JP2012082201A - 血液凝固第viii因子の機能代替抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)第一の抗原に対する第一の抗体と第二の抗原に対する第二の抗体を用意する工程;(2)第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;を含む作製方法による、F.IX/F.IXa及びF.Xの双方に特異的に結合し、F.VIIIaの補因子作用、すなわちF.IXaによるF.X活性化を促進する作用を代替する種々の二重特異性抗体。
【選択図】なし
Description
〔1〕 血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子を認識する第一のドメイン、および血液凝固第X因子を認識する第二のドメインを含む、血液凝固第VIII因子の機能を代替し得る多重特異性抗体であって、第一のドメインは血液凝固第IX因子または活性化血液凝固第IX因子に対する抗体のH鎖の全部または一部を含む第一のポリペプチドを含み、第二のドメインは血液凝固第X因子に対する抗体のH鎖の全部または一部を含む第二のポリペプチドを含み、第一のドメインおよび第二のドメインは更に抗体のL鎖の全部または一部であって共通の配列を有する第三のポリペプチドを含む多重特異性抗体、
〔2〕 第三のポリペプチドが血液凝固第IX因子、活性化血液凝固第IX因子または血液凝固第X因子に対する抗体のL鎖の全部または一部の配列を含む〔1〕に記載の多重特異性抗体、
〔3〕 第三のポリペプチドが2以上の抗体の各L鎖のCDR1, 2, 3からそれぞれ独立に選択されるCDR1, 2, 3からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等な抗原結合部位を含む〔1〕に記載の多重特異性抗体、
〔4〕 第一のポリペプチドが下記(a1)または(a2)または(a3)のCDRのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位を含み、第二のポリペプチドが下記(b)のアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位を含む〔1〕に記載の多重特異性抗体:
(a1)H鎖CDR1、2、3が配列番号:3、5、7(A44のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列
(a2)H鎖CDR1、2、3が配列番号:21、5、22(A69のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列
(a3)H鎖CDR1、2、3が配列番号:16、17、18(A50のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列
(b)H鎖CDR1、2、3が配列番号:26、28、30(B26のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列、
〔5〕 血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに血液凝固第X因子を認識する血液凝固第VIII因子の機能を代替し得る多重特異性抗体であって、血液凝固第VIII因子の代替機能が、抗体溶液 50μL、F.VIII欠乏血漿(Biomerieux)50μL及びAPTT試薬(Dade Behring)50μLの混合液を37℃で3分間加温した後、20 mMのCaCl2 50μLを同混合液に加え、凝固するまでの時間を測定する活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)試験において、抗体無添加時に比べた凝固時間の短縮が50秒以上である多重特異性抗体、
〔6〕 抗血液凝固第IX/IXa因子抗体のH鎖の抗原結合部位またはこれと機能的に同等な抗原結合部位と、抗血液凝固第X因子抗体のH鎖の抗原結合部位またはこれと機能的に同等な抗原結合部位とを含む〔5〕に記載の多重特異性抗体、
〔7〕 抗血液凝固第IX/IXa因子抗体における下記(a1)または(a2)または(a3)のCDRのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位と、抗血液凝固第X因子抗体における下記(b)に記載のCDRのアミノ酸配列からなる抗原結合部位またはこれと機能的に同等の抗原結合部位とを含む〔6〕に記載の多重特異性抗体:
(a1)H鎖CDR1、2、3が配列番号:3、5、7(A44のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列
(a2)H鎖CDR1、2、3が配列番号:21、5、22(A69のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列
(a3)H鎖CDR1、2、3が配列番号:16、17、18(A50のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列
(b)H鎖CDR1、2、3が配列番号:26、28、30(B26のH鎖CDR)に記載のアミノ酸配列、
〔8〕 〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、
〔9〕 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療に用いられる医薬組成物である、〔8〕に記載の組成物、
〔10〕 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患である、〔9〕に記載の組成物、
〔11〕 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血友病Aである、〔10〕に記載の組成物、
〔12〕 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、〔10〕に記載の組成物、
〔13〕 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、後天性血友病である、〔10〕に記載の組成物、
〔14〕 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下によって発症および/または進展する疾患が、フォンビルブランド病である、〔10〕に記載の組成物、
〔15〕 〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体、または〔8〕〜〔14〕のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法、
〔16〕 〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体の、〔8〕〜〔14〕のいずれかに記載した組成物の製造のための使用、
〔17〕 少なくとも〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体、または〔8〕〜〔14〕のいずれかに記載の組成物を含む、〔15〕に記載の予防および/または治療する方法に用いるためのキット、
〔18〕 〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体、または〔8〕〜〔14〕のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を、血液凝固第VIII因子と併用して予防および/または治療する方法、
〔19〕 少なくとも〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の抗体、または〔8〕〜〔14〕のいずれかに記載の組成物を含み、かつ血液凝固第VIII因子を含む〔15〕に記載の予防および/または治療する方法に用いるためのキット、
〔20〕 第一のH鎖、第二のH鎖および共通のL鎖を有する二重特異性抗体の作製方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)第一の抗原に対する第一の抗体と、第二の抗原に対する第二の抗体とを用意する工程;
(2)第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;
(3)前記(2)で作製した二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;
(4)第一の抗体のH鎖および第二の抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して共通L鎖抗体を作製する工程;
(5)前記(4)で作製した共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;
(6)前記(4)で作製した共通L鎖の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または他の抗体であって第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する工程;
(7)前記(6)で作製した共通L鎖抗体と、前記(2)で作製した元の二重特異性抗体または前記(4)で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する工程;および
(8)前記(7)で選択した共通L鎖抗体について、必要に応じて前記(6)および(7)の工程を反復して前記(2)で作製した元の二重特異性抗体と同等以上の活性を有する共通L鎖抗体を得る工程、
〔21〕 前記(6)および(7)の工程が2回以上反復される〔20〕に記載の方法、
〔22〕 〔20〕または〔21〕の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体、
〔23〕 前記(6)の他の抗体が第一の抗原もしくは第二の抗原に対する抗体である〔20〕に記載の方法、
〔24〕 前記(6)および(7)の工程が2回以上反復される〔23〕に記載の方法、
〔25〕 〔23〕または〔24〕の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体、
〔26〕 前記(6)の抗体が第一の抗体または第二の抗体である〔20〕に記載の方法、
〔27〕 前記(6)および(7)の工程が2回以上反復される〔26〕に記載の方法、
〔28〕 〔26〕または〔27〕の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体、を提供するものである。
さらに本発明は、以下の〔29〕および〔30〕を提供するものである。
〔29〕 第一のポリペプチドがH鎖可変領域を含み、第二のポリペプチドがH鎖可変領域を含み、第三のポリペプチドがL鎖可変領域を含み、各ポリペプチドの可変領域の組合わせが以下の通りである請求項1に記載の多重特異性抗体:
(a1)第一のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:130(hA69a)に記載のアミノ酸配列
(b1)第二のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:132(hB26-F123e4)に記載のアミノ酸配列
(c1)第三のポリペプチドのL鎖可変領域が配列番号:134(hAL-F123j4)に記載のアミノ酸配列;
(a2)第一のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:136(hA69-PFL)に記載のアミノ酸配列
(b2)第二のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:138(hB26-PF)に記載のアミノ酸配列
(c2)第三のポリペプチドのL鎖可変領域が配列番号:140(hAL-s8)に記載のアミノ酸配列;
(a3)第一のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:142(hA69-KQ)に記載のアミノ酸配列
(b3)第二のポリペプチドのH鎖可変領域が配列番号:138(hB26-PF)に記載のアミノ酸配列
(c3)第三のポリペプチドのL鎖可変領域が配列番号:144(hAL-AQ)に記載のアミノ酸配列。
〔30〕第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドがヒトIgG4定常領域を含み、第三のポリペプチドがヒトκ定常領域を含む〔29〕に記載の多重特異性抗体。
A44:配列番号:1
A50:配列番号:15
A69:配列番号:20
B26:配列番号:24
A44:配列番号:2(3)、4(5)、6(7)
A50:配列番号:109(16)、110(17)、111(18)
A69:配列番号:112(21)、113(5)、114(22)
B26:配列番号:25(26)、27(28)、29(30)
A44:配列番号:8
A50:配列番号:115
A69:配列番号:116
B26:配列番号:31
A44:配列番号:9(10)、11(12)、13(14)
A50:配列番号:117(10)、118(12)、119(19)
A69:配列番号:120(23)、121(12)、122(14)
B26:配列番号:32(33)、34(35)、36(37)
A44:配列番号:3、10
A50:配列番号:16、10
A69:配列番号:21、23
B26:配列番号:26、33
A44:配列番号:5、12
A50:配列番号:17、12
A69:配列番号:5、12
B26:配列番号:28、35
A44:配列番号:7、14
A50:配列番号:18、19
A69:配列番号:22、14
B26:配列番号:30、37
本発明の抗体は、必要に応じて、脱アミド化、メチオニン酸化などの回避や抗体の構造安定化を目的にアミノ酸残基を改変してもよい。
A44 H鎖CDR1: SSWMH(配列番号:3)
A50 H鎖CDR1: TYWMH(配列番号:16)
A69 H鎖CDR1: DYYMH(配列番号:21)
B26 H鎖CDR1: DNNMD(配列番号:26)
A50 H鎖CDR2: YINPSSGYTKYNQKFKV(配列番号:17)
B26 H鎖CDR2: DINTKSGGSIYNQKFKG(配列番号:28)
A50 H鎖CDR3: GNLGYFFDY(配列番号:18)
A69 H鎖CDR3: GGNGYYLDY(配列番号:22)
B26 H鎖CDR3: RRSYGYYFDY(配列番号:30)
A69 L鎖CDR1: KASQDVSTAVA(配列番号:23)
B26 L鎖CDR1: KASQNVGTAVA(配列番号:33)
B26 L鎖CDR2: SASYRYS(配列番号:35)
A50 L鎖CDR3: QQYSSYLT(配列番号:19)
B26 L鎖CDR3: QQYNSYPLT(配列番号:37)
(1)第一の抗原に対する第一の抗体と、第二の抗原に対する第二の抗体とを用意する工程;
(2)第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;
(3)前記(2)で作製した二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;
(4)第一の抗体のH鎖および第二の抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して共通L鎖抗体を作製する工程;
(5)前記(4)で作製した共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;
(6)前記(4)で作製した共通L鎖抗体の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する工程;
(7)前記(6)で作製した共通L鎖抗体と、前記(2)で作製した元の二重特異性抗体または前記(4)で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する工程;および
(8)前記(7)で選択した共通L鎖抗体について、必要に応じて前記(6)および(7)の工程を反復して前記(2)で作製した元の二重特異性抗体と同等以上の活性を有する共通L鎖抗体を得る工程
(2)該酵素・該基質・該補因子が関わる生体機能を測定するあるいは模倣する系を用い、該補因子非存在条件下にて該抗体を加えることによる機能回復活性を指標とし選択する。
(1)抗原Aに対する抗体A、及び抗原Bに対する抗体Bをそれぞれ選択し、
(2)該抗体のH鎖(好ましくはFd部分、即ちVH及びCH1を含む領域)をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して各H鎖の分泌株Ha(抗体AのH鎖を分泌)及びHb(抗体BのH鎖を分泌))を用意し、
(3)別に、L鎖がファージの表面蛋白との融合蛋白質として発現されるライブラリーを構築し、
(4)該L鎖ライブラリーを前記大腸菌Haに導入して抗体AのH鎖と様々なL鎖から成る抗体(H鎖がFd部分の場合はFab)を表面に提示したファージライブラリーを分泌させ、
(5)該ライブラリーから、抗原Aによるパニングにてクローンを濃縮し、
(6)得られたクローンをさらに大腸菌Hbに感染させ、抗体BのH鎖と様々なL鎖から成る抗体(H鎖がFd部分の場合はFab)を表面に提示したファージライブラリーを得、
(7)該ライブラリーを抗原Bによるパニングによってクローンを濃縮する。
(a)所望の抗原に対して結合する抗体のH鎖を分泌する宿主を製造する工程
(b)抗体L鎖ライブラリーを工程(a)の宿主に導入し、前記H鎖及び前記L鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
(c)工程(a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
(d)工程(c)において選択されたファージライブラリーを、工程(a)の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体のH鎖を分泌する宿主に対して導入し、該H鎖及びL鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
(e)工程(d)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
(a)所望の抗原に対して結合する抗体のH鎖を分泌する宿主を製造する工程
(b)抗体L鎖ライブラリーを工程(a)の宿主に導入し、前記H鎖及び前記L鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
(c)工程(a)記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
(d)工程(c)において選択されたファージライブラリーを、工程(a)のH鎖とは異なるアミノ酸配列を有するH鎖を分泌する宿主に対して導入し、該H鎖及びL鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
(e)工程(d)記載のH鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1-1.免疫およびハイブリドーマ作製
BALB/cマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)8匹およびMRL/lprマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)5匹に、human Factor IXaβ(Enzyme Research Laboratories, Inc.)を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCA(フロイント完全アジュバントH37 Ra(Difco laboratories))でエマルジョン化したFactor IXaβを40μg/head皮下投与した。2週間後にFIA(フロイント不完全アジュバント(Difco laboratories))でエマルジョン化したFactor IXaβを40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3〜7回行った。Factor IXaβに対する血清抗体価の上昇を1-2に示したELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)で確認後、最終免疫としてPBS(-)(カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないphosphate buffered saline)に希釈したFactor IXaβを40μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部は実施例10−2で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U.1(P3U1と称す、ATCC CRL-1597)を、PEG1500(ロシュ・ダイアグノスティックス)を用いた常法に従い細胞融合した。10 % FBS(Invitrogen)を含むRPMI1640培地(Invitrogen)(以下、10 % FBS/RPMI1640と称す)に懸濁した融合細胞を96 well culture plateに播種し、融合1, 2, 3, 5日後にHAT選択培地(10 % FBS/RPMI1640 / 2 % HAT 50x concentrate(大日本製薬)/ 5 % BM-Condimed H1(ロシュ・ダイアグノスティックス))への置換を行うことにより、ハイブリドーマの選択培養を行った。融合後8日目または9日目に採取した培養上清を用いて、1-2に示したELISAによりFactor IXaに対する結合活性を測定することにより、Factor IXa結合活性を有するハイブリドーマを選択した。続いて1-3に示した方法でFactor IXaの酵素活性に対する中和活性を測定し、Factor IXaに対する中和活性を有さないハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマは、96 well culture plateに1 wellあたり1個の細胞を播種することによる限界希釈を2回行ってクローン化した。顕微鏡観察により単一コロニーであることが確認された細胞について、1-2、1-3に示したELISAおよび中和活性測定を行い、クローンを選択した。1-4に示した方法により、クローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、APTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)を延長させないことを、1-5に示した方法で確認した。
Coating buffer(100 mM sodium bicarbonate, pH 9.6, 0.02 % sodium azide)で1μg/mLに希釈したFactor IXaβを、Nunc-Immuno plate(Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))に100μL/wellで分注後、4℃で一晩インキュベーションした。Tween (R) 20を含むPBS(-)で3回洗浄後、diluent buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 1 % bovine serum albumin, 1 mM MgCl2, 0.15 M NaCl, 0.05 % Tween (R) 20, 0.02 % sodium azide)でplateを室温で2時間blockingした。Bufferを除去後、plateにdiluent bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を100μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを3回洗浄後、diluent bufferで1/2000希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG (H+L)(Zymed Laboratories)を100μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを6回洗浄後、発色基質Blue-PhosTM Microwell Phosphatase Substrate(Kirkegaard & Perry Laboratories)を100μL/well添加し、室温で20分インキュベーションした。Blue-PhosTM Stop Solution(Kirkegaard & Perry Laboratories)を100μL/well添加した後、595nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550(Bio-Rad Laboratories)で測定した。
Phospholipid(Sigma-Aldrich)を注射用蒸留水で溶解し、超音波処理を施すことにより、400μg/mLのphospholipid溶液を調製した。0.1 %ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液(以下、TBSB)40μLと30 ng/mL Factor IXaβ(Enzyme Research Laboratories)10μLと400μg/mL phospholipid溶液5μLと100 mM CaCl2、20 mM MgCl2を含むTBSB 5μLとハイブリドーマ培養上清10μLを96穴プレート中で混和し、室温で1時間インキュベーションした。この混合溶液に、50μg/mL Factor X(Enzyme Research Laboratories)20μLおよび3 U/mL Factor VIII(Amrican diagnostica)10μLを加え、室温で30分間反応させた。これに10μLの0.5 M EDTAを添加することにより反応を停止させた。この反応溶液に、50μLのS-2222溶液(Chromogenix)を添加し、室温で30分間インキュベーションした後、測定波長405 nm、対照波長655 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550(Bio-Rad Laboratories, Inc.)により測定した。
樹立したハイブリドーマの腹水作製は常法に従って行った。すなわち、in vitroで培養したハイブリドーマ2 x 106個を、あらかじめプリスタン(2,6,10,14-tetramethylpentadecane; 和光純薬工業)を2回腹腔内に投与しておいたBALB/cマウス(雄、実験開始時5〜7週齢、日本チャールス・リバー)またはBALB/cヌードマウス(雌、実験開始時5〜6週齢、日本チャールス・リバーおよび日本クレア)の腹腔内に移植した。移植後1〜4週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体精製はProtein G SepharoseTM 4 Fast Flow(Amersham Biosciences)カラムを用いて行った。Binding Buffer(20 mM sodium acetate, pH 5.0)にて2倍希釈した腹水をカラムにアプライし、10カラム容量のBinding Bufferで洗浄した。5カラム容量のElution Buffer(0.1 M glycine-HCl, pH 2.5)にて抗体を溶出し、Neutralizing Buffer(1 M Tris-HCl, pH 9.0)で中和した。これをCentriprepTM 10(Millipore)にて濃縮し、TBS(50 mM Tris-buffered Saline)に溶媒を置換した。抗体濃度は、280 nmの吸光度から、A(1 %,1 cm) = 13.5として算出した。吸光度の測定は、DU-650(Beckman Coulter)にて測定した。
APTTはCR-A(Amelung)を接続したKC10A(Amelung)により測定した。TBSBで希釈した抗体溶液 50μL、標準ヒト血漿(Dade Behring)50μL及びAPTT試薬(Dade Behring)50μLの混合液を37℃で3分間加温した。20 mMのCaCl2(Dade Behring)50μLを同混合液に加えることにより凝固反応を開始させ、凝固時間を測定した。
2-1.免疫およびハイブリドーマ作製
BALB/cマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)8匹およびMRL/lprマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)5匹に、human Factor X(Enzyme Research Laboratories)を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCAでエマルジョン化したFactor Xを40μg/head皮下投与した。2週間後にFIAでエマルジョン化したFactor Xを20または40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を合計3〜6回行った。Factor Xに対する血清抗体価の上昇を2-2に示したELISAで確認後、最終免疫としてPBS (-)に希釈したFactor Xを20または40μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部を実施例10−2で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3U1を、PEG1500を用いた常法に従い細胞融合した。10 % FBS/RPMI1640培地に懸濁した融合細胞を96 well culture plateに播種し、融合1, 2, 3, 5日後にHAT選択培地への置換を行うことにより、ハイブリドーマの選択培養を行った。融合後8日目に採取した培養上清を用いて2-2に示したELISAによりFactor Xに対する結合活性を測定した。Factor X結合活性を有するハイブリドーマを選択し、2-3に示した方法でFactor Xaの酵素活性に対する中和活性を測定した。Factor Xaに対する中和活性を有さないハイブリドーマを、限界希釈を2回行うことによりクローン化した。1-4に示した方法により、クローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、APTTを延長させないことを、1−5に示した方法で確認した。
Coating bufferで1μg/mLに希釈したFactor Xを、Nunc-Immuno plateに100μL/wellで分注後、4℃で一晩インキュベーションした。Tween(R) 20を含むPBS(-)で3回洗浄後、diluent bufferでplateを室温で2時間blockingした。Bufferを除去後、plateにdiluent bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを3回洗浄後、diluent bufferで1/2000希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG (H+L)を添加し、室温で1時間インキュベーションした。Plateを6回洗浄後、発色基質Blue-PhosTM Phosphate Substrate(Kirkegaard & Perry Laboratories)を100μL/well添加し、室温で20分インキュベーションした。Blue-PhosTM Stop Solution(Kirkegaard & Perry Laboratories)を100μL/well添加した後、595 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550(Bio-Rad Laboratories)で測定した。
TBSBで1/5希釈したハイブリドーマ培養上清10μLと40μLの250 pg/mL Factor Xa(Enzyme Research Laboratories)を含むTBCP(2.78 mM CaCl2、22.2μMリン脂質(フォスファチジルコリン:フォスファチジルセリン=75:25、Sigma-Aldrich)を含むTBSB)を混和し、室温で1時間インキュベーションした。この混合溶液に、20μg/mLプロトロンビン(Enzyme Research Laboratories)および100 ng/mL活性化凝固第V因子(Factor Va(Haematologic Technologies))を含むTBCPを50μL添加して室温で10分間反応させた。0.5 M EDTAを10μL添加することにより反応を停止させた。この反応溶液に、1 mM S-2238溶液(Chromogenix)を50μL添加し、室温で30分間インキュベーションした後、405 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550(Bio-Rad Laboratories)で測定した。
3-1.ハイブリドーマからの抗体可変領域をコードするDNA断片の調製
抗F.IXa抗体あるいは抗F.X抗体を産生するハイブリドーマから、QIAGEN(R) RNeasy(R) Mini Kit (QIAGEN)を用いて説明書記載の方法に従い全RNAを抽出した。全RNAを40μLの滅菌水に溶解した。精製されたRNA 1〜2μgを鋳型に、SuperScript cDNA合成システム(Invitrogen)を用いて説明書記載の方法に従いRT-PCR法により一本鎖cDNAを合成した。
マウス抗体H鎖可変領域(VH)cDNAの増幅用プライマーとして、Krebberらの報告(J. Immunol. Methods 1997;201:35-55)に記載のHBプライマー混合物、およびHFプライマー混合物を用意した。各0.5μLの100μM HB プライマー混合物および 100μM HFプライマー混合物を用いて、反応液25μL(3-1で調製したcDNA溶液2.5μl、KOD plus buffer(東洋紡績)、0.2 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.75 units DNA polymerase KOD plus(東洋紡績))を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmp PCR system 9700(Parkin Elmer)を用いて、cDNA断片の増幅の効率性に応じて、条件A(98℃で3分間加熱後、98℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒からなる反応を1サイクルとして32サイクル)ないし条件B(94℃で3分間加熱後、94℃ 20秒、46℃ 20秒、68℃ 30秒からなる反応を1サイクルとして5サイクル、さらに94℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクル)のいずれかの条件で行った。PCR後、反応液を1 % アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ(約400 bp)の増幅断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決定した配列群を解析ソフトGENETYX-SV/RC Version 6.1(Genetyx)にて比較解析し、異なる配列を有するものを選択した。
クローニング用制限酵素Sfi I切断サイトを抗体可変領域増幅断片の両末端へ付加するために、以下の操作を行った。
Sfi I切断部位付加VH断片(Sfi I-VH)増幅のために、プライマーHBの (Gly4Ser)2- リンカー配列をSfi I切断部位を有するに示す配列(配列番号:42)へ変更したもの(プライマー VH-5’ end)を用意した。各0.5μlの10μM 配列特異的プライマーVH-5’ endおよび10μM プライマーscfor (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55)を用いて、反応液20μL(3-2で調製した精製VH cDNA増幅断片溶液1μl, KOD plus buffer(東洋紡績)、0.2 mM dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 0.5 units DNA polymerase KOD plus(東洋紡績))を調製した。PCRは、サーマルサイクラーGeneAmp PCR system 9700(Parkin Elmer)を用いて、断片の増幅の効率性に従い、条件A(98℃で3分間加熱後、98℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒からなる反応を1サイクルとして32サイクル)ないし条件B(94℃で3分間加熱後、94℃ 20秒、46℃ 20秒、68℃ 30秒からなる反応を1サイクルとして5サイクル、さらに94℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒からなる反応を1サイクルとして30サイクル)のいずれかの条件で行った。PCR後、反応液を1 % アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ(約400 bp)の増幅断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μLで溶出した。
目的の二重特異性IgG抗体を産生する際に、各H鎖のヘテロ分子を形成させるためにIgG1のknobs-into-holes技術(Ridgway et al., Protein Eng. 1996; 9: 617-621)を参考にIgG4のCH3部分へのアミノ酸置換体を作製した。タイプa(IgG4γa)はY349C、T366W置換体であり、タイプb(IgG4γb)はE356C、T366S、L368A、Y407Vの置換体である。さらに、両置換体のヒンジ領域にも置換(-ppcpScp- - & -ppcpPcp-)を導入した。本技術により、殆どヘテロ体となり得るが、L鎖についてはその限りでなく、不必要な抗体分子の生成がその後の活性測定へ影響を及ぼしかねない。そのため、本方策では各特異性を有する抗体分子片腕(HL分子と称する)を別々に発現させ細胞内で目的型二重特異性IgG抗体を効率的に作らせる為に各HL分子に対応する発現ベクターとして異なる薬剤で誘導がかかるものを用いた。
3-4で調製されたテトラサイクリン誘導型発現プラスミド(pcDNA4-g4HないしpcDNA4-g4L)をSfi Iで消化し、反応液を1 % アガローズゲル電気泳動に供した。もともと有していた抗体可変領域部分(VHないしVL(図1ないし図2参照))が除かれた断片(約5kb)をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μLで溶出した。該断片と、それぞれに対応する3-3で調製されたSfi I 消化抗F.IXa抗体由来Sfi I-VHないしSfi I-VL断片をQuick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸菌DH5α株(Competent high DH5α(東洋紡績))を形質転換した。また、Sfi I消化エクダイソン類似体誘導型発現プラスミド(実施例3-4、pIND-g4HないしpIND-g4L)から、上述と同様の手法で抗体可変領域部分(VHないしVL(図3ないし図2参照))を除いた断片と、それぞれに対応する3-3で調製されたSfi I消化抗F.X抗体由来Sfi I-VHないしSfi I-VL断片を、同様の手法にて組込んだ。
4-1.DNA溶液の調製
抗体右腕HL分子発現用ベクター(pcDNA4-g4IXaHnそしてpcDNA4-g4IXaLn)はテトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しない状況下で発現を完全に抑制する為にTetリプレッサーをコードするプラスミドpcDNA6/TR(Invitrogen)が要求される。また、抗体左腕HL分子発現用ベクター(pIND-g4XHn そしてpIND-g4XLn)は昆虫ホルモンであるエクダイソン類似体(ポナステロンA)により発現誘導がかかる。このとき、ポナステロンAと反応し誘導を行うエクダイソンレセプターとレチノイドXレセプターをコードするプラスミドpVgRXR(Invitrogen)が要求される。従って、動物細胞のトランスフェクションの為に計6種類のプラスミドDNA混液を調製した。細胞培養液1 mLの為に、pcDNA4-g4IXaHn、pcDNA4-g4IXaLn、pIND-g4XHnそしてpIND-g4XLnを各218.8 ng、pcDNA6/TRそしてpVgRXRを各1312.5 ng用いた。
ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)を10 % FCS (MOREGATE)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5×105個/mLの細胞密度で接着細胞用12-wellプレート(CORNING)の各wellへ1 mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター(37℃、5 % CO2)内で培養した。4-1で調製したプラスミドDNA混液をトランスフェクション試薬、Lipofectamine 2000(Invitrogen)7μLとOpti-MEM I培地(Invitrogen)250μLの混液へ加えて室温20分間静置したものを各wellの細胞へ投入し、4〜5時間、CO2インキュベーター(37℃にて5 % CO2)内でインキュベートした。
前項のようにトランスフェクションした細胞培養液から培地を吸引除去し、1μg/mLのテトラサイクリン(和光純薬工業)を含む1 mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培地を投入し、CO2インキュベーター(37℃、5 % CO2)内で1日培養して、抗体右腕HL分子の第一次発現誘導を行った。その後、培地を吸引除去し、一旦1 mL CHO-S-SFM-II培地にて洗浄した後、5μMのポナステロンA(Invitrogen)を含む1 mL CHO-S-SFM-II培地を投入し、CO2インキュベーター(37℃、5 % CO2)内で2日ないし3日培養して、抗体左腕HL分子の第二次発現誘導を行い培地中へ二重特異性IgG抗体を分泌させた。培養上清は回収された後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温)して細胞を除去し、必要に応じてMicrocon(R) YM-50(Millipore)で濃縮を行った。該サンプルは使用するまで4℃で保存した。
Goat affinity purified antibody to human IgG Fc(Cappel)をcoating bufferにて1μg/mLに調製し、Nunc-Immuno plateに固相化した。Diluent buffer(D.B.)にてブロッキング処理した後、D.B.を用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、1000 ng/mLから2倍系列でD.B.にて11段階希釈したヒトIgG4(ヒト型化抗TF抗体、WO 99/51743参照)を同様に添加した。3回洗浄したのち、Goat anti-human IgG, alkaline phosphatase(Biosource International)を反応させた。5回洗浄したのち、Sigma 104(R) phosphatase substrate(Sigma-Aldrich)を基質として発色させ、吸光度リーダーModel 3550(Bio-Rad Laboratories)により、参照波長655 nmとして405 nmの吸光度を測定した。Microplate Manager III(Bio-Rad Laboretories)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。
二重特異性抗体のF.VIIIa様活性は、以下の酵素アッセイで評価した。また、以下の反応は全て室温で行った。3.75μg/mLのFactor IX(Enzyme Research Laboratories)40μLと抗体溶液10μLの混合液を96穴プレート中で1時間インキュベーションした。さらにその混合液に、10 ng/mLのFactor XIa(Enzyme Research Laboratories)10μL, 50μg/mLのFactor X(Enzyme Research Laboratories)20μL, 400μg/mLのphospholipid(実施例1-3参照)5μL, 5 mM CaCl2と1 mM MgCl2を含むTBSB(以下、TBSB-Sと称す)15μLを添加し、酵素反応を開始させた。30分間反応させたのち、0.5 M EDTA 10μLを加えることにより停止させた。
さらに、最も活性の高かったXB12/SB04について、F.VIIIa様活性の濃度依存性を測定した(図6)。
血友病A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、F.VIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)に対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50μL、F.VIII欠乏血漿(Biomerieux)50μL及びAPTT試薬(Dade Behring)50μLの混合液を37℃で3分間加温した。凝固反応は20 mMのCaCl2(Dade Behring)50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CR-A(Amelung)が接続されたKC10A(Amelung)により凝固するまでの時間を測定した(図7および8)。
さらに、最も凝固時間の短縮効果の高かったXB12/SB04について濃度依存性を測定した(図9)。
実施例4に記載の方法で得られた10mLの培養上清をCentricon(R) YM-50(Millipore)により、1 mLまで濃縮した。これに10μLの10 % BSA、10μLの1 % Tween(R) 20及び100μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を添加し、4℃で一晩転倒混和した。その溶液を0.22μmのフィルターカップUltrafree(R)-MC(Millipore)に移し、0.01 % Tween(R)20を含むTBS 500μLにて3回洗浄後、rProtein A SepharoseTM樹脂を100μLの 0.01 % Tween(R) 20を含む10 mM HCl, pH 2.0に懸濁して3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、5μLの1M Tris-HCl , pH 8.0を加えて中和した。Microplate Manager III(Bio-Rad Laboretories)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。抗体濃度は実施例5に従い定量した。
F.Xの活性化ペプチド(AP)とグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク(GST-AP)を発現する組換え大腸菌を構築した。ヒトF.Xの全長翻訳領域をカバーするcDNAをヒト肝臓Marathon-Ready cDNA(Clontech)からPCR法により増幅後、これを鋳型にさらにAP領域(Leytus et al., Biochemistry 1986; 25: 5098)をコードする領域をPCR法により増幅しpGEM-Tベクター(Promega)へサブクローニングしGST-APをコードするpGEX-F10APを得た。該プラスミドを形質転換した大腸菌を培養し、OD 600=0.8にて1 mM IPTGを添加しGST-APの発現誘導を行った。培養液を遠心(3,000 x g, 30分間、4℃)後、菌体を回収し使用に供するまで-20℃にて保存した。
10−1.抗原および免疫
BALB/cマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)3匹、MRL/lprマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)3匹、およびC57BL/6Nマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)3匹に、抗原であるFactor IXaβ(Enzyme Research Laboratories, Inc.)もしくはFactor X (Enzyme Research Laboratories, Inc.)を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCA(フロイント完全アジュバントH37 Ra(Difco laboratories))でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。2週間後にFIA(フロイント不完全アジュバント(Difco laboratories))でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行い、最終免疫の8日後にマウスより脾臓を摘出した。
実施例1−1および2−1で作出した免疫マウス摘出脾臓の一部、ならびに実施例10−1にて作出した免疫マウスからの摘出脾臓をTrizol Reagent (Invitrogen) へ投入(50 mg spleen/ml of the reagent)し、ガラスホモジナイザーを用いて均質化した。その後、試薬添付マニュアル記載の方法に従い、Total RNAを抽出した。抽出溶液からPolyATract System 1000 キット(Promega)を用いて添付マニュアル記載の方法に従いpolyA(+)RNAを抽出した。RT-PCR(SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen) にてc-DNAを合成し、使用に際するまで-20℃で保存した。
Factor IXaβもしくはFactor X をNo-Weigh Premeasured NHS-PEO4-Biotin Microtubes(Pierce)を用いてビオチン標識した。10−2で作成されたファージライブラリー溶液600μlに100 pmolのビオチン標識Factor IXaβもしくはFactor X を加え、60分間抗原と接触させた。5% M-PBS(5%w/vスキムミルクを含むPBS)で洗浄したDynabeads M-280 Streptavidin (DYNAL) 600μLを加え、15分間結合させた。ビーズ結合ファージを1 mLのPBST(0.1 % Tween-20を含むPBS)にて何回か洗浄した後、PBSにて洗浄した。0.8 mLの0.1 mol/L グリシン/HCl(pH 2.2)中にビーズを5分間懸濁し、ファージを溶出した。
上記のシングルコロニーを100μL 2xYTAGに植菌し、30℃で一晩培養した。この5μLを500μL 2xYTAGに植菌、37℃、5時間培養後、ヘルパーファージ2 x 108pfuを投入し37℃にて30分間静置、さらに37℃にて30分間攪拌培養後、0.5 mM IPTGを含む2xYTAKを120μL添加した。30℃にて一晩培養し、遠心上清をELISAに供した。ビオチン標識抗原のパンニングにて得られたクローンのELISAのために、1.0μg/mLのビオチン標識抗原でコートしたStreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)を用いた。また、ネイティブ抗原のパンニングにて得られたクローンのELISAのために、1.0μg/mLのネイティブ抗原を固相化したイムノプレート(MaxiSorp, Nunc)を用いた。PBSTにて洗浄し抗原を除いた後、ブロッキングバッファーとして2 % M-PBS 200μLあるいは2 % BSA-PBS(2%w/v BSAを含むPBS)で室温1時間ブロッキングした。バッファーを除き、ここに培養上清を加え60分間静置しファージを結合させた。洗浄後、結合ファージはブロッキングバッファーにて希釈したHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)とTMB基質(Zymed)で検出し、1 mol/L H2SO4添加により反応を停止した後、プレートリーダーにてA450の値を測定した。
ELISAにて陽性であったクローンの組換え大腸菌2xYTAG培養液からプライマーPBG3-F1(5'- CAGCTATGAAATACCTATTGCC -3'/配列番号:38)とPBG3-R1(5'- CTTTTCATAATCAAAATCACCGG -3'/配列番号:39)を用いてPCRにてscFv領域を増幅し、その塩基配列決定した。培養液1μL、10 x KOD Dash緩衝液1.5μL、10μmol/Lプライマーを0.2μLづつ、KOD Dashポリメラーゼ(東洋紡績、2.5 U/μL)0.3μLを含むPCR反応液15μLを、サーマルサイクラーGeneAmp PCR system 9700(Perkin Elmer)で96℃、10秒、55℃、10秒、72℃、30秒、30サイクルの増幅を行った。PCR後、5μLの反応液にExoSAP-IT(アマシャム)を3μL添加し、37℃、15分間、引き続き80℃、15分間保温した。このサンプルについてPBG3-F2(5'- ATTGCCTACGGCAGCCGCT -3'/配列番号:40)あるいはPBG3-R2(5'- AAATCACCGGAACCAGAGCC -3'/配列番号:41)をプライマーとしてBigDye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems)にて反応を行い、Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencerで泳動した。塩基配列から推定されるアミノ酸配列のCDR3の異なるクローンを抗Factor IXaについて52クローン、及び抗Factor Xについて33クローンを選択した。
scFv抗体をIgG型として発現させるために、実施例3−3、3−4、そして3−5に示す同様の方策にて抗体可変領域(VH,VL)を誘導型発現ベクターにクローニングを行った。抗F.IXa抗体可変領域(VH および VL)はテトラサイクリン誘導型ベクター(それぞれpcDNA4-g4HおよびpcDNA4-g4L)へ組み込まれた。抗F.X抗体可変領域(VH および VL)はエクダイソン類似体誘導型ベクター(それぞれpIND-g4HおよびpcDNA4-g4L)へ組み込まれた。目的クローンからQIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて各々プラスミドDNAを単離し、100μLの滅菌水へ溶解した。
実施例4−1に示す同様の方策で調製されたDNA溶液を用いて、実施例4−2および4−3に示す同様の方策にて動物細胞で発現させ、培養上清を回収した。該サンプルは使用するまで4℃で保存した。
実施例10−7に記載の方法で得られた10 mLの培養上清に100μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を添加し、4℃で一晩転倒混和した。その溶液を0.22μmのフィルターカップUltrafree(R)-MC(Millipore)に移し、0.01 % Tween(R) 20を含むTBS 500μLにて3回洗浄後、rProtein A SepharoseTM樹脂を100μLの 0.01 % Tween(R) 20を含む10 mM HCl, pH 2.0に懸濁して3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、5μLの1M Tris-HCl , pH 8.0を加えて中和した。Microplate Manager III(Bio-Rad Laboretories)ソフトウェアを用いて、ヒトIgG4(ヒト型化抗TF抗体、WO 99/51743参照)の検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。抗体濃度は実施例5に従い定量した。
二重特異性抗体のF.VIIIa様活性は、以下の酵素アッセイで評価した。また、以下の反応は全て室温で行った。15μg/mLのFactor IX(Enzyme Research Laboratories)10μLと100 mM CaCl2と20 mM MgCl2を含むTBSB 5μLと実施例10−7記載の方法で得られた培養上清50μLの混合液を96穴プレート中で1時間インキュベーションした。さらにその混合液に、10 ng/mLのFactor XIa(Enzyme Research Laboratories)10μL, 50μg/mLのFactor X(Enzyme Research Laboratories)20μL, 400μg/mLのphospholipid 5μLを添加し、酵素反応を開始させた。30分間反応させたのち、0.5 M EDTA 10μLを加えることにより停止させた。
Phospholipid、Factor XIa、Factor IX及びFactor Xの溶媒にはTBSBを用いた。発色基質溶液は、添付説明書に従い溶解したテストチーム発色基質S-2222(Chromogenix)とポリブレン液(0.6 mg/L hexadimethrine bromide(Sigma))の1:1混合液である。
実施例11の方法に従い調製した二重特異性抗体が血友病A血液の凝固能を回復するか明らかにするために、F.VIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)に対する同抗体の影響を、実施例7で示す同様の方法で評価した(図13を参照)。さらに、凝固時間の短縮効果の高かったA44/B26、A69/B26について濃度依存性を測定した(図14、図15を参照)。
二重特異性抗体とF.VIIIとの併用検討は、以下の血漿凝固アッセイ条件で評価した。25μg/mL 抗体溶液 40μL、F.VIII欠乏血漿(Biomerieux)50μLの混合液を室温で、30分間インキュベーションした。さらにその混合液に、1 U/mLの遺伝子組換え型血液凝固第VIII因子製剤コージネイト(R)FS(BAYER)10μL 及びAPTT試薬(Dade Behring)50μLを加え、37℃で3分間加温した。凝固反応は20 mMのCaCl2(Dade Behring)50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CR-A(Amelung)が接続されたKC10A(Amelung)により凝固するまでの時間を測定した(図16を参照)。
インヒビター血漿における二重特異性IgG抗体の効果は、以下の血漿凝固アッセイ条件で評価した。F.VIII欠乏血漿(Biomerieux)50μLに100μg/mL 抗ヒトF.VIII中和抗体(Catalog Number:MAB3440、CHEMICON)10μLの混合液を室温で、30分間インキュベーションした。この血漿をインヒビター血漿として用いた。このインヒビター血漿に、25μg/mL抗体溶液 40μL及びAPTT試薬(Dade Behring)50μLを加え、37℃で3分間加温した。凝固反応は20 mMのCaCl2(Dade Behring)50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CR-A(Amelung)が接続されたKC10A(Amelung)により凝固するまでの時間を測定した(図17を参照)。
実施例1〜7で取得した二重特異性抗体の中で、血液凝固時間の短縮効果が最も高かったXB12(マウス抗FactorIXa抗体)/SB04(マウス抗FactorX抗体)について、以下のようにヒト化を実施した。
一般公開されているKabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) およびIMGT Database (http://imgt.cines.fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したDatabaseを用いてマウスXB12-H鎖可変領域、マウスXB12-L鎖可変領域、マウスSB04-H鎖可変領域、マウスSB04-L鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体のフレームワーク領域(以下、FR)に使用することにした。
(1)XB12-H鎖可変領域:KABATID-020619 (Kabat Database)
(Marietteら、Arthritis Rheum. 1993;36:1315-1324)
(2)XB12-L鎖可変領域:EMBL Accession No. X61642(IMGT Database)
(Markら、J Mol Biol. 1991 ; 222 : 581-597.)
(3)SB04-H鎖可変領域:KABATID-025255 (Kabat Database)
(Demaisonら、Immunogetetics 1995;42:342-352)
(4)SB04-L鎖可変領域:EMBL Accession No. AB064111(IMGT Database) (Unpublished data)
(1)-(4)のヒト抗体のFRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域(以下、CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。
(1)XB12-H鎖可変領域:GenBank Accession No. AF062120
(2)XB12-L鎖可変領域:GenBank Accession No. M74019
(3)SB04-H鎖可変領域:GenBank Accession No. BC019337
(4)SB04-L鎖可変領域:GenBank Accession No. AY204756
分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、50base程度の合成オリゴDNAを3’末端側が約20base程度ハイブリダイズするように交互に12本作製した。さらに、抗体可変領域遺伝子の5’末端側にハイブリダイズし、XhoI切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の3’末端側にハイブリダイズし、SfiI切断配列を有するプライマーを作製した。
4種類のヒト化抗体発現ベクターとpcDNA6/TR、pVgRXRを用いて、実施例4−2、4−3に示す方法でHEK293Hへ遺伝子導入および発現誘導を行った。さらに、実施例8、5に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した。
調製したヒト化ニ種特異性抗体およびキメラニ種特異性抗体(XB12/SB04)の血漿凝固能を評価するために、実施例7の方法に従って、F.VIII欠乏血漿を用いてAPTTに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化ニ種特異性抗体について、活性上昇を目指して、ヒト抗体FRのアミノ酸の改変した。また、熱安定性低下などが危惧されるXB12抗体VHのCDR3のシステイン残基についてもアラニン残基に改変した。具体的には、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体発現ベクターに変異を導入した。FR配列のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことでXB12/SB04と同等の活性を有するヒト化ニ種特異性抗体(ヒト化XB12抗体(VH:hXB12f-A, VL:hXBVL)/ ヒト化SB04抗体(VH:hSB04e, VL:hSBVL-F3f)を取得した(図18)。
さらに、CDRシャフルされたL鎖を用いたA44とB26の二重特異性抗体の発現を実施した。
CAGGプロモーターの下流に、2つのSfiIサイトを挟んだ動物細胞シグナル配列とヒトIgG1CH1直前のイントロン、さらにその下流にヒトIgG4定常領域 cDNAを有するベクターpCAGGss-g4CHを構築した。これらSfiI間にシグナル配列プロセシング部位とスプライシング・ドナー配列に挟まれたVH遺伝子を挿入することによってIgG4H鎖として分泌させる動物細胞用発現ベクターを構築することが出来る。さらにH鎖がヘテロな組み合わせであるIgG4を優先的に発現させるために、IgG1のknobs-into-holes(Protein Engineering vol.9, 617-621, 1996)を参考にIgG4のCH3部分へのアミノ酸置換体を用いた。タイプaはY349C、T366W置換体、タイプbはE356C、T366S、L368A、Y407Vの置換体である。さらにH鎖のダイマー形成促進のためにヒンジにもアミノ酸置換(-ppcpScp- →-ppcpPcp-)を導入した。シグナル配列はタイプaにはマウスIL-3、タイプbにはヒトIL-6のものをそれぞれ用いて構築した(pCAGG-IL3ss-g4CHPa, pCAGG-IL6ss-g4CHPb)。pCAGG-IL3ss-g4CHPaのSfiIサイトに上記実施例で得られた抗体A44のVH断片を挿入してpCAGG-chiA44-g4aを、抗体A69のVH断片を挿入してpCAGG-chiA69-g4aを得た。一方、pCAGG-IL6ss-g4CHPbのSfiIサイトに同じく抗体B26のVH断片を挿入し、pCAGG-chiB26-g4bを得た。
