JPH05199894A - 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 - Google Patents
二重特異性抗体および抗体含有薬剤Info
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- JPH05199894A JPH05199894A JP19681091A JP19681091A JPH05199894A JP H05199894 A JPH05199894 A JP H05199894A JP 19681091 A JP19681091 A JP 19681091A JP 19681091 A JP19681091 A JP 19681091A JP H05199894 A JPH05199894 A JP H05199894A
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- antifungal
- apb
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Abstract
(57)【要約】
【目的】毒性の強い抗真菌剤の毒性を軽減し、かつ真菌
に対する選択性を持たせることにより真菌症治療上有用
な抗真菌剤を提供する。 【構成】真菌および抗真菌剤に対する特異性を有する二
重特異性抗体を作製し、該抗体に抗真菌剤を免疫結合さ
せた抗真菌免疫複合体を提供する。 【効果】本発明の抗真菌免疫複合体により、強毒性の抗
真菌剤の毒性を軽減し、かつ抗真菌剤の真菌選択性を向
上させることができる。
に対する選択性を持たせることにより真菌症治療上有用
な抗真菌剤を提供する。 【構成】真菌および抗真菌剤に対する特異性を有する二
重特異性抗体を作製し、該抗体に抗真菌剤を免疫結合さ
せた抗真菌免疫複合体を提供する。 【効果】本発明の抗真菌免疫複合体により、強毒性の抗
真菌剤の毒性を軽減し、かつ抗真菌剤の真菌選択性を向
上させることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は二重特異性を有するハイ
ブリッド・モノクローナル抗体に関する。さらに詳しく
は二重特異性の一方が抗真菌剤に対し、他方が真菌、特
に真菌の細胞壁糖蛋白あるいは多糖類に対するハイブリ
ッド・モノクローナル抗体(以下、ハイブリッドＭoＡb
と略記することがある)およびそれを産生するポリドー
マに関する。本発明はまた、上記ハイブリッドＭoＡbに
抗真菌剤を免疫結合させてなる抗真菌免疫複合体を真菌
に特異的に結合させ、真菌に致死的作用を与えることを
可能とする真菌症治療剤に関する。
ブリッド・モノクローナル抗体に関する。さらに詳しく
は二重特異性の一方が抗真菌剤に対し、他方が真菌、特
に真菌の細胞壁糖蛋白あるいは多糖類に対するハイブリ
ッド・モノクローナル抗体(以下、ハイブリッドＭoＡb
と略記することがある)およびそれを産生するポリドー
マに関する。本発明はまた、上記ハイブリッドＭoＡbに
抗真菌剤を免疫結合させてなる抗真菌免疫複合体を真菌
に特異的に結合させ、真菌に致死的作用を与えることを
可能とする真菌症治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】真菌による疾患は一般に難治とされ、し
かも近年この真菌症が急速に増加する傾向にある。例え
ば臓器移植患者、抗生物質やステロイド剤の多量長期投
与患者、エイズ患者、さらには白血病や癌の末期患者の
深在性真菌症の合併が数多く報告されている。これらの
疾患には(1)イミダゾール誘導体であるケトコナゾール,
ミコナゾール、 (2)フルオロピリミジン誘導体であるフ
ルサイトシン、 そして(3)ポリエン系抗生物質であるア
ムホテリシンＢ(以下、ＡＰＢと略記することがある),
トリコマイシン,ナイスタチンなどが用いられている。
上記(1)および(2)に挙げたイミダゾール誘導体やフルオ
ロピリミジン誘導体などは比較的毒性は弱いとされてい
るものの十分な薬効が得られず、また上記(3)に挙げた
ＡＰＢは真菌の細胞膜に著明な変化を惹起し強い抗菌性
を示すが、毒性が強いため大量投与あるいは長期の連続
投与ができないなどの欠点を有していた。一方、癌細胞
を選択的に殺す薬物として抗癌抗体と抗癌剤との複合体
が作製され、“ミサイル療法剤”として臨床応用されつ
つある。これらの複合体は、抗癌抗体が癌細胞表面上の
癌特異抗原と結合し、次いでその標的癌細胞を抗癌剤が
傷害するというもので、抗癌剤の標的腫瘍部位への効率
的運搬により劇的な副作用の軽減および抗癌効果の増強
をもたらすものである。このような抗癌−薬物複合体の
作製に関し、薬物を抗体に化学結合させる方法では、1)
薬物の薬理活性が低下する、2）品質の一定した複合体
の作製が困難である、 あるいは3)使用しうる薬物が限定
される、 などの欠点があった。そこで癌細胞と抗癌剤と
の双方に結合能を有する二重特異性抗体が作製され、か
かる抗体の出現により薬効の高い、品質の一定した抗体
−薬物複合体の作製が可能となった。
かも近年この真菌症が急速に増加する傾向にある。例え
ば臓器移植患者、抗生物質やステロイド剤の多量長期投
与患者、エイズ患者、さらには白血病や癌の末期患者の
深在性真菌症の合併が数多く報告されている。これらの
疾患には(1)イミダゾール誘導体であるケトコナゾール,
ミコナゾール、 (2)フルオロピリミジン誘導体であるフ
ルサイトシン、 そして(3)ポリエン系抗生物質であるア
ムホテリシンＢ(以下、ＡＰＢと略記することがある),
トリコマイシン,ナイスタチンなどが用いられている。
上記(1)および(2)に挙げたイミダゾール誘導体やフルオ
ロピリミジン誘導体などは比較的毒性は弱いとされてい
るものの十分な薬効が得られず、また上記(3)に挙げた
ＡＰＢは真菌の細胞膜に著明な変化を惹起し強い抗菌性
を示すが、毒性が強いため大量投与あるいは長期の連続
投与ができないなどの欠点を有していた。一方、癌細胞
を選択的に殺す薬物として抗癌抗体と抗癌剤との複合体
が作製され、“ミサイル療法剤”として臨床応用されつ
つある。これらの複合体は、抗癌抗体が癌細胞表面上の
癌特異抗原と結合し、次いでその標的癌細胞を抗癌剤が
傷害するというもので、抗癌剤の標的腫瘍部位への効率
的運搬により劇的な副作用の軽減および抗癌効果の増強
をもたらすものである。このような抗癌−薬物複合体の
作製に関し、薬物を抗体に化学結合させる方法では、1)
薬物の薬理活性が低下する、2）品質の一定した複合体
の作製が困難である、 あるいは3)使用しうる薬物が限定
される、 などの欠点があった。そこで癌細胞と抗癌剤と
の双方に結合能を有する二重特異性抗体が作製され、か
かる抗体の出現により薬効の高い、品質の一定した抗体
−薬物複合体の作製が可能となった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】毒性が非常に強いため
に、十分な有効量を用いえない抗真菌剤の毒性を軽減
し、弱毒性でかつ効率的に真菌を溶解または除去可能な
抗真菌剤を提供する。
に、十分な有効量を用いえない抗真菌剤の毒性を軽減
し、弱毒性でかつ効率的に真菌を溶解または除去可能な
抗真菌剤を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは抗真菌剤に
関わる上記の諸問題を解決するため、最近の蛋白結合技
術あるいは細胞融合技術の進歩により著しく発展した二
重特異性抗体を用いた新しいタイプの抗真菌剤について
鋭意検討し、抗真菌−抗薬物二重特異性抗体を開発し、
それを用いた副作用のきわめて少ない薬効の高い抗体−
薬物複合体を作製した。すなわち、本発明は二重特異性
を有するハイブリッドＭoＡbであって、二重特異性の一
方が抗真菌剤に対し、 他方が標的真菌(例えば、鵞口瘡
カンジダ( Candida albicans：ＣＡ)の細胞壁糖蛋白な
ど)に対する二重特異性抗体およびそれを産生するポリ
ドーマに関するものである。また、本発明はかかる二重
特異性抗体に抗真菌剤を免疫結合させてなる真菌症治療
剤に関するものである。本発明における真菌としては、
例えば(1)コクシジオイデス属菌(例、 Coccidioides im
mitis など)などの藻菌類、 (2)アスペルギルス属菌
(例、Aspergillusterreus, Aspergillus Fumigatus, A
spergillus nidulans など),スコプラリオプシス属菌
(例、 Scopulariopsis blochii など)などの子嚢菌類、
(3)クリプトコックス属菌(例、Cryptococcus neoforma
ns など),カンジダ属菌(例、Candida albicaus など),
トリコスポロン属菌(例、Trichosporon cutaneum, Tri
chosporon beigeliiなど)などのクリプトコックス科
菌,モニリア科菌(例、Sporotrichum schenckii, Acrem
onium potronii, Blastmyces dermatitidis, Blastmy
ces brasiliensis, Histoplasma capsulatum など),
デマチウム科菌(例、 Hormodendrum pedrosoi など)な
どの不完全菌類、 (4)小胞子菌属(例、 Microsporumaudou
inii, Microsporum canis, Microsporum gypseum な
ど), 白癬菌属(例、Trichophyton mentagrophytes, Tr
ichophyton interdigitale, Trichophyton pedis, T
richophyton rubrum, Trichophyton coccineum, Tric
hophytonschoenleinii, Trichophyton ferrugineum, Tr
ichophyton violaceum, Trichophyton concentricum
など),表皮菌属(例、Epidermophyton floccosum など)
などの皮膚糸状菌などの哺乳動物(例、マウス,ラット,
ネコ,ウサギ,イヌ,ブタ,ウマ,ウシ,サル,ヒトなど)に対
して病原性を示す真菌などが挙げられるが、なかでも
不完全菌類が好ましく、さらにクリプトコックス科菌が
好ましく、 とりわけカンジダ属菌(好ましくは Candida
albicans)が好ましく用いられる。
関わる上記の諸問題を解決するため、最近の蛋白結合技
術あるいは細胞融合技術の進歩により著しく発展した二
重特異性抗体を用いた新しいタイプの抗真菌剤について
鋭意検討し、抗真菌−抗薬物二重特異性抗体を開発し、
それを用いた副作用のきわめて少ない薬効の高い抗体−
薬物複合体を作製した。すなわち、本発明は二重特異性
を有するハイブリッドＭoＡbであって、二重特異性の一
方が抗真菌剤に対し、 他方が標的真菌(例えば、鵞口瘡
カンジダ( Candida albicans：ＣＡ)の細胞壁糖蛋白な
ど)に対する二重特異性抗体およびそれを産生するポリ
ドーマに関するものである。また、本発明はかかる二重
特異性抗体に抗真菌剤を免疫結合させてなる真菌症治療
剤に関するものである。本発明における真菌としては、
例えば(1)コクシジオイデス属菌(例、 Coccidioides im
mitis など)などの藻菌類、 (2)アスペルギルス属菌
(例、Aspergillusterreus, Aspergillus Fumigatus, A
spergillus nidulans など),スコプラリオプシス属菌
(例、 Scopulariopsis blochii など)などの子嚢菌類、
(3)クリプトコックス属菌(例、Cryptococcus neoforma
ns など),カンジダ属菌(例、Candida albicaus など),
トリコスポロン属菌(例、Trichosporon cutaneum, Tri
chosporon beigeliiなど)などのクリプトコックス科
菌,モニリア科菌(例、Sporotrichum schenckii, Acrem
onium potronii, Blastmyces dermatitidis, Blastmy
ces brasiliensis, Histoplasma capsulatum など),
デマチウム科菌(例、 Hormodendrum pedrosoi など)な
どの不完全菌類、 (4)小胞子菌属(例、 Microsporumaudou
inii, Microsporum canis, Microsporum gypseum な
ど), 白癬菌属(例、Trichophyton mentagrophytes, Tr
ichophyton interdigitale, Trichophyton pedis, T
richophyton rubrum, Trichophyton coccineum, Tric
hophytonschoenleinii, Trichophyton ferrugineum, Tr
ichophyton violaceum, Trichophyton concentricum
など),表皮菌属(例、Epidermophyton floccosum など)
などの皮膚糸状菌などの哺乳動物(例、マウス,ラット,
ネコ,ウサギ,イヌ,ブタ,ウマ,ウシ,サル,ヒトなど)に対
して病原性を示す真菌などが挙げられるが、なかでも
不完全菌類が好ましく、さらにクリプトコックス科菌が
好ましく、 とりわけカンジダ属菌(好ましくは Candida
albicans)が好ましく用いられる。
【０００５】本発明で用いられる抗真菌剤としては、代
表的なものとして例えば、(1)グリセオフルビン、 ポリ
エン系抗生物質(例、 ナイスタチン,アムホテリシンＢ,
トリコマイシン,ピマリシンなど)、バリオチン、シカニ
ン、ピロールニトリン、エキノカンジン−アクレアシン
群抗生物質(例、エキノカンジンＢ,アクレアシンＡな
ど)、 パプラカンジン群抗生物質(例、 パプラカンジンＢ
など)、アムブルチシンなどの抗生物質、(2)スチルバミ
ジン系化合物(例、 スチルバミジン・イセチオネート,２
−ヒドロキシスチルバミジン・イセチオネートなど)、
ジアムタゾール系化合物(例、ジアムタゾール・ジヒド
ロクロライドなど)、アルキルオキシベンツアミド系化
合物(例、２−n−ヘキシルオキシベンツアミドなど)、
ベンツイミダゾール系化合物(例、クロルイミダゾール
など)、チオカルバミン酸系化合物(例、トルナフテー
ト,トルシクレートなど)、３−ヨードプロパギル系化合
物(例、ハ ロプロギン,メチオジンなど)、フルオロピリ
ジン系化合物(例、フルサイトシン など)、ω−ヨード
アセチレン性脂肪酸系化合物(例、フェニル１１−ヨー
ド−１０−ウンデシノエートなど)、イミダゾール系化
合物(例、クロトリマゾール,ミ コナゾール,エコナゾー
ル,イソコナゾール,スルコナゾール,ブトコナゾール,チ
オコナゾール,ビホナゾール,クロコナゾール,オキシコ
ナゾール,ケトコナゾールなど)、Ｎ−ヒドロキシピリド
ン系化合物(例、シクロピロキソールアミンなど)、トリ
アゾール系化合物(例、ターコナゾール, ＩＣＩ １５
３,０６６,ビブナゾール,フルコナゾール,イトラコナゾ
ールなど)、アリルアミン系化合物(例、ナフチフィン,
タービナフィンなど)、 トリヨードアリル系化合物(例、
ＭＥ−１２０７ など)などの合成化合物などが挙げられ
るが、なかでもポリエン系抗生物質が好 ましく用いら
れる。
表的なものとして例えば、(1)グリセオフルビン、 ポリ
エン系抗生物質(例、 ナイスタチン,アムホテリシンＢ,
トリコマイシン,ピマリシンなど)、バリオチン、シカニ
