CN106086029A - 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用 - Google Patents

一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106086029A
CN106086029A CN201610717476.6A CN201610717476A CN106086029A CN 106086029 A CN106086029 A CN 106086029A CN 201610717476 A CN201610717476 A CN 201610717476A CN 106086029 A CN106086029 A CN 106086029A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gastric cancer
cell
long non
coding rna
lncrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610717476.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张智弘
马红伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Province Hospital
Original Assignee
Jiangsu Province Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Province Hospital filed Critical Jiangsu Province Hospital
Priority to CN201610717476.6A priority Critical patent/CN106086029A/zh
Publication of CN106086029A publication Critical patent/CN106086029A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及lncRNA DUXAP8在制备预测胃癌预后及靶点药物治疗中的应用；在胃癌细胞中中lncRNA DUXAP8的上调，高表达水平的lncRNA DUXAP8患者预后相对较差，通过改变lncRNA DUXAP8的表达对胃癌细胞的侵袭、迁移等产生影响，敲低lncRNA DUXAP8表达能够抑制胃癌增殖和诱导细胞凋亡。

Description

一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胃癌中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胃癌中的应用。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性消化道肿瘤之一，全世界有近一半胃癌患者在中国。尽管手术、介入、放化疗和靶向治疗等综合性治疗手段的发展使发病率和死亡率呈下降趋势，但仍是导致癌症死亡的第二大原因。早期胃癌可通过内窥镜黏膜切除术及胃癌根治术获得治愈效果，但绝大多数胃癌患者在初诊时已是疾病中晚期，即使综合外科、介入、放化疗和靶向治疗的手段，仍有较高的复发转移风险，预后仍不乐观。胃癌较高的发病率和死亡率不仅给患者带来严重的健康损害，而且也给家庭、社会带来严重的负担。
近年来大量研究表明，长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)作为ncRNAs的一种重要类型，在表观遗传水平广泛参与调控人体的各种生命活动进程，其在多种肿瘤组织中的异常表达与恶性肿瘤的发生发展之间存在着密切联系。2014年最新GENE CODE计划发现人类基因组中有15877种lncRNAs，对肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的侵袭转移发挥着关键的调控作用(Version 21,June 2014 freeze,GRCh38，Ens embl 77)。lncRNA是一类长度超过200nt，无蛋白质编码能力的RNA分子。证据表明，lncRNA在胃癌的发生发展过程中发挥着重要的作用。例如，例如，抑制lncRNA HOTA IR可降低MMP1和MMP2的表达，从而抑制胃癌细胞的侵袭性；又如，lncRNA FEND RR在胃癌组织中低表达提示患者预后不良，并可通过调控纤维连接蛋白1(fibronectin 1)促进胃癌的侵袭转移。虽然，在胃癌中已报道了一些lncRNAs的功能和机制，但其他lncRNAs在胃癌的发生发展中的作用仍需进一步研究。
鉴于lncRNAs在胃癌中的重要性，我们探究了lncRNA DUXAP8，通过GEO数据库分析和qPCR的检测，与邻近正常组织相比，lncRNA DUXAP8在胃癌组织中表达显著上调。并且，胃癌中高表达的lncRNA DUXAP8与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期及预后有关。研究发现干扰lncRNA DUXAP8通过绑定多梳抑制复合物2(PRC2)表观沉默下游靶基因PLEKHO1，进而促进胃癌细胞的增殖与转移。这些结果表明，lncRNA DUX AP8是胃癌的一个重要致癌因子，可作为胃癌发生和转移的潜在分子标记物且成为胃癌治疗的一个靶点。
发明内容
本发明的目的是提供用于判断胃癌预后情况或作为胃癌治疗靶点的lncRNADUXAP8，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，
SEQ ID NO.1：
acttcctgcg aggcccctgc agcagcagcg gcgtggtcag agcgagcttc ggagaagcag
tggtgggttc catgtgatgg tggagtagga ggcaggtctc cgcggttcat ctgtgttgct
ctaaatgaca ctgcttcatt attttgatgg ctggagaata tttcctagtg tatgtatatg
agagtttctt gatctcttta tctgtggatg aacaggctag tcaccctgct gtggaataga
aggccagaat tgatcagtct catctgagag taactttgta cccatcactg attccttctg
agactgcctc cacttcccca gcagcctctg gtttcttcat gtggctgcag atggcaggat
ttcccaaagg tttctggctg aaacatattc cgtggtgtat ctgtacagca gtttcctcat
ccctgcagct gtgtttgaac aggtcattta ccatgctgtc ctccaggttc aacagtatgg
ctccaaatga tgaaatttca ttctgatttt ctggctgaag actattctct ttgtgtatgt
ccaccacagt tactttatcc cttcatctgt ggatgggcag gatggagtct cgctgtattg
cccaggctgg agtgcagtgg catgatctca gctcactgca agctctgctt cctgggttca
cgccattctc ctgcctcagc ctcctgagta gctgggatta caggcacccg ccaccacgcc
