CN114371289A - 一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用 - Google Patents
一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114371289A CN114371289A CN202011528210.XA CN202011528210A CN114371289A CN 114371289 A CN114371289 A CN 114371289A CN 202011528210 A CN202011528210 A CN 202011528210A CN 114371289 A CN114371289 A CN 114371289A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirt7
- phosphorylation
- antibody
- marker
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 33
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 68
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 68
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 10
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 claims description 9
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 claims description 9
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 6
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 18
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 102000011990 Sirtuin Human genes 0.000 description 6
- 108050002485 Sirtuin Proteins 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 6
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical group [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 2
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- SNHRIJBANHPWMO-XGEHTFHBSA-N Cys-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)N)O SNHRIJBANHPWMO-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000005971 DNA damage repair Effects 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQJOKDAYFULYIX-AVGNSLFASA-N Lys-Pro-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 UQJOKDAYFULYIX-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RMODQFBNDDENCP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004938 stress stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 1
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01098—Histone deacetylase (3.5.1.98), i.e. sirtuin deacetylase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用。具体方法为作为标志物的所述SirT7‑S288位点的磷酸化形式是在前期根据化疗药物胁迫结合磷酸化质谱鉴定筛选出来的在化疗药物处理后，SirT7‑S288位点磷酸化增强，通过制备针对SirT7‑S288位点特异的磷酸化抗体用以检测SirT7的磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标。本发明制作了特异的SirT7‑S288p磷酸化抗体，可特异性检测到接受化疗药物处理的肿瘤细胞中SirT7是否发生S288位的磷酸化，从而预见肿瘤细胞是否耐药。为肿瘤化疗药物的针对性选择提供可能性，为肿瘤精准治疗提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞耐药性检测技术领域，尤其涉及一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用。
背景技术
