CN103619881B - 新的egfr结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

描述了与表皮生长因子受体(EGFR)相互作用的抗原结合蛋白，例如抗体。还描述了通过施用药学有效量的针对EGFR的抗原结合蛋白来治疗癌症和其他疾病的方法。

Description

新的EGFR结合蛋白
本申请基于2011年4月7日提交的美国临时申请序号61/473,014并且要求其权益，美国临时申请序号61/473,014明确通过引用整体并入本文。
序列表的引用
本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表作为名称为A-1628-WO-PCT_SeqList.txt的文件提供，该文件创建于2012年4月6日，大小为14KB。电子形式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
发明背景
表皮生长因子受体(还称为“EGFR”、“ErbB受体”或“ErbB1受体”)是属于ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶。ErbB受体家族包括ErbB(还称为ErbB1或Her-1受体)、ErbB2(Her-2受体)、ErbB3(Her-3受体)和ErbB4(Her-4受体)以及该家族的其他成员。因此，术语“ErbB1”、“ErbB1受体”、“ErbB受体”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文可互换使用，并且指例如Carpenter等人Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中公开的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(例如，如Humphrey等人PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中的缺失突变体EGFR)。还会理解，如本文使用的，“EGFR”可以是天然序列EGFR或其氨基酸序列变体。
EGFR一般包含可结合ErbB配体(例如EGF、TGF-α等)的细胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守的细胞内酪氨酸激酶结构域；和具有可被磷酸化的几个酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。
EGFR及其配体表皮生长因子(“EGF”)已经牵涉入细胞增殖和许多类型的癌症(包括人类实体瘤)。参见例如Mendelsohn，Cancer Cell，7：359(1989)；Mendelsohn，CancerBiology1：339-344(1990)，Modjtahedi和Dean Int'l，J.Oncology4：277-296(1994)。这包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌和前列腺癌。Modjtahedi和Dean，Int'lJ.Oncology4：277-296(1994)。
许多抗EGFR抗体可商业途径获得，或者目前处于临床开发中。此类抗体包括但不限于(帕尼单抗)、(西妥昔单抗)；扎鲁木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗。
帕尼单抗(以商品名销售)是人类抗EGFR单克隆抗体，在美国、欧洲、日本和世界上的许多其他国家被批准用于转移性结肠直肠癌(mCRC)的某种治疗。帕尼单抗的核酸和氨基酸序列是已知的，并且可以特别参见美国专利号6,235,883和7,807,798(Jakobovits等人)。这些专利的内容通过引用整体并入本文。帕尼单抗的重链(γ)序列在本文以Seq Id No.1示出。帕尼单抗的轻链(κ)序列在本文以Seq Id No.2示出。如本文使用的，术语“AMG954”指(帕尼单抗)。
某些氨基酸残基的异构化是抗体中观察到的现象。例如，Wakankar等人发现两个重组单克隆抗体的轻链互补决定区(CDR)中的某些天冬氨酸残基(Asp)易受这种异构化。具体地，这些抗体中的天冬氨酸(Asp)异构化导致这些抗体的异天冬氨酸(IsoAsp)和环酰亚胺(Asu)变体的形成。参见Wakankar等人，Biochemistry,2007年2月13日；46(6)：1534-44(2007年1月)。发现这些变体的形成降低这些抗体的结合亲和力，从而降低其效价。同上。
已经针对(帕尼单抗)发现了某些氨基酸的异构化。该异构化似乎涉及效价的某些损失以及化学降解的可能性，并且因此是不希望的。因此，存在消除或减少该异构化的强烈愿望。
如将看到的，本文描述的突变体具有(i)保留的效价，或者(ii)提高的稳定性，或(iii)两者。
发明概述
目前，已经意想不到地发现，帕尼单抗中某些点突变可以减轻帕尼单抗中不希望的异构化和由此导致的降解。例如，帕尼单抗突变体具有从D92至N92变化的轻链氨基酸，并且D92至E92已经表明了相对于帕尼单抗保留的效价和/或提高的稳定性。
在37℃下、pH5.8和5.0下的加速稳定性研究已经显示，帕尼单抗的轻链(LC)CDR3天冬氨酸残基D92易于异构化，导致活性损失。为了评价是否可能通过修饰一级序列来消除该问题，制备了两种突变体，在每个突变体中具有单一点突变：轻链(LC)的CDR3中D92至N92(“N”突变体)；和D92至E92(“E”突变体)。两种突变体保留了通过基于细胞的效价测定测量的生物活性。此外，稳定性研究指示，D92至E92突变体在加速条件下比(帕尼单抗)显著更稳定，同时保持效价。D92至N92突变体类似地保留效价，即使没有观察到稳定性提高。
因此，本发明涉及抗原结合蛋白或其片段，例如Seq Id No.3、和/或Seq Id No.4、Seq Id No.5、和/或Seq Id.No.6中发现的那些。本发明的抗原结合蛋白可以是单克隆抗体或其片段，并且包括但不限于人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体及其片段。
在其他方面，本发明涉及包含跨Seq Id No.3的CDR1-3的区域的抗原结合蛋白。本发明还涉及包含跨Seq Id No.4的CDR1-3的区域的抗原结合蛋白。
本发明还涉及在位置92具有点突变的抗EGFR抗体，其中所述点突变是谷氨酸残基或天冬酰胺。
本发明还涉及用于提高EGFR抗体、例如帕尼单抗的稳定性的方法，包括将位置92的天冬氨酸残基改变为谷氨酸残基或天冬酰胺残基。
而且，本发明涉及本文描述的能够减少EGFR与EGF和/或TGF-α结合(或其他相互作用)的分离的抗原结合蛋白。本发明还涉及与本文描述的抗原结合蛋白竞争结合EGFR的分离的抗原结合蛋白。
本发明还涉及编码抗原结合蛋白或其部分的核酸分子，如Seq Id No.3、4、5或6任一个所示。核酸分子可以可操作连接至控制序列。在其他方面，本发明涉及包含这个/这些核酸分子的载体，并且还涉及包含这些载体的宿主细胞。
本发明还涉及制备本文描述的抗原结合蛋白的方法，包括从分泌所述抗原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
在其他方面，本发明还涉及包含本文描述的至少一种抗原结合蛋白(例如抗体)和药学可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明还涉及包含本文描述的一种或多种抗原结合蛋白的药物组合物，所述药物组合物还包含放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂或化疗剂。
在其他方面，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，包括给有相应需要的患者施用有效量的至少一种如本文描述的分离的抗原结合蛋白。本发明还涉及治疗或预防患者中与升高的EGF和EGFR水平的至少一种相关的病症的方法，包括给有相应需要的患者施用有效量的至少一种如本文描述的分离的抗原结合蛋白。本发明还涉及抑制患者中EGFR与EGF结合的方法，包括施用有效量的至少一种如本文描述的抗原结合蛋白。
在一些方面，本发明包括结合EGFR的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含以Seq Id No.3和/或Seq Id No.4所示的一个或多个轻链互补决定区(CDR)。
为了清楚，要理解，抗原结合蛋白中的CDR加下划线，并且以连续顺序示出，即CDR1、CDR2、CDR3。
在一些方面，本发明包括特异性结合被本文公开的抗原结合蛋白的任一个结合的表位的分离的抗原结合蛋白。
本发明的其他方面将被本领域技术人员理解，并且在本文描述。
附图简述
图1显示了如通过Lys-C肽图在pH5.8、37℃下检测6个月的(帕尼单抗)D92异构化。(帕尼单抗)在pH5.8的配制缓冲液中、37℃下孵育6个月。使用Lys-C肽图谱将样品与参考标准对比。通过修饰与原始肽Lys-L3(残基46-103)的比率来定量异构化水平。“A”代表杂交瘤衍生的分子，并且“B”显示了CHO衍生的分子。
图2显示了轻链(LC)D92、isoD92、E92和N92的结构模型。
图3显示了(帕尼单抗)突变体在pH5.0、50℃下4周的加速稳定性数据。野生型(D92)和两种突变体(E92，N92)在pH5.0、50℃下孵育4周。通过胰蛋白酶图谱对应激样品与未处理材料的对比显示，肽Trp-L5分布如下：野生型分子两个Trp-L5峰(D92和isoD92)，突变体N92三个Trp-L5峰(N92、D92和isoD92)，和突变体E92一个Trp-L5峰(E92)。该结果特别显示，突变体E92在这些加速应激条件下是稳定的。
图4显示在基于细胞的测定中(帕尼单抗)突变体的效价。
详述
本文公开了结合EGFR的抗原结合蛋白(例如抗体及其功能结合片段)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合EGFR并防止EGFR以各种方式发挥功能。在一些实施方案中，抗原结合蛋白阻断或减少EGFR与其他物质相互作用的能力。例如，在一些实施方案中，抗原结合蛋白以防止或减少EGFR结合EGF的可能性的方式结合EGFR。在其他实施方案中，抗原结合蛋白结合EGFR但是可能不阻断EGFR与EGF相互作用的能力。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是人类单克隆抗体。
针对EGFR的抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防各种癌症，包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌等。因此，如本文描述的，用于治疗癌症受试者的方法和组合物在本发明范围内。
为了方便，以下章节一般列出了本文使用的术语的各种含义。在该讨论之后，讨论了有关抗原结合蛋白的一般方面，随后是说明抗原结合蛋白的各种实施方案的性质以及如何采用它们的具体实例。
定义和实施方案
要理解，本文描述仅是示例性且说明性的，并且不限制要求保护的发明。在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用表示“和/或”。而且，术语“包括”以及其他形式，例如“包括”和“包括”的使用不是限制性的。而且，除非另外明确说明，否则诸如“元件”或“组分”的术语涵盖包括一个单位的元件和组分以及包括多于一个亚单位的元件和组分。而且，术语“部分”的使用可以包括部分或完整部分的部分。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制描述的主题。本申请引用的所有文件或文件部分包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，明确通过引用整体并入本文用于任何目的。如根据本公开使用的，除非另外说明，否则以下术语将被理解为具有以下含义：
术语“EGFR”指表皮生长因子受体、其片段以及相关多肽，其包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体(包括N末端蛋氨酸的添加)、融合多肽和种间同源物。在某些实施方案中，EGFR多肽包括末端残基，包括但不限于信号肽序列残基、靶向残基、氨基末端蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。对EGFR的提及包括人类EGFR的变体、同种型和物种同源物。在一个优选实施方案中，本发明抗体与EGFR-抗原的结合通过抑制或阻断一个或多个EGFR配体与EGFR的结合来抑制表达EGFR的细胞(例如肿瘤细胞)的生长。术语“EGFR配体”涵盖EGFR的所有(例如生理)配体，包括但不限于EGF、TGF-α、肝素结合EGF(HB-EGF)、双调蛋白(AR)、heregulin、β-细胞素和表皮调节素(EPI)。在另一个优选实施方案中，本发明抗体与EGFR-抗原的结合介导效应细胞吞噬和/或表达EGFR的细胞的杀伤。
成熟EGFR(SwissProt acc.#P00533)的细胞外部分由621个氨基酸和四个受体结构域组成：结构域I包括残基1-165、结构域II残基166-312、结构域III残基313-481和结构域IV482-621(Cochran等人(2004)J.Immunol.Methods，287，147-158)。结构域I和III已经表明促进配体的高亲和力结合位点的形成。结构域II和IV是半胱氨酸富集的层粘连蛋白样区域，其稳定蛋白折叠并含有可能的EGFR二聚化界面。
生物标志
已经发现KRAS基因中的某些突变预示对EGFR抑制剂、例如抗体的非响应性。参见例如Freeman等人的US2008/0293055，“KRAS mutations and Anti-EGFR AntibodyTherapy”，其内容通过引用整体并入本文。已经鉴定了许多这种KRAS突变，包括但不限于：G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13A、G13D和T20M。
Asghar等人，Clin.Colorectal Cancer.，Dec.，9(5)：274-81(2010)中描述了其他生物标志，包括NRAS、PTEN和PIP3。另一个潜在的生物标志，EGFR基因拷贝数，描述于US2007/0087394和US2009/0269344，其内容通过引用整体并入本文。
术语“突变体EGFR多核苷酸”、“突变体EGFR寡核苷酸”和“突变体EGFR核酸”可互换使用，并且指编码EGFR多肽的多核苷酸，所述EGFR多肽包括选自以下的至少一个EGFR突变：L688P、Q701H、K745N、C781R、氨基酸771和772之间的组氨酸插入、T790M、L828stop、Q849R、F910L和V948A。参见例如Freeman等人的US2007/0048754，其通过引用并入本文。
术语“突变体Pl3K多核苷酸”、“突变体Pl3K寡核苷酸”和“突变体Pl3K核酸”可互换使用，并且指编码Pl3K多肽的多核苷酸，所述Pl3K多肽包括选自E542K、E545A和H1047L的至少一个突变。
术语“突变体B-Raf多核苷酸”、“突变体B-Raf寡核苷酸”和“突变体B-Raf核酸”可互换使用，并且指编码具有至少一个B-Raf突变的B-Raf多肽的多核苷酸。这些突变描述于US2009/0075267，其内容通过引用整体并入本文。
如本文使用的，术语“癌症”指人类癌症和癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体瘤和淋巴癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、食道癌和肝癌、淋巴瘤(包括非霍奇金和霍奇金淋巴瘤)、白血病和多发性骨髓瘤。“泌尿生殖系统癌症”指尿路和生殖组织的人类癌症，尿道和生殖组织包括但不限于肾、膀胱、尿路、尿道、前列腺、阴茎、睾丸、外阴、阴道、宫颈和卵巢组织。
术语“过表达”、“过表达”或“过表达”可互换地指通常在癌症细胞中与正常细胞相比以可检测地更大水平转录或翻译的基因。因此，过表达指蛋白和RNA的过表达(归因于增加的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、改变的稳定性和改变的蛋白降解)以及归因于改变的蛋白运输模式(增加的核定位)的局部过表达和增强的功能活性，例如增加的物质的酶水解。过表达还可以是与正常细胞或对比细胞(例如，BPH细胞)相比多50%、60%、70%、80%、90%或更多。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤特异性标志”或“肿瘤标志”可互换地指与正常细胞相比在癌症细胞中优先表达并且用于药理剂对癌症细胞的优先靶向的分子(通常是蛋白、碳水化合物或脂质)。标志或抗原可以在细胞表面或细胞内表达。通常，癌症相关抗原是与正常细胞相比在癌症细胞中被表达或稳定化的具有最小降解的分子，例如与正常细胞相比2倍表达、3倍表达或更多。通常，癌症相关抗原是在癌症细胞中不适当合成的分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。而且，癌症相关抗原可以专门在癌症细胞中表达，并且不在正常细胞中合成或表达。示例的细胞表面肿瘤标志包括乳腺癌的蛋白c-erbB-2和人类表皮生长因子受体(EGFR)、前列腺癌的PSMA和许多癌症(包括乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌)中的碳水化合物粘蛋白。
“激动剂”指结合本发明多肽或多核苷酸(例如受体)、刺激、增加、激活、促进、增强活化、敏化或上调本发明多肽或多核苷酸的活性或表达的剂。
“拮抗剂”指抑制本发明多肽或多核苷酸表达或者结合、部分或完全阻断刺激、降低、预防、延迟活化、去活化、去敏化或下调本发明多肽或多核苷酸的活性的剂。
“小有机分子”指天然存在或合成的有机分子，其具有大于约50道尔顿和小于约2500道尔顿、优选小于约2000道尔顿、优选约100至约1000道尔顿、更优选约200至约500道尔顿的分子量。
细胞毒性剂包括“细胞周期特异性的”或“抗有丝分裂的”或“细胞骨架相互作用的”药物。这些术语可互换地指阻断有丝分裂细胞的任何药理剂。此类剂用于化疗。一般而言，细胞周期特异性药物结合细胞骨架蛋白微管蛋白，并阻断微管蛋白聚合成微管的能力，导致细胞在中期的分裂停止。示例的细胞周期特异性药物包括长春花生物碱、紫杉烷、秋水仙素和鬼臼毒素。示例的长春花生物碱包括长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。示例的紫杉烷包括紫杉醇和多烯紫杉醇。细胞骨架相互作用药物的另一实例包括2-甲氧基雌二醇。
“siRNA”或“RNAi”指形成双链RNA的核酸，所述双链RNA在siRNA与基因或靶基因在相同细胞中表达时具有减少或抑制基因或靶基因表达的能力。因此，“siRNA”或“RNAi”指通过互补链形成的双链RNA。杂交形成双链分子的siRNA的互补部分通常具有大部分或完全同一性。在一个实施方案中，siRNA指与靶基因具有大部分或完全同一性并且形成双链siRNA的核酸。通常，siRNA长度至少约15-50个核苷酸，例如，双链siRNA的每个互补序列长度是15-50个核苷酸，并且双链siRNA长度是约15-50个碱基对、优选约20-30个碱基核苷酸、优选长度约20-25或约24-29个核苷酸、例如长度是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
含有所需治疗基因编码和控制序列的适当载体的构建采用标准连接和限制技术，其是本领域公知的(参见Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(1982))。分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸被切割、修整并以所需形式重新连接。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则它的DNA与多肽的DNA可操作连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，它与编码序列可操作连接；或者如果核糖体结合位点被置于促进翻译，它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接”表示连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下是连续的且在阅读相(reading phase)中。然而，增强子不一定是连续的。通过在方便的限制位点连接而完成连接。如果这种位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或连接体根据常规实践来使用。
在两个或多个核酸或多肽序列上下文中，术语“同一的”或百分比“同一性”指相同或者具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当根据对比窗口或指定区域中最大对应来对比并比对时，在指定区域约60%同一性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性)的两个或多个序列或子序列，如使用具有下述缺省参数的BLAST或BLAST2.0序列比对算法或者通过人工比对以及目测检查测量的(参见例如，NCBI网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或类似网站)。这种序列则被称为“基本同一的”。该定义还指或者可应用于测试序列的称呼。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些。如本文描述的，优选的算法可解释缺口等。优选地，在长度约25个氨基酸或核苷酸的区域或者更优选在长度50-100个氨基酸或核苷酸的区域存在同一性。