caggaaagaa aaaagaagaa aacaaacctc catacgagaa tgggtctaaa ggaacttccc
aaacctccat gattttgcag gaaacaagat aaaggtggtt tccacaagaa aaatggcaca
atgtttctca gaagacaatt acataagaat cagcatactt caaattcaca gcaaataatc
agacaattga tgaaaatact tacccaaaca ctaattgtag actatgcctt ctgaatatgt
ttgtcataaa cttggagtaa ggaatcctca caggcactgg acaattcaaa aaacgtaaag
ttgtttgtta gaatactggt gcttttggat agaaaccctc atccatatcc tggtaaggct
tgaagttgca caggagtttt catttgtcaa aacccagaaa accataagct ttagatttgt
gaattttata ttgtattata tgtgaccttt ctttttaaaa aatgagctgt aagcagtctc
ccagacagta gctcagcctc cagaactctc tttctgcata gttgaagacc cctcttcaca
caagatggta gcaacaaatc ataggtgcaa ttgcaccaaa ttcacagaag atcaattgaa
aatcctcatc aataccttca ctcaaaaacc ttacccaggt tatgctacca aacaaaaact
tgctttagca atcaatgcag aagagtccag aatccagatt tggtttcaga atcaaagagc
taggcatgga ttccagaaaa caccagaacc tgactttaga tttaagccac agccatggac
aagattaacc tggtgtggag tttcaaaata gagaagccag atggtgttgt accacctata
gcacctttca attacacaca gtcatccatg catttatgaa aaacccatac cctgggattg
attccagaga acaacttgct gaagaaattg gtgcttcaga gtcaagagtc caaatttggt
tccaaaatca aagatctaga tttcatctcc agagaaaaag agaacctgtt atgtccttag
aatgagaaga ccagagaaga ccaggggcaa ggtttctgag ggacttcaag gtacagaaga
tacacaaagt ggcaccagcc tcactagcac tctcatttct caagagccag aacatggtga
atacagtcaa gttcagtgta tttgataata tcaatttggg ccccaaatct ctctcacagt
cttcctggga gtctattctt cttccaaaag tgcaagctaa gccttctgaa gatggtaaag
aacttggccg ggtgtggtgg ctcatgcctg taatcccagc actttaggag gctgaggctg
gaagatggct tgagcctagg agtttgaaac cagtctgagc aacatagtaa gaccctgtct
ctattct
本发明还涉及识别所述的长非编码RNA的标记物在制备判断胃癌治疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：
(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；
(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；
(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。
优选的，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示，
Primer F(SEQ ID NO：2)：
5’-GAGAAGCAGTGGTGGGTTCC-3’，
Primer R(SEQ ID NO：3)：
5’-GAGCAACACAGATGAACCGC-3’。
本发明还涉及包含所述的识别所述的长非编码RNA的标记物的用于判断胃癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。
本发明还涉及所述的识别所述的长非编码RNA的标记物或包含所述标记物的试剂或试剂盒在判断胃癌的治疗预后情况中的应用。
本发明还涉及所述的长非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用；
本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选判断胃癌预后情况的诊断试剂中的应用。
本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选治疗胃癌的药物中的应用。
本发明还涉及所述的长非编码RNA通过绑定PRC2表观沉默下游靶基因PLEKHO1表达的应用。
本发明还涉及抑制所述长非编码RNA的抑制剂在制备诊断或治疗胃癌的试剂中的应用。
本发明还涉及所述长非编码RNA的抑制剂，如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
si-DUXAP8 1#(SEQ ID NO：4)：
UUUAGACCCAUUCUCGUAUGGAGGU
ACCUCCAUACGAGAAUGGGUCUAAA
si-DUXAP8 2#(SEQ ID NO：5)：
CAGCAUACUUCAAAUUCACAGCAAA
UUUGCUGUGAAUUUGAAGUAUGCUG
技术方案
组织收集
72对胃癌和对应的邻近的非肿瘤样本是从病人中获得，这些病人是在南京医科大学第一附属医院进行手术。所有病例根据组织病理学评价确认为胃癌。这些病人手术前没有进行局部的或系统的治疗。所有收集的组织样本立即速冻在液氮里，并储存在-80℃备用。我们的研究得到了南京医科大学第一附属医院的研究伦理委员会批准，并从所有的病人中获得书面知情同意。
细胞培养
两个胃癌细胞系(SGC7901&BGC823)是从中国科学院上海细胞库购买(上海，中国)。BGC823细胞在RPMI 1640培养基中培养；SGC7901细胞在DMEM培养基中培养。完全培养基中含有10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的链霉素的，在37℃，5％CO2的培养箱中培养。
RNA提取和定量PCR分析
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa，大连，中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。
质粒构建
人DUXAP8全长cDNA序列合成并插入到pcDNA3.1载体中。lncRNA DUXAP8的异位过表达是通过pcDNA-DUXAP8转染获得的，以一个空的pcDNA载体为对照。48小时后qRT-PCR检测lncRNA DUXAP8的表达水平。
细胞转染
所有用于转染的质粒载体，均用去除内毒素的质粒提取试剂盒提取(DNAMidiprep试剂盒，Qiagen)。LncRNA DUXAP8的干扰序列及乱序对照(si-NC)均购自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。
