JP2016527225A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)抗体を同定する方法に関する。本発明は、uPAに結合でき、uPA活性を低下又は阻害できる抗体にも関する。更に本発明は、治療用及び薬学的使用などのそのような抗体についての使用に関する。

Description

本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)抗体を同定する方法に関する。本発明は更に、uPAに結合でき、uPA活性を阻害又は遮断できる抗体に関する。更に本発明は、治療用及び薬学的使用などのそのような抗体の使用に関する。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)は、細胞外セリンプロテアーゼである。uPAは、以下の3個のドメインからなる:1)uPAのその受容体uPARへの結合を媒介する増殖因子ドメイン(GFD)、2)インテグリンと相互作用するとされているuPAのクリングルドメイン、及び3)uPAのタンパク質分解機能を媒介する触媒ドメイン。uPAの主なタンパク質分解機能は、不活性酵素前駆体プラスミノーゲン(Plg)を活性セリンプロテアーゼプラスミンに転換することである。uPAは、1本鎖酵素前駆体(sc-uPA)として生成され、これはLys158-Ile159ペプチド結合(付番はヒトsc-uPAに対応する)でエンドタンパク質分解性によって(endoproteolytically)切断され得る。生じた2本鎖形態のuPA(tc-uPA)は、単一のジスルフィド架橋によって結びつけられている。sc-uPAのタンパク質分解活性は、tc-uPAのものと比較して最小であるが、sc-uPAは、いくらかの内在性タンパク質分解活性を有する。uPAの触媒ドメインは、2個の構造的コンフォメーション、活性及び不活性コンフォメーションの平衡状態で存在する。sc-uPAでは触媒ドメインの不活性コンフォメーションが支持される。Lys158-Ile159ペプチド結合の加水分解は、これらの構造的コンフォメーション間の動的平衡が活性形態を支持するようにシフトする(Jiangら、Biochem. J. 449:161〜166頁、2013)。

健常な生物では、泌尿器及び胃腸管の外でのuPAの存在は、一般に循環顆粒球及びリモデリングを受けている組織におけるある種の細胞型に限定されている。疾患の際はuPAは、炎症性障害及びがん病変の部位にも見出される。動物実験は、がん及び関節炎疾患を含む炎症性障害におけるuPAの機能的役割を実証した。したがって、uPAに拮抗することは、がん並びに関節リウマチ及び乾癬性関節炎などの炎症性疾患の処置において望ましい。

特許文献US8062637及びWO03033009は、関節炎疾患におけるuPAの機能的役割についての実験的証拠を提供している。文献は、uPAに特異的に結合する抗体を含むアンタゴニストを対象に投与することを含む、対象における炎症性疾患の影響を回復させるための方法を更に記載している。文献US8062637及びWO03033009は、uPAに結合する抗体の使用可能性を記載しているが、いずれの文献もuPAに結合するいかなる抗体についてのデータも記載又は提供していない。

特許文献WO2006050177は、uPAのクリングルドメインに対応する86アミノ酸長エピトープに特異的である抗uPA抗体を同定するための方法及び炎症性疾患の処置のためのこれらの抗体の使用可能性を記載している。WO2006050177特許文献は、uPAに結合するいかなる抗体についてのデータも記載又は提供していない。更に、クリングルドメインに結合する抗体は、uPAのタンパク質分解特性が主に触媒ドメインに関連することから、uPAのタンパク質分解機能に影響を有さないことが予測されている。

特許文献WO2005048822は、uPAの増殖因子ドメイン(GFD)(ATN-292)及びクリングルドメイン(ATN-291)に特異的に結合する2個の抗uPA抗体、ATN-291及びATN-292を記載している。WO2005048822特許文献は、がん又は他の疾患の処置のためのこれらの抗体の使用可能性を更に記載している。GFD又はクリングルドメインのいずれかに結合する抗体は、uPAのタンパク質分解特性が主に触媒ドメインに関連することから、uPAのタンパク質分解機能に影響を有さないことが予測されている。

特許文献US5496549は、2つの特異性の内の1つが3種の抗uPA抗体、UK1-3、UK1-87及びUK1-6のいずれかによって付与されている二特異性抗体を記載している。他の特異性は、血小板表面タンパク質に向けられており、特許は血栓症又は他の心血管疾患の処置のための活性生物学的物質、この場合uPAを送達するためのこれらの二特異性抗体の使用可能性を更に記載している。3種の抗体のいずれもuPAのタンパク質分解活性を阻害しないが、血小板沈着の部位にuPAを送達又は濃縮するように設計されている。

上に記載のとおりuPAに結合する抗体は周知であり、炎症性疾患の処置におけるそれらの使用は想定されてきた。しかし今日までに、臨床試験に入った抗uPA抗体はない。そのため、例えば、炎症性疾患を有する患者又はがんを有する患者における使用のための治療用抗uPA抗体に対する未だ満たされていない必要性がまだある。

本明細書において、新規特徴を有する抗uPA抗体が開示されている。これらの抗体は、医薬品の開発のために好適である。そのような抗体は、がん又は炎症性疾患を有する個体の生活の質に大きな影響を有する可能性がある。

US8062637 WO03033009 WO2006050177 WO2005048822 US5496549 WO2005040219 米国特許出願第20050238646号 米国特許出願第20020161201号 EP404,097 WO93/11161 米国特許第5,677,425号

Jiangら、Biochem. J. 449:161〜166頁、2013 Lundら、J. Biol. Chem. 283:32506〜32515頁、2008 Kromann-Hansenら、2013, Biochemistry 52、7114〜7126頁 Botkjaerら、Biochem J. 438:39〜51頁、2011 Andreasenら、Cell Mol. Life Sci. 57:25〜40頁、2000 Ulisseら、Current Cancer Drug Targets、9:32〜71頁、2009 Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁 Birdら、Science 1988; 242:42S〜426頁 Hustonら、PNAS 1988; 85:5879〜5883頁 Illら、Protein Eng 1997; 10:949〜57頁 Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126〜1136頁 Cai & Garen、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93: 6280〜6285頁、1996 Desmyterら、J. Biol. Chem.、277: 23645〜23650頁、2002 Bondら、J. Mol. Biol. 2003; 332: 643〜655頁 Pluckthun、1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York、269〜315頁 Hollingerら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444〜6448頁 Zapataら、1995, Protein Eng., 8(10):1057〜1062頁 Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by Benny K. C. Lo Angalら、Mol Immunol. 199S; 30:105〜8頁 Kabatら、(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91〜3242 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901〜917頁 Computational Molecular Biology、Lesk、A. M.編、Oxford University Press、New York、1988 Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993 Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin, A. M., and Griffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994 Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987 Sequence Analysis Primer, Gribskov、M. and Devereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991 Carilloら、SIAM J. Applied Math. 48、1073 (1988) Devereuxら、Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis. Altschulら、J. Mol. Biol. 215、403〜410頁(1990) BLAST Manual, Altschulら、NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894 Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 89、10915〜10919頁(1992) Needlemanら、J. Mol. Biol. 48、443〜453頁(1970) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995 Coxら、Mult Scler 19:1268〜74頁、2013 Gur-Wahnonら、J Neuroinflammation 10:124、2013 Davenportら、Internat. Immunopharmacol 2:653〜672頁、2002 Baranら、J. Cell Mol. Med. 13:3797〜3808頁、2009 Belcherら、Ann. Rheum. Dis. 55:230〜236頁、1996 Bussoら、Ann. Rheum. Dis. 56:550〜557頁、1997 Rondayら、Br. J. Rheumatol. 35:416〜423頁, 1996 Cookら、Am. J. Pathol. 160:917〜926頁, 2002 Cookら、Arthritis Res. Ther. 12:R37, 2010 De Nardoら、Arthritis Res. Ther. 12:R199, 2010 Nieuwenhuizenら、Thromb Haemost 110:173〜183頁、2013 Yuら、Cancer Res. 50:7623〜76331頁、1990 Almholtら、Int. J. Cancer 113:525〜532頁、2005 Ossowski and Reich、Cell 35:611〜619頁、1983 Kobayashiら、Thromb. Haemost. 71 :474〜480頁、1994 Schweinitzら、J. Biol. Chem. 279:33613〜33622頁、2004 Hennekeら、Am. J. Respir. Crit Care Med. 181 :611〜619頁、2010 Petersen HHら、Eur J Biochem. 2001 Aug;268(16):4430〜9頁 Lin Lら、J Biol Chem. 2010 Apr 2;285(14):10982〜92頁 Wales and Engen、Mass Spectrom. Rev. 25、158 (2006) Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec、302、139〜148頁(2011) Freerら、1970, Biochemistry 9、1997〜2009 Huber & Bode 1978, Acc Chem Res 11、114〜122頁

本発明は、ヒトuPAに結合できる抗体又はその抗原結合断片であって、タンパク質分解性活性形態(proteolytically active form)のuPAのタンパク質分解活性を阻害し、タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへの1本鎖uPA(sc-uPA)の活性化を阻害することを特徴とする抗体又はその抗原結合断片に関する。この二重機能性を保有するヒトuPAに対して特異的な阻害性モノクローナル抗体が初めて同定された。これらの抗体は(活性)プラスミンによるuPAの酵素前駆体、sc-uPAの活性化を阻害し、同時に抗体は、(不活性)酵素前駆体プラスミノーゲンに対する2本鎖uPA(tc-uPA)のタンパク質分解活性を阻害する。それにより抗体は、sc-uPAとプラスミノーゲンとの間の相互酵素前駆体活性化ループの両方のタンパク質分解性反応を阻害し、タンパク質分解カスケード反応全体の更に強力な阻害を提供する。tc-uPAのタンパク質分解活性だけを阻害する抗体と比較する二重作用性(dual-acting)抗体の利益は、1セットのマウス抗体、mU1及びmU3によって例示される。二重作用性マウス抗体mU1は、mU3と比較してマウスuPAに結合する及びマウスtc-uPAのタンパク質分解機能を阻害する類似の能力を有するが、細胞に基づくアッセイ及びin vivoマウスモデルにおいてマウスuPA活性を機能的に阻害する優れた能力を有する(Lundら、J. Biol. Chem. 283:32506〜32515頁、2008)。これらの抗体は、マウスuPAに対して特異的であり、したがってヒトuPAに結合すると予測されておらず、したがって本出願の範囲における使用に好適ではない。それらは、本発明に記載の抗uPA抗体と同じ新規特徴のすべては有しておらず、医薬開発についての可能性を有さない。

数個の先行技術抗uPA抗体のヒトuPA又はマウスuPAでの結合部位は公表されている(Jiangら、2013, Biochem J 449、161〜166頁; Kromann-Hansenら、2013, Biochemistry 52、7114〜7126頁)。本発明者らは、ヒトuPAにおける新規エピトープに結合する二重作用性抗uPA抗体を記載し、この抗体がuPAの主要なドメイン:GFD、クリングル及び触媒ドメインの3個すべての中のアミノ酸を含むヒトuPAポリペプチド全体にわたる相乗的コンフォメーション変化を誘導することを実証する。新規エピトープ及び酵素を阻害する新規方法に加えて、このドメインスパンニングコンフォメーション変化も先例がない。

本発明の一態様では抗体は、受容体結合uPA及び非受容体結合uPAの両方に結合及び阻害できる。このことは、uPAの特定のタンパク質分解機能がuPA受容体、uPARへの結合に依存することが実証されている一方で、uPAの他のタンパク質分解機能がuPARに依存しないことが実証されていることから利益を付加する。特許文献WO03033009Aにおいて開示されたデータは、uPARに依存し、uPAのタンパク質分解活性にも依存すると考えられるマウス関節炎モデルにおけるuPAの役割を例示している。受容体結合uPA及び非受容体結合uPAの両方の機能を阻害する能力を有する抗体は、したがって、すべての形態のuPAがそのような抗体によって阻害されることから有利点を有し、本明細書に記載のとおり、いかなる所与のヒト疾患についてもuPAの疾患関連機能がどの程度uPARへの結合に依存するかは周知でない。sc-uPAの活性化を阻害し、同時に高親和性を有して受容体結合uPAに結合できる抗体を同定することは自明ではない。これは、sc-uPAの活性化を阻害できるが、非受容体結合sc-uPAと比較してuPARに結合するsc-uPAに結合する能力が10分の1に弱まっている文献において開示されている抗体、mAb-PUKによって例示されている(Botkjaerら、Biochem J. 438:39〜51頁、2011)。MAb-PUKは、tc-uPAの活性に影響を有さず、実施例14において実証する本発明において記載の抗uPA抗体と同じ新規特徴を有さない。

本発明の別の態様では抗体は、炎症性細胞において内因的に発現されたヒトuPAに結合及び阻害できる。これは、本発明の抗体が初代ヒトマクロファージにおいて内因的に発現されたuPAを阻害する下の実施例セクションの実施例9において例示されている。これは、疾患関連細胞型において存在する天然形態でuPAを阻害する抗体の能力を実証している。周知のuPA抗体が初代ヒトマクロファージにおいて内在性uPAを含むuPAのタンパク質分解活性を阻害できることは周知ではない。

本発明の別の態様では抗体は、ヒトuPAに結合及び阻害でき、並びに非ヒト霊長類uPAにも結合及び阻害できる。これは周知のuPA抗体が、カニクイザルなどの非ヒト霊長類由来のuPAに結合又は阻害することが周知でなく、周知の抗体が医薬品の開発のための前臨床研究において一般に使用される動物において検査され得ないことを意味することから、本発明の抗体に固有の利益を付加する。

本発明の抗uPA抗体は、1つ又は複数の自己免疫疾患及び/若しくは慢性炎症性疾患を有する個体、並びに/又はがんを有する個体の処置のための医薬品として使用され得る。したがって本発明は、1つ又は複数の自己免疫疾患及び/若しくは炎症性疾患を有する個体並びに/又はがんを有する個体の治療方法にも関する。

本発明は、抗uPA抗体を同定する方法にも関する。この免疫化及びスクリーニング方法は、本発明による二重作用性抗uPA抗体の同定を可能にするように設計された。二重作用性抗uPA抗体を同定する方法は、(a)抗uPA抗体を生成する工程;(b)工程(a)において生成された抗体から、tc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する抗体を同定する工程;(c)工程(a)において生成された抗体から、タンパク質分解性不活性形態からタンパク質分解性活性形態へのsc-uPAの活性化を阻害する抗体を同定する工程;並びに(d)(b)及び(c)の両方の工程において阻害性である抗体を選択する工程を含む。

Alexa647-コンジュゲート0266-0000-0010及び0266-0000-0015それぞれの、初代ヒトマクロファージへの容量依存的結合を示すフローサイトメトリー分析の図である。 0266-0000-0010及びhz0266-0000-0010抗体のVH、VL及びCDRアミノ酸配列を表す図である(より詳細には実施例13に記載)。 mAb 0266-0000-0043、還元(R)及び非還元(NR)のSDS-PAGEゲルを示す図である(実施例16を参照されたい)。 mAb 0266-0000-0043のSE-HPLC分析を示す図である(実施例16を参照されたい)。 共役酵素前駆体活性化アッセイの原理を示す図である(実施例16を参照されたい)。 共役酵素前駆体活性化アッセイにおけるヒトuPAのmAb rec0266-0000-0010による阻害を示す図である(実施例16を参照されたい)。 共役酵素前駆体活性化アッセイにおけるヒトuPAのmAb 0266-0000-0043による阻害を示す図である(実施例16を参照されたい)。 共役酵素前駆体活性化アッセイにおけるカニクイザルuPAのmAb rec0266-0000-0010による阻害を示す図である(実施例16を参照されたい)。 共役酵素前駆体活性化アッセイにおけるカニクイザルuPAのmAb 0266-0000-0043による阻害を示す図である(実施例16を参照されたい)。

配列の簡単な説明
配列番号1は組換えヒトsc-uPAのアミノ酸配列を表す。
配列番号2は組換えヒトsc-uPAのDNA配列を表す。
配列番号3は野生型カニクイザルsc-uPAのアミノ酸配列を表す。
配列番号4は野生型カニクイザルsc-uPAのDNA配列を表す。
配列番号5は0266-0000-0015のVH配列を表す。
配列番号6は0266-0000-0015のVL配列を表す。
配列番号7は0266-0000-0010のVH配列を表す。
配列番号8は0266-0000-0010のVL配列を表す。
配列番号9は0266-0000-0010のCDR-H1配列を表す。
配列番号10は0266-0000-0010のCDR-H2配列を表す。
配列番号11は0266-0000-0010のCDR-H3配列を表す。
配列番号12は0266-0000-0010のCDR-L1配列を表す。
配列番号13は0266-0000-0010のCDR-L2配列を表す。
配列番号14は0266-0000-0010のCDR-L3配列を表す。
配列番号15はVH3_21/JH4配列を表す。
配列番号16はV6D_41/JK4配列を表す。
配列番号17はhz0266-0000-0010のVH配列を表す。
配列番号18はhz0266-0000-0010のVL配列を表す。
配列番号19はrec0266-0000-0010の重鎖配列を表す。
配列番号20はrec0266-0000-0010の軽鎖配列を表す。
配列番号21は0266-0000-0043の重鎖配列を表す。
配列番号22は0266-0000-0043の軽鎖配列を表す。
配列番号23はrec0266-0000-0010の重鎖についてのDNA配列を表す。
配列番号24はmAb rec0266-0000-0010の軽鎖についてのDNA配列を表す。
配列番号25はmAb 0266-0000-0043の重鎖についてのDNA配列を表す。
配列番号26はmAb 0266-0000-0043の軽鎖についてのDNA配列を表す。

一態様では本発明は、ヒトuPAに結合できる抗体又はその抗原結合断片であって、tc-uPAのタンパク質分解活性を阻害し、タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害することを特徴とする抗体又はその抗原結合断片を提供する。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA):
uPAは、411アミノ酸(配列番号1)を含有する細胞外セリンプロテアーゼである(Andreasenら、Cell Mol. Life Sci. 57:25〜40頁、2000; Ulisseら、Current Cancer Drug Targets、9:32〜71頁、2009)。uPAは、以下の3個のドメインからなる:1)uPAのその細胞表面結合受容体uPARへの結合を媒介するN末端増殖因子様ドメイン(GFD)、2)インテグリンと相互作用するとされているuPAのクリングルドメイン、及び3)uPAのタンパク質分解活性を媒介するC末端触媒ドメイン。uPAは、1本鎖酵素前駆体(sc-uPA)として生成され、これはLys158-Ile159ペプチド結合(付番はヒトsc-uPAに対応する)でエンドタンパク質分解性によって切断され得る。生じた2本鎖形態のuPA(tc-uPA)は、単一のジスルフィド架橋によって結びつけられている。sc-uPAのタンパク質分解活性は、tc-uPAのものと比較して最小であるが、sc-uPAは、いくらかの内在性タンパク質分解活性を有する。uPAの触媒ドメインは、2個の構造的コンフォメーション、活性及び不活性コンフォメーションの平衡状態で存在する。sc-uPAでは触媒ドメインの不活性コンフォメーションが支持される。Lys158-Ile159ペプチド結合の加水分解により、これらの構造的コンフォメーション間の動的平衡が活性形態を支持するようにシフトする(Jiangら、Biochem. J. 449:161〜166頁、2013)。uPAの主なタンパク質分解機能は、不活性酵素前駆体プラスミノーゲン(Plg)を活性セリンプロテアーゼプラスミンに転換することである。プラスミノーゲンは、血漿中に約2μMで存在する肝臓分泌酵素前駆体であり、間質腔全体に高濃度で細胞外にも存在する。次いでプラスミンは、sc-uPAの最も強力な活性化因子であり、sc-uPAとプラスミノーゲンとの間にいわゆる相互酵素前駆体活性化ループを形成する。sc-uPA及びtc-uPAの両方は、uPA活性の空間的制約に寄与するグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー細胞表面受容体uPAR(CD87)にナノモル以下の親和性で結合できる。酵素活性化の時間的及び空間的制御に加えて、uPA及びプラスミンの活性は、それらの内在性阻害物質プラスミノーゲン活性化因子阻害因子-1(PAI-1)及びα2-抗プラスミン(α2-AP)それぞれによって更に調和が保たれている。これらのセリンプロテアーゼ阻害物質(セルピン)は、それらの同族プロテアーゼと不可逆的共有結合複合体を形成する。

定義
uPA:
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びuPAという用語は本明細書において互換的に使用され、任意の好適な生物に由来し得る、天然に存在する、内因的に産生された及び/又は組換え形態の任意のuPAを包含する。例えばuPAは、1本鎖酵素前駆体形態(sc-uPA)及び2本鎖活性形態(tc-uPA)であってよい。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びuPAという用語は更に、不活性及び活性コンフォメーションの触媒ドメインを含むsc-uPA及びすべての構造的コンフォメーションのtc-uPAを包含する。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びuPAという用語は、受容体結合及び非受容体結合形態のuPAの両方、並びに細胞の表面に見出されるuPA又は細胞内に見出されるuPAを含む任意の細胞内位置でのuPAを包含する。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びuPAという用語は更に、任意の前駆体形態のuPA及び任意の分解形態のuPAを包含する。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びuPAという用語は更に、ヒトuPA又は、霊長類(例えばチンパンジー、カニクイザル又はアカゲザル);げっ歯類(マウス又はラットなど)、ウサギ類(ウサギなど)又は偶蹄類(ウシ、ヒツジ、ブタ若しくはラクダなど)由来のuPAなどの哺乳動物由来uPAなどの別の種由来のuPAを包含する。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びuPAという用語は更に、組換えによって生成されたuPAを包含する。これは、これだけに限らないが哺乳動物細胞系又は細菌又は酵母において発現されたタンパク質を含む「組換え遺伝子技術によって生成された」任意のuPAを含む。

