CN106659778A - 用Notch1抗体治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗癌症的方法。更具体而言，本发明提供了包括施用一定剂量的抗Notch1抗体的治疗癌症的方法。

Description

用Notch1抗体治疗癌症的方法
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域。更具体而言，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用抗Notch1抗体。
背景技术
在发达国家，癌症是导致死亡的最大原因之一，仅在美国每年就有超过一百万人被诊断出患有癌症并有500,000例死亡。总体估计，每3人中超过1人会在其生命期间发展某种形式的癌症。
腺癌是始于腺(分泌)细胞的癌类型。腺细胞见于某些内脏器官的内衬组织中，并且在体内制造并释放物质，例如粘液、消化液或其他体液。腺癌包括但不限于乳腺、胰腺、肺、前列腺和结肠的癌。腺样囊性癌(ACC或AdCC)是腺癌的罕见形式，其往往出现在唾液腺中，但也可在身体的其他位置发现。ACC的特征通常在于进展缓慢的临床疗程并伴有多次局部复发和远端转移。最常见的转移部位是肺，但也在骨、肝脏、肾脏和脑中发现了转移。治疗通常由手术切除和/或辅助性术后放疗组成，而化疗通常用于治疗晚期的局部或转移疾病。
癌症治疗已越来越多地从使用作用于全身的细胞毒性药物转向包括更多的靶向疗法，靶向疗法精确导向允许和支持失调的细胞生长和存活的机制。例如，肿瘤血管发生是肿瘤用来建立独立的血液供应的过程，是肿瘤生长的关键步骤。尝试靶向肿瘤血管发生已成为开发新的癌症疗法的重要策略，例如抗VEGF抗体阿伐他汀。
在正常条件下，信号传导途径将细胞外信号与细胞核联系起来，导致直接或间接控制细胞生长、细胞分化、细胞存活和细胞死亡的基因的表达。在多种癌症中，信号传导途径失调，并可能与肿瘤发生和/或肿瘤进展有关。与人肿瘤发生有关的信号传导途径包括但不限于Notch途径、Ras-Raf-MEK-ERK或MAPK途径、PI3K-AKT途径、CDKN2A/CDK4途径、Bcl-2/TP53途径和Wnt途径。
Notch信号传导途径是普遍保守的信号转导系统。在包括胚胎模式形成和后胚胎组织维持的发育过程中，其参与决定细胞命运。此外，Notch信号传导已被鉴定为是保持造血干细胞的关键因素。
已将Notch途径与血液和实体肿瘤及癌联系起来。已显示，与肿瘤发生有关的多种细胞功能和微环境指示信号受到Notch途径信号传导的调节，包括细胞增殖、凋亡、粘附和血管发生(Leong等，2006,Blood,107:2223-2233)。此外，已显示Notch受体和/或Notch配体在多种人类癌症中发挥潜在的致癌作用(Leong等，2006,Blood,107:2223-2233；Nickoloff等，2003,Oncogene,22:6598-6608)。因此，已将Notch途径鉴定为潜在的癌症治疗靶点。
随着药物发现和药物开发的发展，特别是在癌症领域，“一种药物适用所有人”的方法正在向“个体化用药”策略转变。个体化用药策略可以包括基于癌症生物标志物(包括预后标志物、药效学标志物和预测性标志物)的治疗方案。通常，预测性标志物评估肿瘤或癌对特定治疗剂有响应或敏感的可能性，并且使得可以鉴定和/或选择最可能获益于使用该治疗剂的患者。
因此，需要设计新的靶向治疗策略，其能够克服目前的癌症治疗疗法的相对无效性。此外，明确需要开发出能够预测和/或鉴定肿瘤/癌是否会对特定试剂产生响应的测定方法。这一信息应当允许获得更佳的患者选择策略并且导致更佳的治疗功效。
发明内容
本发明的一方面提供了治疗受试者的腺癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。还提供了治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。此外，提供了抑制腺癌或腺样囊性癌的生长的方法，所述方法包括使所述癌与有效量的Notch1结合剂接触。提供了减小腺样囊性癌的尺寸的方法，所述方法包括使所述癌与有效量的Notch1结合剂接触。提供了减小受试者的腺样囊性癌的尺寸的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
本发明的另一方面提供了减少患有腺癌的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。还提供了减少患有腺样囊性癌的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在本文所述的发明的某些方面和实施方式中，腺样囊性癌是复发性的。在一些实施方式中，腺样囊性癌已转移。
在本文所述的方法的一些实施方式中，腺癌或腺样囊性癌包含高水平的Notch1细胞内结构域(ICD)。在一些实施方式中，与预定水平的Notch1 ICD相比，腺癌具有增加水平或升高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，与预定水平的Notch1 ICD相比，腺样囊性癌包含高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，与预定水平的Notch1 ICD相比，腺样囊性癌具有增加水平或升高水平的Notch1 ICD。因此，本发明还提供了治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法，所述方法包括：确定所述癌是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加水平或升高水平的Notch1 ICD，并向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在本文所述的方法的一些实施方式中，腺癌包含影响Notch途径信号传导的突变。在一些实施方式中，腺癌包含Notch1突变。在一些实施方式中，腺样囊性癌包含影响Notch途径信号传导的突变。在一些实施方式中，腺样囊性癌包含Notch1突变。本发明还提供了治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法，所述方法包括：确定所述癌是否包含Notch1突变，并向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在本文所述的方法的一些实施方式中，腺癌或腺样囊性癌包含Notch1突变，其中所述Notch1突变是错义突变、无义突变或移码突变。在一些实施方式中，Notch1突变是移码突变。在一些实施方式中，Notch1突变位于异二聚化(HD)结构域中。在一些实施方式中，Notch1突变位于反式激活结构域(TAD)中。在一些实施方式中，Notch1突变位于PEST结构域中。在一些实施方式中，Notch1突变是激活性突变。在一些实施方式中，Notch1突变增加Notch1信号传导。在一些实施方式中，Notch1突变增加Notch途径的信号传导。
在本文所述的方法的一些实施方式中，突变产生非配体依赖性Notch1蛋白水解和激活。在一些实施方式中，突变移除C端PEST结构域并使Notch1 ICD稳定化。在一些实施方式中，突变产生增加水平或升高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch 1基因中。在一些实施方式中，Notch1突变位于除Notch1基因外的其它基因中。
本发明的另一方面提供了鉴定或选择患有腺癌或腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂(例如抗Notch1抗体)进行治疗的方法。在一些实施方式中，鉴定或选择患有腺癌或腺样囊性癌的受试者以用抗Notch1抗体进行治疗的方法包括：确定所述癌是否具有Notch1突变。在一些实施方式中，方法包括：确定所述癌是否具有Notch1突变，如果所述癌具有Notch1突变，选择该受试者用抗Notch1抗体进行治疗。在一些实施方式中，鉴定或选择患有腺癌或腺样囊性癌的受试者以用抗Notch1抗体进行治疗的方法包括：确定所述癌是否具有高水平或升高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，方法包括：确定所述癌是否具有高水平或升高水平的Notch1 ICD，如果所述癌具有高水平或升高水平的Notch1 ICD，选择该受试者用抗Notch1抗体进行治疗。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在本文所述的方法的一些实施方式中，从受试者获取样品。在一些实施方式中，样品是新鲜样品、冷冻样品或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的样品。
在本文所述的方法的一些实施方式中，Notch1突变通过基于PCR的测定、微阵列分析或核酸测序来确定。在一些实施方式中，NOTCH1 ICD的水平通过免疫组化测定来确定。
本发明的另一方面提供了监视接受用于治疗腺样囊性癌的Notch1结合剂(例如抗Notch1抗体)的受试者的方法。在一些实施方式中，监视接受用于治疗腺样囊性癌的抗Notch1抗体的受试者的方法包括：确定来自接受治疗的受试者的样品中的乳酸脱氢酶(LDH)水平，并将该样品中的LDH水平与预定的LDH水平进行比较。在一些实施方式中，预定的LDH水平用获自治疗前的受试者的样品来确定。
在本文所述的发明的一些方面和实施方式中，Notch1结合剂是抗Notch1抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合人Notch1。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区。在一些实施方式中，Notch1受体的非配体结合性近膜区包含SEQ ID NO:2。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合在SEQID NO:2内。
在本文所述的方法的一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含RGYWIE(SEQ IDNO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
在本文所述的方法的一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：(a)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26具有至少90％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:38具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：(a)SEQ ID NO:8的重链可变区和SEQ ID NO:14的轻链可变区；(b)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区；或(c)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ IDNO:38的轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含SEQ ID NO:8的重链可变区和SEQ ID NO:14的轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体与以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体包含相同的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是与以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体包含相同的CDR的抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是由以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体的人源化版本。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是OMP-52M51。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是OMP-52M51-H4L3。
还提供了包含本文所述的Notch1结合剂(例如抗Notch1抗体)的组合物，其用于本文所述的方法中。还提供了包含本文所述的Notch1结合剂(例如抗Notch1抗体)和药学上可接受的载质(或载剂)的药物组合物，其用于本文所述的方法中。
在前述每个方面的一些实施方式以及本文其他部分所述的其他方面和实施方式中，所述方法还包括施用至少一种适于联合疗法的额外的治疗剂。在一些实施方式中，额外的治疗剂是化疗剂。在一些实施方式中，额外的治疗剂是抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是甲基化剂、亚硝基脲、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂、抗生素、铂类试剂、蛋白激酶抑制剂或血管发生抑制剂。
在以马库什组或其他分组替代方式描述本发明的方面或实施方式时，本发明不仅涵盖了作为整体列出的整个组，还涵盖了该组的每个单独成员以及主组的所有可能的子组，而且还涵盖去掉一个或多个组成员后的主组。本发明还包含了在所要求保护的发明中明确排除一个或多个任何组成员的情况。
附图说明
图1.从用抗Notch1抗体OMP-52M51治疗的患有腺样囊性癌的受试者获得的乳酸脱氢酶测定结果。
图2.在用抗Notch1抗体OMP-52M51治疗前后的患有腺样囊性癌的受试者的肝脏CT扫描图。
图3.Notch1信号传导测定。
图4.Notch1 ICD免疫组化测定。图4A.阳性对照肿瘤OMP-B40。图4B.阴性对照肿瘤OMP-C11。图4C.ACC患者肿瘤。
具体实施方式
本发明提供了结合一种或多种人Notch受体(特别是Notch1)的新型试剂，包括但不限于多肽，例如抗体。所述Notch1结合剂包括人Notch1的拮抗剂。所述Notch1结合剂包括抑制人Notch途径的试剂。所述Notch1结合剂包括抑制Notch信号传导的试剂。还提供了相关的多肽和多核苷酸、包含所述Notch1结合剂的组合物以及制造所述Notch1结合剂的方法。还提供了使用所述Notch1结合剂的方法，例如治疗腺癌(例如腺样囊性癌)的方法。还提供了鉴定和/或选择受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，以及监视接受Notch1结合剂治疗的受试者的方法。
本发明提供了特异性结合人Notch1的细胞外结构域的Notch1结合剂(例如抗体)。在一些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)特异性地结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区。对于配体结合而言必要且充分的Notch1配体结合区已被鉴定为是EGF重复11和12，这表明Notch1受体的该区域对于Notch信号传导和肿瘤发生是重要的(Rebay等，1991,Cell,67:687；Lei等，2003,Dev.,130:6411；Hambleton等，2004,Structure,12:2173)。已出人意料地发现，结合人Notch受体细胞外结构域的配体结合区之外的抗体能在体内抑制肿瘤细胞生长(参见美国专利7,919,092和国际公开WO 2010/005567)。因此，结合一种或多种人Notch受体(即Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)细胞外结构域的配体结合区之外的抗体具有潜在的癌症疗法价值。
I.定义
为了便于理解本发明，下文定义了多种术语和短语。
术语“抗体”指通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区内的抗原识别位点或抗原结合位点来识别和特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述的组合等靶标的免疫球蛋白分子。本文所用的术语“抗体”包括：完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)，单链Fv(scFv)突变形式，诸如双特异性抗体等多特异性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，和任何其它包含抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示出所需的生物活性即可。抗体可以是五个主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于其重链恒定结构域的同一性，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构造。抗体可以是裸抗体，或与其它分子(包括但不限于毒素和放射性同位素)偶联。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且如本文所用是指完整抗体的抗原性决定可变区或抗原结合位点。本文所用的“抗体片段”包括抗原结合位点或表位结合位点。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区通常由通过三个互补决定区(CDR)(还称为高变区)连接的四个框架区组成。每条链中的CDR通过框架区彼此靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成了抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda MD)；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，1997，J.Molec.Biol.273：927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
术语“单克隆抗体”是指参与高度特异性识别和结合单个抗原决定簇或表位的同源抗体群。这与通常包括针对多种不同的抗原决定簇的不同抗体的混合物的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖了完整的全长单克隆抗体以及抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段)、单链Fv(scFv)突变形式、包含抗体部分的融合蛋白和任何其它包含抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指以包括但不限于杂交瘤产生、噬菌体筛选、重组表达和转基因动物在内的多种技术制得的此类抗体。
术语“人源化抗体”是指含有最小限度的非人类(例如鼠类)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的抗体。
术语“人抗体”是指由人类产生的抗体或通过使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人类产生的抗体相应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体以及其片段。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种以上物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区都对应于源自一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需结合特异性、亲和性和/或结合力的抗体可变区，而恒定区与源自另一物种(通常是人类)的抗体中的序列具有同源性，从而避免引发该物种中的免疫应答。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，指的是特定抗体所能够识别并特异性地结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸构成(常称之为“线性表位”)，也可以由借助蛋白的三级结构折叠而并置的不连续氨基酸构成(常称之为“构象表位”)。由连续氨基酸构成的表位通常在蛋白变性时得以保留，然而通过三级结构折叠形成的表位通常在蛋白变性时丢失。表位通常包含独特空间构象中的至少3个且更常见为至少5个或8～10个氨基酸。
抗体“特异性结合”或“特异性地结合”的意思是，与替代性物质(包括相关和不相关的蛋白)相比，结合剂或抗体与表位或蛋白的反应或联结更加频繁、更快速、时间更长、亲和力更高或具有上述效果的某种组合。在某些实施方式中，“特异性地结合”意思是，例如，抗体与蛋白结合的KD为约0.1mM以下，但更常见为小于约1μM。在某些实施方式中，“特异性地结合”是指，抗体与蛋白结合的KD有些时候为至少约0.1μM或更低，另外一些时候为至少约0.01μM或更低。由于不同物种中的同源蛋白间存在序列同一性，特异性结合可以包括识别多于一种物种中的特定蛋白(例如Notch1，例如小鼠Notch1和人Notch1)的抗体。应该理解，与第一靶标特异性结合的抗体或结合部分可以与第二靶标特异性结合或不特异性结合。因此，“特异性结合”不必要求(尽管其可以包括)排他性结合，即，与单一靶标结合。所以，在某些实施方式中，抗体可以特异性地结合多于一种靶标。在某些实施方式中，抗体上的相同抗原结合位点可以结合多种靶标。例如，在某些情况下，抗体可以包含两个相同的抗原结合位点，其中每一个都特异性结合两种以上蛋白(例如，人Notch1和人Notch3)的同一表位。在某些替代性实施方式中，抗体可以是双特异性的，并且包含至少两种具有不同的特异性的抗原结合位点。作为非限制性实例，双特异性抗体可以包含一个识别位于Notch1蛋白上的表位的抗原结合位点，且还包含识别位于第二蛋白(例如DLL4)上的不同表位的另一个不同的抗原结合位点。通常而言，但不是必然地，提及“结合”是指“特异性结合”。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可相换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且可以间插有非氨基酸。该术语还涵盖已天然修饰或人工修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分偶联。该定义还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应理解的是，由于本发明的多肽基于抗体，因此在某些实施方式中，所述多肽可以作为单链或联结的链(例如二聚体或多聚体)存在。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换地使用，是指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可被DNA或RNA聚合酶加入聚合物中的任何底物。
“高度严格的条件”可通过以下条件确定：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃以15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠进行洗涤；(2)在杂交过程中在42℃采用变性剂，例如甲酰胺，例如，在5x SSC(0.75M氯化钠、75mM柠檬酸钠)中的50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液；或(3)在杂交过程中在42℃采用5x SSC中的50％甲酰胺、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声化的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃以0.2×SSC和50％甲酰胺洗涤，随后在55℃用包含EDTA的0.1×SSC进行高度严格洗涤。