化疗在肿瘤的治疗中占有重要地位，但肿瘤细胞极易对化疗药物产生耐药性，一旦癌细胞产生耐药性，化疗药物就无法杀伤癌细胞，但却对正常细胞造成杀伤，引起越来越大的副作用，导致治疗失败，肿瘤细胞耐药性成为治疗肿瘤的最大障碍之一。肿瘤化疗采用最多的药物是DNA损伤药物，而DNA损伤药物对DNA造成的损伤可以通过细胞中不同的DNA修复机制得到修复，这也是细胞对DNA损伤药物产生耐药性的主要原因。然而，患者对化疗药物的耐受性是有个体差异的，如何预测药物的耐药性及敏感性是如何选择用药的关键。对于药物敏感性以及耐药性的许多潜在生物标记物研究已经有一些，但仅有极少数有潜在临床应用的可能，并且相对于分子靶向治疗及免疫检测点治疗的靶向指示性，DNA损伤药物缺乏相应的生物标记物来靶向指导药物的选择，因此，在个体化治疗以及精准医学背景下，开发研究更多的肿瘤耐药的检测指标，这也将是实施肿瘤预见、预后、个体化化疗的前提。
蛋白磷酸化修饰在肿瘤化疗耐药性中发挥重要的作用，蛋白磷酸化是将外界刺激转化为细胞内信号的一个主要机制，是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控形式。由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的硝酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在多种生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。人类蛋白质组中含有十万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在细胞内活性调控中发挥重要的作用。在肺癌细胞中，p-GSK-3βser9升高是造成肺癌耐药性的原因之一，Cx43-S368的磷酸化上调是造成卵巢癌化疗耐药的主要原因。因此，深入研究蛋白磷酸化修饰与肿瘤耐药的关系与调控机制，有利于开发肿瘤耐药预测指标及指导化疗用药。
组蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族是调控肿瘤化疗耐药中非常关键的一类蛋白，它们是与酵母Sir2同源的相关酶类。Sirtuin家族由七个成员组成，SirT1-7，它们都有一个保守的NAD依赖的催化核心区，促进NAD依赖的去乙酰化酶活性以及ADP核糖转移酶活性。Sirtuins依赖于其去乙酰化活性，参与调控细胞的代谢、衰老、增殖、抗压及炎症氧化应激反应等。Sirtuins具有复杂的促癌或抑癌作用，其中SirT7是Sirtuin家族中唯一定位在核仁的蛋白，大量的癌症研究将SirT7归为原癌基因，一方面SirT7通过去乙酰化H3K18维持癌症的特征，另外一方面SirT7促进rDNA转录这一功能也正好符合癌细胞快速增殖对核糖体生成的需要。SirT7自身并没有表现出原癌基因的特性，因为过表达SirT7并不能导致原生纤维母细胞发生癌变，因此认为在癌细胞中SirT7过量表达可能是为了满足快速增殖的癌细胞对核糖体生成的需求。最近报道SirT7通过去琥珀酰化H3K22促进染色体凝集以及参与双链DNA损伤(DSB)修复，这些研究揭示SirT7可能作为肿瘤研究的热点蛋白，但SirT7能否作为肿瘤耐药检测或治疗的靶点，目前的研究还不够，还需要解决的问题是SirT7如何参与化疗药物胁迫以及SirT7的上下游调控如何。据报道，SirT7的磷酸化修饰介导SirT7的定位改变，对其功能影响至关重要。因此，研究SirT7的磷酸化修饰与肿瘤耐药的关系与调控将变得极为有意义，有利于寻找肿瘤化疗药物耐药性预测标志物，可实际用于临床肿瘤预测预后与指导化疗用药。
发明内容
本发明的目的在于解决SirT7如何参与化疗药物胁迫以及SirT7的上下游调控如何的问题，提供一种基于SirT7-S288的预测肿瘤细胞化疗耐药性的高灵敏度、高特异性、可实际应用于肿瘤化疗耐药性预测的生物标志物、其制备方法。为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
作为本发明的第一个方面，在于提供一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物，所述标志物为组蛋白去乙酰化酶SirT7-S288位点磷酸化。
作为标志物的所述SirT7-S288位点的磷酸化形式是在前期根据化疗药物胁迫结合磷酸化质谱鉴定筛选出来的在化疗药物处理后，SirT7-S288位点磷酸化增强，通过制备针对SirT7-S288位点特异的磷酸化抗体用以检测SirT7位点的磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标。
作为本发明的第二个方面，在于提供所述标志物的应用，通过制备针对SirT7-S288位点磷酸化的特异性抗体，标记所述标志物；
具体地，所述抗体制备方法包括如下步骤：
步骤一：以SirT7-S288位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段14个氨基酸的SirT7-S288合成肽；
步骤二：合成含SirT7-S288磷酸化位点的抗原合成肽；
步骤三：全抗原免疫兔子及收集抗血清：将步骤二中SirT7-S288抗原合成肽与佐剂联合免疫SFP级新西兰大白兔，采用背部皮肤注射，多点注射抗原乳状液；免疫次数包括3次注射和最后一次加强注射，产生SirT7-S288特异性磷酸化抗体，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；
步骤四：纯化并鉴定SirT7-S288特异性磷酸化抗体，即p-SirT7-S288磷酸化抗体：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离-亲和纯化方法，先过一次非磷酸化合成肽偶联的层析柱去除抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体的血清；然后将上述血清过一次磷酸化合成肽偶联的层析柱，最后洗脱得到磷酸化抗体的血清，最后通过Western blot实验鉴定抗体的效价；
步骤五：采用SirT7-S288特异性磷酸化抗体检测SirT7-S288磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标。