ン、ピロールニトリン、エキノカンジン−アクレアシン
群抗生物質(例、エキノカンジンＢ,アクレアシンＡな
ど)、 パプラカンジン群抗生物質(例、 パプラカンジンＢ
など)、アムブルチシンなどの抗生物質、(2)スチルバミ
ジン系化合物(例、 スチルバミジン・イセチオネート,２
−ヒドロキシスチルバミジン・イセチオネートなど)、
ジアムタゾール系化合物(例、ジアムタゾール・ジヒド
ロクロライドなど)、アルキルオキシベンツアミド系化
合物(例、２−n−ヘキシルオキシベンツアミドなど)、
ベンツイミダゾール系化合物(例、クロルイミダゾール
など)、チオカルバミン酸系化合物(例、トルナフテー
ト,トルシクレートなど)、３−ヨードプロパギル系化合
物(例、ハ ロプロギン,メチオジンなど)、フルオロピリ
ジン系化合物(例、フルサイトシン など)、ω−ヨード
アセチレン性脂肪酸系化合物(例、フェニル１１−ヨー
ド−１０−ウンデシノエートなど)、イミダゾール系化
合物(例、クロトリマゾール,ミ コナゾール,エコナゾー
ル,イソコナゾール,スルコナゾール,ブトコナゾール,チ
オコナゾール,ビホナゾール,クロコナゾール,オキシコ
ナゾール,ケトコナゾールなど)、Ｎ−ヒドロキシピリド
ン系化合物(例、シクロピロキソールアミンなど)、トリ
アゾール系化合物(例、ターコナゾール, ＩＣＩ １５
３,０６６,ビブナゾール,フルコナゾール,イトラコナゾ
ールなど)、アリルアミン系化合物(例、ナフチフィン,
タービナフィンなど)、 トリヨードアリル系化合物(例、
ＭＥ−１２０７ など)などの合成化合物などが挙げられ
るが、なかでもポリエン系抗生物質が好 ましく用いら
れる。
【０００６】本発明に用いられるポリエン系抗生物質と
しては、テトラエン抗生物質(例、アムホテリシンＡな
ど)、ペンタエン抗生物質(例、ピマリシン,ペンタマイ
シンなど)、ヘキサエン抗生物質(例、ナイスタチンな
ど)、ヘプタエン抗生物質(例、アムホテリシンＢ,カン
ジシジン,ペリマイシン,ハアマイシン,トリコマイシン
など)などがあげられるが、 好ましくはヘプタエン抗生
物質であり、 なかでもアムホテリシンＢ類(好ましくは
アムホテリシンＢ)が好ましく用いられる。ここでアム
ホテリシンＢ類とは、アムホテリシンＢ,その誘導体お
よびこれらの塩を含むものである。 アムホテリシンＢの
誘導体としては、例えば(1)Ｎ−アルキル誘導体（ 例、
metaphosin, etaphosin, propamphosin, butamphosin
など[Kasumov, Kh. M. et.al, Antibiotiki(Moscow),２
９ (７),５１３(１９８４)]、あるいはＮ,Ｎ,Ｎ−トリメ
チルアムホテリシンＢなど)、Ｎ−アシル誘導体(例、Ｎ
−アセチルアムホテリシンＢなど)、Ｏ−シリル誘導体
(例、１３,１４−アン ヒドロアムホテリシンＢ[ＥＰ公
開第３５０１６４号公報]など)、Ｎ−アミノア シル誘
導体(例、Ｎ−グリシルアムホテリシンＢ,Ｎ−リシルア
ムホテリシンＢ, Ｎ−Ｄ−オルニチルアムホテリシンＢ
など)、Ｎ−アルキルアミノアシル誘導体(例、Ｎ,Ｎ−
ジメチルグリシルアムホテリシンＢなど)、エナミン誘
導体、アミジン誘導体などあるいはＮ−チオプロピオニ
ルアムホテリシンＢ,Ｎ−フルクトシ ルアムホテリシン
Ｂ,Ｎ−グルコシルアムホテリシンＢ,１−(ジメチルア
ミノプ ロピル)−３−エチルカルボジイミドアムホテリ
シンＢなどおよび(2)上記誘導体あるいはアムホテリシ
ンＢのエステル(例、アムホテリシンＢメチルエステル
な どのアルキルエステルなど)などがあげられる。ま
た、これらの塩としては、Ｎa塩,ＨＣl塩,Ｎ−メチルグ
ルカミン塩などがあげられる。
しては、テトラエン抗生物質(例、アムホテリシンＡな
ど)、ペンタエン抗生物質(例、ピマリシン,ペンタマイ
シンなど)、ヘキサエン抗生物質(例、ナイスタチンな
ど)、ヘプタエン抗生物質(例、アムホテリシンＢ,カン
ジシジン,ペリマイシン,ハアマイシン,トリコマイシン
など)などがあげられるが、 好ましくはヘプタエン抗生
物質であり、 なかでもアムホテリシンＢ類(好ましくは
アムホテリシンＢ)が好ましく用いられる。ここでアム
ホテリシンＢ類とは、アムホテリシンＢ,その誘導体お
よびこれらの塩を含むものである。 アムホテリシンＢの
誘導体としては、例えば(1)Ｎ−アルキル誘導体（ 例、
metaphosin, etaphosin, propamphosin, butamphosin
など[Kasumov, Kh. M. et.al, Antibiotiki(Moscow),２
９ (７),５１３(１９８４)]、あるいはＮ,Ｎ,Ｎ−トリメ
チルアムホテリシンＢなど)、Ｎ−アシル誘導体(例、Ｎ
−アセチルアムホテリシンＢなど)、Ｏ−シリル誘導体
(例、１３,１４−アン ヒドロアムホテリシンＢ[ＥＰ公
開第３５０１６４号公報]など)、Ｎ−アミノア シル誘
導体(例、Ｎ−グリシルアムホテリシンＢ,Ｎ−リシルア
ムホテリシンＢ, Ｎ−Ｄ−オルニチルアムホテリシンＢ
など)、Ｎ−アルキルアミノアシル誘導体(例、Ｎ,Ｎ−
ジメチルグリシルアムホテリシンＢなど)、エナミン誘
導体、アミジン誘導体などあるいはＮ−チオプロピオニ
ルアムホテリシンＢ,Ｎ−フルクトシ ルアムホテリシン
Ｂ,Ｎ−グルコシルアムホテリシンＢ,１−(ジメチルア
ミノプ ロピル)−３−エチルカルボジイミドアムホテリ
シンＢなどおよび(2)上記誘導体あるいはアムホテリシ
ンＢのエステル(例、アムホテリシンＢメチルエステル
な どのアルキルエステルなど)などがあげられる。ま
た、これらの塩としては、Ｎa塩,ＨＣl塩,Ｎ−メチルグ
ルカミン塩などがあげられる。
【０００７】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
ＭoＡb作製にあたっては、 原料の一つとして抗真菌剤に
対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが用いら
れるが、 かかるハイブリドーマ、 例えば抗ＡＰＢモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマは下記の方法で作製さ
れる。まずＡＰＢ(下記式(Ｉ)参照)もしくはその誘導体
を動物に接種し、抗ＡＰＢ抗体の産生を促す。この場
合、通常ＡＰＢもしくはその誘導体をそのまま免疫原と
して用いたのでは高力価の抗体産生を惹起しえないの
で、ＡＰＢの有するカルボキシル基あるいはアミノ基を
介してキャリア蛋白である牛血清アルブミン(以下、Ｂ
ＳＡと略記することがある)、キーホール・リンペット
・ヘモシアニン(以下、ＫＬＨと略記することがある)、
あるいはチログロブリンなどに結合させ免疫原 として
用いる。
ＭoＡb作製にあたっては、 原料の一つとして抗真菌剤に
対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが用いら
れるが、 かかるハイブリドーマ、 例えば抗ＡＰＢモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマは下記の方法で作製さ
れる。まずＡＰＢ(下記式(Ｉ)参照)もしくはその誘導体
を動物に接種し、抗ＡＰＢ抗体の産生を促す。この場
合、通常ＡＰＢもしくはその誘導体をそのまま免疫原と
して用いたのでは高力価の抗体産生を惹起しえないの
で、ＡＰＢの有するカルボキシル基あるいはアミノ基を
介してキャリア蛋白である牛血清アルブミン(以下、Ｂ
ＳＡと略記することがある)、キーホール・リンペット
・ヘモシアニン(以下、ＫＬＨと略記することがある)、
あるいはチログロブリンなどに結合させ免疫原 として
用いる。
【化１】 免疫動物としては、一般に哺乳類例えばウサギ,ラット,
マウス,モルモットなどが用いられるが、 ＭoＡb 製造の
場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接種方法と
しては、通常実施される方法に従えばよく、例えばマウ
スに１回１〜１００μg、好ましくは１０〜２５μgを等
容量(０.１ml)の生理食塩水およびフロイントの完全ア
ジュバントで乳化して、背部,腹部の皮下あるいは腹腔
内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。
マウス,モルモットなどが用いられるが、 ＭoＡb 製造の
場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接種方法と
しては、通常実施される方法に従えばよく、例えばマウ
スに１回１〜１００μg、好ましくは１０〜２５μgを等
容量(０.１ml)の生理食塩水およびフロイントの完全ア
ジュバントで乳化して、背部,腹部の皮下あるいは腹腔
内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる。
【０００８】これらの免疫動物、例えばマウスから抗体
価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓および
／あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産
生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方
法に従い実施でき、融合促進剤としてはポリエチレング
リコール(以下、ＰＥＧと略記することがある)やセンダ
イウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用
いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ
Ｐ２／０など、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。例
えば脾臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は１：１〜
１０：１で、これに分子量１,０００〜９,０００のＰＥ
Ｇが１０〜８０％の濃度で添加され、２０〜３７℃、好
ましくは３０〜３７℃で３〜１０分インキュベートする
のが良い。抗ＡＰＢマウスモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
る。例えば、ヒト血清アルブミン(以下、ＨＳＡと略記
することがある)を結合させたＡＰＢをマイクロプレー
トに吸着させ、固相化抗原を作製する。次いでハイブリ
ドーマ培養上清をこれらの抗原感作マイクロプレートに
添加し、プレートに結合した抗ＡＰＢ特異抗体を西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼ(以下、ＨＲＰと略記すること
がある)標識した抗マウス免疫グロブリン抗体により検
出する酵素免疫測定法(以下、ＥＩＡと略記することが
ある)により培養上清中の抗体価を測定する。ＨＡＴ(ヒ
ポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)添加培地で
選別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ち
にクローニングに供されるが、通常これは限界希釈法な
どで容易に実施される。クローン化されたハイブリドー
マ培養上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力
価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的
とするモノクローナルな抗ＡＰＢ特異抗体産生ハイブリ
ドーマを取得することができる。以上のような製造法に
従って作製した抗ＡＰＢマウスモノクローナル抗体(Ｉg
Ｇ1,κ鎖)産生ハイブリドーマの例として、後述の実施
例１に示したマウスハイブリドーマＡＴＢ１−１１４が
挙げられる。一方、原料の一つである抗真菌モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマは下記の方法で作製され
る。
価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓および
／あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産
生細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方
法に従い実施でき、融合促進剤としてはポリエチレング
リコール(以下、ＰＥＧと略記することがある)やセンダ
イウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用
いられる。骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ
Ｐ２／０など、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。例
えば脾臓細胞と骨髄腫細胞との好ましい比率は１：１〜
１０：１で、これに分子量１,０００〜９,０００のＰＥ
Ｇが１０〜８０％の濃度で添加され、２０〜３７℃、好
ましくは３０〜３７℃で３〜１０分インキュベートする
のが良い。抗ＡＰＢマウスモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
る。例えば、ヒト血清アルブミン(以下、ＨＳＡと略記
することがある)を結合させたＡＰＢをマイクロプレー
トに吸着させ、固相化抗原を作製する。次いでハイブリ
ドーマ培養上清をこれらの抗原感作マイクロプレートに
添加し、プレートに結合した抗ＡＰＢ特異抗体を西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼ(以下、ＨＲＰと略記すること
がある)標識した抗マウス免疫グロブリン抗体により検
出する酵素免疫測定法(以下、ＥＩＡと略記することが
ある)により培養上清中の抗体価を測定する。ＨＡＴ(ヒ
ポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)添加培地で
選別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ち
にクローニングに供されるが、通常これは限界希釈法な
どで容易に実施される。クローン化されたハイブリドー
マ培養上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力
価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的
とするモノクローナルな抗ＡＰＢ特異抗体産生ハイブリ
ドーマを取得することができる。以上のような製造法に
従って作製した抗ＡＰＢマウスモノクローナル抗体(Ｉg
Ｇ1,κ鎖)産生ハイブリドーマの例として、後述の実施
例１に示したマウスハイブリドーマＡＴＢ１−１１４が
挙げられる。一方、原料の一つである抗真菌モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマは下記の方法で作製され
る。
【０００９】標的とする真菌の抗原としては、例えばカ
ンジダ症の病因菌である Candidaalbicans (以下、ＣＡ
と略記することがある)の加熱死菌やホルマリン処理死
菌そのもの、あるいはそれら死菌の細胞壁糖蛋白あるい
は多糖類(マンナン)が用いられる。後者のマンナン抗原
は公知の方法に従って精製され[ A. Cassone ら：ジャ
ーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー( J.