将SGC7901和BGC823细胞按每孔2×105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，在转染前12h弃掉原有培养基，换成无双抗培养基；取10μl脂质体稀释于250μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀，室温下孵育5min；取100pmol siRNA、si-NC或4ugpcDNA、pcDNA-LINC00707分别稀释于250μL OPTI-MEM中，吹打混匀，室温下孵育5min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀，在室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀，继续放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后，弃去OPTI-MEM培养基，更换为完全培养基，继续放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；转染后24-48h，收集细胞提取总RNA或蛋白进行qRT-PCR检测或western blot分析。
根据操作说明用X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染质粒载体(pcDNA3.1-lncRNADUXAP8和空的pcDNA载体)。A549和PC9细胞融合满了就接种到六孔板里，然后根据说明操作。转染48小时后，收集细胞，用于qRT-PCR或免疫印迹分析。
MTT实验
将转染后24h的SGC-7901和BGC-823细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板；待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h；弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，在微样振荡器上振荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。
克隆形成实验
用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，以适当的细胞密度(500个)接种于6孔板，使细胞分散均匀；放入细胞培养箱中，每4天换液一次，培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS轻轻清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇1ml，固定15分钟；弃甲醇固定液，加1ml 0.1％结晶紫染色液染15分钟，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
流式细胞术
将BGC-823和SGC-7901细胞按每孔2×105个细胞种于6孔板，待细胞贴壁后转染；转染24-48h取出细胞，将上清收集到提前做好标记的流式管中。用不含EDTA的胰酶消化细胞，1ml培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液，吸取到对应的流式管中，1500g，4℃，离心5min；弃上清，加入预冷的PBS清洗2次；小心吸尽细胞沉淀上残留的PBS，涡旋振荡30s，使细胞成均匀悬浮液。加入200μl含钙离子的结合缓冲液，再加入10μl Annexin V-FITC荧光探针，轻轻振荡混匀，冰上避光孵育30min；加入5μl的碘化丙锭(PI)于细胞液中，涡旋振荡混匀，冰上避光孵育5min；加入400μl结合缓冲液，涡旋振荡混匀后，用300目尼龙网过滤，上流式细胞仪利用FL1和FL3双通道波长检测。
Transwell实验
消化已转染好的细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×104。取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含20％FBS或趋化因子的培养基，放入孵箱中常规培养12-48h。取小室用棉签擦去上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。
RNA免疫共沉淀(RIP)实验
1、准备裂解产物
(1)准备完全的RIP裂解缓冲液，配好后放在冰上，体系如下：
当单层贴壁细胞汇合度至80％～90％时，取出用冰冷的10ml PBS洗细胞两次，加入10ml冰冷的PBS，用细胞刮刀刮取细胞并移入15ml无菌无酶的离心管中，1500g，4℃，离心5min；
弃上清，用完全的RIP裂解液重悬细胞，吹打混匀，在冰上孵育5min，将裂解产物分装成每个离心管200μl并且存在-80℃冰箱。
2、准备免疫沉淀的磁珠
(1)通过上下颠倒或者吹打混匀重悬磁珠；
(2)每管加入50μl的磁珠悬液，加入0.5ml的RIP Wash Buffer，并短暂的涡旋，把管子放在磁力分离器上，待珠子聚集后弃上清，再使用0.5ml的RIP Wash Buffer清洗并弃上清；
(3)100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入5μg目的抗体，在室温下旋转孵育30min；
(4)短暂离心小管后并放在磁力分离器上，移除上清，在每管加入0.5ml的RIPWash Buffer并短暂的涡旋，把管子放在磁力分离器上，弃上清，再使用0.5ml的RIP WashBuffer清洗并弃上清；
(5)每管加入0.5ml的RIP Wash Buffer并短暂的涡旋，把管子放在冰上。
3、免疫沉淀RNA连接的蛋白-RNA复合物
(1)准备RIP免疫沉淀反应缓冲液，体系如下：
试剂 ×1 ×N
RIP wash buffer 860μ 860μl×N
0.5M EDTA 35μl 35μl×N
RNase Inhibitor 5μl 5μl×N
(2)把18.2(5)中的管子放在磁力分离器上，弃上清，每管中加入900μl的RIP免疫沉淀反应缓冲液；
(3)把从18.1(3)得到的RIP裂解液快速解冻，14000g，4℃，离心10min；
(4)移取100μl上清加入含有磁珠抗体复合物的RIP免疫沉淀反应缓冲液中，最终的总体积为1ml；
(5)移取RIP裂解液上清10μl放入一个新管中，标记上Input，把Input样本放入-80℃冰箱中直到下一步的RNA纯化；
(6)4℃旋转孵育所有的小管3h至过夜(最好6～8h)；
(7)短暂离心免疫沉淀的小管，然后放在磁力分离器上弃上清；
(8)把小管从磁铁处移开，每管加0.5ml RIP wash buffer，短暂涡旋；
(9)把小管放在磁力分离器上弃上清；
(10)重复8～9步5次，一共清洗小珠6次。
4、纯化RNA
准备蛋白酶K缓冲液，体系如下：
试剂 ×1 ×N
RIP wash Buffer 117μl 117μl×N
10％SDS 15μl 15μl×N
Proteinase K 18μl 18μl×N
注意：加样顺序要严格按照上表，以免高浓度的SDS引起蛋白酶K的变性。
(2)用150μl的蛋白酶K缓冲液重悬18.3(10)得到的免疫沉淀产物；
(3)解冻18.3(5)处的Input样本，加入107μl的RIP wash Buffer，15μl的10％SDS，18μl的Proteinase K，使总体积为150μl；
(4)55℃/30min摇晃孵育所有的管子以消化蛋白；