在两种或多种核酸或多肽的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指为了获得最大对应性而进行比较和比对(如果需要则引入空位)时，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两种或多种序列或子序列，不考虑任何保守性氨基酸替换作为序列同一性的部分。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。可用来获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件是本领域已知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit及其变化形式。在一些实施方式中，本发明的两种核酸或多肽是基本相同的，意味着在为了获得最大对应性而进行比较和比对时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性，如同使用序列比较算法或通过目视检查所测得。在一些实施方式中，在至少约10个、至少约20、至少约40～60个残基的长度或其间的任何整数值的序列区域上存在同一性。在一些实施方式中，在多于60～80个残基、例如至少约90～100个残基的区域上存在同一性，且在一些实施方式中，这些序列在被比较的序列(例如核苷酸序列的编码区)的全长上是基本相同的。
“保守性氨基酸替换”是一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基代替的氨基酸替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，认为苯丙氨酸对酪氨酸的替换是保守性替换。优选地，本发明的多肽和抗体的序列中的保守性替换不影响或消除包含该氨基酸序列的多肽或抗体对抗原的结合，该抗原即该多肽或抗体所结合Notch蛋白。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守性替换的方法是本领域公知的。
本文使用的术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送和通常表达一种或多种目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、阳离子缩合剂伴随的DNA或RNA表达载体、和脂质体中包裹的DNA或RNA表达载体。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处在自然中不存在的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已被纯化到不再处于其天然存在形式的程度的那些。在一些实施方式中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本纯的。
本文所用的“基本纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)的材料。在一些实施方式中，所述材料为至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯。
术语“肿瘤”和“赘生物”是指任何由过度的细胞生长或增殖导致的组织团块，其可以是良性的(非癌的)或恶性的(癌的)，包括癌前病变。
本文所用的术语“转移”是指癌从起始位置扩散或转移到身体的其它区域的过程，并且在新位置发展出类似的癌病变。“转移”或“转移性”细胞是失去与相邻细胞的粘附性接触并且从疾病的原发位置迁移(例如，经由血流或淋巴液)到继发位置的细胞。
术语“癌干细胞”、“CSC”、“肿瘤干细胞”、“肿瘤引发细胞”、“实体瘤干细胞”和“致瘤性干细胞”在本文中可互换使用，并且指具有以下性质的来自肿瘤的一群细胞：(1)具有广泛的增殖能力；2)能够进行不对称细胞分裂从而产生一种以上的增殖或发育潜能减少的分化子代；和(3)能够进行对称分裂以用于自我更新或自我维持。在一些实施方式中，当连续移植到免疫受损宿主(例如小鼠)中时，与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比，这些性质赋予“癌干细胞”或“肿瘤引发细胞”形成可触知肿瘤的能力。癌干细胞以无序方式进行自我更新而不是分化，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，当发生突变时所述异常细胞类型可以随时间而改变。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法等效概念是指源自肿瘤或癌前病变的全部细胞群体，包括构成肿瘤细胞群体块的非致瘤性细胞和致瘤性干细胞(癌干细胞)。当仅指缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时，本文所用的术语“肿瘤细胞”将用术语“非致瘤性”来修饰，以使这些肿瘤细胞与癌干细胞区分开。
本文所用的术语“致瘤性的”是指癌干细胞的功能特征，包括自我更新(产生额外的致瘤性癌干细胞)的性质和增殖以产生所有其它肿瘤细胞(产生分化的、并因此是非致瘤性的肿瘤细胞)的性质。
本文所用的术语“致瘤性”是指当连续移植到免疫受损宿主(例如小鼠)中时，来自肿瘤的细胞的随机样品形成可触知的肿瘤的能力。该定义还包括：当连续移植到免疫受损宿主(例如小鼠)中时形成可触知肿瘤的富集的和/或分离的癌干细胞群。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、犬类、猫科动物、啮齿类等，其将是特定治疗的接受者。术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。通常，本文所用的术语“受试者”和“患者”是指人受试者。
术语“药学可接受”是指美国联邦或州政府的管理机构已批准(或可被其批准)的、或者在美国药典或其他普遍承认的用于动物(包括人)的药典中列出的产品或化合物。
术语“药学可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的药物载体”是指可以与本文公开的至少一种结合剂一起向受治疗者施用的赋性剂、载剂或佐剂，并且其不破坏试结合剂的活性。所述赋性剂、载剂或佐剂在以足以递送治疗效果的剂量的药剂一起施用时应当是是无毒的。药学可接受的赋形剂、载剂或佐剂通常被本领域技术人员或FDA认为是任何制剂的无活性成分。
短语“药学可接受的载质”是指与本文公开的至少一种药剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。
术语“治疗有效量”是指结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其他药物能有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的量。对于癌症的情况，治疗有效量的药物(例如抗体)能够：减少癌细胞数量，减小肿瘤尺寸；抑制和/或终止癌细胞向周边器官的浸润(包括例如癌扩散至软组织和骨中)；抑制和/或终止肿瘤转移；抑制和/或终止肿瘤生长；在一定程度上减轻一种或多种癌症相关症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；降低肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减少癌干细胞在肿瘤中的数量或频率；使致瘤性细胞分化为非致瘤性细胞；或这些效果的组合。只要药物会阻止生长和/或杀死已存在的癌细胞，就可以称之为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
术语“治疗”或“处理”或“要治疗”或“缓解”或“要缓解”是指1)治愈、减慢、减轻诊断的病理性病况或疾病的症状和/或使诊断的病理性病况或疾病的进展停止的治疗措施；和2)防止和/或减缓靶病理性病况或疾病的发展的预防性或防备性措施。因此，需要治疗的对象包括已经患有疾病的对象；有倾向患疾病的对象和要预防疾病的对象。在某些实施方式中，如果患者显示出以下情况的一种或多种，则根据本发明的方法成功地“治疗”了受试者：癌细胞或肿瘤细胞数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减少；癌细胞或肿瘤细胞向外围器官的浸润(包括例如癌扩散到软组织和骨)受到抑制或不存在；肿瘤转移受到抑制或不存在；肿瘤生长受到抑制或不存在；一种或多种与特定癌相关的症状减轻；发病率和致死率降低；生活质量改善；肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力降低；癌干细胞在肿瘤中的数量或频率减少；肿瘤引发细胞在肿瘤中的数量或频率减少；致瘤性细胞分化为非致瘤性状态；或这些效果的组合。
除非上下文另有明确规定，本文和权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含复数形式。
应当理解的是，每当在本文用措辞“包含”来描述实施方式时，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方式。还应当理解的是，每当在本文用措辞“基本上由……组成”来描述实施方式时，还提供了以“由……组成”描述的其它类似实施方式。
本文在短语中使用的术语“和/或”(例如“A和/或B”)意在包括：A和B二者；A或B；A(单独)；和B(单独)。类似地，在短语中使用的术语“和/或”(例如“A、B和/或C”)意在涵盖以下实施方式中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
II.使用方法和药物组合物
本发明提供使用本文所述的Notch1结合剂来治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方式中，治疗受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包括治疗受试者的腺癌，其包括向受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗受试者的腺癌的方法包括向受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗癌症的方法包括治疗受试者的腺样囊性癌，其包括向受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括向受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：(a)确定腺样囊性癌是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高水平的Notch1 ICD，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：(a)从所述受试者获取样品，(b)确定所述样品中的Notch1 ICD水平，和(c)如果该Notch1 ICD水平与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高，向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：(a)确定腺样囊性癌是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高水平的Notch1 ICD，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ IDNO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3；并且其中，所述受试者是基于与预定水平的Notch1 ICD相比具有增加或升高水平的Notch1 ICD的腺样囊性癌而被选择的。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ IDNO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3；并且其中，所述受试者是基于具有Notch1突变的腺样囊性癌而被选择的。
在一些实施方式中，抑制腺癌生长的方法包括使腺癌与有效量的Notch1结合剂接触。在一些实施方式中，抑制腺样囊性癌生长的方法包括使腺样囊性癌与有效量的Notch1结合剂接触。在一些实施方式中，抑制受试者的腺癌生长的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，抑制受试者的腺样囊性癌生长的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在一些实施方式中，减小腺样囊性癌的尺寸的方法包括使该癌与有效量的Notch1结合剂接触。在一些实施方式中，减小受试者的腺样囊性癌的尺寸的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在本文所述的方法的一些实施方式中，腺样囊性癌是复发性的。在一些实施方式中，腺样囊性癌已转移。在一些实施方式中，腺样囊性癌已转移至肺、肝脏、骨、肾脏和/或脑。在一些实施方式中，腺样囊性癌对某些治疗而言是难治性的。在一些实施方式中，腺样囊性癌是化疗难治性的。
在本文所述的方法的一些实施方式中，肿瘤(例如腺样囊性癌)对抗Notch1抗体OMP-52M51的敏感性利用Notch1 ICD的表达水平来预测。高水平的Notch1 ICD与肿瘤对抗Notch1抗体OMP-52M51的响应性之间的关联性可以用来改进治疗癌症的方法。选择已根据Notch1 ICD水平确定其肿瘤可能会对治疗产生响应的癌症患者来用抗Notch1抗体OMP-52M51进行治疗，应当会增加整体治疗价值。通过在OMP-52M51疗法中不选择已确定其肿瘤可能对治疗无响应的癌症患者，也可以提高治疗功效。
在本文所述的方法的一些实施方式中，腺癌包含高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，腺样囊性癌包含高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，与预定水平的Notch1ICD相比，腺癌具有增加或升高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，与预定水平的Notch1 ICD相比，腺样囊性癌具有增加或升高水平的Notch1 ICD。
在本文所述的方法的一些实施方式中，腺癌包含影响Notch信号传导的突变。在一些实施方式中，腺样囊性癌包含影响Notch信号传导的突变。在一些实施方式中，腺癌包含Notch1突变。在一些实施方式中，腺样囊性癌包含Notch1突变。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch1的异二聚化(HD)结构域中。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch1的反式激活结构域(TAD)中。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch1的PEST结构域中。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch1的氨基酸1570～1736内。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch1的氨基酸2090～2320内。在一些实施方式中，Notch1突变位于Notch1的氨基酸2300～2555内。在一些实施方式中，Notch1突变位于SEQ ID NO:41的氨基酸1570～1736内。在一些实施方式中，Notch1突变位于SEQ ID NO:41的氨基酸2090～2320内。在一些实施方式中，Notch1突变位于SEQ ID NO:41的氨基酸2300～2555内。在一些实施方式中，Notch1突变是激活性突变。在一些实施方式中，Notch1突变是错义突变。在一些实施方式中，Notch1突变是无义突变。在一些实施方式中，Notch1突变是移码突变。在一些实施方式中，Notch1突变增加Notch途径信号传导。在一些实施方式中，Notch1突变增加Notch1信号传导。
在一些实施方式中，突变产生非配体依赖性Notch1蛋白水解和激活。在一些实施方式中，突变移除C端PEST结构域并使Notch1 ICD稳定化。在一些实施方式中，突变在肿瘤细胞中产生增加或升高水平的Notch1 ICD。在一些实施方式中，突变位于Notch 1基因或Notch1蛋白中。在一些实施方式中，突变位于除Notch 1外的基因或蛋白中。在一些实施方式中，突变位于除Notch 1外的基因或蛋白中，其中，Notch1信号传导增加。在一些实施方式中，突变位于FBXW7(其是Notch的负调控因子)中。在一些实施方式中，Notch1突变是FBXW7中的功能丧失突变。
在一些实施方式中，腺癌包含p53中的突变。在一些实施方式中，腺样囊性癌包含p53中的突变。p53的序列在本领域是公知的，并且可参见UniProtKB P04637和GenBank NP_000537.3。在一些实施方式中，p53中的突变位于DNA结合核心结构域(DBD)中。在一些实施方式中，p53中的突变位于SEQ ID NO:40的氨基酸102～292内。在一些实施方式中，p53中的突变位于p53的残基248处。在一些实施方式中，p53中的突变位于SEQ ID NO:40的残基248处。在一些实施方式中，位于p53的残基248处的p53中的突变是精氨酸至谷氨酰胺替换。在一些实施方式中，p53中的突变位于p53的残基282处。在一些实施方式中，p53中的突变位于SEQ ID NO:40的残基282处。在一些实施方式中，位于p53的残基282处的p53中的突变是精氨酸至色氨酸替换。
在一些实施方式中，抑制腺癌或腺样囊性癌的生长的方法包括：使所述癌与抗Notch1抗体接触。在一些实施方式中，治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗Notch1抗体。在一些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌是否包含Notch1突变，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法包括：(a)确定所述癌是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高水平的Notch1 ICD，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
在本文所述的方法的某些实施方式中，Notch1结合剂是特异性地结合人Notch1的抗体(抗Notch1抗体)。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ IDNO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26的重链可变区。在某些实施方式中，抗Notch1抗体还包含含有SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:38的轻链可变区。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含SEQ ID NO:8的重链可变区，和包含SEQ ID NO:14的轻链可变区。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区，和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区，和包含SEQ ID NO:38的轻链可变区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含SEQ ID NO:23。在一些实施方式中，抗Notch1抗体还包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:35。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:29。在一些实施方式中，抗Notch1抗体包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:35。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含与以ATCC保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体相同的重链可变区和轻链可变区序列。在某些实施方式中，抗Notch1抗体由ATCC保藏号为PTA-9549的质粒编码，该质粒依照布达佩斯条约的条款于2008年10月15日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA,20110。在某些实施方式中，抗Notch1抗体包含与以ATCC保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体相同的CDR序列，该杂交瘤依照布达佩斯条约的条款于2008年8月7日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA,20110。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是以ATCC保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体的人源化版本。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是OMP-52M51。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是OMP-52M51的人源化版本。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是OMP-52M51-H4L3。
在本文所述的方法的某些实施方式中，抗Notch1抗体与包含以ATCC保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的相同重链可变区和轻链可变区的抗体竞争与人Notch1的特异性结合。在某些实施方式中，抗Notch1抗体与以ATCC保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体竞争与人Notch1的特异性结合。在某些实施方式中，抗Notch1抗体与以ATCC保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体竞争与人Notch1的特异性结合。在某些实施方式中，抗Notch1抗体与OMP-52M51竞争与人Notch1的特异性结合。在某些实施方式中，抗Notch1抗体与OMP-52M51的人源化版本竞争与人Notch1的特异性结合。在某些实施方式中，抗Notch1抗体与OMP-52M51-H4L3竞争与人Notch1的特异性结合。
在另一方面，本发明提供了对可能对Notch1结合剂治疗有响应(“敏感性”)或无响应(“抗性”)的腺癌或腺样囊性癌肿瘤和/或患者进行鉴定、选择和/或分阶(stratify)的方法。此外，提供了治疗可能对Notch1结合剂治疗有响应、预测对Notch1结合剂治疗有响应和/或已确定对Notch1结合剂治疗有响应的腺癌或腺样囊性癌肿瘤患者的方法。
在一些实施方式中，提供了鉴定或选择患有腺癌或腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂(抗Notch1抗体)进行治疗的方法，Notch1结合剂包括但不限于本文所述的每种Notch1结合剂。在一些实施方式中，选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌的Notch1 ICD水平，和(b)如果所述腺样囊性癌具有与预定水平的Notch ICD相比增加或升高水平的Notch1 ICD，则选择该受试者用Notch1结合剂进行治疗。在一些实施方式中，选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法包括：(a)从所述受试者获取样品，(b)确定所述样品中的Notch1 ICD水平，和(c)如果所述样品具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高水平的Notch1ICD，则选择该受试者用Notch1结合剂进行治疗。在一些实施方式中，选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，和(b)如果所述腺样囊性癌具有Notch1突变，则选择该受试者用Notch1结合剂进行治疗。在一些实施方式中，选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法包括：(a)从所述受试者获取样品，(b)确定所述样品是否具有Notch1突变，和(c)如果所述样品具有Notch1突变，则选择该受试者用Notch1结合剂进行治疗。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的Notch1结合剂。