Med. Microbiol. ),２７,２３３(１９８８)]、通常下
記の方法により調製される。1)菌体(ＣＡ)をオートクレ
ーブ処理し(１２０℃,９０分)遠心分離後、 上清液にフ
ェーリング液を添加する。 2)得られた沈殿を遠心分離操
作により、採取後、 塩酸を加えて溶解しメタノール酢酸
混液に添加する。 3)遠心分離後、沈渣にメタノールを加
え洗浄する。 さらに遠心分離し沈渣に少量のエーテルを
加えて室温で風乾する。 マウスへの免疫操作において
は、例えば加熱死菌あるいはホルマリン処理死菌の場
合、一回に１０６〜１０8個／匹, 好ましくは０.５〜２
×１０7個をリン酸食塩緩衝液(以下、 ＰＢＳと略記する
ことがある)に懸濁して、２〜３週毎に３〜８回接種す
る方法が取られる。マンナン抗原の免疫は前述したＡＰ
Ｂ−キャリア蛋白複合体の場合と同様にして実施され
る。以下、これらの免疫動物から採取した抗体産生細胞
と骨髄腫細胞との融合操作は、ＡＰＢについて述べた方
法と同様にして実施できる。
ンジダ症の病因菌である Candidaalbicans (以下、ＣＡ
と略記することがある)の加熱死菌やホルマリン処理死
菌そのもの、あるいはそれら死菌の細胞壁糖蛋白あるい
は多糖類(マンナン)が用いられる。後者のマンナン抗原
は公知の方法に従って精製され[ A. Cassone ら：ジャ
ーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオロジー( J.
Med. Microbiol. ),２７,２３３(１９８８)]、通常下
記の方法により調製される。1)菌体(ＣＡ)をオートクレ
ーブ処理し(１２０℃,９０分)遠心分離後、 上清液にフ
ェーリング液を添加する。 2)得られた沈殿を遠心分離操
作により、採取後、 塩酸を加えて溶解しメタノール酢酸
混液に添加する。 3)遠心分離後、沈渣にメタノールを加
え洗浄する。 さらに遠心分離し沈渣に少量のエーテルを
加えて室温で風乾する。 マウスへの免疫操作において
は、例えば加熱死菌あるいはホルマリン処理死菌の場
合、一回に１０６〜１０8個／匹, 好ましくは０.５〜２
×１０7個をリン酸食塩緩衝液(以下、 ＰＢＳと略記する
ことがある)に懸濁して、２〜３週毎に３〜８回接種す
る方法が取られる。マンナン抗原の免疫は前述したＡＰ
Ｂ−キャリア蛋白複合体の場合と同様にして実施され
る。以下、これらの免疫動物から採取した抗体産生細胞
と骨髄腫細胞との融合操作は、ＡＰＢについて述べた方
法と同様にして実施できる。
【００１０】抗真菌モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる。例
えば、加熱死菌あるいはホルマリン処理死菌をマイクロ
プレートに播き４５℃で乾燥後、ホルマリンで固定した
ものを固相抗原として用いる。あるいは前述の方法で得
られたマンナン抗原を１０〜１００μg／mlの濃度でマ
イクロプレートに感作し抗原固相を得る方法も用いられ
る。以上のようにして作製された抗原感作マイクロプレ
ートにハイブリドーマ培養上清を添加し、プレートに結
合した抗真菌抗体をＨＲＰ標識第２抗体で検出するＥＩ
Ａにより培養上清中の抗体価を測定する。抗体活性陽性
のハイブリドーマは直ちに前述の方法によりクローニン
グに供され、真菌に結合能を有するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを取得することができる。以上のよ
うな製造法に従って作製した抗真菌マウスモノクローナ
ル抗体(ＩgＧ1,κ鎖)産生ハイブリドーマの例として、
後述の実施例２に示したマウスハイブリドーマＣＡ３−
２−１２が挙げられる。
ーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる。例
えば、加熱死菌あるいはホルマリン処理死菌をマイクロ
プレートに播き４５℃で乾燥後、ホルマリンで固定した
ものを固相抗原として用いる。あるいは前述の方法で得
られたマンナン抗原を１０〜１００μg／mlの濃度でマ
イクロプレートに感作し抗原固相を得る方法も用いられ
る。以上のようにして作製された抗原感作マイクロプレ
ートにハイブリドーマ培養上清を添加し、プレートに結
合した抗真菌抗体をＨＲＰ標識第２抗体で検出するＥＩ
Ａにより培養上清中の抗体価を測定する。抗体活性陽性
のハイブリドーマは直ちに前述の方法によりクローニン
グに供され、真菌に結合能を有するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを取得することができる。以上のよ
うな製造法に従って作製した抗真菌マウスモノクローナ
ル抗体(ＩgＧ1,κ鎖)産生ハイブリドーマの例として、
後述の実施例２に示したマウスハイブリドーマＣＡ３−
２−１２が挙げられる。
【００１１】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
ＭoＡbを作製するにはいくつかの方法がある。 １つは化
学的な方法で、この場合抗真菌特異ＭoＡbと抗真菌剤に
対するＭoＡbを共有結合させる。また別法として、抗真
菌特異ＭoＡbおよび抗真菌剤に対するＭoＡbをそれぞれ
産生する２種のハイブリドーマを細胞融合し、ハイブリ
ッド・ハイブリドーマ(例、テトラオーマなど)を作製し
目的の二重特異性抗体を作製する方法がある。一定した
高い品質の抗体を大量に収率良く得る手段としては後者
のハイブリッド・ハイブリドーマ法が好ましく用いられ
る。２種のＭoＡbを化学的に結合させるために、抗体分
子中に存在している置換基、例えばアミノ基、カルボキ
シル基、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基などを
利用することができる。例えば、(1)一方の抗体の反応
性アミノ基と他方の反応性カルボキシル基とを水溶性カ
ルボジイミド試薬〔例、１−エチル−３−(３−ジメチ
ルアミノプロピル)−カルボジイミド,１−シクロヘキシ
ル−３−(２− モルホリノエチル)−カルボジイミド−p
−トルエンスルホネートなど〕を用いて水性溶媒中で脱
水縮合させる、(2)一方の抗体の反応性アミノ基をＮ−
ヒドロキ シスクシミドの活性エステル〔例、p−マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１− カルボキシル−Ｎ−
ヒドロキシスクシミドエステル,Ｎ−(ε−マレイミドカ
プロイロキシ)スクシミドエステルなど〕と反応させマ
レイミド化したのち、ｉ)他方の抗体をジチオスレイト
ール(以下、ＤＴＴと略記することがある)で還元した抗
体、あるいはii)他方の抗体にＮ−スクシミジル−３−
(２−ピリジルジチオ)プ ロピオネート(以下、ＳＰＤＰ
と略記することがある)でスルフヒドリル基を導入した
抗体、あるいはiii)他方の抗体をペプシン処理後還元し
て得られるＦab′画分のスルフヒドリル基とチオエーテ
ル結合させる、 (3)２種の抗体双方の反応性 アミノ基を
スクシンジアルデヒドやグルタルアルデヒドなどのジア
ルデヒド試薬を用いて結合させる、(4)２種の抗体をＤ
ＴＴで還元あるいはＳＰＤＰでスルフ ヒドリル基を導
入し、再酸化によりヘテロダイマーを作製する、(5)２
種の抗体 をいずれもペプシン処理後還元し、Ｆab′とし
たのち再酸化しＦab′ヘテロダイ マーを作製する、な
どの方法がある。またこれらの方法を種々組み合わせ
て、 ２種の抗体活性をできるだけ損なわずに効率良く目
的のヘテロダイメリックな二重特異性抗体を作製する報
告があり〔 M. J. Glennie ら：ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー( J. Immunol. ),１３９,２３６７(１９８
７)；北川常広：有機合成 化学,４２,２８３(１９８
４)〕、 本発明の二重特異性ハイブリッドＭoＡbの作製
に利用できる。以上のような結合反応終了後、二重特異
性抗体結合物はセファデックスＧ１００もしくはＧ２０
０,セファロース６Ｂもしくは４Ｂ、ウルトロゲル Ａc
Ａ４４もしくは３４,セファクリルＳ２００などのゲル
濾過クロマトグラフィーにより精製または分取できる。
あるいは抗原結合カラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーを組み合わせることにより選択的な分取も
可能である。
ＭoＡbを作製するにはいくつかの方法がある。 １つは化
学的な方法で、この場合抗真菌特異ＭoＡbと抗真菌剤に
対するＭoＡbを共有結合させる。また別法として、抗真
菌特異ＭoＡbおよび抗真菌剤に対するＭoＡbをそれぞれ
産生する２種のハイブリドーマを細胞融合し、ハイブリ
ッド・ハイブリドーマ(例、テトラオーマなど)を作製し
目的の二重特異性抗体を作製する方法がある。一定した
高い品質の抗体を大量に収率良く得る手段としては後者
のハイブリッド・ハイブリドーマ法が好ましく用いられ
る。２種のＭoＡbを化学的に結合させるために、抗体分
子中に存在している置換基、例えばアミノ基、カルボキ
シル基、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基などを
利用することができる。例えば、(1)一方の抗体の反応
性アミノ基と他方の反応性カルボキシル基とを水溶性カ
ルボジイミド試薬〔例、１−エチル−３−(３−ジメチ
ルアミノプロピル)−カルボジイミド,１−シクロヘキシ
ル−３−(２− モルホリノエチル)−カルボジイミド−p
−トルエンスルホネートなど〕を用いて水性溶媒中で脱
水縮合させる、(2)一方の抗体の反応性アミノ基をＮ−
ヒドロキ シスクシミドの活性エステル〔例、p−マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１− カルボキシル−Ｎ−
ヒドロキシスクシミドエステル,Ｎ−(ε−マレイミドカ
プロイロキシ)スクシミドエステルなど〕と反応させマ
レイミド化したのち、ｉ)他方の抗体をジチオスレイト
ール(以下、ＤＴＴと略記することがある)で還元した抗
体、あるいはii)他方の抗体にＮ−スクシミジル−３−
(２−ピリジルジチオ)プ ロピオネート(以下、ＳＰＤＰ
と略記することがある)でスルフヒドリル基を導入した
抗体、あるいはiii)他方の抗体をペプシン処理後還元し
て得られるＦab′画分のスルフヒドリル基とチオエーテ
ル結合させる、 (3)２種の抗体双方の反応性 アミノ基を
スクシンジアルデヒドやグルタルアルデヒドなどのジア
ルデヒド試薬を用いて結合させる、(4)２種の抗体をＤ
ＴＴで還元あるいはＳＰＤＰでスルフ ヒドリル基を導
入し、再酸化によりヘテロダイマーを作製する、(5)２
種の抗体 をいずれもペプシン処理後還元し、Ｆab′とし
たのち再酸化しＦab′ヘテロダイ マーを作製する、な
どの方法がある。またこれらの方法を種々組み合わせ
て、 ２種の抗体活性をできるだけ損なわずに効率良く目
的のヘテロダイメリックな二重特異性抗体を作製する報
告があり〔 M. J. Glennie ら：ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー( J. Immunol. ),１３９,２３６７(１９８
７)；北川常広：有機合成 化学,４２,２８３(１９８
４)〕、 本発明の二重特異性ハイブリッドＭoＡbの作製
に利用できる。以上のような結合反応終了後、二重特異
性抗体結合物はセファデックスＧ１００もしくはＧ２０
０,セファロース６Ｂもしくは４Ｂ、ウルトロゲル Ａc
Ａ４４もしくは３４,セファクリルＳ２００などのゲル
濾過クロマトグラフィーにより精製または分取できる。
あるいは抗原結合カラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィーを組み合わせることにより選択的な分取も
可能である。
【００１２】本発明の二重特異性を有するハイブリッド
モノクローナル抗体を産生するハイブリッドハイブリド
ーマの作製にはいくつかの手法があり〔 例、新本洋士
ら：蛋白質・核酸・酵素,３３,２１７(１９８８)な
ど〕、 いずれの方法を用いてもよいが例えば、 前記し
たＨＡＴ抵抗性の抗真菌剤に対するＭoＡbを産生するハ
イブリドーマを、５−ブロモデオキシウリジン(以下、
ＢrdＵと略記することがある)添加の培養液に段階的に
馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクローン化しＨＡ
Ｔ感受性とする。同様にＨＡＴ抵抗性の抗真菌特異Ｍo
Ａb産生ハイブリドーマを８−アザグアニン(以下、ＡＺ
Ｇと略記することがある)耐性とし、 ヒポキサンチン−
グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を
クローン化しＨＡＴ感受性とする。次いで常法に従い両
者を融合して得られるテトラオーマをＨＡＴ添加培地で
選別後、真菌および抗真菌剤の両者に結合能を有するハ
イブリッドＭoＡbを分泌するテトラオーマをクローン化
する、抗真菌特異ＭoＡb産生ハイブリドーマをフルオ
レセイン・イソチオシアネート(以下、ＦＩＴＣと略記
することがある)で標識し、もう一方の抗真菌剤に対す
るＭoＡbを産生するハイブリドーマをテトラメチル・ロ
ダミン・イソチオシアネート(以下、ＴＲＩＴＣと略記
することがある)で標識後、常法に従い両者を融合す
る。得られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティベ
イティッド・セルソーター(以下、ＦＡＣＳと略記する
ことがある)に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣ
の赤色の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別しクロ
ーン化するなどの方法が挙げられる。また両親株のマー
カーを全く逆にして使用し、テトラオーマを選別しクロ
ーン化することも可能である。これらの操作における細
胞融合に当ってはセンダイウイルス、ＰＥＧなどの融合
促進剤やあるいは電気刺激などの方法が用いられる。好
ましくはＰＥＧが用いられ、以下にその一例を挙げる
が、もちろんこの方法に限定されるものではない。すな
わち、分子量約１,０００〜９,０００、濃度約１０〜８
０％等のＰＥＧが用いられ、処理時間は約０.５〜３０
