CN109652555A

CN109652555A - 一种诊治恶性肿瘤的分子标志物

Info

Publication number: CN109652555A
Application number: CN201910101200.9A
Authority: CN
Inventors: 王传贵; 孙莲慧; 张胜萍; 范广建; 胡晨; 侯照远; 李谦; 潘波
Original assignee: Shandong Bingtai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Bingtai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-04-19

Abstract

本发明提供一种诊治恶性肿瘤的分子标志物，属于医药技术和分子生物学技术领域。本发明首次证明了CAP1是分泌蛋白，且分泌依赖于203‑330氨基酸序列，分泌出来的CAP1可以结合到细胞膜上，促进肿瘤细胞的迁移，其中膜结合序列也依赖于203‑330氨基酸序列。同时，本发明证明了CAP1能够促进非小细胞肺癌以及宫颈癌细胞的迁移，为相关疾病的诊断和治疗提供了新的靶点，从而指导临床医师为受试者提供预防方法或者治疗方案。

Description

一种诊治恶性肿瘤的分子标志物

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种诊治恶性肿瘤的分子标志物。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肿瘤转移是恶性肿瘤的显著特征，也是肿瘤患者不良预后和临床抗肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因。恶性肿瘤的转移是多基因参与并相互作用的多步骤过程，其中恶性肿瘤细胞通过迁移和运动穿过水解破坏的组织间隙向局部浸润或经血管和淋巴管向远处纵深发展是肿瘤转移的重要因素。因此对于肿瘤细胞迁移的研究和寻找开发降低或消除肿瘤转移的药物成为目前肿瘤防治研究领域的关键所在。

在开发恶性肿瘤抗迁移的药物研发中，分泌蛋白由于富含有新的生物标记和药物靶标，已经成为开发新药的焦点。分泌蛋白是由活细胞分泌的一类分子，在细胞信号传导、通信和迁移中发挥重要的作用。分泌蛋白作为肿瘤早期标志物的研究已经有很多报道，包括胰腺癌、食道癌和肝癌中均发现特殊的血清分泌蛋白。分泌蛋白在检测肿瘤进程方面也有重要的参考价值，参与肿瘤的侵袭和转移，如通过比较结肠癌细胞以及对应的肿瘤相关成纤维细胞系的分泌蛋白组之间的差异，筛选出XII基因跟结肠癌的转移相关。然而，分泌蛋白在细胞外如何发挥作用，如何调节肿瘤细胞的迁移研究不清楚，如何将分泌蛋白作为肿瘤转移标志物的研究也非常有限，发现和鉴定新的肿瘤转移相关的分泌蛋白，对于肿瘤的临床诊断、预后评价、干预治疗都有重要的指导意义，开展分泌蛋白研究也可能为抗体药物靶标的筛选和疫苗制备提供更多的选择。

肿瘤细胞迁移能力的获得是由一系列细胞内在特性的改变决定的，包括生长速率、粘附性、移动性、对免疫细胞攻击的敏感性、分泌水解酶和血管生长因子等。此外，迁移细胞表面分子可充当与邻近的正常细胞、肿瘤细胞以及基质细胞相互作用的配体或受体，在肿瘤侵入和迁移过程中发挥重要作用。近年来，对这些粘附分子进行了深入的研究，现已证实细胞外基质(ECM)中的主要分子如纤粘蛋白和层粘蛋白的核心序列对细胞粘着、散布和迁移起着重要作用。另外，免疫球蛋白、选择素、钙粘素和整合素家族表达产物被确认为重要的细胞间及细胞与基质之间的粘附分子或受体。细胞骨架及其附属结构是细胞活动和肿瘤细胞转移的基础，各种微管、微丝的聚合与解聚，装配与去装配的动态变化以及膜皱褶、伪足的变化是控制肿瘤细胞迁移和运动的重要因素，一些与细胞骨架活动有关以及激活信号传导通路的因子，在促成转移性细胞亚群以及肿瘤细胞迁移和运动的过程中，起着非常重要的作用。

腺苷酸环化酶相关蛋白家族是一类与细胞骨架运动密切相关的蛋白，包括两个成员CAP1和CAP2，其中，CAP1分布较广，在很多组织内都能检测到，而CAP2分布相对比较狭隘，仅在脑、心脏骨骼肌和皮肤中的表达较为明显。发明人发现，CAP蛋白对肌动蛋白的多聚化具有负调控作用，维持肌动蛋白处于单体肌动蛋白的状态，抑制单体肌动蛋白和多聚肌动蛋白之间的转化，从而抑制细胞骨架的运动。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种诊治恶性肿瘤的分子标志物CAP1。经试验研究证明，CAP1是一种分泌蛋白，其分泌依赖于203-330氨基酸序列，分泌出来的CAP1可以结合到细胞膜上，能够促进肿瘤细胞的迁移，而且膜结合序列也依赖于其203-330氨基酸序列。因此，CAP1蛋白可以作为诊治肿瘤细胞特别是恶性肿瘤细胞的分子标志物。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子在制备恶性肿瘤标志物中的应用。