(5)孵育后，短暂离心小管并把小管放在磁力分离器上，把上清转到一个新的小管中；
(6)每管加入250μl的RIP wash Buffer接触到上清；
(7)每管加入400μl的酚/氯仿，涡旋15秒，14000g，室温，离心10min，分离液相；
(8)转移350μl的水相到一个新管中，加入400μl的三氯甲烷，涡旋15s，14000g，室温，离心10min，分离液相；
(9)转移300μl的水相到一个新管中，每管中加入50μl的Salt Solution I，15μl的Salt Solution II，5μl的Precipitate Enhancer，850μl的EtOH，混合后-80℃保持1h至过夜，以沉淀RNA；
(10)14000g，4℃，离心30min，小心的弃掉上清；
(11)80％EtOH洗一遍沉淀。14000g，4℃，离心10min，弃上清，空气中晾干；
用RNA-free的水7μl重悬，放在冰上。
5、分析免疫沉淀的RNA
(1)逆转录反应
(2)QRT-PCR分析
染色质免疫共沉淀(ChIP)
第一部分
(1)加550微升的37％多聚甲醛到含20ML培养基的大皿中，摇晃均匀(多聚甲醛终浓度为1％，注意使用高质量的多聚甲醛)
(2)摇床上室温孵育10分钟
(3)同时准备2ml的PBS在EP管中，加入5微升cocktail/1ML PBS中，放冰上
(4)加入2ML的10X甘氨酸到培养皿中
(5)摇床上摇晃均匀室温孵育5分钟
(6)培养皿放冰上待用
(7)吸取培养基，尽量吸取，不要碰触到细胞
(8)加入20ml的PBS清洗细胞
(9)重复8-9步骤
(10)加入预冷好的2ml PBS(含有cocktail)
(11)将细胞刮到新的EP管中
(12)800g，4度离心5分钟
(13)离心期间准备0.5ml的细胞裂解液(含有2.5微升的cocktail)
(14)移去上清(固定好的细胞可以在这步用液氮快速冻好放-80冰箱保存数月)
(15)准备好的0.5ml的细胞裂解液重悬细胞
(16)冰上孵育15分钟，每5分钟轻轻的涡旋细胞裂解液
(17)800g，4度离心5分钟
(18)离心期间0.5ml的细胞核裂解液(含有2.5微升的cocktail)
(19)弃上清，0.5ml的细胞核裂解液重悬细胞
(20)接第二部分
第二部分
(1)这步可以取5微升细胞裂解液进行琼脂糖胶分析
(2)冰上超声，条件：
(3)12000g，4度，离心10分钟，弃掉细胞核碎片
(4)可以取5微升看超声效果
(5)将上清每50微升分装到EP管中(每50微升体系含有1X106个细胞，足够一次IP反应，这部分可放在-80保存3个月)
第三部分
(1)准备足够的Dilution buffer，并放冰上(每个IP反应需要450微升的Dilutionbuffer和2.25微升的蛋白酶抑制剂cocktail II)
(2)准备IP反应，每个反应上一部分第5步反应液
(3)每个反应管中加入450微升的Dilution buffer(含有2.25微升的蛋白酶抑制剂cocktail II)
(4)取5微升的上清作为input待第4部分用
(5)将抗体和20微升混匀的磁珠加入反应液中(确保磁珠混匀)，试剂盒中阳参和IgG抗体每个反应加5ug，特异性抗体在1-10ug之间
(6)4度孵育1小时到过夜
(7)将管子放在磁力架上，弃上清
(8)用一下buffer涡旋清洗磁珠-抗体，严格按照顺序，buffer需预冷，每次5分钟，4度，旋转：
A.Low salt buffer，清洗一次
B.High salt buffer,清洗一次
C.LiCi buffer，清洗一次
D.TE buffer，清洗一次
第四部分
(1)将蛋白酶K和CHIP Elution buffer放室温，准备后续IP和input用Elutionbuffer(每个反应需要100ul Elution buffer+1ul蛋白酶K)
(2)62度摇晃孵育2小时
(3)95度孵育10分钟
(4)室温冷却EP管
(5)EP管放磁力架上，将上清分离到新的EP管中
第五部分
(1)将吸附柱放到收集管中，每个反应需要一个收集管
(2)每个IP和input反应中加入0.5ML的bind reagent A,混合均匀
(3)将混合好的反应液加入吸附柱中
(4)12000g离心30秒，弃收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中
(5)加500ul wash reagent B,1200g离心30秒
(6)弃收集管中的液体，吸附柱放回收集管中，1200g离心30秒
(7)弃收集管中的液体，吸附柱转移到新的EP管中加50ul的Elution buffer C到吸附柱的中心，12000g离心30秒，即得到所需DNA用于下一步qPCR分析。
免疫印迹分析和抗体
细胞蛋白裂解产物通过10％SDS-PAGE分离开，转移到0.22μm NC膜，用特定的抗体孵育。放射自显影用密度测定法从而被量化。GAPDH抗体被用来作为对照。
数据处理
实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。PFS和OS分析用Kaplan-Meier方法。
附图说明
图1.lncRNA DUXAP8在胃癌组织中上调且与病人较差的预后有关
1A：在GSE58828和GSE13861两份数据库中，lncRNA DUXAP8的表达水平上调
1B：lncRNA DUXAP8在胃癌组织表达较正常组织上调；
1C：根据lncRNA DUXAP8在胃癌组织中的表达水平分为两组；
1D，1E：Kaplan-Meier生存函数用于分析两组病人的lncRNA DUXAP8表达水平与病人预后的相关性。
图2.lncRNA DUXAP8在胃癌细胞中的表达水平
2A:lncRNA DUXAP8在胃癌细胞中表达较正常细胞上调；
2B：在胃癌细胞中干扰lncRNA DUXAP8；
2C：在胃癌细胞中过表达lncRNA DUXAP8。
图3.lncRNA DUXAP8促进胃癌细胞增殖
3A，3B：MTT实验发现干扰lncRNA DUXAP83后抑制胃癌细胞增殖；
3C，3D：MTT实验发现过表达lncRNA DUXAP83后促进胃癌细胞增殖；
3E：克隆形成实验发现干扰lncRNA DUXAP83后抑制胃癌细胞增殖；
3F：克隆形成实验发现过表达lncRNA DUXAP83后促进胃癌细胞增殖。
图4.lncRNA DUXAP8对胃癌细胞凋亡和转移的影响
4A：干扰lncRNA DUXAP8能够促进胃癌细胞凋亡；
4B：干扰lncRNA DUXAP8能够抑制胃癌细胞转移。
图5.lncRNA DUXAP8通过绑定PRC2，表观沉默下游靶基因PLEKHO1表达
5A：转录组测序结果；
5B：qPCR对测序结果进行验证；
5C：RIP实验证明lncRNA DUXAP8可以绑定PRC2；
5D：ChIP实验证明lncRNA DUXAP8通过绑定PRC2表观沉默PLEKHO1。
图6.lncRNA DUXAP8在体内促进胃癌增殖
6A：裸鼠成瘤实验；
6B：qPCR检测皮下瘤中lncRNA DUXAP8的表达量；
6C：每三天测量皮下瘤体积；
6D：皮下瘤的重量；
6E：皮下瘤HE及Ki-67染色。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
一般性说明：
实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
本发明的材料：本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
实施例1 检测lncRNA DUXAP8在组织和细胞中的表达情况