分であるが、好ましい条件の一例として、約３５〜５５
％のＰＥＧ６,０００を約４〜１０分間、３７℃で細胞
と接触させ、効率よく融合させることができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリッドハイブリド
ーマの作製にはいくつかの手法があり〔 例、新本洋士
ら：蛋白質・核酸・酵素,３３,２１７(１９８８)な
ど〕、 いずれの方法を用いてもよいが例えば、 前記し
たＨＡＴ抵抗性の抗真菌剤に対するＭoＡbを産生するハ
イブリドーマを、５−ブロモデオキシウリジン(以下、
ＢrdＵと略記することがある)添加の培養液に段階的に
馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクローン化しＨＡ
Ｔ感受性とする。同様にＨＡＴ抵抗性の抗真菌特異Ｍo
Ａb産生ハイブリドーマを８−アザグアニン(以下、ＡＺ
Ｇと略記することがある)耐性とし、 ヒポキサンチン−
グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を
クローン化しＨＡＴ感受性とする。次いで常法に従い両
者を融合して得られるテトラオーマをＨＡＴ添加培地で
選別後、真菌および抗真菌剤の両者に結合能を有するハ
イブリッドＭoＡbを分泌するテトラオーマをクローン化
する、抗真菌特異ＭoＡb産生ハイブリドーマをフルオ
レセイン・イソチオシアネート(以下、ＦＩＴＣと略記
することがある)で標識し、もう一方の抗真菌剤に対す
るＭoＡbを産生するハイブリドーマをテトラメチル・ロ
ダミン・イソチオシアネート(以下、ＴＲＩＴＣと略記
することがある)で標識後、常法に従い両者を融合す
る。得られた細胞懸濁液をフルオレセイン・アクティベ
イティッド・セルソーター(以下、ＦＡＣＳと略記する
ことがある)に供し、ＦＩＴＣの緑色およびＴＲＩＴＣ
の赤色の蛍光を同時に有するテトラオーマを選別しクロ
ーン化するなどの方法が挙げられる。また両親株のマー
カーを全く逆にして使用し、テトラオーマを選別しクロ
ーン化することも可能である。これらの操作における細
胞融合に当ってはセンダイウイルス、ＰＥＧなどの融合
促進剤やあるいは電気刺激などの方法が用いられる。好
ましくはＰＥＧが用いられ、以下にその一例を挙げる
が、もちろんこの方法に限定されるものではない。すな
わち、分子量約１,０００〜９,０００、濃度約１０〜８
０％等のＰＥＧが用いられ、処理時間は約０.５〜３０
分であるが、好ましい条件の一例として、約３５〜５５
％のＰＥＧ６,０００を約４〜１０分間、３７℃で細胞
と接触させ、効率よく融合させることができる。
【００１３】ポリドーマ(例、テトラオーマなど)の選択
は、上記のＨＡＴ添加培地などで実施できるが、このた
め８−ＡＺＧ、６−チオグアニン(６−ＴＧ)あるいは５
−ＢrdＵなどの薬剤馴化法により、それぞれの薬物耐性
株が取得される。また新しいマーカーの融合細胞への導
入により、種々の選択培地が用いられる。このような例
として、ネオマイシンやハイグロマイシンＢ添加培地な
どが挙げられる〔 B.Sugden ら：モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー( Mol. Cell. Biol. ),５,４
１０(１９８５)〕。さらに前記したように、異った蛍光
色素で標識したハイブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二
重標識されたハイブリッド・ハイブリドーマをソーティ
ングする方法もある〔 L. Karawajew ら：ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol. Methods
),９６,２６５(１９８７)〕。ハイブリッドＭoＡb産生
ポリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
る。例えば、1)前述した抗真菌特異モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマと抗真菌剤に対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングのため
のＥＩＡの併用、2)真菌あるいは真菌由来の糖蛋白また
は多糖類を結合したマイクロプレートに被検培養上清を
添加し、次にＨＲＰ標識した抗真菌剤−ＨＳＡ複合体を
加えて二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル
抗体検出のためのＥＩＡ、あるいは抗真菌特異マウスモ
ノクローナル抗体と異なるサブクラスに属する抗真菌剤
に対するマウスモノクローナル抗体を用いる場合は、3)
真菌あるいは真菌由来の糖蛋白または多糖類結合マイク
ロプレートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識し
た該抗マウスＩgＧサブクラス特異抗体を加えて二重特
異性モノクローナル抗体を検出するＥＩＡ、およびこれ
らの変法などを適宜組み合せて用いることができる。
は、上記のＨＡＴ添加培地などで実施できるが、このた
め８−ＡＺＧ、６−チオグアニン(６−ＴＧ)あるいは５
−ＢrdＵなどの薬剤馴化法により、それぞれの薬物耐性
株が取得される。また新しいマーカーの融合細胞への導
入により、種々の選択培地が用いられる。このような例
として、ネオマイシンやハイグロマイシンＢ添加培地な
どが挙げられる〔 B.Sugden ら：モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー( Mol. Cell. Biol. ),５,４
１０(１９８５)〕。さらに前記したように、異った蛍光
色素で標識したハイブリドーマを融合し、ＦＡＣＳで二
重標識されたハイブリッド・ハイブリドーマをソーティ
ングする方法もある〔 L. Karawajew ら：ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol. Methods
),９６,２６５(１９８７)〕。ハイブリッドＭoＡb産生
ポリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
る。例えば、1)前述した抗真菌特異モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマと抗真菌剤に対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングのため
のＥＩＡの併用、2)真菌あるいは真菌由来の糖蛋白また
は多糖類を結合したマイクロプレートに被検培養上清を
添加し、次にＨＲＰ標識した抗真菌剤−ＨＳＡ複合体を
加えて二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル
抗体検出のためのＥＩＡ、あるいは抗真菌特異マウスモ
ノクローナル抗体と異なるサブクラスに属する抗真菌剤
に対するマウスモノクローナル抗体を用いる場合は、3)
真菌あるいは真菌由来の糖蛋白または多糖類結合マイク
ロプレートに被検培養上清を添加し、次にＨＲＰ標識し
た該抗マウスＩgＧサブクラス特異抗体を加えて二重特
異性モノクローナル抗体を検出するＥＩＡ、およびこれ
らの変法などを適宜組み合せて用いることができる。
【００１４】ハイブリッドＭoＡb活性陽性のポリドーマ
は直ちにクローニングに供されるが、これは通常限界希
釈法などで容易に実施される。クローン化されたポリド
ーマの培養上清については、上記の方法でその抗体価を
測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するポリドーマ
を選択することにより、目的とするモノクローナルなハ
イブリッドＭoＡb産生ポリドーマを取得することができ
る。上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培
地中、または動物の腹腔内(例えば、マウス等哺乳動物
の腹腔内)で公知の方法により実施できる。培養液およ
び腹水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を
組み合わせて用いることによりできる。例えば、細胞培
養液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り出し、塩析
(通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用
いる)を実施する。得られたタンパク沈殿物を適当な溶
液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィー(イオン
交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡカラム、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等)に付し、目的とする抗体
を分離精製することができる。以上のような分離精製操
作により、例えば１リットルの培養上清からタンパク重
量比で８０％以上の純度のハイブリッドＭoＡbを約１〜
５mg得ることができる。 また、 ２０mlの腹水液からは同
様の抗体が３〜１０mg得られる。以上のようにして得ら
れた二重特異性を有するハイブリッドＭoＡbは蛋白質と
して均一であり、公知免疫グロブリン製剤と同様哺乳動
物に安全に投与することができる。また、蛋白分解酵素
(ペプシンなど)処理などにより、真菌および抗真菌剤に
対する結合能を保持するＦ(ab′)2断片などを得ること
ができ、これらは本発明のハイブリッドＭoＡbと同様の
目的で用いることができる。以上のような製造法に従っ
て作製したハイブリッド抗体産生ポリドーマの例とし
て、後述の実施例３に示したテトラオーマＡＣＴ１−
１.１８が挙げられる。なお、本発明のハイブリッドＭo
Ａbを産生するポリドーマとして、抗真菌特異ＭoＡb産
生ハイブリドーマと抗真菌剤に対するＭoＡbを産生する
ハイブリドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方
のＭoＡbを産生するハイブリドーマと他方のＭoＡbを産
生する細胞とのトリオーマあるいはそれぞれのＭoＡbを
産生する細胞をエプスタイン・バー・ウイルスなどによ
り不滅化後、細胞融合して得られるハイブリドーマなど
であっても、本発明のハイブリッドＭoＡbを産生するも
のであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用いるこ
とができる。また、これらのポリドーマがマウスＩgＧ
ＭoＡbを産生する場合には、該二重特異性ハイブリッ
ドＭoＡbの抗原認識部位を含む可変領域あるいは超可変
領域をコードするＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技
術〔 Z. Steplewski ら：プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエスエー(
Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ),８５,４８５２(１９
８８)〕を用いてヒトＩgＧの定常領域，さらにはフレー
ム・ワーク領域をコードする遺伝子を結合させ、マウス
−ヒトキメラ抗体あるいはヒト型化抗体を作製すること
もできる。かかるキメラ抗体はヒトへの投与に際し、抗
原性が小さいため有利に用いられる。
は直ちにクローニングに供されるが、これは通常限界希
釈法などで容易に実施される。クローン化されたポリド
ーマの培養上清については、上記の方法でその抗体価を
測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するポリドーマ
を選択することにより、目的とするモノクローナルなハ
イブリッドＭoＡb産生ポリドーマを取得することができ
る。上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培
地中、または動物の腹腔内(例えば、マウス等哺乳動物
の腹腔内)で公知の方法により実施できる。培養液およ
び腹水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を
組み合わせて用いることによりできる。例えば、細胞培
養液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り出し、塩析
(通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用
いる)を実施する。得られたタンパク沈殿物を適当な溶
液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィー(イオン
交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡカラム、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等)に付し、目的とする抗体
を分離精製することができる。以上のような分離精製操
作により、例えば１リットルの培養上清からタンパク重
量比で８０％以上の純度のハイブリッドＭoＡbを約１〜
５mg得ることができる。 また、 ２０mlの腹水液からは同
様の抗体が３〜１０mg得られる。以上のようにして得ら
れた二重特異性を有するハイブリッドＭoＡbは蛋白質と
して均一であり、公知免疫グロブリン製剤と同様哺乳動
物に安全に投与することができる。また、蛋白分解酵素
(ペプシンなど)処理などにより、真菌および抗真菌剤に
対する結合能を保持するＦ(ab′)2断片などを得ること
ができ、これらは本発明のハイブリッドＭoＡbと同様の
目的で用いることができる。以上のような製造法に従っ
て作製したハイブリッド抗体産生ポリドーマの例とし
て、後述の実施例３に示したテトラオーマＡＣＴ１−
１.１８が挙げられる。なお、本発明のハイブリッドＭo
Ａbを産生するポリドーマとして、抗真菌特異ＭoＡb産
生ハイブリドーマと抗真菌剤に対するＭoＡbを産生する
ハイブリドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方
のＭoＡbを産生するハイブリドーマと他方のＭoＡbを産
生する細胞とのトリオーマあるいはそれぞれのＭoＡbを
産生する細胞をエプスタイン・バー・ウイルスなどによ
り不滅化後、細胞融合して得られるハイブリドーマなど
であっても、本発明のハイブリッドＭoＡbを産生するも
のであれば、上記テトラオーマと同様の目的で用いるこ
とができる。また、これらのポリドーマがマウスＩgＧ
ＭoＡbを産生する場合には、該二重特異性ハイブリッ
ドＭoＡbの抗原認識部位を含む可変領域あるいは超可変
領域をコードするＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技
術〔 Z. Steplewski ら：プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエスエー(
Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ),８５,４８５２(１９
８８)〕を用いてヒトＩgＧの定常領域，さらにはフレー
ム・ワーク領域をコードする遺伝子を結合させ、マウス
−ヒトキメラ抗体あるいはヒト型化抗体を作製すること
もできる。かかるキメラ抗体はヒトへの投与に際し、抗
原性が小さいため有利に用いられる。
【００１５】本発明の二重特異性ハイブリッドＭoＡbあ
るいは抗真菌剤と該二重特異性ハイブリッドＭoＡbとか
ら作製される選択的な抗真菌免疫複合体を用いる真菌症
治療法においては、幾つかの方法が用いられる。例え
ば、1）本発明のハイブリッドＭoＡbを予め真菌症患者
に投与し、 患者体内で増殖する真菌に結合させるべく十
分な時間経過後に、抗真菌剤、(例えばＡＰＢ)を投与す
る、 2)該ハイブリッドＭoＡbと抗真菌剤とを同時に真菌
症患者に投与する。あるいは、 3)予め該ハイブリッド
ＭoＡbと抗真菌剤とを反応させ未反応の抗真菌剤を分離
後、得られた選択的抗真菌免疫複合体を真菌症患者に投
与する、 などの方法が挙げられる。さらに、本発明の抗
真菌免疫複合体は２種以上(例えば、抗真菌抗ＡＰＢハ
イブリッドＭoＡb−ＡＰＢ免疫複合体と抗真菌抗フルサ
イトシンハイブリッドＭoＡb−フルサイトシン免疫複合
体)を組み合わせて用いてもよく、また１種または２種
以上の毒性の低い抗真菌剤(例、フルサイトシンなど)と
本発明の抗真菌免疫複合体とを併用してもよい。本発明
のハイブリッドＭoＡbを含む抗真菌免疫複合体は、必要
により公知の方法例えばメンブレンフィルター等による
ろ過除菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の薬理学的
に許容され得る担体,賦形剤,希釈剤などと混合し、注射
剤などとして製剤化して、哺乳動物(例、マウス,ラッ
ト,ネコ,ウサギ,イヌ,ブタ,ウマ,ウシ,サル,ヒトなど)
に投与し、例えばカンジダ症,クリプトコッカス症,アス
ペルギルス症あるいはムーコル症(好ましくは、カンジ
ダ症)などの治療に用いることができる。
るいは抗真菌剤と該二重特異性ハイブリッドＭoＡbとか
ら作製される選択的な抗真菌免疫複合体を用いる真菌症
治療法においては、幾つかの方法が用いられる。例え
ば、1）本発明のハイブリッドＭoＡbを予め真菌症患者
に投与し、 患者体内で増殖する真菌に結合させるべく十
分な時間経過後に、抗真菌剤、(例えばＡＰＢ)を投与す
る、 2)該ハイブリッドＭoＡbと抗真菌剤とを同時に真菌
症患者に投与する。あるいは、 3)予め該ハイブリッド
ＭoＡbと抗真菌剤とを反応させ未反応の抗真菌剤を分離
後、得られた選択的抗真菌免疫複合体を真菌症患者に投
与する、 などの方法が挙げられる。さらに、本発明の抗
真菌免疫複合体は２種以上(例えば、抗真菌抗ＡＰＢハ
イブリッドＭoＡb−ＡＰＢ免疫複合体と抗真菌抗フルサ
イトシンハイブリッドＭoＡb−フルサイトシン免疫複合
体)を組み合わせて用いてもよく、また１種または２種
以上の毒性の低い抗真菌剤(例、フルサイトシンなど)と
本発明の抗真菌免疫複合体とを併用してもよい。本発明
のハイブリッドＭoＡbを含む抗真菌免疫複合体は、必要
により公知の方法例えばメンブレンフィルター等による
ろ過除菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の薬理学的
に許容され得る担体,賦形剤,希釈剤などと混合し、注射
剤などとして製剤化して、哺乳動物(例、マウス,ラッ
ト,ネコ,ウサギ,イヌ,ブタ,ウマ,ウシ,サル,ヒトなど)
に投与し、例えばカンジダ症,クリプトコッカス症,アス
ペルギルス症あるいはムーコル症(好ましくは、カンジ
ダ症)などの治療に用いることができる。
【００１６】本発明の抗真菌免疫複合体の投与量は、対
象となる疾患,症状あるいは投与ルートなどによって異
なるが、例えばカンジダ症の成人患者に静脈投与する場
合、ハイブリッドＭoＡbとして１日当り約１〜１００mg
／kg,好ましくは約２〜３０mg／ kg、抗真菌剤として１
日当りＡＰＢでは約０.０２〜１.５mg／kg,好ましくは
約０.０４〜０.５mg／kgとなるように投与するのがよ
い。以上のようにして用いることにより本発明の抗真菌
免疫複合体は、標的真菌に対して特異的に結合可能で、
また抗真菌剤、特にＡＰＢのような強い毒性を有する化
合物の副作用を、それと反応するハイブリッド抗体との
免疫結合により中和し、効率的に真菌を溶解または除去
できる、きわめて優れた真菌特異性を持つ真菌治療薬を
提供する。このようにＡＰＢの持つ強力な抗真菌活性が
標的部位に特異的に発揮され、しかも標的部位到達以前
においては完全にその毒性が中和されていることは、従
来の化学療法剤と比べて際だった特性である。より少な
い投与量でより大きな治療効果を挙げることができるた
め従来は毒性が非常に強いため、十分な有効量を用い得
なかった抗真菌剤を、本発明のハイブリッドＭoＡbと併
用することにより、その毒性を大幅に軽減し、かつ該抗
真菌剤による選択的な真菌傷害が可能となる。
象となる疾患,症状あるいは投与ルートなどによって異
なるが、例えばカンジダ症の成人患者に静脈投与する場
合、ハイブリッドＭoＡbとして１日当り約１〜１００mg
／kg,好ましくは約２〜３０mg／ kg、抗真菌剤として１
日当りＡＰＢでは約０.０２〜１.５mg／kg,好ましくは
約０.０４〜０.５mg／kgとなるように投与するのがよ
い。以上のようにして用いることにより本発明の抗真菌
免疫複合体は、標的真菌に対して特異的に結合可能で、
また抗真菌剤、特にＡＰＢのような強い毒性を有する化
合物の副作用を、それと反応するハイブリッド抗体との
免疫結合により中和し、効率的に真菌を溶解または除去
できる、きわめて優れた真菌特異性を持つ真菌治療薬を
提供する。このようにＡＰＢの持つ強力な抗真菌活性が
標的部位に特異的に発揮され、しかも標的部位到達以前
においては完全にその毒性が中和されていることは、従
来の化学療法剤と比べて際だった特性である。より少な
い投与量でより大きな治療効果を挙げることができるた
め従来は毒性が非常に強いため、十分な有効量を用い得
なかった抗真菌剤を、本発明のハイブリッドＭoＡbと併
用することにより、その毒性を大幅に軽減し、かつ該抗
真菌剤による選択的な真菌傷害が可能となる。
【００１７】
【実施例】以下に参考例・実施例により本発明を具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことは言うまでもない。なお、参考例および実施例
で用いられている動物細胞は、以下の〔表１〕に示すよ
うに寄託が行なわれている。
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことは言うまでもない。なお、参考例および実施例
で用いられている動物細胞は、以下の〔表１〕に示すよ
うに寄託が行なわれている。
【表１】 ──────────────────────────── 動 物 細 胞 (ＩＦＯ) (ＦＲＩ) IFO No. FERM No. ──────────────────────────── マウスハイブリドーマ ＡＴＢ１−１１４ ５０２５３ ３０６９ マウスハイブリドーマ ＣＡ３−２−１２ ５０２５２ ３０７０ マウスハイブリッドハイブリドーマ ＡＣＴ１−１.１８ ５０３４３ １２３６５ ──────────────────────────── ＩＦＯ：財団法人発酵研究所(大阪) ＦＲＩ：通商産業省工業技術院 微生物工業技術研究所
【００１８】参考例１ 抗アムホテリシンＢ抗体測定用
ＥＩＡ (1)固相抗原の調製 Ｎ−(γ−マレイミドブチリルオキシサクシニミド)(以
下、ＧＭＢＳと略記することがある)でマレイミド化し
たＡＰＢを、予めＳＰＤＰとＤＴＴとで修飾還元したＨ
ＳＡに添加し、ＡＰＢ−ＨＳＡ複合体を作製した。ＨＳ
Ａ１モル当り７.６個のＡＰＢ分子が導入された。セフ
ァデックスＧ−２５カラムで未反応のＡＰＢおよび反応
試薬を除去し、次いでこの蛋白複合体５０μg/mlを９６
穴マイクロプレートに１００μl／ウエルの割合で添加
し固相抗原を調製した。 (2)アッセイ法 被検マウスハイブリドーマ培養上清１００μlを上記の
抗原感作プレートに添加し、室温で２時間反応させた。
０.０５％Tween ２０含有２０mＭリン酸食塩緩衝液(pＨ
７.３；以下,ＰＢＳ−Ｔwと略記号する)でプレートを十
分に洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩgＧ抗体を添
加し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、酵素基
質としてオルソーフェニレンジアミンおよびＨ2Ｏ2を含
有する０.１Ｍクエン酸緩衝液を各ウエルに加え、室温
で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸で反応停止後、マルチ
スキャン(フロー社製)を用いて波長４９２nmで発色色素
量を測定した。
ＥＩＡ (1)固相抗原の調製 Ｎ−(γ−マレイミドブチリルオキシサクシニミド)(以
下、ＧＭＢＳと略記することがある)でマレイミド化し
たＡＰＢを、予めＳＰＤＰとＤＴＴとで修飾還元したＨ
ＳＡに添加し、ＡＰＢ−ＨＳＡ複合体を作製した。ＨＳ
Ａ１モル当り７.６個のＡＰＢ分子が導入された。セフ
ァデックスＧ−２５カラムで未反応のＡＰＢおよび反応
試薬を除去し、次いでこの蛋白複合体５０μg/mlを９６
穴マイクロプレートに１００μl／ウエルの割合で添加
し固相抗原を調製した。 (2)アッセイ法 被検マウスハイブリドーマ培養上清１００μlを上記の
抗原感作プレートに添加し、室温で２時間反応させた。
０.０５％Tween ２０含有２０mＭリン酸食塩緩衝液(pＨ
７.３；以下,ＰＢＳ−Ｔwと略記号する)でプレートを十
分に洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩgＧ抗体を添
加し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、酵素基
質としてオルソーフェニレンジアミンおよびＨ2Ｏ2を含
有する０.１Ｍクエン酸緩衝液を各ウエルに加え、室温
で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸で反応停止後、マルチ
スキャン(フロー社製)を用いて波長４９２nmで発色色素
量を測定した。
【００１９】参考例２ 抗真菌抗体測定用ＥＩＡ (1)固相抗原の調製 ＣＡの菌体をオートクレーブ処理(１２０℃, ９０分)
後、上清液にフエーリング液を攪拌しながら添加した。
得られた沈渣に３Ｎ−塩酸を加えて溶解後、メタノール
−酢酸(８：１)混液に滴下した。遠心分離後、沈渣をメ
タノールで数回洗浄し、さらにエーテルを少量加えてメ
タノールを除去し室温で感作することにより、ＣＡ細胞
壁由来マンナン抗原を取得した。このマンナン抗原液１
００μg／mlを９６穴マイクロプレートに１００μl／ウ
エルの割合で添加し固相抗原を調製した。 (2)アッセイ法 参考例１−(2)に記載の方法に従い実施した。
後、上清液にフエーリング液を攪拌しながら添加した。
得られた沈渣に３Ｎ−塩酸を加えて溶解後、メタノール
−酢酸(８：１)混液に滴下した。遠心分離後、沈渣をメ
タノールで数回洗浄し、さらにエーテルを少量加えてメ
タノールを除去し室温で感作することにより、ＣＡ細胞
壁由来マンナン抗原を取得した。このマンナン抗原液１
００μg／mlを９６穴マイクロプレートに１００μl／ウ
エルの割合で添加し固相抗原を調製した。 (2)アッセイ法 参考例１−(2)に記載の方法に従い実施した。
【００２０】参考例３ 抗ＡＰＢ−抗真菌二重特異性抗
体測定用ＥＩＡ (1)標識抗原の調製 参考例１−(1)で作製したＡＰＢ−
ＨＳＡ複合体をビオチン活性化エステル(ベクター社製)
を用いてビオチン化し、ＥＩＡに供した。 (2)アッセイ法 参考例２−(1)で作製したマンナン抗原感作マ イクロプ
レートに二重特異性抗体含有検液１００μlを添加し、
室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔwでプレートを洗
浄後、(1)で作製したビオチン化ＡＰＢ−ＨＳＡ複合体
を添加し室温で１時間反応させた。さらにＰＢＳ−Ｔw
でプレートを十分に洗浄後、アビジン標識ＨＲＰを添加
し、室温で１時間反応させた。固相に結合した酵素活性
を参考例１−(2)に記載の方法で測定した。
体測定用ＥＩＡ (1)標識抗原の調製 参考例１−(1)で作製したＡＰＢ−
ＨＳＡ複合体をビオチン活性化エステル(ベクター社製)
を用いてビオチン化し、ＥＩＡに供した。 (2)アッセイ法 参考例２−(1)で作製したマンナン抗原感作マ イクロプ
レートに二重特異性抗体含有検液１００μlを添加し、
室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔwでプレートを洗
浄後、(1)で作製したビオチン化ＡＰＢ−ＨＳＡ複合体
を添加し室温で１時間反応させた。さらにＰＢＳ−Ｔw
でプレートを十分に洗浄後、アビジン標識ＨＲＰを添加
し、室温で１時間反応させた。固相に結合した酵素活性
を参考例１−(2)に記載の方法で測定した。
【００２１】参考例４ マンナン・カラムの作製 参考例２−(1)で調製したマンナン抗原を過ヨウ素酸ナ
トリウムで酸化・開裂し、生じたアルデヒド基をＥＡＨ
−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）のアミノ基と
反応・結合させた。次いでシアノ化ホウ素ナトリウムで
還元し、マンナン結合セファロースを作製した。
トリウムで酸化・開裂し、生じたアルデヒド基をＥＡＨ
−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）のアミノ基と
反応・結合させた。次いでシアノ化ホウ素ナトリウムで
還元し、マンナン結合セファロースを作製した。
【００２２】実施例１ マウス抗ＡＰＢ抗体産生ハイブ
リドーマの作製 (1)免疫原の調製 ＧＭＢＳでマレイミド化したＡＰＢ １.８mgを、予めＳ
ＰＤＰとＤＴＴとでスルフヒドリル化したＢＳＡ １０m
gに加え、 ５℃で一夜反応させた。セファデックスＧ−
２５カラムで精製後、ＡＰＢ結合量を紫外吸収法で測定
したところ、ＢＳＡ １モル当り６.８個のＡＰＢ分子が
導入された。 (2)免 疫 ＡＰＢ−ＢＳＡ複合体１mg／ml生理食塩水溶液に等量の
フロイント完全アジュバントを加え、マウス(０.１mg／
０.２ml／マウス)の背部および腹部皮下への免疫を開始
した。追加免疫は免疫原に等量のフロイント不完全アジ
ュバントを加えて、２−３週毎に４回接種し実施した。
４回の追加免疫１０日後に、参考例１に記載のＥＩＡで
最大の血清抗体価を示した個体について、同じＡＰＢ−
ＢＳＡ複合体(２００μg／０.１ml生理食塩水／マウス)
を静脈内投与した。 (3)細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した(約１０8個)。次いでマウス骨髄腫細胞
(Ｐ３Ｕ１)２×１０7個を添加し、ＰＥＧ６０００を用
いてケーラーとミルスタインの方法[ネーチャー(Natur
e),２５６,４９５(１９７５)]に準じて細胞融合に供し
た。融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン・アミノプ
テリンおよびチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に
懸濁し、１０日間培養した。以後は、親細胞の選択が終
了次第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培
地に代え培養を続けた。 (4)ハイブリドーマの選択およびクローニング 細胞増殖の見られたウエルについてハイブリドーマ培養
上清を採取し、参考例１に記載のＥＩＡで抗体価を測定
した。特に結合能の強い抗体を産生するハイブリドーマ
について限界希釈法によるクローニングを実施し、抗Ａ
ＰＢモノクローナル抗体産生マウスハイブリドーマＡＴ
Ｂ１−１１４を得た。本ハイブリドーマの産生する抗体
のサブクラスはＩgＧ1(κ鎖)であった。 (5)抗体の精製 予め０.５ml鉱油を腹腔内投与したハイブリッド・ヌー
ドマウス(Ｊcl：ＡＦ−nu)に１０7個／匹のマウスハイ
ブリドーマＡＴＢ１−１１４を腹腔内投与した。約１０
−２０日後に腹水の貯溜が見られたのでそれを採取し、
４５％飽和硫酸アンモニウムで塩析してＩgＧ画分を得
た。ＰＢＳ(pＨ７.５)で透析後、プロテインＡカラムに
供し、pＨ２.９のグリシン・塩酸緩衝液で溶出し精製抗
体を得た。腹水１０mlより約３４mgの抗ＡＰＢ特異マウ
スＭoＡb ＡＴＢ１−１１４を取得した。 (6)抗体の性状(1) 上記(4)で取得したマウスハイブリドーマＡＴＢ１−１
１４の培養上清を参考例１に記載のＥＩＡに供し、抗体
希釈曲線を作製した。得られた結果は図１に示した通り
であった。その結果、抗体ＡＴＢ１−１１４は３,００
０倍以上に希釈した低抗体濃度においてもＡＰＢに対す
る強い結合能を示した。 (7)抗体の性状(2) 上記(4)で取得したマウスハイブリドーマＡＴＢ１−１
１４の培養上清を遊離のＡＰＢ(２５μg／ml)と室温で
１時間反応させ、次いでその混液を参考例１に記載のＥ
ＩＡに供した。得られた結果は図１に示した通りであっ
た。その結果、遊離のＡＰＢによる競合的結合阻害が見
られ、上記の抗体ＡＴＢ１−１１４がＡＰＢに特異的で
あることが示された。
リドーマの作製 (1)免疫原の調製 ＧＭＢＳでマレイミド化したＡＰＢ １.８mgを、予めＳ
ＰＤＰとＤＴＴとでスルフヒドリル化したＢＳＡ １０m
gに加え、 ５℃で一夜反応させた。セファデックスＧ−
２５カラムで精製後、ＡＰＢ結合量を紫外吸収法で測定
したところ、ＢＳＡ １モル当り６.８個のＡＰＢ分子が
導入された。 (2)免 疫 ＡＰＢ−ＢＳＡ複合体１mg／ml生理食塩水溶液に等量の
フロイント完全アジュバントを加え、マウス(０.１mg／
０.２ml／マウス)の背部および腹部皮下への免疫を開始
した。追加免疫は免疫原に等量のフロイント不完全アジ
ュバントを加えて、２−３週毎に４回接種し実施した。
４回の追加免疫１０日後に、参考例１に記載のＥＩＡで
最大の血清抗体価を示した個体について、同じＡＰＢ−
ＢＳＡ複合体(２００μg／０.１ml生理食塩水／マウス)
を静脈内投与した。 (3)細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した(約１０8個)。次いでマウス骨髄腫細胞
(Ｐ３Ｕ１)２×１０7個を添加し、ＰＥＧ６０００を用
いてケーラーとミルスタインの方法[ネーチャー(Natur
e),２５６,４９５(１９７５)]に準じて細胞融合に供し
た。融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン・アミノプ
テリンおよびチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に
懸濁し、１０日間培養した。以後は、親細胞の選択が終
了次第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培
地に代え培養を続けた。 (4)ハイブリドーマの選択およびクローニング 細胞増殖の見られたウエルについてハイブリドーマ培養
上清を採取し、参考例１に記載のＥＩＡで抗体価を測定
した。特に結合能の強い抗体を産生するハイブリドーマ
について限界希釈法によるクローニングを実施し、抗Ａ
ＰＢモノクローナル抗体産生マウスハイブリドーマＡＴ
Ｂ１−１１４を得た。本ハイブリドーマの産生する抗体
のサブクラスはＩgＧ1(κ鎖)であった。 (5)抗体の精製 予め０.５ml鉱油を腹腔内投与したハイブリッド・ヌー
ドマウス(Ｊcl：ＡＦ−nu)に１０7個／匹のマウスハイ
ブリドーマＡＴＢ１−１１４を腹腔内投与した。約１０
−２０日後に腹水の貯溜が見られたのでそれを採取し、
４５％飽和硫酸アンモニウムで塩析してＩgＧ画分を得
た。ＰＢＳ(pＨ７.５)で透析後、プロテインＡカラムに
供し、pＨ２.９のグリシン・塩酸緩衝液で溶出し精製抗
体を得た。腹水１０mlより約３４mgの抗ＡＰＢ特異マウ
スＭoＡb ＡＴＢ１−１１４を取得した。 (6)抗体の性状(1) 上記(4)で取得したマウスハイブリドーマＡＴＢ１−１
１４の培養上清を参考例１に記載のＥＩＡに供し、抗体
希釈曲線を作製した。得られた結果は図１に示した通り
であった。その結果、抗体ＡＴＢ１−１１４は３,００
０倍以上に希釈した低抗体濃度においてもＡＰＢに対す
る強い結合能を示した。 (7)抗体の性状(2) 上記(4)で取得したマウスハイブリドーマＡＴＢ１−１
１４の培養上清を遊離のＡＰＢ(２５μg／ml)と室温で
１時間反応させ、次いでその混液を参考例１に記載のＥ
ＩＡに供した。得られた結果は図１に示した通りであっ
た。その結果、遊離のＡＰＢによる競合的結合阻害が見
られ、上記の抗体ＡＴＢ１−１１４がＡＰＢに特異的で
あることが示された。
【００２３】実施例２ 抗真菌抗体産生ハイブリドーマ
の作製 (1)免疫原の調製 免疫原として加熱死菌およびマンナン抗原の２種の抗原
を用いた。加熱死菌はＣＡの菌体を１００℃で２時間処
理後、生理食塩水で洗浄することにより作製した。マン
ナン抗原は参考例２−(1)に示した方法で作製した。 (2)免 疫 加熱死菌１０8個／mlＰＢＳ懸濁液に等量のフロイント
完全アジュバントを加えて、マウス(１０7個／０.２ml
／マウス)の背部および腹部皮下に免疫した。３週間後
に同量の加熱死菌をフロイント不完全アジュバントと共
に免疫した。次いで２週間隔で、等量のフロイント不完
全アジュバントに懸濁したマンナン抗原(１００μg／
０.２ml／マウス)を２−３回免疫した。１０日後に、参
考例２に示し たＥＩＡで最大の血清抗体価を示した個
体について、同じマンナン抗原液(１０ ０μg／０.１ml
／マウス)を静脈内投与した。 (3)細胞融合 実施例１−(3)に記載の方法に従い実施した。 (4)ハイブリドーマの選択およびクローニング 参考例２に記載のＥＩＡによりハイブリドーマ培養上清
の抗体価を測定し、抗体陽性ウエルを実施例１−(4)に
記載の方法に従いクローニングに供した。その結果、 マ
ンナン抗原およびＣＡ菌体に強い結合能を示す抗真菌抗
体産生マウスハイブリドーマＣＡ３−２−１２を得た。
本ハイブリドーマにより産生される抗体のサブクラスは
ＩgＧ1(κ鎖)であった。 (5)抗体の精製 実施例１−(5)に記載の方法に従い、ハイブリッド・ヌ
ードマウスを用いて腹水化した。さらにプロテインＡカ
ラムにより抗体ＩgＧ画分を得た。腹水１０mlより約２９
mgの抗真菌特異ＭoＡb ＣＡ３−２−１２を取得した。 (6)抗体の性状(1) 上記(4)で取得したマウスハイブリドーマＣＡ３−２−
１２の培養上清を、参考例２に記載のＥＩＡに供し抗体
希釈曲線を作製した。得られた結果は図２に示した通り
であった。その結果、マンナン抗原への強い結合能を有
することが示された。 (7)抗体の性状(2) 上記(6)に記載のハイブリドーマ培養上清に３×１０6−
５×１０7個／mlの加熱死菌を添加し室温で１時間反応
させた。遠心分離後、その上清を参考例２に記載のＥＩ
Ａに供した。得られた結果は図３に示した通りであっ
た。その結果、菌体による抗体の吸収が見られ、上記の
抗真菌抗体が菌体表面の細胞壁マンナン抗原に対するも
のであることが示された。 (8)抗体の性状(3) 上記(6)に記載のハイブリドーマ培養上清に１０7個／ml
のＣＡ菌体懸濁液を添加し、３７℃で９０分間反応させ
た。遠心分離操作により菌体を洗浄後、ＦＩＴＣ標識ウ
サギ抗マウスＩgＧ抗体を添加し４℃で６０分間反応さ
せた。再び菌体を洗浄後、ＰＢＳに懸濁しＦＡＣＳによ
り解析した。得られた結果は図４に示した通りであっ
た。その結果、新鮮培地および抗ＡＰＢ抗体産生マウス
ハイブリドーマＡＴＢ１−１１４培養上清ではＣＡ菌体
は全く蛍光染色されないが、抗真菌抗体産生マウスハイ
ブリドーマＣＡ３−２−１２培養上清では菌体表面が強
く蛍光染色され、菌体表面細胞壁に強く結合している抗
体が存在することが示された。
の作製 (1)免疫原の調製 免疫原として加熱死菌およびマンナン抗原の２種の抗原
を用いた。加熱死菌はＣＡの菌体を１００℃で２時間処
理後、生理食塩水で洗浄することにより作製した。マン
ナン抗原は参考例２−(1)に示した方法で作製した。 (2)免 疫 加熱死菌１０8個／mlＰＢＳ懸濁液に等量のフロイント
完全アジュバントを加えて、マウス(１０7個／０.２ml
／マウス)の背部および腹部皮下に免疫した。３週間後
に同量の加熱死菌をフロイント不完全アジュバントと共
に免疫した。次いで２週間隔で、等量のフロイント不完
全アジュバントに懸濁したマンナン抗原(１００μg／
０.２ml／マウス)を２−３回免疫した。１０日後に、参
考例２に示し たＥＩＡで最大の血清抗体価を示した個
体について、同じマンナン抗原液(１０ ０μg／０.１ml
／マウス)を静脈内投与した。 (3)細胞融合 実施例１−(3)に記載の方法に従い実施した。 (4)ハイブリドーマの選択およびクローニング 参考例２に記載のＥＩＡによりハイブリドーマ培養上清
の抗体価を測定し、抗体陽性ウエルを実施例１−(4)に
記載の方法に従いクローニングに供した。その結果、 マ
ンナン抗原およびＣＡ菌体に強い結合能を示す抗真菌抗
体産生マウスハイブリドーマＣＡ３−２−１２を得た。
本ハイブリドーマにより産生される抗体のサブクラスは
ＩgＧ1(κ鎖)であった。 (5)抗体の精製 実施例１−(5)に記載の方法に従い、ハイブリッド・ヌ
ードマウスを用いて腹水化した。さらにプロテインＡカ
ラムにより抗体ＩgＧ画分を得た。腹水１０mlより約２９
mgの抗真菌特異ＭoＡb ＣＡ３−２−１２を取得した。 (6)抗体の性状(1) 上記(4)で取得したマウスハイブリドーマＣＡ３−２−
１２の培養上清を、参考例２に記載のＥＩＡに供し抗体
希釈曲線を作製した。得られた結果は図２に示した通り
であった。その結果、マンナン抗原への強い結合能を有
することが示された。 (7)抗体の性状(2) 上記(6)に記載のハイブリドーマ培養上清に３×１０6−
５×１０7個／mlの加熱死菌を添加し室温で１時間反応
させた。遠心分離後、その上清を参考例２に記載のＥＩ
Ａに供した。得られた結果は図３に示した通りであっ
た。その結果、菌体による抗体の吸収が見られ、上記の
抗真菌抗体が菌体表面の細胞壁マンナン抗原に対するも
のであることが示された。 (8)抗体の性状(3) 上記(6)に記載のハイブリドーマ培養上清に１０7個／ml
のＣＡ菌体懸濁液を添加し、３７℃で９０分間反応させ
た。遠心分離操作により菌体を洗浄後、ＦＩＴＣ標識ウ
サギ抗マウスＩgＧ抗体を添加し４℃で６０分間反応さ
せた。再び菌体を洗浄後、ＰＢＳに懸濁しＦＡＣＳによ
り解析した。得られた結果は図４に示した通りであっ
た。その結果、新鮮培地および抗ＡＰＢ抗体産生マウス
ハイブリドーマＡＴＢ１−１１４培養上清ではＣＡ菌体
は全く蛍光染色されないが、抗真菌抗体産生マウスハイ
ブリドーマＣＡ３−２−１２培養上清では菌体表面が強
く蛍光染色され、菌体表面細胞壁に強く結合している抗
体が存在することが示された。
【００２４】実施例３ 抗ＡＰＢ−抗真菌二重特異性を
有するハイブリッド・モノクローナル抗体の製造（１） （１）細胞融合 実施例２で取得した抗真菌抗体産生マウスハイブリドー
マＣＡ３−２−１２および実施例１で取得した抗ＡＰＢ
抗体産生マウスハイブリドーマＡＴＢ１−１１４を、そ
れぞれ０.５μg／mlＦＩＴＣおよび１.５μg／mlＴＲＩ
ＴＣ含有イスコフ−ハムＦ１２混合培地で３７℃,３０
分間インキュベートし、蛍光染色する。次いで、ＬＳＭ
溶液（和光純薬工業Ｋ.Ｋ.販売）を添加し死細胞を除去
したのち、両ハイブリドーマを１：１の割合で混ぜ、Ｐ
ＥＧ６０００を用いて細胞融合する。３７℃で２時間イ
ンキュベート後、ＦＡＣＳに供することによりフルオレ
セインおよびローダミンで二重染色された細胞２５,０
００個を分取し、次にフィーダーとしてマウス胸腺細胞
を５×１０5個／ウエル播種した９６穴マイクロプレー
トに、上記の二重染色細胞を１０個／ウエルの割合で播
種し培養する。 (2)ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクロー
ニング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を参考例１および２に記載のＥＩＡ,さらに参考例３に
記載の二重特異性抗体測定用ＥＩＡに供して抗体活性を
測定する。高いハイブリッド抗体活性を示したウエルに
ついて限界希釈法によるクローニングを実施し、目的の
二重特異性抗体産生テトラオーマを取得する。このよう
にして得られた二重特異性抗体産生マウスハイブリッド
ハイブリドーマＡＣＴ１−１.１８により産生される二
重特異性抗体のサブクラスは、ＩgＧ1（κ鎖）であっ
た。 （３）ハイブリッド抗体の精製(１) 予め０.５ml鉱油を腹腔内投与したハイブリッド・ヌー
ドマウスに１０7個／マウスのテトラオーマを腹腔内接
種する。約１７−２３日後に腹水の貯溜がみられるので
それを採取し、４５−５０％飽和硫酸アンモニウムで塩
析してＩgＧ画分を得る。ＰＢＳ(pＨ７.５)で透析後、
ＳＰＢ−ＨＳＡ結合セルロファインカラムに供し、ｐＨ
２.９の０.２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出する。酸溶
出画分をＰＢＳで透析後、さらにヒドロキシ・アパタイ
トカラムを用いる高速液体クロマトグラフィーにより本
発明の抗ＡＰＢ−抗真菌二重特異性を有するハイブリッ
ド抗体を取得する。 (4)ハイブリッド抗体の精製(２) (3)と同様の方法により得られたＩgＧ画分をＰＢＳ(pＨ
７.５)で透析後、参考例４で作製したマンナン結合セフ
ァロースカラムに供しＰＢＳで十分に洗浄後、ＭＡＰＳ
−II溶出緩衝液（バイオラッド社製）で溶出した。溶出
画分をＰＢＳで透析後、さらにＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
〔７.５×７５mm；トーソー(株)〕を用いる高速液体ク
ロマトグラフィーにより本発明の抗ＡＰＢ−抗真菌二重
特異性抗体ＡＣＴ１−１.１８を取得した。得られた結
果は〔図６〕に示した通りであった。参考例３に示した
方法で二重特異性抗体活性を示す単一のピークが得られ
た（図６−（Ｃ）参照）。腹水２０mlより約１２mgのハ
イブリッド抗体を取得した。 (5)ハイブリッド抗体の性状(1) 上記(4)に記載の精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１
８に、１０7個／mlのホルマリン処理病原性酵母菌体懸
濁液を添加し、３７℃で１時間反応させた。遠心分離操
作により菌体を洗浄後、実施例２−(8)の要領でハイブ
リッド抗体の反応性をＦＡＣＳを用いて解析した。得ら
れた結果は図７〜１４に示した通りであった。その結
果、ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８は２種の Cand
ida albicans ＴＡおよびＣaＮにはいずれも強く反応
するが、他の Candida５種には反応しなかった。また、
Cryptococcus neoformans に対してはわずかに反応性
を示した。 (6)ハイブリッド抗体の性状(2) ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８のＡＰＢに対する
毒性中和能を測定するため、ＡＰＢ溶血反応を利用した
〔吉岡史郎ら：真菌誌，２９，１２７（１９８８）〕。
すなわち、各種濃度のＡＰＢに洗浄ヒト赤血球３×１０
6個を添加し３７℃で１０分間インキュベートした。遠
心分離後、上清液のヘモグロビン濃度を５４０nmで測定
した。得られた結果は図１５に示した通りであった。Ａ
ＰＢは２０ug／ml以上の濃度で強い溶血活性を示した。
次にＡＰＢ６０ug／mlに種々の濃度の精製ハイブリッド
抗体ＡＣＴ１−１.１８を添加し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次いで洗浄ヒト赤血球３×１０6個
を添加し、上記と同じ要領で溶血反応を実施し、上清に
遊離したヘモグロビン濃度を測定した。結果は図１６に
示した通りであった。抗体１−２mg／mlで６０ug／mlの
ＡＰＢを完全に中和した。この結果から、本発明のハイ
ブリッド抗体が強い毒性中和能を有することが分かっ
た。 (7)ハイブリッド抗体の性状(3) ＣＤＦ1マウス（♀：１８−２２ｇ）に Candida albic
ans ＴＡ ８×ＬＤ50単位（ＬＤ50：５０％致死量）の
０.２ml生理食塩水懸濁液を静脈注射した。感染２日後
にＡＰＢ（４０ug／ml）もしくはＡＰＢ／二重特異性抗
体免疫複合体（モル比１：１、ＡＰＢとして４０ug／m
l）の生理食塩水溶液０.５mlを腹腔内投与し、生存率を
３０日まで経過観察した。１群５匹のマウスを用いて得
られた結果は図１７に示した通りであった。ＡＰＢ単剤
投与群においても薬剤非投与群よりも生存日数の延長が
見られたが、免疫複合体投与群ではさらにその改善が観
察された。
有するハイブリッド・モノクローナル抗体の製造（１） （１）細胞融合 実施例２で取得した抗真菌抗体産生マウスハイブリドー
マＣＡ３−２−１２および実施例１で取得した抗ＡＰＢ
抗体産生マウスハイブリドーマＡＴＢ１−１１４を、そ
れぞれ０.５μg／mlＦＩＴＣおよび１.５μg／mlＴＲＩ
ＴＣ含有イスコフ−ハムＦ１２混合培地で３７℃,３０
分間インキュベートし、蛍光染色する。次いで、ＬＳＭ
溶液（和光純薬工業Ｋ.Ｋ.販売）を添加し死細胞を除去
したのち、両ハイブリドーマを１：１の割合で混ぜ、Ｐ
ＥＧ６０００を用いて細胞融合する。３７℃で２時間イ
ンキュベート後、ＦＡＣＳに供することによりフルオレ
セインおよびローダミンで二重染色された細胞２５,０
００個を分取し、次にフィーダーとしてマウス胸腺細胞
を５×１０5個／ウエル播種した９６穴マイクロプレー
トに、上記の二重染色細胞を１０個／ウエルの割合で播
種し培養する。 (2)ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクロー
ニング 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を参考例１および２に記載のＥＩＡ,さらに参考例３に
記載の二重特異性抗体測定用ＥＩＡに供して抗体活性を
測定する。高いハイブリッド抗体活性を示したウエルに
ついて限界希釈法によるクローニングを実施し、目的の
二重特異性抗体産生テトラオーマを取得する。このよう
にして得られた二重特異性抗体産生マウスハイブリッド
ハイブリドーマＡＣＴ１−１.１８により産生される二
重特異性抗体のサブクラスは、ＩgＧ1（κ鎖）であっ
た。 （３）ハイブリッド抗体の精製(１) 予め０.５ml鉱油を腹腔内投与したハイブリッド・ヌー
ドマウスに１０7個／マウスのテトラオーマを腹腔内接
種する。約１７−２３日後に腹水の貯溜がみられるので
それを採取し、４５−５０％飽和硫酸アンモニウムで塩
析してＩgＧ画分を得る。ＰＢＳ(pＨ７.５)で透析後、
ＳＰＢ−ＨＳＡ結合セルロファインカラムに供し、ｐＨ
２.９の０.２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出する。酸溶
出画分をＰＢＳで透析後、さらにヒドロキシ・アパタイ
トカラムを用いる高速液体クロマトグラフィーにより本
発明の抗ＡＰＢ−抗真菌二重特異性を有するハイブリッ
ド抗体を取得する。 (4)ハイブリッド抗体の精製(２) (3)と同様の方法により得られたＩgＧ画分をＰＢＳ(pＨ
７.５)で透析後、参考例４で作製したマンナン結合セフ
ァロースカラムに供しＰＢＳで十分に洗浄後、ＭＡＰＳ
−II溶出緩衝液（バイオラッド社製）で溶出した。溶出
画分をＰＢＳで透析後、さらにＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
〔７.５×７５mm；トーソー(株)〕を用いる高速液体ク
ロマトグラフィーにより本発明の抗ＡＰＢ−抗真菌二重
特異性抗体ＡＣＴ１−１.１８を取得した。得られた結
果は〔図６〕に示した通りであった。参考例３に示した
方法で二重特異性抗体活性を示す単一のピークが得られ
た（図６−（Ｃ）参照）。腹水２０mlより約１２mgのハ
イブリッド抗体を取得した。 (5)ハイブリッド抗体の性状(1) 上記(4)に記載の精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１
８に、１０7個／mlのホルマリン処理病原性酵母菌体懸
濁液を添加し、３７℃で１時間反応させた。遠心分離操
作により菌体を洗浄後、実施例２−(8)の要領でハイブ
リッド抗体の反応性をＦＡＣＳを用いて解析した。得ら
れた結果は図７〜１４に示した通りであった。その結
果、ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８は２種の Cand
ida albicans ＴＡおよびＣaＮにはいずれも強く反応
するが、他の Candida５種には反応しなかった。また、
Cryptococcus neoformans に対してはわずかに反応性
を示した。 (6)ハイブリッド抗体の性状(2) ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８のＡＰＢに対する
毒性中和能を測定するため、ＡＰＢ溶血反応を利用した
〔吉岡史郎ら：真菌誌，２９，１２７（１９８８）〕。
すなわち、各種濃度のＡＰＢに洗浄ヒト赤血球３×１０
6個を添加し３７℃で１０分間インキュベートした。遠
心分離後、上清液のヘモグロビン濃度を５４０nmで測定
した。得られた結果は図１５に示した通りであった。Ａ
ＰＢは２０ug／ml以上の濃度で強い溶血活性を示した。
次にＡＰＢ６０ug／mlに種々の濃度の精製ハイブリッド
抗体ＡＣＴ１−１.１８を添加し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次いで洗浄ヒト赤血球３×１０6個
を添加し、上記と同じ要領で溶血反応を実施し、上清に
遊離したヘモグロビン濃度を測定した。結果は図１６に
示した通りであった。抗体１−２mg／mlで６０ug／mlの
ＡＰＢを完全に中和した。この結果から、本発明のハイ
ブリッド抗体が強い毒性中和能を有することが分かっ
た。 (7)ハイブリッド抗体の性状(3) ＣＤＦ1マウス（♀：１８−２２ｇ）に Candida albic
ans ＴＡ ８×ＬＤ50単位（ＬＤ50：５０％致死量）の
０.２ml生理食塩水懸濁液を静脈注射した。感染２日後
にＡＰＢ（４０ug／ml）もしくはＡＰＢ／二重特異性抗
体免疫複合体（モル比１：１、ＡＰＢとして４０ug／m
l）の生理食塩水溶液０.５mlを腹腔内投与し、生存率を
３０日まで経過観察した。１群５匹のマウスを用いて得
られた結果は図１７に示した通りであった。ＡＰＢ単剤
投与群においても薬剤非投与群よりも生存日数の延長が
見られたが、免疫複合体投与群ではさらにその改善が観
察された。
【００２５】実施例４ 抗ＡＰＢ−抗真菌二重特異性を
有するハイブリッド・モノクローナル抗体の製造(2) (1)抗ＡＰＢ抗体のマレイミド化 実施例１で取得した抗ＡＰＢ抗体ＡＴＢ１−１１４ １
０mgを５mＭ酢酸緩衝液(pＨ５.０)２mlに溶解後、２倍
モルのＮ−(ε−マレイミドカプロイロキシ)スクシミド
エステルのジメチルホルムアミド溶液５０μlを添加し
３０℃で２０分間反応させた。反応混液を０．１Ｍリン
酸緩衝液 (pＨ６.５)で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラムに供し結合試薬を除去した。 (2)抗真菌抗体のスルフヒドリル化 実施例２で取得した抗真菌抗体ＣＡ３−２−１２ １０
mgを２mlの０.０５ＭＰＢＳ(pＨ７.３)に溶解後、２倍
モルのＳＰＤＰメタノール溶液５０μlを添加した。３
０℃で３０分間反応後、０.１Ｍ ＤＴＴ水溶液５０μl
を添加し還元後、 (1)に記載のセファデックスＧ−２５
カラムに供して過剰の試薬を除去した。 (3)二重特異性抗体の作製 (1)で得たマレイミド化抗ＡＰＢ抗体８mgに、(2)で作製
したスルフヒドリル化抗真菌８mgを氷冷下攪拌しながら
ゆっくりと添加し、 一夜反応させた。 反応混液をセファ
クリルＳ−２００カラムに供し、未反応の抗体を化学結
合二重特異性抗体から分離除去した結果、約７mgの抗Ａ
ＰＢ−抗真菌二重特異性ハイブリッド抗体を取得した。 (4)二重特異性抗体の結合能 (3)で作製した二重特異性抗体を参考例３に記載のＥＩ
Ａに供し抗体希釈曲線を作製した。結果は図５に示した
通りであった。その結果、固相のマンナン抗原および液
相のＡＰＢ抗原の両者に強い結合能を示した。
有するハイブリッド・モノクローナル抗体の製造(2) (1)抗ＡＰＢ抗体のマレイミド化 実施例１で取得した抗ＡＰＢ抗体ＡＴＢ１−１１４ １
０mgを５mＭ酢酸緩衝液(pＨ５.０)２mlに溶解後、２倍
モルのＮ−(ε−マレイミドカプロイロキシ)スクシミド
エステルのジメチルホルムアミド溶液５０μlを添加し
３０℃で２０分間反応させた。反応混液を０．１Ｍリン
酸緩衝液 (pＨ６.５)で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラムに供し結合試薬を除去した。 (2)抗真菌抗体のスルフヒドリル化 実施例２で取得した抗真菌抗体ＣＡ３−２−１２ １０
mgを２mlの０.０５ＭＰＢＳ(pＨ７.３)に溶解後、２倍
モルのＳＰＤＰメタノール溶液５０μlを添加した。３
０℃で３０分間反応後、０.１Ｍ ＤＴＴ水溶液５０μl
を添加し還元後、 (1)に記載のセファデックスＧ−２５