为了序列对比，通常，一个序列用作参考序列，测试序列与之对比。当使用序列对比算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。优选地，可以使用缺省程序参数，或者可以指定可选参数。序列对比算法然后基于程序参数计算相对于参考序列的测试序列的百分比序列同一性。
“对比窗口”包括对连续位置数目的任何一个的区段的引用，所述连续位置数目选自由以下组成的组：20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中序列可以在两个序列最佳比对之后相同连续位置数目的参考序列对比。用于比对的序列的比对方法是本领域公知的。可以进行对比序列的最佳比对，例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性方法检索，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575ScienceDr.，Madison，Wis.)，或者通过人工比对和目测检查(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑.1995增刊))。
适合测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。使用具有本文描述的参数的BLAST和BLAST2.0来测定本发明核酸和蛋白的百分比序列同一性。进行BLAST分析的软件可通过National Center forBiotechnology Information(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值阈评分T。T被称为相邻字评分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始相邻字击中用作起始发现包含它们的更长HSP的查询的种子。沿着每个序列的两个方向延伸字击中，只要累计比对评分可以增加就一直持续。对于核苷酸序列而言，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。当以下情况时停止每个方向的字击中的延伸：累积比对评分从其最大达到值下降量X；累积评分达到零或以下，归因于一个或多个负评分残基比对的累积；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为缺省值：字长(W)11、预期(E)10、M=5、N=-4和双链对比。对于氨基酸序列，BLASTP使用以下作为缺省值：字长3和预期(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))算法(B)50、预期(E)10、M=5、N=-4和双链对比。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或者从任一类型核苷酸修饰而来。所述修饰包括碱基修饰、例如溴代尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰、例如2’,3’-二脱氧核糖，和核苷酸间连接修饰、例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺硫酸酯和氨基磷酸酯。
术语“寡核苷酸”表示包含200或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸长度是10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸长度是12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如用于构建突变体基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可以例如用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。
“分离的核酸分子”表示不与多核苷酸的全部或部分结合的基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其某种组合，其中发现分离的多核苷酸是天然的，或者与其天然不连接的多核苷酸连接。出于本公开的目的，应该理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不涵盖完整染色体。除了指定序列外，“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子可以包括达10或甚至达20个其他蛋白或其部分的编码序列，或者可以包括控制所述核酸序列的编码区表达的可操作连接调控序列，和/或可以包括载体序列。
除非另外指定，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。新生RNA转录物的5’至3’添加方向被称为转录方向；与处于RNA转录物的5’末端的5’的RNA转录物具有相同序列的DNA链上的序列区域被称为“上游序列”；与处于RNA转录物的3’末端的3’的RNA转录物具有相同序列的DNA链上的序列区域被称为“下游序列”。
术语“控制序列”指以影响与之连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可以取决于宿主生物体。在特定实施方案中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可以包括包含转录因子的一个或多个识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。
术语“载体”表示用于将蛋白编码信息转移入宿主细胞的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”指适合宿主细胞转化的载体，并且包含指导和/或控制(连同宿主细胞)与之可操作连接的一个或多个异源编码区表达的核酸序列。表达构建体可以包括但不限于影响或控制与之可操作连接的编码区的转录、翻译并且如果存在内含子则影响该编码区的RNA剪接的序列。用于本发明的表达载体包含与待表达的DNA序列或片段可操作连接的至少一个表达控制序列。所述控制序列被插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操作子和启动子区域、fd包衣蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子(例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子)、酵母酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、和从多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒衍生的启动子(例如早期和晚期启动子或SV40)和已知控制原核或真核细胞基因及其病毒或其组合表达的其他序列。
如本文使用的，“可操作连接”表示该术语应用的组分处于允许它们在适当条件下进行其固有功能的关系。例如，与蛋白编码序列“可操作连接”的载体的控制序列与之连接，使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白编码序列的表达。
术语“宿主细胞”表示已经被核酸序列转化或者能够被核酸序列转化并从而表达感兴趣的基因的细胞。该术语包括母细胞的后代，无论该后代在形态或基因构成上是否与原始母细胞相同，只要存在感兴趣的基因。
术语“转染”表示外来或外源DNA被细胞摄取，并且当外源DNA被引入细胞膜内时细胞被“转染”。许多转染技术是本领域公知的并且在本文公开。参见例如，Graham等人，1973，Virology52：456；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上；Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等人，1981，Gene13：197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入适当的宿主细胞。
术语“转化”指细胞遗传特性的改变，并且细胞在它被修饰为含有新DNA或RNA时被转化。例如，细胞在它从其天然状态通过经由转染、转导或其他技术而引入新的遗传物质而遗传修饰时被转化。转染或转导之后，转化DNA可以通过物理整合入细胞的染色体而与细胞DNA组合，或者可以作为游离元件短暂存在而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当转化DNA随着细胞分裂而被复制时，认为细胞已经被“稳定转化”。
术语“多肽”或“蛋白”表示具有天然蛋白的氨基酸序列的大分子，即，由天然存在且非重组细胞产生的蛋白；或者它可以由基因工程或重组细胞产生，并且包括具有天然蛋白的氨基酸序列的分子或者相对于天然序列具有一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括其中一个或多个氨基酸是相应的天然存在的氨基酸和聚合物的化学类似物的氨基酸聚合物。术语“多肽”和“蛋白”明确涵盖EGFR抗原结合蛋白、抗体或相对于抗原结合蛋白具有一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”指与全长天然蛋白相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。这种片段还可以包含与天然蛋白相比修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段是大约5至500个氨基酸长。例如，片段可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在EGFR结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的部分或者仅仅其包含两个CDR的可变区等。
提及的术语“分离的蛋白”表示主题蛋白(1)不含至少一些与其正常存在的其他蛋白，(2)基本不含来自相同来源、例如来自相同物种的其他蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)与至少约50%的多核苷酸、脂质、碳水化合物或者与其天然结合的其他物质相分离，(5)可操作结合(通过共价或非共价相互作用)与其天然不结合的多肽，或(6)不天然存在。通常，“分离的蛋白”构成给定样品的至少约5%、至少约10%、至少约25%或至少约50%。合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或者其任意组合可以编码这种分离的蛋白。优选地，分离的蛋白基本不含将干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的其天然环境中存在的蛋白或多肽或其他污染物。
术语“氨基酸”指天然和非天然存在的氨基酸，并且包括其在本领域的正常含义。
多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包括其中相对于另一多肽序列一个或多个氨基酸残基被插入、缺失和/或取代进入氨基酸序列的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
术语“同一性”指如通过比对和对比序列所确定的，两个或多个多肽分子或两个或多个核酸分子的序列之间的相关性。“百分比同一性”表示在对比分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且是基于被对比的分子中最小分子的尺寸计算的。对于这些计算，比对空位(如果有)优选通过特定的数学模型或计算程序(即，“算法”)来解决。可以用于计算比对核酸或多肽的同一性的方法包括Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，编辑)，1988，New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics andGenome Projects(Smith，D.W.，编辑)，1993，New York：Academic Press；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编辑)，1994，NewJersey：Humana Press；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in MolecularBiology，New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，1991，New York：M.Stockton Press；和Carillo等人，1988，SIAMJ.Applied Math.48：1073中描述的那些。
在计算百分比同一性时，被对比的序列通常以给出序列之间最大匹配的方式比对。可用于确定百分比同一性的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，WI)。计算机算法GAP用于比对将要确定其百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸。根据其各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(如通过算法确定的“匹配跨度”)来比对序列。空位开放罚分(其被计算为3x平均对角线，其中“平均对角线”是被使用的对比矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定对比矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数目)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10)以及对比矩阵例如PAM250或BLOSUM62与该算法结合使用。在某些实施方案中，标准对比矩阵(关于PAM250对比矩阵，参见Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure5：345-352；关于BLOSUM62对比矩阵，参见Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)也由该算法使用。
可用于使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的参数的实例如下：
·算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48：443-453
·对比矩阵：来自Henikoff等人，1992，同上的BLOSUM62
·空位罚分：12(但是末端空位无罚分)
·空位长度罚分：4
·相似性阈值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些算法方法可以得到两个序列的仅短区域的匹配，并且该小比对区域可以具有非常高的序列同一性，即使两个全长序列之间没有显著关联。因此，如果希望得到跨靶多肽的至少50个或其他数目的连续氨基酸的比对，则可以调整选择的比对方法(GAP程序)。
如本文使用的，二十个常规(例如，天然存在的)氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub&D.R.Gren，编辑，Sinauer Assoc.，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用并入本文用于任何目的。二十个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适合组成部分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。
相似地，除非另外指明，单链多核苷酸序列的左手末端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。初生RNA转录物的5’至3’添加的方向被称为转录方向；具有与RNA相同序列并且位于RNA转录物的5’端的5’的DNA链上的序列区域被称为“上游序列”；具有与RNA相同序列并且位于RNA转录物的3’端的3’的DNA链上的序列区域被称为“下游序列”
保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物系统合成来并入。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或反转形式。
天然存在的残基可以根据常见侧链性质来分类：
·疏水：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
·中性亲水：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
·酸性：Asp，Glu；
·碱性：His，Lys，Arg；
·影响链定向的残基：Gly，Pro；和
·芳香族：Trp，Tyr，Phe。
例如，非保守取代可以包括这些类别之一的成员交换另一类别的成员。这种取代的残基可以被引入例如与非人类抗体同源的人类抗体的区域，或者被引入该分子的非同源区域。
根据某些实施方案，在对抗原结合蛋白(例如抗体)进行改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。已经基于其疏水性和电荷特性分配每个氨基酸亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
亲水氨基酸指数在赋予蛋白交互式生物功能中的重要性是本领域已知的。Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸，并且还保持相似的生物活性。在基于亲水指数做出改变时，在某些实施方案中，包括其亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括在±1内的那些，并且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些。
本领域还理解，可以基于亲水性有效进行相似氨基酸的取代，特别是当由此产生的生物功能蛋白或肽预期用于免疫实施方案时，如本发明情况中。在某些实施方案中，如通过其相邻氨基酸的亲水性掌控的蛋白的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性，即与蛋白的生物性质相关。
已经给这些氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值做出改变时，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括在±1内的那些，并且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些。还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域还称为“表位核心区”。
示例性氨基酸取代示于表1。
表1
氨基酸取代
术语“衍生物”指包括不同于氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可以具有比非化学修饰的抗原结合蛋白更大的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可以具有针对期望细胞、组织和/或器官的提高的靶向能力。在一些实施方案中，衍生抗原结合蛋白被共价修饰为包括一个或多个水溶性聚合物连接，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如，美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337。在某些实施方案中，衍生抗原结合蛋白包括一个或多个聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或基于其他碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇以及此类聚合物的混合物。
在某些实施方案中，衍生物用聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰。在某些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物在衍生物的一个或多个特定位置、例如氨基末端键合。在某些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物与衍生物的一个或多个侧链随机连接。在某些实施方案中，PEG用于提高对抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG用于提高对人源化抗体的治疗能力。某些此类方法讨论于例如美国专利号6,133,426，其通过引用并入本文用于任何目的。
