JPWO2016047652A1 - Fviiiの反応性を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
血友病AにおけるFVIIIインヒビターの力価測定は、主にBethesda assayまたはNijmegen Bethesda assayによって実施される(非特許文献5、6)。
また、本二重特異性抗体のFIXa Fabに対する抗体、FX Fabに対する抗体が取得され、動物実験の血漿サンプル中の本二重特異性抗体の濃度測定が行われた(非特許文献9)
〔1〕凝固第VIII因子の反応性を測定する方法であって、以下の(1)と(2)を接触させる工程を含む方法。
(1)凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
(2)凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和する一以上の物質
〔2〕凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質が、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子ならびに凝固第X因子および/または活性化血液凝固第X因子に結合する二重特異性抗体である〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記二重特異性抗体が以下に記載のいずれかの抗体であって、第一のポリペプチドと第三のポリペプチドが会合し、第二のポリペプチドと第四のポリペプチドが会合する二重特異性抗体である〔1〕又は〔2〕に記載の方法。
第一のポリペプチドが配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号:11に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号:10に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)。
第一のポリペプチドが配列番号:36に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号:37に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号:38に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)。
〔4〕前記中和する物質が、前記凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和するペプチド、ポリペプチド、有機化合物、アプタマー、および抗体からなる群から選ばれる1以上の物質である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕前記中和する物質が、凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる1以上の抗体である、〔2〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕前記中和する物質が、以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる1以上の組み合わせである、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
(a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(c) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
〔7〕凝固第VIII因子の反応性を測定する方法が、凝固第VIII因子活性を測定する方法又は凝固第VIII因子インヒビター力価を測定する方法である、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔8〕凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる1以上の抗体を含む、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
〔9〕以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる1以上の組み合わせを含む、〔8〕に記載のキット。
(a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(c) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
〔10〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断する方法。
〔11〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断する方法。
〔12〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングする方法。
〔13〕前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、〔10〕〜〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕〔8〕又は〔9〕に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断するためのキット。
〔15〕〔8〕又は〔9〕に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断するためのキット。
〔16〕〔8〕又は〔9〕に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングするためのキット。
〔17〕前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、〔14〕〜〔16〕のいずれかに記載のキット。
(1)FVIIIの機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
(2)FVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質
一般的に用いられているFVIII活性測定方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば凝固時間(aPTT測定)を基本とした、第VIII因子欠乏血漿(Sysmex, Kobe, Japan)を使用したone-stage clotting assay(Casillas et al., (1971) Coagulation 4: 107-11)を用いることができる。one-stage clotting assayは、例えば、以下の方法で実施される。10倍希釈した被験血漿 50 μL、FVIII欠乏血漿 50 μL、及びAPTT試薬 50 μLの3溶液を混合し、37℃、5分間インキュベーション後、カルシウム溶液 50 μLを添加することにより凝固反応を開始させ、凝固するまでの時間を測定する。また、被験血漿の代わりに、正常血漿希釈系列サンプル(10倍希釈した正常血漿中に含まれるFVIII活性を100%とする)を測定し、横軸にFVIII活性、縦軸に凝固時間をプロットした検量線を作成する。検量線から、被験血漿の凝固時間をFVIII活性に換算し、被験血漿中のFVIII活性を算出する。尚、本明細書においては、「FVIII活性の測定」は特に断らない限り、「活性化凝固第VIII因子(FVIIIa)の活性の測定」を含み得るものとして使われる。
(1)FVIIIの機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
(2)FVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質
一般的に用いられているFVIIIインヒビター力価測定方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えばBethesda assay(Kasper et al., (1975) Thrombos Diath Haemorrh 34:869-872)、ELISA法、Nijmegen Bethesda assay(Nijmegen modification assay)(Verbruggen et al., (1995) Thromb Haemost 73:247-251)を用いることができる。Bethesda assayは、例えば以下の方法で実施される。正常血漿と被験血漿を等量混合した溶液を37℃、2時間インキュベーション後、正常血漿中の残存第VIII因子活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)をベースとしたone-stage clotting assayにて測定する。正常血漿中の第VIII因子活性の50%を阻害する作用を1ベセスダ(1BU)と規定されており、そのためFVIIIインヒビターの力価はベセスダの単位で算出する。なお、被験血漿中に含まれるFVIIIインヒビター力価が高く、残存第FVIII活性が25 - 75%の範囲に収まらない場合は、緩衝液で適当に希釈した被験血漿を用いて、再度ベセスダ単位を算出した後、希釈倍率を乗じて被験血漿中のFVIIIインヒビター力価を算出する。
FVIIIは血液凝固に関与する一連の分子の1つであり、トロンビンやFXaにより活性化を受けると補因子活性を呈し、FIXaによるFX活性化反応を促進する。
FVIIIインヒビターは、20〜30%の血友病A患者において生じる、外来性のFVIIIに対する同種抗体である。また、元は正常であった個体においても、後天的にFVIIIに対して自己抗体を生じ得る。一般に、FVIIIインヒビター同種抗体及び自己抗体の大部分は抗FVIII中和抗体として機能し、FVIII活性を減少させるか、又は消滅させる。
本発明のFVIII機能代替活性を有する物質は、FVIII様活性を有する物質と言い換えることもできる。本発明において「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXaによるFXの活性化を促進する(FIXaによるFXa産生を促進する)ことを意味する。また、より具体的には、本発明において「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaを認識し、FIXaによるFXの活性化を促進する(FIXaによるFXa産生を促進する)ことを意味する。FXa産生促進活性は、例えば、FIXa、FX、合成基質S-2222(FXaの合成基質)、リン脂質から成る測定系で評価することができる。このような測定系は、血友病A症例における疾患の重症度および臨床症状と相関性を示す(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23)。
本発明におけるFVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質における「中和」とは例えばFVIII機能代替活性を有する物質のFVIII機能代替活性を全部または一部阻害することをいう。FVIII機能代替活性のを全部または一部の阻害は、例えばFVIIIの機能代替活性を有する物質が抗体の場合、抗体の抗原への結合を全部または一部阻害することによって実現しうるが、これに限定されるものではない。
本発明におけるFVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質における中和する物質の「物質」とは、例えば、FVIIIの機能代替活性を有する物質に結合するペプチド、ポリペプチド、有機化合物、アプタマー、抗体などを言う。
中和する物質は複数組み合わせて使用することができ、例えば抗体とアプタマーを組み合わせて使用することができる。
本発明におけるポリペプチドとは、通常、10アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
本発明における有機化合物は、例えば低分子化合物であり、好ましくは分子量が1000以下である。
「アプタマー」は、ポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する核酸分子を指す。例えば、本発明のアプタマーは、FVIII代替活性を有する物質に特異的に結合することができるRNAアプタマーであることができる。アプタマーの生成および治療的使用は当分野において十分に確立されている。例えば、アプタマーはSELEX法(米国特許第5475096号、同5580737号、同5567588号、同5707796号、同5763177号、同6699843号などを参照)を用いることで取得可能である。
FVIIIの機能代替活性を有する物質に結合する抗体としては、例えばFVIIIの機能代替活性を有する物質がFIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体の場合、FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FIXおよび/またはFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabならびにFXおよび/またはFXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる抗体を挙げることができる。上記抗体を単独で使用することができ、また複数組み合わせて使用することができる。例えば、1種類の抗原に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体を複数、例えばFIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体を複数種類、使用することもできる。FVIIIの機能代替活性を有する物質がFIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体の場合、例えば以下の組み合わせで使用することができる。
(a) FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体とFXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(b) FIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体とFXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(c) FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体とFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(d) FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と、FXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及びFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
AQ8のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列:配列番号:1
核酸配列:配列番号:5
AQ8のL鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列:配列番号:2
核酸配列:配列番号:6
AQ8のH鎖CDR1〜3のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR1アミノ酸配列:配列番号:12
CDR2アミノ酸配列:配列番号:13
CDR3アミノ酸配列:配列番号:14
CDR1核酸配列:配列番号:15
CDR2核酸配列:配列番号:16
CDR3核酸配列:配列番号:17
AQ8のL鎖CDR1〜3のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR1アミノ酸配列:配列番号:18
CDR2アミノ酸配列:配列番号:19
CDR3アミノ酸配列:配列番号:20
CDR1核酸配列:配列番号:21
CDR2核酸配列:配列番号:22
CDR3核酸配列:配列番号:23
AJ540のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列:配列番号:3
核酸配列:配列番号:7
AJ540のL鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列:配列番号:4
核酸配列:配列番号:8
AJ540のH鎖CDR1〜3のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR1アミノ酸配列:配列番号:24
CDR2アミノ酸配列:配列番号:25
CDR3アミノ酸配列:配列番号:26
CDR1核酸配列:配列番号:27
CDR2核酸配列:配列番号:28
CDR3核酸配列:配列番号:29
AJ540のL鎖CDR1〜3のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR1アミノ酸配列:配列番号:30
CDR2アミノ酸配列:配列番号:31
CDR3アミノ酸配列:配列番号:32
CDR1核酸配列:配列番号:33
CDR2核酸配列:配列番号:34
CDR3核酸配列:配列番号:35
抗体としては、遺伝子組換え技術を用いて産生した組換え型抗体を用いることができる。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、ベクターに組み込んで、これを宿主(宿主細胞)に導入し産生させることにより得ることができる。
本発明におけるFVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質の一実施形態である抗体は、当該抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する抗体、より好ましくは同じエピトープに結合する抗体も包含する。
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
本発明において、血液由来サンプルは好ましくは被験者から採取された血液由来サンプルである。このような血液由来サンプルは、FVIII代替活性を有する物質を投与された被験者から取得することができる。被験者としては、体内のいずれかの部位に出血性の症状を伴う患者(出血性疾患患者)が挙げられる。主な出血部位としては、関節内、筋肉内、皮下、口腔内、頭蓋内、消化管、鼻腔内などが挙げられるがこれらに限定されない。出血性疾患患者としては、好ましくはFVIII及び/又はFVIIIaの活性の低下あるいは欠損が原因の出血性疾患患者が挙げられる。FVIII及び/又はFVIIIaの活性の低下あるいは欠損が原因の出血性疾患患者としては、出血性の症状を有する患者であって、先天的あるいは後天的に、FVIII及びFVIIIaのいずれか一方又は両方の活性が低下または欠損した患者を例示することができる。FVIII、FVIIIaの活性の低下としては、健常者と比較して、これらの活性が好ましくは40%未満(例えば40%未満、30%未満、20%未満、10%未満)、より好ましくは10%未満(例えば10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満)、さらに好ましくは5%未満(例えば5%未満、4%未満、3%未満、2%未満)、特に好ましくは1%未満の患者が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明によるFVIIIの反応性を測定する方法に必要なバッファーなど各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキットとして供給することができる。本発明のキットには、バッファーのほか、血液中のFVIII活性やFIX活性が正常なヒトから単離された血漿サンプル、FVIII代替活性を有する物質、FVIII活性測定に使用可能なもの、FVIIIインヒビター力価測定に使用可能なものなどを含むことができる。またキットに含まれる各種の試薬は、その使用態様に応じて粉末状あるいは液状とすることができる。またこれらを適当な容器に収納し、適時に使用することができる。
(a) 第一の投与量のFVIIIの機能代替活性を有する物質を投与する工程;
(b)患者のFVIIIの反応性をモニタリングする工程;
(c) 観測されたFVIIIの反応性に基づいて、FVIIIの機能代替活性を有する物質の第二の投与量を決定する工程、及び
(d)第二の投与量のFVIIIの機能代替活性を有する物質を該患者に投与する工程;
を含む方法を用いることができる。
(a) 第一の投与間隔でFVIIIの機能代替活性を有する物質を投与する工程;
(b)患者のFVIIIの反応性をモニタリングする工程;
(c) 観測されたFVIIIの反応性に基づいて、FVIIIの機能代替活性を有する物質の第二の投与間隔を決定する工程、及び
(d)第二の投与間隔でFVIIIの機能代替活性を有する物質を該患者に投与する工程;
を含む方法を用いることができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体の作製及び可変領域の配列決定
特許文献3(WO 2012/067176)に記載の二重特異性抗体であるACE910 (Q499-z121/J327-z119/L404-k)(配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号:10に記載のL鎖が会合し、配列番号:11に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号:10に記載のL鎖が会合している二重特異性抗体)に対する抗体作製を試みた。遺伝子組み換え手法及びPepsin消化を用い、抗FIXa側、抗FX側それぞれのFabで構成されたF(ab')2を作製した。
リコンビナントマウス抗体AQ8は、実施例1で得られたAQ8抗体の可変領域の配列に既知のマウスIgG2bの定常領域配列(重鎖: EMBL accession No. J00461, 軽鎖: EMBL accession No. V00807)を組み合せて抗体遺伝子の全長を作製し、発現ベクターに挿入した。同様に、リコンビナントラット-ウサギキメラ抗体AJ540は、AJ540抗体の可変領域に既知のラビットIgG (重鎖: EMBL accession No. L29172,軽鎖: EMBL accession No. X00231)を組み合せて作製した。作製した発現クローンプラスミドをHEK293細胞に導入し、大量培養及びProtein Aおよびゲルろ過による精製を行い、リコンビナントマウス抗体AQ8 (rAQ8-mIgG2b)およびリコンビナントラット-ウサギキメラ抗体AJ540 (rAJ540-rbtIgG)を作製した。
10又は100 U/dLのリコンビナントFVIII(コージネイトFS、バイエル薬品株式会社)を含むFVIII欠乏血漿(George King)に、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を、0又は300 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を、イミダゾールバッファー(協和メデックス)で10倍希釈する群と、rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGをそれぞれ300 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群の2群に分けて、測定用サンプル溶液を調製した。尚、ACE910を十分に中和するのに必要な量のrAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを加えた。組合せの詳細は以下に示す。
結果を図1に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体を添加した10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#3、#7)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示し、正しく測定することができなかった。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体を添加した10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体を含むバッファーで希釈した場合(#4、#8)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群(#1、#5)と同様のFVIII活性を示した。したがって、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体の活性を完全に中和することにより、二重特異性抗体が存在しているにもかかわらず血漿中のFVIII活性を正確に測定できることを示した。なお、10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体のみを含むバッファーで希釈した場合(#2、#6)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群(#1、#5)と同様のFVIII活性を示したことから、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体に対して特異的な中和作用を有することが分かった。
10 U/dLのリコンビナントFVIII(コージネイトFS、バイエル薬品株式会社)を含むFVIII欠乏血漿(George King)に、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を、0又は10 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を、イミダゾールバッファー(協和メデックス)で10倍希釈する群と、AQ1およびAJ541をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群、AQ1とAJ522をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群の3群に分けて、測定用サンプル溶液を調製した。尚、ACE910を十分に中和するのに必要な量のAQ1、AJ541、AJ522を加えた。組合せの詳細は以下に示す。
検量線用溶液の各FVIII活性における凝固時間から、測定用サンプルの凝固時間をFVIII活性に換算した。
結果を図2に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#4)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示し、正しく測定することができなかった。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ541を含むバッファーで希釈した場合(#5)又は抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ522を含むバッファーで希釈した場合(#6)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群(#1)と同様のFVIII活性を示した。したがって、二重特異性抗体ACE910の活性を完全に中和する抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体として、rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGだけでなく、別の抗体の組み合わせでも有効であった。
10 U/dLのリコンビナントFVIII(コージネイトFS、バイエル薬品株式会社)を含むFVIII欠乏血漿(George King)に、抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を、0又は10 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を、イミダゾールバッファー(協和メデックス)で10倍希釈する群と、AQ512およびAJ114をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群、AQ512とAJ521をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群の3群に分けて、測定用サンプル溶液を調製した。尚、hBS23を十分に中和するのに必要な量のAQ512、AJ114、AJ521を加えた。組合せの詳細は以下に示す。
検量線用溶液の各FVIII活性における凝固時間から、測定用サンプルの凝固時間をFVIII活性に換算した。
結果を図3に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#4)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示し、正しく測定することができなかった。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ114を含むバッファーで希釈した場合(#5)又は抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ521を含むバッファーで希釈した場合(#6)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群(#1)と同様のFVIII活性を示した。ACE910とは異なる二重特異性抗体hBS23でも、その活性を完全に中和することにより、二重特異性抗体が存在しているにもかかわらず血漿中のFVIII活性を正確に測定できたため、本アプローチは様々なFVIII代替活性を有する二重特異性抗体に対して有効であることを示した。