进一步的，步骤一中所述合成肽的其氨基酸序列为CMTKPPSRRPKLYI，如序列表SEQID NO：1所示。
进一步的，所述标志物的应用，在于肿瘤耐化疗药物检测以及耐辐射等相关肿瘤治疗预测。
更进一步的，作为本发明的第三个方面，作为所述标志物的一种应用方式，还在于制备肿瘤耐药或耐辐射相关的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述SirT7-S288特异性磷酸化抗体，以及封闭液、二抗、显色液和缓冲液。
优选的，所述化疗药物包括但不限于N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍或依托泊苷。
作为本发明的第四个方面，所述标志物的应用，在于以SirT7-S288位点磷酸化作为肿瘤抑制剂药物的靶点，以及以SirT7-S288作为肿瘤治疗的分子靶点。
所述药物包括药物学上可以接受的载体；所述载体为稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、或吸附载体。
作为本发明的第五个方面，在于提供一种核酸，所述核酸编码由编码所述合成肽的碱基序列组成，其核苷酸序列为：
TGCATGACCAAGCCCCCCAGCAGGAGGCCCAAGCTGTACATC，如序列表SEQ ID NO：2所示。
与现有技术相比，本发明的优点及效果是：
本发明涉及一种检验肿瘤细胞是否耐药的标志物及其应用。该标志物是组蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族中的成员SirT7蛋白第288为丝氨酸磷酸化。本发明研究证明：在化疗药物处理下，SirT7发生明显的磷酸化修饰；SirT7-S288是SirT7重要的磷酸化修饰位点，并且参与DNA损伤修复介导的肿瘤细胞耐药性。本发明制作了特异的SirT7-S288p磷酸化抗体，可特异性检测到接受化疗药物处理的肿瘤细胞中SirT7是否发生S288位的磷酸化，从而预见肿瘤细胞是否耐药。本发明将SirT7-S288磷酸化修饰作为肿瘤耐药检测指标，为肿瘤化疗药物的针对性选择提供可能性，为肿瘤精准治疗提供新思路。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1.在化疗药物处理下，SirT7的磷酸化修饰变化及质谱鉴定发生磷酸化的重要位点，其中，图a为化疗药物处理下SirT7的磷酸化水平；图b为质谱样品考马斯亮蓝染色图；图c为化疗药物处理下质谱的鉴定位点。
图2.特异的p-SirT7-S288磷酸化抗体的制备及特异性验证，其中，图a为抗体纯化的原理图；图b为抗体特异性验证。
图3.p-SirT7-S288抗体指示SirT7在化疗药物胁迫下的磷酸化变化。
图4.在化疗药物处理下SirT7的定位及p-SirT7-S288对其定位的重要作用。
图5.p-SirT7-S288决定细胞在化疗处理下的存活率。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。当然实施例中仪器和材料的采用并不局限于本实例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。
本发明的研究主要包括四个方面的内容：SirT7-S288位点的筛选，p-SirT7-288特异性抗体制备，p-SirT7-288的亚细胞定位，p-SirT7-288参与肿瘤细胞耐药性。
具体的技术方案如下：
将过表达SirT7的肿瘤细胞用化疗药物处理，富集SirT7，发现SirT7的磷酸化修饰明显增强，通过磷酸化质谱鉴定出SirT7的磷酸化位点，SirT7-288。
针对SirT7-S288位点设计特异的磷酸化抗原，制备特异的磷酸化抗体p-SirT7-S288，验证该抗体的特异性，并进一步验证化疗药物处理下，细胞中SirT7-S288发生磷酸化。
采用细胞免疫荧光技术，同时结合DAPI染色法，利用荧光显微镜研究化疗药物处理下SirT7的亚细胞定位，证实SirT7在化疗药物刺激下发生从核仁到核质的重定位。进一步，本发明构建SirT7-288S突变成A(磷酸化缺失突变体)以及突变成D和E(D和E代指磷酸化模拟突变体)的表达质粒，转染细胞，荧光显微镜下观察定位，发现SirT7-288D定位在核质中，证实p-SirT7-S288定位在核质中。
根据ShRNA设计原则设计、化学合成针对SirT7的ShRNA，病毒包装，构建SirT7敲低的稳转肿瘤细胞株，然后对其进行化疗药物处理，观察细胞生长情况，MTT法检测细胞死亡的变化。接下来，设计SirT7-WT/288A/D/E回复突变质粒,病毒包装，构建SirT7回复突变的稳转肿瘤细胞株，观察化疗药物胁迫对每组细胞增殖的影响，MTT法检测细胞死亡的变化。结果证实SirT7-288A可以通过促使肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤耐药。
实施例1、SirT7在相应化疗药物刺激下磷酸化变化及关键磷酸化位点鉴定
将Flag-SirT7转染到293T细胞中，20小时以后对细胞分别处理10小时的N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)(10μM)、依托泊苷(Etoposide)(80μM)，收集细胞，用Flag-M2-beads富集Flag，做Western Blot检测，用泛磷酸化抗体(购于Cell Signaling Technology公司，货号25081)检测磷酸化，Flag抗体检测细胞中总的Flag-SirT7的量，图1a显示化疗药物增强SirT7的磷酸化水平。
将Flag-SirT7转染到293T细胞中，24小时后用Etoposide(80μM)处理10小时，收集细胞，用Flag-M2-beads富集Flag，用考马斯亮蓝染色法鉴定Flag-SirT7富集情况，图1b显示富集的SirT7以及与SirT7结合的蛋白条带。
将图1b中得到的SirT7的条带去磷酸化质谱鉴定SirT7重要的磷酸化位点，图1c显示S288位点是SirT7潜在的磷酸化位点。
