FI111518B - Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden ja vasta-ainetta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden ja vasta-ainetta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI111518B
FI111518B FI945485A FI945485A FI111518B FI 111518 B FI111518 B FI 111518B FI 945485 A FI945485 A FI 945485A FI 945485 A FI945485 A FI 945485A FI 111518 B FI111518 B FI 111518B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
mouse
human
antibody
cells
binding
Prior art date
Application number
FI945485A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI945485A (fi
FI945485A0 (fi
Inventor
Hans Loibner
Helmut Eckert
Herbert Jaksche
Evelyne Janzek
Dieter Scholz
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929210929A external-priority patent/GB9210929D0/en
Priority claimed from GB929210930A external-priority patent/GB9210930D0/en
Priority claimed from GB929210944A external-priority patent/GB9210944D0/en
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of FI945485A publication Critical patent/FI945485A/fi
Publication of FI945485A0 publication Critical patent/FI945485A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI111518B publication Critical patent/FI111518B/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)

Description

MENETELMÄ MONOKLONAALI STEN VASTA-AINEIDEN JA VASTA-
AINETTA SISÄLTÄVÄN FARMASEUTTISEN KOOSTUMUKSEN
VALMISTAMISEKSI
111518 ' 5 Eräs lähestymistapa immuunijärjestelmän mani pulointiin perustuu idiotyyppiseen vuorovaikutukseen. Ig-molekyylin antigeenejä sitovissa osissa tai niiden ympärillä olevia ainutlaatuisia antigeenisiä determinantteja, joiden perusteella vasta-aineet erottuvat 10 toisistaan, kutsutaan idiotoopeiksi. Vasta-aineen kaikkia, vaihtelevaa määrää olevia idiotooppeja kutsutaan vasta-aineen idiotyypiksi (id). Idiotyypin molekylääri-nen rakenne on paikallistettu sekä komplementarisuutta määrittelevään alueeseen (complementary determining 15 region = CDR) sekä muuntuvan alueen runkoalueisiin ja siihen myötävaikuttaa yleensä, mutta ei aina, raskas ja kevyt ketju erityisessä yhteydessä.
Idiotyypit ovat serologisesti määriteltyjä itsenäisiä kokonaisuuksia, sillä vasta-aineen (Abi) 20 injektointi syngeeniseen, allogeeniseen tai xenogeeni- seen vastaanottajaan saa aikaan anti-idiotyyppisen vasta-aineen tuotannon (Ab2). Olettaen että idiotyyp- pi/anti-idiotyyppi vuorovaikutuksia on olemassa, Niels
Jerne esitti, että immuunijärjestelmällä on fysiologi- *·· ' 25 sesti reseptoripohjäinen säätely (Ann.Immunol. 125C, 373, 1974). Hänen verkkoteoriassaan immuunijärjestelmä esitetään kokoelmana Ig-molekyylejä ja reseptoreja T- lymfosyyttien pinnalla, joista jokainen on kykenevä tunnistamaan antigeenisen determinantin (epitoopin) 30 sitovalla osallaan (paratooppi) ja joista jokaisen .· voivat järjestelmän toiset vasta-aineet tai solun pin- » · tareseptorit immuunijärjestelmässä olevien idiotooppien avulla tunnistaa. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että idiotyyppisiä ja anti-idiotyyppisiä reseptoreja on 35 sekä B- ja T-lymfosyyttien pinnalla samoin kuin erittyneiden vasta-aineiden pinnalla.
2 111518
Kun sitoutumisen Abi:n ja Ab2:n välillä on estänyt antigeeni, jota vastaan Abi on suunnattu, idio-tyypin katsotaan olevan sitoutumismiskohtaan liittyvä, 1 koska se sisältää vasta-aineen muuntuvan alueen osan, 5 joka vastaa antigeenin tunnistamisesta. Idiotyyppejä, jotka rakenteellisesti jäljittelevät antigeenistä epitooppia, kutsutaan epitoopin sisäkuvaksi (=internal image). Täten sekä Ab2:lla ja antigeenillä, joka sitoutuu relevanttiin Abi:en, saattaa olla samanlainen 10 kolmedimensionaalinen konformaatio, joka edustaa annetun antigeenin sisäkuvaa. Sisä- kuva anti-idiotyyp-pisiä vasta-aineita voidaan periaatteessa pitää korvikkeena antigeenille, josta ne on johdettu idiotyyppisen verkoston avulla. Sen vuoksi näitä korvikeantigeenejä 15 voidaan käyttää aktiivisissa immunisaatiomenetelmissä.
Niistä on etua esimerkiksi silloin, kun alkuperäinen antigeeni ei ole riittävän immunogeeninen aikaansaamaan merkittävää immuunivastetta. Täten sopivat sisäkuva anti-idiotyyppiset vasta-aineet, jotka jäljittelevät 20 ei-immunogeenistä hiilihydraattiantigeeniä, voivat olla erityisen hyödyllisiä rokotussovellutuksissa. Seuraa-vassa näitä aiheita käsitellään tarkemmin.
Hybridoomateknologian kehityttyä, monoklonaa-lisia vasta-aineita (Mabs), suurimmaksi osaksi hiiripe-**, 25 räisiä, on kehitetty monille ihmisen syöpätyypeille.
Lähes kaikki markkereista, jotka on määritelty xeno-geenisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla (Mabs), eivät ole tarkasti kasvainspesifisiä, mutta ovat eri-laistumisantigeenejä, jotka ovat yhteisiä kasvaimille 30 ja/tai sikiöaikaisille kudoksille. Sen vuoksi niitä on ·) parhainta kutsua kasvaimiin liittyviksi antigeeneiksi (= tumor associated antigens = TAAs). Saavatko xeno-geenisten monoklonaalisten vasta-aineiden ilmaisemat ihmisen kasvainmarkkerit aikaan antituumorivasteen 35 syöpäpotilaassa, ja aiheuttavatko sellaiset antigeenit todella vastetta autologisiin kasvaimiin syöpäpotilais- 3 111518 sa, riippuu vastaavan kasvaimeen liittyvän antigeenin (TAA) luonteesta eikä ole vielä täysin selvitetty. Kasvaimiin liittyviä antigeenejä (TAA), jotka ovat joko luonnostaan immunogeenisiä syngeenisessä isännässä tai 5 jotka voidaan tehdä immunogeenisiksi, voidaan mahdollisesti käyttää aikaansaamaan antituumori-immuniteetti sekä terapeuttisesti että. ennaltaehkäisevästi.
Kasvaimiin liittyvät antigeenit ovat usein osa "itseään" (="self") ja saavat aikaan hyvin heikon im-10 muunivasteen syöpäpotilaissa. Sen sijaan sisäkuva ^internal image) anti-idiotyyppiset vasta-aineet, joilla on kolmidimensionaalinen muoto, joka muistuttaa vastaavan kasvaimeen liittyvän antigeenin (TAA) rakenteellista epitooppia, tunnistetaan vieraina molekyyleinä kas-15 vaimen sisältävässä isännässä. Sen vuoksi sopivalla anti-id monoklonaalisella vasta-aineella tehty terapeuttinen tai ennaltaehkäisevä immunisaatio saattaa saada aikaan immuunivasteen, joka aiheuttaa antituumo-ri-immuniteetin.
20 Terapeuttinen immunisaatio syöpää vastaan anti-id monoklonaalisella vasta-aineella saattaa olla erityisen tuloksellista sairauden alkuvaiheessa: Pri- määrikasvaimen leikkausvaiheessa usein piilevät yksittäiset kasvainsolut ovat levinneet potilaan eri eli-25 miin. Näiden mikrometastaattisten solujen tiedetään aiheuttavan myöhemmin etäispesäkkeiden kasvun, usein vuosia diagnoosin ja kasvainkudoksen kirurgisen poiston jälkeen. Toistaiseksi lähes kaikissa tapauksissa epi-teelialkuperää olevat metastaattiset syövät ovat paran-30 tumattomia. Tämän vuoksi "pienen jäännössyövän" tehok-.* kaalle käsittelylle, esim. piilevien mikrometastaat tisten solujen tuhoaminen makrometastaasien kasvun estämiseksi, on kiireellinen lääketieteellinen tarve. Sairauden tässä vaiheessa (täydentävät hoidot) perin-35 teiset kemoterapeuttiset hoidot ovat melko tehottomia. Kuitenkin, kun kasvainta on mahdollisimman vähän jäi- 4 111518 jellä, spesifisen antituumori-immuniteetin indusoiminen sopivalla sisäkuva anti-id monoklonaalisella vasta-aineella saattaa saada aikaan immuunijärjestelmän valikoivan mikrometastaattisten solujen tuhoamisen, joka 5 johtaa pitempään, tautia uusimattomaan elinikään.
Monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on BR55-2 spesifisyys (esitetty esim. Wistar EP 285 059, M.Blasz-cyk-Thurin et ai., J.Biol.Chem. 262 (1987) 372-379, tai Z. Steplewski et ai., Hybridoma 9 (1990) 201-210) mää-10 rittelevät Lewis Y6 antigeenin, hiilihydraattideter-minantin, joka valikoivasti esiintyy suurimmassa osassa ihmisten kiinteissä kasvaimissa. Ominaisuuksiensa perusteella vasta-aineita BR55-2 voidaan käyttää pohjimmiltaan epiteeliperäisten syöpien passiiviseen immuno-15 terapiaan.
Tuumoriin liittyvä Lewis Y oligosakkaridide-terminantti, jota esiintyy myös sikiökehityksen tietyissä vaiheissa, ei itsessään ole oikeastaan lainkaan immunogeeninen. Kuitenkin monoklonaaliset anti-idiot-20 yyppiset vasta-aineet (Ab2) BR55-2 (Abi):tä vastaan, joilla on sisäkuvaominaisuudet, jotka muistuttavat Lewis Y antigeeniä, ovat hyödyllisiä käytettäessä suo-jaavan antituumori-immuniteetin aikaansaamiseen, varsinkin sairauden alkuvaiheissa.