肽类似物常在制药工业中用作性质类似于模板肽的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“拟肽”。Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，15：29(1986)；Veber&Freidinger，TINS，p.392(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.，30：1229(1987)，其通过引用并入本文用于任何目的。这种化合物通常借助计算机分子建模来开发。结构上类似于治疗有用肽的肽模拟物可用于产生相似的治疗或预防效果。一般而言，肽模拟物结构上类似于范式多肽(即，具有生化性质或药理活性的多肽)，例如人类抗体，但是具有任选通过本领域公知的方法被选自以下的至少一个连接替代的一个或多个肽连接：--CH2NH--，--CH2S--，--CH2-CH2--，--CH=CH-(顺式&反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--，和--CH2SO--。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸的系统取代(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于某些实施方案以产生更稳定的肽。此外，可以通过本领域已知的方法产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变化的约束肽(Rizo&Gierasch，Ann.Rev.Biochem.，61：387(1992)，通过引用并入本文用于任何目的)；例如，通过添加能够形成环化肽的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。
在说明书通篇结合生物材料例如多肽、核酸、宿主细胞等使用的术语“天然存在的”指天然存在的材料或天然存在的材料形式。
如本文使用的，“抗原结合蛋白”(“ABP”)表示结合特定靶抗原的任何蛋白。在本申请中，指定靶抗原是EGFR蛋白或其片段或区域。“抗原结合蛋白”包括但不限于抗体及其结合部分，例如免疫功能性片段。肽体是抗原结合蛋白的另一实例。如本文使用的，术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能片段”(或简单说“片段”)是抗原结合蛋白的类别，包括缺少全长链中存在的氨基酸的至少一些、但依然能够特异性结合抗原的抗体的部分(不论该部分是获得还是合成的)。此类部分是生物活性的，因为它们结合靶抗原，并且能够与其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定表位。在一些实施方案中，片段是中和片段。在一些实施方案中，片段可以阻断或减少EGF和EGFR之间相互作用的可能性。一方面，这种片段将保持全长轻链或重链中存在的至少一个CDR，并且在一些实施方案中将包括单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学裂解来产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、双抗体(通过短肽连接体连接的与轻链可变结构域相同的多肽上的重链可变结构域，所述短肽连接体太短以至于不允许相同链上的两个结构域之间的配对)、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以源自任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。还考虑，本文公开的抗原结合蛋白的功能性部分，例如一个或多个CDR，可以与第二蛋白或小分子共价结合以产生针对机体中特定靶的治疗剂，所述治疗剂具有双功能治疗性质或者具有延长的血清半衰期。如本领域技术人员理解的，抗原结合蛋白可以包括非蛋白组分。
本文公开的某些抗原结合蛋白是抗体或者来源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合体(在本文有时称为“抗体轭合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括avimer(紧密结合肽)或者由avimer(紧密结合肽)组成。这些各种抗原结合蛋白在本文进一步描述。
“Fc”区包括两个重链片段，包含抗体的CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个或多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用结合在一起。
“Fab片段”包括一个轻链和一个重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab’片段”包括一个轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一个重链的部分，使得可以在两个Fab’片段的两个重链之间形成链内二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含两个轻链和含有CH1和CH2结构域之间恒定区的部分的两个重链，使得在两个重链之间形成链内二硫键。因此，F(ab’)2片段包括通过两个重链之间的二硫键结合在一起的两个Fab’片段。
“Fv区”包括来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。
“单链抗体”是其中重链和轻链可变区已经被柔性连接体连接以形成单个多肽链的Fv分子，其形成抗原结合区。单链抗体详细讨论于国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203，其公开内容通过引用并入。
“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或多个VH区与肽连接体共价结合以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包括两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是如本文定义的双特异性的。在某些实施方案中，不同于“多特异性”或“多功能性”抗体的二价抗体通常被理解为具有其相同结合位点的每一个。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向多于一个抗原或表位的抗体。
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体分别是杂合抗原结合蛋白或抗体，具有两个不同的抗原结合位点。双特异性抗原结合蛋白和抗体是多特异性抗原结合蛋白抗体的物类，并且可以通过多种方法产生，所述方法包括但不限于杂交瘤的融合或者Fab’片段的连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，其可以位于相同或不同蛋白靶上。
每个个体免疫球蛋白链通常包括几个“免疫球蛋白结构域”，每个由大约90至110个氨基酸组成并且具有特征折叠模式。这些结构域是构成抗体多肽的基本单元。在人类中，IgA和IgD同种型包含四个重链和四个轻链；IgG和IgE同种型包含两个重链和两个轻链；并且IgM同种型包含五个重链和五个轻链。重链C区通常包含可以负责效应子功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。例如，IgG重链包含称为CH1、CH2和CH3的三个C区结构域。提供的抗体可以具有这些同种型和亚型的任何一个。在本发明的某些实施方案中，抗EGFR抗体属于IgG2或IgG4亚型。
据称，当解离常数(Kd)是≤10-7M时，抗原结合蛋白“特异性结合”其靶抗原。当Kd是≤5x10-9M时，抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合抗原，并且当Kd是≤5x10-10M时以“极高亲和力”特异性结合抗原。在一个实施方案中，抗原结合蛋白具有≤10-9M的Kd。在一个实施方案中，解离速率是<1x10-5。在其他实施方案中，抗原结合蛋白将以约10-9M至10-13M的Kd结合人类EGFR，并且在另一实施方案中，抗原结合蛋白以Kd≤5x10-10结合。如本领域技术人员理解的，在一些实施方案中，抗原结合片段的任何一个或所有可以特异性结合EGFR。
当它结合一个靶比它结合第二靶更紧密时，抗原结合蛋白是“选择性的”。
“抗原结合区”表示特异性结合指定抗原(例如，互补位)的蛋白或蛋白部分。例如，含有与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白对该抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗原结合蛋白的部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个互补结合区(CDR)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区。“CDR”是促进抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区可以帮助维持CDR促进抗原结合区与抗原之间结合的适当构象。结构上，框架区可以位于CDR之间的抗体中。
在某些方面，提供了结合EGFR、例如人类EGFR的重组抗原结合蛋白。在该上下文中，“重组抗原结合蛋白”是使用重组技术，即，通过如本文描述的重组核酸的表达制成的蛋白。用于产生重组蛋白的方法和技术是本领域公知的。
术语“抗体”指可以与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的任何同种型的完整免疫球蛋白或其片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完整人类抗体和双特异性抗体。“抗体”是抗原结合蛋白的物类。完整抗体一般包括至少两个全长重链和两个全长轻链，但是在一些情况下可以包括较少链，例如骆驼中天然存在的可以仅包括重链的抗体。抗体可以仅仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可以源自如下文进一步描述的两种不同抗体。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可以在杂交瘤中、通过重组DNA技术、或者通过完整抗体的酶促或化学裂解而产生。除非另外说明，否则除了包括两个全长重链和两个全长轻链的抗体以外，术语“抗体”还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白(mutein)，其实例在下文描述。而且，除非明确排除，否则抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合体(在本文有时称为“抗体轭合物”)及其各自的片段。在一些实施方案中，该术语还涵盖肽体。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这种四聚体通常包括两个相同的多肽链对，每对具有一个全长“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)和一个全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分通常包括约100至110或更多氨基酸的可变区，其通常负责抗原识别。每个链的羧基末端部分通常定义了可以负责效应子功能的恒定区。人类轻链通常被分类为κ和λ轻链。重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA相似地被细分成亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。通常，在全长轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多氨基酸的“J”结合，重链还包括约10个更多氨基酸的“D”区。参见例如，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，编辑，第2版Raven Press，N.Y.(1989))(通过引用整体并入用于任何目的)。每个轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常表现出由三个超变区结合的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构，还称为互补决定区或CDR。来自每对的两个链的CDR通常通过框架区比对，其能够实现与特异性表位的结合。从N端到C端，两个轻链和重链可变区通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸的分配通常根据Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature，342：878-883(1989)的定义。
要理解，本文使用的“92”编号指氨基酸编号92。要理解，这种情况下的氨基酸编号92是相同的位置，无论使用Kabat编号还是简单地根据帕尼单抗抗体突变体的信号肽序列直接计数。
在某些实施方案中，在抗体轻链不存在下，抗体重链结合抗原。在某些实施方案中，在抗体重链不存在下，抗体轻链结合抗原。在某些实施方案中，在抗体轻链不存在下，抗体结合区结合抗原。在某些实施方案中，在抗体重链不存在下，抗体结合区结合抗原。在某些实施方案中，在其他可变区不存在下，个体可变区特异性结合抗原。
在某些实施方案中，通过解析抗体结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成CDR的明确划分和构成抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的许多技术的任何一种、例如X射线结晶学来完成。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或估计CDR区。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、“AbM”定义和接触定义(contact definition)。
Kabat定义是编号抗体残基的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见例如，Johnson&Wu，Nucleic Acids Res.，28：214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但是Chothia定义考虑某些结构环区的位置。参见例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901-17(1986)；Chothia等人，Nature，342：877-83(1989)。“AbM”定义使用Oxford Molecular Group制作的模拟抗体结构的计算机程序的集成套件。参见例如，Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：9268-9272(1989)；“AbMTM，A Computer Program for Modeling VariableRegions of Antibodies”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd。AbM定义使用知识数据库和从头开始的方法(ab initio methods)、例如Samudrala等人，“AbInitio ProteinStructure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach”PROTEINS，Structure，Function and Genetics增刊，3：194-198(1999)描述的那些的组合从一级序列模拟抗体的三级结构。接触定义基于可获得的复合物结晶结构的分析。参见例如，MacCallum等人，J.Mol.Biol.，5：732-45(1996)。
根据惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且以从氨基末端到羧基末端的方向顺序编号。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且以从氨基末端到羧基末端的方向顺序编号。
术语“轻链”包括全长轻链及具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
本发明抗体或其片段对EGFR的特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。由抗原与抗体的解离平衡常数(Kd)代表的亲和力度量抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合强度的量度。亲合力与表位与其抗体上抗原结合位点之间的亲和力以及抗体的价有关，抗体的价指特异性针对特定表位的抗原结合位点的数目。抗体通常以10-5至10-11升/mol的解离常数(Kd)结合。任何大于10-4升/mol的Kd一般被认为指示非特异性结合。Kd值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。
术语“重链”包括全长重链及具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2、和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，并且CH结构域位于羧基末端，CH3最接近多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
双特异性或双功能抗体通常是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过许多方法产生，包括但不限于杂交瘤融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.，79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)。
一些哺乳动物物种还产生仅具有单个重链的抗体。
每个个体免疫球蛋白链通常包括几个“免疫球蛋白结构域”，每个由大约90至110个氨基酸组成并且具有特征折叠模式。这些结构域是构成抗体多肽的基本单元。在人类中，IgA和IgD同种型包含四个重链和四个轻链；IgG和IgE同种型包含两个重链和两个轻链；并且IgM同种型包含五个重链和五个轻链。重链C区通常包含可以负责效应子功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。例如，IgG重链包含称为CH1、CH2和CH3的三个C区结构域。提供的抗体可以具有这些同种型和亚型的任何一个。在本发明的某些实施方案中，抗EGFR抗体属于IgG2或IgG4亚型。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体轻链和/或重链的部分，通常包括重链中大约氨基末端120至130个氨基酸和轻链中约100至110个氨基末端氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区即使在相同物种的抗体中的氨基酸序列有很大不同。抗体的可变区通常决定特定抗体对其抗原的特异性。
术语“中和抗原结合蛋白”或“中和抗体”分别指结合配体并预防或减少配体与结合配偶体结合的抗原结合蛋白或抗体。这可以例如通过直接阻断配体上的结合位点或者通过结合配体并改变配体通过间接方式结合的能力(例如配体中的结构或能量改变)来进行。在一些实施方案中，该术语还可以指示防止与之结合的蛋白发挥生物功能的抗原结合蛋白。在评估抗原结合蛋白、例如抗体或其免疫功能性片段的结合和/或特异性中，当过量抗体使与配体结合的结合配偶体的量减少至少约1-20、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或更多(如在体外竞争性结合测定中测量的)时，抗体或片段可以基本抑制配体与其结合配偶体的结合。在一些实施方案中，在EGFR抗原结合蛋白的情况下，这种中和分子可以减少EGFR结合EGF的能力。在一些实施方案中，中和能力通过竞争测定来表征和/或描述。在一些实施方案中，中和能力以IC50或EC50值的方式来描述。在一些实施方案中，抗原结合蛋白可以是非中和抗原结合蛋白。
术语“靶”指能够被抗原结合蛋白结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，靶可以具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶是抗原。在短语“抗原结合蛋白”中“抗原”的使用简单地指示包含可以被抗体结合的抗原的蛋白序列。在该上下文中，它不需要蛋白是外来的，或者它能够诱导免疫应答。