「組換え」という用語は、組換えによって生成されたタンパク質がタンパク質の天然に存在する形態に可能な限り近いことから、天然に存在する形態と比べて変更されたタンパク質を意味しない。本出願において使用される「組換え」という用語は、したがってタンパク質の野生型及び変異体形態に適用される。

1本鎖uPA(sc-uPA):
1本鎖uPA(sc-uPA)という用語は、本明細書において、(ヒトsc-uPAの)Lys158-Ile159ペプチド結合でのタンパク質分解性切断に供されていない1本鎖411アミノ酸酵素前駆体形態(又はpro-形態)のヒトuPAを意味して使用される。sc-uPAは、文献においてsc-uPA又はpro-uPAのいずれでも互換的に称される。sc-uPAという用語は更に、触媒ドメインの不活性及び活性コンフォメーションを含むすべての構造的コンフォメーションのsc-uPAを包含する。sc-uPAという用語は更に、受容体結合及び非受容体結合形態のsc-uPAの両方を包含する。sc-uPAという用語は、ヒト及び他の関連する種を含むすべての種由来のsc-uPAを包含する。

2本鎖uPA(tc-uPA):
2本鎖uPA(tc-uPA)という用語は、本明細書において、(ヒトsc-uPAの)Lys158-Ile159ペプチド結合でのタンパク質分解性切断に供された2本鎖形態のヒトuPAを意味して使用される。tc-uPAという用語は更に、触媒ドメインの不活性及び活性コンフォメーションを含むすべての構造的コンフォメーションのtc-uPAを包含する。tc-uPAという用語は更に、受容体結合及び非受容体結合形態のtc-uPAの両方を包含する。tc-uPAという用語は、ヒト及び他の関連する種を含むすべての種由来のtc-uPAも包含する。

不活性形態のuPA:
「不活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性不活性uPA」又は「不活性uPA」という用語は、タンパク質分解性が不活性であり、又は顕著に低下したタンパク質分解活性(すなわち陰性対照と比べてタンパク質分解活性の50%、60%、70%、80%、85%、90%又は95%低下)を有するすべての形態のuPAを意味して本明細書において使用される。「不活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性不活性uPA」又は「不活性uPA」という用語は更に、sc-uPA及びtc-uPAの両方を包含し、ただし、これらの形態のuPAはタンパク質分解性が不活性な状態にある又は顕著に低下したタンパク質分解活性を有する。「不活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性不活性uPA」又は「不活性uPA」という用語は更に、すべての構造的コンフォメーションのuPAを包含し、ただし、uPAのこれらの構造的コンフォメーションはタンパク質分解性が不活性であり、又は顕著に低下したタンパク質分解活性を有する。「不活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性不活性uPA」又は「不活性uPA」という用語は更に、受容体結合及び非受容体結合形態のuPAの両方を包含する。「不活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性不活性uPA」又は「不活性uPA」という用語は更に、ヒト及び他の関連する種を含むすべての種由来のuPAを包含する。

活性形態のuPA:
「活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性活性uPA」又は「活性uPA」という用語は、タンパク質分解性が活性であり、顕著に低下したタンパク質分解活性を有さないuPAのすべての形態を意味して本明細書において使用される。「活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性活性uPA」又は「活性uPA」という用語は更に、sc-uPA及びtc-uPAの両方を包含し、ただし、これらの形態のuPAは、タンパク質分解性が活性な状態にあり、又は顕著に低下したタンパク質分解活性(すなわち陰性対照と比べてタンパク質分解活性の50%、60%、70%、80%、85%、90%又は95%低下)を有さない。「活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性活性uPA」又は「活性uPA」という用語は更に、すべての構造的コンフォメーションのuPAを包含し、ただし、これらの構造的コンフォメーションのuPAは、タンパク質分解性が活性であり、顕著に低下したタンパク質分解活性を有さない。「活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性活性uPA」又は「活性uPA」という用語は更に、受容体結合及び非受容体結合形態のuPAの両方を包含する。「活性形態のuPA」又は「タンパク質分解性活性uPA」又は「活性uPA」という用語は更に、ヒト及び他の関連する種を含むすべての種由来のuPAを包含する。

二重作用性抗uPA抗体:
本発明の抗uPA抗体の重要な一態様は、それらの二重作用機序であり、本明細書において「二重作用性」抗体と称される。本発明の抗体は、ヒトtc-uPAのタンパク質分解活性及びタンパク質分解性不活性形態のヒトuPAからタンパク質分解性活性形態のヒトuPAへのヒトsc-uPAの活性化の両方を阻害する。

sc-uPAの活性化:
本発明は、タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害する抗体を記載する。sc-uPAの活性化は、文献において完全には記載されていない複数工程プロセスである。以下は、sc-uPAの活性化に関与する工程の包括的な記載として解釈されるべきではない:sc-uPAの活性化に関与する工程の内の1つは、sc-uPAと、sc-uPAが基質である別のプロテアーゼとの間のタンパク質タンパク質相互作用である。そのようなプロテアーゼの非排他的例は、プラスミンである。sc-uPAの活性化の別の工程は、いわゆる活性化ループ内に位置付けられている(ヒトsc-uPAの)Lys158とIle159との間の単一のペプチド結合のエンドタンパク質分解性切断である。uPAの活性化の別の工程は、触媒ドメイン内に位置付けられた活性化ポケットと呼ばれる疎水性ポケットへの新たに形成されたN末端の挿入である。uPAの活性化における別の工程は、三次元構造中のいくつかの可動性ループ領域によって特徴付けられるコンフォメーションから構造的に更に緻密なコンフォメーションへの触媒ドメインの構造変化である。4個のセグメントは、sc-uPAを含むセリンプロテアーゼの活性化における顕著なコンフォメーション変化に関与するとして定義されている。これら4個のセグメントは、活性化ループ、自己分解ループ、オキシアニオン安定化ループ及びS1エントランスフレームと名付けられている。

本発明に記載のuPAに結合する抗体は、周知ではない又は上に記載されていない工程を含むsc-uPAの活性化における1つ又は複数の工程を阻害する可能性がある。例として本発明に記載の抗体は、Lys158-Ile159ペプチド結合を切断するために必要なsc-uPAとプロテアーゼとの間のタンパク質タンパク質相互作用を遮断することによって、sc-uPAの活性化を阻害できる。別の例としてそのような抗体は、Lys158-Ile159ペプチド結合に結合する又は接近し(例えば10、5、2又は1アミノ酸未満)、それによりこのペプチド結合を切断から保護することによってsc-uPAの活性化を阻害できる。別の例としてそのような抗体は、触媒ドメインの疎水性活性化ポケットへの新たに形成されたN末端の挿入を阻害することによってuPAの活性化を阻害できる。別の例としてそのような抗体は、不活性から活性構造的コンフォメーションへの転移に関与するコンフォメーション変化を阻害することによってuPAの活性化を阻害できる。

本明細書の実施例セクションの実施例8は、発色uPA基質を使用してuPAの触媒活性を測定する工程によってsc-uPAのこの活性化を阻害する抗体を同定する1つの具体的な方法を記載している。

tc-uPAの活性:
本発明は、tc-uPAの活性を阻害する抗体を記載する。本内容におけるtc-uPAの活性は、天然及び合成基質に対するtc-uPAのタンパク質分解活性を指す。そのような基質の非排他的例は、プラスミノーゲンである。tc-uPAの活性は、文献において完全には記載されていない複数工程プロセスである。以下は、tc-uPAのタンパク質分解活性に関与する工程の包括的な記載として解釈されるべきではない。tc-uPAのタンパク質分解活性に関与する工程の内の1つは、tc-uPAと、tc-uPAについての基質として作用できるタンパク質との間のタンパク質タンパク質相互作用である。tc-uPAの活性についての別の必要要件は、tc-uPAの触媒部位への接近である。tc-uPAの活性のための別の必要要件は、触媒ドメインの構造的に緻密なコンフォメーションの安定性である。セリンプロテアーゼの活性化の際に顕著なコンフォメーション変化を受ける4個のセグメントは、tc-uPAの活性のために重要であると考えられている。これら4個のセグメントは、活性化ループ、自己分解ループ、オキシアニオン安定化ループ及びS1エントランスフレームと名付けられている。tc-uPAの活性のための別の必要要件は、tc-uPAの触媒部位に結合する基質の放出である。

本発明に記載のuPAに結合する抗体は、周知ではない又は上に記載されていない工程及び/又は必要要件を含むtc-uPAの活性のための1つ又は複数の工程及び/又は必要要件を阻害できる。例として本発明に記載の抗体は、tc-uPAとtc-uPAについての基質として作用できるタンパク質との間のタンパク質タンパク質相互作用を遮断することによってtc-uPAの活性を阻害できる。別の例としてそのような抗体は、tc-uPAの触媒部位への接近を遮断することによってtc-uPAの活性を阻害できる。別の例としてそのような抗体は、プロテアーゼを抗体(陰性対照)の不在下でのtc-uPAと比較してあまり活性ではなくする(すなわち陰性対照と比べたタンパク質分解活性の50%、60%、70%、80%、85%、90%若しくは95%低下)又は不活性にするコンフォメーション変化をtc-uPAにおいて誘導することによってtc-uPAの活性を阻害できる。別の例としてそのような抗体は、tc-uPAの触媒部位に結合する基質の放出を阻害することによってtc-uPAの活性を阻害できる。

uPAのタンパク質分解活性を測定する既に公表及び認識された機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例5、6、7及び8は、発色アッセイの具体的な応用を記載している。

阻害する/阻害/阻害性:
本明細書において使用される「阻害する/阻害/阻害性」という用語は、対照と比較した活性又は特性のレベルにおける統計的に有意な低下を指す。

本発明の抗体は、tc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する。例示的低下は、50から100%であり、したがって陰性対照、例えば抗体省略対照又はアイソタイプ合致無関係抗体対照と比べてタンパク質分解活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%又は95%低下を含む。広く認められているタンパク質分解活性を測定する機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例5、6及び7は、発色アッセイの具体的な応用を記載している。本明細書で抗uPA抗体は、抗体を阻害するための最も高い抗体濃度で80%〜100%に常に達する阻害のレベルのIC₅₀値を決定するための通常の合理的な濃度範囲内のいくつかの異なる濃度において検査された。

一実施形態では本発明の抗体は、tc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する。他の実施形態では本発明の抗体は、sc-uPAの活性化も阻害する。

本発明の抗体は、タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害する。例示的低下は、50から100%であり、したがって陰性対照と比べて、例えば抗体省略対照又はアイソタイプ合致無関係抗体対照と比べて活性化率の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%又は95%低下を含む。活性化画分を測定する機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA基質を含む。本明細書の実施例セクションの実施例8は、発色uPA基質を使用してuPAの触媒活性を測定することによってsc-uPAのこの活性化を阻害する抗体を同定するための具体的な方法を記載している。本明細書で抗uPA抗体は、抗体を阻害するための最も高い抗体濃度で80%〜100%に常に達する阻害のレベルのIC₅₀値を決定するための通常の合理的な濃度範囲内のいくつかの異なる濃度において検査された。

uPARへのuPAの結合:
一実施形態では本発明の抗体は、受容体結合及び非受容体結合形態のuPAの両方に結合できる。uPAは、uPA受容体(uPAR又はCD87)にナノモル以下の親和性で結合できる。この相互作用は、uPAのGFDドメインを通じて主に媒介される。天然に存在するuPARは、いくつかの形態で存在する。例としてuPARは、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して細胞表面に付着できる。別の例として、全長及び短縮形態を含むいくつかの形態の可溶性uPAR(suPAR)が実証された。別の例として、細胞表面結合形態及び可溶性形態を含む短縮形態のuPARが実証された。細胞表面結合全長形態及び可溶性全長形態のuPARを含む全長形態のuPARは、uPAに対して高親和性を有する。短縮形態のuPARは、uPAに対して高親和性、低親和性又は親和性がほとんどないことを含んでuPAに対して変化しやすい親和性を有する。

受容体結合uPA:
「受容体結合uPA」及び「uPAR結合uPA」という用語は、細胞表面に結合している又は可溶性形態で存在するuPARを含む、任意の変種型のuPAR又はuPARに結合しているすべての形態のuPAを意味して本明細書において互換的に用いられる。受容体結合uPAという用語は更に、sc-uPA及びtc-uPAの両方を包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合している。受容体結合uPAという用語は更に、すべての構造的コンフォメーションのuPAを包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合している。受容体結合uPAという用語は更に、活性形態及び不活性形態のuPAを含むすべての形態のuPAを包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合している。受容体結合uPAという用語は更に、ヒト及び他の関連する種を含むすべての種由来のuPAを包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合している。

uPAR固定化uPAのタンパク質分解活性を測定する既に公表及び認識された機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例6:「共役酵素前駆体活性化アッセイにおけるuPAR受容体固定化sc-uPA」は、発色プラスミン基質を使用するuPAR固定化uPAのタンパク質分解活性を測定する具体的な方法を記載している。本明細書で抗体は、uPAがuPARに結合する場合でさえ阻害性であるはずである。

非受容体結合uPA:
「非受容体結合uPA」という用語は、細胞表面に結合している又は可溶性形態で存在するuPARを含む、任意の変種形態のuPAR又はuPARにも結合していないすべての形態のuPAを意味して本明細書において使用される。非受容体結合uPAという用語は更に、sc-uPA及びtc-uPAの両方を包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合していない。非受容体結合uPAという用語は更に、すべての構造的コンフォメーションのuPAを包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合していない。非受容体結合uPAという用語は更に、活性形態及び不活性形態のuPAを含むすべての形態のuPAを包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合していない。非受容体結合uPAという用語は更に、ヒト及び他の関連する種を含むすべての種由来のuPAを包含し、ただし、これらの形態はuPARに結合していない。

抗uPA抗体を同定する方法:
一態様では本発明は、二重作用性抗uPA抗体を同定する方法を提供する。本発明による抗uPA抗体を同定する方法は、(a)抗uPA抗体を生成する工程;(b)工程(a)において生成された抗体からtc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する抗体を同定する工程;(c)工程(a)において生成された抗体から、タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害する抗体を同定する工程;並びに(d)(b)及び(c)の両方の工程において阻害性である抗体を選択する工程を含む。

本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法の工程(a)、すなわち抗uPA抗体を生成する工程は、当技術分野において周知の方法により行われてよい。例えば抗uPA抗体は、これだけに限らないが、種々の動物宿主において及びファージディスプレイ、細菌性ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ又はリボソーム若しくはmRNAディスプレイを使用して生成されてよい。本明細書の実施例セクションの実施例3は、マウスにおいて抗uPA抗体を生成する具体的な方法を記載している。

本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法の工程(b)、すなわちtc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する抗体を同定する工程は、当技術分野において周知の方法により行われてよい。uPAのタンパク質分解活性を測定する既に公表及び認識された機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例5、6及び7は、発色アッセイの具体的な応用を記載している。

本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法の工程(c)、すなわちタンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害する抗体を同定する工程は、当技術分野において周知の方法により行われてよい。sc-uPAから活性形態のuPAへの活性化を測定する既に公表及び認識された機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例8は、発色uPA基質を使用するuPAの触媒活性を測定することによってsc-uPAのこの活性化を阻害する抗体を同定する具体的な方法を記載している。

本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法の工程(d)、すなわち工程(b)及び(c)の両方の工程において阻害性である抗体を選択する工程は、sc-uPAから活性形態のuPAへの活性化を阻害し、更にはtc-uPAのタンパク質分解活性も阻害する抗体を選択することによって行われる。工程(b)においてタンパク質分解活性の少なくとも50%を阻害する(50から100%、したがって陰性対照、例えば抗体省略対照又はアイソタイプ合致無関係抗体対照と比べて活性化率の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%又は95%低下を含む、及び工程(c)において活性化の少なくとも50%を阻害する(例示的低下は50から100%であり、したがって陰性対照(例えば抗体省略対照又はアイソタイプ合致無関係抗体対照)と比べて活性化率の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%又は95%低下を含む、抗uPA抗体だけが選択される。本明細書の実施例セクションの実施例5、6、7及び8は、これらの酵素のための発色基質を使用するuPA又はプラスミンの触媒活性を測定することによって、sc-uPAの活性化及びuPAのタンパク質分解活性の両方を阻害する抗体を同定する固有の方法を記載している。

一実施形態では、本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法は、uPAがuPARに結合している場合でさえ阻害性である抗uPA抗体を同定する工程を更に含む。uPAR固定化uPAのタンパク質分解活性を測定する既に公表及び認識された機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例6:「共役酵素前駆体活性化アッセイにおけるuPAR受容体固定化sc-uPA」は、プラスミンのための発色基質を使用するuPAR固定化uPAのタンパク質分解活性を測定する具体的な方法を記載している。本明細書で抗体は、uPAがuPARに結合している場合でさえuPAの酵素活性を阻害するそれらの能力について検査される。

別の実施形態では本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法は、内因的性由来uPAを阻害する工程を更に含む。自己免疫若しくは炎症性疾患において又はがんにおいて、免疫細胞は、炎症の部位に遊走及び浸潤する場合がある。これらの細胞は、組織の炎症による疾患の初期及び後期ステージの両方において主要な役割を演じる場合があり、uPAは最終的には疾患進行を支持する組織リモデリングを生じる。関節リウマチの場合ではマクロファージは、uPAのそれらの内在性産生を通じて中心的であると考えられている。したがって本明細書に記載の抗uPA抗体は、マクロファージによって産生されたuPAを阻害できるはずである。本明細書の実施例セクションの実施例9:内因的性由来uPAを阻害する抗体は、M1/M2マクロファージからの内因的性由来uPAのタンパク質分解活性を測定する具体的及び固有の方法を記載している。

別の実施形態では本発明による二重作用性抗uPA抗体を同定する方法は、ヒトuPAに結合及び阻害することに加えて、他の種由来のuPAに結合及び阻害もする抗体を同定する工程を更に含む。代替抗体の使用を回避し、候補抗体を直接毒性研究に使用することは明らかに有利である。ヒトuPAのタンパク質分解活性を測定する既に公表及び認識された機能性アッセイは、Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁に記載の発色及び蛍光発生uPA/プラスミン基質に基づくアッセイを含む。本明細書の実施例セクションの実施例5は、カニクイザル由来uPAのタンパク質分解活性を測定する発色アッセイの代替的使用を記載している。

抗体:
本明細書の「抗体」という用語は、生殖系列免疫グロブリン配列由来で、抗原又はその部分に結合できるタンパク質を指す。抗体という用語は、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及び/又はIgYである任意のクラス(又はアイソタイプ)の全長抗体を含む。抗原又はその部分に結合する抗体は、その抗原若しくはその部分に特異的に又は排他的に結合できる或いはそれは、限定された数の相同性抗原(交差反応)又はその部分に結合できる。

本発明のいくつかの実施形態では抗体は、ヒトuPAに結合及び阻害でき、非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、カニクイザル又はアカゲザル);げっ歯類(マウス若しくはラットなど)、ウサギ類(ウサギなど)又は偶蹄類(ウシ、ヒツジ、ブタ若しくはラクダなど)由来uPAなどの他の哺乳動物uPAなどの別の種由来のuPAにも結合及び阻害できる。

本発明の具体的な実施形態では抗体は、ヒトuPAに結合でき、非ヒト霊長類uPA(例えばチンパンジー、カニクイザル又はアカゲザル)にも結合できる。

本明細書において使用される「特異的に結合」及び「特異的結合」という用語は、化合物又は抗体が、具体的なエピトープ、アイソフォーム、オルソログ(種)又はuPAの変種、例えばヒトuPAを排他的又は選択的に認識し、結合することを意味する。本発明の抗体は、ヒト以外の他の種(カニクイザルなど)のuPAに結合し、したがって特異的なヒトuPA結合抗体ではない。

天然全長抗体は、少なくとも4本のポリペプチド鎖:ジスルフィド結合によって繋がれた重(H)鎖2本及び軽(L)鎖2本を通常含む。いくつかの場合では、ラクダにおいて見出される重鎖だけの抗体(VHH断片)及び軟骨魚綱(Chondrichthyes)において見出されるIgNARの場合のとおり天然抗体は、4本より少ない鎖を含む。詳細な薬学的目的の免疫グロブリンのクラスの1つはIgGである。ヒトではIgGクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて4個のサブクラスIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4に更に分類できる。軽鎖は、それらの配列組成における差異に基づいて2つの型、カッパ及びラムダ鎖に分類できる。IgG分子は、2つ以上のジスルフィド結合によって連結された2本の重鎖、及びジスルフィド結合によって重鎖にそれぞれ付着された2本の軽鎖からなる。IgG重鎖は、重鎖可変領域(VH)及び3つまでの重鎖定常(CH)領域:CH1、CH2及びCH3を含んでよい。軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域(CL)を含んでよい。VH及びVL領域は、より保存されたフレームワーク領域(FR)と名付けられる領域に組み入れられた、相補性決定領域(CDR)又は高頻度可変領域(HvR)と名付けられる超可変性の領域に更に分類できる。VH及びVL領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された、典型的には3つのCDR及び4つのFRからなる。重鎖及び軽鎖の高頻度可変性領域を含む可変ドメインは、抗原と相互作用できる「結合」ドメインを形成するが、一方抗体の定常領域は、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介でき、これだけに限らないが免疫系の種々の細胞(エフェクター細胞)、Fc受容体及び古典的補体系のC1複合体の第一成分(C1q)を含む。

本発明の抗体は、それらが単一のB細胞から又はB細胞のクローン集団によって発現される一連の固有の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を表す意味でモノクローナル抗体であってよい。本発明の抗体は、当業者に周知である種々の方法を使用して産生及び精製できる。例えば抗体は、融合細胞から産生されてよい。抗体は、B細胞増殖によって産生されてよい。抗体又はその断片は、哺乳動物又は微生物発現系において、又はin-vitro翻訳によって組換えによって発現されてよい。抗体又はその断片は、例えばファージディスプレイ、細菌性ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ又はリボソーム若しくはmRNAディスプレイの手段によって、細胞表面結合分子として組換えによって発現されてもよい。

本発明の抗体は、単離されてよい。「単離された抗体」という用語は、それが産生された環境中の(1つの)他の構成成分(複数可)から分離された及び/若しくは回収された、並びに/又はそれが産生された環境に存在する構成成分の混合物から精製された抗体を指す。

抗体のある種の抗原結合断片は、抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって実施され得ることが示されたことから、本発明の内容において好適である場合がある。抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書に記載のuPA又は別の標的分子などの抗原に結合する能力を保持している抗体の1つ又は複数の断片を指す。抗原結合断片の例は、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(典型的には抗体の単一の腕のVL及びVHドメイン)、1本鎖Fv(scFv;例えばBirdら、Science 1988; 242:42S〜426頁及びHustonら、PNAS 1988; 85:5879〜5883頁を参照されたい)、dsFv、Fd(典型的にはVH及びCHIドメイン)、並びにdAb(典型的にはVHドメイン)断片;VH、VL、VhH及びV-NARドメイン;単一のVH及び単一のVL鎖を含む一価分子;ミニボディ(minibody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)並びにカッパボディ(kappa body)(例えば、Illら、Protein Eng 1997; 10:949〜57頁を参照されたい);ラクダIgG;IgNAR;並びに、機能性抗体断片を形成するように単離されたCDR又は抗原結合残基又はポリペプチドが互いに会合又は連結される場合がある1つ又は複数の単離されたCDR又は機能性パラトープ、を含む。抗体断片の種々の種類は、例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126〜1136頁; WO2005040219、及び公開された米国特許出願第20050238646号及び第20020161201号に記載又は概説されている。これらの抗体断片は、従来の当業者に周知の技術を使用して得ることができ、断片は未処置抗体と同じやり方で有用性についてスクリーニングされてよい。

「Fab」及び「F(ab')2」断片を含む抗体の「Fab断片」は、抗体の重鎖に繋がれているヒンジシステイン残基のN末端又はC末端側のヒンジ領域中の重鎖の切断によって前記抗体に由来する。「Fab」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメイン並びに重鎖の可変ドメイン及び第1の定常ドメイン(CH1)を含む。「F(ab')2」断片は、それらのヒンジシステインによって共有結合的に一般に連結されている一対の「Fab'」断片を含む。Fab'は、形式的には、F(ab')2中の重鎖を繋いでいるヒンジジスルフィド結合の切断によってF(ab')2断片に由来する。抗体断片のジスルフィド連結以外の化学的カップリングも当技術分野において周知である。Fab断片は、潜在的には低い親和性でその抗原に結合する親抗体の能力を保持している。F(ab')2断片は、二価結合である場合があるが、一方Fab及びFab'断片は一価的に結合できる。一般にFab断片は、Fc受容体との相互作用が生じる定常CH2及びCH3ドメイン、すなわちFc部分を欠失している。したがってFab断片は、一般にエフェクター機能を欠いている。Fab断片は、例えばFabを得るためのパパイン又はF(ab')2を得るためのペプシンを使用する抗体の酵素切断によってのいずれかにより当技術分野において周知の方法によって産生でき、Fab、Fab'、F(ab')2を含むFab断片は、当業者に十分周知の技術を使用して組換えによって産生できる。

「Fv」断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片であり、一般に1つの重鎖及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体を天然で共有結合性であってよい関連、例えば1本鎖可変ドメイン断片(scFv)で含む。この立体配置では、各可変ドメインの3個の高頻度可変性領域は、VH-VL二量体の表面の抗原結合部位を明確にするように相互作用する。合わせて6個の高頻度可変性領域又はそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、抗原に特異的な3個だけの高頻度可変性領域を含む単一の可変ドメインでさえ、結合部位全体よりも通常低い親和性であるが抗原を認識し、結合する能力を保持できる(Cai & Garen、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93: 6280〜6285頁、1996)。例えば、重鎖可変ドメイン(VHH)だけを有する天然に存在するラクダ抗体は抗原に結合できる(Desmyterら、J. Biol. Chem.、277: 23645〜23650頁、2002; Bondら、J. Mol. Biol. 2003; 332: 643〜655頁)。

「1本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは、1本鎖ポリペプチド鎖で存在する。一般にFvポリペプチドは、抗原結合のために望ましい構造を形成するscFvを可能にするVHとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含む。scFvの概説について、Pluckthun、1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York、269〜315頁を参照されたい。

「ダイアボディ」という用語は、断片が同じポリペプチド鎖(VH及びVL)中の軽鎖可変ドメイン(VL)に繋がれている重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指す。同じ鎖における2つの可変ドメイン間を対合するには短すぎるリンカーを使用することによって、可変ドメインは別の鎖の相補性ドメインと対合するように仕向けられ、2つの抗原結合部位を作る。ダイアボディは、例えばEP404,097;WO93/11161;及びHollingerら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444〜6448頁において更に十分に記載されている。

「直鎖状抗体」という表現は、Zapataら、1995, Protein Eng., 8(10):1057〜1062頁に記載の抗体を指す。簡潔にはこれらの抗体は一対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を相補性軽鎖ポリペプチドと共に含有し、一対の抗原結合領域を形成する。直鎖状抗体は二特異性又は単一特異性であってよい。

本明細書において使用される「モノボディ(monobody)」という用語は、重鎖可変ドメインを有し、軽鎖可変ドメインを有さない抗原結合分子を指す。モノボディは、軽鎖の不在下でも抗原に結合でき、典型的には3個の高頻度可変性領域、例えばCDRH1、CDRH2及びCDRH3と名付けられたCDRを有する。重鎖IgGモノボディは、ジスルフィド結合によって繋がれた2個の重鎖抗原結合分子を有する。重鎖可変ドメインは、1つ又は複数の高頻度可変性領域、好ましくはCDRH3又はHVL-H3領域を含む。

抗体断片は、従来の組換え又はタンパク質操作技術を使用して得られてよく、断片は無処理抗体と同じやり方でヒトuPAへの結合、又は別の機能についてスクリーニングされてよい。

本発明の抗体断片は、短縮によって、例えばポリペプチドのN及び/又はC末端からの1つ又は複数のアミノ酸の除去によって作られてよい。断片は、1つ又は複数の内部欠失によって生成されてもよい。

本発明の抗体は、mAb 0266-0000-0010若しくは0266-0000-0015抗体の断片又はこれらの抗体の変種であってよい又は含んでよい。本発明の抗体は、これらの抗体の1つ又はその変種の抗原結合部分であってよい又は含んでよい。例えば本発明の抗体は、これらの抗体の1つのFab断片若しくはその変種であってよい、又はこれらの抗体の1つ又はその変種由来の1本鎖抗体であってよい。

本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化(humanised)抗体であってよい。本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域の少なくとも部分及び/又はCDR領域の少なくとも部分が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体を含むことを意図される。(例えばヒト抗体は、フレームワーク及びCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有してよい)。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、無作為又は部位特異的変異導入(in vitro)によって又は体細胞変異(in vivo)によって導入された変異)を含んでよい。

そのようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってよい。そのようなヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントレパートリーを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られ、不死化細胞に融合されたB細胞を含む融合細胞によって産生されてよい。

ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択で構築され、更に天然及び合成配列多様性で多様化された配列ライブラリーから単離されてよい。

ヒト抗体は、ヒトリンパ球のin vitro免疫化に続くエプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)でのリンパ球の形質転換によって調製され得る。

「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の薬剤又は抗体のコンジュゲートなどのヒト抗体の任意の修飾形態を指す。

本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列(CDR領域又はその部分)を含有するヒト/非ヒトキメラ抗体を指す。したがってヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域由来の少なくとも残基がマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種由来の抗体(ドナー抗体)の高頻度可変領域由来の残基によって置き換えられており、所望の特異性、親和性、配列組成及び機能性を有するヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合ではヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。そのような修飾の例は、典型的にはドナー抗体由来のアミノ酸残基である、1つ又は複数のいわゆる逆突然変異の導入である。抗体のヒト化(Humanisation)は、当業者に周知の組換え技術を使用して実行されてよい(例えばAntibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by Benny K. C. Loを参照されたい)。軽鎖及び重鎖可変ドメイン両方についての好適なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列又は構造的相同によって同定され得る。代替的に固定レシピエントフレームワークは、例えば構造、生物物理学的及び生化学特性の知識に基づいて、使用され得る。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来又は成熟抗体配列由来であってよい。ドナー抗体由来のCDR領域は、CDR移植によって移行されてよい。CDR移植ヒト化抗体は、例えば親和性、機能性及び生物物理学的特性について、ドナー抗体からのアミノ酸残基の再導入(逆突然変異)がヒト化抗体の特性に有益な影響を与える決定的フレームワーク位置の同定によって更に最適化されてよい。ドナー抗体由来逆突然変異に加えてヒト化抗体は、CDR又はフレームワーク領域中での生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、部位特異的変異導入、親和性成熟などによって操作されてよい。

更にヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含んでよい。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するために作られる。一般にヒト化抗体は、すべて又は実質的にすべてのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、すべて又は実質的にすべてのFR残基がヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも部分も含み得る。

「ヒト化抗体誘導体」という用語は、抗体及び別の薬剤又は抗体のコンジュゲートなどのヒト化抗体の任意の修飾された形態を指す。

本明細書において使用される「キメラ抗体」という用語は、その軽鎖及び重鎖遺伝子が異なる種に由来する免疫グロブリン可変及び定常領域遺伝子から典型的には遺伝子操作によって構築された抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントは、ヒト定常領域に連結されてよい。

抗体の断片結晶可能領域(「Fc領域」/「Fcドメイン」)は、抗体のN末端領域であり、定常CH2及びCH3ドメインを含む。Fcドメインは、Fc受容体と称される細胞表面受容体、及び補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する場合がある。Fc領域は、抗体を免疫系と相互作用できるようにする。本発明の一態様では抗体は、Fc領域内に修飾を含むように、典型的には血清半減期、補体結合反応、Fc-受容体結合、タンパク質安定性及び/若しくは抗原依存性細胞傷害性又はそれらの欠損などのその機能的特性の1つ又は複数を変更するように操作されてよい。更に本発明の抗体は、化学的に修飾されてよい(例えば、1つ又は複数の化学的成分は抗体に付着されてよい)又はそのグリコシル化を変更するように、抗体の1つ又は複数の機能的特性を再度変更するように修飾されてよい。IgG1抗体は、次のある種のFc受容体(L234A、L235E及びG237A)への親和性の減少及び、C1q媒介補体結合反応(A330S及びP331S)の低下をそれぞれ生じる次の変異の1つ又は複数、及びおそらくすべてを含む修飾されたFcドメインを保有する場合がある(EUインデックスによる残基の付番)。

本発明の抗体のアイソタイプは、IgG1など、IgG2など、IgG4などのIgGであってよい。所望により抗体のクラスは、周知の技術によって「スイッチ」されてよい。例えばIgM分子として最初に産生された抗体は、IgG抗体にクラススイッチされてよい。クラススイッチ技術は、1つのIgGサブクラスを別のものに転換するためにも使用できる、例えば:IgG1からIgG2若しくはIgG4へ;IgG2からIgG1若しくはIgG4へ;又はIgG4からIgG1若しくはIgG2へ。異なるIgGサブクラス由来の領域の組合せによる、定常領域キメラ分子を生成するための抗体の操作も、実施されてよい。

一実施形態ではCH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更される、例えば増加する又は減少するように修飾される。この手法は、例えばBodmerら、による米国特許第5,677,425号に更に記載されている。

定常領域は、抗体を安定化するために、例えば二価抗体が2つの一価VH-VL断片に分離する危険性を低下させるために修飾されてよい。例えばIgG4定常領域では、残基S228(EUインデックスによる残基の付番)は、ヒンジでの内部重鎖ジスルフィド架橋形成を安定化するためにプロリン(P)残基に変異されてよい(例えば、Angalら、Mol Immunol. 199S; 30:105〜8頁を参照されたい)。

抗体又はその断片は、それらの相補性決定領域(CDR)に関して定義される場合もある。本明細書において使用される「相補性決定領域」又は「高頻度可変性領域」という用語は、抗原結合に関与するアミノ酸残基が位置している抗体の領域を指す。超可変性又はCDRの領域は、抗体可変ドメインのアミノ酸配列比較において最も高い可変性を有する領域として同定できる。Kabatデータベースなどのデータベースは、CDR同定のために使用できる、例えばCDRは軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)及び89〜97(L3)並びに重鎖可変ドメインにおける31〜35(H1)、50〜65(H2)及び95〜102(H3)を含むとして定義される;(Kabatら、(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91〜3242)、代替的にCDRは「高頻度可変性ループ」由来の残基として定義されてよい{軽鎖可変ドメイン中の残基26〜33(L1)、50〜52(L2)及び91〜96(L3)並びに重鎖可変ドメイン中の26〜32(H1)、53〜55(H2)及び96〜101(H3) Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901〜917頁}。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の付番は、上記Kabatら、に記載の方法によって実施される。本明細書における「Kabat位置」、「Kabat残基」及び「Kabatによる」などの表現は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番システムを指す。Kabat付番システムを使用して、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク(FR)又はCDRの短縮又は挿入に対応するより少ない又は追加的なアミノ酸を含有する場合がある。例えば重鎖可変ドメインは、CDRH2の残基52の後にアミノ酸挿入(Kabatによる残基52a、52b及び52c)及び重鎖FR残基82の後に挿入された残基(Kabatによる例えば残基82a、82b及び82cなど)を含む場合がある。残基のKabat付番は、「標準的」Kabat付番配列を有する抗体の配列の相同領域での配列比較によって所与の抗体について決定できる。

「フレームワーク領域」又は「FR」残基という用語は、本明細書に定義のCDR内ではないVH又はVLアミノ酸残基のものを指す。

本発明の抗体は、抗uPA抗体0266-0000-0010(配列番号9から14)由来CDR領域又は抗uPA抗体0266-0000-0015(配列番号5〜6)のVH及びVL配列又はヒト化抗uPA抗体hz0266-0000-0010(配列番号17及び18)のVH及びVL配列、又はヒト化抗uPA抗体0266-0000-0043(配列番号21及び22)の重鎖及び軽鎖配列などの、本明細書に開示の1つ又は複数の具体的な抗体由来のCDR領域を含む場合がある。

「抗原」(Ag)という用語は、Agを認識する抗体(Ab)を産生するための免疫適格性脊椎動物の免疫化のために使用される分子実体を指す。本明細書においてAgは、更に幅広く使われ、Abによって認識される標的分子を含むことが一般に意図され、それによりAbを生成するために使用される免疫化工程又は他の工程、例えばファージディスプレイにおいて使用される分子の断片又は模倣物を含む。

エピトープ:
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、抗体(Ab)とその対応する「抗原」(Ag)などの「抗原結合分子」間の分子相互作用の内容において定義される。抗原(Ag)という用語は、Agを認識する抗体(Ab)を産生するための免疫適格性脊椎動物の免疫処置のために使用される分子実体を指す場合がある。一般に「エピトープ」は、Abが特異的に結合するAgにおけるエリア又は領域、すなわちAbと物理的に接触するエリア又は領域を指す。物理的接触は、Ab中の原子とAg分子についての距離基準(例えば距離カットオフ4Å)を通じて定義できる。

「不連続エピトープ」は、直鎖状ペプチド配列中で互いに隣接していないが、構造エピトープを形成するようにポリペプチドの三次元構造において配置されているポリペプチドの2つ以上の領域によって形成されるエピトープである。他の種類のエピトープは:直鎖状ペプチドエピトープ、抗原の三次元構造において互いに近くに位置付けられている2つ以上非近接アミノ酸からなるコンフォメーションエピトープ;及び炭水化物基など、抗原に共有結合で付着した分子構造の全体又は部分のいずれかからなる翻訳後エピトープを含む。

所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)対に対するエピトープは、種々の実験的及びコンピューターによるエピトープマッピング方法を使用して異なるレベルの詳細さで定義及び特徴付けされてよい。実験的方法は、変異導入、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法及び水素重水素交換質量分析(HX-MS)、当技術分野において周知の方法を含む。各方法が固有の原理によることから、エピトープの記載は、それが測定された方法に密接に関連する。そのため用いられたエピトープマッピング方法に依存して、所与のAb/Ag対についてのエピトープは、さまざまに記載される。

最も詳細なレベルではAgとAbとの間の相互作用についてのエピトープは、Ag-Ab相互作用に存在する原子的接触(atomic contact)を定義する空間的座標、及び結合熱動力学へのそれらの相対的寄与についての情報によって記載できる。あまり詳細ではないレベルではエピトープは、AgとAbとの間の原子的接触を定義する空間的座標によって記載できる。更に詳細ではないレベルではエピトープは、AbとAg中の原子との間の距離などの具体的基準によって定義されるそれが含むアミノ酸残基によって記載できる。更に詳細ではないレベルではAb-Ag相互作用は、競合結合がエピトープについていかなる構造情報も提供しないが、例えば他のAbとの競合結合及び「ビニング」によって機能を通じて特徴付けされ得る。

Ab、例えばFab断片とそのAgとの間の複合体の空間的座標によって定義されたX線由来結晶構造の内容では、エピトープという用語は本明細書において、他に特に規定のない又は内容と矛盾しない限り、約3.5から約5.0Å以内、例えばAb中の重原子から4Åなどの距離に重原子(すなわち非水素原子)を有することによって特徴付けられるuPA残基として具体的に定義される。

使用されたエピトープマッピング方法に依存して、エピトープの記載及び定義は、さまざまなレベルの詳細さで得られ、同じAgにおける異なるAbに対するエピトープの比較は、同様にさまざまなレベルの詳細さで行われる場合がある。

アミノ酸レベルで記載された、例えばX線構造から決定されたエピトープは、それらが同じアミノ酸残基のセットを含有する場合同一であると称される。エピトープは、少なくとも1つのアミノ酸がエピトープによって共有されている場合に重複と称される。エピトープは、エピトープによってアミノ酸残基が共有されていない場合別々(固有)と称される。

「パラトープ」という用語の定義は、観点を反転することによって「エピトープ」の上の定義に由来する。これにより用語「パラトープ」は、Agが特異的に結合する、すなわちAgと物理的に接触するAbにおけるエリア又は領域を指す。

Ab、例えばFab断片とそのAgとの間の複合体の空間的座標によって定義されたX線由来結晶構造の内容では、パラトープという用語は本明細書において、他に特に規定のない又は内容と矛盾しない限り、uPA中の重原子から約4Å(3.5から5.0Å)以内の距離に重原子(すなわち非水素原子)を有することによって特徴付けられるAb残基として具体的に定義される。

結合領域:
抗原の結合領域という用語は、抗体結合などの1つ又は複数の抗原結合分子が結合するアミノ酸配列によって定義される抗原における領域を指す。したがって結合領域は、少なくとも1つのエピトープを含むが、同一エピトープ、重複エピトープの両方及び可能性がある別々のエピトープの複数の抗体の複数のエピトープも含んでよい。結合領域は、不連続であってよく、直鎖状ペプチド配列中で互いに隣接していないが、構造結合領域を形成するようにポリペプチドの三次元構造において配置されている抗原ポリペプチドの2つ以上の領域によって形成される。結合領域は、抗原における直鎖状ペプチド領域であってもよく、又は抗原の三次元構造において互いに近くに位置付けられた2つ以上の非隣接アミノ酸からなるコンフォメーション結合領域;及び炭水化物基などの抗原に共有結合的に付着している分子構造の全体又は一部のいずれかからなる翻訳後結合領域であってよい。

同じ抗原に結合する抗体は、それらの共通抗原に同時に結合するそれらの能力に関して特徴付けられてよく、「競合結合」/「ビニング(binning)」に供されてよい。この内容では、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体をグループ化するための方法を指す。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISA又はフローサイトメトリーなどの標準的技術に基づくアッセイにおいてそれらの共通抗原への2つの抗体の競合結合に基づく場合がある。

抗体の「ビン(bin)」は、参照抗体を使用して定義される。第2の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できない場合、第2の抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると称される。この場合、参照及び第2の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合し、「競合抗体」を作る。第2の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合できる場合、第2の抗体は、別の「ビン」に属すると称される。この場合、参照及び第2の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」を作る。

抗体「ビニング」は、エピトープについて直接の情報は提供しない。競合抗体、すなわち同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複エピトープ又は更に別々のエピトープを有する場合がある。後者は、抗原におけるそのエピトープに結合する参照抗体が、第2の抗体が抗原におけるそのエピトープに接触するために必要な空間を占めている場合である(「立体障害」)。非競合抗体は、一般に別々のエピトープを有する。

「結合親和性」という用語は、2つの分子、例えば抗体又はその断片と抗原との間の非共有結合的相互作用の強度の目安として本明細書において使用される。「結合親和性」という用語は、一価相互作用(内在性活性)を記載するために使用される。

一価相互作用を通じた2つの分子間、例えば抗体又はその断片と抗原の結合親和性は、平衡解離定数(KD)を決定することによって定量できる。次にKDは、複合体形成及び解離の動態の、例えばSPR法による測定によって決定できる。一価複合体の会合及び解離に対応する速度定数は、会合速度定数ka(又はkon)及び解離速度定数kd(又はkoff)とそれぞれ称される。KDは、式KD=kd/kaを通じてka及びkdと関連する。

上の定義に従って、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較などの異なる分子相互作用に関連する結合親和性は、個々の抗体/抗原複合体についてのKD値の比較によって比較できる。

本発明による抗体は、天然に存在するリガンド若しくは受容体又は別の抗体などの別の分子とuPAへの結合について競合できる可能性がある。したがって本発明による抗体は、やはりuPAに結合できる別の分子より大きい親和性でuPAに結合できる可能性がある。抗原への結合について天然のリガンド/受容体と競合する抗体の能力は、抗体と抗原との間の特異的相互作用などの目的の相互作用についてのKD値を決定及び、目的ではない相互作用のKD値と比較することによって評価できる。典型的には、標的に関する抗体についてのKDは、無関係の材料又は環境に付随する材料などの他の非標的分子に関するKDの2分の1、好ましくは5分の1、より好ましくは10分の1である。より好ましくはKDは、50分の1、例えば、100分の1又は200分の1;更により好ましくは500分の1、例えば、1,000分の1又は10,000分の1である。

この解離定数の値は、十分周知の方法によって直接決定できる。標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するための標準的アッセイは、当技術分野において周知であり、例えばELISA、ウエスタンブロット、RIA及びフローサイトメトリー分析を含む。抗体の結合動態及び結合親和性は、SPRなどの当技術分野において周知の標準的アッセイによっても評価できる。

標的への抗体の結合が、別の抗体などの標的の別のリガンドによる標的の結合と比較される競合的結合アッセイは、実施できる。

本発明の抗体は、抗体0266-0000-0010(すなわちmAb 0266-0000-0010のVH配列(配列番号7)及びmAb 0266-0000-0010のVL配列(配列番号8)を含む抗体又はその断片)、又はmAb 0266-0000-0015(すなわちmAb 0266-0000-0015のVH配列(配列番号5)及びmAb 0266-0000-0015のVL配列(配列番号6)を含む抗体又はその断片)又はmAb hz0266-0000-0010(すなわちmAb hz0266-0000-0010のVH配列(配列番号17)及びmAb hz0266-0000-0010のVL配列(配列番号18)を含む抗体又はその断片)、又はmAb 0266-0000-0043(すなわちヒト化抗uPA抗体mAb 0266-0000-0043の重鎖及び軽鎖配列(配列番号21及び22)を含む抗体又はその断片)と、sc-uPA及びtc-uPAを含むヒトuPAへの結合について競合できる。本発明の抗体は、抗体0266-0000-0010(すなわちmAb 0266-0000-0010のVH配列(配列番号7)及びmAb 0266-0000-0010のVL配列(配列番号8)を含む抗体又はその断片)、又はmAb 0266-0000-0015(すなわちmAb 0266-0000-0015のVH配列(配列番号5)及びmAb 0266-0000-0015のVL配列(配列番号6)を含む抗体又はその断片)又はmAb hz0266-0000-0010(すなわちmAb hz0266-0000-0010のVH配列(配列番号17)及びmAb hz0266-0000-0010のVL配列(配列番号18)を含む抗体又はその断片)、又はmAb 0266-0000-0043(すなわちヒト化抗uPA抗体mAb 0266-0000-0043の重鎖及び軽鎖配列(配列番号21及び22)を含む抗体又はその断片)と、sc-uPA及びtc-uPAを含むカニクイザルuPAへの結合について競合できる。

本発明の抗体は、その標的への結合について1×10^-7M以下、1×10^-8M以下又は1×10^-9M以下、又は1×10^-10M以下、1×10^-11M以下、又は1×10^-12M以下のKDを有してよい。本発明の抗体のKDは、0.7nM未満など、0.6nM未満など、0.5nM未満など、0.4nM未満など、0.3nM未満など、0.2nM未満など、0.1nM未満など、0.05nM未満など、0.025nM未満など、0.015nM未満など、0.015nMと0nMとの間などの0.8nM未満であってよい。

当技術分野において周知のとおり「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される2つ以上のポリペプチドの配列間の関連を指す。当技術分野では「同一性」は、2つ以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチの数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、具体的な数学的モデル又はコンピュータープログラム(すなわち「アルゴリズム」)によって指定されたギャップ配列比較(ある場合)での2つ以上配列のうち小さい方の間の同一のマッチの百分率を測定する。関連するポリペプチドの同一性は、周知の方法によって容易に算出できる。そのような方法は、これだけに限らないがComputational Molecular Biology、Lesk、A. M.編、Oxford University Press、New York、1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993; Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin, A. M., and Griffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994; Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov、M. and Devereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991及びCarilloら、SIAM J. Applied Math. 48、1073 (1988)において記載のものを含む。

同一性を決定するための好ましい方法は、検査する配列間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性決定の方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するために好ましいコンピュータープログラム法は、GAP {Devereuxら、Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.}、BLASTP、BLASTN及びFASTA{Altschulら、J. Mol. Biol. 215、403〜410頁(1990)}を含むGCGプログラムパッケージを含む。BLASTXプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の情報源から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschulら、NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschulら、上記)。十分周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性を決定するために使用できる。

例えば、コンピューターアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison、Wis.)を使用して、配列同一性百分率が決定される2つのポリペプチドは、それらそれぞれのアミノ酸の最適なマッチングについて配列比較される(アルゴリズムによって決定される「マッチスパン」)。ギャップ開始ペナルティー(gap opening penalty)(平均対角(average diagonal)の3倍として算出される;「平均対角」は使用される比較マトリクスの対角の平均である;「対角」は具体的な比較マトリクスによってそれぞれの完全なアミノ酸マッチに割り当てられるスコア又は数である)、ギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty)(通常ギャップ開始ペナルティーの{割合(1/10)}倍である)、及びPAM 250又はBLOSUM 62などの比較マトリクスは、アルゴリズムと合わせて使用される。標準的比較マトリクス{PAM 250比較マトリクスについて、Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)、BLOSUM 62比較マトリクスについて、Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 89、10915〜10919頁(1992)を参照されたい}もアルゴリズムによって使用される。

ペプチド配列比較についての好ましいパラメーターは次を含む:アルゴリズム:Needlemanら、J. Mol. Biol. 48、443〜453頁(1970);比較マトリクス:Henikoffら、PNAS USA 89、10915〜10919頁(1992)からのBLOSUM 62;ギャップペナルティー:12、ギャップ長ペナルティー: 4、類似性閾値:0。

GAPプログラムは、上のパラメーターを含んで有用である。前述のパラメーターは、GAPアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップについてペナルティーを伴わない)のための初期設定パラメーターである。

「類似性」という用語は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に同一マッチ及び保存的置換マッチの両方を含む配列関連性を指す。2つのポリペプチド配列が、例えば、{割合(10/20)}同一のアミノ酸を有する場合、残りはすべて非保存的置換であり、それにより同一性百分率及び類似性は両方とも50%である。同じ例において、保存的置換がある5個のさらなる位置がある場合、それにより同一性百分率は25%であり、百分率類似性は75%である{割合(15/20)}。したがって保存的置換がある場合、2つのポリペプチド間の類似性の程度はこれら2つのポリペプチド間の同一性百分率より高い。

医薬用製剤:
一態様では本発明は、本明細書に記載の抗uPA抗体などの本発明の分子を含む組成物及び製剤を提供する。例えば本発明は薬学的に許容される担体と併せて製剤化された本発明の1つ又は複数の抗uPA抗体を含む医薬組成物を提供する。

したがって本発明の1つの目的は、0.25mg/mlから250mg/mlの濃度で存在するそのような抗体を含む医薬用製剤であって、2.0から10.0までのpHを有する医薬用製剤を提供することである。製剤は、1つ又は複数の緩衝液系、保存剤、等張化剤(tonicity agent)、キレート剤、安定剤、又はサーファクタント及びそれらの種々の組合せを更に含んでよい。医薬組成物における保存剤、等張剤、キレート剤、安定化剤及びサーファクタントの使用は、当業者に周知である。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照する。

一実施形態では医薬用製剤は、水性製剤である。そのような製剤は、典型的には溶液又は懸濁液であるが、コロイド、分散剤、乳液及び多相性材料も含む場合がある。「水性製剤」という用語は、少なくとも50%w/w水を含む製剤として定義される。同様に「水性溶液」という用語は少なくとも50%w/w水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は少なくとも50%w/w水を含む懸濁液として定義される。

別の実施形態では医薬用製剤は、凍結乾燥製剤であり、それに医師又は患者は使用前に溶媒及び/又は希釈剤を加える。

さらなる態様では医薬用製剤は、そのような抗体の水性溶液、及び緩衝液を含み、抗体は、濃度1mg/ml以上で存在し、前記製剤は約2.0から約10.0のpHを有する。

炎症:
本発明に記載のuPAに結合する抗体は、炎症性状態を罹患している個体の処置における使用のために好適である場合がある。炎症は、これだけに限らないが病原体、損傷細胞又は刺激物質を含む種々の刺激への組織の複合的生物学的応答である。炎症は、傷害性の刺激を除去、中和又は単離し、治癒工程を開始する生物による防御応答である。炎症は、感染と同義語ではなく、感染は外来性病原体による生物の侵襲である一方で炎症は病原体への免疫系の応答である。したがって炎症は、感染の構成要素であるが、感染は炎症の構成要素である必要はない。

炎症は、脈管構造(例えば、内皮細胞、ペリサイト、平滑筋細胞)、免疫系の細胞(例えば、T及びBリンパ球;単球及び好中球などの多形核白血球又は顆粒球;樹状細胞、マクロファージ並びにNK細胞)、細胞由来可溶性媒介物質(サイトカイン、ケモカイン)並びに標的化組織中の常在細胞(例えば、上皮細胞、滑膜線維芽細胞、ニューロン細胞)を含む複数の構成要素が関与する事象のカスケードである。急性炎症は短期間(時間から日)のものであり、組織中の常在細胞、免疫系の細胞の移動及び炎症の部位への体液及び血漿タンパク質の滲出に大きく関与する。これは、維束管流、細胞活性化及び、循環から傷害の部位に免疫系の細胞を誘引する細胞成分の変化から生じる。慢性炎症は、活発な炎症、組織破壊及び修復の試みが同時に進行する長期間のものである。慢性炎症は、持続性の感染、毒物への長期間及び反復性の曝露から生じる、又は自己免疫、身体の免疫細胞がそれら自身の組織を攻撃することにより傷害を生じる現象による場合がある。

通常、免疫系は身体の正常細胞(又は「自己」)と外来病原体又は異常細胞(「非自己」)との間を識別できる。いくつかの場合では免疫系は、正常な「自己」を認識する能力を喪失し、組織又は細胞に対する応答を不適切に開始する。この応答は、自己への寛容性の喪失から起き、「自己免疫」と名付けられる。自己免疫から生じる病態は、しばしば深刻な臨床的帰結を有し、世界の、特に先進国における主な健康問題の1つである。そのような疾患の例は、炎症性腸疾患(IBD)、クローン疾患(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、過敏性腸症候群、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、I型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症(MS)、自己免疫性心筋炎、川崎病、環状動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グットパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、アレルギー、喘息及び、急性又は慢性炎症のいずれかの結果である他の自己免疫疾患を含む。

標的化生物学的治療剤は、ある種の自己免疫疾患及び/又はがんの処置においていまや利用可能である。例えば、がんを有する患者はCD20に対する抗体(抗CD20)で処置でき;関節リウマチを有する患者は抗CD20、TNFアンタゴニスト(可溶性TNFR又は抗TNF-α)で処置でき;乾癬を有する患者は抗CD11aで処置でき;多発性硬化症を有する患者はINF-ベータで処置でき;潰瘍性大腸炎を有する患者は抗TNF-αで処置でき、クローン病を有する患者は抗TNF-α又は抗α4インテグリンで処置できる。残念ながら、これらの生物製剤(biologics)のいずれかでの処置を受けた多数の患者は、種々の副作用を経験する場合がある、応答しない場合がある及び/又は治療用医薬に対する中和抗体を生じる場合がある。病態を特異的に標的化するが、健康な細胞/組織に影響を与えず、重度の副作用を生じることが少ない及び/又は低い代替的生物学的医薬に対する必要性はまだある。付加的にそのような代替的生物学的医薬は、長期間使用できる、及び/又は中和抗体の生成を生じない。一態様では本発明は、自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患を有する患者におけるこれらのまだ対処されていない必要性に関する。

炎症性腸疾患:
炎症性腸疾患(IBD)は、口から肛門までの胃腸管の任意の部分を冒す場合があり、多種多様な症状を生じる疾患である。IBDは、主に腹部痛、下痢(血性である場合がある)、嘔吐又は体重減少を生じるが、皮膚の皮疹(発疹)、関節炎、眼の炎症、疲労及び集中力の欠如などの胃腸管以外の合併症も生じる場合がある。IBDを有する患者は、2つの主なクラス、潰瘍性大腸炎(UC)を有する者及びクローン病(CD)を有する者に分類され得る。CDが一般に回腸及び結腸に関与し、腸管の任意の領域を冒す場合があるがしばしば非連続的である(疾患の病巣エリアは腸管全体に広がる)一方でUCは直腸(結腸)に常に関与し、より連続的である。CDでは炎症は貫壁的であり、膿瘍、瘻孔及び狭窄を生じるが、UCでは炎症は典型的には粘膜に限局されている。クローン病に対する周知の薬学的又は外科的治癒法はないが、UCを有するいくらかの患者は結腸の外科的除去によって治癒する場合がある。治療選択肢は、症状の管理、寛解の維持及び再発の予防に限定されている。臨床における炎症性腸疾患への有効性は、臨床検査及び生活の質質問票に基づくスコア付け尺度であるCDについてのクローン病活性指数(CDAI)スコアの低下として測定できる。動物モデルでは有効性は、体重の増加によって主に及び、便の固さ、重さ及び便中の血液の組合せである疾患活性指数(DAI)によっても測定される。

多発性硬化症:
多発性硬化症(MS)は、しびれ、脱力、筋肉協調の喪失並びに視覚、発声及び膀胱制御での問題を特徴とする中枢神経系(CNS)の疾患である。MSは、身体の免疫系がミエリン、神経インスレーターとして作用し、神経シグナルの伝達を助ける物質を攻撃する自己免疫疾患である。MSは、脳の白質の脱髄を生じ、この工程は時には、灰白質に及ぶ。脱髄は、脂質及びタンパク質からなるミエリンの喪失である。ミエリンがMSにおいて損傷されると、神経線維伝導が不完全になる又は消失する。これらの脱髄神経線維に関連する身体機能の障害又は感覚変化は、MSの症状をもたらす。再発寛解、一次進行性及び二次進行性を含むMSの複数のサブグループがある。これらのサブタイプのいくつかを表すマウスモデルが潜在的治療法の有効性を検査するために利用可能である。マウスモデルにおける有効性は、肢での麻痺の低下によって測定される。患者での有効性は、MRIによって測定される脳での活性スコアの低下及び筋緊張/運動における改善によって測定される。

再発寛解多発性硬化症(RRMS)を有する患者由来の末梢血液単核細胞(PBMC)のゲノム規模での発現分析は、uPA遺伝子(PLAU)の発現が健常対照由来のPBMCと比較してRRMSを有する患者由来のPBMCにおいて顕著に増加していることを明らかにした(Coxら、Mult Scler 19:1268〜74頁、2013)。多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスモデルでは、uPA阻害性PAI-1-由来ペプチドでの処置が疾患スコアを低下させた(Gur-Wahnonら、J Neuroinflammation 10:124、2013)。

乾癬:
乾癬は、皮膚のT細胞媒介性炎症性障害であり、相当な不快感を生じる場合がある。それは、現在治療法がなくすべての年齢の人々が罹患する疾患である。軽度の乾癬を有する個体は、局所薬剤で彼らの疾患をしばしば管理できるが、世界で百万人を超える患者が紫外線処置又は全身性免疫抑制治療を必要としている。残念ながら、紫外線照射の不便さ及び危険性並びに多くの治療の毒性は、それらの長期間の使用を制限する。更に患者は、通常、乾癬の再発を有し、いくらかの場合には免疫抑制治療を停止したすぐ後にリバウンドした。CD4+T細胞の移行に基づいて近年開発された乾癬のモデルは、ヒト乾癬の多くの態様を模倣し、それにより乾癬の処置における使用のために好適な化合物を同定するために使用できる(Davenportら、Internat. Immunopharmacol 2:653〜672頁、2002)。このモデルにおける有効性は、評価系を使用する皮膚病態の低下によって測定される。同様に患者での有効性は、皮膚病態の減少によって測定される。

乾癬性関節炎:
乾癬性関節炎(PsA)は、乾癬を有する患者のサブセットにおいて生じる炎症性関節炎の一種である。これらの患者では、皮膚病態/症状は、関節リウマチにおいて見られるものに類似の関節腫脹を伴う。斑状、隆起した、落屑を伴う皮膚炎症の発赤を特性とする。乾癬は、肘及び膝の先端、頭皮、臍及び生殖器部又は肛門周辺をしばしば冒す。乾癬を有する患者のおよそ10%は、その関節の関連炎症も発症する。

関節リウマチ:
関節リウマチ(RA)は、身体の全体ではなくてもほとんどを冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の1つである。疼痛、こわばり、温感、発赤及び腫脹を生じる関節の炎症によって特徴付けられる。この炎症は、関節に浸潤した炎症性細胞のもたらしたものであり、これらの炎症性細胞は、骨及び軟骨を消化する場合がある酵素を放出する。結果としてこの炎症は、重度の骨及び軟骨損傷並びに関節劣化並びに生理学的影響のなかでも特に重度の疼痛を導く場合がある。発症した関節は、その形状及びアライメントを喪失する場合があり、疼痛及び運動の喪失を生じる。

当技術分野において周知の関節リウマチについてのいくつかの動物モデルがある。例えばコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルでは、マウスはヒト関節リウマチに似ている炎症性関節炎を発症する。CIAがRAと類似の免疫学的及び病理学的特性を共有することから、このことは、それを可能性があるヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための好適なモデルにしている。このモデルでの有効性は、関節腫脹の減少によって測定される。臨床でのRAにおける有効性は、関節腫脹、赤血球沈降速度、C反応性タンパク質レベル及び抗シトルリン化タンパク質抗体などの血清因子のレベルの組合せとして測定される、患者における症状を低下させる能力によって測定される。

uPAのレベルの増加は、RAを有する患者由来の血液、滑液及び組織において記載されている(Baranら、J. Cell Mol. Med. 13:3797〜3808頁、2009; Belcherら、Ann. Rheum. Dis. 55:230〜236頁、1996; Bussoら、Ann. Rheum. Dis. 56:550〜557頁、1997; Rondayら、Br. J. Rheumatol. 35:416〜423頁, 1996)。uPAは、多数のマウスモデルにおいて関節炎症及び関節炎疾患に関係している。関節炎症におけるuPAの機能的役割は、コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルにおいて(Cookら、Am. J. Pathol. 160:917〜926頁, 2002)、抗II型コラーゲン抗体誘発関節炎(CAIA)モデルにおいて(Cookら、Arthritis Res. Ther. 12:R37, 2010)及びK/BxN血清移行関節炎モデルにおいて(De Nardoら、Arthritis Res. Ther. 12:R199, 2010)uPAノックアウトマウスを使用して実証された。CIAモデルではuPAノックアウトマウスにおいて観察された関節炎症状の低下は、野生型骨髄を移植することによって元に戻すことができ、免疫細胞由来のuPAが疾患進行に不可欠であることを実証している。

血友病関節症:
血友病関節症は関節への反復性の出血によって生じる変形性関節炎である{関節血症(haemarthrosis)}。血友病A及びBによく見られる合併症であるが他の凝固障害においても見られる場合がある。反復性の関節血症は、滑膜の慢性炎症、軟骨劣化及び骨のリモデリングを導く。罹患した関節は、疼痛、こわばり、温感、発赤、腫脹及び関節運動の制限によって特徴付けられる。最も一般に冒される関節は、膝、足首、肘、肩及び股関節である。

血友病性関節症についてのいくつかの動物モデルがある。いくつかの動物モデルは、血友病イヌなどの突発性関節血症を経験するが、他の確立されたモデルは、血友病マウスにおいて確立された針誘発膝出血モデルなどの関節出血の人工的誘発に基づいている。これらの動物モデルは、関節血症を予防することによって又は関節血症によって生じる炎症性及び分解性工程を弱めることによってのいずれかで、血友病性関節症へのそれら効果について薬物候補をスクリーニングするために好適である可能性がある。

uPAのレベルの顕著な上昇が、血友病マウスにおける針誘発膝出血を含む関節血症の動物モデルにおける罹患した関節由来の組織及び滑液において観察された(Nieuwenhuizenら、Thromb Haemost 110:173〜183頁、2013)。

全身性エリテマトーデス:
全身性エリテマトーデス(SLE)は、抗dsDNAなどの偏在性の自己抗原に方向付けられた慢性IgG抗体産生によって特徴付けられる免疫複合体関連障害である。SLEにおける疾患の中心的メディエーターは、自己タンパク質/組織に対する自己抗体(auto-antibody)の産生及び続く免疫媒介性炎症の発生である。抗体は、直接又は間接的に炎症を媒介する。Tリンパ球が直接疾患を生じるとは考えられていないが、それらは自己抗体産生のために必要である。SLEの影響は、特定の器官に局在化されるよりむしろ全身性(例えば、腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系 心血管系、胃腸管、骨髄、血液)であるが、糸球体腎炎がいくつかの場合において生じることがある(すなわちループス腎炎)。複数の染色体の遺伝子座が疾患に関与しており、抗dsDNA抗体及び糸球体腎炎などの疾患のさまざまな態様に寄与している可能性がある。ヒト疾患及び適切なマウスモデルでのSLEにおける有効性は、自己抗体(Eg:抗dsDNA)を減少させる治療用実体の能力によって及び/又は疾患症状の回復を導く腎臓の病態における減少(腎臓機能の増強)によって測定される。

がん:
本発明に記載のuPAに結合する抗体は、これだけに限らないが、扁平細胞細胞腫を含む膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺及び皮膚のものを含む細胞腫;白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫及び多発性骨髄腫を含むリンパ系の造血性腫瘍;急性及び慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病及び骨髄異形成症候群を含む骨髄性系列の造血性腫瘍;線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系由来の腫瘍;メラノーマ、セミノーマ、テラト細胞腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍;星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍;線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む間葉系由来の腫瘍;並びにメラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性がん及び奇形癌腫を含む他の腫瘍を含むがん及び他の増殖性疾患を有する個体の処置における使用のために好適であり得る。

本発明により処置され得る具体的な障害は、リンパ系造血性腫瘍、例えばT細胞及びB細胞腫瘍、これだけに限らないが小細胞及び大脳様細胞型を含むT前リンパ球性白血病(T-PLL)などのT細胞障害;大型顆粒リンパ球性白血病(LGL)、好ましくはT細胞型;セザリー症候群(SS);成人T細胞白血病リンパ腫(ATLL);T-NHL肝脾リンパ腫;末梢/ポスト胸腺(post-thymic)T細胞リンパ腫(多形性及び免疫芽球性サブタイプ);血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫;血管中心性(鼻)T細胞リンパ腫;未分化(Ki1+)大細胞リンパ腫;腸T細胞リンパ腫;Tリンパ芽球性;リンパ腫/白血病(T-Lbly/T-ALL)、多発性骨髄腫を含む。

例えば過形成、線維症(特に肺だが腎線維症などの他の種類の線維症も)、血管新生、乾癬、粥状動脈硬化及び、血管形成術後の狭窄又は再狭窄などの血管における平滑筋増殖を含む他の増殖性障害も、本発明により処置され得る。

現在の処置と比較してより大きな有効性及び/又はより低い重度の副作用を有する代替的生物学的医薬に対する必要性がまだある。本発明は、転移性(播種性)疾患を有する患者を含む、がんを有する患者におけるこれらのまだ対処されていない必要性に関する。

uPAの組織及び血漿レベルの増加は、多数の異なるがん形態において実証されている(Ulisseら、Current Cancer Drug Targets、9:32〜71頁、2009)。uPAは、多数のマウスモデルにおけるがん及びがん転移にも関与している。uPAの機能的役割は、uPA mRNA発現を干渉することによって(Yuら、Cancer Res. 50:7623〜76331頁、1990)、uPA遺伝子欠損マウスの使用によって(Almholtら、Int. J. Cancer 113:525〜532頁、2005)、及び中和抗体(Ossowski and Reich、Cell 35:611〜619頁、1983; Kobayashiら、Thromb. Haemost. 71 :474〜480頁、1994)又はuPA特異的阻害物質の適用によって(Schweinitzら、J. Biol. Chem. 279:33613〜33622頁、2004; Hennekeら、Am. J. Respir. Crit Care Med. 181 :611〜619頁、2010)実証された。

処置:
本明細書において使用される「処置」という用語は、それを必要とする任意のヒト又は他の動物対象の医学的治療を指す。前記対象は、前記処置の使用が前記ヒト又は他の動物対象の健康に有益であることを示す仮又は確定診断を与える医師又は獣医師による身体診察を受けることが想定される。前記処置の時期及び目的は、対象の健康状態などの多数の要因に応じて個体により変わる場合がある。したがって前記処置は、予防的、対症療法的、対症的及び/又は治療的である場合がある。

本発明の観点では、予防的、対症療法的、対症的及び/又は治療的処置は、別々の本発明の態様を表す場合がある。

作用機序:
本発明の抗体は、静脈内など、筋肉内など、皮下など非経口的に投与され得る。代替的に本発明の抗体は、経口的又は局所的などの経口経路を介して投与され得る。本発明の抗体は、予防的に投与されてよい。本発明の抗体は、治療的に投与されてよい(オンデマンドで)。

非限定的実施形態
本発明は、次の非限定的実施形態によって更に記載される:
1.ヒトuPAに結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトtc-uPAのタンパク質分解活性を阻害し、タンパク質分解性不活性形態のヒトuPAからタンパク質分解性活性形態のヒトuPAへのヒトsc-uPAの活性化を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。

2.受容体結合ヒトuPA及び非受容体結合ヒトuPAの両方を阻害する、実施形態1に記載のモノクローナル抗体又はその断片。

3.カニクイザルtc-uPAなどの非ヒト霊長類tc-uPAのタンパク質分解活性も阻害する、実施形態1又は2のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。

4.カニクイザルuPAなどの、タンパク質分解性不活性形態の非ヒトuPAからタンパク質分解性活性形態の非ヒトuPAへの非ヒトsc-uPAの活性化も阻害する、実施形態1、2又は3のいずれかに記載の抗体又はその断片。

5.ヒトuPA及びチンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ又はラクダuPAなどの他の種由来のuPAに結合でき、tc-uPAのタンパク質分解活性を阻害し、タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害することを特徴とする、実施形態1〜4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

6.初代細胞における内因的に産生された/天然に存在するuPAも阻害する、実施形態1〜5に記載の抗体又はその断片。

7.tc-uPAのタンパク質分解活性を阻害し、タンパク質分解活性の50から100%低下、例えば、タンパク質分解活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90又は95%低下である、実施形態1〜6のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

8.タンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害し、活性化率の50から100%低下、例えば、活性化率の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90又は95%低下である、実施形態1〜7のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

9.ヒトuPA(配列番号1)においてコンフォメーション変化を誘導することによって作用する二重作用性抗uPA抗体である、実施形態1〜4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

10.二重作用性抗uPA抗体が、ヒトuPA(配列番号1)のアミノ酸番号1〜33、67〜80、187〜215、230〜234、243〜256、260〜274、291〜306、322〜341、375〜389及び397〜410のいずれかにおいてコンフォメーション変化を誘導する、実施形態9に記載の抗体又はその抗原結合断片。

11.二重作用性抗uPA抗体が、Ile167-Ala175及びTyr218-Leu224(配列番号1)を覆うエピトープに結合することによって、ヒトuPA(配列番号1)のアミノ酸番号1〜33、67〜80、187〜215、230〜234、243〜256、260〜274、291〜306、322〜341、375〜389及び397〜410のいずれかにおいてコンフォメーション変化を誘導する、実施形態9又は10に記載の抗体又はその抗原結合断片。

12.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番(sequential)では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個又は3個が異なるアミノ酸によって置換されている場合があり、特にD95(Kabat;連続付番では99)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG96(Kabat;連続付番では100)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はD98(Kabat;連続付番では102)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG99(Kabat;連続付番では103)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
を含む、実施形態1〜4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

13.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されている場合があるCDR1配列
を含む、実施形態1〜4又は12のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

14.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1個、2個又は3個が異なるアミノ酸残基によって置換されている場合があるCDR2配列
を含む、実施形態1〜4又は12〜13のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

15.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は10〜14のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

16.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列、並びに
配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列、並びに
配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は10〜14のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

17.前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個又は3個が異なるアミノ酸によって置換されている場合があるCDR1配列
を含む、実施形態1〜4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

18.前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個又は2個が異なるアミノ酸によって置換されている場合があるCDR2配列
を含む、実施形態1〜4又は実施形態17のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

19.前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個又は2個が異なるアミノ酸によって置換されている場合がある、特にN90がN以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はS91がS以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は実施形態17〜18のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

20.前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列;並びに
配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列;並びに
配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は実施形態17〜19のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

21.前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列;及び/又は
配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列;及び/又は
配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列であって、N90がN以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はS91がS以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は17〜19のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

22.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列;及び/又は
配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列;及び/又は
配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列であって、D95(Kabat;連続付番では99)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG96(Kabat;連続付番では100)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はD98(Kabat;連続付番では102)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG99(Kabat;連続付番では103)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は12〜14のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

23.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列;及び/又は
配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列;及び/又は
配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列であって、D95(Kabat;連続付番では99)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG96(Kabat;連続付番では100)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はD98(Kabat;連続付番では102)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG99(Kabat;連続付番では103)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
を含み、
前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列;及び/又は
配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列;及び/又は
配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列であって、N90がN以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はS91がS以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は12〜22のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

24.前記抗体の重鎖が、
配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列;及び
配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列;及び
配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列を含み、
前記抗体の軽鎖が、
配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列;及び
配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列;及び
配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列
を含む、実施形態1〜4又は12〜22のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

25.前記抗体の軽鎖が配列番号18を含み、V2(Kabat及び連続付番)がIに変異されている場合があり、及び/又はT22(Kabat及び連続付番)がSに変異されている場合があり、及び/又はV58(Kabat及び連続付番)がIに変異されている場合があり、及び/又はT69(Kabat及び連続付番)がSに変異されている場合があり、及び/又はN90(Kabat及び連続付番)がN以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はS91が(Kabat及び連続付番)S以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、前記抗体の重鎖が配列番号17を含み、E1(Kabat及び連続付番)がDに変異されている場合があり、及び/又はQ3(Kabat及び連続付番)がKに変異されている場合があり、及び/又はS49(Kabat及び連続付番)がAに変異されている場合があり、及び/又はA93(Kabat;連続付番では97)がTに変異されている場合があり、及び/又はD95(Kabat;連続付番では99)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG96(Kabat;連続付番では100)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はD98(Kabat;連続付番では102)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG99(Kabat;連続付番では103)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合がある、
実施形態1〜4に記載の抗体又はその抗原結合断片。

26.前記抗体の軽鎖が配列番号18を含み、V2(Kabat及び連続付番)がIに変異されている場合があり、及び/又はT22(Kabat及び連続付番)がSに変異されている場合があり、及び/又はV58(Kabat及び連続付番)がIに変異されている場合があり、及び/又はT69(Kabat及び連続付番)がSに変異されている場合があり、及び/又はN90(Kabat及び連続付番)がN以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はS91(Kabat及び連続付番)がS以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、カッパ定常部分又はその変種と組み合わされており、前記抗体の重鎖が配列番号17を含み、E1(Kabat及び連続付番)がDに変異されている場合がある及び/又はQ3(Kabat及び連続付番)がKに変異されている場合があり、及び/又はS49(Kabat及び連続付番)がAに変異されている場合があり、及び/又はA93(Kabat;連続付番では97)がTに変異されている場合があり、及び/又はD95(Kabat;連続付番では99)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG96(Kabat;連続付番では100)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はD98(Kabat;連続付番では102)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG99(Kabat;連続付番では103)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、IgG1若しくはIgG1の変種又はIgG2若しくはIgG2の変種又はIgG4若しくはIgG4定常部分の変種と組み合わされている、
実施形態1〜4又は実施形態25に記載の抗体又はその抗原結合断片。

27.可変重鎖が配列番号17を含む、及び/又は可変軽鎖が配列番号18を含む、実施形態1〜4又は12〜24のいずれかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。

28.uPAに結合でき、重鎖が配列番号21を含み、及び/又は軽鎖が配列番号22を含む、実施形態1〜4又は12〜24のいずれかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。

29.重鎖が、
アミノ酸残基31〜35(Kabat)に位置付けられた配列番号9を含むCDR-H1;及び/又は
アミノ酸残基50〜65(Kabat)に位置付けられた配列番号10を含むCDR-H2;及び/又は
アミノ酸残基95〜102(Kabat)に位置付けられた配列番号11を含むCDR-H3
を含む、実施形態1〜4又は12〜24のいずれかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。

30.軽鎖が、
アミノ酸残基24〜34(Kabat)に位置付けられた配列番号12を含むCDR-L1;及び/又は
アミノ酸残基50〜56(Kabat)に位置付けられた配列番号13を含むCDR-L2;及び/又は
アミノ酸残基89〜97(Kabat)に位置付けられた配列番号14を含むCDR-L3
を含む、実施形態1〜4、12〜24又は29のいずれかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。

31.重鎖が、
アミノ酸残基31〜35(Kabat)に位置付けられた配列番号9を含むCDR-H1;及び
アミノ酸残基50〜65(Kabat)に位置付けられた配列番号10を含むCDR-H2;及び
アミノ酸残基95〜102(Kabat)に位置付けられた配列番号11を含むCDR-H3
を含み、並びに軽鎖が、
アミノ酸残基24〜34(Kabat)に位置付けられた配列番号12を含むCDR-L1;及び
アミノ酸残基50〜56(Kabat)に位置付けられた配列番号13を含むCDR-L2;及び
アミノ酸残基89〜97(Kabat)に位置付けられた配列番号14を含むCDR-L3
を含む、実施形態1〜4又は29〜30のいずれかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。

32.ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において実施形態22に記載の抗体と競合する、実施形態1〜11のいずれかに記載の抗原又はその抗原結合断片。

33.ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において実施形態23に記載の抗体と競合する、実施形態1〜11のいずれかに記載の抗原又はその抗原結合断片。

34.ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において実施形態26に記載の抗体と競合する、実施形態1〜11のいずれかに記載の抗原又はその抗原結合断片。

35.ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において実施形態27に記載の抗体と競合する、実施形態1〜11のいずれかに記載の抗原又はその抗原結合断片。

36.ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において実施形態30に記載の抗体と競合する、実施形態1〜11のいずれかに記載の抗原又はその抗原結合断片。

37.ヒトuPA(配列番号1)における不連続エピトープ/結合領域に結合し、不連続エピトープ/結合領域の第1の結合部分が配列番号1のアミノ酸番号167〜175によって定義され、不連続エピトープ/結合領域の第2の結合部分が配列番号1のアミノ酸番号218〜224によって定義される、実施形態1〜11のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

38.ヒトuPA(配列番号1)における不連続エピトープ/結合領域の第1の結合部分の1つ又は複数のアミノ酸に結合し、不連続エピトープ/結合領域の第1の結合部分が配列番号1のアミノ酸番号167〜175によって定義され、不連続エピトープ/結合領域の第2の結合部分における1つ又は複数のアミノ酸に結合し、第2の結合部分が配列番号1のアミノ酸番号218〜224によって定義される、実施形態1〜11に記載の抗体又はその抗原結合断片。

39.ヒトuPA(配列番号1)における不連続エピトープ/結合領域に結合し、前記結合領域が、配列番号1の次のアミノ酸:Ile167、Glu168、Asn169、Gln170、Pro171、Trp172、Phe173、Ala174及びAla175の1つ又は複数(好ましくは2個以上、好ましくは3個以上、好ましくは4個以上、好ましくは5個以上、好ましくは6個以上、好ましくは7個以上、好ましくは8個以上、好ましくは9個すべて、並びに配列番号1の次のアミノ酸:Tyr218、Leu219、Gly220、Arg221、Ser222、Arg223及びLeu224の1つ又は複数(好ましくは2個以上、好ましくは3個以上、好ましくは4個以上、好ましくは5個以上、好ましくは6個以上、好ましくは7個すべてを含む、実施例1〜11のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

40.ヒトuPA(配列番号1)における不連続エピトープ/結合領域への結合において実施形態23、24、27、28又は31の抗体と競合し、不連続エピトープ/結合領域の第1の結合部分が配列番号1のアミノ酸番号167〜175によって定義され、不連続エピトープ/結合領域の第2の結合部分が配列番号1のアミノ酸番号218〜224によって定義される、抗体又はその抗原結合断片。

41.モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体の抗原結合領域、scFv、Fab、F(ab')2、Fv及び1本鎖抗体からなる群から選択される、前述の実施形態のいずれか1つに記載の抗体又はその断片。

42.Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv、1本鎖、dsFv、Fd及びdAb断片;VH、VL、VhH及びV-NARドメイン;単一のVH及び単一のVL鎖を含む一価分子;ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びカッパボディ;ラクダIgG;IgNAR;並びに単離されたCDR又は抗原結合残基又はポリペプチドが機能性抗体断片を形成するように合わせて会合又は連結されている場合がある1つ又は複数の単離されたCDR又は機能性パラトープからなる群から選択される抗原結合断片である、前述の実施形態のいずれか1つに記載の抗体又はその断片。

43.治療剤にコンジュゲートされている、前述の実施形態のいずれか1つに記載の抗体又はその断片。

44.医薬としての使用のための、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体又はその断片。

45.自己免疫疾患及び/又は慢性炎症の処置のための医薬の製造のための、前述の実施形態のいずれか1つに記載の抗体又はその断片。

46.がん疾患及び/又は自己免疫疾患及び/又は慢性炎症の処置における使用のための、前述の実施形態のいずれか1つに記載の抗体又はその断片。

47.関節リウマチの処置における使用のための、実施形態44〜46に記載の抗体又はその断片。

48.自己免疫疾患又は慢性炎症性疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に前述の実施形態のいずれか1つに記載の抗体又はその断片を投与することを含む方法。

49.薬学的に許容される担体と共に製剤化された、実施形態1〜48のいずれか1つに記載の1つ又は複数の抗uPA抗体又はその断片を含む医薬組成物。

50.(a)抗uPA抗体を生成する工程;(b)工程(a)において生成された抗体からヒトtc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する抗体を同定する工程;(c)工程(a)において生成された抗体から、タンパク質分解性不活性形態のヒトuPAからタンパク質分解性活性形態のヒトuPAへのヒトsc-uPAの活性化を阻害する抗体を同定する工程;並びに(d)(b)及び(c)の両方の工程において阻害性である抗体を選択する工程を含む、抗uPA抗体の同定方法。

51.ヒトuPAがヒトuPARに結合されている場合でも阻害性である抗uPA抗体を同定する工程を更に含む、実施形態50に記載の方法。

52.内因的に由来するヒトuPAを阻害する抗uPA抗体を同定する工程を更に含む、実施形態50に記載の方法。

53.チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ又はラクダuPAなどの他の種由来のuPAにも結合及び阻害する抗uPA抗体を同定する工程を更に含む、実施形態50に記載の方法。

54.ヒトuPAに結合でき、実施形態50〜53のいずれかに記載の同定方法により同定される、抗体又はその抗原結合断片を産生する方法。

(実施例1)
ヒトsc-uPAの産生
組換えヒトsc-uPA(配列番号1)の発現のために、全長cDNA配列を合成し(配列番号2)、哺乳動物発現構築物にCMVプロモーターと共に標準的技術によってクローニングした。生成された発現プラスミドをpJSV-ヒトpro-uPAと表す。すべての構築物をDNA配列決定によって検証した。ヒトsc-uPAのcDNA配列(配列番号2)において、成熟sc-uPAタンパク質をコードするヌクレオチド配列には、20アミノ酸シグナルペプチド[MRALLARLLLCVLVVSDSKG]をコードするヌクレオチド配列が先行する。このシグナルペプチドは、成熟ヒトsc-uPAタンパク質には存在しない。

組換え野生型ヒトsc-uPAタンパク質を293Fectin(商標)Transfection Reagent(Life Technologies-Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA)を使用して一過性トランスフェクションによってヒト胚性腎臓293細胞(HEK293)において発現させた。細胞培養培地をトランスフェクション72時間後に回収した。

組換え野生型sc-uPAタンパク質をフロースルーモードでのQクロマトグラフィー及びSP精製工程、並びにポリッシュステップとしての追加的Superdex75によって精製した。最終的なタンパク質産生物は、純度>95%(SDS-PAGE、Bioanalyzer CE及びSEC-HPLCによって推定)、及び内毒素<1EU/mg(動態学的比濁法検査によって評価)を有した。

(実施例2)
カニクイザルsc-uPAの産生
組換えカニクイザルsc-uPA(配列番号3)の発現のために、全長cDNA配列を合成し(配列番号4)、C末端の6xHisタグを含む発現ベクターpcDNA3.1+(Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA)にクローニングした(標準的技術によって。生成された発現プラスミドをpcDNA3.1-cyno pro-uPA-6xHisと表した。カニクイザルsc-uPA(配列番号4)のcDNA配列において、成熟sc-uPAタンパク質をコードするヌクレオチド配列には、ヒトとカニクイザル配列との間の相同に基づいて20アミノ酸長[MRALLAHLLLCVLVVSDSKS]であると予測される、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が先行する。カニクイザルsc-uPAについてのシグナルペプチドの正確な同一性は確立されていない。成熟カニクイザルsc-uPAタンパク質にはシグナルペプチドは存在しない。

組換えカニクイザルsc-uPAタンパク質を293Fectin(商標)Transfection Reagent(Life Technologies -Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA)を使用して、活性化部位でのタンパク質分解性切断を防ぐために10μg/mLアプロチニンの存在下での(Petersen HHら、Eur J Biochem. 2001 Aug;268(16):4430〜9頁; Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁、培養培地(Roche Applied Science社、Mannheim Germany)中、一過性トランスフェクションによってHEK293細胞において発現した。細胞培養培地をトランスフェクション24時間後に回収した。

組換えカニクイザルsc-uPAタンパク質をニッケルカラム及び続いてSuperdex_75精製によって精製した。ニッケルカラム精製を10μg/mLアプロチニンの存在下で実施した。Superdex_75の緩衝液及び最終保存緩衝液は、自発性活性化を防ぐために20mM NaAc、150mM NaCl、pH5.0であった{Lin Lら、J Biol Chem. 2010 Apr 2;285(14):10982〜92頁}。最終タンパク質産生物は、純度>90%(SDS-PAGE、Bioanalyzer CE及びSEC-HPLCによって推定)、及び内毒素<1EU/mg(動態学的比濁法検査によって評価)を有した。

(実施例3)
モノクローナル抗uPA抗体の生成:
マウスモノクローナル抗体(mAb)RBFを生成するために、マウスを組換えヒトsc-uPA(配列番号1)で免疫化した。

マウスを皮下で免疫化した。初回免疫化のために、抗原20μgをフロイント完全アジュバントと混合した。続く免疫化においては、フロイント不完全アジュバントを同量の抗原と共に使用した。最終免疫化の10日後、マウス由来の眼血液をELISAによってuPA-特異的抗体について分析した。陽性力価を有するマウスをPBS中10μg抗原で静脈内で追加免役し、3日後に屠殺した。脾臓を無菌的に取り、単一細胞懸濁物に分散させた。脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合を電気融合によって実施した。特異的抗体を分泌している融合細胞を実施例5に記載の特異的結合アッセイを使用して選択した。

(実施例4)
ヒトsc-uPAに結合する抗体の一次スクリーニング:
Immunoplates(Maxisorb、Nunc社)を2μg/ml組換えヒトsc-uPAでコートした。容積比1:1のPBS中20μg/mlアプロチニンと融合細胞培養上清とを、プレートに加え室温、1時間インキュベートした。検出は、ネズミ抗体に特異的なHRP-コンジュゲートポリクローナル抗体(pAb)で行った。

(実施例5)
共役酵素前駆体活性化アッセイ
uPAは、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性プラスミンに転換する。次に、プラスミンもsc-uPAをtc-uPAに活性化し、それにより反応動態を増強する正のフィードバックループが存在する。

本発明者らは、Blouseら、2009(Blouse GEら、J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4647〜57頁)からこのアッセイを適合させ、sc-uPAの活性化を阻害する及び/又はtc-uPAの触媒活性を阻害する抗uPA抗体を同定するために使用した。簡潔には、抗uPA検査抗体を含有する融合細胞培養上清10μLを40μL組換えヒトsc-uPA(配列番号1)と共にHBS-B緩衝液(30mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA、pH7.4)中最終濃度0.625nMでマイクロタイタープレート(Perkin Elmer社、#6005659)で室温、30分間インキュベートした。アッセイ動態への上清の顕著な干渉は観察されず、粗培養上清から直接の非精製抗体のスクリーニングを可能にした。インキュベーション後、50μLをヒトプラスミノーゲン(american diagnostica社、#400)を含有する混合物に最終濃度0.5μMで及び、名称S-2251の発色プラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド(Chromogenix社、#820332)を最終濃度0.5mMで加えた。S-2251加水分解を405nmでの吸光度における放物型増加について3時間、経時的に記録した。吸光度をuPA活性の間接的測定であるプラスミン活性の目安として使用した。低い又は更に欠如している吸光度を生じた抗体をヒトuPAを機能的に阻害しているとして同定し、ヒトsc-uPAの代わりにカニクイザル(cyno)由来組換えsc-uPAを使用するこのアッセイの改変バージョンでのさらなる検査に含めた。他のすべての構成成分及びアッセイ工程は、上に記載のものと同じである。cyno-uPAを機能的に阻害できる抗体を、さらなる特徴付けのために選択した。選択した抗体の精製したバッチを阻害のIC₅₀値を決定するために使用した{Table 9(表9)}。

カニクイザル由来sc-uPA(配列番号3)でのアッセイにおいて検査した0266-000-0010抗体は、0.9nMのIC₅₀値を生じ、この抗体がカニクイザル由来sc-uPAを有効に中和できることも示している。

(実施例6)
uPAR受容体は、共役酵素前駆体活性化アッセイにおいてsc-uPAを固定した
ヒトuPAは、天然でその同族uPA受容体(uPAR)に結合する。ヒトuPARに固定したヒトsc-uPAをヒトプラスミノーゲンをプラスミンに活性化する能力について検査した機能性アッセイを使用した。これは、uPAへのuPARの結合と競合せず、それにより受容体結合及び非受容体結合uPAの両方を機能的に阻害できる機能性抗体の選択を可能にした。簡潔には、細胞表面上にuPARを発現することが示されたU937細胞をHBS-B緩衝液中で洗浄し、次いで内因的に結合したuPAを除くために、グリシン緩衝液(pH3.0)で3分間処置した。低pHを次いでHEPES緩衝液(500mM HEPES、100mM NaCl、pH7.5)で中和した。細胞をHBS-B緩衝液中に細胞10×10⁶個/mLで再懸濁し、12.5nM組換えヒトsc-uPA(配列番号1)と室温で1時間インキュベートした。細胞を未結合sc-uPAを除去するために3回HBS-B緩衝液で洗浄し、次いで細胞0.25×10⁶個に対応する25μLを96ウエルマイクロタイタープレート(Perkin Elmer社、#6005659)のウエルに分注し、抗uPAu検査抗体を含有する25μL融合細胞培養上清と室温、30分間インキュベートした。インキュベーション後、50μLにヒトプラスミノーゲン(american diagnostica社、#400)を含有する混合物を最終濃度0.5μMで及び、名称S-2251の発色プラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド(Chromogenix社、#820332)を最終濃度0.5mMで加えた。S-2251加水分解を405nmでの吸光度における放物型増加について3時間経時的にリアルタイムでモニターした。吸光度をuPARに結合している際のuPA活性の間接的測定であるプラスミン活性の目安として使用した。参照用に0266-0000-0010及び0266-0000-0015の両方並びにヒト化抗体0266-0000-0043は、このアッセイにおいてヒトuPA(配列番号1)の活性をIC₅₀値<0.7nMで阻害した。低い又は更に欠如している吸光度を生じた抗体をuPAR上に固定されている際にヒトuPAを機能的に阻害しているとして同定し、さらなる検査のために選択した。

(実施例7)
抗触媒抗uPA抗体の同定
プラスミノーゲンからプラスミンへのtc-uPA触媒転換を測定するアッセイを、共役酵素前駆体活性化アッセイ(実施例5を参照されたい)において選択された機能性中和抗体がヒトtc-uPAの触媒活性を阻害するかどうかを決定するために使用した。簡潔には、抗uPA検査抗体を含有する融合細胞培養上清10μLをHBS-B緩衝液(30mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA、pH7.4)中最終濃度0.6nMの40μL組換えヒトtc-uPA(R&D Systems社、#1310-SE)とマイクロタイタープレート(Perkin Elmer社、#6005659)において室温、30分間予備インキュベートした。アッセイ動態に上清の顕著な干渉は観察されず、粗培養上清からの直接での未精製抗体のスクリーニングを可能にした。インキュベーション後、50μLにヒトプラスミノーゲン(american diagnostica社、#400)を含有する混合物を最終濃度0.5μMで及び、名称S-2251の発色プラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド(Chromogenix社、#820332)を最終濃度0.5mMで加えた。S-2251加水分解を405nmでの吸光度における放物型増加について3時間経時的にリアルタイムでモニターした。吸光度をプラスミノーゲンからプラスミンへの転換におけるtc-uPA触媒活性の間接的測定であるプラスミン活性の目安として使用した。ヒトtc-uPAの触媒活性を中和できる抗体をさらなるスクリーニングのために選択した。選択した抗体の精製したバッチを阻害のIC₅₀値を決定するために使用した{Table 9(表9)}。

(実施例8)
不活性形態から活性形態へのsc-uPAの活性化を阻害する抗uPA抗体の同定
共役酵素前駆体活性化アッセイ(実施例5を参照されたい)において同定された機能性中和抗uPA抗体が、不活性形態から活性形態のuPAへのヒトsc-uPAの活性化を阻害できるかどうかを決定するために、プラスミンによってヒトsc-uPAが不活性形態から活性形態へ活性化される、活性化アッセイにおいてそれらを更に検査した。簡潔には、抗uPA検査抗体を含有する融合細胞培養上清10μLをHBS-B緩衝液(30mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA、pH7.4)中最終濃度6.4nMの40μL組換えヒトsc-uPA(配列番号1)とマイクロタイタープレート(Perkin Elmer社、#6005659)において室温、30分間予備インキュベートした。インキュベーション後、50μLにヒトプラスミン(Raybiotech社、# MD-14-0070P)を含有する混合物を最終濃度5nΜで及び、名称S-2444の発色uPA基質<Glu-Gly-Ar-p-ニトロアニリド(Chromogenix社、#S-2444)を最終濃度0.5mMで加えた。S-2444加水分解を405での吸光度における放物型増加について3時間経時的に記録した。吸光度を活性形態のヒトuPAの直接測定として使用した。

二重作用性抗体の選択及び特徴付け
受容体結合uPA(実施例5及び6を参照されたい)を含むuPAを阻害し、抗活性化(実施例8を参照されたい)及び抗触媒能力(実施例7を参照されたい)の両方を有することが見出された抗体は、二重作用性として定義され、さらなる特徴付けのために選択された。選択された抗体の精製バッチを、実施例5、7及び8に記載のアッセイ(Table 9(表9)を参照されたい)の阻害のIC50値を決定するために使用した。

(実施例9)
内因性由来uPAを機能的に阻害する抗体
選択された二重作用性抗uPAモノクローナル抗体が内因的由来uPAを機能的に阻害できるかどうかを評価するために、本発明者らは、ヒトM1及びM2マクロファージ由来uPAの活性が測定できるアッセイを確立した。簡潔にはマクロファージをヒトバフィーコートから単離した単球からM1及びM2に成熟させた。細胞をRM緩衝液(0.4mM MgS0₄、0.5mM MgCl₂、0.5mM CaCl₂、20mM HEPES、0.01%BSA、pH7.4)で洗浄及び再懸濁した。細胞0.5×10⁶個に対応する40マイクロリットルを96ウエルマイクロタイタープレート(Perkin Elmer社、#6005659)の1ウエルに加え、精製抗uPA検査抗体10μLを加え、反応物を室温、30分間インキュベートした。インキュベーション後、50μLにヒトプラスミノーゲン(american diagnostica社、#400)を含有する混合物を最終濃度0.5μMで及び、名称S-2251の発色プラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド(Chromogenix社、#820332)を最終濃度0.5mMで加えた。S-2251加水分解を405nmでの吸光度における放物型増加について96ウエルマイクロタイタープレートで3時間経時的に記録した。吸光度をマクロファージ由来uPA活性の間接的測定値であるプラスミン活性の目安として使用した。参照用に、0266-0000-0010は1.3nMのIC₅₀でuPAを阻害し、0266-0000-0015はこのアッセイにおいてIC₅₀<0.7nMを有した。重要なことにヒト化抗体、0266-0000-0043も、マクロファージ由来uPA活性を2.1nMのIC₅₀で阻害できた。M1及びM2マクロファージ由来uPAを阻害できる二重作用性抗体を、マクロファージが疾患の発症において主な役割を演じると考えられていることから、関節リウマチを処置するための候補として選択した。

(実施例10)
フローサイトメトリーによって分析したヒトin vitro生成マクロファージへの結合
材料及び方法:バフィーコートは、Copenhagen University Hospitalからの健常志願者から得た。単球をHuman Monocyte Enrichment Coctail Rosette Separationを使用して単離した。精製した単球を6日間、40ng/ml rhM-CSFの存在下、37℃、5%C0₂で培養した。培地を3日目に40ng/ml rhM-CSFを含有する新鮮培地で交換した。6日目に培地をrhIFN-ガンマ(50ng/ml)を含有する培養培地に再度交換し、細胞をM1マクロファージに分化させるために一晩更にインキュベートした。細胞を10、1又は0.1μg/mlの抗uPA mAbクローン0266-0000-0010(IgG1)又は0266-0000-0015(IgG1)で染色した。マウスIgG1アイソタイプ対照(10μg/ml)を陰性対照として使用した。二次APCコンジュゲートヤギ抗マウスIgGを検出のために使用した。フローサイトメトリー分析をBD FACS Fortessa(Becton & Dickinson社)で実施した。

結果:両方の抗uPAモノクローナル抗体クローン(0266-0000-0010及び0266-0000-0015)のM1マクロファージへの結合を実証した(図1)。両方の抗体は、同様の強度を有する容量依存的結合を示したが、わずかに高いMFI値が0266-0000-0015について記録され、いくらか高い親和性を示した{Table 1(表1)}。これは、Biacore分析によって作成された親和性データと一致する。アイソタイプ対照抗体(マウスIgG1)は、10μg/mlで低いバックグラウンド染色だけを示した。

Table 1(表1)は、uPA抗体の2つの異なるクローンで染色したM1マクロファージについての平均蛍光強度(MFI)値を示している。

(実施例11)
抗原結合親和性の決定
ヒト及びカニクイザルsc-uPA(配列番号1及び3)に対する抗uPA mAbの親和性をBiacore T200 instrument(GE Healthcare社)を使用するSPRによって測定した。これらの研究は、直接結合手順を使用して実施した。それぞれの抗体は、遊離アミン基を介してセンサーチップ表面のカルボキシメチル化デキストラン膜(CM5/CM4)に300〜500共鳴単位(RU)のレベルまで共有結合でカップリングした。HBS-B(300mM Hepes、135mM NaCl、1mM EDTA及び1%BSA、pH7,4)中のSc-uPAを種々の濃度で注入し、センサーチップ表面の一定緩衝液流での解離ピリオドが続いた。注入時間は60秒間であり、180秒間の解離が続いた。再生は、グリシンHCl pH1.5の2回の短パルス注射によって実施した。

相互作用についての動力学的パラメーター(k_a、k_d及びK_D)を1:1相互作用ラングミュアフィッティングモデルを使用した算出した。

測定された親和性はすべて低nM範囲内であった。

ヒト又はカニクイザルsc-uPAと固定mAbs 0266-0000-0010及び0266-0000-0015との間の相互作用についての動力学的パラメーターをSPR分析によって測定した。結果をTable 2(表2)に示す。会合速度定数(ka)及び解離速度定数(kd)を測定した。平衡解離定数はKD=kd/kaとして算出する。

(実施例12)
融合細胞由来抗uPA mAb VL及びVH cDNAのクローニング及び配列決定
抗体0266-0000-0010及び0266-0000-0015をそれぞれ発現しているm-uPA-1F21A1及びm-uPA-1F58A1と名付けられた2つの異なる抗uPA mAb発現融合細胞から全RNAを抽出した。RNAを融合細胞からRNeasy mini kit(Qiagen社、カタログ番号74106)を使用して抽出し、得られたRNAのアリコートをSMARTer RACE cDNA Amplification kit(Clontech社、カタログ番号634923)を、SMARTer II Aオリゴヌクレオチドと共に5' RACE CDSプライマーAを使用する5' RACEのために製造者の説明書に従って使用して第1鎖cDNA合成のための鋳型として使用した。2つの抗uPA融合細胞のそれぞれ由来の軽鎖可変ドメイン(VL)及び重鎖可変ドメイン(VH)コード領域cDNAを次にマウスLC、カッパ特異的リバースプライマー(5' gga gct ggt ggt ggc ate tea gga cct ttg 3')と共に又はマウスIgG1配列を認識するリバースプライマー(5' aaaaa tctagaATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC 3')と共にユニバーサルプライマーA混合物(UPM)を使用してPCR増幅した。PCR反応をphusion PCR mix(FinnZymes社、カタログ番号F-531 L)を使用して実施した。得られたPCR断片をZero blunt Topo PCR cloning kit(Invitrogen社、カタログ番号K280040)を使用してクローニングし、配列決定した。

(実施例13)
抗uPA抗体についてのヒト化モデル
0266-0000-0010の配列を融合細胞1F21A1のクローニングから実施例12に記載のとおり得た、重鎖及び軽鎖の可変部分をTable 3(表3)に列挙する。本明細書において全長0266-0000-0010VHは配列番号7において示し、KabatのCDR定義によるCDRは配列番号9、配列番号10及び配列番号11にそれぞれ示す。更に全長0266-0000-0010VLは配列番号8に示し、KabatのCDR定義によるCDRは、配列番号12、配列番号13及び配列番号14にそれぞれ示す。

本実施例において使用するすべての付番は、Kabat付番スキームを参照する。

0266-0000-0010の3DモデルをMOE(www.chemcomp.comから入手可能)における標準的技術を使用して構築し、有効CDR領域(VH:31〜35B、50〜58、95〜102;VL:24〜34、50〜56、89〜97)の4.5Å以内のすべての残基をマスク残基として定義した。マスク残基は、CDRにおける結合を持続させるためにすべて潜在的に重要である。

0266-0000-0010についてのマスク残基は、重鎖についての1〜4、22、27〜37、47〜60、69〜71、73、78、91〜104位及び軽鎖についての1〜5、6、22〜36、46〜58、62、64〜71、87〜98位を含む。

生殖系列探索及び手作業での調査を使用して、VH3_21及びJH4を重鎖についての適切なヒト生殖系列組合せとして同定し、対応する配列をTable 4(表4)配列番号15に列挙する、並びにV6D_41及びJK4を軽鎖についての適切なヒト生殖系列組合せとして同定し、対応する配列をTable 4(表4)配列番号16に列挙する、しかし他の生殖系列も使用できる可能性がある。

ここでヒト化は、次の規定に従って実施されてよい:
- マスクの外の残基はヒトと見なされる
- マスク内及びKabat CDR内の残基はネズミと見なされる
- マスク内及び、マウス/生殖系列コンセンサスを含むKabat CDRの外の残基は共通配列と見なされる
- マスク内及び、マウス/生殖系列差異を含むKabat CDRの外の残基はヒトと見なされ、これらの残基は潜在的逆突然変異に供される。

0266-0000-0010の有効CDR領域を生殖系列に移植することは、0266-0000-0010の基礎ヒト化構築物を形成し、hz0266-0000-0010及びその可変部分をTable 5(表5)に列挙する。重鎖を配列番号17に示し、軽鎖を配列番号18に示す。

hz0266-0000-0010配列の分析から、Kabat定義によるCDRは、Table 6(表6)に示すとおりであり、対応するネズミmAb 0266-0000-0010と同一である。

0266-0000-0010とhz0266-0000-0010との間のマスク残基におけるいかなる矛盾も潜在的逆突然変異を作り、潜在的逆突然変異の一覧をTable 7(表7)に示す。

さらなるリード(lead)は、少なくとも1個の潜在的脱アミド化部位NSを軽鎖の90〜91位に、及び2個の潜在的イソアスプ(isoasp)部位を重鎖の95〜96及び98〜99に含有する。これらの潜在的部位を含まない候補を評価するために、Table 8(表8)に示す変異体を調製する。

すべての潜在的なヒト化mAbを調査するために、Table 7(表7)及びTable 8(表8)に列挙した上の変異体のすべての組合せが産生される必要があり、親和性スクリーニング、発現分析及び安定性研究に基づいて最終ヒト化候補が選択される。

(実施例14)
商業的に入手できるモノクローナル抗体の特徴付け
いくつかの先行技術抗ヒトuPAモノクローナル抗体が報告されており、商業的に販売されている。本発明者らに入手可能な抗体のすべてを本出願において報告した本発明者らの抗uPA二重作用性モノクローナル抗体(実施例5、7及び8を参照されたい)を選択するために使用したアッセイにおいて検査した。Table 9(表9)に列挙した結果は、検査した18個の抗体の内の4個が共役酵素前駆体活性化アッセイ(実施例5を参照されたい)において及び触媒アッセイ(実施例7を参照されたい)においての両方でヒトuPA活性を阻害できたが、sc-uPA活性化アッセイ(実施例8を参照されたい)においてはできなかったことを示している。1個の抗体は、共役酵素前駆体活性化アッセイ(実施例5を参照されたい)及びsc-uPA活性化アッセイ(実施例8)の両方においてuPA活性を阻害できる。他の9個の抗体は、いずれのアッセイにおいても顕著にuPAを阻害しなかった。重要なことに、先行技術抗体はいずれも、3種すべてのアッセイ(実施例5、7及び8におけるアッセイを参照されたい)においてuPA活性を阻害できなかった。

(実施例15)
ヒト好中性顆粒球(neutrophil granulocyte)(PMN)において内在性uPAを機能的に阻害する抗体
選択された二重作用性抗uPAモノクローナル抗体がヒト好中球において内在性uPAを機能的に阻害できるかどうかを評価するために、本発明者らは実施例9に記載のアッセイを使用した。

PMNをMal0vのNovo Nordisk A/Sの志願ドナー団体によって提供された血液から得た。手順はScientific Ethical Committees of Region Copenhagen(Journal number H-D-2007-0055)によって承認されている。新鮮採取血液をEDTAを含有するバイアルに回収した。血液細胞を、血液(4部)をFicoll-Paque PLUS(GE Health Care社)勾配(3部)を通して30分間(400×g)、室温での遠心分離によって分離した。顆粒球含有層をデキストラン500(Sigma社)を含有するPBS中に1時間、混入している赤血球を除去するために懸濁した。上清を5分間(250×g)、室温で遠心分離し、残存している赤血球を0.2%NaClを使用して55秒間浸透圧的に溶解した。溶液を1.2%NaCl+PBSによって等張にし、浸透圧的溶解を反復する前に250×gで5分間遠心分離した。遠心分離後、PMNを反応混合物(RM):0.4mM MgS0₄ ^*7H₂0、0.5mM MgCl₂、0.5mM CaCl₂、20mM HEPESを補充したHBSS:(カタログ番号14175 Gibco社)137mM NaCl、5.3mM KCl、0.33mM Na₂HP0₄、4mM NaHC0₃、0.44mM KH₂P0₄、5mMグルコースに再懸濁した。細胞密度をNucleoCounter(Chemometec社)によって決定した。検査化合物をRMに溶解した。懸濁物は>95%PMNを含有した。

組換えヒトGM-CSFを、本発明者らはこれがuPA活性を増加させることを以前示したことから、10nMでPMN懸濁物に加えた。ウエルをヒトフィブリノーゲン(カタログ番号F3879-1G、Sigma社)でコートした。各ウエルは0.35〜0.5 10⁶PMN、0.5μMヒトプラスミノーゲン(American diagnostic社)、0.5mM発色プラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリドS-2251(Chromogenix社)及び抗uPA検査抗体を含有した。405及び650nmでの吸光度を5分ごとに3時間、37℃、SpectraMaxPlus(Molecular Devices社)で測定した。吸光度(405〜650nm)からの曲線はプラスミン活性の目安である。曲線を微分し、最大傾斜を最大uPA活性として使用した。

結果は、二重作用性抗体0266-0000-0010がuPAを14nMのIC₅₀で、及び0266-0000-0015がIC₅₀ 0.9nMで阻害したことを示した。単一作用性0266-0000-0016及び0266-0000-0019は、それぞれ25及び約200nMのIC₅₀で低い強度を示した。

(実施例16)
抗ヒトuPA抗体のヒト化
抗体のヒト化形態は、実質的にヒト免疫グロブリン(受容体免疫グロブリンと称する)由来の可変フレームワーク領域及び実質的にネズミ抗体由来のCDRを有する、この場合mAb 0266-0000-0010(配列番号7及び8)。結合親和性及び特異性を維持するために不可欠である可能性がある逆突然変異は、3Dモデル分析によって予測された。抗体0266-0000-0010のヒト化形態、mAb 0266-0000-0043を産生しSPR及び発色基質での共役酵素前駆体活性化アッセイを使用するuPA機能性アッセイによって評価した。

実験データは、mAb 0266-0000-0043及びmAb 0266-0000-0010の組換えによって産生したバージョン(rec0266-0000-0010)が、ヒト及びカニクイザルsc-uPAに同様の結合プロファイルを;及びヒト又はカニクイザルuPAによるプラスミノーゲン活性化に同等の阻害効果を有することを実証した。mAbs 0266-0000-0043及びrec0266-0000-0010のタンパク質配列をTable 10(表10)に示す。クローニング目的のために配列番号20のVLからCLへの移行部分の配列は、完全なネズミRADAAカッパ配列の代わりにRTVAA配列モチーフ、すなわちヒトカッパ配列由来の2つの残基「TV」を保有する。

mAbのための発現ベクターの生成
軽鎖又は重鎖についてのコード配列をpJSV002、CMVプロモーターに基づく発現ベクターの、EcoRIとBam HI部位の間に挿入した。CD33由来のシグナルペプチド(mplllllpllwagala)を分泌を促進するためにコード配列の前に加えた。

組換えmAb発現
軽鎖及び重鎖それぞれをコードするプラスミドDNAを293fectin(商標)試薬(Invitrogen社、カタログ番号12347)を使用して1:1の量比でFreestyle(商標)293-F細胞(Life Technologies社、カタログ番号R79007)に共トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を4mMグルタミン(Life Technologies社、カタログ番号25030-024)、1%PLURONIC(登録商標)F68(Gibco社、カタログ番号24040-032)及びペニシリンストレプトマイシン抗生物質(Life Technologies社、カタログ番号10378016)を含有する無血清FreeStyle 293培地(Gibco社、カタログ番号12338)において1mlあたり細胞1×10⁶個で増殖させ、5日間、37℃、8%C0₂で振とうしながらインキュベートした。上清をトランスフェクション5日後に回収し、遠心分離によって清澄化した。

DNAトランスフェクション:
・トランスフェクションのために使用した培養物の細胞密度は細胞0.9〜2.0×10⁶個/mlであった。
・0.5μg軽鎖(LC)ベクターDNAと0.5μg重鎖(HC)ベクターDNAとの混合物を細胞培養物1mlあたりに使用した。
・DNAをOpti-MEM培地(Gibco社)中、30μl培地/μg DNAに希釈し、混合し、室温(23〜25℃)、5分間インキュベートした。
・293Fectin(商標)(Invitrogen社)をトランスフェクション試薬としてDNA 1μgあたり1μlの濃度で使用した。
・293Fectin(商標)をOpti-MEM培地(Gibco社)に30×希釈し、混合し、室温(23〜25℃)、5分間インキュベートした。
・DNA及び293Fectin溶液を混合し、室温(23〜25℃)、25分間インキュベートしたままにした。
・DNA-293Fectin混合物を次いで細胞培養物に直接加えた。
・トランスフェクトした細胞培養物を37℃、8%C0₂及び125rpmの振とうインキュベーターに移した。
・トランスフェクション5日後、細胞培養上清を遠心分離によって収集し、0.22μm PESフィルター(Corning社)を通すろ過が続いた。
・抗体産生物の定量分析をForteBio Octet system及びプロテインAバイオセンサーを使用して清澄化細胞培養上清についてBiolayer Interferometryによって直接実施した。

精製
分泌された0266-0000-0043を含有する培養上清を遠心分離(15,000rpm×20分間、4℃)によって収集し、次いで0.45μmセルロース硝酸塩膜でのろ過によって清澄化した。清澄化した上清を5mL MabSelectSuReカラム(GE 17-5438-02)に添加し、PBS 10カラム容積での洗浄が続いた。結合したmAbを次いで20mMギ酸及び100mMアルギニンpH3.5で溶出し、2mL画分として1M Tris-HCl pH9.0 200ulを含むガラス管に回収した。ピーク画分をプールし、Amicon ultra 15 centrifugal units(30kD MWCO、Millipore社)でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に緩衝液交換した。濃縮後、最終タンパク質濃度を280nm吸光度をNANODROP UV分光光度計で測定することによって決定した。タンパク質純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。内毒素レベルをLAL test(Charles River社)によって評価した。SDS-PAGEゲル設定をTable 12(表12)に示し、得られたゲルを図3に示す。

SE-HPLC分析
典型的にはSE-HPLCのためにタンパク質50μgをTSKSWxl 3000カラム(Tosoh社、部品番号08541、300×7.8mm)で1200 HPLCシステム(Agilent Technologies社)を使用して分析した。他に述べる場合を除いて緩衝液は、16mM Na2HPO4、3mM KH2PO4、247mM NaCl、6mM KCl、5%イソプロパノールv/v pH6.8であり、流速は0.5ml/分であった。SE-HPLC結果要約を下のTable 13(表13)に及び結果を図4に示す。

SPRによる結合動態の測定
ネズミmAbと比較するために、組換えヒトsc-uPAタンパク質(配列番号1)及びカニクイザルsc-uPA(配列番号3)への結合プロファイルを表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。

実験はBiacore(商標)instrument(GE Healthcare社)で実施し、BIAcore 4000評価ソフトウェアで分析した。抗ヒトuPA rec0266-0000-0010(配列番号19及び20)並びに0266-0000-0043(配列番号21及び22)をCM5センサーチップ(GE Healthcare社;カタログ番号BR-1000-12)のフローセルにアミンカップリングを介して150〜600RUでそれぞれ直接固定化した。組換えヒトsc-uPA及びカニクイザルsc-uPAタンパク質を1%BSA緩衝液を含むHBS-N(GE Healthcare Cat BR-1006-70)に希釈係数3×、範囲1000〜0.13nMで希釈した。組換えヒトsc-uPA及びカニクイザルsc-uPAタンパク質を60秒間注入し、600秒間の解離相が続いた。結合曲線を、25℃、30μl/分の流速で測定した。チップ表面の再生は、pH1.5グリシンで25秒間、30μl/分で実施した。動力学的パラメーターの決定は、1:1結合モデルをフィッティングすることによって実施した。動力学的パラメーターを算出し下のTable 14(表14)に示す。

rec0266-0000-0010(配列番号19及び20)並びに0266-0000-0043(配列番号21及び22)の両方は、ヒト及びカニクイザルsc-uPA両方への非常に良好な結合を示した。結合動態プロファイルは、rec0266-0000-0010と0266-0000-0043との間で類似している。

共役酵素前駆体活性化アッセイ
In vivoではuPAは、酵素前駆体プラスミノーゲンを活性プラスミンに転換する。次に、プラスミンもsc-uPA(pro-uPA)をtc-uPA(活性uPA)に活性化転換し、それにより反応動態を増強する正のフィードバックループが存在する。この機構は、発色プラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-pNA(S-2251、Chromogenix社、カタログ番号0082033239)を使用して生成されたプラスミンの量をモニタリングすることによってuPAの活性を測定するために使用できる。図5を参照されたい。

uPA媒介プラスミノーゲン活性化を中和できる抗uPA結合mAbの阻害効果は、sc-uPA及びプラスミノーゲンの存在下でのS-2251の加水分解によって測定できる。sc-uPA(0.25nM)を種々の濃度のrec0266-0000-0010又は0266-0000-0043(0〜400ng/ml)とHBS-B中、室温、30分間予備インキュベートした。0.5Mプラスミノーゲン(Glu-Plasminogen、Haematologic Technologies社、カタログ番号HCPG-0130)及び0.5mMプラスミン基質H-D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド(S-2251)の添加は、37℃で反応を開始させた。S-2251加水分解を405nmでの吸光度における放物型増加についてモニターした。

HBS-B緩衝液は:30mM Hepes、135mM NaCl、1mM EDTA、0.1%BSA、pH7.4を含有し、ろ過した。

共役酵素前駆体活性化アッセイ(1試料あたり):
・HBS-B緩衝液178.51μlをエッペンドルフチューブに加える
・ヒトsc-uPA試料をPBSで×1000希釈し、5.68μlをエッペンドルフチューブに加える
・抗uPA mAbをPBSで1mg/mlに標準化し、21μlをチューブに加える
・ボルテックスによって混合し、R.T.、30分間インキュベート
・インキュベーション終了5分前、プラスミノーゲン1.25μl及びS-2251 3.57μlを新たなエッペンドルフチューブでボルテックスによって混合
・プラスミノーゲンとS-2251との混合物4.82μlをHBS-B、sc-uPA及びmAb(合計容積210μl)を含有するエッペンドルフチューブに加える
・ボルテックスによって混合、遠心分離
・プレートをR.T.で405でのABSを5分(又は10分)ごとに4時間読み取る

共役酵素前駆体活性化アッセイの結果を図6〜図9に示す。図6は、0、20、50、100μg/mlの濃度でのヒトsc-uPA(hu pro-uPA)へのmAb rec0266-0000-0010(0010)を示す。図7は、0、20、50、100、200、400μg/mlの濃度でのヒトsc-uPA(hu pro-uPA)へのmAb 0266-0000-0043(0043)を示す。図8は、0、20、50、100μg/mlの濃度でのカニクイザルsc-uPA(cyno pro-uPA)へのmAb rec0266-0000-0010(0010)を示し、図9は、0、20、50、100、200、400μg/mlの濃度でのカニクイザルsc-uPA(cyno pro-uPA)へのmAb 0266-0000-0043(0043)を示す。

SPR及び共役酵素前駆体活性化アッセイの両方からの結果は、rec0266-0000-0010及び0266-0000-0043がヒト及びカニクイザルsc-uPAについて同様の結合プロファイル;及びヒト及びカニクイザルuPAによるプラスミノーゲン活性化に同等の阻害効果を有することを実証している。

(実施例17)
1個の逆突然変異又は4個の逆突然変異を含有するヒト化抗uPA mAbの産生
ヒト化抗uPA LC並びにHC(ヒトIgG4及びヒトIgG1アイソタイプ)をコードするプラスミドを単一の逆突然変異をプラスミドに導入するための出発点として使用した。VLにおいて4個(V2I、T22S、V58I及びT69S)並びにVHにおいて4個(E1D、Q3K、S49A、A93T)の候補逆突然変異を同定し、特異的VL又はVH点変異を導入するためのフォワード及びリバースDNAプライマーをEurofins Genomics社、Germanyから購入した。部位特異的変異導入をAgilent社からのQuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit、鋳型としてLC又はHC発現プラスミド、変異導入特異的フォワード及びリバースプライマー対を使用し、製造者によって提供された説明書を使用して実施した。得られた発現プラスミドは、1個の逆突然変異を含む4個の異なるヒト化抗uPA LC及び、1個の逆突然変異を含む8個の異なるヒト化抗uPA HCをコードしていた(4個の異なる逆突然変異はIgG4に及びIgG1に導入された)。1個の単一逆突然変異を4個すべての逆突然変異をVLに、又は4個すべての逆突然変異をVHに、のいずれかで有する2つの抗uPA mAb変種と共に含有する16個の異なるヒト化抗uPA mAb変種(ヒトIgG4アイソタイプ)を、DNA(0.5mg LC及び0.5mg HC)合計1mg並びに293fectin(Invitrogen社、カタログ番号12347-019)1mlをHEk293トランスフェクション1Lあたりに使用するHEK293懸濁細胞の一過性共トランスフェクションによって発現させた。細胞は、典型的にはトランスフェクション後5〜7日間培養し、得られた細胞培養上清を収集し、プロテインAに基づく方法により精製した。18個のヒト化抗uPA mAb変種(1個の逆突然変異を含む16個の変種、及び4個の逆突然変異を含む2個の変種)をすべて実施例5及び実施例16に記載の共役酵素前駆体活性化アッセイにおいて検査した。mAb 0266-0000-0043は多数の示唆された逆突然変異を有するヒト化抗体の一例である。mAb 0266-0000-0043は、実施例16で実証したとおり共役酵素前駆体活性化アッセイにおいてヒトuPAを効果的に阻害する。

(実施例18)
重鎖での抗ヒトuPA潜在的イソアスプ部位の除去
rec0266-0000-0010の重鎖における潜在的な2個のイソアスプ部位「D95G96」及び「D98G99」(太字で強調する)の除去の可能性を検査するために、単一変異変種を産生し、ヒトsc-uPAへのそれらの結合親和性をBiacoreによって測定した。

単一変異変種の生成
変異をQuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社、カタログ番号200521)での部位特異的変異導入によって導入し、各変異についてのコドン交換を下のTable 16(表16)に列挙する。

変異体変種発現及び精製
単一変異を保有している重鎖をコードしているプラスミドDNAを293fectin(商標)試薬(Invitrogen社、カタログ番号12347)を使用して1:1の量比でFreestyle(商標)293-F細胞(Life Technologies社、カタログ番号R79007)に野生型軽鎖のものと共トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を4mMグルタミン(Life Technologies社、カタログ番号25030-024)、1%PLURONIC(登録商標)F68(Gibco社、カタログ番号24040-032)及びペニシリンストレプトマイシン抗生物質(Life Technologies社、カタログ番号10378016)を含有する無血清FreeStyle 293培地(Gibco社、カタログ番号12338)において1mlあたり細胞1×10⁶個で増殖させ、5日間、37℃、8%CO₂で振とうしながらインキュベートした。上清をトランスフェクション5日後に回収し、遠心分離によって清澄化した。

DNAトランスフェクション:
・トランスフェクションのために使用した培養物の細胞密度は細胞0.9〜2.0×10⁶個/mlであった。
・0.5μg軽鎖(LC)ベクターDNAと0.5μg重鎖(HC)ベクターDNAとの混合物を細胞培養物1mlあたりに使用した。
・DNAをOpti-MEM培地(Gibco社)中、30μl培地/μg DNAに希釈し、混合し、室温(23〜25℃)、5分間インキュベートした。
・293Fectin(商標)(Invitrogen社)をトランスフェクション試薬としてDNA 1μgあたり1μlの濃度で使用した。
・293Fectin(商標)をOpti-MEM培地(Gibco社)に30×希釈し、混合し、室温(23〜25℃)、5分間インキュベートした。
・DNA及び293Fectin溶液を混合し、室温(23〜25℃)、25分間インキュベートしたままにした。
・DNA-293Fectin混合物を次いで細胞培養物に直接加えた。
・トランスフェクトした細胞培養物を37℃、8%CO₂及び125rpmの振とうインキュベーターに移した。
・トランスフェクション5日後、細胞培養上清を遠心分離によって収集し、0.22μm PESフィルター(Corning社)を通すろ過が続いた。
・抗体産生物の定量分析をForteBio Octet system及びプロテインAバイオセンサーを使用して清澄化細胞培養上清でBiolayer Interferometryによって直接実施した。

培養上清を遠心分離(15,000rpm×20分間、4℃)によって収集し、0.45μmセルロース硝酸塩膜でのろ過によって清澄化した。清澄化した上清を50μl PreDictor MabSelect SuRe、96ウエルフィルタープレート(GE 28-9258-25)に添加した。結合したmAbを次いで20mMギ酸及び100mMアルギニンpH3.5で溶出し、Amicon ultra 15 centrifugal units(30kD MWCO、Millipore社)でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に緩衝液交換した。試料の濃度をNanoDrop(Thermo Scientific社、Molar Absorbance=1.553)によって測定した。試料の純度を215nmでのSEC-UPLCによって75%から99%の範囲と推定した。

SPRによる結合動態の測定
組換えヒトsc-uPAタンパク質(配列番号1)への結合親和性を表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。

実験はBiacore(商標)instrument(GE Healthcare社)で実施し、BIAcore 4000評価ソフトウェアで分析した。抗ヒトuPA mAb変種をCM5センサーチップ(GE Healthcare社;カタログ番号BR-1000-12)のフローセルにアミンカップリングを介して150〜600RUでそれぞれ直接固定化した。組換えヒトsc-uPAを1%BSA緩衝液を含むHBS-N(GE Healthcare社カタログBR-1006-70)に希釈係数3×、範囲1000〜0.13nMで希釈した。組換えヒトsc-uPAを60秒間注入し、600秒間の解離相が続いた。結合曲線を、25℃、30μL/分の流速で測定した。チップ表面の再生は、pH1.5グリシンで25秒間、30μl/分で実施した。動力学的パラメーターの決定は、1:1結合モデルをフィッティングすることによって実施した。結合親和性を算出し下のTable 17(表17)に示す。