在一些实施方式中，选择患有腺样囊性癌的受试者以用特异性结合人Notch1的抗体进行治疗的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌中的Notch1 ICD水平，(b)如果所述腺样囊性癌具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高水平的Notch1 ICD，则选择该受试者用所述抗体进行治疗，和(c)向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体；其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；和包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ IDNO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在一些实施方式中，选择患有腺样囊性癌的受试者以用特异性结合人Notch1的抗体进行治疗的方法包括：(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，(b)如果所述腺样囊性癌具有Notch1突变，则选择该受试者用所述抗体进行治疗，和(c)向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体；其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；和包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
在本文所述的方法的一些实施方式中，Notch1 ICD的预定水平是正常组织样品中的Notch1 ICD量。在一些实施方式中，Notch1 ICD的预定水平是不具有Notch1激活性突变的癌或肿瘤样品中的Notch1 ICD量。在一些实施方式中，Notch1 ICD的预定水平是在免疫组化测定中H分数为1以下的组织样品中的Notch1 ICD量。在一些实施方式中，Notch1 ICD的预定水平是在IHC测定中使用阳性对照和阴性对照确定的H分数阈值水平。
确定肿瘤或癌是否在特定基因中具有突变的方法是本领域技术人员已知的。确定肿瘤或癌是否具有Notch1突变的方法是本领域技术人员已知的。为了在核酸水平上进行确定，方法包括但不限于基于PCR的测定、微阵列分析和核苷酸测序(例如下一代测序、全基因组测序(WGS))。
检测肿瘤样品中的Notch1的方法是本领域的技术人员已知的。本文提供了检测肿瘤样品中的Notch1 ICD的方法。
在本文所述的方法的一些实施方式中，从受试者获取样品。在一些实施方式中，样品被加工成细胞裂解物。在一些实施方式中，样品被加工成DNA。在一些实施方式中，样品被加工成RNA。
在本文所述的方法的一些实施方式中，样品包括但不限于任何临床相关的组织样品，例如肿瘤活检、中心活检组织样品、细针吸取物、毛囊，或者体液样品，例如血液、血浆、血清、淋巴液、腹水、囊液或尿液。在一些实施方式中，样品取自患有腺癌或腺样囊性癌的患者。在一些实施方式中，样品是原发肿瘤。在一些实施方式中，样品是转移物。样品可以取自人或非人类哺乳动物，例如小鼠、大鼠、非人类灵长动物、犬类、猫科动物、反刍类、猪或羊。在一些实施方式中，在多个时间点从受试者获取样品，例如，治疗前、治疗期间和/或治疗后。在一些实施方式中，样品取自受试者的不同部位，例如，来自原发肿瘤的样品和来自远端位置的转移物的样品。
在本文所述的方法的一些实施方式中，样品是石蜡包埋的固定组织样品。在一些实施方式中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织样品。在一些实施方式中，样品是新鲜组织(例如肿瘤)样品。在一些实施方式中，样品是冷冻组织样品。在一些实施方式中，样品是新鲜冷冻(FF)的组织(例如肿瘤)样品。在一些实施方式中，样品是分离自体液的细胞。在一些实施方式中，样品包含循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施方式中，样品是存档组织样品。在一些实施方式中，样品是具有已知的诊断、治疗和/或结果历史的存档组织样品。在一些实施方式中，样品是组织块。在一些实施方式中，样品是分散的细胞。在一些实施方式中，样品的大小为约1个细胞至约1×106个细胞或更多。在一些实施方式中，样品的大小为约10个细胞至约1×105个细胞。在一些实施方式中，样品的大小为约10个细胞至约10,000个细胞。在一些实施方式中，样品的大小为约10个细胞至约1,000个细胞。在一些实施方式中，样品的大小为约10个细胞至约100个细胞。在一些实施方式中，样品的大小为约1个细胞至约10个细胞。在一些实施方式中，样品的大小为单细胞。
在一些实施方式中，通过评估与基因表达相比的蛋白表达来分析Notch1表达。分析蛋白表达的常用方法包括但不限于基于免疫组化(IHC)、抗体和质谱的方法。抗体，通常是单克隆抗体，可以用来检测基因产物(例如蛋白)的表达。在一些实施方式中，可通过对抗体本身直接加标记来检测抗体。在另一些实施方式中，无标记的一抗与带标记的二抗组合使用。
在一些实施方式中，用本领域技术人员已知的测定来确定Notch1表达，所述测定包括但不限于：多重分析物特征谱测试、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、蛋白质印迹、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫沉淀测定、化学发光测定、免疫组化(IHC)测定、点印迹测定、狭缝印迹测定、蛋白阵列和FACS。在一些实施方式中，NOTCH1 ICD的水平通过IHC测定来确定。
在本文所述的方法的一些实施方式中，NOTCH1 ICD的水平使用特异性结合Notch1ICD的试剂来确定。在一些实施方式中，NOTCH1 ICD的水平使用特异性结合Notch1 ICD但不结合全长Notch1的试剂来确定。任何展示出对NOTCH1 ICD的特异性结合的分子实体都可以用来确定样品中的NOTCH1 ICD蛋白的水平。特异性结合剂包括但不限于抗体、抗体模拟物和多核苷酸(例如适体)。本领域技术人员理解，通过用于检测NOTCH1 ICD的特定测定来确定所需的特异性程度。在一些实施方式中，用来检测和/或确定Notch1 ICD水平的试剂是抗Notch1 ICD抗体。在一些实施方式中，抗Notch1 ICD抗体是抗体D3B8(#4147 CellSignaling Technology)。
在测定中使用抗体的一些实施方式中，抗体带有可检测标记。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
在本文所述的方法的一些实施方式中，Notch1 ICD的水平使用IHC测定来确定。例如，从肿瘤样品中切出4μm厚的FFPE切片，并安装在经涂布的玻璃载片上。将组织在二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇和蒸馏水中连续温育来使组织脱石蜡和脱水，以恢复抗原。将载片置于恢复溶液中并置于修复液中以进行抗原恢复。为了封闭内源过氧化物酶活性，将载片在过氧化氢中温育并用PBS洗涤。为了封闭非特异性背景染色，将载片在封闭液中温育。将载片与抗Notch1 ICD抗体温育一段适当的时间。使用包含二氨基联苯胺(DAB)的试剂盒检测特异性结合。用苏木精复染切片。在一些实施方式中，将FFPE切片安装在经涂布的玻璃载片上并用自动化系统(例如，在使用Ventana试剂的Ventana BenchMark ULTRA设备上)染色。在一些实施方式中，在IHC测定中使用的抗体是抗Notch1 ICD抗体D3B8。
IHC载片可以使用自动化设备来分析或使用显微镜来手动评估。测量每个肿瘤细胞核的染色强度(0：无表达；1：弱表达；2：中等表达；3：强表达)，并对每个染色等级的细胞核进行计数，计算每种类型的百分比。对于每个组织切片，将数据整合为加权H分数：H分数＝[3×(％3+细胞核)]+[2×(％2+细胞核)]+[1×(％1+细胞核)]。使用这些参数，可获得的最高分是H分数＝300。在一些实施方式中，认为1以下的H分数是阴性的。在一些实施方式中，IHC测定具有阈值。在一些实施方式中，IHC测定具有特异性阈值。在一些实施方式中，IHC测定具有功效阈值。在一些实施方式中，IHC测定具有通过筛选阳性和阴性肿瘤组织而确定的阈值。在一些实施方式中，IHC测定的阈值为约25。在一些实施方式中，IHC测定的阈值为约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、或约110、或约120。在一些实施方式中，在IHC测定中用来确立阈值的抗体是抗Notch1 ICD抗体D3B8。
在另一方面，本发明提供了减少患有腺癌的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，本发明还提供了减少患有腺样囊性癌的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。在一些实施方式中，疼痛是骨痛。在一些实施方式中，Notch1结合剂是本文所述的抗Notch1抗体。
在一些实施方式中，治疗腺癌或腺样囊性癌的方法包括施用约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约2.5mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约12.5mg/kg、约15mg/kg或约20mg/kg的剂量的抗Notch1抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、或每四周施用一次。在一些实施方式中，治疗腺癌或腺样囊性癌的方法包括每四周施用一次约1mg/kg。在一些实施方式中，治疗腺癌或腺样囊性癌的方法包括每四周施用一次约2.5mg/kg。在一些实施方式中，治疗腺癌或腺样囊性癌的方法包括每四周施用一次约5mg/kg。在一些实施方式中，治疗腺癌或腺样囊性癌的方法包括每三周施用一次约2.5mg/kg。在一些实施方式中，治疗腺癌或腺样囊性癌的方法包括每三周施用一次约5mg/kg。
本领域技术人员知晓，施用任何治疗剂都可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性非常严重，以致于不能以治疗有效量施用特定试剂。在一些情况下，必须中止药物治疗，并可以尝试其他试剂。但是，同一治疗类别中的许多试剂往往显示出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者要么不得不停止治疗，要么(如果可能的话)承受与治疗剂相关的令人不适的副作用。
治疗剂的副作用可以包括但不限于荨麻疹、皮疹、瘙痒、恶心、呕吐、食欲减退、痢疾、寒冷、发热、疲劳、肌肉痛、头痛、低血压、高血压、低钾血症、低血细胞计数、流血和心脏问题。
因此，本发明的一个方面涉及治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法，所述方法包括使用间歇式定量给药方案施用抗Notch1抗体。本文所用的“间歇式定量给药”是指使用超过每周1次的定量给药间隔的定量给药方案，例如每2周定量给药一次，每3周1次，每4周1次，等等。在一些实施方式中，治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法包括按照间歇式定量给药方案向受试者施用有效剂量的抗Notch1抗体。在一些实施方式中，治疗受试者的腺癌或腺样囊性癌的方法包括：按照间歇式定量给药方案向受试者施用有效剂量的抗Notch1抗体，并增加所述抗Notch1抗体的治疗指数。在一些实施方式中，间歇式定量给药方案包括向受试者施用起始剂量的抗Notch1抗体，并且约每2周1次施用后续剂量的抗Notch1抗体。在一些实施方式中，间歇式定量给药方案包括向受试者施用起始剂量的抗Notch1抗体，并且约每3周1次施用后续剂量的抗Notch1抗体。在一些实施方式中，间歇式定量给药方案包括向受试者施用起始剂量的抗Notch1抗体，并且约每4周1次施用后续剂量的抗Notch1抗体。
在某些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：每四周1次向受试者施用约0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg或2.5mg/kg的剂量的本文所述的抗Notch1抗体。在某些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：每三周1次向受试者施用约2.5mg/kg、5.0mg/kg或10.0mg/kg的剂量的本文所述的抗Notch1抗体。在某些实施方式中，治疗受试者的腺样囊性癌的方法包括：每三周1次向受试者施用约2.5mg/kg的剂量的抗Notch1抗体，其中，所述抗Notch1抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；和包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
在一些实施方式中，定量给药方案可以限于特定数量的施用或“周期”。在一些实施方式中，抗Notch1抗体施用3、4、5、6、7、8或更多个周期。例如，每3周施用抗Notch1抗体并持续6个周期，每4周施用抗Notch1抗体并持续6个周期，每3周施用抗Notch1抗体并持续4个周期，每4周施用抗Notch1抗体并持续4个周期，等等。定量给药计划可以由本领域技术人员(例如治疗医师)来决定并随后进行修改。
可以根据受试者对导入体内的抗Notch1抗体的耐受能力来选择各种剂量的抗Notch1抗体的递送方法。因此，在本文所述的任何方面和/或实施方式中，抗Notch1抗体的施用可以是静脉内注射。在一些实施方式中，施用为静脉内输注。在本文所述的任何方面和/或实施方式中，抗Notch1抗体的施用可以是非静脉内途径。
本发明还提供了包含本文所述的Notch1结合剂(例如抗Notch1抗体)的药物组合物。在某些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载质。在一些实施方式中，这些药物组合物可用于抑制受试者(例如人类患者)的肿瘤生长和/或治疗受试者的癌症。
在某些实施方式中，通过将经纯化的本发明的抗体或试剂与药学上可接受的载质(例如载剂或赋形剂)组合，制备用于贮存和使用的药物组合物或制剂。适合的药学上可接受的载质包括但不限于：无毒缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苄烷铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(例如，小于约10个氨基酸残基)；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和非离子表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London)。
可以以用于局部治疗或全身治疗的多种方式来施用本发明的药物组合物或制剂。施用可以是：局部施用，通过表皮或真皮透皮贴、膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末；肺部施用，通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括使用喷雾器)；气管内和鼻内施用；口服；或胃肠外施用，包括静脉内(例如注射或输注)、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如注射或输注)或颅内(例如硬膜内或脑室内)。
治疗性制剂可以是单位剂型。所述制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、水中或非水性介质中的溶液或悬浮液、或栓剂。在诸如片剂等固体组合物中，主要活性成分与药物载剂混合。常规的制造片剂的成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和稀释剂(例如水)。这些成分可用来形成含有本发明的化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。随后将该固体预制剂组合物再分为上述类型的单位剂型。所述制剂或组合物的片剂、丸剂等可以带有包衣或以其他方式复合以提供具有延长的作用的优点的剂型。例如，该片剂或丸剂可以包含经外部组分包覆的内部组合物。此外，这两种组分可被肠溶层分开，肠溶层用来抵抗崩解并允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。可将多种材料用于此类肠溶层或包衣层，所述材料包括多种聚合物酸和聚合物酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素酯等材料的混合物。
本文所述的Notch1结合剂还可以包封在微胶囊中。通过例如凝聚技术或通过界面聚合来制备此类微胶囊，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米粒和纳米胶囊)或在粗乳剂(如Remington,The Science and Practice ofPharmacy第22版，2012,Pharmaceutical Press,London中所述)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
在某些实施方式中，本发明的Notch1结合剂(例如抗体)与脂质体复合。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可以用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物通过反相蒸发来产生。可以将脂质体挤压通过具有确定孔径的滤器，从而产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方式中，可以产生持续释放型制剂。持续释放型制剂的适合实例包括含有Notch1结合剂(例如抗体)的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质为定形物形式(例如，膜或微胶囊)。持续释放型基质的实例包括聚酯、诸如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚乙烯醇等水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸酯异丁酸酯和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
在本发明的另一方面，本文所述的方法还可以包括施用至少一种额外的治疗剂。额外的治疗剂可以在施用抗Notch1抗体之前、同时和/或之后施用。还提供了包含抗Notch1抗体和额外的治疗剂的药物组合物。在一些实施方式中，至少一种额外的治疗剂包括1种、2种、3种或更多种额外的治疗剂。
使用至少两种治疗剂的联合疗法常常使用通过不同的作用机制起作用的试剂，但这不是必须的。使用具有不同作用机制的试剂的联合疗法可以产生加合或协同效应。联合疗法可以允许使用与单一疗法相比更低剂量的每种试剂，由此减少副作用和/或毒性。联合疗法可以降低发展具有抗性的癌细胞的可能性。在一些实施方式中，联合疗法包括主要影响(例如抑制或杀死)非致瘤性细胞的治疗剂和主要影响(例如抑制或杀死)致瘤性CSC的治疗剂。
应理解的是，抗Notch1抗体与额外的治疗剂的组合可以以任何顺序施用或同时施用。在一些实施方式中，将抗Notch1抗体施用于此前已经历用第二治疗剂治疗的受试者。在某些其它实施方式中，抗Notch1抗体与第二治疗剂基本上同时或同步施用。例如，可以向正在经历第二治疗剂疗程(例如化疗)的受试者施用抗Notch1抗体。在某些实施方式中，抗Notch1抗体在用第二治疗剂治疗1年内施用。在某些替代性实施方式中，在用第二治疗剂进行任何治疗10、8、6、4或2个月内施用抗Notch1抗体。在某些其他实施方式中，在用第二治疗剂进行任何治疗4、3、2或1周内施用抗Notch1抗体。在一些实施方式中，在用第二治疗剂进行任何治疗5、4、3、2或1天内施用抗Notch1抗体。还应该意识到的是，两种(或更多种)试剂或治疗可以在大约数小时或数分钟内(即基本上同时)施用给受试者。
可用的治疗剂类别包括例如：微管蛋白抑制剂，Auristatin类，DNA小沟结合剂，DNA复制抑制剂，烷基化剂(例如铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸素、抗代谢物、化疗增敏剂、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、Lexitropsin类、亚硝基脲、顺氯氨铂、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射增敏剂、甾类、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱等。在某些实施方式中，额外的治疗剂是烷基化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管发生抑制剂。
可以与抗Notch1抗体联合施用的治疗剂包括化疗剂。因此，在一些实施方式中，治疗方法包括将本发明的抗Notch1抗体与化疗剂或多种不同的化疗剂的混合物联合施用。用抗Notch1抗体进行的治疗可以发生在施用化疗剂之前、同时或之后。联合施用可以包括：以单一药物制剂方式或使用独立的多个制剂的共施用，或以任何顺序但通常在使所有活性试剂能够同时发挥其生物学活性的时期内进行的连续使用。可以使用制造商的操作说明所述的或技术熟练的从业者凭经验确定的此类化疗剂的制剂和定量给药计划。用于此类化疗的制剂和定量给药方案还描述于Chemotherapy Source Book,第4版,2008,M.C.Perry(编),Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
可用于本发明的化疗剂包括但不限于：烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；Bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK；丙亚胺；西佐非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨(XELODA)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、易维特(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方式中，化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放射菌素D、依托泊苷、盐酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康，以及这些中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方式中，化疗剂是抗代谢药。抗代谢药是结构与正常生化反应所需的代谢物类似的化学物质，但是其区别足以干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢药包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、喃氟啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨，以及这些中任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些实施方式中，化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的试剂。在一些实施方式中，所述试剂是紫杉烷。在某些实施方式中，所述试剂是紫杉醇或多西他赛，或紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，所述试剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合的紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方式中，抗有丝分裂剂包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶(例如Aurora A或Plk1)的抑制剂。