取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×107细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。
紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入1μl溴化乙锭(EB，10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TAE缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1：4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。
Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：
实时定量PCR
胃癌组织及癌旁组织标本，胃癌细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRaPrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。逆转录反应体系如下：
反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，
qPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：
反应条件：
结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。
lncRNA DUXAP8的引物如下：
Primer F(SEQ ID NO：2)：
5’-GAGAAGCAGTGGTGGGTTCC-3’，
Primer R(SEQ ID NO：3)：
5’-GAGCAACACAGATGAACCGC-3’。
数据库分析结果表明lncRNA DUXAP8在胃癌组织中较正常组织表达上调(图1A)。利用实时定量PCR检测了72对胃癌组织/癌旁正常组织中lncRNA DUXAP8的表达水平，结果显示与癌旁正常组织相比，lncRNA DUXAP8的表达在癌组织中上调(图1B)。
实施例2 高表达的lncRNA DUXAP8与胃癌肿瘤大小、淋巴结转移、临床分型和不良预后有显著相关
为了检测lncRNA DUXAP8表达与临床病理特点的相关性，胃癌病人根据肿瘤组织中相对lncRNA DUXAP8表达的中位值被分为两组：lncRNA DUXAP8相对低表达组和lncRNADUXAP8相对高表达组(图1C)。显而易见的是，胃癌中lncRNA DUXAP8高表达与TNM分期(p＝0.001)、淋巴结转移(P＝0.007)及肿瘤大小(P＝0.002))显著相关。然而，lncRNA DUXAP8的表达与别的参数如性别(P＝0.635)和年龄(P＝0.157不相关。为了确定lncRNA DUXAP8的表达与胃癌患者预后之间的关系，无进展生存期(PFS)和总生存率(OS)曲线根据Kaplan-Meier分析和对数秩检验中lncRNA DUXAP8的表达水平而作图(图1D和1E)。这些结果表明高表达lncRNA DUXAP8组胃癌病人三年总的生存率明显低于低表达组病人。这些结果提示胃癌中lncRNA DUXAP8表达上调与患者的预后显著相关。
实施例3 lncRNA DUXAP8对胃癌细胞增殖的影响
MTT实验
将转染后24h的SGC-7901和BGC-823细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板；待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h；弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，在微样振荡器上振荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。
克隆形成实验
用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，以适当的细胞密度(500个)接种于6孔板，使细胞分散均匀；放入细胞培养箱中，每4天换液一次，培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS轻轻清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇1ml，固定15分钟；弃甲醇固定液，加1ml 0.1％结晶紫染色液染15分钟，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
为了研究lncRNA DUXAP8是否对胃癌细胞的增殖具有调控作用，我们进行了MTT实验及克隆实验。结果表明，干扰lncRNA DUXAP8后胃癌细胞的增值能力下调(图3A，3B，3E)，而过表达lncRNA DUXAP8后胃癌细胞的增值能力上调(图3C，3D，3F)。干扰序列如下：
si-DUXAP8 1#(SEQ ID NO：4)：
UUUAGACCCAUUCUCGUAUGGAGGU
ACCUCCAUACGAGAAUGGGUCUAAA
si-DUXAP8 2#(SEQ ID NO：5)：
CAGCAUACUUCAAAUUCACAGCAAA
UUUGCUGUGAAUUUGAAGUAUGCUG
实施例4 lncRNA DUXAP8对胃癌细胞凋亡及转移的影响
流式细胞术
将BGC-823和SGC-7901细胞按每孔2×105个细胞种于6孔板，待细胞贴壁后转染；转染24-48h取出细胞，将上清收集到提前做好标记的流式管中。用不含EDTA的胰酶消化细胞，1ml培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液，吸取到对应的流式管中，1500g，4℃，离心5min；弃上清，加入预冷的PBS清洗2次；小心吸尽细胞沉淀上残留的PBS，涡旋振荡30s，使细胞成均匀悬浮液。加入200μl含钙离子的结合缓冲液，再加入10μl Annexin V-FITC荧光探针，轻轻振荡混匀，冰上避光孵育30min；加入5μl的碘化丙锭(PI)于细胞液中，涡旋振荡混匀，冰上避光孵育5min；加入400μl结合缓冲液，涡旋振荡混匀后，用300目尼龙网过滤，上流式细胞仪利用FL1和FL3双通道波长检测。
Transwell实验
消化已转染好的细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×104。取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含20％FBS或趋化因子的培养基，放入孵箱中常规培养12-48h。取小室用棉签擦去上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。
细胞凋亡和转移在肿瘤的发展发展过程中发挥着重要作用。因此，我们用流式细胞术和Transwell实验来评价lncRNA DUXAP8对胃癌细胞凋亡和转移的影响。如图4A所示，干扰lncRNA DUXAP8后能够促进胃癌细胞凋亡。并且干扰lncRNA DUXAP8后能够抑制胃癌细胞转移(图4B)。
实施例5 lncRNA DUXAP8通过绑定PRC2，表观沉默下游靶基因PLEKHO1表达RNA免疫共沉淀(RIP)实验
1、准备裂解产物
(1)准备完全的RIP裂解缓冲液，配好后放在冰上，体系如下：
当单层贴壁细胞汇合度至80％～90％时，取出用冰冷的10ml PBS洗细胞两次，加入10ml冰冷的PBS，用细胞刮刀刮取细胞并移入15ml无菌无酶的离心管中，1500g，4℃，离心5min；