进一步的，CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子制备恶性肿瘤标志物中的应用，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展。

所述恶性肿瘤的进展包括肿瘤细胞的增殖、生长和/或迁移；更进一步的，所述恶性肿瘤的进展包括肿瘤细胞的迁移；

其中，所述CAP1蛋白具体可为人源CAP1蛋白。

进一步的，所述CAP1蛋白具体可为如下任一：

(a)氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的蛋白质；

(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有且具有相同功能的蛋白质；

(c)与(a)-(b)任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(d)在(a)-(c)中任一限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述恶性肿瘤包括但不限于宫颈癌、非小细胞肺癌。

其中，宫颈癌细胞具体为Hela细胞；非小细胞肺癌细胞具体为H1299细胞或A549细胞。

本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展的组合物，其包含CAP1蛋白、编码CAP1蛋白的核酸分子、CAP1蛋白的核酸亲和配体和/或肽亲和配体。

所述恶性肿瘤的进展至包括肿瘤细胞的增殖、生长和/或迁移；更进一步的，所述恶性肿瘤的进展包括肿瘤细胞的迁移；

所述恶性肿瘤包括但不限于宫颈癌、非小细胞肺癌。

所述亲和配体至少包括对CAP1蛋白特异性的适体、对CAP1蛋白特异性的抗体和/或对CAP1蛋白特异性的抗体变体。

更进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展的组合物。

本发明的第三个方面，提供能够抑制CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子表达和/或活性降低的物质在如下(a')-(c')至少一种中的应用：

(a')抑制恶性肿瘤细胞的迁移，或制备用于抑制肿瘤细胞迁移的产品；

(b')抑制恶性肿瘤细胞的增殖，或者制备用于抑制恶性肿瘤细胞增殖的产品；

(c')抑制恶性肿瘤细胞的生长，或者制备用于抑制恶性肿瘤细胞生长的产品。

本发明的第四个方面，提供一种用于治疗或预防恶性肿瘤的药物组合物，其包含抑制CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子表达和/或活性降低的物质，如CAP1特异的抗体、针对编码CAP1蛋白的核酸分子的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA；进一步的，所述抗体为人抗体。

在本发明中，恶性肿瘤包括但不限于宫颈癌、非小细胞肺癌，“治疗或预防”指的是能够抑制恶性肿瘤细胞的迁移、增殖和/或生长。

进一步的，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。

优选的，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

进一步优选的，所述药物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明有益效果：本发明首次证明了CAP1是分泌蛋白，且分泌依赖于203-330氨基酸序列，分泌出来的CAP1可以结合到细胞膜上，促进肿瘤细胞的迁移，其中膜结合序列也依赖于203-330氨基酸序列。同时，本发明证明了CAP1能够促进非小细胞肺癌以及宫颈癌细胞的迁移，为相关疾病的诊断和治疗提供了新的靶点，从而指导临床医师为受试者提供预防方法或者治疗方案。

附图说明

图1为实施例1中检测CAP1的分泌情况图；其中图1a为瞬时过表达CAP1的293T细胞在血清饥饿下CAP1的分泌情况；图1b为稳定表达CAP1的HeLa稳转细胞株在血清饥饿下的CAP1分泌情况；图1c为细胞内源的CAP1蛋白在血清饥饿下分泌情况。

图2为实施例2中将CAP1氨基酸序列分割成几段，寻找CAP1蛋白分泌所依赖的必须氨基酸序列电泳图。

图3为实施例3中体外纯化的CAP1蛋白在细胞中的重定位；图3a为细胞骨架蛋白是否进入细胞的western blot检测图，图3b为CAP1蛋白进入细胞后重定位的免疫荧光检测图；图3c为CAP1蛋白与细胞孵育不同时间后在细胞中重定位的免疫荧光检测图。

图4为实施例4中体外纯化的CAP1蛋白在细胞中重定位所依赖的氨基酸序列；其中，图4a为CAP1不同突变体进入细胞的western blot检测图，图4b为CAP1不同突变体进入细胞的免疫荧光检测图。