当在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，中和抗原结合蛋白或中和抗体)上下文中使用的术语“竞争”表示抗原结合蛋白之间的竞争，如通过其中被测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能片段)预防或抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，EGFR或其片段)特异性结合的测定所确定的。许多类型的竞争性结合测定可用于确定一个抗原结合蛋白是否与另一个竞争，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人，1983，Methods in Enzymology9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland等人，1986，J.Immunol.137：3614-3619)固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Cheung等人，1990，Virology176：546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，这种测定涉及与固体表面结合的纯化抗原或者携带这些任何一个的单元、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白的使用。竞争性抑制通过测定在测试抗原结合蛋白存在下于固体表面或单元结合的标记的量来测量。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白和与参考抗原结合蛋白结合的表位足够靠近而发生空间位阻的相邻表位结合的抗原结合蛋白。有关测定竞争性结合的方法的其他细节提供于本文实施例中。通常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，它使参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制(例如，减少)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多。在一些情况下，结合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。
术语“抗原”指能够被选择性结合剂、例如抗原结合蛋白(包括例如抗体或其免疫功能片段)结合的分子或分子部分。在一些实施方案中，抗原能够在动物中用于产生能够结合该抗原的抗体。抗原可以具有能够与不同抗原结合蛋白、例如抗体相互作用的一个或多个表位。
术语“表位”包括能够被抗原结合蛋白、例如抗体结合或者结合至T细胞受体的任何决定簇。表位是被靶向该抗原的抗原结合蛋白结合的抗原区域，并且当抗原是蛋白时，包括直接接触抗原结合蛋白的特定氨基酸。大多数情况下，表位位于蛋白上，但是在一些情况下可以位于其他种类的分子、例如核酸上。表位决定簇可以包括化学活性表面分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的群集，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。一般而言，针对特定靶抗原的抗体将在蛋白和/或大分子复杂混合物中优先识别靶抗原上的表位。
如本文使用的，“基本上纯的”表示所描述的分子物类是存在的优势物类，即，以摩尔计，它比相同混合物中任何其他个体物类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子是其中目标物类占存在的所有大分子物类的至少50%(以摩尔计)的组合物。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物类的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他实施方案中，目标物类被纯化至必要的同质性，其中污染物类不能通过常规检测方法在组合物中被检测到，并且因此组合物由单一可检测的大分子物类组成。
术语“剂”在本文用于指示化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制成的提取物。
如本文使用的，术语“标记”或“标记的”指可检测标志的加入，例如通过将放射性标记的氨基酸加入或连接至可以通过标志亲和素(例如，含有可以通过光学或比色方法检测的荧光标志或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素部分的多肽。在某些实施方案中，标记或标志还可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的，并且可以使用。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、若丹明、镧系磷)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光剂、生物素基团、由第二报告分子(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定多肽表位。在某些实施方案中，标记由各种长度的空间臂连接以减少潜在空间位阻。
如本文使用的，术语“生物样品”包括但不限于来自活物或原来活物的任何量的物质。这种活物包括但不限于人类、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。这种物种包括但不限于血液、血清、尿、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴结和皮肤。
如本文使用的术语“药剂组合物”(或剂或药物)指化合物、组合物、当适当施用给患者时能够产生预期治疗效果的剂或药物。它不一定需要多于一种类型的成分。
术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指经测定在哺乳动物中产生治疗响应的EGFR抗原结合蛋白的量。这种治疗有效量容易被本领域普通技术人员确定。确切的剂量和制剂将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，Gennaro，Editor(2003)，和Pickar，Dosage Calculations(1999))。
术语“药学可接受的盐”或“药学可接受的载体”表示包括活性化合物的盐，其用相对无毒性的酸或碱制备，根据本文描述的化合物上存在的特定取代基。
如本文使用的，术语“调节剂”是变化或改变分子活性或功能的化合物。例如，调节剂可以引起分子的某些活性或功能的强度与不存在调节剂时观察到的活性或功能的强度相比的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是抑制剂，其减少分子的至少一种活性或功能的强度。分子的某些示例性活性和功能包括但不限于结合亲和力、酶活性和信号转导。某些示例性抑制剂包括但不限于蛋白、肽、抗体、肽体、糖类或小有机分子。肽体描述于例如美国专利号6,660,843(对应于PCT申请号WO01/83525)。
术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用并且包括人类和非人类动物受试者以及之前被诊断患有疾患的那些、之前没有发现患有疾患的那些、接受医疗关注的那些、处于发展疾患风险的那些、等。
术语“治疗”和“治疗”包括治疗性治疗、预防性治疗和其中减少受试者发展疾患的风险或其他风险因素的应用。治疗不需要疾患的完全治愈，并且涵盖其中减少症状或潜在风险因素的实施方案。
术语“预防”不需要事件可能性的100%消除。而是，它指示事件发生的可能性在化合物或方法存在下已经被减少。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶反应和纯化技术可以根据生产商说明书或者如本领域普遍实现的或者如本文描述的进行。之前技术和程序一般可以根据本领域公知以及在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法来进行。参见例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989))，其通过引用并入本文用于任何目的。除非提供具体定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学和医疗和药物化学相关使用的命名以及本文描述的分析化学、合成有机化学和医疗和药物化学的实验程序和技术是本领域公知且普遍使用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
本文提供了结合EGFR(包括人类EGFR)的抗原结合蛋白(ABP)。在一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白是包含如本文描述的一个或多个互补决定区(CDR)的多肽。在一些抗原结合蛋白中，CDR被嵌入“框架”区，其定向CDR，使得实现CDR的适当抗原结合性质。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白可以干扰、阻断、减少或调解EGFR和EGF之间的相互作用。这种抗原结合蛋白被指示为“中和”。在一些实施方案中，中和抗原结合蛋白以防止EGFR结合EGF的位置和/或方式结合EGFR。
在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白能够抑制EGFR介导的活性(包括结合)。在一些实施方案中，结合这些表位的抗原结合蛋白尤其抑制EGFR和EGF之间的相互作用以及由EGFR介导的其他生理效应。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是针对EGFR的人类抗体、例如完全人类抗体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合EGFR的催化结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合EGFR的成熟形式。在一些实施方案中，抗原结合蛋白在EGFR的前结构域中结合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白选择性结合EGFR的成熟形式。在一些实施方案中，抗原结合蛋白以使得EGFR不能结合或者有效结合EGF的方式结合催化结构域。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化结构域的c端。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化结构域的n端。在一些实施方案中，抗原结合蛋白不结合EGFR蛋白的N端或C端。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合被本文讨论的抗体结合的表位的任何一个。在一些实施方案中，这可以通过本文公开的抗体和其他抗体之间的竞争测定来测定。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合由本文描述的抗体之一结合的表位。在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合EGFR的特定构象状态以防止EGFR与EGF相互作用。
本文公开的抗原结合蛋白具有许多效用。例如，一些抗原结合蛋白用于特异性结合测定、EGFR(特别是人类EGFR或其配体)的亲和纯化以及用于鉴定EGFR活性的其他拮抗剂的筛选测定。一些抗原结合蛋白用于抑制EGFR与EGF的结合，或者抑制EGFR介导的活性。
如本文解释的，抗原结合蛋白可用于许多治疗应用。例如，在一些实施方案中，EGFR抗原结合蛋白用于治疗与EGF和/或EGFR相关的疾病和病症，例如癌症，如本文进一步描述的。
在一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白包括一个或多个CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括(a)多肽结构和(b)被插入和/或结合至多肽结构的一个或多个CDR。多肽结构可以采取许多不同形式。例如，它可以是或者包括天然存在的抗体的框架或其片段或变体，或者可以是性质上完全合成的。各种多肽结构的实例在下文进一步描述。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是抗体或者源自抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(在本文有时称为“抗体轭合物”)及其各自的部分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体的免疫片段(例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子，例如scFv)。
在抗原结合蛋白用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白可以抑制、干扰或调解EGFR的一种或多种生物活性。在一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合人类EGFR和/或基本上抑制人类EGFR与EGF结合的至少约20%-40%、40-60%、60-80%、80-85%或更多(例如，通过在体外竞争性结合测定中测量结合)。本文提供的抗原结合蛋白的一些是抗体。在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有小于(更紧密结合)10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13M的Kd。在一些实施方案中，抗原结合蛋白具有小于1μM、1000nM至100nM、100nM至10nM、10nM至1nM、1000pM至500pM、500pM至200pM、小于200pM、200pM至150pM、200pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM的阻断EGF与EGFR结合的IC50。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白结合EGFR的特定构象状态以防止EGFR与EGF相互作用。
人源化抗原结合蛋白(例如，抗体)
如本文描述的，针对EGFR的抗原结合蛋白可以包括人源化抗体和/或其部分。这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。
在某些实施方案中，人源化抗体在人类中是基本上非免疫原性的。在某些实施方案中，人源化抗体具有与人源化抗体来源的另一物种的抗体相同的对靶的亲和力。参见例如，美国专利号5,530,101，美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；和美国专利号5,585,089。
在某些实施方案中，可以被修饰而不减少抗原结合结构域的天然亲和力、同时减少其免疫原性的抗体可变结构域的氨基酸被鉴定。参见例如，美国专利号5,766,886和5,869,619。
在某些实施方案中，通过本领域已知的方法对抗体的修饰通常被设计为实现对靶增加的结合亲和力和/或减少抗体在受体中的免疫原性。在某些实施方案中，人源化抗体被修饰以消除糖基化位点，以增加抗体对其同源抗原的亲和力。参见例如，Co等人，Mol.Immunol.，30：1361-1367(1993)。在某些实施方案中，使用诸如“重构”、“超嵌合”或“饰面/表面重建”等技术产生人源化抗体。参见例如，Vaswami等人，Annals of Allergy，Asthma，&Immunol.81：105(1998)；Roguska等人，Prot.Engin.，9：895-904(1996)；和美国专利号6,072,035。在某些此类实施方案中，这类技术通常通过降低外源残基的数目减少抗体免疫原性，但是没有阻止重复施用抗体之后产生的抗独特型反应和抗异型反应。用于减少免疫原性的某些其他方法描述在Gilliland等人，J.Immunol.，62(6)：3663-71(1999)中。
在某些情况下，人源化抗体导致抗原结合能力的损失。在某些实施方案中，人源化抗体被“回复突变”。在某些此类实施方案中，人源化抗体被突变成包括在供体抗体中发现的氨基酸残基的一个或多个。参见例如，Saldanha等人，Mol.Immunol.36：709-19(1999)。
在某些实施方案中，针对EGFR的抗体的轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)可以被移植至相同或另一物种的框架区(FR)。在某些实施方案中，针对EGFR的抗体的轻链和重链可变区的CDR可以被移植至共有的人类FR。为了产生共有的人类FR，在某些实施方案中，来自几个人类重链或轻链氨基酸序列的FR被比对以鉴定共有的氨基酸序列。在某些实施方案中，针对EGFR的抗体重链或轻链的FR被不同重链或轻链的FR替代。在某些实施方案中，针对EGFR的抗体重链和轻链的FR中的稀少氨基酸没有被替代，而其他FR氨基酸被替代。稀少氨基酸是位于它们通常不存在于FR的位置的特定氨基酸。在某些实施方案中，来自针对EGFR的抗体的移植的可变区可以与不同于针对EGFR的抗体的恒定区的恒定区一起使用。在某些实施方案中，移植的可变区是单链Fv抗体的部分。CDR移植描述于例如美国专利号6,180,370、6,054,297、5,693,762、5,859,205、5,693,761、5,565,332、5,585,089和5,530,101，以及Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)，Winter，FEBSLetts.，430：92-94(1998)，其通过引用并入本文用于任何目的。
人类抗原结合蛋白(例如，抗体)
如本文描述的，结合EGFR的抗原结合蛋白可以包括人类(即，全长人类)抗体和/或其部分。在某些实施方案中，提供了编码重链和轻链免疫球蛋白分子、特别是对应于可变区的序列的核苷酸序列和包含重链和轻链免疫球蛋白分子、特别是对应于可变区的序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供了对应于具体来自CDR1至CDR3的互补决定区(CDR)的序列。根据某些实施方案，提供了表达这种免疫球蛋白分子的杂交瘤细胞。根据某些实施方案，提供了表达这种单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，提供了针对人类EGFR的纯化的人类单克隆抗体。
可以使用人类Ig基因座的大片段工程化小鼠抗体生成缺陷的小鼠品系，预期这样的小鼠在缺乏小鼠抗体时会产生人类抗体。大的人类Ig片段可以保留大的可变基因多样性以及抗体生成和表达的适当调控。通过探索抗体多样化和选择以及对人类蛋白免疫耐受性的缺乏的小鼠机制，在这些小鼠品系中再生产人类抗体产品可以产生针对包括人类抗原在内的任何感兴趣抗原的高亲和力完全人类抗体。使用杂交瘤技术，可以产生并选择具有期望特异性的抗原特异性人类MAb。某些示例性方法描述于WO98/24893、美国专利号5,545,807、EP546073和EP546073。
在某些实施方案中，可以使用来自不同于人类的物种的恒定区以及人类可变区。
在酵母人工染色体(YAC)中克隆并重建兆碱基大小的人类基因座并且将它们引入小鼠种系的能力提供了阐释极大或粗制谱图基因座的功能组分以及产生有用的人类疾病模型的方法。而且，用其人类等同物替代小鼠基因座的这种技术的利用可以提供对以下方面的理解：人类基因产品在发育中的表达和调控、其与其他系统的交流以及其在疾病诱导和进展中的参与。
人类抗体避免了一些与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的问题。这种鼠或大鼠来源的蛋白的存在可以导致抗体的快速清除，或者可以导致患者针对该抗体产生免疫应答。为了避免鼠或大鼠来源的抗体的使用，可以通过将功能性人类抗体基因座引入啮齿类动物、其他哺乳动物或动物，使得啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生全长人类抗体，来产生全长人类抗体。
人源化抗体是虽然开始含有非人类的抗体氨基酸序列，但这些非人类抗体氨基酸序列的至少一些被人类抗体序列替换的那些抗体。这与人类抗体相反，其中人类抗体由人类具有的基因编码(或者能够被人类具有的基因编码)。
抗原结合蛋白变体
提供的其他抗体是通过本文描述的可变重链和可变轻链的组合或子部分形成的上列抗原结合蛋白的变体，并且包括各自具有与这些序列(完整序列或者该序列的子部分，例如，一个或多个CDR)的氨基酸序列至少50%、50-60、60-70、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-99%或更高99%同一性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，这种抗体包括至少一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括与Seq Id No：3、Seq Id No.4、Seq IdNo.5或Seq Id No.6所示氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括与Seq Id No：3、Seq Id No.4、Seq Id No.5或Seq Id No.6所示氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括与Seq Id No：3、Seq IdNo.4、Seq Id No.5或Seq Id No.6所示氨基酸序列至少99%相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包括与Seq Id No：3、Seq Id No.4、Seq IdNo.5或Seq Id No.6中所示的一个或多个CDR至少90%、90-95%和/或95-99%相同的氨基酸序列。
根据本公开，本领域技术人员能够使用公知技术确定本文提出的抗原结合蛋白的适当变体。在某些实施方案中，本领域技术人员能够鉴定可以通过靶向不被认为对活性重要的区域而被改变但不破坏活性的分子的适当区域。在某些实施方案中，可以鉴定在相似多肽中保守的分子的残基和部分。在某些实施方案中，甚至可能对生物活性或者对结构重要的区域可以经受保守的氨基酸取代，而不破坏生物活性或无不利地影响多肽结构。
此外，本领域技术人员可以回顾鉴定相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这种对比，可以预测对应于在相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基的蛋白中的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择对这种预测的重要氨基酸残基进行化学上相似的氨基酸取代。
本领域技术人员还可以分析与类似于抗原结合蛋白的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于此类信息，本领域技术人员可以预测抗体的氨基酸残基相对于其三维结构的比对。在某些实施方案中，本领域技术人员可以选择不对被预测在蛋白表面上的氨基酸残基做出根本改变，因为此类残基可能参与重要的与其他分子的相互作用。而且，本领域技术人员可以产生在每个期望的氨基酸残基包含单个氨基酸取代的测试变体。然后可以使用本领域技术人员已知的活性测定来筛选变体。此类变体可用于收集有关适当变体的信息。例如，如果发现对特定氨基酸残基的变化导致破坏的、不希望减少的或不适当的活性，可以避免具有这种变化的变体。换言之，基于从此类常规实验收集的信息，本领域技术人员容易确定其中应该单独或与其他突变组合避免进一步取代的氨基酸。
许多科学出版物已经致力于预测二级结构。参见MoultJ.，Curr.Op.inBiotech.，7(4)：422-427(1996)，Chou等人，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等人，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou等人，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou等人，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276和Chou等人，Biophys.J.，26：367-384(1979)。而且，计算机程序目前可用于辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性模拟。例如，具有大于30%序列同一性或大于40%相似性的两个多肽或蛋白经常具有相似的结构拓扑学。蛋白结构数据库(PDB)的最近增长已经提供了增强的二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白的结构内潜在的折叠数目。参见Holm等人，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)。Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997)中已经表明，给定多肽或蛋白中存在有限数目的折叠，并且一旦解析了关键数目的结构，结构预测将变得显著更准确。
预测二级结构的其他方法包括“穿引法(threading)”(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等人，Structure，4(1)：15-19(1996))、“概形分析(profile analysis)”(Bowie等人，Science，253：164-170(1991)；Gribskov等人，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，84(13)：4355-4358(1987))和“进化连锁(evolutionarylinkage)”(参见Holm，同上(1999)，和Brenner，同上(1997))。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数目和/或类型与亲代多肽的氨基酸序列相比已经被改变。在某些实施方案中，蛋白变体包括比天然蛋白更大或更小数目的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征为以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。产生这种序列的氨基酸残基的取代提供了用于添加N-连接的糖链的可能的新位点。可选择地，消除这种序列的取代将移除现有的N连接的糖链。还提供了N-连接的糖链的重排，其中一个或多个N-连接的糖基化位点(通常是天然存在的那些糖基化位点)被消除并且一个或多个新的N-连接的位点被产生。另外的优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中相比于亲代氨基酸序列，一个或多个半胱氨酸残基从中被缺失或者取代了另一个氨基酸(例如丝氨酸)。半胱氨酸变体在例如在分离不溶性包涵体之后、抗体必须被重折叠成生物活性构象时可能是有用的。半胱氨酸变体一般具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数以最大限度减小由未配对半胱氨酸产生的相互作用。
根据某些实施方案，氨基酸取代是如下的氨基酸取代：(1)减少对蛋白水解作用的易感性，(2)减少对氧化的易感性，(3)改变对形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和/或(4)赋予或改变这类多肽其他生化或功能性质。根据某些实施方案，可以在天然存在的序列中(在某些实施方案中，在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)作出单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守性氨基酸取代)。在某些实施方案中，保守性氨基酸取代通常可以不明显改变亲代序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应倾向于破坏存在于亲代序列中的螺旋，或破坏表征亲代序列的其他类型的二级结构)。领域公认的多肽二级结构和三级结构的实例描述在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，编辑，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction toProtein Structure(C.Branden&J.Tooze，编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人，Nature，354：105(1991)，其每一个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，变体是本文公开的抗原结合蛋白的核酸序列的变体。本领域技术人员将理解，上述讨论可用于鉴定、评价和/或产生抗原结合蛋白变体，并且还用于可编码那些蛋白变体的核酸序列。
短语“严格杂交条件”指探针将与其靶子序列(通常在核酸的复杂混合物中)杂交、但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同的环境中是不同的。较长的序列在更高的温度下特异性杂交。对于核酸杂交的广泛指导参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with NucleicProbes“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays”(1993)。一般而言，严格条件被选择为在确定离子强度pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm是在平衡时与靶互补的探针的50%与靶序列(因为靶序列过量存在，在Tm下，50%的探针在平衡时被占据)杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。还可以通过添加去稳定剂、例如甲酰胺来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性的严格杂交条件可以如下：50%甲酰胺、5×SSC和1%SDS，在42℃孵育，或，5×SSC，1%SDS，在65℃孵育，在65℃下0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤。
如果它们编码的多肽基本相同，在严格条件下不相互杂交的核酸依然是基本相同的。这发生在例如当核酸拷贝使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生时。在这种情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括在37℃下40%甲酰胺、1MNaC1、1%SDS的缓冲液中杂交，并且在45℃下1×SSC中洗涤。阳性杂交至少两倍背景。本领域普通技术人员容易理解，可以使用可选的杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件。例如，用于确定杂交参数的其他指导提供于许多参考文献，例如，和CurrentProtocols in Molecular Biology，编辑Ausubel等人，John Wiley&Sons。对于PCR，约36℃的温度对于低严格扩增是典型的，但是退火温度可以在约32℃至约48℃之间变化，取决于引物长度。对于高严格性PCR扩增，约62℃的温度是典型的，但是高严格退火温度范围可以从约50℃至约65℃，取决于引物长度和特异性。高和低严格性扩增的典型循环条件包括90℃-95℃持续30秒-2分钟的变性期，持续30秒-2分钟的退火期，和约72℃下持续1-2分钟的延伸期。低和高严格扩增反应的方案和指导提供于例如Innis等人(1990)PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，A cademic Press，Inc.N.Y.)。
抗原结合蛋白(例如，抗体)的制备
在某些实施方案中，抗原结合蛋白(例如抗体)通过用抗原(例如，EGFR)免疫来产生。在某些实施方案中，抗体可以通过用全长EGFR、EGFR的可溶形式、仅催化结构域、EGFR的成熟形式、EGFR的剪接变体形式或其片段免疫来产生。在某些实施方案中，本发明抗体可以是多克隆或单克隆的，和/或可以是重组抗体。在某些实施方案中，本发明抗体是例如通过能够产生人类抗体的转基因动物免疫制备的人类抗体(参见例如，PCT公布申请号W093/12227)。
在某些实施方案中，可以利用某些策略来操纵抗体的固有性质，例如抗体对其靶的亲和力。这种策略包括但不限于使用编码抗体的多核苷酸分子的位点特异性诱变或随机诱变来产生抗体变体。在某些实施方案中，这种产生之后是筛选表现出期望的改变、例如增加或减少的亲和力的抗体变体。
在某些实施方案中，在诱变策略中的目标氨基酸残基是CDR中的那些氨基酸残基。在某些实施方案中，可变结构域的框架区中的氨基酸是目标。在某些实施方案中，这种框架区已经显示促进某些抗体的靶结合性质。参见例如，Hudson，Curr.Opin.Biotech.，9：395-402(1999)和其中的参考文献。
在某些实施方案中，抗体变体的更小且更有效筛选的文库通过把随机诱变或定点诱变局限于CDR中的超变位点来产生，所述超变位点是与在体细胞亲和成熟过程中易于突变的区域对应的位点。参见例如，Chowdhury&Pastan，Nature Biotech.，17：568-572(1999)和其中的参考文献。在某些实施方案中，某些类型的DNA元件可用于鉴定超变位点，包括但不限于某些正向和反向重复序列、某些共有序列、某些二级结构以及某些回文序列。例如，可用于鉴定超变位点的这种DNA元件包括但不限于四碱基序列，包括嘌呤(A或G)，随后是鸟嘌呤(G)，随后是嘧啶(C或T)，随后是腺苷酸或胸苷(A或T)(即，A/G-G-C/T-A/T)。可用于鉴定超变位点的DNA元件的另一实例是丝氨酸密码子，A-G-C/T。
全长人类抗原结合蛋白(例如，抗体)的制备
在某些实施方案中，使用噬菌体展示技术产生来单克隆抗体。在某些实施方案中，这种技术产生完全人类单克隆抗体。在某些实施方案中，编码单个Fab或Fv抗体片段的多核苷酸在噬菌体粒子的表面上表达。参见例如，Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J Mol Biol.222：581(1991)；美国专利号5,885,793。在某些实施方案中，“筛选”噬菌体以鉴定对靶具有亲和力的那些抗体片段。因此，某些此类过程通过在丝状噬菌体表面上展示抗体片段组成部分来模拟免疫选择，并通过它们与靶的结合来模拟随后的噬菌体选择。在某些这样的程序中，分离了高亲和力功能性中和抗体片段。在某些这样的实施方案(下文更详细讨论)中，人抗体基因的完整组成部分通过从外周血淋巴细胞克隆自然重排的人V基因来产生。参见例如，Mullinax等人，Proc Natl Acad Sci(USA)，87：8095-8099(1990)。
根据某些实施方案，通过利用插入了人类抗体生成基因组的大部分、但是在内源性鼠抗体生成方面缺陷的转基因小鼠来制备本发明抗体。然后，这样的小鼠能够产生人类免疫球蛋白分子和抗体，并且不能产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于实现该结果的技术公开于本说明书中公开的专利、申请和参考文献中。在某些实施方案中，可以采用例如以下中公开的那些方法：PCT公布申请号WO98/24893或Mendez等人，Nature Genetics，15：146-156(1997)，其通过引用并入本文用于任何目的。
一般而言，EGFR特异性的完全人类单克隆抗原结合蛋白(例如，抗体)可以如下产生。含有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠用感兴趣的抗原、例如EGFR免疫，从表达抗体的小鼠获得淋巴细胞(例如B细胞)。这种回收的细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系，并且这种杂交瘤细胞系被筛选并选择以鉴定产生针对感兴趣的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，提供了产生EGFR特异性抗体的杂交瘤细胞系的生成。
在某些实施方案中，通过使人类脾细胞(B或T细胞)体外暴露于抗原，然后在免疫受损小鼠、例如SCID或nod/SCID中重建暴露的细胞，来产生完全人类抗体。参见例如，Brams等人，J.Immunol.160：2051-2058(1998)；Carballido等人，Nat.Med.，6：103-106(2000)。在某些这种方法中，人类胎组织富集进入SCID小鼠(SCID-hu)导致长期的血细胞生成和人类T细胞发育。参见例如，McCune等人，Science，241：1532-1639(1988)；Ifversen等人，Sem.Immunol.，8：243-248(1996)。在某些情况下，这种嵌合小鼠中的体液免疫应答依赖于动物中人类T细胞的共发育。参见例如，Martensson等人，Immunol.，83：1271-179(1994)。在某些方法中，将人的外周血淋巴细胞移植到SCID小鼠中。参见例如，Mosier等人，Nature，335：256-259(1988)。在某些此类实施方案中，当这种移植的细胞用引发剂、例如葡萄球菌肠毒素A(SEA)或用抗人CD40单克隆抗体处理时，检测到更高水平的B细胞生成。参见例如，Martensson等人，Immunol.，84：224-230(1995)；Murphy等人，Blood，86：1946-1953(1995)。
因此，在某些实施方案中，完全人类抗体可通过在宿主细胞中表达重组DNA或通过在杂交瘤细胞中表达而生成。在其它实施方案中，抗体使用本文所述的噬菌体展示技术而生成。
如本文所述，本文描述的抗体部分地通过利用技术来制备。然后，这种小鼠能够产生人类免疫球蛋白分子和抗体，并且不能产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于实现此的技术公开于本文背景章节中公开的专利、申请和参考文献。然而，具体地，小鼠的转基因生成以及来自其的抗体的优选实施方案公开于1996年12月3日提交的美国专利申请序号08/759,620和1998年6月11日公开的WO98/24893以及2000年12月21日公开的WO00/76310，其公开内容通过引用并入本文。还参见Mendez等人，Nature Genetics，15：146-156(1997)，其公开内容通过引用并入本文。
通过使用这种技术，已经产生了针对许多抗原的完全人类单克隆抗体。基本上，系的小鼠用感兴趣的抗原(例如EGFR)免疫，从超免疫小鼠回收淋巴细胞(例如B细胞)，并将回收的淋巴细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系被筛选并选择以鉴定产生针对感兴趣的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供了用于产生生成EGFR特异性的抗体的多种杂交瘤细胞系的方法。而且，本文提供了通过此类细胞系产生的抗体的鉴定，包括此类抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
品系的小鼠的生成进一步讨论并描述于1990年1月12日提交的美国专利申请序号07/466,008、1990年11月8日提交的07/610,515、1992年7月24日提交的07/919,297、1992年7月30日提交的07/922,649、1993年3月15日提交的08/031,801、1993年8月27日提交的08/112,848、1994年4月28日提交的08/234,145、1995年1月20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430,938、1995年6月5日提交的08/464,584、1995年6月5日提交的08/464,582、1995年6月5日提交的08/463,191、1995年6月5日提交的08/462,837、1995年6月5日提交的08/486,853、1995年6月5日提交的08/486,857、1995年6月5日提交的08/486,859、1995年6月5日提交的08/462,513、1996年10月2日提交的08/724,752、1996年12月3日提交的08/759,620、2001年11月30日提交的美国公布2003/0093820和美国专利号6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本专利号3068180B2、3068506B2和3068507B2。还参见1996年6月12日公开授权的欧洲专利号EP0463151B1、1994年2月3日公开的国际专利申请号WO94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请号WO96/34096、1998年6月11日公开的WO98/24893、2000年12月21日公开的WO00/76310。
完全人类单克隆抗体(Mab)技术的发展已经成为面对实现抗体疗法在人类疾病中的承诺的重要里程碑。人类单克隆抗体最大限度减少鼠或人源化抗体固有的免疫原性和变态反应，并且已经证明了增加的效力和/或安全性。存在用于产生人类单克隆抗体的许多技术，包括但不限于Abgenix(现在是AmgenInc.的部分)开拓的方法。参见Green等人，Nature Genetics7：13-21(1994)。技术的其他变化可以参见Mendez等人，Nature Genetics15：146-156(1997)和美国专利申请号08/759,620，其公开内容通过引用整体并入本文。
在可选方法中，包括GenPharm International Inc.在内的其他人使用了“迷你基因座(minilocus)”方法来产生人类抗体。该方法描述于Surani等人的美国专利号5,545,807以及Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806和5,625,825，以及1990年8月29日提交的美国专利申请序号07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、1992年6月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,741，其公开内容通过引用并入本文。还参见WO94/25585、WO93/12227、WO92/22645和WO92/03918，其公开内容通过引用整体并入本文。用于产生人类抗体的其他技术已经由例如(现在是Bristol Myers的部分)和Cambridge Antibody(CAT，现在是的部分)开发。
上述专利、申请和参考文献的每一个的公开内容也通过引用整体并入本文。