弃上清，用完全的RIP裂解液重悬细胞，吹打混匀，在冰上孵育5min，将裂解产物分装成每个离心管200μl并且存在-80℃冰箱。
2、准备免疫沉淀的磁珠
(1)通过上下颠倒或者吹打混匀重悬磁珠；
(2)每管加入50μl的磁珠悬液，加入0.5ml的RIP Wash Buffer，并短暂的涡旋，把管子放在磁力分离器上，待珠子聚集后弃上清，再使用0.5ml的RIP Wash Buffer清洗并弃上清；
(3)100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入5μg目的抗体，在室温下旋转孵育30min；
(4)短暂离心小管后并放在磁力分离器上，移除上清，在每管加入0.5ml的RIPWash Buffer并短暂的涡旋，把管子放在磁力分离器上，弃上清，再使用0.5ml的RIP WashBuffer清洗并弃上清；
(5)每管加入0.5ml的RIP Wash Buffer并短暂的涡旋，把管子放在冰上。
3、免疫沉淀RNA连接的蛋白-RNA复合物
(1)准备RIP免疫沉淀反应缓冲液，体系如下：
试剂 ×1 ×N
RIP wash buffer 860μ 860μl×N
0.5M EDTA 35μl 35μl×N
RNase Inhibitor 5μl 5μl×N
(2)把18.2(5)中的管子放在磁力分离器上，弃上清，每管中加入900μl的RIP免疫沉淀反应缓冲液；
(3)把从18.1(3)得到的RIP裂解液快速解冻，14000g，4℃，离心10min；
(4)移取100μl上清加入含有磁珠抗体复合物的RIP免疫沉淀反应缓冲液中，最终的总体积为1ml；
(5)移取RIP裂解液上清10μl放入一个新管中，标记上Input，把Input样本放入-80℃冰箱中直到下一步的RNA纯化；
(6)4℃旋转孵育所有的小管3h至过夜(最好6～8h)；
(7)短暂离心免疫沉淀的小管，然后放在磁力分离器上弃上清；
(8)把小管从磁铁处移开，每管加0.5ml RIP wash buffer，短暂涡旋；
(9)把小管放在磁力分离器上弃上清；
(10)重复8～9步5次，一共清洗小珠6次。
4、纯化RNA
准备蛋白酶K缓冲液，体系如下：
试剂 ×1 ×N
RIP wash Buffer 117μl 117μl×N
10％SDS 15μl 15μl×N
Proteinase K 18μl 18μl×N
注意：加样顺序要严格按照上表，以免高浓度的SDS引起蛋白酶K的变性。
(2)用150μl的蛋白酶K缓冲液重悬18.3(10)得到的免疫沉淀产物；
(3)解冻18.3(5)处的Input样本，加入107μl的RIP wash Buffer，15μl的10％SDS，18μl的Proteinase K，使总体积为150μl；
(4)55℃/30min摇晃孵育所有的管子以消化蛋白；
(5)孵育后，短暂离心小管并把小管放在磁力分离器上，把上清转到一个新的小管中；
(6)每管加入250μl的RIP wash Buffer接触到上清；
(7)每管加入400μl的酚/氯仿，涡旋15秒，14000g，室温，离心10min，分离液相；
(8)转移350μl的水相到一个新管中，加入400μl的三氯甲烷，涡旋15s，14000g，室温，离心10min，分离液相；
(9)转移300μl的水相到一个新管中，每管中加入50μl的Salt Solution I，15μl的Salt Solution II，5μl的Precipitate Enhancer，850μl的EtOH，混合后-80℃保持1h至过夜，以沉淀RNA；
(10)14000g，4℃，离心30min，小心的弃掉上清；
(11)80％EtOH洗一遍沉淀。14000g，4℃，离心10min，弃上清，空气中晾干；
用RNA-free的水7μl重悬，放在冰上。
5、分析免疫沉淀的RNA
(1)逆转录反应
(2)QRT-PCR分析
染色质免疫共沉淀(ChIP)
第一部分
(1)加550微升的37％多聚甲醛到含20ML培养基的大皿中，摇晃均匀(多聚甲醛终浓度为1％，注意使用高质量的多聚甲醛)
(2)摇床上室温孵育10分钟
(3)同时准备2ml的PBS在EP管中，加入5微升cocktail/1ML PBS中，放冰上
(4)加入2ML的10X甘氨酸到培养皿中
(5)摇床上摇晃均匀室温孵育5分钟
(6)培养皿放冰上待用
(7)吸取培养基，尽量吸取，不要碰触到细胞
(8)加入20ml的PBS清洗细胞
(9)重复8-9步骤
(10)加入预冷好的2ml PBS(含有cocktail)
(11)将细胞刮到新的EP管中
(12)800g，4度离心5分钟
(13)离心期间准备0.5ml的细胞裂解液(含有2.5微升的cocktail)
(14)移去上清(固定好的细胞可以在这步用液氮快速冻好放-80冰箱保存数月)
(15)准备好的0.5ml的细胞裂解液重悬细胞
(16)冰上孵育15分钟，每5分钟轻轻的涡旋细胞裂解液
(17)800g，4度离心5分钟
(18)离心期间0.5ml的细胞核裂解液(含有2.5微升的cocktail)
(19)弃上清，0.5ml的细胞核裂解液重悬细胞
(20)接第二部分
第二部分
(1)这步可以取5微升细胞裂解液进行琼脂糖胶分析
(2)冰上超声，条件：
(3)12000g，4度，离心10分钟，弃掉细胞核碎片
(4)可以取5微升看超声效果
(5)将上清每50微升分装到EP管中(每50微升体系含有1X106个细胞，足够一次IP反应，这部分可放在-80保存3个月)
第三部分
(1)准备足够的Dilution buffer，并放冰上(每个IP反应需要450微升的Dilutionbuffer和2.25微升的蛋白酶抑制剂cocktail II)
(2)准备IP反应，每个反应上一部分第5步反应液
(3)每个反应管中加入450微升的Dilution buffer(含有2.25微升的蛋白酶抑制剂cocktail II)
(4)取5微升的上清作为input待第4部分用
(5)将抗体和20微升混匀的磁珠加入反应液中(确保磁珠混匀)，试剂盒中阳参和IgG抗体每个反应加5ug，特异性抗体在1-10ug之间
(6)4度孵育1小时到过夜
(7)将管子放在磁力架上，弃上清
(8)用一下buffer涡旋清洗磁珠-抗体，严格按照顺序，buffer需预冷，每次5分钟，4度，旋转：
A.Low salt buffer，清洗一次
B.High salt buffer,清洗一次
C.LiCi buffer，清洗一次
D.TE buffer，清洗一次
第四部分
(1)将蛋白酶K和CHIP Elution buffer放室温，准备后续IP和input用Elutionbuffer(每个反应需要100ul Elution buffer+1ul蛋白酶K)
(2)62度摇晃孵育2小时
(3)95度孵育10分钟
(4)室温冷却EP管
(5)EP管放磁力架上，将上清分离到新的EP管中
第五部分
(1)将吸附柱放到收集管中，每个反应需要一个收集管
(2)每个IP和input反应中加入0.5ML的bind reagent A,混合均匀
(3)将混合好的反应液加入吸附柱中
(4)12000g离心30秒，弃收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中
(5)加500ul wash reagent B,1200g离心30秒
(6)弃收集管中的液体，吸附柱放回收集管中，1200g离心30秒
(7)弃收集管中的液体，吸附柱转移到新的EP管中
加50ul的Elution buffer C到吸附柱的中心，12000g离心30秒，即得到所需DNA用于下一步qPCR分析。