图5为实施例5中检测体外CAP1蛋白与细胞孵育以后对细胞迁移的作用；其中，图5a为细胞划痕实验检测CAP1蛋白对HeLa细胞迁移的影响图，图5b为Transwell实验检测CAP1蛋白对H1299细胞迁移的影响，图5c为Transwell实验检测CAP1蛋白对A549细胞迁移的影响图。

图6为实施例6中体外CAP1蛋白对细胞中因缺失CAP1导致迁移能力的影响；其中，图6a为CAP1敲低稳转株中敲低的效率检测图，图6b为CAP1蛋白对CAP1敲低稳转细胞株迁移能力的影响图，图6b左侧图为各处理组细胞划痕实验图；图6b右侧图为各处理组细胞数目比率图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明一个具体实施方式中，提供CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子在制备恶性肿瘤标志物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子在制备恶性肿瘤标志物中的应用，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展。

其中，所述CAP1蛋白具体可为人源CAP1蛋白。

进一步的，所述CAP1蛋白具体可为如下任一：

(a)氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的蛋白质；

所述恶性肿瘤包括但不限于宫颈癌、非小细胞肺癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展的组合物，其包含CAP1蛋白、编码CAP1蛋白的核酸分子、CAP1蛋白的核酸亲和配体和/或肽亲和配体。

所述恶性肿瘤包括但不限于宫颈癌、非小细胞肺癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展的组合物。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测、诊断、监测或预测恶性肿瘤的进展的方法，所述方法至少包括下述步骤：测定样品中CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子的水平。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于治疗或预防恶性肿瘤的药物组合物，其包含抑制CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子表达和/或活性降低的物质，如CAP1特异的抗体、针对编码CAP1蛋白的核酸分子的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA；进一步的，所述抗体为人抗体。

本发明又一具体实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约0.1％至约99.9％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液；

本发明又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂；

本发明又一具体实施方式中，所述药物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例1

CAP1蛋白是分泌蛋白。

1、实验材料

1.1细胞及培养耗材

人肾胚细胞293T，人宫颈癌细胞HeLa、细胞培养皿、培养板，细胞培养基：

DMEM+10％胎牛血清

1.2试剂

Flag-M2-beads(sigma)、Protein A/G beads(Abmart)

配制的试剂

调节PH值至7.4，定容至1L，高压蒸汽灭菌40min后备用。

IP lysis buffer

RIPA buffer

加水定容到100ml，抽滤，分装，用前加蛋白酶抑制剂。

磷酸钙转染基本试剂配制：

调节PH值至7.05，微调至最合适的PH值，定容至1L，0.22μm的滤膜过滤。

2.5M CaCl₂ 100mL

CaCl₂ 3.874g

H₂O 50mL

用0.22μm的滤膜过滤，分装保存。

2、实验方法

2.1Western blot的具体实验步骤如下所述：

(1)配制变性聚丙烯酰胺凝胶：将胶板清洗干净，按正确的顺序安置在制胶架上；检漏；配制分离胶，ddH₂O密封；待分离胶凝固，配制浓缩胶，然后插上梳子，待浓缩胶完全凝固后就可以使用了。

(2)电泳：将配好的胶与电泳槽安置好；将running buffer加入电泳槽中；上样；将电泳仪的电压调到80V开始电泳，当loading完全进入分离胶时，将电压调高到120V，直至loading到达分离胶的底部，结束电泳。

(3)转膜：将PVDF膜在甲醇中浸泡30s后也放入transfer buffer中备用；将transfer buffer加入到转膜槽中，并提前用冰水混合物冷却；按正确的顺序将海绵、滤纸、胶和PVDF膜放置好，然后都放在转膜槽的卡槽中；启动电泳仪，使用80V电压进行转膜，一般所需的时间是90min。

(4)封阻：将转好膜的PVDF膜放入PBST配制的5％的脱脂牛奶，室温摇床孵育1-1.5小时。

(5)加一抗：用5％脱脂牛奶将特异性的一抗稀释到适当的浓度，室温摇床上孵育2小时或4℃摇床过夜。然后用PBST室温洗涤3-4遍，每次10min。

(6)加二抗：用5％脱脂牛奶将对应的二抗(偶联有HRP)稀释到所需要的浓度，室温下孵育2-2.5小时，然后用PBST室温洗涤4-5遍，每次10分钟。

(7)显影及定影：在暗房中，吸掉PVDF膜上面的液体，将混合好的发光试剂A、B液滴在膜上；将PVDF膜放在避光盒子中，覆盖上X光片；将X光片依次显影和定影；冲洗干净X光片，于烘箱中烘干，即可分析结果。

2.2磷酸钙颗粒转染

(1)配制A液(16ulCaCI+目的质粒+无菌水共300ul)，配制B液(300ul2×HEPES)，将两种试剂各自混匀之后，用电动移液枪向B液均匀吹泡，同时用移液枪吸取A液往B液里滴加，速度要均匀。

(2)吹完后，轻轻混匀A、B液，将600ul混合物轻轻的均匀的滴加进入待转染的6cm皿中，轻摇混匀。

(3)将转染后的细胞放进培养箱中继续培养，约1小时左右即可在显微镜下观察形成的钙颗粒的大小。

(4)大约4-6小时，将转染的细胞换成新鲜的培养基，具体时间可根据钙颗粒大小的情况决定。

(5)12小时后，可以在荧光显微镜下观察GFP荧光蛋白的表达情况，16小时左右根据荧光的表达可以判断转染效率的高低，24小时左右目的蛋白表达。

(6)根据实验需求，在目的蛋白表达以后可收细胞做后续实验。

3、结果与分析

图1a.将Flag-CAP1及与细胞骨架相关的其他质粒(Flag-C3G、Flag-CBL、Flag-TC10)转染到293T细胞中，24小时以后对细胞进行血清饥饿处理，4小时以后，分别收集培养基和细胞，细胞用RIPA裂解，得到细胞裂解液(Lysate)；培养基用Flag-M2-beads富集细胞外的Flag标签的蛋白，Western blot实验检测培养基中富集的情况，发现只有CAP1明显的被富集下来，证明CAP1是分泌蛋白。图1b.将图1a中所述质粒构建到病毒表达载体上，包装病毒，构建HeLa的过表达稳转细胞株，将细胞株进行血清饥饿处理4小时，分别收集培养基和细胞，分别检测细胞中质粒的表达情况和培养基中的分泌情况，结果显示过表达CAP1的稳转细胞中有大量的CAP1分泌到细胞外。图1c.将HeLa细胞用无血清培养基培养不同时间(如图所示)，收集细胞及培养基，细胞用RIPA裂解，培养基用TCA沉淀法沉淀培养基中的蛋白，用抗CAP1的抗体检测培养基中分泌的CAP1蛋白，证实内源性的CAP1可以分泌到细胞外。以上结果证明，无论外源过表达还是内源的CAP1蛋白均能分泌到细胞外。

实施例2

CAP1蛋白的分泌依赖于204-330氨基酸序列。

1、实验材料

1.1细胞

人肾胚细胞293T，人宫颈癌细胞HeLa

培养基：DMEM+10％胎牛血清

1.2质粒

Flag-CAP1缺失突变体是以Flag-CAP1为模板，构建的缺失突变体

1.3试剂

Flag-M2-beads(sigma)，RIPA buffer

2、实验方法

该实施例中涉及到CAP1缺失体的构建,具体操作如下：

(1)引物设计

通过浏览NCBI网站，下载CAP1基因的序列，使用相关软件查找出基因序列中所包含的酶切位点，研究所用载体的图谱，选择合适的限制性内切酶，将CAP1分成如图2所示的五段，通过primer-5等软件辅助设计所需的上、下游引物。

(2)PCR扩增目的基因

PCR体系如下：

将配好的PCR反应液，混匀，瞬离，放入PCR仪中反应。反应条件：先94℃3min；然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，此步35个循环；最后72℃10min。

(3)扩增的目的片段的割胶回收、酶切

PCR结束后，取适量产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察胶上是否有预计分子量的主要产物带，并将目的条带进行割胶回收。

a.根据回收DNA片段的大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶(加适量的EB)。

b.向PCR产物，加入6×DNA loading稀释到1×，开始点样。

c.加样后立即通电进行电泳，电压为120V，20分钟以后停止电泳。

d.取出凝胶，在紫外灯下观察条带所在位置，然后用凝胶成像系统拍照保存，切下目的条带，用天根琼脂胶回收试剂盒回收目的基因。

e.选用pcDNA3.0Flag载体，将载体和PCR产物用同样的酶分别同时进行酶切，以产生相同的酶切位点。酶切条件为37℃下3-4小时。用琼脂糖凝胶电泳分离载体和PCR产物的酶切产物，然后用胶回收试剂盒(试剂盒购自天根生化科技有限公司)回收需要的产物。具体步骤见试剂盒说明书。

(4)连接

实验原理：在一定的条件下，T4DNA连接酶可以催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键，从而将两个片段连接起来。向体系中加入1μl载体，1μl T4连接酶，1μl buffer，7μl目的基因片段，混合均匀后，放到16℃水浴锅中8-12小时。

(5)转化

利用热激法原理进行转化，将50微升刚融化的感受态加入到连接产物中，冰上放置30分钟，然后放入42℃水浴锅中热激60秒，然后放到冰上5分钟，再加入700微升的无抗性的LB，37度摇床复苏45分钟，低速离心后，涂板到相应抗性的平板上，倒置放到37度培养箱培养12小时。

(6)小摇并提取质粒

在超净工作台中，挑取转化所得的克隆，接种到相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养12-16小时，然后保菌，将剩余的菌液使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，详细步骤可查阅说明书。

(7)酶切鉴定、测序分析及验证表达

取1μg质粒，选择对应的酶和Buffer进行酶切鉴定。37℃酶切处理3h，然后用琼脂糖凝胶电泳检测。将酶切验证正确的质粒挑取一个克隆送去测序公司测序，将反馈的结果进行分析，检测是否构建成功。将构建成功的质粒瞬转到293T细胞中，通过免疫印迹实验验证表达。

3、实验结果

利用上述突变缺失体构建方法，构建Flag-CAP1的缺失突变体(1-203aa,204-475aa,1-330aa，331-475aa,Δ204-330aa)，然后转染到293T细胞中，24小时以后对细胞进行血清饥饿处理4小时，分别收集培养基和细胞，用RIPA裂解细胞，用Flag-M2-beads富集细胞外的Flag标签的蛋白，WB检测到CAP1全长、204-475aa、1-330aa都可以明显的分泌到细胞外，而1-203aa,331-475aa以及Δ203-330aa都不可以分泌出去，说明CAP1的分泌依赖于204-330aa。结果如图2所示，204-330氨基酸序列介导CAP1蛋白的分泌。

实施例3

体外纯化的CAP1蛋白可结合到细胞膜上。

1、实验材料

1.1细胞与培养基

人肾胚细胞293T，培养基：DMEM+10％FBS

1.2质粒

His标签的质粒是用于原核表达蛋白并纯化

1.3试剂

His beads(Novagen)，RIPA buffer以及下述配制的试剂

纯化蛋白所需的试剂：

(1)Lysis buffer(用5N NaOH调节PH至8.0)配方1L

NaH₂PO₄6g

NaCl 17.5g

咪唑0.68g

(2)Wash buffer(用5N NaOH调节PH至8.0)

配方1L

NaH₂PO₄6g

NaCl 17.5g

咪唑1.36g

(3)Elution buffer(用5N NaOH调节PH至8.0)

配方1L

NaH₂PO₄6g

NaCl 17.5g

咪唑17.0g

注：使用时lysis buffer和wash buffer中添加DTT、PMSF以及甘油等

(4)20×溶菌酶(使用时终浓度是1mg/ml)

将2g溶菌酶粉末溶于100ml的10mM的Tris-HCl(PH为8.0)中即可。

(5)1000×IPTG

称取0.4766gIPTG溶于20ml的灭菌水中，用0.22微米的滤膜过滤，分装到2.0ml的灭菌离心管中，储藏在-20℃冰箱中。

(6)200×DTT

称取DTT粉末7.725g溶于50ml的0.01M乙酸钠溶液中(PH为5.2)，用0.22微米的滤膜过滤，分装到2.0ml的灭菌离心管中，储藏在-20℃冰箱中。

免疫荧光所需的试剂：

(1)10×多聚赖氨酸(1mg/ml)

将10mg多聚赖氨酸粉末溶于10ml PBS中，用0.22微米的滤膜过滤，分装后放于-20℃冰箱保存，使用时用灭菌的重蒸水稀释为1×多聚赖氨酸，放于4℃冰箱备用。

(2)4％多聚甲醛

称取20mg多聚甲醛粉末，溶于500ml 1×PBS溶液中。充分溶解后，分装好放于－20℃冰箱储存。

2、实验方法

该实施例中涉及到的实验方法具体操作步骤如下：

2.1His蛋白纯化

(1)构建蛋白纯化所需要的质粒，测序正确以后将其转化到Transetta菌株中，挑取单克隆，做小诱，设置不同的诱导温度和不同的OD，探索蛋白诱导的最佳条件。

(2)按照对蛋白就行小量诱导时摸索的诱导条件，扩大培养进行大诱。将活化的菌液加入到LB中，在37℃中220rpm摇至小诱时摸索的OD值，加入IPTG，然后将摇床温度调至摸索的温度，合适时间后收取菌液。

(3)将菌液离心后，加入lysis buffer、溶菌酶、PPMSF、DTT等，冰上静止一段时间后，用超声仪进行超声。

(4)将超声完成的裂解液高速离心，收集上清于新的100ml离心管中，加入偶联镍的beads，放到4度冰箱中，用静音混匀器摇2-4小时。

(5)将溶液过柱，然后用wash buffer冲洗3遍。

(6)用Elution buffer将蛋白质洗脱下来，用PBS在4度冰箱进行透析，测浓度，检测所纯化蛋白的质量。

2.2免疫荧光技术

(1)处理板：将盖玻片放入24孔板中，每孔用200ul多聚赖氨酸处理，紫外照射风干约45min；

(2)接入细胞：接入适量的待检测细胞，待细胞长到50％时，进行转染，根据实验需求，转染24-48小时后用于实验；

(3)细胞固定：洗掉培养基，常温PBS漂洗细胞一遍，用4％多聚甲醛固定细胞，在摇床上缓慢摇动10分钟；

(4)细胞打孔：吸去固定液，然后用的PBS清洗两遍，用含0.3％的TritonX-100的PBS孵育10分钟。

(5)细胞封阻：吸去TritonX-100的PBS，用PBS洗3次，每次5分钟，之后，用2％BSA室温封阻30分钟；

(6)加一抗：用2％BSA按比例稀释一抗，室温孵育2个小时或4℃孵育过夜；

(7)加二抗：洗去一抗，PBS洗3次，每次5分钟，用2％BSA按比例稀释荧光二抗，室温孵育2个小时，此步以后要避光；

(8)染核：洗掉二抗，PBS清洗3遍，然后DAPI作用2分钟；

(9)封片：吸去DAPI，封片，荧光显微镜下观察并拍片。

3、实验结果

图3a.构建原核表达的质粒His-GFP-CAP1及与细胞骨架相关的其他质粒(His-GFP-C3G/CBL/TC10)，并纯化得到蛋白，将各蛋白与HeLa细胞孵育12小时，将细胞培养基弃掉，用PBS清洗三遍，然后将细胞用RIPA裂解，WB检测细胞中吸收的蛋白，结果显示在细胞裂解液里只检测到CAP1蛋白，接下来将图3a所述处理的细胞清洗以后，做免疫荧光染色观察CAP1的定位，即将细胞用4％多聚甲醛固定，将细胞骨架用α-Tubulin染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色，绿色代表细胞吸收的蛋白，可以看到CAP1结合在细胞的细胞膜上，证明CAP1蛋白与细胞孵育以后，能重新定位在细胞膜上。

实施例4

204-330氨基酸序列介导CAP1蛋白定位到细胞膜上。

1、实验材料

1.1细胞与培养基

人宫颈癌细胞HeLa，培养基：DMEM+10％FBS

1.2质粒

原核表达质粒His-GFP-CAP1缺失突变体是以His-GFP-CAP1全长为模板，构建的缺失突变体。

1.3试剂

RIPA buffer，PBS以及蛋白质纯化与免疫荧光染色所需的各试剂(配制方法如实施例3所述)

2、实验方法

缺失突变体构建方法如实施例2所述，蛋白质纯化技术与免疫荧光技术方法如实施例3所述。

3、实验结果

图4a.构建原核表达的质粒His-GFP-CAP1缺失突变体并纯化出蛋白，将各蛋白与HeLa细胞孵育12小时以后，将细胞培养基弃掉，用PBS清洗三遍，然后将细胞用RIPA裂解，WB检测细胞中吸收的蛋白，细胞裂解液中可以明显检测到His-GFP-CAP1全长以及His-GFP-CAP1-204-330aa两个蛋白。图4b.如图4a所述处理的细胞清洗以后，用4％多聚甲醛固定，将细胞骨架用α-Tublin染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色，绿色代表细胞吸收的蛋白，同样，可以看到CAP1全长以及包含有204-330aa片段的蛋白(His-GFP-CAP1-204-330和His-GFP-CAP1-204-475)均呈现明显细胞膜定位。结果证明204-330氨基酸序列介导CAP1蛋白定位到细胞膜上。

实施例5

体外纯化的CAP1蛋白促进多种肿瘤细胞迁移。

1、实验材料

1.1细胞及培养基

人宫颈癌细胞HeLa，人肺癌细胞H1299和A549，培养基：DMEM+10％FBS

1.2试剂

纯化蛋白试剂如实施例3所述，

0.1％结晶紫溶液的配制：称取0.5g的结晶紫粉末，将其溶解于500ml的PBS溶液中即可，4℃冰箱保存备用。

2、实验方法

2.1细胞划痕实验具体方法如下：

(1)在6孔板的背面用marker笔划线，每孔穿过5道线，且线与线之间的间距要均匀。

(2)在六孔板中铺细胞，密度要适中，把握在过夜可以长满的原则，一般每孔中加入5X10⁵个细胞，但根据细胞株的不同适当调节细胞的数目。

(3)用白枪头比着直尺对细胞进行划痕，枪头要垂直，不能倾斜，否则划痕会粗细不均。

(4)用PBS轻轻地对细胞进行冲洗3次，去除由于划痕带来的悬浮细胞，然后加入无血清的培养基。

(5)将处理完成的6孔板放到培养箱中(37℃5％CO₂)继续培养，在不同的时间段对细胞进行拍照，分析结果。

2.2细胞迁移Transwell技术方法如下：

(1)所要使用的细胞在向TRANSWELL小室铺细胞之前要先血清饥饿12小时。

(2)将血清饥饿12小时的细胞，倒掉培养皿中培养基，用PBS轻轻的清洗2遍，然后用胰酶将其消化，用含血清的培养基进行终止，1000rpm离心5min，弃上清，用不含血清的DMEM培养基对细胞进行重悬。

(3)计数，将细胞按比例进行稀释，最终使100μl中含有的细胞数目为1X10⁵个。

(4)向下室中加入600μl的20％FFBS培养基及其纯化的蛋白质。

(5)向上室中加入100μl稀释好的细胞，使其在小室内均匀分布并确保小室的膜上没有气泡。

(6)处理好后将24孔板放到培养箱中培养12h。

(7)收细胞，将上室和下室的培养基全部吸干净，然后用PBS将上室和下室都洗三遍，每次10min。

(8)将PBS吸干以后，用甲醇对细胞进行固定，每孔加入800μl的甲醇放在水平摇床上固定30min。然后用PBS洗两遍，吸干PBS。

(9)每个孔中在下室加入600μl的0.1％的结晶紫溶液，放在水平摇床上染色30min。

(10)用PBS洗四遍，每次10min。

(11)用棉签将上室的细胞轻轻地擦去，不要碰到小室下表面。

(12)在显微镜下拍照计数，每个处理组至少要拍五个事视野(避开小室的边缘，边缘效应使结果不准确)，求平均值。

3、实验结果

图5a.将体外纯化的CAP1蛋白与HeLa细胞孵育12小时以后，细胞划痕实验检测细胞迁移的情况，其中His-GFP作为对照组。可以看到加入His-GFP-CAP1的一组细胞迁移速度明显增强。图b-c.将体外纯化的CAP1蛋白分别与H1299(图5b)和A549细胞(图5c)孵育12小时以后，Transwell实验检测细胞迁移的情况，发现在两种细胞中，孵育His-CAP1的一组细胞迁移速度增强。结果证明，体外纯化的CAP1蛋白能促进包括HeLa、H1299、A549多种肿瘤细胞的迁移。

实施例6

体外纯化的CAP1蛋白能补偿细胞因缺失CAP1丧失的迁移能力。

1、实验材料

1.1细胞及培养基

CAP1敲低的H1299稳转细胞株，培养基：DMEM+10％FBS

1.2试剂

Puromycin(sigma)

2、实验方法

CAP1敲低的稳转细胞株构建方法如下：

(1)慢病毒表达载体的构建

a.根据实验需求，选择具有嘌呤霉素抗性的慢病毒Plko.1载体。

b.对CAP1基因设计构建shRNA。在已发表的文章中或者公司网站中找到3-5个siRNA序列，经退火延伸连接到Plko.1载体上。

c.测序鉴定正确的克隆。

d.筛选高效的shRNA。将shRNA转染到293T细胞中，通过western blot分析蛋白水平的变化，蛋白降低的越多表明基因沉默的效率越好。

(2)慢病毒的包装

a.转染：将CAP1-shRNA(10ug)、psPAX2(10ug)及pMD2G(5ug)三种质粒以磷酸钙转染法转染到预先铺好的10cm的293T细胞内。

b.换液：4小时左右，将转染后的细胞换成新鲜的培养基，继续培养。

c.收集病毒：按转染后的时间为0h计，收集24h,48h的病毒颗粒上清。

d.病毒浓缩：将收集好的病毒先低速离心：3000rpm/5min，除去残留的细胞碎片，然后将上清加入病毒浓缩柱子里，4度离心：4000g/2h，离心结束后，将柱子里的上清吸出。

e.保存：将病毒分装成小管，-80度冰箱保存。

(3)稳转细胞的筛选

a.铺板：选择合适的状态良好的H1299细胞铺到3.5cm皿中。

b.病毒感染：待细胞密度30％-40％时，弃掉一部分培养基，加入浓缩的病毒，同时，加入polybrane(8ug/ml)，促进病毒进入宿主细胞。

c.换液：感染12h左右，弃掉含有病毒的培养基，换成新鲜的培养基继续培养。细胞换液2次以后，便可带出病毒房。

d.传达：细胞长满便可以进行传代培养，将3.5cm皿的细胞直接传到10cm皿中。

e.筛选：按照病毒载体的抗性(嘌呤霉素)，加入1mg/ml puromycin进行筛选。同时处理一皿不感染病毒的H1299细胞作为对照组。

f.稳转细胞株pool的建立：用含有puromycin的培养基每两天换液一次，大概一周左右的时间，待细胞不再出现漂浮死亡，而对照组细胞全部死亡的时候，稳转细胞株pool大概就建好了。

g.细胞鉴定：将建好的稳转细胞株收下来，通过western检测基因沉默的效果。

h.细胞冻存：将鉴定好的稳转细胞株大量冻存，以便后续实验的使用。

3、实验结果

图6a.按照上述构建质粒的方法，构建CAP1的ShRNA1-3，病毒包装，构建CAP1敲低的H1299稳转细胞株，WB检测CAP1敲低的效率，最后成功拿到3株效果很好的敲低稳转细胞株。图6b.将图6a中所述的CAP1对照及敲低的H1299稳转细胞株与CAP1蛋白孵育，12小时以后用Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果如图所示，CAP1敲低的细胞呈现较低水平的迁移能力，而与体外纯化蛋白CAP1结合以后，发现细胞的迁移能力明显回复，表明CAP1蛋白可补偿细胞缺失的迁移能力。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东秉泰生物科技有限公司

<120> 一种诊治恶性肿瘤的分子标志物

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Thr Gly Leu Ala Trp Ser Lys Thr Gly Pro Val Ala Lys Glu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Pro Ser Gly Pro Ser Ala Gly Ser Cys Pro Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Thr Ile Ser Cys Ser Tyr Glu

35 40 45

Ser Ala Ser Arg Ser Ser Leu Phe Ala Gln Ile Asn Gln Gly Glu Ser

50 55 60

Ile Thr His Ala Leu Lys His Val Ser Asp Asp Met Lys Thr His Lys

65 70 75 80

Asn Pro Ala Leu Lys Ala Gln Ser Gly Pro Val Arg Ser Gly Pro Lys

85 90 95

Pro Phe Ser Ala Pro Lys Pro Gln Thr Ser Pro Ser Pro Lys Arg Ala

100 105 110

Thr Lys Lys Glu Pro Ala Val Leu Glu Leu Glu Gly Lys Lys Trp Arg

115 120 125

Claims

1.CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子在制备恶性肿瘤标志物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤标志物用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展；

优选的，所述恶性肿瘤的进展包括肿瘤细胞的增殖、生长和/或迁移；进一步优选的，所述恶性肿瘤的进展包括肿瘤细胞的迁移。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述CAP1蛋白具体为如下任一：

(a)氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的蛋白质；

4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括宫颈癌、非小细胞肺癌；

优选的，宫颈癌细胞为Hela细胞；非小细胞肺癌细胞为H1299细胞或A549细胞。

5.一种用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展的组合物，其特征在于，包含CAP1蛋白、编码CAP1蛋白的核酸分子、CAP1蛋白的核酸亲和配体和/或肽亲和配体；

优选的，所述恶性肿瘤的进展至包括肿瘤细胞的增殖、生长和/或迁移；进一步优选的，所述恶性肿瘤的进展包括肿瘤细胞的迁移；

优选的，所述恶性肿瘤包括宫颈癌、非小细胞肺癌；

进一步优选的，宫颈癌细胞具体为Hela细胞；非小细胞肺癌细胞具体为H1299细胞或A549细胞；

优选的，所述亲和配体至少包括对CAP1蛋白特异性的适体、对CAP1蛋白特异性的抗体和/或对CAP1蛋白特异性的抗体变体。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测恶性肿瘤的进展的组合物。

7.抑制CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子表达和/或活性降低的物质在如下(a')-(c')至少一种中的应用：

8.一种用于治疗或预防恶性肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含抑制CAP1蛋白和/或编码CAP1蛋白的核酸分子表达和/或活性降低的物质。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述物质包括CAP1特异的抗体、针对编码CAP1蛋白的核酸分子的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA；优选的，所述抗体为人抗体。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。