在一些实施方式中，额外的治疗剂包括诸如小分子等试剂。例如，治疗可包括组合施用本发明的抗Notch1抗体与充当另外的肿瘤相关蛋白(包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF)的抑制剂的小分子。在某些实施方式中，额外的治疗剂是抑制癌干细胞途径的小分子。在一些实施方式中，额外的治疗剂是Notch途径的小分子抑制剂。在一些实施方式中，额外的治疗剂是Wnt途径的小分子抑制剂。在一些实施方式中，额外的治疗剂是BMP途径的小分子抑制剂。在一些实施方式中，额外的治疗剂是抑制β-连环蛋白信号传导的小分子。
在一些实施方式中，额外的治疗剂包括生物分子，例如抗体。例如，治疗可包括组合施用本发明的抗Notch1抗体与针对另外的肿瘤相关蛋白的其他抗体(包括但不限于结合EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF的抗体)。在某些实施方式中，额外的治疗剂是抗体，所述抗体是抗癌干细胞标志物的抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是结合Notch途径的其他组分的抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是结合Wnt途径的组分的抗体。在某些实施方式中，额外的治疗剂是抑制癌干细胞途径的抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是抑制Notch途径的抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是抑制Wnt途径的抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是抑制BMP途径的抗体。在一些实施方式中，额外的治疗剂是抑制β-连环蛋白信号传导的抗体。在某些实施方式中，额外的治疗剂是抗体，所述抗体是血管发生抑制剂或调节剂(例如，抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体)。在某些实施方式中，额外的治疗剂是贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥单抗(HERCEPTIN)、帕尼单抗(VECTIBIX)或西妥昔单抗(ERBITUX)。联合施用可以包括：以单一药物制剂方式或使用独立的多个制剂的共施用，或以任何顺序但通常在使所有活性试剂能够同时发挥其生物学活性的时期内进行的连续使用。
用本文所述的抗Notch1抗体进行的治疗可以包括与其他生物分子(例如一种或多种细胞因子(例如，淋巴因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子))的联合治疗，或可以伴随有手术摘除肿瘤、癌细胞或治疗医师认为必需的任何其他疗法。
在本文所述的方法的某些实施方式中，治疗包括联合施用本文所述的抗Notch1抗体和放射疗法。用抗Notch1抗体进行的治疗可以出现在施用放射疗法之前、同时或之后。此类放射疗法的剂量方案可由熟练的医学从业者来确定。
在另一方面，本发明提供了监视接受抗Notch1抗体治疗的受试者的方法，所述方法包括：确定来自接受治疗的受试者的样品中的标志物水平，并将该样品中的标志物水平与预定的标志物水平进行比较。在一些实施方式中，与标志物的预定水平相比，样品中标志物水平的下降表明治疗有正面效果。治疗的正面效果可以包括但不限于：肿瘤尺寸减小，肿瘤数量减少，转移物数量减少，疼痛减少，肿瘤尺寸稳定化，或肿瘤数量稳定化，等等。许多肿瘤类型可以升高乳酸脱氢酶(LDH)水平，测量LDH水平可有助于监视治疗。因此，在一些实施方式中，与预定水平或正常水平相比，受试者具有升高水平的LDH。在一些实施方式中，监视接受用于治疗腺样囊性癌的抗Notch1抗体的受试者的方法包括：确定来自治疗后的受试者的样品中的乳酸脱氢酶(LDH)水平，并将该样品中的LDH水平与来自治疗前的受试者的预定的LDH水平进行比较。在一些实施方式中，监视接受用于治疗腺样囊性癌的抗Notch1抗体的受试者的方法包括：从接受治疗的受试者获取样品，确定该样品中的LDH水平，并将该样品中的LDH水平与来自治疗前的受试者的预定LDH水平进行比较。在一些实施方式中，监视接受用于治疗腺样囊性癌的抗Notch1抗体的受试者的方法包括：从接受治疗的受试者获取样品，确定该样品中的LDH水平，并将该样品中的LDH水平与来自治疗前的受试者的预定LDH水平进行比较，其中，LDH水平下降表明治疗有正面效果。在一些实施方式中，样品是血液、血浆或血清。
III.Notch1结合剂
本发明提供特异性结合人Notch1的试剂、包含这些结合剂的组合物和使用这些结合剂治疗癌症的方法。在某些实施方式中，本发明提供结合Notch1的试剂和使用这些结合剂治疗腺癌的方法。在某些实施方式中，Notch1结合剂抑制腺癌生长。在某些实施方式中，Notch1结合剂用于治疗腺样囊性癌。在某些实施方式中，Notch1结合剂抑制腺样囊性癌生长。在某些实施方式中，Notch1结合剂是特异性地结合人Notch1的抗体(抗Notch1抗体)。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区。在一些实施方式中，抗Notch1抗体结合人Notch1的包含约氨基酸1427～约氨基酸1732的区域。在一些实施方式中，抗Notch1抗体结合包含SEQ ID NO:2的区域。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合SEQ ID NO:2内的区域。在一些实施方式中，抗Notch1抗体特异性地结合位于包含SEQ ID NO:2的区域内的表位。
在某些实施方式中，特异性结合人Notch1的抗体包含抗体OMP-52M51的一个、两个、三个、四个、五个和/或六个CDR(参见表1)。在一些实施方式中，该抗体包含OMP-52M51的一个以上CDR、OMP-52M51的两个以上CDR、OMP-52M51的三个以上CDR、OMP-52M51的四个以上CDR、OMP-52M51的五个以上CDR或OMP-52M51的全部六个CDR。在一些实施方式中，该抗体包含每个CDR具有至多四个(即，0、1、2、3或4个)氨基酸替换的CDR。在某些实施方式中，重链CDR包含在重链可变区中。在某些实施方式中，轻链CDR包含在轻链可变区中。
表1
在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：(a)包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQID NO:17)的重链CDR3；和/或(b)包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个氨基酸替换的变体；(b)包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个氨基酸替换的变体；和(c)包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸替换的变体。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：(a)包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个氨基酸替换的变体；(b)包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个氨基酸替换的变体；和(c)包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个氨基酸替换的变体。在一些实施方式中，这些氨基酸替换是保守性氨基酸替换。
在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:8具有至少约90％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:14具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:8具有至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:14具有至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:8具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:14具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：包含SEQ ID NO:8的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:14的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：包含SEQ ID NO:8的重链可变区，和包含SEQ ID NO:14的轻链可变区。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体或抗体片段。
在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:26具有至少约90％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:32具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:26具有至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:32具有至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:26具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:32具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区，和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体或抗体片段。
在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:26具有至少约90％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:38具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:26具有至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:38具有至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：与SEQ ID NO:26具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO:38具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:38的轻链可变区。在一些实施方式中，结合人Notch1的抗体包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区，和包含SEQ ID NO:38的轻链可变区。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体或抗体片段。
在一些实施方式中，Notch1结合剂是抗体OMP-52M51(也称为52M51)，其由依照布达佩斯条约的条款于2008年8月7日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,VA,USA)且保藏号为PTA-9405的杂交瘤细胞系产生。在一些实施方式中，该抗体是OMP-52M51的人源化版本。在一些实施方式中，该抗体是OMP-52M51的人源化版本“OMP-52M51-H4L3”，其由依照布达佩斯条约的条款于2008年10月15日保藏在ATCC(10801University Boulevard,Manassas,VA,USA)且保藏号为PTA-9549的质粒编码。在一些实施方式中，该抗体是OMP-52M51的人源化版本“OMP-52M51-H4L4”。在一些实施方式中，本发明提供结合与抗体OMP-52M51所结合的表位相同的表位的抗体。在其它实施方式中，本发明提供与以上实施方式和/或方面、以及本文别处描述的其它方面/实施方式中所述的任何抗体竞争对人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区的特异性结合的抗体。
本发明提供多种多肽，包括但不限于抗体和抗体片段。在某些实施方式中，多肽是分离的。在一些实施方式中，多肽基本上是纯的。
在某些实施方式中，本发明的多肽可以是包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列的重组多肽、天然多肽或合成多肽(带有或不带有信号/前导序列)。在一些实施方式中，该多肽包含分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34和/或SEQ ID NO:35中提供的重链和/或轻链(带有或不带有信号/前导序列)。在某些实施方式中，该多肽是抗体。在某些实施方式中，该多肽特异性结合人Notch1。在某些实施方式中，该多肽特异性结合人Notch1的细胞外结构域。在某些实施方式中，该多肽特异性结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQID NO:8的重链可变区序列，和包含SEQ ID NO:14的轻链可变区序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区序列，和包含SEQ ID NO:32的轻链可变区序列。在某些实施方式中，该多肽包含：包含SEQ ID NO:26的重链可变区序列，和包含SEQ IDNO:38的轻链可变区序列。在某些实施方式中，该多肽是抗体。
本发明的多肽可以包括：SEQ ID NO:8的多肽，以及与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性的多肽和与SEQ ID NO:8具有至少95％序列同一性的多肽，和在其它实施方式中，与SEQ ID NO:8具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。本发明的多肽可以包括：SEQ ID NO:14的多肽，以及与SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的多肽和与SEQID NO:14具有至少95％序列同一性的多肽，和在其它实施方式中，与SEQ ID NO:14具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
本发明的多肽可以包括：SEQ ID NO:26的多肽，以及与SEQ ID NO:26具有至少90％序列同一性的多肽和与SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的多肽，和在其它实施方式中，与SEQ ID NO:26具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。本发明的多肽可以包括：SEQ ID NO:32的多肽，以及与SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性的多肽和与SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的多肽，和在其它实施方式中，与SEQ ID NO:32具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。本发明的多肽可以包括：SEQ IDNO:38的多肽，以及与SEQ ID NO:38具有至少90％序列同一性的多肽和与SEQ ID NO:38具有至少95％序列同一性的多肽，和在其它实施方式中，与SEQ ID NO:38具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)结合Notch1并调节Notch1活性。在一些实施方式中，Notch1结合剂是拮抗剂并调节Notch1活性。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)是Notch1的拮抗剂并抑制Notch1活性。在某些实施方式中，Notch1结合剂抑制所结合的人Notch1活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％。在一些实施方式中，Notch1结合剂抑制突变的Notch1的活性。在一些实施方式中，Notch1结合剂抑制组成型激活的Notch1的活性。在一些实施方式中，突变的Notch1在腺癌中。在一些实施方式中，突变的Notch1在腺样囊性癌中。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)抑制Notch信号传导。应理解的是，在某些实施方式中，抑制Notch信号传导的Notch1结合剂可抑制通过一种或多种Notch的信号传导，但不必抑制通过所有Notch的信号传导。在某些替代性实施方式中，可抑制通过所有人Notch的信号传导。在某些实施方式中，通过选自由Notch1、Notch2、Notch3和Notch4组成的组的一种或多种Notch的信号传导被抑制。在某些实施方式中，Notch1结合剂对Notch信号传导的抑制是Notch1信号传导水平减少了至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)抑制Notch激活。应理解的是，在某些实施方式中，抑制Notch激活的Notch1结合剂可抑制一种或多种Notch的激活，但不必抑制所有Notch的激活。在某些替代性实施方式中，可抑制所有人Notch的激活。在某些实施方式中，选自由Notch1、Notch2、Notch3和Notch4组成的组的一种或多种Notch的激活被抑制。在某些实施方式中，Notch1结合剂对Notch激活的抑制是Notch1激活水平减少了至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。
用于确定Notch1结合剂(或候选Notch1结合剂)是否抑制Notch激活的体内和体外测定是本领域已知的。在一些实施方式中，利用在萤火虫萤光素酶报告基因上游包含多个拷贝的TCF结合结构域的TCF/Luc报告基因载体的基于细胞的萤光素酶报告基因测定可用于在体外测量Notch信号传导水平。在其它实施方式中，可使用利用在萤火虫萤光素酶报告基因上游包含多个拷贝的CBF结合结构域的CBF/Luc报告基因载体的基于细胞的萤光素酶报告基因测定。将在Notch1结合剂存在时由Notch配体引起的Notch激活水平与Notch1结合剂不存在时由Notch配体引起的Notch激活水平进行比较。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)具有一种或多种以下效果：抑制癌细胞增殖，抑制癌细胞生长，预防或减少癌细胞的转移，降低肿瘤或癌中的癌干细胞频率，触发癌细胞的细胞死亡(例如，通过凋亡)，通过降低癌细胞群中的癌干细胞频率来减少癌细胞的致瘤性，使致瘤性细胞分化为非致瘤性状态，或延长患者的存活时间。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)能够抑制癌细胞生长。在某些实施方式中，Notch1结合剂能够在体外抑制癌细胞生长(例如，使癌细胞与抗体体外接触)。在某些实施方式中，Notch1结合剂能够在体内抑制癌症生长(例如，在异种移植小鼠模型中和/或在患有癌症的人中)。
在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)能够减少腺癌的致瘤性。在某些实施方式中，Notch1结合剂(例如抗体)能够减少腺样囊性癌的致瘤性。在某些实施方式中，Notch1结合剂或抗体能够在动物模型(例如小鼠异种移植模型)中减少包含癌干细胞的癌的致瘤性。在一些实施方式中，Notch1结合剂能够通过降低癌中的癌干细胞频率来减少癌的致瘤性。在某些实施方式中，癌中的癌干细胞的数量或频率下降了至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍或约1000倍。在某些实施方式中，癌干细胞的频率下降通过利用动物模型的有限稀释测定(LDA)来确定。关于使用有限稀释测定来确定肿瘤中的癌干细胞的数量或频率下降的实例和指导可见于例如国际公开WO 2008/042236以及美国专利公开2008/0064049和2008/0178305。
在某些实施方式中，Notch1结合剂或抗体经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导表达Notch1的细胞的细胞死亡。ADCC包括通过识别抗体的Fc部分的效应细胞进行的细胞裂解。例如，许多淋巴细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、粒细胞和嗜酸粒细胞具有Fc受体并能够介导细胞溶解。
在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、约0.5nM或更小或者约0.1nM或更小的解离常数(KD)结合人Notch1。在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约1nM或更小的KD结合人Notch1。在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约0.8nM或更小的KD结合人Notch1。在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约0.6nM或更小的KD结合人Notch1。在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约0.5nM或更小的KD结合人Notch1。在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约0.4nM或更小的KD结合人Notch1。在某些实施方式中，抗Notch1抗体以约0.3nM或更小的KD结合人Notch1。在一些实施方式中，KD通过表面等离子体共振来测量。在一些实施方式中，该抗体对Notch1的解离常数是使用固定在Biacore芯片上的包含Notch1细胞外结构域的Notch融合蛋白(例如，Notch1ECD-Fc融合蛋白)确定的解离常数。
在某些实施方式中，抗Notch1抗体结合人Notch1的半最大有效浓度(EC50)为约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下或约1nM以下。在某些实施方式中，抗Notch1抗体结合人Notch1的EC50为约40nM以下、约20nM以下、约10nM以下或约1nM以下。
在一些实施方式中，抗Notch1抗体是重组抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是嵌合抗体。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是IgG抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是IgG1抗体。在一些实施方式中，抗Notch1抗体是IgG2抗体。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是人抗体。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。