*· 25 Paitsi epiteeliperäisiin syöpiin, Lewis Y
hiilihydraattiantigeeni liittyy myös ihmisen immuuni-vajausviruksen (HIV) infektion patogeneesiin. Hankittu immuunivajausoireyhtymä (AIDS) on tunnistettu tietyksi taudiksi, joka etiologialtaan liittyy lymfotrooppisen 30 retroviruksen (HIV) infektioon. Sairaudelle on tunnusomaista, että se heikentää soluvälitteistä immuniteettiä ja aiheuttaa täydellisen imusoluniukkuuden (lymfosytopenia), erityisesti vähentää auttaja-T-lym-fosyyttien (CD4) määrää. AIDS:ia saattaa edeltää esi-35 syndrooma, joka ilmenee ryhmänä selkeitä kliinisiä piirteitä ja auttaja-T-lymfopeniana. Tätä esisyndroomaa 5 111518 kutsutaan AIDS:iin liittyväksi yhdistelmäksi (=aids related complex = (ARC).
HIV kuuluu viruksiin, joita on tutkittu runsaasti kahden viimeksi kuluneen vuosikymmenen aikana.
5 Kun retrovirus tunkeutuu ihmis- tai eläinsoluun, RNA muuttuu DNArksi ja tunkeutuu isäntäsoluun, joka sitten hämääntyy käsittelemään viruksen geenejä ominaan. HIV voi pysyä oireettomana näissä soluissa vuosia, kehon immuunijärjestelmän suojaamana ja sokeasti kopioituvana io aina kun isäntäsolu jakautuu. Vain siinä tapauksessa, että infektoituneiden solujen aktivaatio laukaisee nopean virusreplikaation, tuotetut viruspartikkelit tappavat solut ja leviävät verenkiertoon.
HIV:n erityispiirteiden vuoksi parantaminen 15 poistamalla sekä virus että proviraalinen geneettinen informaatio, joka on jo kopioitu ihmisen genomiin infektoituneissa potilaissa, on hankalasti saavutettavissa. Sen vuoksi useimmat lääketieteelliset yritykset ovat keskittyneet aineisiin, jotka hidastavat taudin 20 kehitystä puuttumalla virusreplikaation oleellisiin vaiheisiin.
Päätavoite on turvallisen ja tehokkaan rokotteen avulla estää HIV-infektio ja hoitaa jo infektoituneita potilaita. Useita rokotesovellutuksia on jo ko-25 keiltu esikliinisesti tai varhaisissa kliinisissä vaiheissa. Suurimmaksi osaksi ne perustuvat sovellutuksille, joissa virusrakenteet toimivat antigeeneinä, erityisesti pääkuoriglykoproteiini gp 120.
Luonnollinen immuunivaste koostuu vasta-ai-30 neista kaikkia virusproteiineja vastaan ja solutason • immuniteetin aktivoitumisesta. Tämä isäntäreaktio HIV- infektiossa ei kuitenkaan näytä pysäyttävän taudin kulkua oireettoman vaiheen jälkeen, joka tavallisesti kestää vuosia. Sen vuoksi rokotesovellutukset, jotka 35 perustuvat samoihin antigeeneihin, jotka aiheuttavat luonnollisen ja lopulta ei-suojaavan immuunivasteen, 6 111518 ovat kyseenalaisia. Yksi pääongelmista on HIV:n suuri heterogeenisyys, jonka avulla tämä virus kykenee väistämään tyyppispesifisten neutraloivien anti-gp 120 vasta-aineiden hyökkäyksen.
5 Rokotuksella saatava tehokas suoja HIV:tä vastaan vaatii kaksi puolustusstrategiaa: yksi vapaina verenkierrossa olevia viruksia vastaan ja toinen jo infektoituneita soluja vastaan. On tunnettua, että HIV-infektoituneilla soluilla in vitro ja in vivo on pin-10 nallaan muuttunut glykosylaatiomalli, nimittäin Lewis Y hiilihydraattideterminantti. Koska tämä antigeeni tavallisesti esiintyy tietyissä sikiövaiheissa ja myös erilaisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa, ilmentyminen HIV-infektoituneissa soluissa saattaa osoittaa niiden 15 muuttunutta erilaistumisastetta, jonka on saanut aikaan retroviraalinen transformaatio. Sen vuoksi tämä pinta-fenotyyppi muistuttaa ainutlaatuista solutason isäntä-reaktiota, joka tapahtuu HIV:n tunkeutuessa ihmisen genomiin. HIV-kuoriglykoproteiinin saa aikaan infek-20 toituneiden solujen glykosylaatiomekanismi. Sen vuoksi muutokset HIV:tä tuottavien infektoituneiden solujen glykosylaatiomallissa on havaittavissa myös vapautuneissa viruspartikkeleissa. Sen seurauksena myös sellaisissa soluissa kehittyneiden HIV:n kuoriglykopro-’ 25 teiinilla koostuu Lewis Y hiilihydraattideterminanteis- ta. Täten Lewis Y oligosakkaridi edustaa erityistä isännän vastetta, joka ilmenee sekä HIV-infektoituneissa soluissa että vapaissa HIV-partikkeleissa.
Edellä esitettyjen näkökohtien perusteella, 30 Lewis Y rakenne täyttää tärkeät vaatimukset käyttöön • rokotusstrategiassa sekä vapaata virusta että HIV-in- fektoituneita viruksia vastaan. Lisäksi, koska Lewis Y antigeeni on isäntäreaktio HIV:lie yleensä, se on riippumaton HIV -kannasta eikä siihen vaikuta tämän viruk-35 sen geneettinen vaihtelu. Valitettavasti hiilihydraat-tirakenteensa ja "self"-ominaisuuksiensa sikiövaiheen l 7 111518 erilaistumisantigeenina vuoksi, Lewis Y on tuskin lainkaan immunogeeninen itsessään. Mitään luonnollista im-' muunivastetta tätä antigeeniä vastaan ei ole havaittu ihmisessä. Kuitenkin BR55-2 (Abi):tä vastaan olevat 5 monoklonaaliset anti-idiotyyppiset vasta-aineet (Ab2), joilla on sisäkuva ominaisuudet, jotka muistuttavat Lewis Y antigeenin rakenteellisia epitooppeja, saattavat olla hyödyllisiä ennaltaehkäisevän ja hoidollisen immuniteetin aikaansaamiseksi sekä vapaissa että HIV-10 infektoituneissa soluissa riippumatta viruskannasta.
Lisäksi monoklonaaliset sisäkuva anti-id vasta-aineet ovat paitsi ainutlaatuisia ennaltaehkäisevinä ja hoidollisina rokotteina, myös hyvin spesifisiä rea-gensseja sille vasta-aineen idiotyypille, josta ne on 15 kehitetty. Ne melkein yksinomaan tunnistavat Abl:n sitoutumisalueen. Tämä tunnistamismalli on riippumaton Abi:n muista determinanteista. Toisin sanoen sopivat anti-id monoklonaaliset vasta-aineet valikoivasti määrittelevät minkä tahansa molekyylin, jolla on Abi: n 20 ainutlaatuinen idiotyyppi oikeassa kolmidimensionaali-sessa muodossa. Sen vuoksi nämä anti-id monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat vastaavalla affiniteetillä Abi:n F (ab1) 2-, Fab- ja Fv-fragmentteihin kuin myös sen vaihtuviin variantteihin (vaihtuvilla varianteilla on .·' 25 erilaiset vakioalueet e.g. hiiri-Ig2a, Ig2b, IgGl, mutta samanlainen idiotyyppi). Lisäksi tämä sisäkuva anti-id monoklonaalisten vasta-aineiden hyvin spesifinen tunnistusmalli sisältää myös kanta-hiiri-monoklonaalisesta vasta-aineesta rekombinantti-DNA-30 tekniikalla saadut variantit.
Jotta voitettaisiin mahdolliset ongelmat, jotka aiheutuvat hiiri-vasta-aineiden toistuvasta käytöstä ihmisen immunoterapiassa, hiiri/ihminen kimeeri-siä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan kehittää 35 yhdistämällä valitun kanta-hiiri-monoklonaalisen vasta-aineen muuntuva alue ihmisen vakioalueisiin. Tällaisten 8 111518 hiiri/ihminen kimeeristen monoklonaalisten vasta-aineiden toteaminen ihmisen seerumissa vaatii hyvin spesifisiä reagensseja, sillä näillä kimeerisillä monoklonaa-lisilla vasta-aineilla on samanlaiset vakioalueet kuin 5 luonnollisesti esiintyvissä ihmisen immunoglobuliineis-sa. Sisäkuva anti-id monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on kehitetty kanta-hiiri-Abl:tä vastaan tunnistavat myös siitä johdetut kimeeriset vasta-aineet. Täten tällaiset anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat 10 hyödyllisiä reagensseja spesifisiin ja herkkiin kvantitatiivisiin määrityksiin esim. määritettäessä seerumista hiiri/ihminen kimeerisiä vasta-aineita, kun normaalia ihmisen immunoglubuliinia on suurina pitoisuuksina läsnä.
15 Passiiviseen immunoterapiaan käytetttävien terapeuttisesti mielenkiintoisia ominaisuuksia omaavien monoklonaalisten vasta-aineiden ominaisuuksien kehittämiseksi edelleen, voidaan kehittää "täysin humanisoituja" vasta-aineita DNA-tekniikallla, jossa on vain 20 minimimäärä tarvittavia osia kanta-hiiri-vasta-ainees-ta, komplementaarisuudesta määräävä alue (complementarity determining regions= CDR), yhdistetään ihmisen muuntuvan alueen runkoon ja ihmisen vakioalueeseen. Näiden "täysin humanisoitujen" monoklonaalisten vasta-25 aineiden suunnitteluun ja konstruointiin käytetään sekvenssihomologiaa ja molekyylimallitusta, hiiren ja ihmisen sekvenssiosien yhdistelmän valitsemiseksi, joka yhdistelmä vähentäisi immunogeenisyyttä, mutta säilyttäisi sitoutumisominaisuudet. Tietyt sisäkuva anti-id 30 monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on kehitetty kanta-hiiri-Abl:n idiotyyppiä vastaan saattavat silti sitoutua CDR-lisättyyn humanisoituun varianttiin, mikäli seuraavat ehdot täyttyvät: 35 a) Humanisoidun muuntelijan yhdistyvän alueen kolmedimensionaalinen rakenne on hyvin samankaltainen kuin sen 9 111518 kanta-hiiri-vasta-aine b) Tietty anti-id vasta-aine tarkasti tunnistaa yhdistävän alueen 3-dimensionaalisen muodon ("todellinen 5 sisäkuva vasta-aine") Täten anti-idiotyyppiset monoklonaaliset vasta-aineet, joilla on yllämainittu ominaisuus, ovat erityisen käyttökelpoisia reagensseja spesifiseen ja herkkään kvantitatiiviseen määritykseen esim. täysin 10 humanisoitujen (CDR liitetyt) monoklonaalisten vasta-aineiden konsentraatioiden määritykseen seerumista, kun normaalia ihmisimmunoglobuliinia on läsnä ylimäärin.
Keksintö koskee menetelmää BR55-2 (Abi) monoklonaalisia vasta-aineita vastaan olevien hiiri-15 monoklonaali sisäkuva anti-idiotyyppisten vasta-aineiden (Ab2) valmistamiseksi ja vasta-aineiden kehittämistä, tuotantoa ja karakterisointia. Näitä anti-idiotyyppisiä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisessa ja ennaltaehkäisevässä 20 immunoinnissa epiteeliperäistä syöpää ja pienisolukeuhkosyöpää sekä HIV-infektion aiheuttamia tauteja vastaan. Näitä anti-idiotyyppisia vasta-aineita voidaan lisäksi käyttää BR55-2 spesifisten vasta-aineiden tai niiden fragmenttien ja johdannaisten, 25 mukaan lukien kimerisoidut ja humanisoidut variantit (kuten kuvattu WO 92/03165) hyvin selektiiviseen ja kvantitatiiviseen määritykseen sekä yleisesti sopivaan menetelmään BR55-2 spesifisten molekyylien selektiiviseen immuno-affiniteettipuhdistukseen.
30 ·' BR55-2 vasta-aineiden idiotyyppiä vastaan olevien hii- ri-monoklonaali anti-idiotyyppi vasta-aineiden kehittäminen ja karakterisointi 35 Ei-toivottujen anti-isotyyppisten immuunivas teiden minimoimiseksi, BR55-2:n F (ab') 2-fragmentti, 10 111518 hiiri-IgG3, valittiin immunisointiin. Hiiri-anti-id monoklonaalisen vasta-aineen onnistuneelle kehittämiselle hiiri-monoklonaalista vasta-ainetta BR55-2 vastaan, on tärkeää maksimoida immunogeenisyys, jotta 5 saadaan tarkoituksenmukainen immuunivaste syngeenisessä isännässä. Sen vuoksi F (ab')2-fragmentti, josta puuttuu Fc-osa (irrotus ja puhdistus kuvattu EP-A-julkaisussa 528.767) yhdistettiin immunogeeniseen kantajaan avai-menreikämaljakotilon hemosyaniiniin (keyhole limpet 10 hemocyanin, KLH) käyttäen hetrobifunktionaalista yhdistäjää N-sukkini-imidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propio-naattia (=SPDP) kuvattujen menetelmien mukaan (J.Carlsson et ai., Biochem.J. 173, 723, 1978).
Balb/c hiiret immunisoitiin tällä BR55-2/hiiri 15 Ig3-F(ab')2 -KLH-konjugaatilla käyttäen Freundin täydellistä adjuvanttia ja käyttäen hiiri-monoklonaalisten vasta-aineiden tyypillistä valmistusmenetelmää. Seuraavien toistettujen immunisointien jälkeen hiiren pernasolut yhdistettiin 20 hiiren myeloomasolulinjaan SP2/0 (kokeen yksityiskohdat, katso esimerkki 1).
Viljeltyjen hybridoomasolujen sopivaksi valitsemiseksi tehtiin sarja testejä niiden supernatanteil-la. Valinta perustui seuraaviin kriteereihin: 25 a) Hybridoomien eritysaste määrittämällä hiiri-IgG:n konsentraatio supernatantissa (kokeen yksityiskohdat, katso esimerkki 2). Solut, jotka tuottivat hiiri-IgG:tä runsaasti, alikloonattiin yksisoluviljelmiksi.
30 * s b) Valittujen supernatanttien sitoutuminen BR55-2/hii- ri-IgG3:n F (ab') 2-fragmenttiin (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 3) 35 c) Valikoitujen supernatanttien aiheuttama BR55-2/hii-ri-IgG2a:n sitoutumisen inhibitio Lewis Y antigeeni 11 111518 positiivinen SKBR5 ihmisen rintasyöpäsoluun (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 4).
Jälkimmäinen testi on suunniteltu osoittamaan Ab2:n sisäkuva ominaisuudet. BR55-2:n vaihtuva 5 variantti hiiri-Ig2a:ta käytettiiin sitoutumiseen, jotta voitiin minimoida Ab2 aikaansaama BR55-2/hiiri IgG3 F(ab') 2“fragmentin jäljelle jääneiden vakioaluei-den tunnistaminen, jota fragmenttia oli käytetty immunisointiin. Testit tehtiin kvantitatiivisesti ja 10 perustui IgG konsentraatioon, joka oli määritetty testissä a) (esimerkki 2). Lisäksi ylimäärä epäspesifistä hiiri-IgG:a lisättiin tähän inhibitiokokeeseen, jotta vältettiin niiden Ab2:n tunnistaminen, jotka eivät ole spesifisiä BR55-2:n idiotyypille. Ne hybridoomat va-15 Iittiin, jotka tuottivat IgG:a, joiden inhibitioka-pasiteetti oli yli 95% (BR55-2/hiiri-IgG2a sitoutumisen esto SKBR5 solulinjaan).
Käyttäen edellämainittuja testimenettelyjä kuusi erilaista hybridoomaa viimein valittiin ja kehi-20 tettiin (E4, Cll, B3, B9, G6, G9) . Kaikki kuusi hybridoomaa tuottavat hiiri-IgGl, kuten on todettu alatyyppi ELISA-menetelmällä käyttämällä kani-antihiiri-IgGl/pe-roksidaasia (Esimerkiksi Zymedin reagenssit).
Kaikki kuusi hybridoomaa kasvatettiin pyöri-25 vissä pulloissa (37 °C, 5% CO2 G-alustassa, alustan vaihto joka 3-4 päivä) ja supernatantit kerättiin myöhempää puhdistusta varten.
Jokainen supernatantti, joka sisälsi vastaavaa anti-id BR55-2 monoklonaalista vasta-ainetta, puhdis-30 tettiin immunoaffiniteettikromatografialla. Yleensä af-,* finiteettikromatografia perustuu immobilisoidun ligan- din ja tutkittavan aineen vuorovaikutukseen. BR55-2 anti-idiotyyppisten vasta-aineiden ollessa kyseessä, affiniteettikölonnin erittäin spesifinen ligandi on 35 monoklonaalinen vasta-aine BR55-2/hiiri-IgG2a, joka sitoo valitun anti-idiotyyppisen monoklonaalisen vasta- 12 111518 aineen (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 5).
Eristettyjen anti-idiotyyppisten BR55-2 mono-klonaalisten vasta-aineiden (E4, Cll, B3, B9, G6, G9) puhtausaste määritettiin analyyttisellä FPLC-ioninvaih-5 tokromatografialla, koko-ekskluusiokromatografialla, SDS-PAGE:lla ja isoelektrisellä fokusoinnilla. Kaikkien anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden puhtaus oli yli 95% (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 6; SDS-PAGE ja isoelektrinen fokussointi on esitetty kulo vissa 1 ja 2).
Puhdistetut anti-id monoklonaaliset vasta-aineet karakterisoitiin kvantitatiivisesti määrittämällä niiden kyky inhiboida BR55-2/hiiri-IgG3 sitoutuminen Lewis Y antigeenipositiiviseen SKBR5 solulinjaan. Kaik-15 ki anti-id monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat Abi: n sitoutumisen antigeeniinsä stökiömetrialla 1:1 (kokeen yksityiskohdat, katso esimerkki 7; vastaavat tulokset on esitetty kuvassa 3).
Ratkaiseva todiste edellä kuvattujen anti-id 20 BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden sisäkuvaominai-suuksista ja käytöstä korvikekasvainantigeenina perustuu niiden kykyyn kehittää Ab3 vaste tuumoriin liittyviin antigeeneihin (tumor associated antigens, TAA) eri lajeissa. N. Jernen verkkoteorian mukaan anti-id mono-• ' 25 klonaalisten vasta-aineiden (Ab2) sisäkuvilla immuni- t soimalla aikaansaadulla vasta-aine Ab3:lla on samanlainen sitoutumisspesifisyys kuin Abl:llä. Sen vuoksi anti-id BR55-2 monoklonaalisilla vasta-aineilla immunisoimalla aiheutetun immuunivasteen pitäisi olla spesi-30 finen Lewis Y antigeenipositiivinen kasvainsoluille. Tästä seuraa, että immunisoimalla anti-id BR55-2 monoklonaalisilla vasta-aineilla voidaan saada aikaan suo-jaava antituumori-immuniteetti ihmisessä.
Ab3 vasteen ominaisuuksien tutkimiseksi kanit 35 ja reesusapinat immunisoitiin anti-id BR55-2#E4:llä alumiinihydroksidi kantajana ja adjuvanttina. Tätä 13 111518 mietoa adjuvanttia käytetään laajasti eri rokotteissa ihmisillä. Negatiivisena kontrollina eläimet immunisoitiin myös samalla määrällä epäspesifistä hiiri-IgGl:tä. Viiden viikon aikana tapahtuneen neljän immunisaation 5 jälkeen, seerumit kerättiin viikolla 9 (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 8). Seerumin Ig:n sitoutuminen Lewis Y antigeenipositiivinen SKBR5 rintasyöpäsolu-linjaan ja Lewis Y antigeeninegatiivinen WM9 melanooma solulinjaan määritettiin (kokeen yksityiskohdat katso io esimerkit 9 ja 10).
Anti-id BR55-2#E4 saa aikaan korkeatiitterisen humoraali-immuunivasteen sekä kaneissa että reesusapi-noissa. BR55-2#E4 immunisoitujen eläinten seerumin Ig valikoivasti sitoutuu Lewis Y antigeenipositiivinen 15 SKBR5 solulinjaan, muttei Lewis Y antigeeninegatiivinen WM9 solulinjaan. Vastakohtana, immunisoimalla epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä lähes lainkaan kasvainsoluja sitovaa seerumi Ig:a ei ollut havaittavissa. Nämä tulokset on koottu taulukkoon 1. Kuvissa 4 ja 5 on esitetty 20 Ig-sitoutumiskäyrät, jotka on määritetty solu-ELISA (S-KBR5 solut)-menetelmällä kanin ja reesusapinoiden seerumeista ennen ja jälkeen immunisaation. Anti-id BR55-2#E4 immunisoitujen eläinten seerumin Ig:n sitoutuminen SKBR5 soluihin on havaittavissa vielä seerumilaimennok-• 25 sissa 1:10 000.