为了进一步分析lncRNA DUXAP8调控的下游靶基因，我们在BGC823细胞中干扰了lncRNA DUXAP8后进行了转录组测序(图5A)，并且对测序结果进行验证(图5B)；发现抑癌基因PLEKHO1的上调倍数最高。我们通过RIP和ChIP实验证明lncRNA DUXAP8可以和PRC2结合，来抑制下游靶基因PLEKHO1的表达，从而促进胃癌细胞的增殖转移(图5C，5D)。
实施例6 裸鼠皮下成瘤实验
(1)选取4周大的雄性免疫缺陷小鼠备用。
(2)在SGC-7901细胞中转染sh-LINC00707质粒或空质粒载体；
(3)转染24h后从孵箱取出细胞，弃培养基，用1ml PBS清洗两遍，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液；
(4)将细胞悬液收集到15ml无菌无酶的离心管中，1500g，4℃，离心5min；
(5)弃上清，用7ml PBS重悬细胞沉淀，1500g，4℃，离心5min；
(6)弃上清，用700μl PBS重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀，转移至1.5ml无菌无酶的EP管中，用封口膜封口，置于冰上备用；
(7)使用1ml注射器每次吸取100μl细胞悬液，吸前吹打混匀，皮下注射到小鼠腋下；
(8)等瘤体出现后，每三天观察并记录一次两组的小鼠瘤体大小；
(9)待瘤体形成15天后处死小鼠，取出瘤体，拍照记录，并称重。
免疫组化实验
(1)脱蜡：二甲苯3×5min，100％乙醇1×5min，100％乙醇1×1min，95％乙醇2×1min，70％乙醇1×1min，双蒸水浸泡洗去乙醇；
(2)烧杯中盛放600ml DW+5.6ml抗原修复液，将玻片架于塑料架上，浸入，置微波炉大火3-5min，沸腾就调成小火，15-20min，时间长些利于抗原更多的暴露；
(3)自然冷却后，擦干组织片周围的水，用免疫组化笔划好；
(4)PBS+0.03％Tween20(300μl Tween20加入1000ml PBS中)，滴加，冲洗5min，甩去；
(5)3％H2O2滴加，15min，甩去；
(6)PBS冲洗5min；
(7)封闭抗原(用PBS配制5％脱脂牛奶滴加)30min；
(8)滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，甩去水分，加入一抗，4℃过夜；
(9)滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，3×5min；
(10)滴加二抗孵育；
(11)滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，2×5min，PBS冲洗1×5min；
(12)滴加DAB，流水冲洗5-10min；
(13)苏木素染色1min，流水冲洗5min；
(14)1％Hcl(用70％酒精配制)浸泡5-15s，流水冲洗10min；
(15)70％乙醇2min，80％乙醇2min，95％乙醇2×2min，100％乙醇2×15min，二甲苯3×5min；
封片。
为进一步验证lncRNA DUXAP8对胃癌细胞瘤体形成能力的影响，我们在SGC7901细胞中转染sh-DUXAP8质粒或空质粒载体，皮下注射4周大的雄性免疫缺陷小鼠。等瘤体出现后，每三天观察并记录一次两组的小鼠瘤体大小。待瘤体形成15天后处死小鼠，取出瘤体，拍照记录，同时量取瘤体的大小并称其重量。统计结果显示：与空质粒载体转染形成的瘤体组相比较，转染sh-DUXAP8质粒组小鼠体内瘤体形成能力显著减弱(图6A)；同时瘤体检测结果显示：敲低lncRNA DUXAP8组小鼠瘤体的平均重量显著低于对照组瘤体的重量(图6B)。取瘤体组织提取总RNA，使用qRT-PCR技术检测lncRN A DUXAP8在两组瘤体组织中的表达水平，结果发现相较于对照组，下调lncRNA DUX AP8组小鼠的瘤体中lncRNA DUXAP8的表达水平显著降低(图6D)。H&E染色及免疫组化检测结果显示：干扰lncRNA DUXAP8组小鼠瘤体组织中ki-67的表达水平明显低于对照组小鼠瘤体组织(图6E)。综上结果证实：敲低lncRNADUXAP8表达可显著抑制胃癌细胞的肿瘤形成能力。

Claims (10)

1.一种用于判断胃癌(GC)预后情况或作为胃癌治疗靶点的长非编码RNA(lncRNADUXAP8)，所述长非编码RNA的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。
2.序列1中的长非编码RNA的诊断胃癌及判断胃癌治疗预后情况的用途。
3.识别权利要求1所述的长非编码RNA的标记物在判断胃癌治疗预后情况的诊断中的应用，所述的标记物包括但不限于：
(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；
(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；
(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
5.包含权利要求2或3所述的标记物的用于判断胃癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。
6.权利要求1所述的长非编码RNA在作为筛选判断胃癌预后情况的诊断试剂中的应用。
7.权利要求1所述的长非编码RNA在作为筛选治疗胃癌的药物中的应用。
8.权利要求1所述的长非编码RNA通过绑定PRC2表观沉默下游靶基因PLEKHO1表达的应用。
9.抑制权利要求1所述长非编码RNA的抑制剂在制备诊断或治疗胃癌的试剂中的应用。
10.权利要求9中的抑制剂，其特征在于SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
CN201610717476.6A 2016-08-24 2016-08-24 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用 Pending CN106086029A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610717476.6A CN106086029A (zh) 2016-08-24 2016-08-24 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610717476.6A CN106086029A (zh) 2016-08-24 2016-08-24 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106086029A true CN106086029A (zh) 2016-11-09

Family

ID=57225819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610717476.6A Pending CN106086029A (zh) 2016-08-24 2016-08-24 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106086029A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106480037A (zh) * 2016-12-20 2017-03-08 江苏省人民医院 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
CN106834288A (zh) * 2016-12-16 2017-06-13 南京医科大学 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用