在一些实施方式中，抗Notch1抗体是多克隆抗体。多克隆抗体可以用任何已知方法制备。在一些实施方式中，通过多次皮下注射或腹膜内注射相关抗原(例如，纯化的肽片段、全长重组蛋白和融合蛋白等)来免疫动物(例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、驴)，从而制备多克隆抗体。所述抗原可以可选地与载体蛋白(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白)偶联。在无菌盐水中稀释该抗原(带有或不带有载体蛋白)并通常与佐剂(例如完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂)联合以形成稳定的乳液。在足够长的一段时间后，从经免疫的动物的血液和腹水等中回收多克隆抗体。根据本领域的标准方法，包括但不限于亲和层析、离子交换色谱、凝胶电泳和透析，可从血清或腹水中纯化出多克隆抗体。
在一些实施方式中，抗Notch1抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，可采用本领域技术人员已知的杂交瘤方法来制备单克隆抗体。使用杂交瘤法按上文所述使小鼠、仓鼠或其他适合的宿主动物免疫，以引发淋巴细胞来产生特异性结合免疫抗原的抗体。在一些实施方式中，在体外免疫化淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫性抗原(例如Notch蛋白)是人蛋白或其部分。在一些实施方式中，免疫性抗原(例如Notch蛋白)是小鼠蛋白或其部分。在一些实施方式中，免疫性抗原是人Notch蛋白的细胞外结构域。在一些实施方式中，免疫性抗原是小鼠Notch蛋白的细胞外结构域。在一些实施方式中，用人抗原来免疫化小鼠。在一些实施方式中，用小鼠抗原来免疫化小鼠。
免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与适当骨髓瘤细胞系融合。使用本领域已知的特化培养基来选择杂交瘤细胞，未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞在该选择过程中不会存活。可通过多种技术，包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹和体外结合测定(例如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))来鉴定产生针对靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。可使用标准方法在组织培养物中体外增殖或以宿主动物腹水体内增殖所述杂交瘤。根据本领域的标准方法，包括但不限于亲和层析、离子交换色谱、凝胶电泳和透析，可从培养基或腹水中纯化出单克隆抗体。
在一些实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的重组DNA技术来制备单克隆抗体。在一些实施方式中，通过例如使用特异性扩增编码抗体重链和轻链的寡核苷酸引物的RT-PCR，将编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟B细胞或杂交瘤细胞中分离出，并使用常规技术确定其序列。将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆至适合的表达载体中，当将该表达载体转染到宿主细胞(例如大肠杆菌、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中时，所述表达载体产生单克隆抗体。在某些实施方式中，可以从表达所需物种的可变区或CDR的噬菌体展示文库中分离出重组单克隆抗体或其片段。
可以例如使用重组DNA技术修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生替代性抗体。在一些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定区可以被替换成例如人抗体的对应区域已产生嵌合抗体或替换成非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方式中，恒定区被截短或除去，以产生单克隆抗体的所需抗体片段。在一些实施方式中，可以使用可变区的定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力和/或其它生物学特征。在一些实施方式中，可以使用CDR的定点诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和力和/或其它生物学特征。
在一些实施方式中，抗Notch1抗体是人源化抗体。通常，人源化抗体是利用本领域技术人员已知的方法将来自CDR的残基替换成非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的具有所需特异性、亲和力和/或结合力的CDR残基而得到人免疫球蛋白。在一些实施方式中，人类免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人类物种的抗体中的具有所需特异性、亲和力和/或结合力的相应残基置换。在一些实施方式中，通过对Fv框架区中的和/或在已置换的非人残基中的其他残基进行替换，可以进一步修饰人源化抗体，从而细调和优化抗体的特异性、亲和力和/或结合力。通常，人源化抗体基本上会包含至少一个且通常两个或三个可变区域中的全部，在该可变区中，全部或基本上全部CDR都对应于非人免疫球蛋白，而全部或基本上全部框架区都属于人免疫球蛋白序列。在一些实施方式中，人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的相应部分。在某些实施方式中，在施用给人受试者时，治疗上使用此类人源化抗体，因为它们可减少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)响应。依照已知技术，本领域技术人员将能够获得具有降低的免疫原性的功能性人源化抗体。
在某些实施方式中，抗Notch 1抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的各种技术来直接制造人抗体。在一些实施方式中，可以从经体外免疫的永生化人B淋巴细胞或从分离自经免疫的个体的淋巴细胞中产生人抗体。在上述两种情况的任一种情况下，可以产生并分离出产生针对靶抗原的抗体的细胞。
在一些实施方式中，可以从表达人抗体的噬菌体文库中选择人抗体。可使用噬菌体展示技术来从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。用于产生和使用抗体噬菌体文库的各种技术是本领域熟知的。
一旦抗体被鉴定，可以采用本领域已知的亲和力成熟策略(包括但不限于链改组和定点诱变)来产生高亲和力人抗体。
在一些实施方式中，人抗体可以在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造。在免疫化后，这些小鼠在无内源性免疫球蛋白生产的情况下能够产生人抗体全谱。
在某些实施方式中，抗Notch 1抗体是双特异性抗体。双特异性抗体能够特异性地识别并结合至少两种不同的表位。所述不同表位可以处在同一分子中或者处在不同的分子上。在一些实施方式中，该抗体可特异性识别和结合第一抗原靶(例如Notch1)以及第二抗原靶，例如白细胞上的效应分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受体(例如，CD64、CD32或CD16)，从而将细胞防御机制集中于表达第一抗原靶的细胞。在一些实施方式中，可以使用抗体来将细胞毒剂引导至表达特定靶抗原(例如Notch1)的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。在某些实施方式中，这些抗体可用来影响血管发生。在某些实施方式中，双特异性抗体结合Notch1和VEGF。在某些实施方式中，该双特异性抗体特异性结合Notch1以及Notch配体(例如DLL4、Jagged1或Jagged2)或选自Notch2、Notch3和Notch4的至少一种另外的Notch受体。
制造双特异性抗体的技术是本领域技术人员已知的，参见例如：Millstein等，1983,Nature 305:537-539；Brennan等，1985,Science 229:81；Suresh等，1986,Methodsin Enzymol 121:120；Traunecker等，1991,EMBO J.10:3655-3659；Shalaby等，1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelny等，1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruber等，1994,J.Immunol.152:5368；美国专利5,731,168和美国专利公开2011/0123532。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。还考虑了具有多于两个结合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等，J.Immunol,147:60(1991))。因此，在某些实施方式中，Notch1抗体是多特异性的。
在某些实施方式中，本文所述的抗Notch1抗体可以是单特异性的。例如，在某些实施方式中，抗体所包含的一个或多个抗原结合位点中的每一个能够结合(或结合)Notch1上的同源表位。
在某些实施方式中，抗Notch1抗体是抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力；例如，抗体片段可具有增加的肿瘤渗透。用于产生抗体片段的多种技术是已知的，包括但不限于完整抗体的蛋白水解性消化。在一些实施方式中，抗体片段包括由胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab')2片段。在一些实施方式中，抗体片段包括通过还原F(ab')2片段的二硫键桥而产生的Fab片段。在其它实施方式中，抗体片段包括以木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段。在某些实施方式中，通过重组手段来制造抗体片段。在一些实施方式中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗体片段可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并分泌，使得可以大量地制造这些片段。在一些实施方式中，抗体片段分离自本文讨论的抗体噬菌体文库。例如，可使用构建Fab表达文库的方法，以允许快速有效地鉴定对Notch1或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方式中，抗体片段是线性抗体片段。在某些实施方式中，抗体片段是单特异性或双特异性的。在某些实施方式中，抗Notch1抗体是scFv。可以使用各种技术来产生对Notch1有特异性的单链抗体。
还可能理想的是，特别是对于抗体片段的情况，修饰抗体以改变(例如延长或缩短)其血清半衰期。这可以通过例如下述方式来实现：通过使抗体片段中的适当区域突变，或通过将表位整合至肽标签中并随后将该标签融合至抗体片段的任一末端或中部(例如通过DNA合成或肽合成)，从而将救助受体(salvage receptor)结合表位整合到抗体片段中。
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两种共价接合的抗体构成。例如，已提出此类抗体来将免疫细胞靶向至不需要的细胞(参见美国专利4,676,980)。还认为异源偶联抗体可以使用合成蛋白化学中已知的方法在体外制备，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物和甲基-4-巯基环丁酰亚胺。
为了实现本发明的目的，应认识到的是，经修饰的抗体或其片段可以包含使抗体与人Notch1联结的任何类型的可变区。在一些实施方式中，该区是可以属于或源自经诱导可引发体液应答并产生针对所需抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物的可变区。因此，经修饰的抗体的可变区可以源于例如人、鼠、非人灵长类(例如，食蟹猴、猕猴等)或兔。在一些实施方式中，经修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区都属于人。在其他实施方式中，相容抗体的可变区(通常源自非人来源)可以经改造或经特定修剪而提高结合性质或降低该分子的免疫原性。就此而言，可以通过包含导入的氨基酸序列来人源化或修改可用于本发明的可变区。
在某些实施方式中，通过部分置换一个或多个CDR，并且必要时还通过进行部分框架区置换和序列修饰和/或修改，来修改重链和轻链中的可变区。虽然可以从与框架区所源自的抗体属于同一类别或甚至亚类的抗体得到CDR，但考虑了可以从属于不同类别的抗体且往往从来自不同物种的抗体得到CDR。可以不必用来自供体可变区的所有CDR来置换全部CDR以将一个可变区的抗原结合能力转移至另一个。相反，可能仅需要转移保持抗原结合位点的活性所必须的那些残基。
尽管对可变区进行了修改，但本领域的技术人员会认识到，本发明的经修饰的抗体将包括下述抗体(例如全长抗体或其抗原结合片段)：其中，在与包含天然的或未修改的恒定区的具有近似相同的免疫原性的抗体相比时，所述抗体已经缺失或修改了一个或多个恒定区结构域的至少一部分以提供所需的生物化学特性，例如提高的肿瘤定位、增加的肿瘤渗透、缩短的血清半衰期或延长的血清半衰期。在一些实施方式中，经修饰的抗体的恒定区包含人恒定区。对恒定区的修饰包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或替换。本文公开的经修饰的抗体可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定区(CL)中的一个或多个的修改或修饰。在一些实施方式中，从经修饰的抗体的恒定区中部分缺失或完全缺失一个或多个结构域。在一些实施方式中，去除了整个CH2结构域(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，用短氨基酸间隔物(例如，10个氨基酸残基)来置换略去的恒定区结构域，所述短氨基酸间隔物提供一些通常由缺失的恒定区赋予的分子柔性。
在某些实施方式中，改造经修饰的抗体以将CH3结构域直接融合到抗体的铰链区。在其它实施方式中，在铰链区和经修饰的CH2和/或CH3结构域之间插入肽间隔物。例如，可以表达构建体，其中CH2结构域已经缺失，并且余下的CH3结构域(修饰或未修饰的)通过5至20个氨基酸的间隔物而连接到铰链区上。可以添加这样的间隔物以确保恒定区的调控元件保持自由且可及，或者确保铰链区保持柔性。然而，应当注意的是，在某些情况中，可能证实氨基酸间隔物具有免疫原性并引发针对所述构建体的不需要的免疫应答。因此，在某些实施方式中，添加到所述构建体的任何间隔物应当相对无免疫原性，从而保持经修饰的抗体的所需生物学品质。
在一些实施方式中，经修饰的抗体可仅具有恒定区的部分缺失或数个或甚至单个氨基酸替换。例如，CH2结构域的选定区域中的单氨基酸突变可能足以显著降低Fc结合，并由此加强肿瘤定位和/或肿瘤渗透。类似地，可能希望简单地缺失一个或多个恒定区的控制待调节的特定效应子功能(例如补体C1q结合)的那部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的选定特性(血清半衰期)，同时使与该恒定区域关联的其它所需功能保持完整。而且，如上文所示，可以通过增强所得构建体的特性的一个或多个氨基酸的突变或替换来修饰所公开的抗体的恒定区。在这方面，可能可以破坏由保守的结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本保持经修饰的抗体的构型和免疫原性特性。在某些实施方式中，经修饰的抗体包含向恒定区添加的一个或多个氨基酸，以增强所需特性，例如降低或增加效应子功能，或者提供更多的细胞毒素或碳水化合物粘附。
在本领域中已知恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分与IgG或IgM抗体(已结合抗原)的Fc区的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的激活也刺激了炎症反应并且也可参与自身免疫超敏症。另外，抗体的Fc区可结合表达Fc受体(FcR)的细胞。存在许多对于不同类别的抗体有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发了许多重要且多样的生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解、炎症介质的释放、胎盘转运和对免疫球蛋白生成的控制。
在某些实施方式中，抗Notch1抗体提供改变的效应子功能，这进而影响所施用抗体的生物学特性。例如，在一些实施方式中，恒定区结构域的(通过点突变或其他方法造成的)缺失或失活可以减少循环中的经修饰抗体(例如抗Notch1抗体)与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位和/或渗透。在其它实施方式中，恒定区修饰延长或缩短抗体的血清半衰期。在一些实施方式中，修饰恒定区来消除二硫键或寡糖部分，这允许加强肿瘤定位和/或渗透。
在某些实施方式中，抗Notch1抗体不具有一种或多种效应子功能。在一些实施方式中，该抗体不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，该抗体不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方式中，抗体不具有效应子功能。
本发明还涵盖了与本文提出的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体或它们的抗体片段基本同源的变体和等效物。这些变体或等效物可以含有例如保守性替换突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸替换。
通过本领域中已知的任何方法，可以针对特异性结合来测定本发明的抗Notch1抗体。可以使用的免疫测定包括但不限于使用诸如BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、放射免疫测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定等技术的竞争和非竞争测定系统。这些测定在本领域中是常规的并且是众所周知的(参见，例如Ausubel等(编者),1994至今,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。
例如，可以使用ELISA来确定抗Notch1抗体对人Notch1的特异性结合。ELISA测定包括制备抗原、用抗原包被96孔微孔板的孔、向孔中添加与诸如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物偶联的抗体、温育一段时间并检测结合剂或抗体的存在。在一些实施方式中，抗体不与可检测化合物偶联，而是向所述孔中添加识别所述抗体的偶联的二抗。在一些实施方式中，不用抗原包被孔，而是可以用抗体包被孔，并且在向经包被的孔中添加抗原，而后添加与可检测化合物偶联的二抗。本领域技术人员将知晓可经修改和/或优化而增加检测到的信号的参数以及ELISA的其他可用变化形式(参见例如Ausubel等(编者)，1994至今,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。
在另一实例中，可以使用FACS来确定抗Notch1抗体对人Notch1的特异性结合。FACS筛选测定可以包括：产生表达作为融合蛋白的抗原的cDNA构建体，将该构建体转染到细胞中，在所述细胞表面表达该抗原，将抗Notch1抗体与转染的细胞混合，并温育一段时间。可以使用与可检测化合物偶联的二抗(例如PE偶联的抗Fc抗体)和流式细胞仪来鉴定结合有抗体的细胞。本领域技术人员知晓可经修改而优化所检出的信号的参数以及可增强筛选的的FACS的其它变化形式(例如筛选封闭性抗体)。
可以通过竞争结合测定来确定抗Notch1抗体的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的结合-解离速率。在一些实施方式中，竞争结合测定是放射免疫测定，其包括：在逐渐增加的量的未标记的抗原存在时，将带标记的抗原(例如3H或125I)或其片段或变体与所感兴趣的抗体温育，随后检测与带标记的抗原结合的抗体。可以从利用Scatchard作图分析获得的数据来确定抗体对抗原的亲和力和结合-解离速率。在一些实施方式中，使用Biacore动力学分析来确定抗体或结合Notch1的抗体的结合亲和力和结合-解离速率。Biacore动力学分析包括分析抗体与固定在Biacore芯片表面上的抗原(例如Notch蛋白)的结合和解离。在一些实施方式中，可使用Biacore动力学分析来确定在定性表位竞争结合测定中不同抗体的结合。
因此，本发明提供了产生结合人Notch1的细胞外结构域的抗体的方法。在一些实施方式中，本发明提供了产生结合人Notch1的细胞外结构域的抗体的方法。在一些实施方式中，本发明提供了产生结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区的抗体的方法。在一些实施方式中，产生结合Notch1的抗体的所述方法包括使用杂交瘤技术。在一些实施方式中，所述方法包括使用小鼠Notch1或人Notch1的细胞外结构域作为免疫性抗原。在一些实施方式中，产生结合Notch1的抗体的方法包括筛选人噬菌体文库。本发明还提供鉴定结合人Notch1的抗体的方法。在一些实施方式中，通过以流式细胞术(FACS)筛选对Notch1的结合来鉴定抗体。在一些实施方式中，针对对人Notch1的结合来筛选抗体。在一些实施方式中，针对对小鼠Notch1的结合来筛选抗体。在一些实施方式中，通过筛选对Notch1激活的抑制或阻断来鉴定抗体。
在某些实施方式中，本文所述的抗体是分离的。在某些实施方式中，本文所述的抗体基本上是纯的。
抗Notch1抗体的非限制性实例已在例如美国专利8,435,513中描述。
在本发明的一些实施方式中，抗Notch1抗体是多肽。该多肽可以是结合人Notch1的细胞外结构域的重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域技术人员应理解的是，可以对多肽的一些氨基酸序列进行改变而不会显著影响蛋白的结构或功能。因此，所述多肽还包括显示与人Notch1蛋白的表位的显著结合活性的多肽的变化形式。在一些实施方式中，多肽的氨基酸序列变化形式包括缺失、插入、倒位、重复和/或类型替换。
可以进一步修饰多肽及其变体以包含通常不属于该多肽的一部分的额外化学部分。这些衍生出的部分可以改进多肽的溶解性、生物学半衰期或吸收。这些部分还可以减少或消除多肽及变体的任何不需要的副作用。关于这些化学部分的综述可参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London。
可以通过本领域已知的任何合适的方法来生产本文所述的分离的多肽。这些方法从直接蛋白合成方法，到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在合适的宿主中表达这些序列。在一些实施方式中，使用重组技术通过分离或合成编码野生型目标蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选的是，可以通过位点特异性诱变来对该序列进行诱变从而提供其功能性变体。
在一些实施方式中，编码目标多肽的DNA序列可以通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成来构建。可以基于所需多肽的氨基酸序列和选择在会产生目标重组多肽的宿主细胞中偏好的那些密码子来设计寡核苷酸。可以应用标准方法来合成编码目标多肽的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列来构建回译基因。另外，可以合成含有编码特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几种编码所需多肽的一部分的小寡核苷酸并随后将其连接起来。单独的寡核苷酸通常含有5’和/或3’延伸序列以用于互补组装。