结果如图1所示，在化疗药物刺激下，SirT7的磷酸化水平明显增强，质谱鉴定出S288是重要的磷酸化位点。
实施例2、特异的p-SirT7-S288磷酸化抗体的制备、纯化及特异性验证
制备过程：
步骤一：以SirT7-S288位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段14个氨基酸的SirT7-S288合成肽；步骤一中所述合成肽的其氨基酸序列为CMTKPPS(p)RRPKLYI；
步骤二：合成含SirT7-S288磷酸化位点的抗原合成肽，在本实施例中，所述SirT7-S288合成肽由上海吉尔生化生物科技有限公司合成，具体过程为：氨基酸S288上添加磷酸化基团，并与载体蛋白血蓝蛋白KLH偶联形成全抗原合成肽，与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和纯化的填料，所有合成肽都经HPLC的纯化和质谱检测；
步骤三：全抗原免疫兔子及收集抗血清：将步骤二中合成的SirT7-S288磷酸化位点的抗原合成肽(即，Ser288位点磷酸化合成多肽)与佐剂(弗氏完全佐剂)联合免疫SFP级新西兰大白兔，采用背部皮肤注射，多点注射抗原乳状液。免疫次数包括3次注射和最后一次加强注射，产生SirT7-S288特异性磷酸化抗体，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；
步骤四：纯化并鉴定SirT7蛋白Ser288特异性磷酸化抗体：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离-亲和纯化方法：先过一次非磷酸化合成肽偶联的层析柱去除抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体的血清；然后将上述血清过一次磷酸化合成肽偶联的层析柱，最后洗脱得到磷酸化抗体的血清，最后通过Western blot实验鉴定抗体的效价。
制备兔多抗p-SirT7-S288并纯化过程如图2中a图所示，具体过程如下所述：
制备过程
1)先用生理盐水稀释抗原短肽，将抗原短肽与佐剂以1:1的比例混匀，形成稳定的乳剂，此操作步骤在4℃完成。
2)从家兔的耳缘静脉取出大约1ml血液，取血清，在后续检测抗体效价时可作为阴性对照。
3)抗原免疫：一共要进行三次免疫。
(1)第一次免疫，将1ml弗氏完全佐剂(FCA)与溶解在1ml缓冲液中的100μg抗原充分混匀，达到“油包水”的状态，在兔子背部脊椎皮下分6-10次注射；
(2)一周以后进行第二次免疫，将1ml弗氏不完全佐剂(FIA)与1ml缓冲液溶解的100抗原充分混匀，在兔子背部脊椎皮下(避开第一次免疫的部位)分6-10次注射；
(3)一周以后进行第三次免疫，操作方法与第二次相同。
4)心脏取血：免疫完成后，从耳缘静脉取1ml血液，取血清做western blot检测抗体效价。如果效价较高，则将兔子麻醉后进行心脏取血；如果效价不高，则需要再次进行免疫。将兔子进行心脏取血后，静置取血清，进行抗体纯化。
纯化过程：
1)准备Sulfolink Coupling树脂柱
(1)将Sulfolink Coupling树脂与其他试剂放到室温平衡一会。
(2)用减掉前端的1ml枪头吸取2ml树脂放到专用过滤柱中，将过滤柱下端的塞子拿掉，使树脂中的液体流出，直至剩余1ml的树脂固体。
(3)将过滤柱下端塞住，向过滤柱中加入4ml的Coupling buffer平衡树脂，再将过滤柱下端塞子拿掉，使Coupling buffer流出，重复一次，将过滤柱下端塞住。
2)将多肽或蛋白结合到树脂上
(1)用2ml Coupling buffer溶解2mg多肽，从中取出20μl用于检测结合效率，其余的液体全部加入过滤柱中。
(2)将过滤柱上下都封住，室温旋转孵育15分钟。
(3)取下过滤柱，静置30分钟，将上下都打开，过滤柱内的液体流出，流出20μl液体放到EP管，做好标记。
(4)检测第1步中的多肽溶解液与第3步中的流出液在280nm处的吸光值，通过读值差距判断树脂结合多肽的效率。
3)封闭树脂上的非特异性结合位点
(1)向过滤柱中加入4ml的Coupling buffer，再流出以清洗树脂，之后将下端出口塞住，再加入与树脂等体积的L-Cystein e·HCl(50mM)。
(2)将过滤柱的上下都盖紧，室温旋转孵育15分钟。
(3)取下过滤柱，室温静置30分钟，将上下都打开，让过滤柱内的液体流出。
4)清洗过滤柱
(1)向过滤柱中加入6ml的NaCl(1M)，然后流出。
(2)向过滤柱中加入4ml的Storage buffer，然后再流出。
(3)用Storage buffer浸泡一会，4℃保存。
5)亲和纯化抗体的步骤
配制试剂
Binding/Wash Buffer：PBS，1M NaCl
Elution Buffer：0.1M-0.2M Glycine·HCl(PH 2.5-4.0)
Neutralization Buffer：1M Tris·HCl
(1)准备柱子：将亲和过滤柱平衡到室温，取下上下塞子，让过滤柱内的Storagesolution流出，向过滤柱内加入6ml binding Buffer，然后流出。
(2)去掉血清中未结合到树脂的成分：向过滤柱内加入5ml的血清样品，上下塞子都塞好，4℃旋转孵育2-12小时，之后取下过滤柱，拿掉上下塞子，液体流出，收集样品，向样品中加入0.05％NaN3置于4℃保存，用PBS冲洗过滤柱。
(3)洗脱结合在树脂上的非特异杂质：再向过滤柱中加入500μl的Glycine(PH-4)，然后取下塞子，让液体自然流出，用EP管收集，重复三次，每次一管，置于冰上，之后向每管中加入100ul的Tris·HCl，中和洗脱液的酸性，便于储存。
(4)洗脱目的蛋白：再用Glycine-HCI(PH-2.5)洗脱过滤柱，每次都收集到一个EP管中，重复7次，这样目的蛋白就被洗脱下来了。
(5)检测浓度：检测每个EP管中的液体在280nm波长处的吸光值。