为了制备本发明的适当的抗体以及为了根据本发明的使用，例如重组、单克隆或多克隆抗体，可以使用许多本领域已知的技术(参见例如，Kohler&Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today4：72(1983)；Cole等人，pp.77-96，于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane，Antibodies，A LaboratoryManual(1988)；和Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版.1986))。编码感兴趣的抗体的重链和轻链的基因可以从细胞克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可以从杂交瘤克隆，并且用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库还可以从杂交瘤或血浆细胞制备。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的抗体的大集合(参见例如，Kuby，Immunol.(第3版.1997))。用于产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利号4,946,778，美国专利号4,816,567)可适于产生针对本发明多肽的抗体。而且，转基因小鼠或其他生物体例如其他哺乳动物可以用于表达人源化或人类抗体(参见例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-13(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology14：826(1996)；和Lonberg&Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。可选地，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合选定抗原的抗体和异聚Fab片段(参见例如，McCafferty等人，Nature348：552-554(1990)；Marks等人，Biotechnology10：779-783(1992))。抗体还可以被制成双特异性的，即，能够识别两个不同的抗原(参见例如，WO93/08829，Traunecker等人，EMBOJ.10：3655-3659(1991)；和Suresh等人，Methods in Enzymology121：210(1986))。抗体还可以是异轭合物，例如，两个共价结合的抗体，或免疫毒素(参见例如，美国专利号4,676,980，WO91/00360；WO92/200373；和EP03089)。
用于人源化或灵长类动物化非人类抗体的方法是本领域公知的。一般而言，人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基经常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化可以基本上按照Winter及同事的方法进行(参见例如，Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整人类可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿类抗体中相似位点的残基取代的人类抗体。
在可选方法中，包括GenPharm International Inc.在内的其他人已经使用了“迷你基因座”方法。在迷你基因座方法中，通过加入来自Ig基因座的片段(个体基因)来模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和通常第二恒定区(优选γ恒定区)被形成用于插入动物的构建体。该方法描述于Surani等人的美国专利号5,545,807和Lonberg&Kay的美国专利号5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458，Krimpenfort&Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010，Berns等人的美国专利号5,612,205、5,721,367和5,789,215，以及Choi&Dunn的美国专利号5,643,763，和GenPharmInternational美国专利申请序号07/574,748、07/575,962、07/810,279、07/853,408、07/904,068、07/990,860、08/053,131、08/096,762、08/155,301、08/161,739、08/165,699、08/209,741，其公开内容通过引用并入本文。还参见欧洲专利号0546073B1、国际专利申请号WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852和WO98/24884以及美国专利号5,981,175，其公开内容通过引用整体并入本文。还参见Taylor等人，1992，Chen等人，1993，Tuaillon等人，1993，Choi等人，1993，Lonberg等人，(1994)，Taylor等人，(1994)，和Tuaillon等人，(1995)，Fishwild等人，(1996)，其公开内容通过引用整体并入本文。
Kirin也证明了从小鼠产生人类抗体，其中通过微细胞融合，引入了大片段染色体或完整染色体。参见欧洲专利申请号773288和843961，其公开内容通过引用并入本文。此外，已经产生了KMTM小鼠，它是Kirin的Tc小鼠与Medarex的迷你基因座(Humab)小鼠杂交的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人类IgH转染色体和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等人，Cloning Stem Cells，(2002)4：91-102)。
还可以通过体外方法衍生人类抗体。适当的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT，Morphosys，Dyax，Biosite/Medarex，Xoma，Symphogen，Alexion(formerly Proliferon)，Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示等。
在一些实施方案中，本文描述的抗体具有人类IgG4重链以及IgG2重链。抗体还可以具有其他人类同种型，包括IgG1。当通过各种技术测量时，抗体具有高亲和力，通常具有约10-6至约10-13M或以下的Kd。
在一个实施方案中，抗体被轭合至“效应子”部分。效应子部分可以是任何数目的分子，包括标记部分，例如放射性标记或荧光标记，或者可以是治疗性部分。
本发明抗体可以与其他氨基酸残基融合。此类氨基酸残基可以是肽标签，可能促进分离。还考虑了用于针对特定器官或组织的抗体归巢的其他氨基酸残基。
在本发明的另一方面，抗EGFR抗体或抗体片段可以化学或生物合成地连接至抗肿瘤剂或可检测的信号生成剂。如下示例的，本发明抗体在与携带EGFR的细胞结合时被有效内化。与抗体连接的抗肿瘤剂包括破坏或损伤抗体结合的或抗体结合的细胞的环境中的肿瘤的任何剂。例如，抗肿瘤剂是毒性剂，例如化疗剂或放射性同位素。适当的化疗剂是本领域技术人员已知的，并且包括蒽环类(例如道诺霉素和阿霉素)、氨甲喋呤、长春地辛、新制癌菌素、顺铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、蓖麻毒素和卡奇霉素。使用常规方法将化疗剂与抗体轭合(参见例如，Hermentin和Seiler，Behring Inst.Mitt.82：197-215(1988))。
可检测的信号生成剂在体内和体外用于诊断目的。信号生成剂产生了可检测的信号，其可通过外部手段检测，通常是测量电磁辐射。大多数情况下，信号生成剂是酶或生色团，或者通过荧光、磷光或化学发光而发射光。生色团包括吸收紫外线或可见区域中的光的染料，并且可以是酶催化反应的底物或降解产物。
一方面，抗体调节蛋白活性。这种效应部分包括但不限于抗肿瘤药物、毒素、放射活性剂、细胞因子、二抗或酶。而且，本发明提供了其中本发明抗体与将前药转化成细胞毒性剂的酶连接的实施方案。
免疫轭合物可用于将效应子部分靶向至N-钙粘着蛋白阳性细胞、特别是表达N-钙粘着蛋白或Ly6蛋白的细胞。这种差异可以在观察用测试和对照样品大致相似加载的凝胶条带时容易明显。细胞毒性剂的实例包括但不限于蓖麻毒素、阿霉素、柔红霉素、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟基炭疽毒素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白和糖皮质激素以及其他化疗剂和放射性同位素。适当的可检测标志包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。
在以上实施方案的任何一个中，化疗药物和/或放射疗法可以被进一步施用。在一些实施方案中，患者还接受激素拮抗剂疗法。患者与抗体或抗体片段的接触可以通过静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内或皮内施用抗体给患者。在一些实施方案中，患者具有泌尿生殖系统癌症(例如，膀胱癌、前列腺癌)。在一些上述实施方案中，患者罹患前列腺癌并任选进一步接受患者激素消融疗法。在一些实施方案中，接触包括将抗体直接施用进入癌或癌转移。在一些实施方案中，化疗剂可以选自由以下组成的组：蓖麻毒素、蓖麻毒素A-链、阿霉素、柔红霉素、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟基炭疽毒素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、胡连根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素(retstrictocin)、酚霉素、尹诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白、卡奇霉素(calicheamicin)、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、美登素类和糖皮质激素蓖麻毒素。
此外，包含本发明单克隆抗体的任何一个的抗原结合区的本发明重组蛋白可用于治疗癌症。在这种情况下，重组蛋白的抗原结合区与具有治疗活性的第二蛋白的至少功能活性部分结合。该第二蛋白可以包括但不限于酶、淋巴因子、制癌蛋白或毒素。适当的毒素包括阿霉素、柔红霉素、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟基炭疽毒素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、糖皮质激素和放射性同位素。
用于将治疗剂轭合至抗体的技术是公知的(参见例如，Arnon等人，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，MonoclonalAntibodies&Cancer Therapy，Reisfeld等人(编辑)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编辑)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987)；Thorpe,“Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，Monoclonal Antibodies'84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编辑)，pp.475-506(1985)；和Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982))。
如将理解的，抗体可以在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适当的哺乳动物宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法，包括例如将多核苷酸包裹在病毒中(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者通过本领域已知的转染程序，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455所示例的(所述专利据此通过引用并入本文)。使用的转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域公知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸包封在脂质体中以及DNA直接显微注射进入核。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，并且包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有组成型EGFR结合性质的抗体来选择特别优选的细胞系。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白(例如抗体)以小于约1nM，例如，1000pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM和/或1pM至0.1pM或更小的解离常数(KD)结合EGFR。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型的至少一个的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人类κ轻链和/或人类重链。在某些实施方案中，重链属于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型。在某些实施方案中，抗原结合蛋白已经被克隆用于在哺乳动物细胞中表达。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括不同于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型的恒定区的任何一个的恒定区。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人类λ轻链和人类IgG2重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人类λ轻链和人类IgG4重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人类λ轻链和人类IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包括人类κ轻链和人类IgG2重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人类κ轻链和人类IgG4重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括人类κ轻链和人类IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括与恒定区连接的抗体的可变区，所述恒定区既不是IgG2同种型的恒定区，也不是IgG4同种型的恒定区。在某些实施方案中，抗原结合蛋白已经被克隆用于在哺乳动物细胞中表达。
相反，在某些实施方案中，针对EGFR的抗体的功能和/或化学特征的实质改变可以通过选择重链和轻链的氨基酸序列中、对维持以下的作用显著不同的取代：(a)取代区域中例如作为折叠或螺旋构象，分子骨架的结构，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链大小。
例如，“保守氨基酸取代”可以包括非天然残基对天然氨基酸残基的取代，使得在该位置的氨基酸残基的极性或电荷很少或没有影响。而且，多肽中任何天然残基还可以用丙氨酸取代，如之前已经针对“丙氨酸扫描诱变”描述的。
期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员在期望这种取代时确定。在某些实施方案中，氨基酸取代可用于鉴定针对EGFR的抗体的重要残基，或者增加或减少如本文所述的针对EGFR的抗体的亲和力。
在某些实施方案中，本发明抗体可以在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达。在某些实施方案中，编码特定抗体的序列可用于转化适当的哺乳动物宿主细胞。根据某些实施方案，转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法，包括例如将多核苷酸包裹在病毒中(或者在病毒载体中)并用该病毒(或载体)转染宿主细胞，或者通过本领域已知的转染程序，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(其专利通过引用并入本文用于任何目的)所示例的。在某些实施方案中，使用的转化程序可以取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域公知的，并且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸包封在脂质体中以及DNA直接显微注射进入核。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，并且包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)和许多其他细胞系。在某些实施方案中，通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有组成型HGF结合性质的抗体来选择细胞系。用于哺乳动物宿主细胞的适当表达载体是公知的。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括一种或多种多肽。在某些实施方案中，许多表达载体/宿主系统可用于表达编码包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽的多核苷酸分子。这种系统包括但不限于：用重组的噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti质粒或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
在某些实施方案中，包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽在酵母中重组表达。某些此类实施方案使用商购的表达系统、例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)，遵循生产商的说明书。在某些实施方案中，这样的系统依赖前原α序列来指导分泌。在某些实施方案中，插入物的转录在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。
在某些实施方案中，包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的分泌多肽从酵母生长培养基纯化。在某些实施方案中，用于从酵母生长培养基纯化多肽的方法与用于从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化多肽的那些方法相同。
在某些实施方案中，编码包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽的核酸被克隆入杆状病毒表达载体，例如pVL1393(PharMingen，San Diego，CA)。在某些实施方案中，这种载体可以根据生产商的指导(PharMingen)用于在无sF9蛋白培养基中感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)并产生重组多肽。在某些实施方案中，使用肝素-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)从这种培养基纯化并浓缩多肽。
在某些实施方案中，包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽在昆虫系统中表达。用于多肽表达的某些昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以在草地贪夜蛾细胞或在夜蛾幼虫(Trichoplusia larvae)中表达外来基因。在某些实施方案中，可以将编码多肽的核酸分子插入病毒的非必要基因(例如多角体蛋白基因内)，并置于该基因的启动子的控制之下。在某些实施方案中，核酸分子的成功插入将使非必要基因失活。在某些实施方案中，该失活结果导致可检测的特征。例如，多角体蛋白基因的失活导致缺少外壳蛋白的病毒的产生。
在某些实施方案中，重组病毒可用于感染草地贪夜蛾细胞或夜蛾幼虫。参见例如，Smith等人，J.Virol.，46：584(1983)；Engelhard等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)，91：3224-7(1994)。
在某些实施方案中，在细菌细胞中制备的包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽作为不溶的包涵体在细菌中产生。在某些实施方案中，通过离心收集包含这种包涵体的宿主细胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH8，1mM EDTA中洗涤；并且用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)在室温下处理15分钟。在某些实施方案中，溶菌产物通过超声处理澄清，并且细胞碎片通过在12,000Xg离心10分钟来沉淀。在某些实施方案中，将含有多肽的沉淀重悬在50mM Tris，pH8和10mM EDTA中；经50%甘油而分层；并在6000Xg离心30分钟。在某些实施方案中，可以将该沉淀重悬在不含Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。在某些实施方案中，通过将重悬的沉淀在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离来进一步纯化多肽(参见例如，Sambrook等人，同上)。在某些实施方案中，将这样的凝胶浸泡在0.4MKCl中以使蛋白可见，可以将蛋白切离并将其在缺乏SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。根据某些实施方案，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白在细菌中作为可溶蛋白产生。在某些实施方案中，使用GSTPurification Module(Pharmacia)纯化这种GST融合蛋白。
在某些实施方案中，希望“重折叠”某些多肽，例如包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽。在某些实施方案中，使用本文讨论的某些重组系统产生这样的多肽。在某些实施方案中，多肽被“重折叠”和/或氧化以形成希望的四级结构和/或产生二硫键。在某些实施方案中，这样的结构和/或键与多肽的某些生物活性相关。在某些实施方案中，使用本领域公知的许多程序的任何一个完成重折叠。示例性方法包括但不限于将溶解的多肽剂在离液剂存在下暴露于通常高于7的pΗ。示例性离液剂是胍。在某些实施方案中，重折叠/氧化溶液还包含还原剂和该还原剂的氧化形式。在某些实施方案中，还原剂及其氧化形式以产生允许二硫键改组发生的特定氧化还原电位的比例存在。在某些实施方案中，这种改组允许形成半胱氨酸桥。示例性的氧化还原对包括但不限于半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在某些实施方案中，使用共溶剂来提高重折叠的效率。示例性共溶剂包括但不限于甘油、各种分子量的聚乙二醇以及精氨酸。
在某些实施方案中，基本上纯化包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽。某些蛋白质纯化技术是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，蛋白质纯化包括从非多肽级分进行多肽分级分离的粗分级分离。在某些实施方案中，使用色谱技术和/或电泳技术纯化多肽。示例性纯化方法包括但不限于用硫酸铵沉淀；用PEG沉淀；免疫沉淀；热变性、随后离心；色谱，包括但不限于亲和色谱(例如，蛋白-A-琼脂糖凝胶)、离子交换色谱、排阻色谱和反相色谱；凝胶过滤；羟基磷灰石色谱；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；和这种和其他技术的组合。在某些实施方案中，通过快速蛋白液相色谱或者通过高效液相色谱(HPLC)纯化多肽。在某些实施方案中，纯化步骤可以被改变，或者某些步骤可以被忽略，并且依然得到适合制备基本上纯化的多肽的方法。
在某些实施方案中，定量多肽制品的纯化程度。用于定量纯化程度的某些方法是本领域技术人员已知的。某些示例性方法包括但不限于确定制品的特异性结合活性并通过SDS/PAGE分析估计制品内多肽的量。用于估计多肽制品纯化的量的某些示例性方法包括计算制品的结合活性并将其与最初提取物的结合活性相比较。在某些实施方案中，这种计算的结果表示为“纯化倍数(fold purification)”。用于代表结合活性的量的单位取决于进行的特定测定。
在某些实施方案中，包含一种或多种抗原结合蛋白组分或抗原结合蛋白本身的多肽是部分纯化的。在某些实施方案中，部分纯化可以通过使用更少的纯化步骤或通过利用相同的通用纯化方案的不同形式来实现。例如，在某些实施方案中，利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱法通常将比利用低压色谱系统的相同技术产生更大的“纯化倍数”。在某些实施方案中，得到较低纯化程度的方法在多肽的总回收或在保持多肽的结合活性方面可能具有优点。
在某些情况下，多肽的电泳迁移有时能够随不同的SDS/PAGE条件而显著改变。参见例如Capaldi等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76：425(1977)。将理解，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的多肽的表观分子量可以不同。
示例性表位
已经描述了与抗EGFR抗体结合的表位。Freeman等人，Journal of ClinicalOncol.，26：14536(2008)；ASCO Annual Meeting Proceedings。在一些实施方案中，结合EGFR表位或者竞争性结合EGFR抗体表位的抗原结合蛋白是有用的。
某些治疗用途和药物组合物
在一些实施方案中，超过一种针对EGFR的抗原结合蛋白被用于调节EGFR活性。
在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白被单独施用。在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白在施用至少一种其他治疗剂之前施用。在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白与施用至少一种其他治疗剂的同时施用。在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白在施用至少一种其他治疗剂之后施用。在其他实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白在施用至少一种其他治疗剂之前施用。
在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体可以与一种或多种其他抗肿瘤剂组合施用。组合疗法的实例参见例如，美国专利号6,217,866(Schlessinger等人)(与抗肿瘤剂组合的抗EGFR抗体)；WO99/60023(Waksal等人)(与放射组合的抗EGFR抗体)。可以使用任何适当的抗肿瘤剂，例如化疗剂、放射或其组合。抗肿瘤剂可以是烷化剂或抗代谢药。烷化剂的实例包括但不限于顺铂、环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和达卡巴嗪。抗代谢药的实例包括但不限于阿霉素、柔红霉素和紫杉醇、吉西他滨和拓扑异构酶抑制剂伊立替康(CPT-11)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f和拓扑替康(拓扑异构酶I)和依托泊苷(VP-16)和表鬼臼毒噻吩糖苷(VM-26)(拓扑异构酶II)。当抗肿瘤剂是放射时，对于被治疗的患者而言，放射来源可以是外部的(外部束放射疗法—EBRT)或内部的(近距离疗法—BT)。施用的抗肿瘤剂的剂量取决于许多因素，包括例如剂的类型、被治疗的肿瘤的类型和严重度以及剂的施用途径。然而，应该强调，本发明不限于任何特定的剂量。
本领域目前已知或被评价的抗肿瘤剂可以分成许多类别，包括例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素和抗血管生成剂。
这些类别中，本文报道的数据表明，拓扑异构酶抑制剂在与结合EGFR的抗体组合使用时是特别有效的抗肿瘤剂。因此，本发明的实施方案包括其中拓扑异构酶抑制剂与结合EGFR的抗体组合施用的方法。抑制剂可以是拓扑异构酶I或拓扑异构酶II的抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂包括伊立替康(CPT-11)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、拓扑替康。拓扑异构酶II抑制剂包括依托泊苷(VP-16)和表鬼臼毒噻吩糖苷(VM-26)。其他物质目前相对于拓扑异构酶作为抗肿瘤剂的抑制活性和效力来评价。在一个优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂是伊立替康(CPT-11)。组合使用的抗体是与结合EGFR结合并具有以下性质的至少一个的本发明抗体：(i)抑制EGF与EGFR的结合；(ii)中和EGF对EGFR的活化；(iii)减少EGFR表面受体；和以约1×10-10M-1或更小的Kd结合EGFR。在一个更优选的实施方案中，与拓扑异构酶抑制剂组合使用的抗体具有上述人类抗体的特征。
本发明的抗EGFR抗体可以与中和参与肿瘤生长或血管生成的其他受体的抗体一起施用。在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体与特异性结合EGFR的受体拮抗剂组合使用。特别优选的是结合EGFR的细胞外域并阻断其配体的一个或多个的结合和/或中和EGFR的配体诱导的活化的抗原结合蛋白。EGFR拮抗剂可以是结合EGFR或EGFR的配体并抑制EGFR与其配体结合的抗体。EGFR的配体包括例如EGF、TGF-α、双调蛋白、肝素结合EGF(HB-EGF)和β细胞素。认为EGF和TGF-α是导致EGFR介导的刺激的主要内源性配体，但是已经显示TGF-α在促进血管生成中更有效。应该理解，EGFR拮抗剂可以外部结合EGFR的细胞外部分，其能够或不能抑制配体的结合，或者内部结合酪氨酸激酶结构域。结合EGFR的EGFR拮抗剂的实例包括但不限于生物分子，例如EGFR特异性的抗体(及其功能等同物)，和小分子，例如直接作用于EGFR的细胞质结构域的合成激酶抑制剂。
这种受体的另一实例是VEGFR。在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体与VEGFR拮抗剂组合使用。在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体与特异性结合VEGFR-1/Flt-1受体的受体拮抗剂组合使用。在另一实施方案中，抗EGFR抗体与特异性结合VEGFR-2/KDR受体的受体拮抗剂组合使用。特别优选的是与VEGFR-1或VEGFR-2的细胞外域结合并阻断其配体结合(VEGFR-2被VEGF最有力地刺激；VEGFR-1被P1GF、但也被VEGF最有力地刺激)和/或中和配体诱导的活化的抗原结合蛋白。例如，IMC-1121是结合并中和VEGFR-2的人类抗体(WO03/075840；Zhu)。另一实例是MAb6.12，其是结合可溶性和细胞表面表达的VEGFR-1的scFv。ScFv6.12包含小鼠单克隆抗体MAb6.12的VL和VH结构域。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约及其下条例(布达佩斯条约)的规定，产生MAb6.12的杂交瘤细胞系已经被保藏为ATCC号PTA-3344。参与肿瘤发生的生长因子受体的其他实例是血小板衍生的生长因子(PDGFR)、神经生长因子(NGFR)和成纤维细胞生长因子(FGFR)的受体。
在另一可选实施方案中，EGFR抗体可以与一种或多种适当的佐剂组合施用，所述佐剂例如细胞因子(例如，IL-10和IL-13)或其他免疫刺激剂，例如但不限于趋化因子、肿瘤相关抗原和肽。参见例如，Larrivée等人，同上。然而，应该理解，仅抗EGFR抗体的施用足以以治疗有效方式预防、抑制或减少肿瘤的进展。
在组合疗法中，抗EGFR抗体在开始用另一剂治疗之前、期间或之后施用，以及其任意组合，即，在开始抗肿瘤剂治疗之前和期间、之前和之后、期间和之后、或者之前、期间和之后。
例如，抗EGFR抗体可以在开始放射疗法之前1至30天、优选3至20天、更优选5至12天施用。在本发明的一个优选实施方案中，化疗与抗体疗法同时、或者更优选在抗体疗法之后施用。在本发明的另一方面，本发明的抗EGFR抗体可以与一种或多种抗肿瘤剂或抗血管生成剂化学或生物合成地连接。
本发明还考虑与靶或报告分子部分连接的抗EGFR抗体。靶部分是结合对的第一成员。例如，抗肿瘤剂与这种对的第二成员轭合，并从而导向其中结合抗EGFR抗体的位点。这种结合对的常见实例是亲和素和生物素。在一个优选实施方案中，生物素与抗EGFR抗体轭合，并从而提供与亲和素或链霉亲和素轭合的抗肿瘤剂或其他部分的靶。可选地，生物素或另外这种部分与本发明的抗EGFR抗体连接，并且例如在诊断系统中用作报告分子，在诊断系统中，可检测的信号生成剂与亲和素或链霉亲和素轭合。
要理解，当为了预防或治疗目的而在哺乳动物中使用时，本发明的抗EGFR抗体将以组合物的形式施用，所述组合物还包含药学可接受的载体。适当的药学可接受载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或多种以及其组合。药学可接受载体还可以包括小量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强结合蛋白的贮存寿命或效力。如本领域公知的，可以配制注射组合物以提供在施用给哺乳动物之后快速、持续或延迟的活性成分释放。
本发明还包括用于抑制肿瘤生长和/或血管生成的试剂盒，包括治疗有效量的人类抗EGFR抗体。试剂盒还可以含有例如参与肿瘤生成或血管生成的另一生长因子受体(例如，如上所述的，EGFR、VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2、PDGFR、NGFR、FGFR等)的任何适当的拮抗剂。可选或附加地，本发明试剂盒还可以包含抗肿瘤剂。在本发明上下文中适当的抗肿瘤剂的实例已经在本文描述。本发明的试剂盒还可以包括佐剂；实例也已经在上文描述。
而且，本发明范围包括本发明抗体在体内和体外用于检查或诊断方法的用途，这是本领域公知的。诊断方法包括包含本发明抗体的试剂盒。
因此，本发明受体抗体由此可在体内和体外用于检查、诊断、预防或治疗方法，这是本领域公知的。当然，要理解并预期，本文公开的发明原理的改变可以由本领域技术人员进行，并且预期这种改变包括在本发明范围内。
本发明还提供了通过给哺乳动物施用有效量的如前所述的抗体来治疗哺乳动物肿瘤生长的方法。EGFR信号途径已经被广泛证明是在许多类型癌症的发育中的诱因。
在本发明中，任何适当的方法或途径可用于施用本发明的抗EGFR抗体，并且任选地，共施用抗肿瘤剂和/或其他受体的拮抗剂。根据本发明使用的抗肿瘤剂方案包括被认为最佳适合治疗患者肿瘤病症的任何方案。不同的恶性肿瘤可能需要使用特定的抗肿瘤抗体和特定的抗肿瘤剂，这将根据患者而定。施用途径包括例如口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。施用的拮抗剂的剂量取决于许多因素，包括例如拮抗剂的类型、被治疗的肿瘤的类型和严重度、拮抗剂的施用途径。然而，应该强调，本发明不限于任何特定的施用方法或途径。
要注意，本发明的抗EGFR抗体可以作为轭合物施用，轭合物特异性结合受体并在配体-毒素内化之后递送毒性、致命的有效负载。抗体-药物/小分子轭合物可以直接相互连接或者通过肽或非肽的连接体连接。
在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白与特定治疗剂一起使用来治疗各种癌症。在某些实施方案中，根据病症和希望的治疗水平，可以施用两种、三种或更多剂。在某些实施方案中，这些剂可以通过加入相同制剂中而被一起提供。在某些实施方案中，这些剂可以分开配制并通过加入治疗试剂盒而一起提供。在某些实施方案中，这些剂和针对EGFR的抗原结合蛋白可以分开配制并通过加入治疗试剂盒而一起提供。在某些实施方案中，这些剂被分开提供。在某些实施方案中，当通过基因疗法施用时，编码蛋白剂和/或针对EGFR的抗原结合蛋白的基因可以被包括在相同载体中。在某些实施方案中，编码蛋白剂和/或针对EGFR的抗原结合蛋白的基因可以在相同启动子区域的控制下。在某些实施方案中，编码蛋白剂和/或针对EGFR的抗原结合蛋白的基因可以在分开的载体中。
在某些实施方案中，本发明提供了包含针对EGFR的抗原结合蛋白与药学可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白可以与用于炎症的至少一种治疗剂一起使用。在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白可以与用于免疫疾患的至少一种治疗剂一起使用。炎症和免疫疾患的示例性治疗剂包括但不限于1型环氧合酶(COX-1)和2型环氧合酶(COX-2)抑制剂，38kDa促有丝分裂原激活的蛋白激酶(p38-MAPK)的小分子调节剂；参与炎症途径的细胞内分子的小分子调节剂，其中这种细胞内分子包括但不限于jnk、IKK、NF-κB、ZAP70和lck。炎症的某些示例性治疗剂描述于例如C.A.Dinarello&L.L.Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in RheumatoidArthritis：A Primer for Clinicians，第3版(2001)Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA。
在某些实施方案中，药物组合物将包括超过一种不同的针对EGFR的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物将包括超过一种针对EGFR的抗原结合蛋白，其中针对EGFR的抗原结合蛋白结合超过一种表位。在一些实施方案中，不同的抗原结合蛋白相互间不会竞争结合EGFR。在一些实施方案中，本文描述的抗原结合蛋白的任何一个可以在药物组合物中组合在一起。
在某些实施方案中，可接受的配制材料优选在采用的剂量和浓度下对受体无毒性。在一些实施方案中，配制材料用于s.c.和/或I.V.施用。药物组合物可以包含用于改变、维持或保留例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透的配制材料。在某些实施方案中，适合的配制材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；增量剂(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(咖啡因、聚乙烯比咯酮、β环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他糖类(例如、葡萄糖、甘露糖或环糊精)；蛋白(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯酮)；低分子量多肽；形成盐的反离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如pluronics、PEG、山梨醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨醇)；张度增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编，Mack PublishingCompany(1995)。在一些实施方案中，制剂包含PBS；20mM NaOAC，pH5.2，50mM NaCl；和/或10mM NAOAC，pH5.2，9%蔗糖。
在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白和/或治疗分子与本领域已知的延长半衰期的媒介物连接。这种媒介物包括但不限于聚乙二醇、糖原(例如，抗原结合蛋白的糖基化)和葡聚糖。这种媒介物描述于例如美国申请序号09/428,082(现在是美国专利号6,660,843)和公布的PCT申请号WO99/25044，通过引用并入本文。
在某些实施方案中，最佳的药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和期望剂量来确定。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在某些实施方案中，这种组合物可以影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体可以在性质上是水性或非水性的。例如，在某些实施方案中，适合的媒介物或载体可以是可能补充了肠胃外施用组合物中常见的其他材料的注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液。在一些实施方案中，盐水包括等渗磷酸盐缓冲盐水。在某些实施方案中，中性缓冲盐水或混有血清白蛋白的盐水是另外的示例性媒介物。在某些实施方案中，药物组合物包含约PH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，所述缓冲液还可以因此包括山梨醇或适合的替代品。在某些实施方案中，可以通过将具有期望纯度的所选组合物与任选的处于冻干饼或水溶液形式的配制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences，同上)相混合来制备包含针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有至少一种其他治疗剂的组合物。此外，在某些实施方案中，可以使用适当的赋形剂、例如蔗糖将包含针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有至少一种其他治疗剂的组合物配制成冻干产物。
特别是用于本发明的抗体和免疫轭合物和抑制剂的药物制剂可以通过混合具有期望纯度的抗体与任选药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂来制备。这种制剂可以是冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对于受体无毒性。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)防腐剂低分子量多肽；蛋白例如血清白蛋白或明胶，或亲水聚合物例如聚乙烯比咯烷酮；和氨基酸、单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂；和离子和非离子表面活性剂(例如，聚山梨酸酯)；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂。抗体可以0.5-200mg/ml或10-50mg/ml的浓度配制。
制剂还可以提供其他活性化合物，包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和抗激素剂。活性成分还可以制备为持续释放制剂(例如，固体疏水聚合物的半透性基质(例如，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯。抗体和免疫轭合物还可以包埋入例如通过团聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或微乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
组合物可以被施用用于治疗性或预防性治疗。在治疗性应用中，组合物以“治疗有效剂量”施用给罹患疾病(例如癌症)的患者。该用途的有效量取决于疾病严重度和患者健康的一般状态。组合物的单次或多次施用可以根据所需以及患者耐受的剂量和频率施用。为本发明目的的“患者”或“受试者”包括人类和其他动物，特别是哺乳动物。因此，所述方法适用于人类疗法和兽医应用。在一个优选实施方案中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物，并且在最优选的实施方案中，患者是人类。其他已知的癌症疗法可与本发明方法组合。例如，根据本发明使用的组合物还可以用于靶向或敏化细胞至其他癌症治疗剂，例如SFU、长春花碱、放线菌素D、顺铂、氨甲喋呤等。
在某些实施方案中，可以选择药物组合物用于肠胃外递送。在某些实施方案中，可以选择组合物用于吸入或用于通过消化道、例如口服递送。此类药学上可接受的组合物的制备是在本领域技术人员能力之内。
在某些实施方案中，配制组分以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲液可以用来将组合物保持在生理pH或稍微低的pH，通常在约5到约8的pH范围之内。
在某些实施方案中，当考虑肠胃外施用时，治疗组合物可以是无热原的、在药学上可接受的媒介物中包含期望的针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有其他治疗剂的肠胃外可接受的水溶液的形式。在某些实施方案中，用于肠胃外注射的媒介物是无菌蒸馏水，其中针对EGFR的抗原结合蛋白(有或没有至少一种其他治疗剂)被配制成适当地保存的无菌、等渗溶液。在某些实施方案中，制备可以包括期望的分子与可提供可随后通过贮库注射递送的产物的控制或持续释放的剂一起配制，所述剂例如可注射的微球、生物可蚀解的颗粒、多聚化合物(聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体。在某些实施方案中，透明质酸也可以被使用，并且可以具有提升在循环中持续时间的作用。在某些实施方案中，可以使用可植入的药物递送装置引入期望的分子。
在某些实施方案中，药物组合物可以被配制用于吸入。在某些实施方案中，针对EGFR的抗原结合蛋白(有或没有至少一种其他治疗剂)可以被配制为用于吸入的干粉。在某些实施方案中，包含针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有至少一种其他治疗剂的吸入溶液可以与推进剂一起配制以用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可以是喷雾的。肺部施用另外描述在PCT申请号PCT/US94/001875中，它描述了化学修饰的蛋白的肺部递送。
在某些实施方案中，考虑制剂可以口服施用。在某些实施方案中，以这种方式施用的针对EGFR的抗原结合蛋白(有或没有至少一种其他治疗剂)可以在有或没有固体剂型(例如片剂和胶囊)的混合中惯常使用的那些载体下配制。在某些实施方案中，可以将胶囊设计为在胃肠道中的某点释放制剂的活性部分，此时生物利用度最大并且系统前降解最小。在某些实施方案中，可以包括至少一种其他剂以促进针对EGFR的抗原结合蛋白和/或任何其他治疗剂的吸收。在某些实施方案中，还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片崩解剂和粘合剂。
在某些实施方案中，药物组合物可以包括在与适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的针对EGFR的抗原结合蛋白，有或没有至少一种其他治疗剂。在某些实施方案中，通过在无菌水或另一适当媒介物中溶解片剂，可以制备单位剂量形式的溶液。在某些实施方案中，适合的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
其他药物组合物对本领域技术人员将是明显的，包括涉及持续或控制递送制剂中的针对EGFR的抗原结合蛋白(有或没有至少一种其他治疗剂)的制剂。在某些实施方案中，用于配制各种其他持续或控制递送工具的技术也是本领域技术人员已知的，所述递送工具例如脂质体载体、可生物蚀解的微粒或多孔珠以及贮库注射。参见例如PCT申请号PCT/US93/00829，它描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的控制释放。在某些实施方案中，持续释放制剂可以包括处于成形产品形式、例如膜或微胶囊的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(U.S.3,773,919和EP058,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。在某些实施方案中，持续释放组合物还包括可以通过本领域已知的几种方法中任一种制备的脂质体。参见例如，Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；EP036,676；EP088,046和EP143,949。
用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。在某些实施方案中，这可以通过无菌滤膜过滤实现。在某些实施方案中，在组合物被冻干时，使用该方法的除菌可在冻干和复溶之前或之后进行。在某些实施方案中，用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。在某些实施方案中，通常将肠胃外组合物放入具有无菌获取通道的容器，例如具有可通过皮下注射针穿透的塞的输液袋或管形瓶。
在某些实施方案中，配制药物组合物一经配制，可将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干的粉末储存在无菌管形瓶中。在某些实施方案中，这种制剂可以即用形式或施用前复溶的形式(例如冻干的)储存。
在某些实施方案中，提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可以同时包含具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在某些实施方案中，还包括含有单腔和多腔预装填的注射器(例如液体注射器和药粉注射器(lyosyringe))的试剂盒。
在某些实施方案中，治疗上采用的包含针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有至少一种其他治疗剂的药物组合物的有效量将取决于例如治疗环境和治疗目标。根据某些实施方案，本领域技术人员将理解，用于治疗的适当的剂量水平将部分地根据递送的分子、使用的针对EGFR的抗原结合蛋白(有或没有至少一种其他治疗剂)所针对的适应症、施用途径、患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医师可以滴定剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。在某些实施方案中，典型剂量范围可以在约0.1μg/kg至约100mg/kg或更大，这取决于上面提到的因素。在某些实施方案中，剂量范围可以在0.1μg/kg至约100mg/kg；或1μg/kg至约100mg/kg；或5μg/kg至约100mg/kg。
在某些实施方案中，给药频率将考虑使用的制剂中针对EGFR的抗原结合蛋白和/或任何其他治疗剂的药物代谢动力学参数。在某些实施方案中，临床医师将施用组合物直至达到实现期望效果的剂量。在某些实施方案中，组合物因此可以按单剂或按多剂(其可以或可以不含有相同量的期望分子)随时间施用或通过植入装置或导管连续输注。适当剂量的其他改进可以由本领域普通技术人员常规做出，并且在他们常规进行的任务范围内。在某些实施方案中，可以通过使用适当的剂量-响应数据来确定适当的剂量。
在某些实施方案中，药物组合物的施用途径是依据已知方法，例如口服；通过静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径(intralesional route)；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，可以通过快速浓注或连续输注或通过植入装置施用组合物。
在某些实施方案中，可以通过已经吸收或封装期望分子的膜、海绵或另一种适当材料的植入来局部施用组合物。在某些实施方案中，当使用植入装置时，可以将装置植入到任何适合的组织或器官中，并且可以通过扩散、定时释放的药丸或连续施用来递送期望的分子。
在某些实施方案中，以离体方式使用包含针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有至少一种其他治疗剂的药物组合物可能是令人期望的。在这种情况下，将已从患者移除的细胞、组织和/或器官暴露于包含针对EGFR的抗原结合蛋白且有或没有至少一种其他治疗剂的药物组合物，之后所述细胞、组织和/或器官被植入回患者中。
在某些实施方案中，可以通过植入某些细胞来递送针对EGFR的抗原结合蛋白和/或任何其他治疗剂，所述细胞已使用例如本文所述的那些方法进行基因工程化改造以表达和分泌多肽。在某些实施方案中，此类细胞可以是动物细胞或人细胞，并且可以是自体的、异源的或异基因的。在某些实施方案中，细胞可以是永生化的。在某些实施方案中，为了降低免疫反应的机会，可以封装细胞以避免周围组织的浸润。在某些实施方案中，封装材料通常是可生物降解的、半透性聚合外壳或膜，它们允许蛋白产物的释放，但阻止细胞被患者的免疫系统或来自周围组织的其他有害因素破坏。
诊断应用
在一些实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白用于或提供于用于检测哺乳动物组织或细胞中EGFR的测定试剂盒和/或方法中，以筛选/诊断与EGFR水平变化相关的疾病或疾患。所述试剂盒包括结合EGFR的抗原结合蛋白和用于指示抗原结合蛋白与EGFR(如果存在)的结合以及任选地EGFR蛋白水平的工具。可以使用用于指示抗原结合蛋白存在的各种工具。例如，荧光团、其他分子探针或酶可以连接至抗原结合蛋白，并且可以许多方式观察抗原结合蛋白。用于筛选此类疾患的方法可以包括使用所述试剂盒，或者简单地使用公开的抗原结合蛋白之一，并确定抗原结合蛋白是否结合样品中的EGFR。如本领域技术人员理解的，高或升高水平的EGFR将导致更大量的抗原结合蛋白结合样品中的EGFR。因此，抗原结合蛋白结合的程度可用于确定有多少EGFR在样品中。具有大于预定量(例如，没有EGFR相关疾患的人将具有的量或范围)的EGFR量的受试者或样品被鉴定为具有EGF和/或EGFR介导的疾患。
帕尼单抗及其各自突变体的相关氨基酸和核酸序列示于表2。
表2
前面的书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。前面的说明和实例给出了本发明的某些优选实施方案的细节并且描述了本发明人所认为的最佳方式。然而，要理解，无论前面内容多么具体地以文本呈现，本发明可以许多方式实施，并且本发明应该根据所附权利要求及其任何等同方式来解释。
实施例，包括进行的实验和获得的结果，仅为了示例说明的目的而提供，并且不要被解释为限制本发明。
实施例1
诱变
帕尼单抗的重链和轻链氨基酸序列(Seq Id No.1&2)被用作诱变的起始材料。设计PCR引物以使用Stratagene(Now Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)的Quik定点诱变试剂盒进行定点诱变。根据生产商的方案，使用寡核苷酸建立PCR反应并用于转化XL-Gold超-感受态细胞。然后将这些细胞涂板在TIM选择性板上。将所述板置于37℃下过夜以允许集落形成。挑取来自每个构建体的两个集落并在TIM板上再划线。然后准备每个构建体的一个集落用于maxipreps。maxipreps被测序并匹配100%。对maxipreps进行SalI-NotI消化以选择感兴趣的片段。将两个限制末端连接进入Sal I-NotI消化的pDC414。将新的连接转化进入DH10B感受态细胞并铺板在TIM选择板上。然后将板置于37℃下过夜以允许集落形成。消化几个集落以测试插入。对每个突变进行一次maxiprep：pDC414-AMG954Asp92-Glu，和pDC414-AMG954Asp92-Asn。maxipreps被测序并匹配100%。使用293(E)细胞瞬时转染Megapreps。培养细胞7天，并然后收获。使用蛋白A柱和标准技术从上清液纯化表达的抗体。
内切蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶肽谱
得到的分子然后被变性并还原，并且烷基化巯基。通过凝胶过滤使还原的烷基化分子脱盐，然后酶法去糖基化。然后用Lys-C或胰蛋白酶内切蛋白酶消化还原的烷基化去糖基化的分子。猝灭反应并通过乙腈/TFA梯度的反相HPLC分离得到的片段，针对Lys-C消化使用聚合物柱(Grace-Vydac，Deerfield，IL)，并且针对胰蛋白酶消化使用UPLCBEH酰胺柱(Waters，Milford，MA)。通过UV检测监测肽洗脱。如通过Lys-C肽谱检测的(帕尼单抗)D92异构化结果示于图1。
实施例2
结构模型
使用Molecular Operating Environment(MOE)软件(Chemical ComputingGroup，Montreal，Canada)分析(帕尼单抗)的结构。通过打破并形成MOE内必要的原子键来手工模拟异构化。使用被构建入MOE模拟软件的突变能力来模拟特定突变。结果示于图2。
实施例3
加速稳定性研究
在pH5.8的50mM乙酸钠和100mM氯化钠中、在37℃下进行(帕尼单抗)的稳定性研究，持续6个月。为了加速异构化，将突变体的缓冲液更换成pH5.0的10mM谷氨酸、2.6%w/v甘油，并经受持续4周的50℃下的升高温度。结果示于图3。
实施例4
生物测定
磷酸化生物测定.使用的磷酸化生物测定基于EGF受体的EGF诱导的酪氨酸磷酸化的检测。(帕尼单抗)结合EGF受体，抑制EGF结合并因此抑制受体磷酸化。表达细胞表面EGF受体的A431细胞在具有固定量的EGF和可变量的的纤维滴定板中孵育。裂解细胞，并将可溶性EGF受体捕获在用抗EGF受体抗体涂布的第二微量滴定ELISA板上。通过使用与HRP轭合的抗磷酸酪氨酸抗体、随后添加生色底物来检测磷酸化的EGF受体。然后使用吸光度板读数器测量颜色发生。通过平行线分析确定相对效价。
基因表达生物测定.32DMRE-1/S#13细胞作为悬浮培养物在含有GlutamaxTM(含有10%FBS、5ng/mLmIL-3、500ug/mLG418和700ug/mL潮霉素-B)的RPMI1640培养基中生长。准备细胞的测定烧瓶用于离心，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤以去除生长培养基组分。然后将细胞以8E+05个细胞/mL重悬于测定培养基(RPMI1640，含有GlutamaxTM，1%FBS)
将参考标准、对照和测试样品在测定培养基中稀释至440ng/mL。准备参考标准、对照和测试样品的连续稀释以产生440至87ng/mL的浓度范围。在制备这些稀释液之后，向每管添加等体积的固定浓度的TGF-α。添加细胞之后，测定孔中的终浓度是110至22ng/mL
测定使用四个96孔板和部分随机化的样品定位方案。向测定孔添加25μL与TGF-α加标液混合的每种连续稀释液。向仅有细胞的孔添加25μL测定培养基，以用作细胞空白。向仅有培养基的孔添加50μL测定培养基，以用作培养基空白。向背景孔添加25μLTGF-α加标对照(TGF-α加标对照)。然后，所有标准、对照样品、测试样品、背景和仅有细胞的孔接收25μL的8E+05个细胞/mL的32DMRE-1/S#13细胞悬液。然后将板在37℃/5%CO2加湿孵育箱中孵育3.5±0.5小时。
在孵育期之后，从孵育箱取出板，然后冷却至室温，持续10-20分钟。向每孔添加50μL(含有裂解细胞的去污剂和荧光素、荧光素酶底物的试剂混合物)。然后覆盖测定板以最小化光暴露，并在室温孵育30-120分钟。然后使用发光计定量发光信号。通过对比测试样品响应与使用参考标准获得的响应来确定测试样品活性。
使用平行线分析来分析数据。控制的电子表格(spreadsheet)以95%的置信限计算对照和每个测试样品与参考标准相比的相对效价。电子表格通过构建参考标准与对照和测试样品的方差分析(ANOVA)表来计算相对效价。一旦从样品的3次独立测定获得3个有效测定值，根据USP<111>使用控制的电子表格计算加权平均结果。
结果示于图4。

Claims (12)

1.一种抗体或其免疫功能片段，包含SEQ ID No. 3所示的轻链和SEQ ID No. 1所示的重链，其中所述抗体或其免疫功能片段减少EGFR与EGF的结合并且所述免疫功能片段为Fab、双抗体、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体或单链抗体。
2.权利要求1所述的抗体或其免疫功能片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1所述的抗体或其免疫功能片段，其中所述抗体是人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体。
4.一种抗体或其免疫功能片段，包含SEQ ID No. 4所示的轻链和SEQ ID No. 1所示的重链，其中所述抗体或其免疫功能片段减少EGFR与EGF的结合并且所述免疫功能片段为Fab、双抗体、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体或单链抗体。
5.权利要求4所述的抗体或其免疫功能片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求4所述的抗体或其免疫功能片段，其中所述抗体是人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体。
7.权利要求4所述的抗体或其免疫功能片段，其中所述抗体是人类抗体。
8.一种抗体或其免疫功能片段，包含含有跨SEQ ID No. 3的CDR 1-3的区域的轻链和SEQ ID No. 1所示的重链，其中所述抗体或其免疫功能片段减少EGFR与EGF的结合并且所述免疫功能片段为Fab、双抗体、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体或单链抗体。
9.一种抗体或其免疫功能片段，包含含有跨SEQ ID No. 4的CDR 1-3的区域的轻链和SEQ ID No. 1所示的重链，其中所述抗体或其免疫功能片段减少EGFR与EGF的结合并且所述免疫功能片段为Fab、双抗体、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体或单链抗体。
10.一种抗EGFR抗体，其包含SEQ ID No. 2的轻链和SEQ ID No. 1的重链，所述抗体在SEQ ID No. 2的位置92具有点突变，其中所述点突变是谷氨酸残基或天冬酰胺残基，其中所述抗体减少EGFR与EGF的结合。
11.一种药物组合物，包含至少一种根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其免疫功能片段或权利要求10的抗EGFR抗体和药学可接受的赋形剂。
12.权利要求11所述的药物组合物，还包含放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂或化疗剂。
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