Kaksi vuotta alkuperäisen immunisointijärjes-telyn jälkeen samat reesusapinat saivat ensimmäisen lisäinjektion anti-id BR55-2#E4 tai epäspesifistä hiiri-IgGl :a. Samalla tavoin toinen tehoste annettiin 30 kolme vuotta alkuperäisen immunisoinnin jälkeen (=yksi . vuosi ensimmäisen tehosteen jälkeen, kokeen yksityis kohdat katso esimerkki 8). Seerumit kerättiin ennen ja jälkeen näiden tehosteiden.
Anti-id BR55-2#E4 rokotettujen reesusapinoiden 35 kokonaishumoraalinen immuunivaste määritettiin ELISA-menetelmällä, joka perustui BR55-2#E4 päällystettyihin 14 111518 mikrotiitterilevyjen käyttöön (kokeen yksityiskohdat, katso esimerkki 13) . Reesusapinoiden seerumeissa oli havaittavissa hyvin korkea immuunivaste ensimmäisen immunisointijärjestelyn jälkeen, kuin myös ensimmäisen 5 ja toisen tehosteen jälkeen. Ig:n sitoutuminen BR55-2#E4:ään oli havaittavissa vielä seerumilaimennoksissa 1:50 000. Hieman alhaisempi, mutta silti merkittävä tiitteri oli havaittavissa seerumeissa ennen tehostein-jektointeja. Nämä tulokset on esitetty kuvissa 6-8.
10 Epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä rokotettujen reesusapinoiden humoraalinen immuunivaste määritettiin käyttäen samaa edellä mainittua ELISA-menetelmää (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 13) . Kuten odotettua, anti-id BR55-2#E4:ään sitoutuvan Ig:n seerumitiit-15 terit ovat alhaisempia kuin tiitterit anti-id BR55-2#E4:llä rokotettujen apinoiden seerumeissa. Kun epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä immunisoitujen reesusapinoiden immuunivaste ristireagoi anti-id BR55-2#E4:n vakioalueiden kanssa, osuus immuunivasteesta, joka 20 suuntautuu anti-id:n hypermuuntuviin alueisiin selvästi puuttuu. Nämä tulokset on esitetty kuvissa 9-10.
Alkuperäisen, kuin myös ennen ja jälkeen te-hosteimmunisointien, immuunivasteen kasvainspesifisyy-den todistamiseksi, apinan seerumin Ig:n sitoutuminen ’/ 25 useisiin Lewis Y antigeenipositiivinen syöpäsolulinjoi hin (rinta-, vatsa-, paksusuoli- ja pienisolukeuhkosyö-pä) sekä Lewis Y negatiivinen melanooma solulinjaan määritettiin (kokeen yksityiskohdat, katso esimerkki 10). ReesusapinoisSa, joita oli käsitelty anti-id BR55-30 2#E4:llä, oli kaksi vuotta ensimmäisen immunisaation . ja ennen ensimmäistä immunisointitehostetta, havaitta vissa seerumi Ig:a, joka sitoutuu Lewis Y antigeenipositiivinen kasvainsoluun. Ensimmäisen tehosteimmuni-soinnin jälkeen, spesifisesti Lewis Y antigeeniposi-35 tiivinen kasvainsoluihin sitoutuvan, seerumi-Ig:n huomattavasti kohonnut tiitteri oli havaittavissa eläimis- 15 111518 sä, jotka oli immunisoitu anti-id BR55-2#E4:llä, mutta sitoutumista antigeeninegatiivinen solulinjaan oli tuskin havaittavissa. Mitään spesifistä sitoutumista ei ollut havaittavissa missään vaiheessa niissä reesusapi-5 noissa, jotka oli immunisoitu epäspesifisellä hiiri-IgGlrllä. Samanlaiset tulokset on todettu seerumeissa ennen ja jälkeen toisen tehosteimmunisaation. Kuvissa 11-20 on esitetty seerumeiden titrauksen tulokset, jotka on saatu eri aikaväleillä Solu-ELISA-menetelmällä 10 käyttäen useita kasvainsolulinjoja.
Samanlainen malli Ig:n immunoreaktiivisuudesta eri apinoiden seerumeissa ennen ja jälkeen ensimmäisen immunisaatiojärjestelyn kuin myös ennen ja jälkeen ensimmäisen tehosteimmunisaation oli havaittavissa 15 sitoutumiskokeissa Lewis Y antigeenipositiivinen SKBR5 solujem membraanivalmisteeseen (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 11). Nämä tulokset on koottu taulukkoon 2.
Reesusapinoissa anti-id BR55-2#E4 immunisaati-20 on aiheuttaman humoraalisen immuunivasteen lisäanaly-soimiseksi, rokotettujen apinoiden eri seerumit immuno-puhdistettiin kolonnissa, jossa oli Sepharosiin yhdistettyä anti-id BR55-2#E4:ää (kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 12) . Tällä selektiivisellä yksivaihe- : 25 menetelmällä koko humoraalinen immuunivaste anti-id * BR55-2#E4:ä vastaan erottuu muista irrelevanteista seerumiproteiineista. Ensimmäisessä kokeessa anti-id BR55-2#E4:llä immunisoidun reesusapinan Ig immunopuh-distettiin seerumista, joka oli saatu 9 viikkoa alkupe-30 räisen immunisaation jälkeen. Toisessa kokeessa anti-id • ( BR55-2#E4 immunisoidun reesusapinan Ig immunopuhdistet- tiin yhdistetyistä seerumeista, jotka oli kerätty 4 ja 9 viikkoa toisen tehosteen antamisen jälkeen. Saadut Ig-fraktiot, retentionsa anti-id BR55-2#E4-kolonnissa 35 perusteella, sitoutuvat spesifisesti anti-id BR55-2#E4 vasta-ainemolekyylin erilaisiin epitooppeihin. Nämä Ig- 111513 16 fraktiot sisältävät vasta-aineita anti-id BR55-2#E4:n vakioalueita vastaan (anti-isotyyppinen immuunivaste) kuin myös vasta-aineita anti-id BR55-2#E4:n muuntuvia alueita, mukaan lukien sitoutuvia alueita vastaan 5 (anti-idiotyyppinen immuunivaste). Johdannossa mainitun idiotyyppisen verkkoteorian mukaan, jälkimmäinen osuus (AB3) on erityisen tärkeä, koska sillä on vastaavanlaisia sitoutumisominaisuuksia kuin BR55-2 spesifisillä vasta-aineilla (ABI).
10 4 ja 9 viikkoa toisen tehosteen jälkeen kerät- tyjen ja yhdistettyjen immuunipuhdistettujen Ig-frakti-oiden ja läpivirtausfraktion sitoutuminen anti-id BR55-2#E4-määritettiin (kokeen yksityiskohdat, katso esimerkki 13). Kun immunopuhdistettu Ig-fraktio sitoutuu 15 voimakkaasti anti-id BR55-2#E4:n, läpvirtausfraktion sitoutumista ei havaittu. Tällä tuloksella immunopuh-distusmenetelmän selektiivisyys ja tehokkuus on todistettu (tulokset esitetty kuvassa 21).
Seuraavaksi, 4 ja 9 viikkoa toisen tehosteen 20 jälkeen kerättyjen ja yhdistettyjen immunopuhdistettu-jen Ig-fraktioiden ja läpivirtausfraktion ja humanisoidun version kanta-hiiri-monoklonaalisesta vasta-aineesta (ABI) sitoutumisominaisuuksia SKBR5 rintasyö-päsoluihin verrattiin. Tämä humanisoitu ABI variantti ’ ' 25 (BR55-2/humanisoitu IgGl) valittiin mahdollistamaan vertailu, sillä se voidaan määrittää samalla reagens-silla kuin reesusapina Ig (vuohi-anti-ihminen-Ig/pe-roksidaasi, joka samankaltaisesti sitoutuu myös ree-susapinan Ig:a muistuttaviin yhdisteisiin). Melkein 30 kaikki kasvainsolusitoutumisreaktiivisuus kerääntyy im-munopuhdistettuun Ig-fraktioon. Tämän tuloksen perusteella anti-id BR55-2#E4 immunisaatiolla aikaansaadun reesusapinan Ig:n ristireaktiivisuus Lewis Y anti-geenipositiivinen kasvainsolulinjan kanssa on todis-35 tettu. Lisäksi massa/massa perusteella immunologisesti puhdistetun Ig-fraktion sitoutumisvoimakkuus on vain 5 17 111518 kertaa alhaisempi kuin BR55-2/humanisoitu IgGlrn (ABI). Ottaen huomioon, että vain tietty osuus immunologisesti . puhdistetusta Ig-fraktiosta on suunnattu anti-id BR55-2#E4:n yhdistyvään osaan ja verkkoteorian mukaan vain 5 tällä osuudella on ABl:een verrattavissa olevia sitou-tumisominaisuuksia, tämä tulos on merkittävä. Reesus-apinan seerumeiden immuno-affiniteettipuhdistuksen saannon perusteella, immunologisesti puhdistetun Ig-fraktion tiitteri on n. 200 pg/ml seerumia, vastaten 40 10 pg/ml Ig, jolla on kasvainsolua sitovat ominaisuudet, jotka ovat samanlaiset kuin BR55-2/humanisoitu IgGl:llä (tulokset on esitetty kuvassa 22, kokeen yksityiskohdat, katso esimerkit 10 ja 12).
Immunologisesti puhdistetun apina Ig:n (AB3) 15 ja BR55-2/humanisoitu IgGl:n sitoutumista Lewis Y positiivinen rintasyöpäsolulinja SKBR5:een ja Lewis Y negatiivinen melanoomasolulinja WM9:än vertailtiin, kuva 23 (kokeen yksityiskohdat esimerkki 10) . Kun sekä AB3-fraktio ja BR55-2/humanisoitu IgGl sitoutuvat voimak-20 kaasti Lewis Y positiivinen solulinjaan kuten yllä on kuvattu, kumpikaan vasta-aineista ei sitoudu spesifisesti Lewis Y negatiivinen solulinjaan. Näiden tulosten perusteella AB3-fraktion ja humanisoidun ABI variantin samankaltaisuus sitoutumismallissa on osoitettu.
: : 25 AB3-fraktion immunoreaktiivisuuden samanlainen malli on havaittu myös ELISA-menetelmällä käyttäen Lewis Y positiivinen SKBR5 solulinjan ja Lewis Y negatiivinen solulinja WM9:n membraanifraktioita. AB3-frak-tion todellinen sitoutuminen on havaittu vain Lewis Y 30 positiivinen solumembraaniin (tulokset on esitetty kuvassa 24, kokeen yksityiskohdat esimerkki 11).
Immunologisesti puhdistetun apina Ig (AB3) sitoutumisominaisuudet lukuisiin Lewis Y positiivinen ihmisen kasvainsolulinjoihin (pienisolukeuhkosyöpä, 35 vatsasyöpä, paksusuolensyöpä, rintasyöpä) vahvistettiin. Immunologisesti puhdistettu apina-Ig 18 111518 sitoutuu voimakkaasti kaikkiin testattuihin solulinjoihin (tulokset on esitetty kuvassa 25, kokeen yksityiskohdat katso esimerkki 10).
ABI vasta-aine BR55-2/hiiri IgG3 sitoutuessaan 5 kasvainsoluihin aiheuttaa kasvainsolujen tuhoutumisen aktivoimalla ihmisen effektori (=effector) järjestelmät. Anti-id BR55-2#E4 immunisoimalla aikaansaadun ree-susapinan-Ig:n kasvainsolutuhoamiskapasiteetin määrittämiseksi, käytettiin immunologisesti puhdistettua 10 apinan lg:a (AB3). Tätä koetta varten AB3-fraktio puhdistettiin immunologisesti (katso edellä) seerumista, joka oli saatu 9 viikkoa alkuperäisen anti-id BR55-2#E4:llä immunisoinnin jälkeen. Tätä AB3-fraktiota verrattiin BR55-2/hiiri-IgG3:een (ABI) ADCC-kokeessa 15 käyttäen ihmisen PBMC:tä effektorisoluina (tulokset on esitetty kuvassa 26, kokeen yksityiskohdat esimerkissä 14) . Immunologisesti puhdistettu AB3-fraktio korkeina konsentraatioina aiheuttaa solutuhoa aktivoimalla ihmisen effektorisolut samaan tapaan kuin hiiri-ABl. Tämä 20 tulos osoittaa, että rokottaminen anti-id BR55-2#E4:llä saa aikaan selektiivisen kasvainsolu sytotoksisuuden. Korkeahko konsentraatio AB3:a vaaditaan, sillä tietty osuus immunologisesti puhdistetusta Ig-fraktiosta on suuntautunut anti-id BR55-2#E4:n yhdistävään osaan ja ··· 25 vain tämän osuuden oletetaan sitoutuvan kasvainsoluihin ja saavan aikaan ADCC:n(=antibody dependent cellular cytotoxity=vasta-aine riippuva sytotoksisuus).
Kuten on mainittu johdannossa, on tunnettua, että Lewis Y hiilihydraattiantigeeni esiintyy myös HIV-30 infektoituneissa soluissa. Anti-id BR55-2#E4:llä tai epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä immunisoimalla aikaan-saadun reesusapinan Ig:n sitoutumista HIV-infektoitu-neisiin soluihin tutkimiseksi, apinan seerumit ennen ja 9 viikkoa jälkeen alkuperäisen immunisaation testattiin 35 kaupallisesti saatavalla testipakkauksella, joka alunperin on tarkoitettu HIV-seropositiivisuuden määrittä- 19 111518 miseksi ihmisen seerumista. Tämä testi perustuu ihmisen seerumi-Ig:n kykyyn sitoutua HIV-infektoituun ihmisen T-solulinjaan PALL kuten määritetään epäsuoralla im-munofluoresenssilla käyttäen anti-ihminen-IgG-FITC:tä.
5 Koska ihmisen ja reesusapinan Ig:t ovat hyvin samankaltaisia, testipakkauksen alkuparäinen reagenssi soveltuu käyettäväksi reesusapinan Ig:lle. Sitoutuminen ei-in-fektoituihin PALL-soluihin soveltuu kontrolliksi (kokeen yksityiskohdat esimerkissä 15) .
10 Normaalilla reesusapinan seerumilla taustaim- munofluoresenssi sekä HIV-infektoituneille että ei-infektoituneille PALL-soluille on hieman korkeampi kuin taustaimmunofluoresenssi ihmisen normaalilla seerumilla. Kuitenkin vain anti-id BR55-2#E4:llä immunisoiduil-15 la apinoilla seerumin Ig todella sitoutuu HIV-infektoi-tuneisiin soluihin, kun tuskin lainkaan sitoutumista ei-infektoituneisiin PALL-soluihin on havaittavissa. Epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä immunisoidun reesusapinan seerumin Ig:n reaktiivisuus HIV-infektoituneisiin 20 PALL-soluihin on selkeästi vähemmän ilmeinen ja lähellä taustaimmunofluoresenssia, joka on havaittu normaalissa apinan seerumissa (tulokset on koottu taulukkoon 3).
Anti-id BR55-2#E4:llä immunisoidun reesusapinan immunoglobuliini puhdistettiin immunologisesti 4 ja ·· 25 9 viikkoa toisen tehosteen jälkeen talteenotetuista ja yhdistetyistä seerumeista käyttäen anti-id BR55-2#E4-kolonnia (katso edellä). Tämän immunologisesti puhdistetun Ig:n (AB3) sitoutumisominaisuuksia verrattiin BR55-2/hiiri-IgG3 (ABI) vastaaviin ominaisuuksiin aie-30 mmin mainitulla kaupallisesti saatavalla testipakkauk-,* sella, joka on suunniteltu HIV-seropositiivisuuden määrittämiseen ihmisen seerumista (kokeen yksityiskohdat esimerkissä 15) . Immunologisesti puhdistettu Ig-fraktio (AB3) sitoutuu selektiivisesti HIV-infektoitu-35 neisiin PALL-soluihin, muttei ei-infektoituneisiin PALL-soluihin. Samankaltainen sitoutumismalli havait- 20 111518 tiin BR55-2/hiiri-IgG3:11a (ABI). Nämä tulokset on koottu taulukkoon 4.
Lisänä ainutlaatuiselle käytölle rokotteina ennaltaehkäisevänä ja hoitoon syövissä ja HIV:n aiheut-5 tamissa taudeissa, BR55-2 sitoutumisaluetta vastaan olevat sisäkuva anti-idiotyyppiset vasta-aineet, joiden valmistaminen on kuvattu.tässä keksinnössä, ovat hyviä välineitä sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden, niiden johdannaisten tai fragmenttien, joilla on BR55-2 10 sitoutumisspesifisyys, kvantitatiiviseen määrittämi seen. Esimerkiksi niitä voidaan käyttää kaikkien BR55-2 hiiri- alatyyppien konsentraatioiden määrityksessä ihmisen seerumista. Nämä anti-id monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat vain immunoreaktiiviseen BR55-2 ra-15 kenteisiin, koska ne tunnistavat BR55-2:n sitoutumis-alueen kolmidimensionaalisen muodon. Tämä ominaisuus johtaa määritysmenetelmiin, jotka ovat huomattavasti parempia kuin ne, jotka perustuvat perinteisiin anti-vakioaluereagensseihin. ELISA-menetelmä im- 20 munoreaktiivisen BR55-2/hiiri-IgG3 tai BR55-2/hiiri-IgG2a:n kvantitatiiviseksi määrittämiseksi on kuvattu esimerkissä 16 ja tyypillinen standardikäyrä näistä monoklonaalisista vasta-aineista ihmisen seerumista on esitetty kuvassa 27.
'·· ' 25 Samanlainen ELISA-menetelmä, joka perustuu tämän keksinnön mukaisten anti-id monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöön, voidaan soveltaa immunoreak-tiivisten BR55-2 hiiri/ihminen kimeerien hyvin selektiiviseen kvantitatiiviseen määrittämiseen ihmisen 30 seerumista. Nämä kimeerit sisältävät BR55-2 muuntuvan alueen ja ihmisen vakioalueen (esim. ihmisen IgGl tai ihmisen IgG3). Koska ihmisen seerumissa on suuri ylimäärä normaalia Ig:ä (>10mg/ml), perinteisillä anti-ihminen-Fc reagensseilla, jotka sitoutuvat mihin tahan-35 sa ihmisen Ig:in, ei voida todeta tällaisia hiiri/ihminen kimeerejä. Selektiiviset ELISA-menetelmät on 21 111518 kuvattu esimerkeissä 17 ja 18, tyypilliset standardi-käyrät ihmisen seerumista on esitetty kuvissa 28 ja 29.
BR55-2:n täysin humanisoidut variantit on konstruoitu liittämällä hiiri-kanta-monoklonaalisen 5 vasta-aineen komplementaarinen määrittelevä alue ^complementarity determining region = CDR) ihmisen runkoon ja vakioalueisiin. Tietokonemallituksen avulla ihmis-runkoon valitut pistemutaatiot johtivat humanisoituihin variantteihin, joilla ei tapahtunut merkittävää vähene-10 mistä sitoutumisaffiniteetissa Lewis Y positiivinen kasvainsoluihin verrattuna kanta-hiiri-monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Täten näissä humanisoiduissa varianteissa vain se hyvin pieni osuus alkuperäisestä hiiri-aminohapposekvenssistä, joka määrää sitoutumisominai-15 suuksista, jää muuttumattomaksi. Huomattavaa on, että kaikki anti-id BR55-2 monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on kuvattu tässä keksinnössä, myöskin sitoutuvat voimakkaasti kanta-hiiri-IgG3 monoklonaalisen vasta-aineen humanisoidun igGl variantin idiotyyppiin. Anti-20 id monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskäyttäyty-minen ABI:n humanisoituihin variantteihin on verrattavissa yllä mainittujen hiiri/ihminen monoklonaalisten vasta-aineiden vastaaviin ominaisuuksiin. Tämä on osoitettu biospesifisellä vuorovaikutusanalyysillä käyttäen ·· 25 Pharmacian BIAcore menetelmää. Useimmissa tapauksissa suurehkoilla konsentraatioilla stökiömetria lähes 1:1 on havaittavissa anti-id BR55-2 ja BR55-2/kimeerinen ihmisen IgGl tai BR55-2/humanisoitu IgGl välillä. Kokeen yksityiskohdat on esitetty esimerkissä 19, tit-30 rauskäyrät on esitetty kuvissa 30-35. Nämä tulokset .* korostavat anti-id monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisselektiivisyyttä BR55-2:n kaikkien varianttien koskemattomaan kolmidimensionaaliseen hypervari-aabeliin alueeseen ja todistaa niiden sisäkuvaominai-35 suudet.
Anti-id BR55-2 monoklonaalisten ainutlaatuisen 22 111518 ja selektiivisen tunnistamismallin perusteella, niitä voidaan käyttää BR55-2 spesifisten immunoreaktiivisten humanisoitujen vasta-aineiden hyvin selektiiviseen kvantitatiiviseen määrittämiseen, huolimatta suuresta 5 ylimäärästä seerumissa olevaa ihmisen immunoglobulii-nia. Tämä sama ELISA-menetelmä on käyttökelpoinen määritettäessä kvantitatiivisesti BR55-2 spesifisiä humanisoituja vasta-aineita apinan seerumista. Tämä on tärkeää esim. apinan toksisuus- ja farmakokineettisissä 10 tutkimuksissa, joita vaaditaan passiiviseen immunotera-piaan tarkoitettujen humanisoitujen BR55-2 monoklonaa-listen vasta-aineiden esikliinisissä tutkimuksissa. ELISA-menetelmä on kuvattu esimerkissä 20, tyypillinen standardikäyrä ihmisen seerumista on esitetty kuvassa 15 36.
BR55-2:n kaikkien varianttien sitoutumisalueen tunnistaminen anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden avulla on myöskin osoitettu kilpailemalla BR55-2/hiiri-IgG3 sitoutumisesta anti-id BR55-2#E4:ään 20 BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl:n ja BR55-2/kimeerinen ihmis-IgG3:n avulla. Molemmat kimeerit kilpailevasta inhiboivat kanta-hiiri-monoklonaalisen vasta-aineen määrätyn konsentraation sitoutumisen anti-id BR55-2#E4 :ään annoksesta riippuvalla tavalla. Tämä kilpailu ELI-·· 25 SA-menetelmä on kuvattu esimerkissä 21 ja tulokset on esitetty kuvassa 37.
BR55-2/hiiri-IgG3:n sitoutuminen antigeenipo-sitiivinen kasvainsolulinjaan on välttämätön komplementin aikaansaamalle tuholle. Täten kasvainsytötoksi-30 suuden inhibitio anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden avulla viittaa niiden kykyyn estää Abi:n sitoutuminen antigeeniinsä solun pinnalla. Komplementti-riippuvan sytotoksisuuden SKBR5 ihmisen rintasyöpäso-luihin, joka tapahtuu BR55-2/hiiri-IgG3: avulla, mah- 35 dollinen neutralisaatio anti-id BR55-2#E4:n avulla, on esitetty kuvassa 38, kokeen yksityiskohdat esimerkissä 22.
23 111518
Kaikkien rakenteiden, joilla on BR55-2:n koskematon sitoutumisalue, erittäin korkean spesifisen tunnistamisen ansiosta, anti-id BR55-2 monoklonaalisia 5 vasta-aineita voidaan käyttää BR55-2:n kaikkien varianttien yksivaiheiseen immunologiseen puhdistukseen. Anti-id BR55-2#E4 on liitetty CH-SEpharose 4B:hen. Tätä immunoaffiniteetimateriaalia voidaan käyttää esimerkiksi in vitro tuotetun BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl suo-10 raan puhdistukseen. Kimeerisen monoklonaalisen vasta-aineen saanto oli 75%, puhtauden ollessa yli 95%. Tämän immunologisen puhdistusmenetelmän korkean selek-tiivisyyden vuoksi menetelmä on parempi verrattuna affiniteettipuhdistuksen, jossa käytetään Proteiini 15 A:ta. Kokeen yksityiskohdat ovat esimerkissä 23; SDS-PAGE on esitetty kuvassa 39. Epäpuhtauksia ei havaittu. Tätä samaa menetelmää voidaan käyttää menestyksellisesti BR55-2 humanisoidun variantin, jotka on saatu liittämällä siihen CDR, soluviljelysupernatantin te-20 hokkaaseen yksivaihepuhdistukseen.
Voidaan päätellä, että kanien ja apinoiden immunisaatio hiiri-monoklonaalisella IgGl anti-idiotyyp-pisellä vasta-aineella, joka kohdistuu BR55-2 (anti-id BR55-2#E4) spesifisyyden omaavan vasta-aineen idio-·· 25 tyyppiä vastaan, johtaa korkeatiitteriseen immuunivas teeseen, joka spesifisesti sitoutuu Lewis Y positiivinen ihmisen kasvainsoluun. Kuten on osoitettu reesus-apinoilla tehdyillä kokeilla, toistuvilla tehosteimmu-nisoinneilla antituumori-immuniteetti voidaan ylläpitää 30 vuosia. Näiden immuniosaatioiden aikaansaama Ig:n erittyminen ihmisen effektorisolujen läsnäollessa osoittaa kasvainsytotoksisuutta ADCCrssä. Anti-id immunisaation spesifisyys on osoitettu immunisoimalla reesusapinoiden kontrolliryhmä epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä. Huoli-35 matta selkeästä immuunivasteesta epäspesifiseen hiiri IgGlreen, mitään spesifistä sitoutumista kasvainsolui- 24 111518 hin ei ollut havaittavissa.
Näiden tulosten perusteella korostetaan anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöä Lewis Y kasvaimeen liittyvän antigeenin korvikkeena 5 terapeuttiseen ja ennaltaehkäisevään aktiiviseen immunisaatioon suojaavan antituumori-immuniteetin tuottamiseksi .
Lisäksi, reesusapinoiden Immunisaatio anti-id BR55-2 monoklonaalisilla vasta-aineilla johtaa korkeaan 10 immuunivasteeseen, joka myöskin selektiivisesti sitoutuu HIV-infektoituneisiin positiivisiin soluihin. Näiden solujen tiedetään ilmentävän Lewis Y:tä. Vastakohtana, reesusapinoiden immunisaatio epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä ei johda mihinkään spesifiseen sitoutu-15 miseen HIV-positiivisissa tai negatiivisissa soluissa.
Näiden tulosten perusteella korostetaan anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöä Lewis Y hiilihydraattiantigeenin korvikkeena terapeuttiseen ja ennaltaehkäisevään ihmisen rokotukseen, suojaavan 20 immuniteetin HIV:tä ja HIV-infektion aikaansaamia sairauksia vastaan tuottamiseksi.
Lisänä anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden käytölle ennaltaehkäisevänä ja terapeuttisena rokotteina, nämä sisäkuva anti-id monoklonaaliset vas-25 ta-aineet ovat käyttökelpoisia reagensseja hyvin selektiivisille ja kvantitatiivisille molekyylien määrityksille, molekyylien, joilla on BR55-2 spesifisyys, mukaan lukien kimerisoidut ja humanisoidut variantit seerumissa ja muissa kehon nesteissä. Näitä anti-id 30 monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää sopivaan matriisiin kovalenttisesti sidottuna selektiivisessä yksivaiheimmunoaffiniteettipuhdistuksessa, puhdistettaessa BR55-2 spesifisiä molekyylejä, jolloin saadaan hyvä saanto.
35 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä. Käyte tyt lyhennykset: 25 111518 ADCC: antibody dependent cellular cytotoxity= vas- ta-aineriippuva solusytotoksisuus BSA: Bovine serum albumin= häränseerumin al- 5 burniini CDC: complement dependent cytotoxicity= komple- menttiriippuva solusytotoksisuus DMEM: Dulbecco modified Eagle medium= Modifioitu
Dulbeccon Eagle alusta 10 EDC: N-etyyli-N’ - (3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidihydrokloridi ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay FCS: fetal calf serum=sikiövasikan seerumi HBS: hepes-buffered saline=hepespuskuroitu suola- 15 liuos
Mab: monoklonaalinen vasta-aine NHS: N-hydroksisukkini-imidi PBMC: peripheral blood mononuclear cells= ää- reisveren mononukleaarisolut 20 PBS: fosfaattipuskuroitu suolaliuos RAM-IgGl: rabbit anti mouse IgGl immunoglobulin = kani-anti-hiiri IgGl immunoglobuliini RPMI: Roswell Park Memorial Institute SDS: natriumdodekyylisulfaatti 25 KLH: keyhole limpet hemocyanin=avaimenreikäsimpukkahemosyaniini SPDP: N-sukkini-imidyyli-3(2-pyridyyli-ditio-pro- pionaatti) PAGE: polyakryyliamidigeelielektroforeesi 30 IEF: isoelektrinen fokussointi ,· PEG: polyetyleeniglykoli FITC: fluoreiini isotiosyanaatti IFA: immunofluoresenssi-testi 35 Esimerkeissä käytetyt materiaalit ovat seuraa- vat: 26 111518
Mikrotiitterilevyt: Immunoplates II (Nunc)
Solulinjat: 5 SKBR5: ihmisen rintasyöpäsolulinja CATO: ihmisen vatsasyöpänsolulinja SW948: ihmisen paksusuolensyöpäsolulinja SW2: ihmisen pienisolukeuhkosyöpäsolulinja 10 WM9: ihmisen melanoomasolulinja PALL: ihmisen T-solulinja SP2: hiiren myeloomasolulinja 15 Alusta A:RPMI 1640 + 2 g/1 NaHC03 100 U/ml penisilliini G 100 g/ml streptomysiinisulfaatti 4 mM glutamiini 10% FCS (lämpöinaktivoitu, γ-globuliiniton) 20
Alusta B:RPMI 1640 + 2 g/1 NaHCOs 100 U/ml penisilliini G 100 pg/ml streptomysiinisulfaatti 25 4 mM glutamiini 5% FCS (lämpöinaktivoitu)
Alusta C:DMEM
10% NCTC-135 (synteettinen alusta, (Gibco) 30 1% MEM ei-välttämättömät aminohapot (Gibco) 0,5% natriumpyruvaatti 0,5% oksaalietikkahappo 20% FCS lämpöinaktivoitu 4 mM glutamiini
35 100 U/ml penisilliini G
100 pg/ml streptomysiinisulfaatti 27 111518
Alusta D:Alusta C + 1,36 mg/ml hypoksantiini 0,39 mg/ml tymidiini 5 Alusta E:Alusta D + 0,4 mg/1 aminopteriini
Alusta F:Alusta C + hiiren tymosyyttejä (Balb/c hiiren tymosyyttejä suspendoituna 25 ml:aan alustaan C
10
Alusta G:DMEM
10% FCS lämpöinaktivoitu 4 mM glutamiini
100 U/ml penisilliini G
15 100 pg/ml streptomysiinisulfaatti
Alusta H:10 mM N-(2-hydroksietyyli)piperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo 3,4 mM etyleenidinitrilotetraetikkahappo 20 0,15 M NaCl 0,005% P20 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Ruotsi) PEG: polyetyleeniglykoli (MW=3400)
25 1 g liuotetaan 1 ml DMEM
Epätäydellinen PBS: 138,0 mM NaCl
1,5 mM KOH
2,7 mM KC1 30 6,5 mM Na2HP04 pH 7,2
Peitepuskuri: 15 mM Na2C03 35 mM NaHC03 35 3 mM NaN3 pH 9, 6 28 111518 Värjäävä puskuri: 24,3 mM sitruunahappo 51,4 mM Na2HP04 pH 5,0 5
Pesupuskuri: 2% NaCl
0,2% Triton X
riittämättömässä PBS-liuoksessa 10 Substraattiliuos: 40 mg o- fenyleenidiamiinidihydrokloridi 100 ml värjäävä puskuri 20 μ1 H202 30% 15 Sitova puskuri:0,1 M Tris/HCl 0,2 M NaCl pH 7,5
Eluutiopuskuri:0,15 M glysiini/HCl 20 0,2 M NaCl pH 2,8
Kytkentäpuskuri: 0,1 M NaHCC>3 0,5 M NaCl pH 8,0 25
Esimerkki 1: Anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta- aineiden kehittäminen 1.1: Hiirten immunisaatio 30 .* Balb/c hiiret immunisoitiin 100 pg:lla BR55- 2/hiiri-IgG3:n F (ab')2-fragmenttia, joka oli liitetty KLH:in (keyhole limpet hemocyanine) SPDP:n avulla kuten on esitetty julkaisussa J.Carlsson et ai., Biochem.J.
35 173, 723, 1978, injektoimalla vatsakalvonontelonsisäi- sesti noudattaen seuraavaa menettelyä: 29 111518 päiväO 0: 100 pg konjugaattia (1 mg/ml epätäydel lisessä PBS-puskurissa) + Freundin täydellinen adjuvantti 5 päivä 7 ja 28: 100 pg konjugaattia (1 mg/ml epätäydellisessä PBS-puskurissa + Freundin epätäydellinen adjuvantti io Päivinä 8, 9, 10 ja 11 primääri-immunisaation jälkeen kaikkiaan 4 tehosteinjektointia (100 pg konjugaattia 100 pl:ssa epätäydellistä PBS-puskuria) annetaan suonensisäisesti. Päivänä 12 pernat otetaan talteen aseptisesti, liuotetaan epätäydelliseen PBS-pusku- 15 riin ja pestään kolmesti epätäydellisellä PBS-puskuril- la.
1.2: Hybridisaatio 20 Nämä pernasolut lisätään SP2/0 solujen suspen sioon suhteessa 1:1 ja sentrifugoidaan 900 x g viiden minuutin ajan. 1 ml PEG-liuosta (37°C) lisätään tipoit-tain solupellettiin yhden minuutin aikana ja laimennetaan 1 ml :11a epätäydellisistä PBS-puskuria seuraavan ,j 25 minuutin aikana. 10 ml alustaa C lisätään samanaikai sesti varovasti sekoittaen ja suspensio laimennetaan 50 ml:ksi epätäydellisellä PBS-puskurilla. Suspensio sentrifugoidaan 800 x g viiden minuutin ajan, pelletti sus-pendoidaan alustaan D ja solut siirretään mikrotiitte- 30 rilevyn (Nunc 96) kuoppiin konsentraationa 2,5 χ 105 "V solua/kuoppa. Yli yön inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa, 5% C02, alustaa E lisätään 100 pl/kuoppa. 72 tunnin ja sen jälkeen joka neljännen päivän jälkeen alusta korvataan alustalla D.
35 30 111518
Esimerkki 2: Hybridoomasupernatanttien hiiri-IgG:n kvantitatiivinen määrittäminen 100 μΐ kani-anti-hiiri-IgG-liuosta (esim.
5 Nordic'in reagenssi, 1:1000 peitepuskurissa) lisätään mikrotiitterilevyn kuoppiin ja inkuboidaan 37°C:ssa 60 minuuttia. Levyt pestään kuusi kertaa pesupuskurilla, 200 μΐ epätäydellistä PBS-puskuria/5% FCS lisätään ja inkuboidaan 30 minuuttia 37°C. Levyt pestään kuten 10 edellä on kuvattu. 100 μΐ hybridoomasupernatanttien liuosta, joka on saaatu kahden viikon kasvatuksen jälkeen, lisätään ja levyjä inkuboidaan 60 minuuttia 37°C. Sitoutumaton vasta-aine huuhdellaan pois kuten edellä on kuvattu ja 100 μΐ peroksidaasiin liitetyn vasta-15 aineen liuosta (kani-anti-hiiri-IgG/peroksidaasi,esim. Dianovan reagenssit; 1:1000 PBS-puskurissa/2%FCS) lisätään. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa levyt pestään 4 kertaa pesupuskurilla ja kahdesti värjäyspus-kurilla. 100 μΐ substraattiliuosta lisätään ja värin-20 muodostus lopetetaan 5 minuutin kuluttua 50 pl:lla 4 N H2SO4. Fotometrinen ekstinktio mitataan aallonpituudella 492 nm (referenssimittaus 620nm).
Esimerkki 3: Hybridoomasupernatantti IgG:n spesifinen ·· 25 sitoutuminen BR55-2 F (ab')2 -fragmenttiin (ELISA)
Hybridoomat, jotka tuottavat riittävästi hii-ri-IgG (esim. enemmän kuin 10-kertainen optinen tiheys verrattuna alustan nollakokeeseen) alikloonataan yksi-30 soluviljelmäksi F-alustalla ja viljellään alustalla C vielä 2 viikkoa. Supernatantit testataan kuten on kuvattu esimerkissä 2, käyttäen 100 μΐ BR55-2 F(ab')2~ fragmentin liuosta (10 μΐ/ml; laimennus peitepuskurissa) .
35 31 111518
Esimerkki 4: BR55-2/hiiri-IgG2a:n sitoutumisen esto SKBR5 ihmisen rintasyöpäsoluihin hybridoomasupernatant-ti-IgG:llä (solu-ELISA) 5 Kaikki hybridoomasupernatantit, jotka ovat positiivisia yllämainitussa testissä testataan seuraavasti :
Mikrotiitterilevyt esikäsitellään poly-L-ly-siini hydrobromidilla (20-30 kD; 20 pg/ml epätäydelli-10 sessä PBS-puskurissa; 100 μΐ/kuoppa; 30 minuuttia; huoneenlämpötila) pestään kahdesti epätäydellisellä PBS-liuoksella (200 μΐ/kuoppa) ja. sen jälkeen inkuboi-daan yön yli 4 °C lämpötilassa yhdessä 50 μΐ/kuoppa SKBR solususpensiota B-alustassa (4 χ 106 solua/ml). 15 Supernatantin poiston jälkeen solut kiinnitetään 50 μΐ.-lla glutaraldehydiä/kuoppa (0,1 % fysiologisessa suolaliuoksessa) 5 minuutin ajan huoneenlämmössä, . su-pernatantit poistetaan, solut suspendoidaan 200 μΐ/kuo-ppa epätäydelliseen PBS-liuokseen/1% BSA/0,1% NaN3 ja 20 jätetään yhdeksi tunniksi huoneenlämpötilaan. Superna-tantit poistetaan ja levyt pestään kahdesti 200 μΐ/kuoppa PBS-liuoksella, jossa on 0,05% Tween 20.
Hybridoomasupernatantit, joiden pitoisuus on sovitettu 1 pg/ml hiiri-IgG, preinkuboidaan 10-kertai-” 25 sessa ylimäärässä epäspesifistä hiiri-IgG 30 minuuttia 37 °C. Sitten nämä näytteet preinkuboidaan yhdessä 0,5 pg/ml BR55-2/hiiri IgG2a:n kanssa 30 minuuttia 37 °C. 100 μΐ tätä seosta lisätään soluihin ja levyjä inkuboi-daan 1 tunti 37 °C.
30 Seoksen teko: Sitoutumaton vasta-aine pestään kahdesti 100 μΐ/kuoppa jääkylmällä PBS-liuoksella, joka * sisältää Tween 20. 100 μΐ peroksidaasiin konjugoitua vasta-aineliuosta (kani-antihiiri-Ig2a/peroksidaasi, esim. Zymedin reagenssi; 1:1000 epätäydellisessä PBS-35 liuoksessa/2% FCS) lisätään. 45 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa, kuopat pestään kolmesti yllä maini- 32 111518 tulla PBS/Tween 20-liuoksella ja sen jälkeen 100 μΐ substraattiliuosta lisätään jokaiseen kuoppaan. 5 minuutin kuluttua värinmuodostus lopetetaan lisäämällä 50 μΐ 4 N H2SO4 /kuoppa. Vasta-aineen sitoutuminen 5 soluihin määritetään niittämällä ekstinktio aallonpituudella 492nm (referenssimittaus 620nm).
Esimerkki 5: Anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta- aineiden immunoaffiniteettipuhdistus 10 5.1: BR55-2/hiiri-IgG2a Sepharosen valmistus
10 g kylmäkuivattua aktivoitua CH-Sepharose 4B:tä suspendoidaan ImM HC1, siirretään sintterilasisu-15 otimeen ja pestään 2 1:11a 1 mM HC1 15 minuutin ajan. Ligandi (120 mg BR55-2/hiiri-IgG2a) liuotetaan 50 ml kytkentäpuskuriin, sekoitetaan pestyn geelin kanssa suljetussa astiassa sekoittaen ylösalaisin yhden tunnin ajan huoneenlämmössä. Geeli pestään kytkentäpuskurilla 20 ja inkuboidaan yhden tunnin ajan 50 ml 1 M etanoliamii-nin kanssa jäljelle jäävien aktiivisten ryhmien inakti-voimiseksi. Affiniteettisorbentti pestään kolmessa eri vaiheessa vaihtelevissa pH-arvoissa. Jokainen vaihe sisältää pesun pH-arvolla 4 (0,1 M asetaatti, 0,5 M
···' 25 NaCl) , jota seuraa pesu pH-arvolla 8 (0,1 M Tris, 0,5 M
NaCl).