(6)检测IgG：每管各取出10μl再加入10μl的2×SDS loading，制成蛋白质样品，上样、电泳、考马斯亮蓝染色，如果在55KD和25KD处有清晰的条带，就说明我们已经把血清中的IgG结合下来并洗脱成功。
(7)透析：综合280nm处的吸光值和考马斯亮蓝的染色结果，选取效价最高的一管或多管液体，PBS缓冲液透析。
验证纯化后的抗体的特异性：
将Flag-SirT7-WT、Flag-SirT7-288A(去磷酸化的形式)及Flag-SirT7-288A(去磷酸化的形式)转染到293T细胞中，24小时以后收集细胞，用Flag-M2-beads富集Flag，用抗p-SirT7-S288抗体验证抗体特异性，结果如图2b所示，p-SirT7-288A抗体特异性非常好，而且效价较高。
实施例3、p-SirT7-S288抗体检测SirT7在化疗药物处理下的磷酸化
将Flag-SirT7转染到293T细胞中，20小时以后分别处理Etoposide(80μM)3小时，收集细胞，用Flag-M2-beads富集Flag，用western blot方法检测SirT7的磷酸化，用抗p-SirT7-S288抗体显示SirT7在Ser288位点的磷酸化水平。
结果如图3所示，发现在Etoposide处理下，SirT7的磷酸化水平明显升高，表明SirT7-S288是SirT7在响应化疗药物刺激时关键的磷酸化位点。
实施例4、p-SirT7-S288定位在核质的研究：
首先构建SirT7-S288去磷酸化的形式(S288A)以及模拟磷酸化的形式(S288D)，然后将Flag-SirT7-WT/288A/288D分别转染到HeLa细胞中，20小时以后处理Etoposide(80μM)，12小时以后用4％多聚甲醛固定细胞，用Flag一抗、红色荧光标记二抗来识别Flag-SirT7，在荧光显微镜下观察不同条件下SirT7的定位。
结果如图4所示，SirT7在化疗药物刺激下从核仁转移到核质中，SirT7-S288A无论在正常情况还是化疗药物刺激下的定位均在核仁，SirT7-288D无论在正常情况还是化疗药物刺激下，定位均在核质。表明磷酸化形式p-SirT7-S288定位在核质。
实施例5、p-SirT7-S288标记肿瘤细胞的耐药性
SirT7敲低细胞在不同化疗药物胁迫刺激下的细胞存活率。首先构建SirT7基因敲低的稳转细胞株HeLa，然后将SirT7正常及敲低的稳转细胞株分别用化疗药物(MNNG/Etopside)处理24小时，MTT法检测两种细胞的存活率，图5中a图显示SirT7敲低的肿瘤细胞对化疗药物更敏感。
构建SirT7回复突变稳转细胞株：SirT7-Si+WT，SirT7-Si+288A(去磷酸化形式)，SirT7-Si+288D(模拟磷酸化形式)、SirT7-Si+288E(模拟磷酸化形式)，然后将这些稳转细胞株分别用Etoposide(100μM)或者MNNG(10μM)处理24小时，然后用MTT法检测每组细胞株的存活率。
结果如图5中b图所示，磷酸化形式p-SirT7-S288(SirT7-Si+288D或者SirT7-Si+288E)抵抗化疗药物对细胞的杀伤，标记肿瘤细胞的耐药性。
实施例6：采用SirT7-S288特异性磷酸化抗体检测SirT7-S288磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标，Western blot检测过程如下所述：
Western blot检测
(1)配制变性聚丙烯酰胺凝胶：将胶板清洗干净，按正确的顺序安置在制胶架上；检漏；配制分离胶，ddH2O密封；待分离胶凝固，配制浓缩胶，然后插上梳子，待浓缩胶完全凝固后就可以使用了。
(2)电泳：将配好的胶与电泳槽安置好；将running buffer加入电泳槽中；上样；将电泳仪的电压调到80V开始电泳，当loading完全进入分离胶时，将电压调高到120V，直至loading到达分离胶的底部，结束电泳。
(3)转膜：将PVDF膜在甲醇中浸泡30s后也放入transfer buffer中备用；将transfer buffer加入到转膜槽中，并提前用冰水混合物冷却；按正确的顺序将海绵、滤纸、胶和PVDF膜放置好，然后都放在转膜槽的卡槽中；启动电泳仪，使用80V电压进行转膜，一般所需的时间是90min。
(4)封阻：将转好膜的PVDF膜放入PBST配制的5％的脱脂牛奶，室温摇床孵育1-1.5小时。
(5)加一抗：用5％脱脂牛奶将特异性的一抗稀释到适当的浓度，室温摇床上孵育2小时或4℃摇床过夜。然后用PBST室温洗涤3-4遍，每次10min。
(6)加二抗：用5％脱脂牛奶将对应的二抗(偶联有HRP)稀释到所需要的浓度，室温下孵育2-2.5小时，然后用PBST室温洗涤4-5遍，每次10分钟。
(7)显影及定影：在暗房中，吸掉PVDF膜上面的液体，将混合好的发光试剂A、B液滴在膜上；将PVDF膜放在避光盒子中，覆盖上X光片；将X光片依次显影和定影；冲洗干净X光片，于烘箱中烘干，即可分析结果。
10×Running buffer(电泳缓冲液)
10×Transfer buffer(转膜缓冲液)
Tris 165g
Glycine 720g
ddH2O 至5L
实施例7：肿瘤耐药或耐辐射相关的ELISA检测试剂盒
所述试剂盒包括所述SirT7-S288特异性磷酸化抗体，以及封闭液、二抗、显色液和缓冲液。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东秉泰生物科技有限公司
<120> 一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用
<130> 2020.12.07
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Cys Met Thr Lys Pro Pro Ser Arg Arg Pro Lys Leu Tyr Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tgcatgacca agccccccag caggaggccc aagctgtaca tc 42