一旦进行了组装(通过合成、定点诱变或其他方法)，则可以将编码特定目标多肽的多核苷酸序列插入表达载体，并可操作地连接至适合在所需宿主中表达所述多肽的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制性酶切定位和/或在合适的宿主中表达生物活性多肽来确认正确的组装。如本领域中众所周知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，必须将该基因可操作地连接至在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方式中，使用重组表达载体来扩增和表达编码Notch1抗体或其片段的DNA。例如，重组表达载体可以是可复制的DNA构建体，其具有编码抗Notch1抗体或其片段的多肽链的合成或cDNA来源的DNA片段，所述DNA片段与源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件可操作地连接。转录单元通常包括以下组件的组装体：(1)在基因表达中起作用的调控元件，例如，转录启动子和/或增强子，(2)转录为mRNA并且翻译成蛋白的结构序列或编码序列，和(3)合适的转录和翻译起始序列和终止序列。调控元件可以包括用于控制转录的操纵基因序列。在宿主中进行复制的能力通常由复制起点赋予，并且可以另外引入便于识别转化体的选择基因。当DNA区域在功能上相互相关时，这些DNA区域是“可操作地连接”的。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则该DNA与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与该编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点位于允许翻译的位置，则该核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。意在在酵母表达体系中使用的结构元件包括能够使宿主细胞将翻译的蛋白分泌到胞外的前导序列。作为另一选择，当表达不具有前导序列或转运序列的重组蛋白时，其可以包括N端甲硫氨酸残基。可以随后可选地从表达的重组蛋白中切下该残基以提供最终产物。
表达载体和控制元件的选择取决于对宿主的选择。可以采用多种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物在内的来自大肠杆菌的质粒，以及诸如M13和其他丝状单链DNA噬菌体等更广宿主范围的质粒。
用于表达抗Notch1抗体(或用作抗原的Notch蛋白)的合适的宿主细胞包括处于适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述的哺乳动物来源的已建立的细胞系。还可以使用无细胞翻译系统。
使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白可能是优选的，因为所述蛋白通常正确地折叠、合适地得到修饰且具有生物学功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7(来源于猴肾)、L-929(来源于鼠成纤维细胞)、C127(来源于鼠乳腺肿瘤)、3T3(来源于鼠成纤维细胞)、CHO(来源于中国仓鼠卵巢)、HeLa(来源于人宫颈癌)、BHK(来源于仓鼠肾成纤维细胞)和HEK-293(来源于人胚肾)细胞系及其变体。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件(例如与待表达的基因连接的复制起点、合适的启动子和增强子，以及其它5’或3’侧翼非转录序列)以及5’或3’非翻译序列(例如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列)。
在昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白还提供了产生正确折叠的且具有生物学功能的蛋白的稳健方法。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统是本领域技术人员熟知的(参见例如Luckow和Summers,1988,Bio/Technology,6:47)。
可以根据任何合适的方法对经转化宿主所产生的蛋白(例如抗体)进行纯化。这些方法包括色谱(例如离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻柱色谱)、离心、差别溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其它标准技术。可以将诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感病毒衣壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签与蛋白连接，从而允许通过经过合适的亲和柱而容易地进行纯化。可以使用诸如蛋白水解、高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)和X射线晶体学等技术对分离的蛋白进行物理表征。
例如，可以首先使用商购的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的表达系统的上清液。浓缩步骤后，可将浓缩物施加到合适的纯化基质。在一些实施方式中，可以使用阴离子交换树脂，例如具有悬挂的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其它种类。在一些实施方式中，采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括各种含有磺丙基或羧甲基的不溶性基质。在一些实施方式中，可以使用羟磷灰石介质，包括但不限于陶瓷羟磷灰石(CHT)。在一些实施方式中，可以使用一个或多个采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有悬挂的甲基或其它脂肪族基团的硅胶)的反相HPLC步骤来进一步纯化蛋白。还可以以各种组合使用上述纯化步骤中的一些或全部，从而提供均质的重组蛋白。
在一些实施方式中，细菌培养物中产生的重组蛋白可通过例如以下方式分离：从细胞团块中进行初步提取，然后是一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。在某些实施方式中，最后的纯化步骤使用HPLC。可以通过任何常规方法破碎用于表达重组蛋白的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。
本领域已知用于纯化抗体和其它蛋白的方法还包括例如美国专利公开2008/0312425和2009/0187005以及美国专利7,691,980中描述的那些。
用于鉴定和产生以高亲和性结合蛋白靶的非抗体多肽的多种方法是本领域已知的。参见例如，Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等,2006,ProteinScience,15:14-27；Gill等,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76；和Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83。在某些实施方式中，可使用噬菌体展示技术来产生和/或鉴定Notch1结合性多肽。在某些实施方式中，Notch1结合性多肽包括选自由以下组成的组的类型的蛋白支架：蛋白A、蛋白G、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。
在某些实施方式中，抗Notch1抗体能够以多种偶联(即免疫偶联物或放射偶联物)或未偶联形式的任何一种使用。在某些实施方式中，抗体以未偶联形式使用，以利用受试者的包括CDC和/或ADCC的自然防御机制来消除恶性细胞或癌细胞。
在一些实施方式中，抗Notch1抗体与细胞毒剂偶联。在一些实施方式中，细胞毒剂是化疗剂，包括但不限于：氨甲喋呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂。在一些实施方式中，细胞毒剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物。在一些实施方式中，细胞毒剂是产生放射偶联物或放射偶联抗体的放射性同位素。可获得用于产生放射偶联抗体的多种放射性核素，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。还可以使用抗体和一种或多种小分子毒素(例如卡奇霉素、美登醇、单端孢霉烯和CC1065)及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的偶联物。抗体和细胞毒剂的偶联物是使用多种双功能蛋白偶联剂制成的，例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如盐酸己二亚胺酸二甲酯)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两种共价接合的抗体构成。例如，已提出此类抗体能够将免疫细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)。认为这些抗体可以使用合成蛋白化学中已知的方法体外制备，包括涉及交联剂的方法。
IV.多核苷酸
在某些实施方式中，本发明涵盖包含编码特异性结合人Notch1的细胞外结构域的多肽或这种多肽的片段的多核苷酸的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包括多肽编码序列的多核苷酸、以及包括额外的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。例如，本发明提供包含编码抗人Notch1的抗体或编码这种抗体的片段的核酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，如果是单链，其可以是编码链或非编码链(反义链)。
在某些实施方式中，所述多核苷酸包含编码多肽的多核苷酸，其包含选自以下序列组成的组的序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:36。在某些实施方式中，所述多核苷酸包含选自以下序列组成的组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:30。在一些实施方式中，质粒含有包含SEQ ID NO:24的多核苷酸。在一些实施方式中，质粒含有包含SEQ ID NO:30的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述多核苷酸所包含的多核苷酸的核苷酸序列与包含选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:36组成的组的序列的多核苷酸至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同，且在一些实施方式中，至少96％、97％、98％或99％相同。还提供了一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36杂交的多核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:36的互补序列杂交的多核苷酸。在某些实施方式中，该杂交是在高度严格性条件下。
本发明的结合剂可以由一种或多种多核苷酸编码。例如，在一些实施方式中，重链多肽由一种多核苷酸编码，轻链多肽由另一种多核苷酸编码。在一些实施方式中，重链多肽和轻链多肽由一种多核苷酸编码。
某些实施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合于有助于例如在宿主细胞中表达和分泌多肽的多核苷酸(例如用作控制多肽从细胞中转运的分泌序列的前导序列)。具有前导序列的多肽是一种前体蛋白，其前导序列可被宿主细胞切除以产生成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码由成熟蛋白加上额外的5'氨基酸残基得到的前体蛋白。具有前体序列的成熟蛋白是一种前体蛋白，并且是该蛋白的非活性形式。一旦切除了前体序列，会留下活性成熟蛋白。
在某些实施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在同一阅读框中融合于允许例如纯化和/或鉴定所编码多肽的标志序列。例如，在细菌宿主的情况中，该标志序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以纯化与该标志物融合的成熟多肽，或者，当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，标志序列可以是源自于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。在一些实施方式中，标志序列是可与其它亲和标签联合使用的FLAG标签，即序列DYKDDDDK的肽(SEQ ID NO:39)。
本发明还涉及上述多核苷酸的变体，其编码例如片段、类似物和/或衍生物。
在某些实施方式中，本发明提供分离的多核苷酸，其所包含的多核苷酸的核苷酸序列与编码包含本文所述的抗体或其片段的多肽的多核苷酸至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同，且在一些实施方式中，至少96％、97％、98％或99％相同。
本文所用的短语“多核苷酸的核苷酸序列与参照核苷酸序列至少例如95％‘相同’”是指，对于参照核苷酸序列的每100个核苷酸，所述多核苷酸的序列可包含至多5个点突变，除此之外，所述多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的。换言之，为了获得核苷酸序列与参照核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参照序列中至多有5％的核苷酸可以缺失或被其他核苷酸替换，或者占参照序列总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可以插入到参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5'末端位置或3'末端位置，或者这些末端位置之间的任意位置，或者单独地散布在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个连续组散布在参照序列中。
多核苷酸变体可以在编码区和/或非编码区中包含改变。在一些实施方式中，多核苷酸变体含有产生沉默替换、添加或缺失但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方式中，多核苷酸变体含有不造成氨基酸序列的任何变化的改变。在一些实施方式中，由于遗传密码子的简并性，多核苷酸变体包含“沉默”替换。可以出于各种原因，例如为了针对特定宿主优化密码子表达(例如，将人mRNA中的密码子变为细菌宿主(例如大肠杆菌)所偏好的密码子)，而产生多核苷酸变体。
在某些实施方式中，多核苷酸是分离的。在某些实施方式中，多核苷酸基本上是纯的。
还提供包含本文所述多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方式中，表达载体包含多核苷酸。在一些实施方式中，宿主细胞包含含有该多核苷酸的表达载体。在一些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸。
V.试剂盒
本发明提供包含本文所述的抗体或其他试剂的试剂盒，该试剂盒可用来执行本文所述的方法。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个容器中的抗Notch1抗体。在一些实施方式中，试剂盒包含对于进行检测测定(例如检测Notch1突变)而言必要和/或充分的所有组分，包括所有的对照、进行检测的说明书和用于分析和呈现结果的任何必要的软件。在一些实施方式中，试剂盒包含对于进行检测测定(例如检测组织样品中的Notch1 ICD)而言必要和/或充分的所有组分，包括所有的对照、进行检测的说明书和用于分析和呈现结果的任何必要的软件。本领域技术人员将容易知道，可以将本发明所公开的抗体或试剂容易地并入本领域公知的一种成熟的试剂盒形式中。
还提供了包含抗Notch1抗体和至少一种额外的治疗剂的试剂盒。在某些实施方式中，额外的治疗剂是化疗剂。在某些实施方式中，额外的治疗剂是血管发生抑制剂。在某些实施方式中，额外的治疗剂是额外的抗体。
本公开内容的实施方式可以参照以下非限制性实施例进一步得到限定，以下实施例描述了抗Notch1抗体用于治疗癌症的用途。对本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本公开的范围的情况下对材料和方法做出多种修改。
实施例
实施例1
1a期研究
对具有一定的复发的或难治性实体瘤的受试者进行的抗Notch1抗体OMP-52M51的开放标签1a期剂量递增研究正在进行中。该研究包括剂量递增期和扩展(expansion)期。该研究的终点包括确定安全性、药代动力学(PK)、免疫原性、药效学(PD)和初步功效。
在招募之前，筛选受试者以确定研究准入资格。在进入研究时，所有受试者都接受评估，以利用存档的肿瘤组织或者利用(如果没有存档的肿瘤组织可用的话)新鲜芯或穿刺活检组织来确认Notch1途径激活的存在。
在研究初期，进行剂量递增以确定OMP-52M51的最大耐受剂量。如下静脉内施用药物：以0.25、0.5、1.0和2.5mg/kg的剂量水平每四周施用1次(Q4W)，和以2.5、5和10mg/kg的剂量水平每三周施用1次(Q3W)。如果出现药物相关的毒性，则以2.0、1.5和1.0mg/kg的剂量水平每三周静脉内施用1次药物。在一个剂量队列(cohort)中不允许剂量递增或剂量减少。
以0.25mg/kg的初始剂量水平开始，采用了加速滴定法以使得在每个队列中，每个剂量队列有最少一个受试者被招募，并且允许至多至下一个(更高的)剂量水平的剂量递增，前提是未观察到2级研究药物相关毒性或剂量限制性毒性(DLT)。在队列中招募额外的受试者，前提是他们得到鉴定，并且在第一位受试者2周内接受第一次剂量。在招募每个后续剂量水平的第一位受试者之前，之前的队列中的所有受试者都必须接受至少28天的观察(如果使用Q3W剂量计划，则观察至少21天)。
如果两位受试者经历了2级以上的研究药物相关毒性，或任何受试者经历DLT，则中止加速滴定，并且在当前的剂量队列和任何后续队列中招募最少3位受试者。如果观察到DLT，则在剂量队列中招募至少6位受试者，除非在招募全部6位受试者之前出现了第二次DLT。在同一天，不会以之前未测试过的剂量对两位受试者给药。不过，在经过24小时后，可以招募额外的受试者。如果两位患者经历DLT，在该水平不会再对受试者给药，并且将在前一个剂量队列中(除非6位受试者已经用该剂量水平治疗过)或在中间的剂量水平增加3位额外的受试者。将在第0至第28天(对于Q4W给药方式)和第0至第21天(对于Q3W给药方式)对受试者进行DLT评估。
2014年2月12日的研究总结见表2A。2015年2月24日的研究总结见表2B。
表2A
表2B
在该研究的剂量递增期，7位患者具有Notch1 ICD高的肿瘤，19位具有Notch1 ICD低的肿瘤，且7位患者由于缺乏肿瘤材料而未确定Notch1 ICD肿瘤状况。
此外，该研究的剂量扩展队列期已开始招募患者。该队列仅招募具有Notch1 ICD高的肿瘤的患者。
实施例2
患有腺样囊性癌的受试者
在2.5mg/kg Q3W队列中招募的一位受试者是一位28岁的男性，他具有复发性腺样囊性癌，且已转移至肝脏、肺和骨。该受试者的肿瘤在Notch1基因的外显子34中具有Notch1突变，预测该突变会引起移码突变，导致翻译过早终止。该突变的标准化命名是NM_017617.3(NOTCH1):c.7398_7401del p.S2467fs*。该突变位于Notch1的PEST结构域内，据信是激活性突变。从2013年三月至2013年十二月，该受试者接受了四个在先的治疗疗程。这些治疗包括：顺铂/阿霉素/环磷酰胺，卡铂/长春瑞滨，ISIS481464，和西妥昔单抗，且注意到该受试者在每个这些治疗后都具有疾病恶化。
许多癌类型可以升高乳酸脱氢酶(LDH)水平，且在LDH水平升高时测量LDH水平可有助于监视治疗。由于该受试者的LDH水平升高，所以使用了该标志物来监视OMP-52M51治疗。在第0天，受试者的LDH水平是1125IU/L。在第一次剂量的OMP-52M51后的第7天，受试者的LDH水平已降至500IU/L；在第14天，其LDH水平已进一步降至254IU/L。在第21天，受试者的LDH水平已升至约475IU/L，但在第二次剂量的OMP-52M51后的第28天，其LDH水平再次降至约280IU/L，且在第35天又少量下降(见图1)。
该受试者曾具有骨转移导致的巨大疼痛。在用OMP-52M51治疗前，该受试者每天服用60mg奥施康定。在第一次剂量的OMP-52M51后，从第2天至第20天，受试者经历了显著减少的骨痛，并且能够将其奥施康定服用量减少至每天0至8mg。在第21天，受试者经历了增加的疼痛，但在第二次剂量的OMP-52M51后，在第23和28天，受试者报告了疼痛再次减轻。
在两次剂量的OMP-52M51后，获得了受试者胸部、腹部和骨盆区域的CT扫描图，并与约5周前完成的CT扫描图比较。肺小结保持稳定，且看似没有新的转移疾病。肝脏的CT扫描显示了若干个肝脏转移块的尺寸显著减小(图2)。此外，还报告了肝脏转移物和硬化性骨转移物的数量减少。
因此，用抗Notch1抗体OMP-52M51进行的治疗看似对包含激活性Notch1突变的腺样囊性癌具有有效效果。这些前期研究是令人惊奇和出人意料的，原因是事实上已显示受试者的肿瘤对若干种不同的治疗(包括化疗、反义疗法和靶向细胞激酶的单克隆抗体)是难治性的。
实施例3
Notch1信号传导测定
如上文实施例2中所述，在ACC患者的肿瘤中鉴定出了Notch1突变c.7398_7401del,p.S2467fs。为了确定该突变对Notch1信号传导的影响，使用具有所需的4bp缺失(c.7398_7401del)的合成DNA片段构建了表达全长突变Notch1 S2467fs蛋白的质粒。对照包括：空白载体、Notch1野生型(Notch1.WT)、在EGF9结构域中具有突变的Notch1(Notch1.F357delF)和具有激活性突变的Notch 1(Notch1.G2427fs)，其之前已在源自乳腺癌患者的异种移植肿瘤(OMP-B40)中得到确定。
用测试质粒和对Notch信号传导有响应性的萤火虫萤光素酶报告基因载体(8xCBF-萤光素酶报告基因)转染人PC3细胞。还使用作为转染效率的内部对照的海肾萤光素酶报告基因(Promega,Madison,WI)转染这些细胞。在37℃过夜温育经转染的PC3细胞。使用双萤光素酶测定系统(Promega,Madison WI)确定萤光素酶水平，并将萤火虫萤光素酶活性归一化为海肾萤光素酶活性。
每种Notch1蛋白的萤光素酶活性都是相对于被设为1的野生型Notch1(NOTCH1-WT)的活性而言的。如图3所示，在无配体的情况下，Notch1.S2467fs表现出的活性是野生型Notch1(NOTCH1-WT)的活性的3.3倍。该数据表明，位于Notch1的PEST结构域中的该移码突变(Notch1.S2467fs)是组成型激活的。该组成型激活的程度与之前已在源自乳腺癌患者的异种移植肿瘤(OMP-B40)中确定的另一种移码突变(Notch1.G2427fs)所观察到的激活程度相似。
实施例4
用IHC评估的Notch1 ICD表达
使用兔单克隆抗体D3B8(#4147,Cell signaling Technology,Danvers,MA)建立并优化了Notch1 ICD免疫组化(IHC)测定。该抗体仅在因Gly1753和Val1754之间的裂解而释放出多肽时检测Notch1细胞内结构域(ICD)。该抗体并不识别全长Notch1或在其他位置裂解得到的Notch1片段。切出4μm厚的FFPE切片，并安装在经涂布的玻璃载片上。在使用Ventana试剂的Ventana BenchMark ULTRA设备(Ventana Medical Systems,Inc.TucsonAZ)上将组织染色。用扩展细胞调理液1处理切片，随后在37℃下与抗体温育30分钟，并从用户定义的制备试剂盒中分配，抗体为9μg/ml。使用带有二氨基联苯胺(DAB)的ultraViewand Amplification试剂盒检测抗体，并用苏木精复染色。
使用Aperio设备(Leica Biosystems)分析载片。测量每个肿瘤细胞核的染色强度(0：无表达；1：弱表达；2：中等表达；3：强表达)，并对每个染色等级的细胞核进行计数，计算每种类型的百分比。对于每个组织切片，将数据整合为加权H分数：H分数＝[3×(％3+细胞核)]+[2×(％2+细胞核)]+[1×(％1+细胞核)]。阳性对照和阴性对照包括：购自FolioBiosciences(Columbus OH)的人组织切片，和具有已知的Notch1 ICD表达水平的源自患者的异种移植物(PDX)样品(来自OncoMed肿瘤库)。
使用该IHC测定，检查了来自实施例2所述的患者的肿瘤样品。如图4所示，患者的肿瘤具有高水平的Notch1 ICD，这与患者的肿瘤具有激活性Notch1突变的观察结果一致。此外，具有历时至多10个月的稳定疾病的、用OMP-52M51治疗的另一患者显示具有表达高水平Notch1 ICD的肿瘤。相反，在用OMP-52M51治疗期间疾病恶化的患者显示具有低水平或不可检测水平的Notch1 ICD的肿瘤。这些结果为用于鉴定可能对用抗Notch1抗体OMP-52M51进行的治疗有响应的肿瘤和患者的Notch1 ICD IHC预测性测定提供了非常坚实的基础。
应理解的是，本文描述的实施例和实施方式仅出于说明性目的，本领域技术人员据此可以想到多种修改或改变，且这些修改和改变也包含在本申请的主旨和范围内。
出于所有目的将本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请都通过援引完整地并入本文中，其程度如同具体地单独表明将各个单独的出版物、专利或专利申请都这样通过援引并入本文中。
以下是本申请中公开的序列：
人Notch1多核苷酸，编码氨基酸1427-1732(SEQ ID NO:1)
CACATCCTGGACTACAGCTTCGGGGGTGGGGCCGGGCGCGACATCCCCCCGCCGCTGATCGAGGAGGCGTGCGAGCTGCCCGAGTGCCAGGAGGACGCGGGCAACAAGGTCTGCAGCCTGCAGTGCAACAACCACGCGTGCGGCTGGGACGGCGGTGACTGCTCCCTCAACTTCAATGACCCCTGGAAGAACTGCACGCAGTCTCTGCAGTGCTGGAAGTACTTCAGTGACGGCCACTGTGACAGCCAGTGCAACTCAGCCGGCTGCCTCTTCGACGGCTTTGACTGCCAGCGTGCGGAAGGCCAGTGCAACCCCCTGTACGACCAGTACTGCAAGGACCACTTCAGCGACGGGCACTGCGACCAGGGCTGCAACAGCGCGGAGTGCGAGTGGGACGGGCTGGACTGTGCGGAGCATGTACCCGAGAGGCTGGCGGCCGGCACGCTGGTGGTGGTGGTGCTGATGCCGCCGGAGCAGCTGCGCAACAGCTCCTTCCACTTCCTGCGGGAGCTCAGCCGCGTGCTGCACACCAACGTGGTCTTCAAGCGTGACGCACACGGCCAGCAGATGATCTTCCCCTACTACGGCCGCGAGGAGGAGCTGCGCAAGCACCCCATCAAGCGTGCCGCCGAGGGCTGGGCCGCACCTGACGCCCTGCTGGGCCAGGTGAAGGCCTCGCTGCTCCCTGGTGGCAGCGAGGGTGGGCGGCGGCGGAGGGAGCTGGACCCCATGGACGTCCGCGGCTCCATCGTCTACCTGGAGATTGACAACCGGCAGTGTGTGCAGGCCTCCTCGCAGTGCTTCCAGAGTGCCACCGACGTGGCCGCATTCCTGGGAGCGCTCGCCTCGCTGGGCAGCCTCAACATCCCCTACAAGATCGAGGCCGTGCAGAGTGAGACCGTGGAGCCGCCCCCGCCG
人Notch1氨基酸1427-1732(SEQ ID NO:2)
HILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVVVVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNVVFKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRELDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSETVEPPPP
小鼠抗体52M51序列
52M51重链多核苷酸序列(SEQ ID NO:3)
ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGTAACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTCCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATATCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATAACAGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA
52M51重链氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:4)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRPGHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
52M51重链可变区多核苷酸序列(SEQ ID NO:5)
ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGTAACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA
52M51重链可变区氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:6)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRPGHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT
52M51重链可变区多核苷酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:7)
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGTAACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA
52M51重链可变区氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:8)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRPGHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGSSVTVSSA
52M51轻链多核苷酸序列(SEQ ID NO:9)
ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGATTTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGTATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTGACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAAGGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCCTAG
52M51轻链氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:10)
MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS
52M51轻链可变区多核苷酸序列(SEQ ID NO:11)
ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC
52M51轻链可变区氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:12)
MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQG
52M51轻链可变区多核苷酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:13)
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC
52M51轻链可变区氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:14)
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG
52M51重链CDR1(SEQ ID NO:15)
RGYWIE
52M51重链CDR2(SEQ ID NO:16)
QILPGTGRTNYNEKFKG
52M51重链CDR3(SEQ ID NO:17)
FDGNYGYYAMDY
52M51轻链CDR1(SEQ ID NO:18)
RSSTGAVTTSNYAN
52M51轻链CDR2(SEQ ID NO:19)
GTNNRAP
52M51轻链CDR3(SEQ ID NO:20)
ALWYSNHWVFGGGTKL
人源化52M51序列
52M51-H4重链多核苷酸序列(SEQ ID NO:21)
ATGGATTGGACATGGAGGGTGTTCTGCCTCCTCGCTGTGGCTCCTGGAGTCCTGAGCCAGGTCCAGCTCGTCCAGAGCGGGGCTGAAGTCAAGAAGCCTGGCGCTAGCGTCAAAATCAGCTGTAAGGTCAGCGGATACACACTGAGGGGATACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGATCGGCCAGATCCTGCCTGGAACCGGAAGGACAAATTACAATGAGAAGTTTAAGGGAAGGGTCACAATGACAGCAGACACAAGCACAGACACAGCTTATATGGAACTCAGCTCCCTCAGATCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGTGCCAGGTTCGATGGAAATTACGGATACTATGCCATGGATTACTGGGGACAGGGGACAACGGTCACCGTGAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
52M51-H4重链氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:22)
MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
52M51-H4重链氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:23)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
52M51-H4重链可变区多核苷酸序列(SEQ ID NO:24)
ATGGATTGGACATGGAGGGTGTTCTGCCTCCTCGCTGTGGCTCCTGGAGTCCTGAGCCAGGTCCAGCTCGTCCAGAGCGGGGCTGAAGTCAAGAAGCCTGGCGCTAGCGTCAAAATCAGCTGTAAGGTCAGCGGATACACACTGAGGGGATACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGATCGGCCAGATCCTGCCTGGAACCGGAAGGACAAATTACAATGAGAAGTTTAAGGGAAGGGTCACAATGACAGCAGACACAAGCACAGACACAGCTTATATGGAACTCAGCTCCCTCAGATCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGTGCCAGGTTCGATGGAAATTACGGATACTATGCCATGGATTACTGGGGACAGGGGACAACGGTCACCGTGAGCTCAGCC
52M51-H4重链可变区氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:25)
MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVSSA
52M51-H4重链可变区氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVSSA
52M51-L3轻链多核苷酸序列(SEQ ID NO:27)
ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGCGGAGTGGATAGCCAGGCCGTCGTCACACAGGAACCTAGCCTCACCGTTAGCCCTGGAGGAACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGAGCTCCCGGAGTCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTCCTGGGTGGCAAGGCTGCTCTGACACTCAGCGGTGCCCAGCCAGAGGATGAAGCGGAGTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAACCATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCTAGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTCTGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCCCCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCCGCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGCCGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA
52M51-L3轻链氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:28)
MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
52M51-L3轻链氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:29)
SGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
52M51-L3轻链可变区多核苷酸序列(SEQ ID NO:30)
ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGCGGAGTGGATAGCCAGGCCGTCGTCACACAGGAACCTAGCCTCACCGTTAGCCCTGGAGGAACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGAGCTCCCGGAGTCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTCCTGGGTGGCAAGGCTGCTCTGACACTCAGCGGTGCCCAGCCAGAGGATGAAGCGGAGTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAACCATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGG
52M51-L3轻链可变区氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:31)
MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG
52M51-L3轻链可变区氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:32)
SGVDSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG
52M51-L4轻链多核苷酸序列(SEQ ID NO:33)
ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGCGGAGTGGATAGCCAGACCGTCGTCACACAGGAACCTAGCTTTTCCGTTAGCCCTGGAGGAACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAACTGGTATCAGCAGACTCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGAGCTCCCGGAGTCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCATCCTGGGAAATAAAGCTGCTCTGACAATCACAGGTGCCCAGGCTGACGATGAAAGCGACTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAACCATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCTAGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTCTGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCCCCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCCGCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGCCGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA
52M51-L4轻链氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:34)
MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
52M51-L4轻链氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:35)
SGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
52M51-L4轻链可变区多核苷酸序列(SEQ ID NO:36)
ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGCGGAGTGGATAGCCAGACCGTCGTCACACAGGAACCTAGCTTTTCCGTTAGCCCTGGAGGAACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAACTGGTATCAGCAGACTCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGAGCTCCCGGAGTCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCATCCTGGGAAATAAAGCTGCTCTGACAATCACAGGTGCCCAGGCTGACGATGAAAGCGACTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAACCATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGG
52M51-L4轻链可变区氨基酸序列-下划线部分为预测的信号序列(SEQ ID NO:37)
MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG
52M51-L4轻链可变区氨基酸序列(无预测的信号序列)(SEQ ID NO:38)
SGVDSQTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG
FLAG-标签(SEQ ID NO:39)
DYKDDDDK
人p53(SEQ ID NO:40)
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD
人Notch1(SEQ ID NO:41)
MPPLLAPLLCLALLPALAARGPRCSQPGETCLNGGKCEAANGTEACVCGGAFVGPRCQDPNPCLSTPCKNAGTCHVVDRRGVADYACSCALGFSGPLCLTPLDNACLTNPCRNGGTCDLLTLTEYKCRCPPGWSGKSCQQADPCASNPCANGGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTCRQDVNECGQKPGLCRHGGTCHNEVGSYRCVCRATHTGPNCERPYVPCSPSPCQNGGTCRPTGDVTHECACLPGFTGQNCEENIDDCPGNNCKNGGACVDGVNTYNCRCPPEWTGQYCTEDVDECQLMPNACQNGGTCHNTHGGYNCVCVNGWTGEDCSENIDDCASAACFHGATCHDRVASFYCECPHGRTGLLCHLNDACISNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVDECSLGANPCEHAGKCINTLGSFECQCLQGYTGPRCEIDVNECVSNPCQNDATCLDQIGEFQCICMPGYEGVHCEVNTDECASSPCLHNGRCLDKINEFQCECPTGFTGHLCQYDVDECASTPCKNGAKCLDGPNTYTCVCTEGYTGTHCEVDIDECDPDPCHYGSCKDGVATFTCLCRPGYTGHHCETNINECSSQPCRHGGTCQDRDNAYLCFCLKGTTGPNCEINLDDCASSPCDSGTCLDKIDGYECACEPGYTGSMCNINIDECAGNPCHNGGTCEDGINGFTCRCPEGYHDPTCLSEVNECNSNPCVHGACRDSLNGYKCDCDPGWSGTNCDINNNECESNPCVNGGTCKDMTSGYVCTCREGFSGPNCQTNINECASNPCLNQGTCIDDVAGYKCNCLLPYTGATCEVVLAPCAPSPCRNGGECRQSEDYESFSCVCPTGWQGQTCEVDINECVLSPCRHGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGRNCETDIDDCRPNPCHNGGSCTDGINTAFCDCLPGFRGTFCEEDINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCENNTPDCTESSCFNGGTCVDGINSFTCLCPPGFTGSYCQHDVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQGYTGPNCQNLVHWCDSSPCKNGGKCWQTHTQYRCECPSGWTGLYCDVPSVSCEVAAQRQGVDVARLCQHGGLCVDAGNTHHCRCQAGYTGSYCEDLVDECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKCVAGYHGVNCSEEIDECLSHPCQNGGTCLDLPNTYKCSCPRGTQGVHCEINVDDCNPPVDPVSRSPKCFNNGTCVDQVGGYSCTCPPGFVGERCEGDVNECLSNPCDARGTQNCVQRVNDFHCECRAGHTGRRCESVINGCKGKPCKNGGTCAVASNTARGFICKCPAGFEGATCENDARTCGSLRCLNGGTCISGPRSPTCLCLGPFTGPECQFPASSPCLGGNPCYNQGTCEPTSESPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVVVVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNVVFKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRELDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSETVEPPPPAQLHFMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQHGQLWFPEGFKVSEASKKKRREPLGEDSVGLKPLKNASDGALMDDNQNEWGDEDLETKKFRFEEPVVLPDLDDQTDHRQWTQQHLDAADLRMSAMAPTPPQGEVDADCMDVNVRGPDGFTPLMIASCSGGGLETGNSEEEEDAPAVISDFIYQGASLHNQTDRTGETALHLAARYSRSDAAKRLLEASADANIQDNMGRTPLHAAVSADAQGVFQILIRNRATDLDARMHDGTTPLILAARLAVEGMLEDLINSHADVNAVDDLGKSALHWAAAVNNVDAAVVLLKNGANKDMQNNREETPLFLAAREGSYETAKVLLDHFANRDITDHMDRLPRDIAQERMHHDIVRLLDEYNLVRSPQLHGAPLGGTPTLSPPLCSPNGYLGSLKPGVQGKKVRKPSSKGLACGSKEAKDLKARRKKSQDGKGCLLDSSGMLSPVDSLESPHGYLSDVASPPLLPSPFQQSPSVPLNHLPGMPDTHLGIGHLNVAAKPEMAALGGGGRLAFETGPPRLSHLPVASGTSTVLGSSSGGALNFTVGGSTSLNGQCEWLSRLQSGMVPNQYNPLRGSVAPGPLSTQAPSLQHGMVGPLHSSLAASALSQMMSYQGLPSTRLATQPHLVQTQQVQPQNLQMQQQNLQPANIQQQQSLQPPPPPPQPHLGVSSAASGHLGRSFLSGEPSQADVQPLGPSSLAVHTILPQESPALPTSLPSSLVPPVTAAQFLTPPSQHSYSSPVDNTPSHQLQVPEHPFLTPSPESPDQWSSSSPHSNVSDWSEGVSSPPTSMQSQIARIPEAFK
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
2.一种减少患有腺样囊性癌的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述疼痛是骨痛。
4.一种抑制腺样囊性癌生长的方法，所述方法包括使所述癌与有效量的Notch1结合剂接触。
5.一种减小腺样囊性癌的尺寸的方法，所述方法包括使所述癌与有效量的Notch1结合剂接触。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌具有与预定水平的Notch1细胞内结构域(ICD)相比增加或升高的水平的Notch1 ICD。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌包含Notch1突变。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述Notch1突变：
(a)是错义突变、无义突变或移码突变；
(b)位于HD结构域中；
(c)位于TAD结构域中；
(d)位于PEST结构域中；
(e)是激活性突变；
(f)增加Notch1信号传导；和/或
(g)增加Notch1 ICD的水平。
9.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌(i)是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1 ICD或(ii)是否包含Notch1突变；和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
10.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获取样品，
(b)确定所述样品中的Notch1 ICD水平，和
(c)如果所述样品具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1ICD，则选择该受试者以用Notch1结合剂进行治疗。
11.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获取样品，
(b)确定所述样品是否具有Notch1突变，和
(c)如果所述样品具有Notch1突变，则选择所述受试者以用Notch1结合剂进行治疗。
12.如权利要求10或11所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述Notch1结合剂是特异性地结合人Notch1的细胞外结构域的抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区。
15.如权利要求14所述的方法，其中，Notch1受体的非配体结合性近膜区包含SEQ IDNO:2。
16.如权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
17.如权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:38具有至少90％序列同一性的轻链可变区。
18.如权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:8的重链可变区和SEQ ID NO:14的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区；或
(c)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区。
19.如权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，所述抗体：
(a)与以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体包含相同的重链可变区和轻链可变区；
(b)是以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体；
(c)是OMP-52M51-H4L3；或
(d)是以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体的人源化版本。
20.如权利要求13～19中任一项所述的方法，其中，所述抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。
21.如权利要求1～20中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌是复发性的；和/或已从原始部位转移。
22.如权利要求1～20中任一项所述的方法，其中，(i)所述受试者具有与预定水平或正常水平相比升高的水平的乳酸脱氢酶(LDH)，或(ii)所述腺样囊性癌具有与预定水平或正常水平相比升高的水平的LDH。
23.如权利要求1～3、6～9或12～22中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种额外的治疗剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述额外的治疗剂是化疗剂。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述额外的治疗剂是额外的治疗性抗体。
26.如权利要求1～3、6～9或12～25中任一项所述的方法，其中，所述受试者接受放射治疗。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述受试者在用Notch1结合剂进行治疗之前接受放射治疗。
28.如权利要求9或11～27中任一项所述的方法，其中，所述Notch1突变通过基于PCR的测定、微阵列分析或核酸测序来确定。
29.如权利要求9、10或12～27中任一项所述的方法，其中，所述Notch1 ICD水平通过免疫组化测定来确定。
30.如权利要求10～29所述的方法，其中，所述样品是新鲜肿瘤样品、冷冻肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋的样品。

Claims (68)

1.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
2.一种减少患有腺样囊性癌的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述疼痛是骨痛。
4.一种抑制腺样囊性癌生长的方法，所述方法包括使所述癌与有效量的Notch1结合剂接触。
5.一种减小腺样囊性癌的尺寸的方法，所述方法包括使所述癌与有效量的Notch1结合剂接触。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌具有与预定水平的Notch1细胞内结构域(ICD)相比增加或升高的水平的Notch1 ICD。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌包含Notch1突变。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述Notch1突变是错义突变、无义突变或移码突变。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述Notch1突变位于HD结构域中。
10.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述Notch1突变位于TAD结构域中。
11.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述Notch1突变位于PEST结构域中。
12.如权利要求7～11中任一项所述的方法，其中，所述Notch1突变是激活性突变。
13.如权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，所述Notch1突变增加Notch1信号传导。
14.如权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，所述Notch1突变增加Notch1 ICD的水平。
15.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1 ICD；和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
16.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌是否包含Notch1突变，和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
17.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌中的Notch1 ICD水平，和
(b)如果所述腺样囊性癌具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1 ICD，则选择所述受试者以用Notch1结合剂进行治疗。
18.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获取样品，
(b)确定所述样品中的Notch1 ICD水平，和
(c)如果所述样品具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1ICD，则选择该受试者以用Notch1结合剂进行治疗。
19.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，和
(b)如果所述腺样囊性癌具有Notch1突变，则选择所述受试者以用Notch1结合剂进行治疗。
20.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用Notch1结合剂进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获取样品，
(b)确定所述样品是否具有Notch1突变，和
(c)如果所述样品具有Notch1突变，则选择所述受试者以用Notch1结合剂进行治疗。
21.如权利要求17～20中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的Notch1结合剂。
22.如权利要求1～21中任一项所述的方法，其中，所述Notch1结合剂是特异性地结合人Notch1的抗体。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合人Notch1的细胞外结构域的非配体结合性近膜区。
25.如权利要求24所述的方法，其中，Notch1受体的非配体结合性近膜区包含SEQ IDNO:2。
26.如权利要求22～25中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ ID NO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
27.如权利要求22～25中任一项所述的方法，其中，所述抗体是重组抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。
28.如权利要求22～27中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:38具有至少90％序列同一性的轻链可变区。
29.如权利要求22～27中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:8的重链可变区和SEQ ID NO:14的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区；或
(c)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区。
30.如权利要求22～25中任一项所述的方法，其中，所述抗体与以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体包含相同的重链可变区和轻链可变区。
31.如权利要求28～30中任一项所述的方法，其中，所述抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。
32.如权利要求22～26中任一项所述的方法，其中，所述抗体是以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体。
33.如权利要求22～26中任一项所述的方法，其中，所述抗体是以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体的人源化版本。
34.如权利要求22～26中任一项所述的方法，其中，所述抗体是OMP-52M51-H4L3。
35.如权利要求1～34中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌是复发性的。
36.如权利要求1～34中任一项所述的方法，其中，所述腺样囊性癌已从原始部位转移。
37.如权利要求1～3或6～36中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有与预定水平或正常水平相比升高的水平的乳酸脱氢酶(LDH)。
38.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述腺样囊性癌具有与预定水平或正常水平相比升高的水平的LDH。
39.如权利要求1～38中任一项所述的方法，通过测量样品中的LDL水平来监视所述方法。
40.如权利要求1～3、6～16或21～39中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种额外的治疗剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述额外的治疗剂是化疗剂。
42.如权利要求40所述的方法，其中，所述额外的治疗剂是额外的治疗性抗体。
43.如权利要求1～3、6～16或21～42中任一项所述的方法，其中，所述受试者接受放射治疗。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述受试者在用Notch1结合剂进行治疗之前接受放射治疗。
45.如权利要求16、19或20～44中任一项所述的方法，其中，所述Notch1突变通过基于PCR的测定、微阵列分析或核酸测序来确定。
46.如权利要求15、17、18或21～44中任一项所述的方法，其中，所述Notch1ICD水平通过免疫组化测定来确定。
47.如权利要求18或20～34所述的方法，其中，所述样品是新鲜肿瘤样品、冷冻肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋的样品。
48.如权利要求1～3、6～16或21～44中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
49.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用特异性结合人Notch1的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌中的Notch1 ICD水平，
(b)如果所述腺样囊性癌具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1 ICD，则选择所述受试者以用所述抗体进行治疗，和
(c)向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体；
其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
50.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌是否具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1 ICD；和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；
其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
51.一种选择患有腺样囊性癌的受试者以用特异性结合人Notch1的抗体进行治疗的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，
(b)如果所述腺样囊性癌具有Notch1突变，则选择所述受试者以用所述抗体进行治疗；和
(c)向所述受试者施用治疗有效量的所述抗体；
其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
52.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：
(a)确定所述腺样囊性癌是否具有Notch1突变，和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；
其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3。
53.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；
其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3；并且
其中，所述受试者是基于具有与预定水平的Notch1 ICD相比增加或升高的水平的Notch1 ICD的腺样囊性癌而被选择的。
54.一种治疗受试者的腺样囊性癌的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的特异性结合人Notch1的抗体；
其中，所述抗体包含：包含RGYWIE(SEQ ID NO:15)的重链CDR1，包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO:16)的重链CDR2，和包含FDGNYGYYAMDY(SEQ ID NO:17)的重链CDR3；以及包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:18)的轻链CDR1，包含GTNNRAP(SEQ IDNO:19)的轻链CDR2，和包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO:20)的轻链CDR3；并且
其中，所述受试者是基于具有Notch1突变的腺样囊性癌而被选择的。
55.如权利要求49～52中任一项所述的方法，所述方法包括从所述受试者获取样品。
56.如权利要求55所述的方法，其中，所述样品是新鲜肿瘤样品、冷冻肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋的样品。
57.如权利要求49～56中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
58.如权利要求49、50、53或55～57中任一项所述的方法，其中，所述Notch1 ICD水平通过免疫组化(IHC)测定来确定。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述IHC测定包含抗体D3B8。
60.如权利要求51、52或54～57中任一项所述的方法，其中，所述Notch1突变通过基于PCR的测定、微阵列分析或核酸测序来确定。
61.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体是重组抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。
62.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26具有至少90％序列同一性的重链可变区；和/或
(b)与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:38具有至少90％序列同一性的轻链可变区。
63.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:8的重链可变区和SEQ ID NO:14的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:32的轻链可变区；或
(c)SEQ ID NO:26的重链可变区和SEQ ID NO:38的轻链可变区。
64.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体与以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体包含相同的重链可变区和轻链可变区。
65.如权利要求62～64中任一项所述的方法，其中，所述抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。
66.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体是以ATCC专利保藏号PTA-9549保藏的质粒所编码的抗体。
67.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体是以ATCC专利保藏号PTA-9405保藏的杂交瘤所产生的抗体的人源化版本。
68.如权利要求49～60中任一项所述的方法，其中，所述抗体是OMP-52M51。
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