第VIII因子欠乏ヒト血漿(含FVIIIインヒビター)(George King Bio-Medical)に抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を、0又は300 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を0.25% (w/v)ウシ血清アルブミン(Sigma-Aldrich)含有イミダゾールバッファー(協和メデックス) (以下BSA-imidazole)にて25倍希釈又は30倍希釈した。標準血漿であるコアグトロールN(シスメックス)にrAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを無添加、又はそれぞれ300 μg/mLとなるように添加した。
調製した各血漿のうちの2種類を以下の組合せ(計8種類)で等量混合し、37℃、2時間インキュベーションした。
結果を図4に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体のみを含むFVIIIインヒビター血漿(#3)では、検量線のFVIII 100%以上の活性を示したことから、FVIIIインヒビター力価が測定できなかった。
一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体及び抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体を含むFVIIIインヒビター血漿(#4)では、無添加のインヒビター血漿(#1)と同様のFVIIIインヒビター力価を示した。したがって、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体の活性を完全に中和することにより、二重特異性抗体が存在しているにもかかわらず血漿中のFVIIIインヒビター力価を正確に測定できることを示した。なお、2種類の抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体のみを含むFVIIIインヒビター血漿(#2)は、#1と同様の結果を示したことから、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体に対して特異的な中和作用を有することが分かった。
Claims (17)
- 凝固第VIII因子の反応性を測定する方法であって、以下の(1)と(2)を接触させる工程を含む方法。
(1)凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
(2)凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和する一以上の物質 - 凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質が、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子ならびに凝固第X因子および/または活性化血液凝固第X因子に結合する二重特異性抗体である請求項1に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が以下に記載のいずれかの抗体であって、第一のポリペプチドと第三のポリペプチドが会合し、第二のポリペプチドと第四のポリペプチドが会合する二重特異性抗体である請求項1又は2に記載の方法。
第一のポリペプチドが配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号:11に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号:10に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)
第一のポリペプチドが配列番号:36に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号:37に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号:38に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k) - 前記中和する物質が、前記凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和するペプチド、ポリペプチド、有機化合物、アプタマー、および抗体からなる群から選ばれる1以上の物質である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記中和する物質が、凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる1以上の抗体である、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記中和する物質が、以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる1以上の組み合わせである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
(a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(c)凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体 - 凝固第VIII因子の反応性を測定する方法が、凝固第VIII因子活性を測定する方法又は凝固第VIII因子インヒビター力価を測定する方法である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる1以上の抗体を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
- 以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる1以上の組み合わせを含む、請求項8に記載のキット。
(a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(c)凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体 - 請求項1〜7のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断する方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断する方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングする方法。
- 前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
- 請求項8又は9に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断するためのキット。
- 請求項8又は9に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断するためのキット。
- 請求項8又は9に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングするためのキット。
- 前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、請求項14〜16のいずれかに記載のキット。
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