Claims (10)
1.一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物，其特征在于，所述标志物为组蛋白去乙酰化酶SirT7-S288位点磷酸化。
2.根据权利要求1提供的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，通过制备针对SirT7-S288位点磷酸化的特异性抗体，标记所述标志物。
3.根据权利要求2所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，所述抗体制备方法包括如下步骤：
步骤一：以SirT7-S288位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段14个氨基酸的SirT7-S288合成肽；
步骤二：合成含SirT7-S288磷酸化位点的抗原合成肽；
步骤三：全抗原免疫兔子及收集抗血清：将步骤二中SirT7-S288抗原合成肽与佐剂联合免疫SFP级新西兰大白兔，采用背部皮肤注射，多点注射抗原乳状液；免疫次数包括3次注射和最后一次加强注射，产生SirT7-S288特异性磷酸化抗体，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；
步骤四：纯化并鉴定SirT7-S288特异性磷酸化抗体：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离-亲和纯化方法，先过一次非磷酸化合成肽偶联的层析柱去除抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体的血清；然后将上述血清过一次磷酸化合成肽偶联的层析柱，最后洗脱得到磷酸化抗体的血清，最后通过Western blot实验鉴定抗体的效价。
4.根据权利要求3所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，最后还包括如下步骤：采用SirT7-S288特异性磷酸化抗体检测SirT7-S288磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标。
5.根据权利要求3所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，步骤一中所述SirT7-S288合成肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
6.根据权利要求2所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，在于肿瘤耐化疗药物检测以及耐辐射相关肿瘤治疗预测。
7.根据权利要求6所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，所述化疗药物包括但不限于N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍或依托泊苷。
8.根据权利要求2所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，在于以SirT7-S288位点磷酸化作为肿瘤抑制剂药物的靶点，以及以SirT7-S288作为肿瘤治疗的分子靶点。
9.一种肿瘤耐药或耐辐射相关的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3任一项所述SirT7-S288特异性磷酸化抗体，以及封闭液、二抗、显色液和缓冲液。
10.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码由编码权利要求3～5任一项所述合成肽的碱基序列组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011105584 | 2020-10-15 | ||
| CN2020111055840 | 2020-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114371289A true CN114371289A (zh) | 2022-04-19 |
| CN114371289B CN114371289B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=81138064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011528210.XA Active CN114371289B (zh) | 2020-10-15 | 2020-12-22 | 一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114371289B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002030970A2 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Human histone deacetylase gene |
| CN101035527A (zh) * | 2004-09-13 | 2007-09-12 | 伊利舍医药品公司 | 治疗疾病的方法 |
| US20100048414A1 (en) * | 2008-05-09 | 2010-02-25 | The Regents Of The University Of California A California Corporation | Novel methods for predicting and treating tumors resistant to drug, immunotherapy, and radiation |
| CN105585636A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-05-18 | 南方医科大学 | 一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用 |
| CN109652555A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-19 | 山东秉泰生物科技有限公司 | 一种诊治恶性肿瘤的分子标志物 |
| CN111450098A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-28 | 中国科学院动物研究所 | 拉米夫定在延缓衰老中的应用以及制备用于筛选延缓衰老药物的细胞模型 |
-
2020
- 2020-12-22 CN CN202011528210.XA patent/CN114371289B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002030970A2 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Human histone deacetylase gene |
| CN101035527A (zh) * | 2004-09-13 | 2007-09-12 | 伊利舍医药品公司 | 治疗疾病的方法 |
| US20100048414A1 (en) * | 2008-05-09 | 2010-02-25 | The Regents Of The University Of California A California Corporation | Novel methods for predicting and treating tumors resistant to drug, immunotherapy, and radiation |
| CN105585636A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-05-18 | 南方医科大学 | 一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用 |
| CN109652555A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-19 | 山东秉泰生物科技有限公司 | 一种诊治恶性肿瘤的分子标志物 |
| CN111450098A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-28 | 中国科学院动物研究所 | 拉米夫定在延缓衰老中的应用以及制备用于筛选延缓衰老药物的细胞模型 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHEN XIAO等: "Dicer regulates non-homologous end joining and is associated with chemosensitivity in colon cancer patients", 《 CARCINOGENESIS.》, vol. 38, no. 9, pages 873 - 882 * |
| JIE ZHAO等: "SIRT7 regulates hepatocellular carcinoma response to therapy by altering the p53-dependent cell death pathway", 《J EXP CLIN CANCER RES. 》, vol. 38, no. 252, pages 1 - 16 * |
| YUNFEI JIANG等: "Depletion of SIRT7 sensitizes human non-small cell lung cancer cells to gemcitabine therapy by inhibiting autophagy", 《 BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS.》, vol. 506, no. 1, pages 266 - 271 * |
| 安艳新;王菁;杨同辉;孙英刚;张小桥;: "肿瘤多药耐药分子机制研究进展", 现代生物医学进展, no. 14, pages 2793 - 2796 * |
| 徐近;朱文伟;秦毅;许文彦;吉顺荣;: "下调组蛋白去乙酰化酶1对胰腺癌细胞DNA损伤修复及放化疗抵抗的影响", 中国癌症杂志, no. 02, pages 93 - 98 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114371289B (zh) | 2024-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20050095249A1 (en) | Protein markers for lung cancer and use thereof | |
| EP2105447A1 (en) | Avian-derived antibody capable of binding specifically to human hmgb1, immunological determination method for human hmgb1, and immunological determination reagent for human hmgb1 | |
| EP3086813B1 (en) | Mtg substrates for covalent conjugation of compounds | |
| Walpurgis et al. | Testing for the erythropoiesis‐stimulating agent Sotatercept/ACE‐011 (ActRIIA‐Fc) in serum by means of Western blotting and LC‐HRMS | |
| EP3519592B1 (en) | Materials and methods for evaluating cancer | |
| JP6810609B2 (ja) | Ｅｈｄ２抗体とその乳がん免疫組織化学的検出試薬の製造への応用 | |
| Lin et al. | Neurofibromin interacts with CRMP-2 and CRMP-4 in rat brain | |
| CN114371289A (zh) | 一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用 | |
| CN105548561B (zh) | 阿尔茨海默病的诊断药和诊断方法 | |
| Santiago et al. | Extracellular signal-regulated kinase-1 phosphorylates early growth response-1 at serine 26 | |
| Fierabracci et al. | Osteopontin is an autoantigen of the somatostatin cells in human islets: identification by screening random peptide libraries with sera of patients with insulin-dependent diabetes mellitus | |
| JP4714265B2 (ja) | ニューログロビン酵素免疫測定キット及びその使用 | |
| US20100221742A1 (en) | Novel cancer associated antibodies and their use in cancer diagnosis | |
| CN114487412A (zh) | 一种检验宫颈癌细胞化疗药物耐药性的标志物及其应用 | |
| Ning et al. | An alternative strategy for high throughput generation and characterization of monoclonal antibodies against human plasma proteins using fractionated native proteins as immunogens | |
| WO2010038831A1 (ja) | 細胞増殖を伴う糖尿病合併症の検査のための方法、組成物およびキット | |
| CN112345769A (zh) | 一种基于多克隆抗体的骨钙素胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备方法 | |
| EP2187216A1 (en) | Novel liver cancer marker | |
| CN115902221B (zh) | BAZ1B_K426hy及其多克隆抗体在制备检测肿瘤的产品中的应用 | |
| CN112812187B (zh) | 一种磷酸化eif5b特异性抗体及其制备方法与应用 | |
| CN110054675B (zh) | 免疫原性多肽以及抗ttc36抗体cp4-3及应用 | |
| CN117903252A (zh) | 以smim30微小蛋白相关多肽为基础制备其多抗的方法及应用 | |
| Yon et al. | Preparation of a novel monoclonal antibody specific for myelin basic protein phosphorylated on Thr98 | |
| JP3472664B2 (ja) | 抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナル抗体 | |
| CN116199763A (zh) | Atrx抗原表位肽及其在检测脑胶质瘤中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 271000 Taishan innovation Valley, Zhengyangmen street, Daiyue district, Tai'an City, Shandong Province Applicant after: SHANDONG BTAI-BIOTECH Co.,Ltd. Applicant after: Mount Taishan Science and Technology Research Institute (Tai'an Innovation and Development Research Institute) Applicant after: The Second Affiliated Hospital of Shandong First Medical University Address before: 271000 Taishan innovation Valley, Zhengyangmen street, Daiyue district, Tai'an City, Shandong Province Applicant before: SHANDONG BTAI-BIOTECH Co.,Ltd. Applicant before: TAISHAN SCIENCE AND TECHNOLOGY Applicant before: The Second Affiliated Hospital of Shandong First Medical University |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |