CN105585636A - 一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人NOTCH1？NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)合成包含如SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸序列的抗原合成肽；(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1？NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。本发明的人NOTCH1？NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体可用于检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

Description

一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体及其制备技术领域，具体涉及一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用。

背景技术

NOTCH信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中，它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一，调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化。从果蝇到人类，NOTCH信号途径的遗传特征高度保守，而在哺乳动物中其过程尤为复杂。

NOTCH受体、NOTCH配体和细胞内效应分子CSL共同组成NOTCH信号通路。NOTCH受体为单链跨膜蛋白，其分子由胞外区(ECN)、跨膜区和胞内区(NICD)组成，具有高度保守性(参见图1)。目前哺乳动物中发现4种NOTCH基因(NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4)，各亚型的主要差异在EGF样重复的数目和胞内区的长度。NOTCH配体亦为细胞表面表达的单链跨膜蛋白，已发现人的NOTCH配体有Jagged1，Jagged2，Delta1，Delta3，Delta4。

NOTCH信号蛋白受体与配体相互作用导致NOTCH蛋白连续裂解，释放出胞内段蛋白(NICD)，NOTCH1NICD转入细胞核内，通过与CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)相互作用形成复合物，使后者由转录抑制因子转化为转录激活因子。NICD-CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)复合物直接诱导转录的靶基因是HES1，HES1是碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)类转录因子，它又调节其它与细胞分化直接相关基因的转录。在细胞分化中，NOTCH信号的功能有以下几个方面：①参与胚胎发育；②参与T细胞发育；③维持造血干细胞的自我更新；④调节血管生成。

NOTCH1信号途径参与细胞的分化、增值和凋亡，并影响许多器官的发育和功能，其病理生理改变与肿瘤、血液系统、心血管系统、干细胞等多种疾病相关。研究表明：在肿瘤的发生和发展过程中，NOTCH1信号通路发挥着不同的作用；在大多数恶性肿瘤中，NOTCH1信号主要为促癌作用，活化的NOTCH1蛋白可使细胞恶性转化发展为肿瘤，如在宫颈癌、头颈肿瘤、肾癌及多种血液系统肿瘤中均发现NOTCH1的异常表达；NOTCH1信号的紊乱会阻止细胞分化，使得未分化细胞向恶性转化；而在B细胞白血病等肿瘤中，NOTCH1则可以抑制细胞生长诱导凋亡。在宫颈癌的早期，NOTCH1信号起促癌作用，晚期则起抑癌作用。这表明NOTCH1在不同肿瘤和肿瘤的不同阶段中，其发挥的作用也不尽相同。此外，由于NOTCH1信号通路可能作为多条通路的重要交汇点，NOTCH1信号的异常不仅对肿瘤的发生有直接的作用，而且能通过对其他通路的影响间接地诱导肿瘤的发生。

磷酸化、泛素化等翻译后修饰在NOTCH信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用。细胞中NOTCH1NICD蛋白的降解对于NOTCH1信号通路的精准调控具有非常重要的意义，其半衰期主要由泛素化修饰和蛋白酶体介导的降解进行调节。已有研究表明：NOTCH蛋白泛素化修饰的前提条件是NOTCH1NICD蛋白必须进行磷酸化修饰。若NOTCH1NICD蛋白磷酸化修饰发生异常，将造成半衰期的延长而导致白血病和其它癌症的发生。因此，NOTCH1NICD蛋白的磷酸化修饰在NOTCH1信号通路的调控中扮演着重要角色。此外，已有证据表明：NOTCH1蛋白的磷酸化修饰可依赖于GSK-3β激酶，而GSK-3β激酶在Wnt-1信号通路中亦发挥重要的生物学功能，因此NOTCH信号通路与Wnt-1信号通路存在交叉反应。NOTCH1蛋白的持续活化对Wnt-1信号通路将产生一定的影响，从而导致细胞的致癌性转化。NOTCH1氨基酸序列中Ser2162位点位于NOTCH的胞内段序列区，是NOTCH1NICD蛋白磷酸化修饰的一个位点，在NOTCH1NICD蛋白降解失活的动态调控中可能具有重要的作用。

抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，磷酸化抗体的制备和应用已成为国际上关注的热点。

发明内容

本发明目的在于解决在NOTCH1信号通路中发挥重要作用的NICD蛋白磷酸化修饰有效研究的问题，NOTCH1NICD蛋白发挥作用的首要条件是进行翻译后修饰作用，如磷酸化修饰。为此本发明提供一种特异性针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法。

本发明提供的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法可以包括以下步骤：(1)合成包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的抗原合成肽；(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

上述步骤(1)中所述的抗原合成肽可以通过以下步骤合成：以人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser2162上添加磷酸化基团，同时在N末端连接一个半胱氨酸与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)进行偶联。

上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可以包括：用上述步骤(1)合成的抗原合成肽与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。

上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可以包括：将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对目的合成肽的效价及其是否能够特异性识别目的合成肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Dotblot和Westernblot实验确定抗血清是否能够特异性识别磷酸化NOTCH1NICD蛋白。

上述利用亲和分离‐亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤可以包括：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首次采用非磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

本发明还提供一种通过上述方法所制备的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

本发明还提供上述人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。

本发明还提供一种用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂，其包括上述的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

本发明还提供一种合成肽在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用，所述合成肽包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。

上述药物制剂包括上述的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

本发明制备得到的高特异性的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体可用Westernblot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究NOTCH1NICD蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，还可以用ICC、ELISA等免疫学相关实验以检测人NOTCH1NICD蛋白的磷酸化水平，探讨其与肿瘤、血液系统、心血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

本发明的优点及实现的有益效果：(1)本发明提供磷酸化抗体在实际应用中能够检测人NOTCH1NICD蛋白的翻译后磷酸化修饰情况；(2)本发明提供的磷酸化抗体在实际应用中便于探讨人NOTCH1NICD蛋白特定位点磷酸化修饰与特定生物学事件如细胞应激、DNA损失、细胞周期等的相关性；(3)本发明是针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化的激酶作用，探讨人NOTCH1NICD蛋白多种生物学功能在NOTCH1细胞信号通路及蛋白/核酸相互作用网络；(4)本发明提供的磷酸化抗体有助于探讨NOTCH1NICD蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，亦可用于检测用药后肿瘤相关蛋白表达的差异，为临床肿瘤疾病的诊断与治疗提供潜在的作用靶点。

附图说明

图1是NOTCH1蛋白结构图。

图2是根据本发明实施例的的制备与纯化高特异性的人NOTCH1NICD磷酸化抗体技术路线图。

图3是NOTCH1_HumanPhosohoSitePlus查询结果屏幕截图，其中，SS：蛋白质组学检测文献；MS：质谱检测文献。

图4是NOTCH1NICD抗原性分析结果。

图5是NOTCH1NICD疏水性性分析结果。

图6a是合成肽pSer2162-KLH的HPLC纯化结果。

图6b是合成肽pSer2162-KLH的MassSpectral检测结果。

图7a是合成肽pSer2162-BSA的HPLC纯化结果。

图7b是合成肽pSer2162-BSA的MassSpectral检测结果。

图8a是合成肽Ser2162-BSA的HPLC纯化结果。

图8b是合成肽Ser2162-BSA的MassSpectral检测结果。

图9是S2162-BSA、pS2162-BSA蛋白电泳图，其中，1：S2162-BSA；2：pS2162-BSA；M：Marker(Broad)。

图10是免疫前筛选Westernblot结果图，其中，1：BSA标准蛋白(5μg)；2：S2162-BSA合成肽(5μg)；3：pS2162-BSA合成肽(5μg)；一抗：阴性血清1:5000稀释液。

图11是pS2162-KLH蛋白电泳图，其中，M：Marker(Broad)；1：pS2162-KLH。

图12是非磷酸化层析柱和磷酸化层析柱的偶联效率检测结果，其中，M：Marker(35-200kD)；1：磷酸化肽层析柱保留液②；2：磷酸化肽层析柱保留液①；3：非磷酸化肽层析柱保留液②；4：非磷酸化肽层析柱保留液①。

图13是Doltblot鉴定洗脱液的IgG活性的结果图，其中，1：洗脱液1-5管；2：洗脱液6-10管；3：洗脱液10-15管+阳性对照点。

图14a是Dotblot检测纯化后抗体的磷酸肽特异性—阴性对照，其中，1：BSA标准蛋白：1μg，100ng，10ng，1ng，0.1ng；2：S2162-BSA合成肽：0.647μg、64.7ng、6.47ng、0.647ng、0.0647ng；3：pS2162-BSA合成肽：0.692μg、69.2ng、6.92ng、0.692ng、0.0692ng；一抗：阴性血清1:5000稀释液。

图14b是Dotblot检测纯化后抗体的磷酸肽特异性—阳性对照，其中，1：BSA标准蛋白：1μg，100ng，10ng，1ng，0.1ng；2：S2162-BSA合成肽：0.647μg、64.7ng、6.47ng、0.647ng、0.0647ng；3：pS2162-BSA合成肽：0.692μg、69.2ng、6.92ng、0.692ng、0.0692ng；一抗：纯化前抗血清1:5000稀释液。

图14c是Dotblot检测纯化后抗体的磷酸肽特异性—样品检测，其中，1：BSA标准蛋白：1μg，100ng，10ng，1ng，0.1ng；2：S2162-BSA合成肽：0.647μg、64.7ng、6.47ng、0.647ng、0.0647ng；3：pS2162-BSA合成肽：0.692μg、69.2ng、6.92ng、0.692ng、0.0692ng；一抗：纯化后抗血清1:500稀释液。

图15a是Westernblot检测纯化后抗体的磷蛋白特异性—阳性对照，其中，1：pS2162-BSA合成肽(5μg)；2：S2162-BSA合成肽(5μg)；3：BSA标准蛋白(5μg)；一抗：纯化前抗血清1:10000稀释液。

图15b是Westernblot检测纯化后抗体的磷蛋白特异性—样品检测，其中，1：BSA标准蛋白(5μg)；2：S2162-BSA合成肽(5μg)；3：pS2162-BSA合成肽(5μg)；一抗：纯化后抗血清1:500稀释液。

图16是纯化抗体的ELISA检测数据图。

图17是磷酸化抗体检测MKN-45细胞的Westernblot结果图，其中，1：MKN-45细胞RIPA裂解物；2：2.5μg/mlACGs刺激MKN-45细胞36h的RIPA裂解物3：5μg/mlACGs刺激MKN-45细胞36h的RIPA裂解物；4：10μg/mlACGs刺激MKN-45细胞36h的RIPA裂解物；一抗：纯化后抗血清1:500稀释液。

具体实施方式

参见图2，本发明实施例提供的针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法与应用，总体上包括以下步骤：

步骤一：首先通过生物信息软件筛选人NOTCH1NICD氨基酸序列(NP_060087)中可能发生磷酸化的位点，并通过质谱文献确定了人NOTCH1蛋白(NP_060087)中胞内段蛋白(NICD)的2162位点丝氨酸(Ser)发生磷酸化修饰，分析该位点为高抗原性、高亲水性，并以该位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段9个aa的合成肽，并且分析其同源性；

步骤二：合成含Ser2162磷酸化位点的抗原合成肽。采用多肽合成技术合成步骤一所设计含Ser2162磷酸化位点的9个aa半抗原合成肽，氨基酸Ser2162上添加磷酸化基团，并与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联形成全抗原合成肽，与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和纯化的填料，与之对应，合成非磷酸化修饰合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和分离的填料，所有合成肽都经HPLC的纯化和MassSpectral的检测；

步骤三：全抗原免疫动物及收集抗血清。将步骤二中Ser2162位点磷酸化合成肽和载体蛋白KLH偶联形成的全抗原与佐剂联合免疫SPF级新西兰大白兔，采用经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下(s.c)注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉(i.m)注射，腰部两侧进行皮内(i.d)注射，家兔爪垫部位注射等多部位多点注射抗原乳状液。免疫次数包括1次引发注射、3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；

步骤四：纯化并鉴定人NOTCH1NICD蛋白Ser2162特异性磷酸化抗体。采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离-亲和纯化循环纯化技术。首次使用非磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；第二次使用磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体，以Dotblot和Westernblot实验确定抗血清特异性识别磷酸化合成肽；最终获得纯化的抗pS2162磷酸化抗体，以2.5％(wt/vol)BSA,0.01％(vol/vol)Tween-20和25％(vol/vol)甘油的混合液保存，再次以ELISA检测纯化后抗体效价以及针对磷酸化目的合成肽、非磷酸化合成肽的识以别性，最后以Westernblot和Dotblot实验进行抗体鉴定。

以下结合具体实施例参照附图，对本发明提供的针对人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备技术路线，进一步进行阐述和说明。

实施例1确定人NOTCH1NICD蛋白磷酸化位点

1.1首先通过生物信息软件NetPhorest2.0和NetPhos2.0筛选人NOTCH1NICD蛋白中可能发生磷酸化位点，随后通过质谱文献查阅和蛋白质磷酸化位点数据库PhosohoSitePlus(图3)的查找，确证Ser2162是人NOTCH1NICD氨基酸序列中的一个磷酸化位点；同时利用软件CLCProteinWorkbench5计算人NOTCH1氨基酸序列的抗原性、亲水性(图4、图5)，最终确定人NOTCH1NICD蛋白特异性磷酸化位点Ser2162。