CN107988311A (zh) * 2017-11-24 2018-05-04 陕西中医药大学 LncRNA的UCA1和UCA1a共有序列对膀胱癌细胞生物学功能影响的检测方法
CN108707672A (zh) * 2018-06-13 2018-10-26 北京泱深生物信息技术有限公司 Duxap8在肝细胞癌诊断和治疗中的应用
CN108728549A (zh) * 2018-08-06 2018-11-02 江阴市人民医院 长链非编码rna duxap8作为生物标志物在膀胱癌预后中的应用
CN110438229A (zh) * 2019-08-01 2019-11-12 上海交通大学 一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNE ET AL: "Annotation, nomenclature and evolution of four novel homeobox genes expressed in the human germ line", 《GENE》 *
BOOTH ET AL: "NR_122113.1", 《GENBANK》 *
MA ET AL: "The pseudogene derived long noncoding RNA DUXAP8 promotes gastric cancer cell proliferation and migration via epigenetically silencing PLEKHO1 expression", 《ONCOTARGET》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834288A (zh) * 2016-12-16 2017-06-13 南京医科大学 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用
CN106834288B (zh) * 2016-12-16 2020-08-21 南京医科大学 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用
CN106480037A (zh) * 2016-12-20 2017-03-08 江苏省人民医院 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
CN107988311A (zh) * 2017-11-24 2018-05-04 陕西中医药大学 LncRNA的UCA1和UCA1a共有序列对膀胱癌细胞生物学功能影响的检测方法
CN108707672A (zh) * 2018-06-13 2018-10-26 北京泱深生物信息技术有限公司 Duxap8在肝细胞癌诊断和治疗中的应用
CN108728549A (zh) * 2018-08-06 2018-11-02 江阴市人民医院 长链非编码rna duxap8作为生物标志物在膀胱癌预后中的应用
CN110438229A (zh) * 2019-08-01 2019-11-12 上海交通大学 一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106086029A (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用
Zhang et al. Long non-coding RNA Malat1 regulates angiogenesis in hindlimb ischemia
Olsen et al. Transglutaminase 2 and its role in pulmonary fibrosis
EP3604634A1 (en) Methods for discovering therapeutic targets
JP6216849B2 (ja) Ｓｌｉｔ−Ｒｏｂｏシステムを用いた骨折又は骨粗鬆症の予防或いは治療用組成物
JP2013178260A5 (zh)
CN108601802A (zh) 塞尼卡谷病毒（svv）细胞受体靶向的肿瘤治疗
CN106754914A (zh) 一种长非编码rna及其在诊断／治疗子痫前期中的应用
Wang et al. Laminin receptor is an interacting partner for viral outer capsid protein VP5 in grass carp reovirus infection
CN106520771B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用
CN109022584B (zh) 一种食管癌的分子标志物及其用途
CN106480037A (zh) 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
Xuan et al. Elevated circulating IL-32 presents a poor prognostic outcome in patients with heart failure after myocardial infarction
CN105950628A (zh) 一种长非编码rna 及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用
Emanuel et al. SSTR2 in nasopharyngeal carcinoma: relationship with latent EBV infection and potential as a therapeutic target
Li et al. Screening and validating the core biomarkers in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma
WO2012015836A1 (en) Highly potent peptides to control cancer and neurodegenerative diseases
CN108034655A (zh) 一种长非编码rna及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用
CN106148337B (zh) 长非编码rna ay927503及其用途
CN106834288B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用
CN109652555A (zh) 一种诊治恶性肿瘤的分子标志物
CN109628455A (zh) 一种检测人结肠癌的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用
CN105969846A (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用
CN105734155A (zh) 软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用
WO2007069423A1 (ja) アレルギー診断用マーカー

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161109

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication