
ttgaactggg agcatgtaaa aaccatggaa aatgagtctg aagtgctggg ctacaagatc 2820
ctctatcggc agaaccgaca gagtaaaact catattttgg aaacaaataa tacatctgct 2880
gaactcctgg ttccatttga agaagactat ttgattgaaa tcagaacagt cagtgatggt 2940
ggagatggaa gcagcagtga ggaaatcaga attccagaac aaaaactcat ctcagaagag 3000
gatctgaaaa tgtcaagttt gagttccaca ggagttcaga tctcgaagcc cagcacccag 3060
tccctgtcaa tggttggggt tttttactgt tttgctattc acccactttc gagatag 3117
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
gaagactttg aaaccaaaac cagaagcaca gtatctgtcc gagaaggtca aggagtggta 60
ctactctgtg gcccaccacc acattttgga gaattatcat atgcctggac cttcaatgat 120
agccctttgt atgttcaaga ggacaagcga agatttgtat ctcaagacac agggaacttg 180
tactttgcca aagtagaacc atctgatgtg ggcaattata cttgctttgt cacaaacaaa 240
gaggcccata gaagtgtcca aggtccacct acgcctttag tg 282
<210> 3
<211> 246
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ccaaagattg aagtgcgttt tcctgaaaca atacaagctg caaaggattc atctataaaa 60
ctggaatgct ttgcccttgg aaatccagtc cctgatatta gttggaaaag gttggatgga 120
agcccgatgc cagggaaaat caagtacagc aaatcccaag ctatccttga aatccccaag 180
ttccaacaag aggatgaagg cttctatgaa tgcatcgcag gtaaccttcg aggaagaaac 240
cttgca 246
<210> 4
<211> 561
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
gaagactttg aaaccaaaac cagaagcaca gtatctgtcc gagaaggtca aggagtggta 60
ctactctgtg gcccaccacc acattttgga gaattatcat atgcctggac cttcaatgat 120
agccctttgt atgttcaaga ggacaagcga agatttgtat ctcaagacac agggaacttg 180
tactttgcca aagtagaacc atctgatgtg ggcaattata cttgctttgt cacaaacaaa 240
gaggcccata gaagtgtcca aggtccacct acgcctttag tgctgcgcac tgatggtgtc 300
atgggggaat atgagccaaa gattgaagtg cgttttcctg aaacaataca agctgcaaag 360
gattcatcta taaaactgga atgctttgcc cttggaaatc cagtccctga tattagttgg 420
aaaaggttgg atggaagccc gatgccaggg aaaatcaagt acagcaaatc ccaagctatc 480
cttgaaatcc ccaagttcca acaagaggat gaaggcttct atgaatgcat cgcaggtaac 540
cttcgaggaa gaaaccttgc a 561
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
cacagtggcg gccgctcgag ggatgaggtt gctatg 36
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
cccccatgac accatcagtg cgcagaatat atgcaaactg tagcttggct 50
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
ctgcgcactg atggtgtcat gggggaatat gagccaaaga ttgaag 46
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
gaagggccct ctagactcga gctatctcga aagtgggtga atagc 45
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
cagatatcca gcacagtggc ggccgctcga gatgaggttg ctatggaaac tggta 55
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ggagcataga aaattagttg acccttctca tattccccca tgacaccatc 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
gatggtgtca tgggggaata tgagaagggt caactaattt tctatgctcc 50
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
agcgggttta aacgggccct ctagactcga gctatctcga aagtgggtga atagcaa 57
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
cagatatcca gcacagtggc ggccgctcga gatgaggttg ctatggaaac tggta 55
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
gagcatagaa aattagttga cccttaatat atgcaaactg tagcttggct 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
agccaagcta cagtttgcat atattaaggg tcaactaatt ttctatgctc 50
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
agcgggttta aacgggccct ctagactcga gctatctcga aagtgggtga atagcaa 57

Claims (5)

1.一种contactin 6蛋白突变体，其特征在于，所述的突变体是缺失contactin 6蛋白中的IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域；
所述的缺失contactin 6蛋白中的IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域是将编码contactin 6蛋白中的IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域的核苷酸缺失；
编码所述的contactin 6蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
编码IgG2结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码IgG3结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码IgG2-3结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种权利要求1所述的contactin 6蛋白突变体的编码基因。
3.一种携带权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。
4.一种表达权利要求1所述的contactin 6蛋白突变体的转化体。
5.一种权利要求1所述的contactin 6蛋白突变体非诊断、非治疗目的的应用，其特征在于，所述的应用包括：
缺失IgG2结构域的contactin 6蛋白突变体在介导contactin 6蛋白同源性相互作用引起的接触性抑制中的应用；
缺失IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域的contactin 6蛋白突变体在鉴定可识别contactin 6蛋白IgG2结构域、IgG3结构域或IgG2-3结构域的单克隆抗体中的应用。
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免疫球蛋白超家族分子在神经系统中的分布及功能;陈丽华等;《细胞生物学杂志》;20001231(第02期);全文 *
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