1.2以Ser2162位点为中心，两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段9个aa的合成肽(其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示)，并在序列的N端添加一个半胱氨酸。利用NCBI网站的blastp对该合成肽进行同源性分析，Ser2162位点合成肽序列与家兔无同源性。设计的合成肽序列为：NOTCH1_S2162：VRKPp(S)SKGL-C

实施例2合成包括Ser2162磷酸化位点的合成肽

根据半抗原合成肽的设计，在Ser2162位点上添加一个磷酸化基团得到磷酸化合成肽，并通过N端的半胱氨酸与血蓝蛋白(KLH)偶联得到全抗原用于家兔免疫，经HPLC的纯化后纯度为95％以上(图6a)。在Ser2162位点上添加一个磷酸化基团得到磷酸化合成肽，并通过N端的半胱氨酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和纯化层析柱的填料，经HPLC的纯化后纯度为90％以上(图7a)。与之相应，合成一段非磷酸化合成肽并通过N端的半胱氨酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和分离层析柱的填料，经HPLC的纯化后纯度为90％以上(图8a)。所有合成肽都经MassSpectral的检测，结果如图6b、7b和8b。

实施例3所述全抗原按常规制备多克隆抗体的方法制备抗血清。

3.1制备阴性血清：从用于注射的新西兰大白兔(2～3kg，雌性，健壮，南方医院实验动物中心提供)的耳静脉采取3mL血液于采血管中，用棉球压迫止血。将血液置室温1h左右，待血液凝固形成血块，4℃下放置2h使血清析出，2500g离心10min，吸取上清，标记为阴性对照血清，分装并贮存于-20℃待测。

3.2免疫前筛选-Westernblot：BCA蛋白浓度检测试剂盒测定已溶的磷酸化合成肽-BSA的浓度，S2162-BSA、pS2162-BSA的浓度分别为1.1mg/ml、0.845mg/ml，R²＝0.991；蛋白电泳(分子量大小约为66kD)结果如图9：泳道一为S2162-BSA，泳道二为pS2162-BSA，由于合成肽为人工合成，因此蛋白条带为一段粗宽条带；因磷酸化修饰使得pS2162-BSA合成肽的条带略高于S2162-BSA合成肽的条带。取溶解后的纯化抗原5μg，加入适当的5×SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸10min使蛋白质变性，10000×g离心10min；SDS-PAGE电泳分离胶为10％，浓缩胶为5％；按预定顺序使用加样枪上样，在不用的样品孔中加等体积的5×SDS凝胶上样缓冲液；60V20min电泳后改为100V约70min，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。转膜条件：恒流180mA，时间为180min。5％脱脂奶粉封闭，摇床37℃2h。将转印膜放入用TBST缓冲液按1:5000配制免疫前抗血清稀释液，水平缓慢摇匀，4℃过夜。次日37℃作用20min，弃一抗溶液，1×TBST洗膜10min，重复4次。将膜置于用1×TBST按1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG的二抗稀释液中，摇床37℃，50min。弃二抗溶液，1×TBST洗膜10min，重复3次。按照厂家说明使用ECL试剂盒显影，拍照记录。结果如图10：未出现目的条带，即未出现针对目的组织或细胞提取物的抗体，为理想实验动物。

3.3动物免疫：约73天

3.3.1用无菌的1×PBS溶解pS2162-KLH合成肽粉末，分别进行BCA蛋白定量检测和SDS-PAGE电泳检测，得到以下结果：pS2162-KLH浓度为0.176mg/ml(R²＝0.997)，共4ml；蛋白电泳结果如图11：200KD以上有明显的目的条带。用一个无菌注射器吸取抗原溶液，另一个注射器吸取等量弗氏完全佐剂(CFA)，二者之间以塑料管连接，来回反复抽吸，直至形成完全乳化的乳状液，滴于水中不扩散。

3.3.2首次免疫分别经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下(s.c)注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉(i.m)注射，腰部两侧进行皮内(i.d)注射，家兔爪垫部位注射等多部位多点注射抗原乳状液。pS2162-KLH首次免疫的抗原总量约为0.61mg。

3.3.3首次免疫20天后进行第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)代替CFA作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.9mg。

3.3.4免疫12天后进行加第二次强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)代替CFA作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.9mg。

3.3.6免疫10天后，从耳静脉采血5mL，将血液置室温1h左右，待血液凝固形成血块，4℃下放置2h使血清析出，3500g离心10min，吸取上清，标记为阳性抗血清，分装并贮存于-20℃待测。

3.3.7阳性抗血清按比例1:1000、1:5000、1:10000稀释，进行ELISA检测抗体效价，待测OD值均在1.0以上，各稀释度的阳性抗血清的P/N值分别7.0、7.4、7.3，则此时血清抗体效价至少为1:5000。抗体效价达到预期水平(ELISA效价>1:1000)，大量采血前进行最后一次加强免疫：pS2162-KLH抗原溶液直接肌肉注射家兔，约0.6mg。

3.3.8最后一次加强免疫3天后，家兔进行腹主动脉大采血，大量收集抗血清。将收集了血液的烧杯封闭后室温静置过夜，使血块收缩。次日无菌操作将析出的血清分装于50ml离心管中，4000g离心10min，取上清，分装1ml/管，标记为免疫后抗血清(共约51ml)，贮存于-20℃。

3.3.9免疫后抗血清的效价测定，具体步骤如下：

3.3.9.1用抗原包被液(CBS)将抗原pS2162-BSA按以下浓度稀释：1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL；用抗原包被液(CBS，pH9.6)将抗原pS2162-KLH稀释至2μg/mL。将稀释的抗原按下述的加样策略加入96孔酶标板中，每孔0.1ml，封盖滴定板后振荡混匀，4℃过夜包被(12h以上)。加样策略：第1-3列孔加入1μg/mL的pS2162-BSA抗原稀释液，第4-6列加入2μg/mL的pS2162-BSA抗原稀释液，第7-9列加入4μg/mL的pS2162-BSA抗原稀释液，第10-12列加入2μg/mL的pS2162-KLH抗原稀释液。

3.3.9.2包被完毕，弃去孔中的液体，1×PBST充分洗涤滴定板的各包被孔，弃去洗涤液，重复3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。各包被孔内加入封闭缓冲液(0.25％BSA/PBST)，200μl/孔，37℃孵育2h，1×PBST洗涤滴定板3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。

3.3.9.3用1×PBST将阳性血清按1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:16000的比例分别进行稀释。向A排每孔加入100μl的1×PBS缓冲液作为空白对照。用待测抗体稀释液将阴性血清按1:5000稀释，向B排每孔加入100μl作为阴性对照。向C-H排依次加入100μl/孔的1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:160000免疫后血清稀释液，盖封滴定板，37℃孵育1h。

3.3.9.4弃去孔中液体，用1×PBST洗涤滴定板3次。加入用1×PBST按1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗稀释液，100μl/孔，37℃孵育1h。盖封滴定板，37℃孵育1h。用1×PBST洗涤滴定板5次，扣干。加入临时配制的TMB显色液，100μl/孔，室温避光反应30min。加入2MH2SO4终止反应，50μl/孔。酶标仪450nm测各孔OD值。

3.3.9.5稀释度为1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:160000的免疫后抗血清的OD值均在0.5以上(见下表1)，其P/N值如表2所示，则免疫后抗血清抗体效价为1:160000以上。

表1免疫后抗血清ELISA检测的OD值

表2免疫后抗血清与阴性血清之比(P/N值)

实施例4纯化并鉴定人NOTCH1NICD蛋白Ser2162特异性磷酸化抗体

4.1磷酸化合成肽层析柱与非磷酸化合成肽层析柱的制备。

4.1.1用无菌1×PBS分别溶解S2162-BSA和pS2162-BSA，BCA蛋白定量试剂盒检测溶解浓度分别为0.647mg/ml、0.692mg/ml(R²＝0.9952)，SDS-PAGE电泳检测分子量大小正确。分别取3mL的S2162-BSA和2.8mL的pS2162-BSA溶解液，用偶联缓冲液调pH值至9.0，4℃保存溶液备用。

4.1.2称出0.3gCNBr-琼脂糖加入到15mL一次性聚丙烯锥形管中，用于1mL柱床容量的层析柱，具体用量比例见下表3。向CNBr-琼脂糖粉末加入7mL10mMHCl，室温下使用反转摇匀仪混合60min。

表3合成肽-BSA、CNBr活化的琼脂糖用量比例表

4.1.3在Bio-RadEcono-Pac柱的底部接上其附带的一个小活塞，竖起。向层析柱中加满10mMHCl，让其自然流出，重复3次。保持活塞关闭，将步骤3.1.2溶胀的CNBr-琼脂糖树脂加入到柱中，用10mMHCl冲刷15mL一次性聚丙烯锥形管并将冲刷液加入到柱中，打开活塞让其自然流出。加满10mMHCl并让其自然流出，重复3次。向层析柱柱中加入10mL偶联缓冲液并让其自然流出(激活树脂)。在最后一滴缓冲液流出前，用1.5mLEP管收集约500μl琼脂糖，标记为保留液①(未结合合成肽的CNBr-琼脂糖)，用于检测合成肽-BSA与琼脂糖的偶联效率。

4.1.4向层析柱柱中加入步骤3.1.1中pH为9.0的合成肽-BSA混合液。向层析柱中加满偶联缓冲液，盖上层析柱顶部，室温下轻轻反转摇匀层析柱的内容物1h。将层析柱置于旋转摇匀器中，4℃过夜继续混匀柱内容物。

4.1.5移去底部活塞和顶部盖子释放合成肽-BSA混合液，用1.5mLEP管标收集500μl，标记为保留液②(结合合成肽的CNBr-琼脂糖)，用于检测合成肽-BSA与琼脂糖的偶联效率。

4.1.6分别取步骤4.1.3中未结合活化的CNBr-琼脂糖和步骤4.1.5中结合BSA活化的CNBr-琼脂糖各20μl，每管加入适量的5×SDS上样缓冲液然后沸水浴煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，检测合成肽-BSA复合物与琼脂糖珠的结合程度。电泳结果如图12：未结合合成肽-BSA的琼脂糖即保留液①泳道无明显蛋白条带，合成肽-BSA偶联琼脂糖即保留液②泳道可见淡淡的目的条带。

4.1.7合成肽-BSA与琼脂糖的偶联效率检测完毕后，向层析柱中加满碱性洗脱缓冲液，让其流出并弃去。向层析柱中加满酸性冲洗缓冲液，让其流出并弃去，按上述操作重复5次。

4.1.8向层析柱中加满封闭缓冲液，让其自然流出并弃去，重复5次。将10mL封闭缓冲液倒入层析柱用于保存，4℃下可保存3个月。

4.2磷酸化抗体的纯化

4.2.1冰上解冻1mL粗制血清，微型离心机10000g、4℃离心5min，去除较大的残渣；使用冷藏的100mMNaCl以1：10稀释血清，冰上操作。

4.2.2从4℃冷藏室中取出非磷酸肽层析柱，向层析柱中加入100mMNaCl，让其自然流出。关闭活塞，加入稀释血清后加入100mMNaCl，确保层析柱顶部无多余的空位，加盖并使用封口膜密封整个层析柱，4℃下过夜温和反转摇匀。次日收集层析柱的流出液置于冰上，标记为目标液①(含目的抗体)，4℃保存。

4.2.3从4℃冷藏室中取出磷酸肽层析柱，打开层析柱的盖子和活塞，让储存溶液流出。向层析柱中加满100mMNaCl，让其自然流出。关闭活塞，加入步骤4.2.2中目标液①，加入100mMNaCl确保层析柱顶部无多余的空位，加盖并用封口膜密封整个层析柱。用反转摇匀仪4℃过夜温和反转摇匀层析柱。次日，层析柱在室温下再摇匀1h后收集流出液，标记为保留液③，4℃下保存。

4.2.4向层析柱中加入10mMTris(pH7.5)和0.5MNaCl的混合液，自然流出，弃流出液，重复3次。向层析柱中加入碱性冲洗缓冲液(pH9.5)，让其自然流出。向层析柱中加入酸性冲洗缓冲液(pH4.0)，让其自然流出。按碱性冲洗缓冲液-酸性冲洗缓冲液顺序重复洗涤层析柱3次。

4.2.5取15个1.5mL的EP管，分别加入100μl1MTris碱，标上序号。向层析柱中加入1mL的甘氨酸缓冲液洗脱(pH2.2)，使用EP管收集洗脱液，翻转摇匀中和样本并置于冰上。重复14次，共收集15管洗脱液。

4.2.6从每个EP管中取1μl用于pH试纸检测是否中和，若不显中性则用1MTris碱中和洗脱液至中性，分别标记为1～15号洗脱液。

4.2.7层析柱的再生：向层析柱中加满甘氨酸缓冲液(pH2.2)，自然流出并弃去，重复一次。向层析柱中加满10mMTris(pH8.8)，自然流出并弃去，重复一次。向层析柱中加满10mMTris(pH7.5)，自然流出并弃去，重复一次。向层析柱中加满10mMTris(pH7.5)和0.5MNaCl的混合液，自然流出并弃去，重复一次。关闭活塞，向层析柱中加入10mL封闭缓冲液层析柱中，盖上盖子，封口全密封后4℃保存。

4.3点印迹(Doltblot)鉴定洗脱液的IgG活性：从15管洗脱液中各取1μl按顺序点在一条硝酸纤维膜纸上，取阴性血清1μl作为阳性对照点在同一条硝酸纤维膜纸上，室温下等待样点完全变干。将膜置于5％脱脂奶粉(1×TBST)的封闭液中，水平摇床37℃孵育30min。弃去封闭液，用1×TBST洗10min，重复3次。将硝酸纤维膜置于含有HRP标记的羊抗兔IgG稀释液(1:5000)中，摇床37℃孵育50min。1×TBST洗10min，重复3次。按照厂家说明使用ECL试剂显影，扫描记录，结果如图13所示：3-6号洗脱液有特异性点即阳性的IgG组分，收集3-6管洗脱液并标记为IgG阳性混合液。

4.4采用Doltblot实验检测纯化后抗体的磷酸肽特异性：将S2162-BSA(0.647mg/ml)和pS2162-BSA(0.692mg/ml)分别进行梯度稀释：64.7ng/μl、6.47ng/μl、0.647ng/μl、0.0647ng/μl和69.2ng/μl、6.92ng/μl、0.692ng/μl、0.0692ng/μl；配制BSA蛋白1mg/ml，按以下梯度进行稀释：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl和0.1ng/μl。按顺序各取1μl上述3种抗原的5个浓度点样在同一条硝酸纤维膜上，另准备两条硝酸纤维膜，按第一条硝酸纤维膜方式点样，晾干所有样点。将所有膜分别置于5％脱脂奶粉(1×TBST)的封闭液，水平摇床37℃孵育30min。弃去封闭液，用1×TBST洗膜10min，共4次。将第一条硝酸纤维膜置于按1:5000稀释的阴性血清中，将第二条硝酸纤维膜置于按1:5000稀释的纯化前抗血清中，将第三条硝酸纤维膜置于按1:500稀释的IgG阳性组分混合液中，摇床37℃孵育1h。弃去溶液，用1×TBST洗膜10min，共4次。将硝酸纤维膜置于含有HRP标记的羊抗兔IgG稀释液(1:5000)中，摇床37℃孵育50min。用1×TBST洗膜10min，共3次。按照厂家说明使用ECL试剂显影，扫描记录，结果如图14a、图14b和图14c：图14a的一抗为阴性血清稀释液，图中均无出现特异性斑点；图14b的一抗为纯化前抗血清稀释液，BSA梯度点均无出现特异性斑点，S2162-BSA和pS2162-BSA合成肽梯度点的8ng水平以上的有明显的特异性斑点；图14c的一抗为纯化后抗血清稀释液，BSA梯度点均无出现特异性斑点，S2162-BSA和pS2162-BSA合成肽梯度点的6ng水平以上的有明显的特异性斑点。

4.5Westernblot检测纯化后抗体的磷蛋白特异性：BCA蛋白浓度检测试剂盒测定已溶的磷酸化合成肽-BSA的浓度，S2162-BSA、pS2162-BSA的浓度分别为0.647mg/ml、0.692mg/ml(R²＝0.9952)各取溶解后的纯化抗原5μg，加入适当的5×SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸10min使蛋白质变性，10000×g离心10min。Westernblot具体操作与步骤2.1.2至步骤2.1.8相同，其中一抗溶液改为1:500的纯化后抗体稀释液和1:10000的纯化前抗血清稀释液。结果如图15a和图15b：图15a的一抗为纯化前抗血清稀释液，BSA泳道均无出现特异性条带，S2162-BSA合成肽的5μg泳道以及pS2162-BSA合成肽的5μg泳道均有特异性条带；图15b的一抗为纯化后抗血清稀释液，BSA泳道和S2162-BSA合成肽的5μg泳道均无出现特异性条带，pS2162-BSA合成肽的5μg泳道有特异性条带。

4.6纯化后磷酸抗体制剂在Doltblot检测中表现出对非磷酸肽的反应性(图14a-c)，Westernblot检测出非特异性条带(图15a-b)，则对抗体进行重新纯化，即采用亲和分离-亲和纯化循环技术，并按上述过程进行纯化-检测-再纯化直至纯化完全(重复步骤3.3.2至步骤3.3.6；图2，h→b)。

4.7纯化后抗体特异性鉴定：最后用Westernblot和Dotblot的实验方法鉴定抗体的特异性，分别取目的磷酸化合成肽-BSA和非磷酸化合成肽抗原-BSA作为抗原进行Westernblot和Dotblot，其中一抗溶液为纯化后所得抗体制剂1:500的稀释液，二抗溶液为HRP标记的羊抗兔1:5000的稀释液；结果如图14c和图15b：一抗为纯化后抗血清稀释液的Dotblot检测，BSA和S2162-BSA合成肽梯度点均无出现特异性斑点，pS2162-BSA合成肽梯度点的8ng水平以上的有明显的特异性斑点；一抗为纯化后抗血清稀释液的Westernblot检测，BSA泳道和S2162-BSA合成肽的5μg泳道均无出现特异性条带，pS2162-BSA合成肽的5μg泳道均有特异性条带。

4.8抗体的保存：将IgG阳性组合混合液加入终浓度为2.5％(wt/vol)BSA,0.01％(vol/vol)Tween-20和25％(vol/vol)甘油的混合液，分装为1mL/管,-80℃长期保存。

4.9再次以ELISA检测纯化后磷酸化抗体的效价及针对磷酸化目的合成肽、非磷酸化合成肽的识别性。首先分别包被人工合成的磷酸化合成肽抗原-BSA和非磷酸化合成肽抗原-BSA，设置抗原量为1ug/孔，100ng/孔，10ng/孔；加入不同比例稀释的阴性血清、纯化前血清以及纯化后抗血清孵育，洗涤后加入HRP标记羊抗兔IgG稀释液，孵育后洗涤，TMB显色，反应终止测定OD450。结果如图16：稀释度为1:8000时，针对磷酸化抗原的OD450值大于0.5且P/N值大于2.1，针对非磷酸化抗原的OD450值均低于0.2，则纯化后抗体效价至少为1:8000以上。

实施例5人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体在肿瘤中的应用

5.1本发明制备得到高特异性的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体可用Westernblot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异。相关研究表明番荔枝内酯类化合物(ACGs)具有很强的肿瘤细胞抑制活性，分别用2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的ACGs刺激MKN-45胃癌细胞36h后RIPA裂解细胞提取蛋白，用人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体以Westernblot实验检测细胞提取物，结果如图17：未处理的MKN-45细胞和用2.5μg/mlACGs刺激的MKN-45细胞出现目的条带，大小约为90多kD，而5μg/ml和10μg/mlACGs刺激的MKN-45胃癌细胞未出现目的条带。由此可见，人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体可用于检测用药后肿瘤细胞的表达变化。

5.2本发明提供磷酸化抗体在实际应用中能够应用于ICC、ELISA等免疫学实验中检测人NOTCH1NICD蛋白的转录后磷酸化修饰情况，从而探讨人NOTCH1NICD蛋白磷酸化修饰在肿瘤相关疾病中的意义。

5.3人NOTCH1NICD蛋白的降解失活依赖于磷酸化修饰，其半衰期的延长可使细胞持续增殖停止分化，因此磷酸化抗体在实际应用中便于研究人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化修饰对于特定生物学事件如细胞增殖、细胞分化的影响，从而探讨其在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用。

5.4本发明提供的磷酸化抗体有助于探讨NOTCH1NICD蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，在临床应用中更利于抑制药物对肿瘤抑制作用的研究。

5.5本发明是针对人NOTCH1NICD蛋白特定Ser2162位点制备的磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化的激酶作用，探讨人NOTCH1NICD蛋白多种生物学功能在NOTCH1细胞信号通路及蛋白/核酸相互作用网络，从而发现临床肿瘤疾病的诊断和治疗的潜在作用靶点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的抗原合成肽；

(2)利用步骤(1)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；

(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的抗原合成肽通过以下步骤合成：以人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser2162上添加磷酸化基团，同时在N末端连接一个半胱氨酸与载体蛋白血蓝蛋白或牛血清白蛋白进行偶联。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的免疫动物的步骤包括：用步骤(1)合成的抗原合成肽与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤包括：将步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对目的合成肽的效价及其是否能够特异性识别目的合成肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Dotblot和Westernblot实验确定抗血清是否能够特异性识别磷酸化NOTCH1NICD蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤包括：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首次采用非磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

6.一种人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体，其特征在于，其通过权利要求1至5中任一项所述的方法所制备。

7.一种如权利要求6所述的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。

8.一种用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

9.一种合成肽在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用，其特征在于，所述合成肽包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的合成肽在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用，其特征在于，所述药物制剂包括如权利要求6所述的人NOTCH1NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。