カラムに供して過剰の試薬を除去した。 (3)二重特異性抗体の作製 (1)で得たマレイミド化抗ＡＰＢ抗体８mgに、(2)で作製
したスルフヒドリル化抗真菌８mgを氷冷下攪拌しながら
ゆっくりと添加し、 一夜反応させた。 反応混液をセファ
クリルＳ−２００カラムに供し、未反応の抗体を化学結
合二重特異性抗体から分離除去した結果、約７mgの抗Ａ
ＰＢ−抗真菌二重特異性ハイブリッド抗体を取得した。 (4)二重特異性抗体の結合能 (3)で作製した二重特異性抗体を参考例３に記載のＥＩ
Ａに供し抗体希釈曲線を作製した。結果は図５に示した
通りであった。その結果、固相のマンナン抗原および液
相のＡＰＢ抗原の両者に強い結合能を示した。
【００２６】
【図１】は実施例１で作製した抗ＡＰＢ抗体産生マウス
ハイブリドーマＡＴＢ１−１１４の培養上清を参考例１
に記載のＥＩＡに供して得た抗体希釈曲線(○)及び該培
養上清を予め遊離のＡＰＢ(２５μg／ml)と反応させた
のち、ＥＩＡに供して得た結果(●)を示す。
ハイブリドーマＡＴＢ１−１１４の培養上清を参考例１
に記載のＥＩＡに供して得た抗体希釈曲線(○)及び該培
養上清を予め遊離のＡＰＢ(２５μg／ml)と反応させた
のち、ＥＩＡに供して得た結果(●)を示す。
【図２】は実施例２で作製した抗真菌抗体産生マウスハ
イブリドーマＣＡ３−２−１２の培養上清を参考例２に
記載のＥＩＡに供して得た抗体希釈曲線を示す。
イブリドーマＣＡ３−２−１２の培養上清を参考例２に
記載のＥＩＡに供して得た抗体希釈曲線を示す。
【図３】は実施例２で作製した抗真菌抗体産生マウスハ
イブリドーマＣＡ３−２−１２の培養上清５０倍希釈液
にＣＡ菌体の加熱死菌を添加して室温で１時間反応後、
その上清を参考例２に記載のＥＩＡに供して得た結果を
示す。
イブリドーマＣＡ３−２−１２の培養上清５０倍希釈液
にＣＡ菌体の加熱死菌を添加して室温で１時間反応後、
その上清を参考例２に記載のＥＩＡに供して得た結果を
示す。
【図４】新鮮培地、実施例１で作製した抗ＡＰＢ抗体産
生マウスハイブリドーマＡＴＢ１−１１４の培養上清ま
たは実施例２で作製した抗真菌抗体産生マウスハイブリ
ドーマＣＡ３−２−１２の培養上清に１０7個／mlのＣ
Ａ菌体の加熱死菌を添加して３７℃で９０分反応後、さ
らにＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解
析した結果を示す。
生マウスハイブリドーマＡＴＢ１−１１４の培養上清ま
たは実施例２で作製した抗真菌抗体産生マウスハイブリ
ドーマＣＡ３−２−１２の培養上清に１０7個／mlのＣ
Ａ菌体の加熱死菌を添加して３７℃で９０分反応後、さ
らにＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解
析した結果を示す。
【図５】実施例４で作製した二重特異性抗体を参考例３
に記載のＥＩＡに供して得た抗体希釈曲線を示す。
に記載のＥＩＡに供して得た抗体希釈曲線を示す。
【図６】実施例３−(4)記載の抗ＡＰＢ−抗真菌二重特
異性抗体ＡＣＴ１−１.１８の精製結果を表す。すなわ
ち、ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８を含有する腹
水液の塩析処理によりＩgＧ画分を取得し、さらにマン
ナン結合カラムで精製したのちＤＥＡＥ−カラムに供し
た結果を表す〔実施例３−(4)参照〕。
異性抗体ＡＣＴ１−１.１８の精製結果を表す。すなわ
ち、ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８を含有する腹
水液の塩析処理によりＩgＧ画分を取得し、さらにマン
ナン結合カラムで精製したのちＤＥＡＥ−カラムに供し
た結果を表す〔実施例３−(4)参照〕。
【図７】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に Ca
ndida albicans ＴＡホルマリン処理死菌を添加した反
応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより
解析した結果を示す。
ndida albicans ＴＡホルマリン処理死菌を添加した反
応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより
解析した結果を示す。
【図８】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に Ca
ndida toropicalisホルマリン処理死菌を添加した反応
後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解
析した結果を示す。
ndida toropicalisホルマリン処理死菌を添加した反応
後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解
析した結果を示す。
【図９】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に Ca
ndida krusei ホルマリン処理死菌を添加した反応後、
ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解析し
た結果を示す。
ndida krusei ホルマリン処理死菌を添加した反応後、
ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解析し
た結果を示す。
【図１０】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に
Candida glabratr ホルマリン処理死菌を添加した反応
後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解
析した結果を示す。
Candida glabratr ホルマリン処理死菌を添加した反応
後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより解
析した結果を示す。
【図１１】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に
Candida albicans ＣaＮホルマリン処理死菌を添加し
た反応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳに
より解析した結果を示す。
Candida albicans ＣaＮホルマリン処理死菌を添加し
た反応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳに
より解析した結果を示す。
【図１２】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に
Candida parapsilosisホルマリン処理死菌を添加した反
応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより
解析した結果を示す。
Candida parapsilosisホルマリン処理死菌を添加した反
応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳにより
解析した結果を示す。
【図１３】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に
Candida guillermondii ホルマリン処理死菌を添加し
た反応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳに
より解析した結果を示す。
Candida guillermondii ホルマリン処理死菌を添加し
た反応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳに
より解析した結果を示す。
【図１４】精製ハイブリッド抗体ＡＣＴ１−１.１８に
Cryptococcus neoformans ホルマリン処理死菌を添加
した反応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳ
により解析した結果を示す。
Cryptococcus neoformans ホルマリン処理死菌を添加
した反応後、ＦＩＴＣ標識第２抗体を結合させＦＡＣＳ
により解析した結果を示す。
【図１５】ＡＰＢのヒト赤血球に対する溶血活性を示す
〔実施例３−(6)〕。
〔実施例３−(6)〕。
【図１６】実施例３−(4)に記載の精製ハイブリッド抗
体ＡＣＴ１−１.１８のＡＰＢ溶血活性に対する中和能
を示す〔実施例３−(7)参照〕。
体ＡＣＴ１−１.１８のＡＰＢ溶血活性に対する中和能
を示す〔実施例３−(7)参照〕。
【図１７】実施例３−(4)に記載の精製ハイブリッド抗
体ＡＣＴ１−１.１８のＡＰＢ抗真菌活性に対する増強
能を示す。すなわち、ＡＰＢ／ＡＣＴ１−１.１８免疫
複合体投与群（●）を、薬剤非投与群（コントロール）
（○）およびＡＰＢ単剤投与群（□）と生存率において
比較した〔実施例３−(7)〕。
体ＡＣＴ１−１.１８のＡＰＢ抗真菌活性に対する増強
能を示す。すなわち、ＡＰＢ／ＡＣＴ１−１.１８免疫
複合体投与群（●）を、薬剤非投与群（コントロール）
（○）およびＡＰＢ単剤投与群（□）と生存率において
比較した〔実施例３−(7)〕。
【００２７】
（ａ）は新鮮培地の解析結果を示す。 （ｂ）実施例１で作製した抗ＡＰＢ抗体産生マウスハイ
ブリドーマＡＴＢ１−１１４の培養上清の解析結果を示
す。 （ｃ）実施例２で作製した抗真菌抗体産生マウスハイブ
リドーマＣＡ３−２−１２の培養上清の解析結果を示
す。 （Ａ）はマンナンカラムに供する前のＩgＧ画分を示
す。 （Ｂ）はマンナンカラムの素通り画分を示す。 （Ｃ）はマンナンカラムの溶出画分の抗体溶出パターン
を示す〔実施例３−(4)参照〕を示す。
ブリドーマＡＴＢ１−１１４の培養上清の解析結果を示
す。 （ｃ）実施例２で作製した抗真菌抗体産生マウスハイブ
リドーマＣＡ３−２−１２の培養上清の解析結果を示
す。 （Ａ）はマンナンカラムに供する前のＩgＧ画分を示
す。 （Ｂ）はマンナンカラムの素通り画分を示す。 （Ｃ）はマンナンカラムの溶出画分の抗体溶出パターン
を示す〔実施例３−(4)参照〕を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】二重特異性を有するハイブリッド・モノク
ローナル抗体であって、二重特異性の一方が真菌に対す
るものであり、他方が抗真菌剤に対するものである抗
体。 - 【請求項２】抗真菌剤がポリエン系抗生物質である請求
項１記載の二重特異性抗体。 - 【請求項３】ポリエン系抗生物質がアムホテリシンＢ類
である請求項２記載の二重特異性抗体。 - 【請求項４】請求項１記載の抗体に、抗真菌剤を免疫結
合させてなる抗真菌免疫複合体。 - 【請求項５】抗真菌剤がポリエン系抗生物質である請求
項４記載の抗真菌免疫複合体。 - 【請求項６】ポリエン系抗生物質がアムホテリシンＢ類
である請求項５記載の抗真菌免疫複合体。 - 【請求項７】請求項１記載のハイブリッド・モノクロー
ナル抗体を産生するポリドーマ。
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|---|---|---|---|
| JP19681091A JPH05199894A (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-06 | 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-219629 | 1990-08-20 | ||
| JP21962990 | 1990-08-20 | ||
| JP19681091A JPH05199894A (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-06 | 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05199894A true JPH05199894A (ja) | 1993-08-10 |
Family
ID=26509998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19681091A Withdrawn JPH05199894A (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-06 | 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05199894A (ja) |
Cited By (16)
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| EP2311945A1 (en) | 2003-10-14 | 2011-04-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibodies substituting for functional proteins |
| WO2015046554A1 (ja) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 中外製薬株式会社 | 改変されたヘルパーファージを用いて抗原結合分子を作製する方法 |
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-
1991
- 1991-08-06 JP JP19681091A patent/JPH05199894A/ja not_active Withdrawn
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| US9975966B2 (en) | 2014-09-26 | 2018-05-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cytotoxicity-inducing theraputic agent |
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