結果は、潜在的イソアスプ部位「D95G96」をrec0266-0000-0010-VH_D95V及びrec0266-0000-0010-VH_G96Kによって親和性を失うことなく除去できること;及び潜在的イソアスプ部位D98G99をrec0266-0000-0010-VH_G99Sによって親和性を失うことなく除去できることを示している。rec0266-0000-0010-VH_D95V及びrec0266-0000-0010-VH_G99Sの両方が、共役酵素前駆体活性化アッセイにおいてヒトuPAによって誘導されるプラスミノーゲン活性化への阻害効果を保持していることが実証されている。

(実施例19)
軽鎖での抗ヒトuPA潜在的脱アミド部位の除去
rec0266-0000-0010の軽鎖における潜在的脱アミド部位「N90S91」(太字で強調する)の除去の可能性を検査するために、単一変異変種を産生し、ヒトsc-uPAへのそれらの結合親和性をBiacoreによって測定した。

単一変異変種の生成
変異をQuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies社、カタログ番号200521)での部位特異的変異導入によって導入し、各変異についてのコドン交換を下に列挙する。

変異体変種発現及び精製
単一変異を保有している軽鎖をコードしているプラスミドDNAを293fectin(商標)試薬(Invitrogen社、カタログ番号12347)を使用して1:1の量比でFreestyle(商標)293-F細胞(Life Technologies社、カタログ番号R79007)に野生型重鎖のものと共トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を4mMグルタミン(Life Technologies社、カタログ番号25030-024)、1%PLURONIC(登録商標)F68(Gibco社、カタログ番号24040-032)及びペニシリンストレプトマイシン抗生物質(Life Technologies社、カタログ番号10378016)を含有する無血清FreeStyle 293培地(Gibco社、カタログ番号12338)において1mあたり細胞1×10⁶個で増殖させ、5日間、37℃、8%CO₂で振とうしながらインキュベートした。上清をトランスフェクション5日後に回収し、遠心分離によって清澄化した。

DNAトランスフェクション:
・トランスフェクションのために使用した培養物の細胞密度は細胞0.9〜2.0×10⁶個/mlであった。
・0.5μg軽鎖(LC)ベクターDNAと0.5μg重鎖(HC)ベクターDNAとの混合物を細胞培養物1mlあたりに使用した。
・DNAをOpti-MEM培地(Gibco社)中、30μl培地/μg DNAに希釈し、混合し、室温(23〜25℃)、5分間インキュベートした。
・293Fectin(商標)(Invitrogen社)をトランスフェクション試薬としてDNA 1μgあたり1μlの濃度で使用した。
・293Fectin(商標)をOpti-MEM培地(Gibco社)に30×希釈し、混合し、室温(23〜25℃)、5分間インキュベートした。
・DNA及び293Fectin溶液を混合し、室温(23〜25℃)、25分間インキュベートしたままにした。
・DNA-293Fectin混合物を次いで細胞培養物に直接加えた。
・トランスフェクトした細胞培養物を37℃、8%CO₂及び125rpmの振とうインキュベーターに移した。
・トランスフェクション5日後、細胞培養上清を遠心分離によって収集し、0.22μm PESフィルター(Corning社)を通すろ過が続いた。

タンパク質精製:
培養上清を遠心分離(15,000rpm×20分間、4℃)によって収集し、0.45μmセルロース硝酸塩膜でのろ過によって清澄化した。清澄化した上清を50μl PreDictor MabSelect SuRe、96ウエルフィルタープレート(GE 28-9258-25)に添加した。結合したmAbを次いで20mMギ酸及び100mMアルギニンpH3.5で溶出し、Amicon ultra 15 centrifugal units(30kD MWCO、Millipore社)でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に緩衝液交換した。試料の濃度をNanoDrop(Thermo Scientific社、モル吸光度=1.553)によって測定した。試料の純度を215nmでのSEC-UPLCによって75%から99%の範囲と推定した。

SPRによる結合動態の測定
組換えヒトsc-uPAタンパク質(配列番号27)への結合親和性を表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。

実験はBiacore(商標)instrument(GE Healthcare社)で実施し、BIAcore 4000評価ソフトウェアで分析した。抗ヒトuPA mAb変種をCM5センサーチップ(GE Healthcare社;カタログ番号BR-1000-12)のフローセルにアミンカップリングを介して150〜600RUでそれぞれ直接固定化した。組換えヒトsc-uPAを1%BSA緩衝液を含むHBS-N(GE Healthcar社カタログ番号BR-1006-70)に希釈係数3×範囲1000〜0.13nMで希釈した。組換えヒトsc-uPAを60秒間注入し、600秒間の解離相が続いた。結合曲線を、25℃、30μL/分の流速で測定した。チップ表面の再生は、pH1.5グリシンで25秒間、30μl/分で実施した。動力学的パラメーターの決定は、1:1結合モデルをフィッティングすることによって実施した。結合親和性を算出し下のTable 20(表20)に示す。

結論は、潜在的脱アミド化部位「N90S91」がrec0266-0000-0010-VL_N90E、rec0266-0000-0010-VL_N90H、rec0266-0000-0010-VL_N90Q、rec0266-0000-0010-VL N90S及びrec0266-0000-0010-VL N90Tによって組換えヒトsc-uPAへの親和性を失うことなく除去できることである。

(実施例20)
mAb 0266-0000-0043のヒトuPA(配列番号1)へのHDX-MSによるエピトープマッピング
HDX-MSへの導入
HDX-MS技術は、タンパク質の水素交換(HDX)が質量分析(MS)によって容易に追跡できることを利用している。水素を含有する水性溶媒を重水素を含有する水性溶媒で交換することによる、タンパク質中の所与の部位での重水素原子の取り込みは、1Daの質量の増加をもたらす。この質量増加は、交換反応由来のクエンチされた試料の質量分析での分析によって時間の関数としてモニターできる。重水素標識情報は、クエンチされた状態でのペプシン消化に続く、得られたペプチドの質量増加によってタンパク質の特異的領域に局所化できる。

HDX-MSの1つの使用は、タンパク質タンパク質複合体形成の際に低減する水素交換の領域を同定することによって分子相互作用に関与する部位を探索することである。通常、結合界面は、溶媒の立体排除による水素交換率における顕著な低減によって明らかになる。結合界面は、短いインキュベーション時間(10秒間〜40秒間)の際に観察される水素交換における低減によって典型的には明らかになる。結合界面内での水素交換の低減は、長いインキュベーション時間が使用される場合には横ばいになることがしばしば見出されている。HDX-MSの別の使用は、短いインキュベーション時間(すなわち10秒間〜20秒間)について水素交換レベルに変化がない一方で長いインキュベーション時間(40秒間以上)後に水素交換における低減が観察されることによって特徴付けられる、分子内のアロステリック変化を帰属させることである。複合体形成によって誘導されるタンパク質タンパク質複合体形成及びアロステリック変化は、結合パートナーの存在及び不在下で時間の関数としていずれかのタンパク質メンバーに取り込まれた重水素の総量を単に測定することによってHDX-MSによって検出できる。HDX-MS技術は、天然構成成分、すなわち標的タンパク質及び抗体/Fab断片を使用し、溶液で実施される(HDX-MS技術についての最近の概説について、Wales and Engen、Mass Spectrom. Rev. 25、158 (2006)を参照されたい)。

材料及び方法
使用したタンパク質バッチは、ヒトuPA(huPA):ヒト組換えsc-uPA(配列番号1)及びmAb 0266-0000-0043(配列番号21及び22)であった。すべてのタンパク質を実験前にPBS pH7.4に緩衝液交換した。

HDX実験をSynapt G2 mass spectrometer(Waters社)に連結したnanoACQUITY UPLC System with HDX Technology(Waters社)で実施した。Waters HDX系は、重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLC系への注入及び消化時間制御を実施するLeapShellソフトウェア(Leap Technologies社/Waters社)によって操作されるLeap robot(H/D-x PAL; Waters社)を含んだ。Leap robotは、緩衝液保存及びHDX反応のために20℃に維持された並びにタンパク質及びクエンチ溶液の保存のために2℃に維持された2個の温度制御されたスタックを、それぞれ備えている。Waters HDX系は、予備及び分析用カラム並びにLCチューブ及びスイッチバルブを1℃で保持している温度制御されたチャンバーを更に含有している。温度制御チャンバーは、ペプシンカラムを25℃で保持していた。インラインペプシン消化のために、300pmolヒトuPAを含有している100μLクエンチ試料を25℃にしたPoroszyme(登録商標)Immobilized Pepsin Cartridge{2.1×30mm(Applied Biosystems社)}にロードし、100μL/分(0.1%ギ酸:CH₃CN 95:5)の一定流速を使用して通した。得られたペプチドを捕捉し、VanGuard pre-column BEH C18 1.7μm{2.1×5mm(Waters社)}で脱塩した。次にバルブを分析用カラム、UPLC-BEH C18 1.7μm{1×100mm(Waters社)}とインラインにあるプレカラムに切り換え、ペプチドをnanoAQUITY UPLC system(Waters社)から40μl/分で送られる10〜50%Bの9分間勾配を使用して分離した。移動相はA:0.1%ギ酸及びB:CH₃CN中0.1%ギ酸からなった。ESI MSデータ及び別個のエネルギー上昇(elevated energy)(MS^E)実験は、Synapt G2 mass spectrometer(Waters社)を使用する陽イオンモードにおいて取得された。ロイシンエンケファリンをロック質量(lock mass)として使用し([M+H]⁺イオン、m/z 556.2771)、データを連続モードで回収した{さらなる記載について、Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec、302、139〜148頁(2011)を参照されたい}。

データ分析
消化性ペプチドをペプチド及び断片をSynapt G2(Waters社)のイオン移動特性を利用して更に配列比較される標準的MS^E方法を使用する別々の実験において同定した。MS^EデータをProteinLynx Global Server version 2.5(Waters社)を使用して処理した。HDX-MS生データファイルをDynamX 2.0ソフトウェア(Waters社)で処理した。DynamXは、ロック質量補正及び重水素取り込み決定すなわち、重水素化ペプチドの質量中心決定を自動で実施する。更にすべてのペプチドをソフトウェアによるピーク補正及び重水素化帰属を確実にするために手動で調べた。

エピトープマッピング実験
アミド水素/重水素交換(HDX)をmAb 0266-0000-0043の存在又は不在でのhuPAの対応する重水素化緩衝液への16倍希釈によって開始した{すなわちD₂O中に調製したPBS、最終96%D₂O、pH7.4(未補正値)}。すべてのHDX反応を20℃で実施し、2.4μM mAbの存在又は不在で4μM huPAを含有し、それにより1.2倍モル過剰のmAb結合部位を生じた。10秒から480秒の範囲の適切な時間間隔で、HDX反応物の50μlアリコートを、最終pH2.5(未補正値)を生じる50μl氷冷クエンチ緩衝液(1.35M Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン)の添加によってクエンチした。

結果及び考察
huPAの一次配列の93%を網羅する163ペプチドのHDX-MS時間経過を抗uPAの存在又は不在で10、20、40、60、120、240及び480秒間モニターした。

得られたデータは、抗uPAのhuPAへのエピトープ結合部位を残基167〜175及び218〜224をそれぞれ網羅する2つの直鎖状配列に帰属できるようにした。これはTable 22(表22)に示され、抗uPA(mAb 0266-0000-0043)のヒトuPA(配列番号1)へのHDX-MS分析によるエピトープの同定を実証している。重水素交換反応後、huPAをペプシンで消化し、抗uPAの存在下、短いインキュベーション時間、少なくとも10秒、20秒及び40秒でHDX保護を示すと同定された当の消化性ペプチドを得る。抗uPAの存在下で影響されない交換を示し、帰属されたアロステリック領域に寄与することが同定された消化性ペプチドは、同様に存在する。

更にHDX-MS研究は、残基1〜33、67〜80、187〜215、225〜234、243〜256、260〜274、291〜306、322〜341、375〜389及び397〜410を網羅する抗uPAへの結合で低下した重水素取り込みを示す、アロステリック的にカップルした部位の大規模なネットワークを明らかにする。これをTable 21(表21)に示す、アロステリック領域は、抗uPA(mAb 0266-0000-0043)のヒトuPA(配列番号1)へのHDX-MS分析によって同定された。重水素交換反応後、huPAをペプシンで消化し、抗uPAの存在下、40秒より長いインキュベーション時間で水素から重水素への交換(HDX)保護を示すことが同定された当の消化性ペプチドを得る。抗uPAの存在下で影響されないHDXを示し、帰属されたアロステリック領域に寄与することが同定された消化性ペプチドは、同様に存在する。

重水素取り込みの変化は、抗uPAへの結合での低下としてだけ観察される。したがってデータは、可動性リガンド未結合アンサンブルから更に硬い抗uPA結合アンサンブルへのアロステリック集団シフトを取り込む。

更にHDX-MSは、抗uPA(mAb 0266-0000-0043)のエピトープ結合部位のhuPA(配列番号1)の残基167〜175及び218〜224を網羅する2つの直鎖状配列への帰属を可能にする。可動性リガンド未結合アンサンブルから更に硬い抗uPA結合アンサンブルへのアロステリック集団シフトのヒントは、残基1〜33、67〜80、187〜215、225〜234、243〜256、260〜274、291〜300、320〜341、375〜389及び402〜410を網羅する抗uPAへの結合で低下した重水素取り込みによって提供された。

(実施例21)
mAb 0266-0000-0043の作用機序
4個のセグメントがセリンプロテアーゼの活性化での顕著なコンフォメーション変化に関与するとして定義されている(Freerら、1970, Biochemistry 9、1997〜2009; Huber & Bode 1978, Acc Chem Res 1 1、114〜122頁; Jiangら、2013, Biochem J 449, 161〜166頁)。活性化ループは(16〜21ウシキモトリプシノーゲン;159-164ヒトsc-uPA)、Lys158-Ile159ペプチド結合の切断後に再配置されIle159のα-アミノ基とAsp355の埋もれた側鎖カルボキシル基との間に内部イオン対の形成を生じる。

Phe298及びGly299からIle159への直接相互作用によって活性酵素中の活性化ループを安定化する自己分解ループ(142〜154ウシキモトリプシノーゲン;299〜311ヒトsc-uPA)。オキシアニオン安定化ループ(184〜194ウシキモトリプシノーゲン;343〜355ヒトsc-uPA)は、活性酵素中の骨格媒介陽電荷のポケットを形成し、解離しやすいペプチド結合のカルボニルを活性化し、四面体中間体の負に荷電したオキシアニオンを安定化する。最終的にS1エントランスフレーム(entrance frame)(216〜223ウシキモトリプシノーゲン;377〜384ヒトsc-uPA)は、プロテアーゼの特異性を決定し、基質加水分解を促進するようにペプチド基質と相互作用するS1ポケットを形成する。

mAb-112が活性化ポケットからのN末端の置換を導く自己分解ループとの相互作用によってヒトuPA活性を阻害する(Jiangら、2013, Biochem J 449, 161〜166頁)一方で、マウスmU1はヒトuPAを阻害できず、マウスuPAだけを、自己分解ループドッキングのアロステリック阻害並びにS1ポケット及びオキシアニオンホールひずみ(distortion)を導くヒトsc-uPAアミノ酸残基Gly183、Val185(マウスuPAではPro)、Thr186(マウスuPAではPro)、Arg223(マウスuPAではLys)、Asn225(マウスuPAではSer)、Asn227(マウスuPAではTyr)、Thr228(マウスuPAではAsn)、Gln229(マウスuPAではPro)に対応する残基との相互作用によって阻害でき(Kromann-Hansenら、2013、Biochemistry 52、7114〜7126頁);mAb 0266-0000-0043は、1〜33、67〜80、187〜215、230〜234、243〜256、260〜274、291〜306、322〜341、375〜389及び397〜410領域のコンフォメーションに相乗的変化を誘導するIle167〜Ala175及びTyr218〜Leu224を網羅するエピトープを通じてヒトuPAを阻害することから固有であり、これだけに限らないが自己分解ループ及びS1エントランスフレームの再編成並びに同時のuPA活性化及び活性のアロステリック阻害に関与する。Ile167〜Ala175及びTyr218〜Leu224エピトープを通じて誘導されるコンフォメーション変化の大規模なネットワークは、相当するコンフォメーション変化がアロステリック的に影響を受ける部位のいずれかのmAb標的化によって誘導され得ることを示唆している。

本発明の特定の特性が本明細書に例示及び記載されているが、多数の修飾、置換、変更及び等価物が当業者に想定される。したがって添付の特許請求の範囲が、すべてのそのような修飾及び変更が本発明の真の精神の範囲内にあるとして網羅することを意図していることは理解される。

Claims (15)

1. ヒトuPAに結合できる抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトtc-uPAのタンパク質分解活性を阻害し、タンパク質分解性不活性形態のヒトuPAからタンパク質分解性活性形態のヒトuPAへのヒトsc-uPAの活性化を阻害することを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
2. 受容体結合ヒトuPA及び非受容体結合ヒトuPAの両方を阻害する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. tc-uPAのタンパク質分解活性も阻害し、及び/又はタンパク質分解性不活性形態のuPAからタンパク質分解性活性形態のuPAへのsc-uPAの活性化を阻害し、uPAがチンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ又はラクダuPAなどの他の種由来である、請求項1から2のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. ヒトuPA(配列番号1)における不連続エピトープ/結合領域に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、不連続エピトープの第1の結合部分/結合領域が配列番号1のアミノ酸番号167〜175によって定義され、不連続エピトープの第2の結合部分/結合領域が配列番号1のアミノ酸番号218〜224によって定義される、請求項1、2又は3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
5. 前記抗体の重鎖が、
   配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列;及び/又は
   配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列;及び/又は
   配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列であって、D95(Kabat;連続付番では99)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG96(Kabat;連続付番では100)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はD98(Kabat;連続付番では102)がD以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はG99(Kabat;連続付番では103)がG以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
   を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
6. 前記抗体の軽鎖が、
   配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列及び/又は
   配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列及び/又は
   配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個又は2個が異なるアミノ酸で置換されている場合があり、特にN90がN以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があり、及び/又はS91がS以外の任意のアミノ酸に変異されている場合があるCDR3配列
   を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
7. 前記抗体の重鎖が、
   配列番号7のアミノ酸残基31(Kabat及び連続付番)から35(Kabat及び連続付番)(SYTMS)のCDR1配列;及び
   配列番号7のアミノ酸50(Kabat及び連続付番)から65(Kabat;連続付番では66)(TISGGGSHIYYADSVKG)のCDR2配列;及び
   配列番号7のアミノ酸残基95(Kabat;連続付番では99)から102(Kabat;連続付番では108)(DGRDGSWFAY)のCDR3配列
   を含み、
   前記抗体の軽鎖が、
   配列番号8のアミノ酸残基24(Kabat及び連続付番)から34(Kabat及び連続付番)(RTSQSIGDYLH)のCDR1配列;及び
   配列番号8のアミノ酸残基50(Kabat及び連続付番)から56(Kabat及び連続付番)(YVSQSIS)のCDR2配列;及び
   配列番号8のアミノ酸残基89(Kabat及び連続付番)から97(Kabat及び連続付番)(QNSHSFPLT)のCDR3配列
   を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
8. 重鎖が、
   アミノ酸残基31〜35(Kabat)に位置付けられた配列番号9を含むCDR-H1;及び
   アミノ酸残基50〜65(Kabat)に位置付けられた配列番号10を含むCDR-H2;及び
   アミノ酸残基95〜102(Kabat)に位置付けられた配列番号11を含むCDR-H3
   を含み、
   軽鎖が、
   アミノ酸残基24〜34(Kabat)に位置付けられた配列番号12を含むCDR-L1;及び
   アミノ酸残基50〜56(Kabat)に位置付けられた配列番号13を含むCDR-L2;及び
   アミノ酸残基89〜97(Kabat)に位置付けられた配列番号14を含むCDR-L3
   を含む、ヒト化された、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
9. 配列番号21を含む重鎖及び配列番号22を含む軽鎖を含む、ヒト化された、請求項1から4又は8のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
10. 請求項8若しくは9のいずれかのヒト化抗体又は請求項7の抗体と、ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において競合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
11. ヒトuPA(配列番号1)又はカニクイザルuPA(配列番号3)への結合において参照抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片であって、前記参照抗体が配列番号7を含む可変重鎖及び配列番号8を含む可変軽鎖を含み、並びに/又は参照抗体が配列番号21を含む重鎖及び配列番号22を含む軽鎖を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
12. モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体の抗原結合領域、scFv、Fab、F(ab')2、Fv及び1本鎖抗体からなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
13. 関節リウマチなどの自己免疫疾患及び/又は慢性炎症の処置における医薬品の使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
14. (a)抗uPA抗体を生成する工程;(b)工程(a)において生成された抗体から、ヒトtc-uPAのタンパク質分解活性を阻害する抗体を同定する工程;(c)工程(a)において生成された抗体から、タンパク質分解性不活性形態のヒトuPAからタンパク質分解性活性形態のヒトuPAへのヒトsc-uPAの活性化を阻害する抗体を同定する工程;並びに(d)(b)及び(c)の両方の工程において阻害性である抗体を選択する工程を含む、抗uPA抗体の同定方法。
15. ヒトuPAに結合できる抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、抗体が請求項14に記載の同定方法によって同定され、産生された抗体が請求項13のいずれかにより使用され得る、方法。

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