CAGGプロモーターの下流に、2つのSfiIサイトを挟んだマウスIL-3シグナル配列とヒトkappa定常領域直前のイントロン、さらにその下流にヒトkappa鎖定常領域(CL) エクソンを有するベクターpCAGG-kappa (pCAGG-IL3ss-hIgG light)を構築した(図19)。これらSfiI間にシグナル配列プロセシング部位とスプライシング・ドナー配列に挟まれたVL遺伝子を挿入することによってkappa鎖として分泌させる動物細胞用発現ベクターを構築することが出来る。
GCCATGGCGGACTACAAAGATATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGAC
A44LR1(配列番号:51)
GGCTACAGCAGTCCCCACATCCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCTACTGATGTGGA
A44LF2(配列番号:52)
GTGGGGACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTAC
A44LR2(配列番号:53)
GAAGCGATCAGGGACTCCAGTGTGCCGGGTGGATGCCCAGTAAATCAGTAGTTTAGG
A44LF3(配列番号:54)
GGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTAGATATGGGACAGATTTCACTCTCACCATT
A44LR3(配列番号:55)
ACAGAGATAATCTGCCAGGTCTTCAGACTGCACATTGCTAATGGTGAGAGTGAAATC
A44LF4(配列番号:56)
CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAGCAACTATATCACGTTCGGTGGTGGGACC
A44LR4(配列番号:57)
GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGACTTACCACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCACCACCGAACGT
A44LR4Gly(配列番号:58)
GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGACTTACCTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCACCACCGAACGT
B26LR1_A44fr(配列番号:59)
GGCTACAGCAGTCCCCACATtCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCTACTGATGTGGA
B26LR2_A44fr(配列番号:60)
GAAGCGATCAGGGACTCCACTGTACCGGTAGGATGCCGAGTAAATCAGTAGTTTAGG
B26LF4_A44fr(配列番号:61)
CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCACTCACGTTCGGTGGTGGGACC
A69LR1_A44fr(配列番号:62)
GGCTACAGCAGTACTCACATCCTGACTGGCCTTGCAGGTGATGCTGACCCTGTCTCCTACTGATGTGGA
A50LF4_A44fr(配列番号:63)
CTGGCAGATTATCTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATTTAACGTTCGGTGGTGGGACC
scback(配列番号:64)
TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACTACAAAG
scfor(配列番号:65)
GGAATTCGGCCCCCGAG
ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293を10 % FCS (Moregate)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、接着細胞用10 cm径ディッシュ(Corning)に6×106個の細胞を播種しCO2インキュベーター(37℃, 5 % CO2)内で一晩培養した。実施例18の任意のL鎖発現ベクターと実施例17のpCAGG-chiB26-g4bと pCAGG-chiA44-g4aもしくはpCAGG-chiA69-g4aの2種のH鎖発現ベクター(30μg)と1.5 mLのOPTI-MEMI培地の混合液をトランスフェクション試薬Lipofectamine 2000(Invitrogen)60μLとOpti-MEM I培地(Invitrogen)1.5 mLの混合液へ加えて室温20分間静置したものをディッシュへ加え、CO2インキュベーター(37℃, 5 % CO2)内で3日間培養した。得られた培養上清に100μLのrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を添加し、4℃で一晩転倒混和した。遠心操作により樹脂を沈殿させ、0.01 % Tween(R) 20を含むTBSにて3回洗浄後、樹脂を100μLの 0.01 % Tween(R) 20を含む10 mM HCl, 150 mM NaCl pH 2.0に懸濁して3分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、5μLの1 M Tris-HCl , 150 mM NaCl pH 8.0を加えて中和した。
Goat affinity purified antibody to human IgG Fc(Cappel)をPBSにて1μg/mLに調製し、Nunc-Immuno plateに固相化した。2 % BSAを含むPBSにてブロッキング処理した後、このBufferを用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、1 μg/mLから2倍系列でD.B.にて11段階希釈したヒトIgG4(ヒト型化抗TF抗体、WO 99/51743参照)を同様に添加した。3回洗浄したのち、Goat anti-human IgG, alkaline phosphatase(Biosource International)を反応させた。5回洗浄したのち、Sigma 104(R) phosphatase substrate(Sigma-Aldrich)を基質として発色させ、吸光度リーダーSUNRISE RAINBOW(TECAN)により、参照波長655 nmとして405 nmの吸光度を測定した。LS-PLATEmanager2001(TECAN)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトIgG濃度を算出した。
血友病A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、F.VIII欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)に対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50μL、F.VIII欠乏血漿(Biomerieux)50μL及びAPTT試薬(Dade Behring)50μLの混合液を37℃で3分間加温した。凝固反応は20 mMのCaCl2(Dade Behring)50μLを同混合液に加えることにより開始させた。CR-A(Amelung)が接続されたKC10A(Amelung)により凝固するまでの時間を測定した(図20〜26)。その結果、抗体無添加時に比べて、二重特異性抗体は凝固時間を短縮した。
血液凝固時間の短縮効果が最も高かった抗FactorIXa抗体 A69-VH、抗FactorX抗体 B26-VH、ハイブリッドL鎖(BBA)の組み合わせから成る二重特異性抗体について、以下のようにヒト化を実施した。
一般公開されているKabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) およびIMGT Database (http://imgt.cines.fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したDatabaseを用いてマウスA69-H鎖可変領域(アミノ酸配列:配列番号:20)、マウスB26-H鎖可変領域(アミノ酸配列:配列番号:24)、マウスBBA-L鎖可変領域(アミノ酸配列:配列番号:69)に分けてホモロジー検索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体のフレームワーク領域(以下、FR)に使用することにした。
(1)A69-H鎖可変領域:KABATID-000064 (Kabat Database)
(Kippsら、J Clin Invest. 1991;87:2087-2096)
(2)B26-H鎖可変領域:EMBL Accession No. AB063872(IMGT Database)
(Unpublished data)
(3)BBA-L鎖可変領域:KABATID-024300 (Kabat Database)
(Welschofら、J Immunol Method. 1995;179:203-214)
(1)-(3)のヒト抗体のFRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域(以下、CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。
(1)A69-H鎖可変領域:GenBank Accession No. AF062257
配列番号:123(塩基配列)、配列番号:124(アミノ酸配列)
(2)B26-H鎖可変領域:GenBank Accession No. AAC18248
配列番号:125(塩基配列)、配列番号:126(アミノ酸配列)
(3)BBA-L鎖可変領域:GenBank Accession No. AAA59100
配列番号:127(塩基配列)、配列番号:128(アミノ酸配列)
分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、50 base程度の合成オリゴDNAを3’末端が約20 base程度ハイブリダイズするように交互に12本作製した。合成オリゴDNAは、5’末端から3’末端までがヒト抗体配列になるように、もしくは5’末端がヒト抗体配列であり3’末端がマウス抗体配列になるように設計した。さらに、抗体可変領域遺伝子の5’末端にアニ−ルし、XhoI切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の3’末端側にアニ−ルし、SfiI切断配列を有し且つイントロン配列の5’末端配列をコードするプライマーを作製した。
ヒト化二重特異性抗体の発現は、実施例4−2に記載した方法か以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)を10 % Fetal Bovine Serum (Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105個/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ(直径10 cm, CORNING)の各ディッシュへ10 mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター(37℃、5 % CO2)内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、1 %のFetal Bovine Serumを含むCHO-S-SFM-II培地6.9 mLを添加した。22−2で調製したプラスミドDNA混合液(合計13.8μg)を1μg/mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7μLとCHO-S-SFMII培地 690μLと混合して室温10分間静置したものを各ディッシュの細胞へ投入し、4〜5時間、CO2インキュベーター(37℃にて5 % CO2)内でインキュベートした。その後、1 %のFetal Bovine Serumを含むCHO-S-SFM-II(Invitrogen)培地6.9 mLを添加して、3日間 CO2インキュベーター内で培養した。培養上清を回収した後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温)して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV(Millipore)を通して滅菌した。該サンプルは使用するまで4℃で保存した。
調製したヒト化二重特異性抗体およびキメラ二重特異性抗体(A69/B26/BBA)の血漿凝固能を評価するために、実施例21の方法に従って、F.VIII欠乏血漿を用いてAPTTに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化二重特異性抗体について、活性上昇を目指してヒト抗体FRのアミノ酸を改変した。また、発現分泌時にはヒト化A69/ヒト化BBA抗体, ヒト化B26/ヒト化BBA抗体、ヒト化A69/ヒト化B26/ヒト化BBA二重特異性抗体の3種類の抗体が発現するが、この3種類の抗体を分離し、二重特異性抗体のみ精製することを目的として、ヒト化A69 H鎖可変領域の等電点を下降させ、ヒト化B26 H鎖可変領域の等電点を上昇させるアミノ酸改変を行った。また、同時にH鎖アミノ末端のピログルタミル化を防ぐためのアミノ酸改変、CDR配列の脱アミド化を抑制するためのアミノ酸改変、熱安定性を上昇させるためのアミノ酸改変を実施した。具体的には、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体可変領域に変異を導入した。目的のヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたH鎖可変領域断片挿入プラスミドをXhoIおよびSfiIで、L鎖可変領域断片挿入プラスミドをEcoRIで消化した後に、反応液を1 %アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ(約400 bp)のDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水30μlで溶出した。その後、実施例22−2に示す方法で抗体定常領域遺伝子と連結し、抗体発現プラスミドを作製した。実施例22−3に示す方法でヒト化二重特異性抗体の調製し、実施例21に示す方法で血液凝固活性を評価した。
(1) ヒト化A69抗体VH(hA69a) 配列番号:129(塩基配列)、配列番号:130(アミノ酸配列)
(2) ヒト化B26抗体VH(hB26-F123e4) 配列番号:131(塩基配列)、配列番号:132(アミノ酸配列)
(3) ヒト化BBA抗体VL(hAL-F123j4) 配列番号:133(塩基配列)、配列番号:134(アミノ酸配列)
(4) ヒト化A69抗体VH(hA69-PFL) 配列番号:135(塩基配列)、配列番号:136(アミノ酸配列)
(5) ヒト化B26抗体VH(hB26-PF) 配列番号:137(塩基配列)、配列番号:138(アミノ酸配列)
(6) ヒト化BBA抗体VL(hAL-s8) 配列番号:139(塩基配列)、配列番号:140(アミノ酸配列)
L鎖を共通化した二重特異性抗体は、動物細胞における発現分泌時に3種類の抗体が発現することが考えられる。本実施例の抗体においてもヒト化A69/ヒト化BBA抗体, ヒト化B26/ヒト化BBA抗体、ヒト化A69/ヒト化B26/ヒト化BBA二重特異性抗体の3種類の抗体が発現することが予想された。この3種類の抗体を分離し、二重特異性抗体のみ精製することを目的として、ヒト化A69 H鎖可変領域の等電点を下降させ、ヒト化B26 H鎖可変領域の等電点を上昇させるアミノ酸改変を行った。その結果、所望の二重特異性抗体の分離が可能になったことから、野生型定常領域を持つヒト化二重特異性抗体を調製し、凝固活性評価を実施した。熱安定性向上のために、実施例22−4に示したヒト化二重特異性抗体(ヒト化A69(hA69-PFL)/ ヒト化B26 (hB26-PF)/ヒト化BBA(hAL-s8))のヒト化A69およびヒト化BBAの可変領域アミノ酸配列を改変した。各ヒト化抗体の可変領域配列を以下の配列番号に示した。
(7) ヒト化A69抗体VH(hA69-KQ) 配列番号:141(塩基配列)、配列番号:142(アミノ酸配列)
(8) ヒト化BBA抗体VL(hAL-AQ) 配列番号:143(塩基配列)、配列番号:144(アミノ酸配列)
実施例22−3に示す方法でヒト化二重特異性抗体の調製し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析を用いて二重特異性抗体を精製した。陽イオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりであり、ヒト化A69のホモ会合体、ヒト化A69とヒト化B26のヘテロ会合体である目的の二重特異性抗体、ヒト化B26のホモ会合体の3種類のピークが得られることから、二重特異性抗体のピークを分取することで、二重特異性抗体を精製した。二重特異性抗体が含まれる画分をAmicon Ultra, MWCO 10000 (Millipore)による濃縮後、20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0に対して一晩冷所で透析を行い、濃度定量を行った。
移動相:A: 10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4, pH 6.25
B: 10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4, 500 mmol/L NaCl, pH 6.25
流速:1.0 mL/min
グラジエント:10 %B(5 min)→(40 min)→60 %B→(5 min)→100 %B (5 min)
検出:220 nm
二重特異性抗体と1種以上の他の抗体の併用による効果を血漿凝固アッセイにより確認した。抗体溶液 50μL、F.VIII欠乏血漿(Biomerieux)100μL、0.3 % カオリン溶液(Biomerieux)50μLを混合し、37℃で3分間加温した。凝固反応は20 mMのCaCl2(Dade Behring)100μLを同混合液に加えることにより開始させた。CR-A(Amelung)が接続されたKC10A(Amelung)により凝固するまでの時間を測定した。二重特異性抗体(A69/B26/BBA)に抗F.IXa抗体(XB12)、抗F.X抗体(SB04)、XB12とSB04、二重特異性抗体(XB12/SB04)を混合したときの血漿凝固時間の結果を図29に示す。混合後の各抗体濃度は20μg/mLである。
本発明の多重特異性抗体は、血中での安定性が高く、抗原性も低いと考えられることから、医薬品となるものと大いに期待される。
Claims (9)
- 第一のH鎖、第二のH鎖および共通のL鎖を有する二重特異性抗体の作製方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)第一の抗原に対する第一の抗体と、第二の抗原に対する第二の抗体とを用意する工程;
(2)第一の抗体および第二の抗体の可変領域を有する第一の抗原および第二の抗原に対する二重特異性抗体を作製する工程;
(3)前記(2)で作製した二重特異性抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;
(4)第一の抗体のH鎖および第二の抗体のH鎖を、第一の抗体または第二の抗体のL鎖で共通化して共通L鎖抗体を作製する工程;
(5)前記(4)で作製した共通L鎖抗体の抗原への結合活性または抗体の生物活性を測定する工程;
(6)前記(4)で作製した共通L鎖の1または2個または3個のCDRを、第一の抗体、第二の抗体または他の抗体であって第一の抗体または第二の抗体のCDRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する抗体のCDRにより置換して共通L鎖抗体を作製する工程;
(7)前記(6)で作製した共通L鎖抗体と、前記(2)で作製した元の二重特異性抗体または前記(4)で作製した共通L鎖抗体とを抗原への結合活性または抗体の生物活性について比較し、所望の活性を有する共通L鎖抗体を選択する工程;および
(8)前記(7)で選択した共通L鎖抗体について、必要に応じて前記(6)および(7)の工程を反復して前記(2)で作製した元の二重特異性抗体と同等以上の活性を有する共通L鎖抗体を得る工程。 - 前記(6)および(7)の工程が2回以上反復される請求項1に記載の方法。
- 請求項1または2の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体。
- 前記(6)の他の抗体が第一の抗原もしくは第二の抗原に対する抗体である請求項1に記載の方法。
- 前記(6)および(7)の工程が2回以上反復される請求項4に記載の方法。
- 請求項4または5の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体。
- 前記(6)の抗体が第一の抗体または第二の抗体である請求項1に記載の方法。
- 前記(6)および(7)の工程が2回以上反復される請求項7に記載の方法。
- 請求項7または8の方法により得られる共通のL鎖を有する二重特異性抗体。
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