5.2: Anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden eristäminen 30
Kromatografia tehdään 4 °C lämpötilassa. Ko-lonni (BIO REX MP kolonni halkaisija 1,5 cm) on täytetty monoklonaalisella vasta-aineella BR55-2/hiiri IgG2a Sepharose (tilavuus 35 ml) . Geeli pestään sito-35 mis- ja eluutiopuskurilla. Sitomispuskurilla tehdyn tasapainotuksen jälkeen alusta, joka sisältää anti-id 33 111518 BR55-2, laitetaan kolonniin virtausnopeudella 15 ml/m-in. Läpimenneen fraktion eluution jälkeen, sitoutunut anti-id BR55-2 desorboidaan eluutiopuskurilla ja neutralisoidaan välittömästi desorption jälkeen 1 M Tris/-5 HC1 puskurilla pH 7,5.
5.3: Anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden konsentrointi 10 Eluoidun vasta-aineliuoksen konsentrointi (0,12 mg/ml) tehdään sekoitetussa Amicon ultrasuodatus-kennossa käyttäen PM Diaflo membraania. Liuotteen esto IgG:lle on yli 98%, lopullinen IgG:n konsentraatio on 3,7 mg/ml.
15
Esimerkki 6: Puhdistettujen anti-id BR55-2 monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi 6.1: Ioninvaihtokromatografia Mono Q:lla 20
Kolonni: Mono-Q HR5/5 (Pharmacia)
Puskuri A: 20mM tri etanoliamiini, pH 7,7 Puskuri B: 20mM trietanoliamiini, 1 M NaCl, pH 7,7 Virtausnopeus: 1 ml/min ·· 25 Detektio: UV 280 nm
Gradientti: lineaarinen 2%/min
Tulokset: >95% puhtaus todettu kaikissa anti-id BR55-2 monoklonaalisissa vasta-aineissa 30 6.2: Korkean erotuskyvyn koko-ekskluusio-kromatografia •
Kolonni: Zorbax GF250, 9,4 x 250 mm
Puskuri: Natriumfosfaatti 0,1 M, 0,2 M NaCl, pH
7,0 35 Virtausnopeus: 1 ml/min Detektio: UV 280 nm 34 111518
Tulokset: >95% puhtaus todettu kaikissa anti-id BR55-2 monoklonaalisissa vasta-aineissa.
5 6.3: SDS-PAGE
Kokeet tehdään pelkistävissä ja ei-pelkistä-vissä olosuhteissa Laemmli'n menetelmän mukaan käyttäen 10% akryyliamidigeeliä. Epäpuhtauksia ei havaittu (tulo lokset on esitetty kuvassa 1).
6.4: Isoelektrinen fokusointi
Analyysi tehdään Phast-menetelmällä (Pharma-15 cia) käyttäen pH-gradienttiä 3-9 (Phast geeli IEF 3-9) hopeavärjäystä (tulokset on esitetty kuvassa 2).
il
Esimerkki 7: BR55-2/hiiri IgG3 sitoutumisen esto SKBR5 solulinjaan (solu-ELISA) puhdistettujen anti-id mono-20 klonaalisten vasta-aineiden vaikutuksesta
Mikrotiitterilevyjen esikäsittely suoritettiin kuten esimerkissä 4. Vastaava anti-id BR55-2 monoklo-naalinen vasta-aine laimennetaan epätäydellisessä ΡΕΕΙ.; 25 liuoksessa, joka sisältää 2% FCS (10:stä 0,5:een pg/ml). Jokaiseen näistä laimennoksista lisätään 1 pg/ml BR55-2/hiiri IgG3. 100 μΐ tätä liuosta lisätään soluihin ja levyjä inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C.
Seos käsitellään kuten esimerkissä 4. BR55-2/hiiri 30 IgG3:n sitoutumisaste soluihin määritettiin mittaamalla ekstinktio aallonpituudella 492 nm (referenssimittaus aallonpituudella 620nm).
Esimerkki 8: Kanien ja reesusapinoiden immunisointi 35 anti-id BR55-2#E4 vasta-aineella 35 111518 8.1: Kanien immunisointi anti-id BR55-2#E4 vasta-ai neella
Kolme naaraspuolista chincillakania immunoi-5 daan ihonsisäisesti 300 pg:lla anti-id BR55-2#E4, joka oli adsorboitu alumiinihydroksidiin (1 mg vasta-ainetta + 3.3 mg Al(OH)3/ml PBS-liuos), päivinä 1, 8, 15 ja 36. Kolme kania immunisoidaan samalla määrällä epäspesifistä hiiri-IgGl negatiivisena kontrollina samoissa olo-10 suhteissa. Seerumit kerättiin ennen immunisointia ja viikolla 9 ensimmäisen immunisoinnin jälkeen.
8.2: Reesusapinoiden immunisointi anti-id BR55-2#E4 vasta-aineella 15
Kolme reesusapinaa immunisoitiin ihonalaisesti (s.c.) 0.1 mg:11a anti-id BR55-2#E4/kg adsorboituna alumiinihydroksidiin (1 mg vasta-ainetta + 3.3 mg Al(OH)3/ml PBS-liuos), päivinä 1,8, 15 ja 36. Kaksi 20 reesusapinaa immunisoitiin samalla määrällä epäspesifistä hiiri-IgGl vasta-ainetta negatiivisena kontrollina samoissa olosuhteissa. Seerumit kerättiin ennen immunisointia ja viikoilla 4 ja 9 ensimmäisen immunisoinnin jälkeen.
25 Kaksi vuotta alkuperäisen rokotusohjelmaan jälkeen samat apinat saivat ihonalaisesti (s.c.) ensimmäisen tehosteinjektion anti-id BR55-2#E4:ä tai vastaavasti epäspesifistä hiiri-IgGl (sama määrä ja sama muoto kuin edellä). Seerumit kerättiin ennen ja 1 ja 4 30 viikkoa tämän ensimmäisen tehosteimmunisoinnin jälkeen.
T Kolme vuotta alkuperäisen rokotusohjelman jälkeen (=yksi vuosi ensimmäisen tehosteinjektion jälkeen) samat apinat saivat toisen ihonalaisen (s.c.) tehosteinjektion anti-id BR55-2#E4 tai vastaavasti 35 epäspesifistä hiiri-IgGl (sama määrä ja sama muoto kuin edellä). Seerumit kerättiin ennen ja 1, 4 ja 9 viikkoa 111518 36 toisen tehosteimmunisoinnin jälkeen.
Esimerkki 9: Kanin seerumin Ig:n sitoutuminen SKBR5- tai WM9-solulinjaan (solu-ELISA) 5
Mikrotiitterilevyjen esikäsittely tehtiin kuten esimerkissä 4. 100 μΐ kanin seerumia sopivissa laimennoksissa lisätään soluihin ja levyjä inkuboidaan yksi tunti 37 °C. Vasta-aineen sitoutuminen soluihin 10 määritetään mittaamalla ekstinktio aallonpituudella 492 nm (referenssimittaus aallonpituudella 620nm).
Esimerkki 10: Reesusapinan seerumin Ig:n tai immunolo-gisesti puhdistetun Ig:n (AB3) sitoutuminen SKBR5, 15 CATO, SW948, SW2 ja WM9 ihmisen kasvainsolulinjaan (solu-ELISA)
Mikrotiitterilevyjen esikäsittely tehdään kuten esimerkissä 4. 100 μΐ reesusapinan seerumia tai 20 immunologisesti puhdistettua reesusapinan Ig:tä (katso myös esimerkki 12) ja BR55-2 humanisoitu IgGlrä kontrollina lisätään sopivina laimennoksina soluihin ja inkuboidaan yksi tunti 37 °C. Seos käsitellään kuten esimerkissä 4. Vasta-aineen sitoutuminen soluihin mää-25 ritetään mittaamalla ekstinktio aallonpituudella 492 nm (referenssimittaus aallonpituudella 620nm).
Esimerkki 11: Reesusapinan seerumin Ig:n tai immunologisesti puhdistetun Ig (AB3):n sitoutuminen SKBR5- tai 30 WM9 kasvainsolumembraanivalmisteisiin (ELISA)
Lewis Y antigeenipositiivinen SKBR5 rintasyö-päsolulinjan membraanit ja Lewis Y antigeeni negatiivinen WM9 melanooma solulinjamembraanit valmistetaan 35 kuten on kuvattu artikkelissa D.Thorn et ai., Biochem.J. 168, 187-194 (1977) . 100 μΐ vastaavaa membraanivalmis- 37 111518 tetta (10 μg/ml; laimennus peitepuskurissa) lisätään mikrotiitterilevyn kuoppiin ja inkuboidaan +4°C yön yli. Levyt pestään neljä kertaa pesuliuoksella, 200μ1 epätäydellistä PBS-liuosta/5% FCS lisätään ja inkuboi-5 daan 30 minuuttia 37 °C. Levyt pestään kuten edellä on kuvattu. 100 μΐ reesusapinan seerumia tai immunologi-sesti puhdistettua reesusapinan Ig (katso muös 2) sopivissa laimennoksissa epät. PBS-liuosta/2% FCS lisätään ja levyjä inkuboidaan 60 minuuttia 37°C. Sitoutumaton 10 vasta-aine pestään pois kuten on kuvattu edellä ja 100 μΐ peroksidaasikonjugoitua vasta-ainetta (vuohi-anti-ihminen-Ig/peroksidaasi, esim. Chemicon & Co. reagens-si, 1:1000 PBS/2% FCS-liuoksessa) lisätään. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa, levyt pestään kahdesti 15 pesupuskurilla ja kahdesti värjäyspuskurilla.
100 μΐ substraattiliuosta lisätään ja värin-muodostus lopetetaan 5 minuutin kuluttua 50 pl:lla 4N H2SO4 liuosta. Optinen tiheys mitataan aallonpituudella 492 nm (referenssimittaus aallonpituudella 620nm).
20
Esimerkki 12: Anti-id BR55-2#E4(AB3):11a immunisoidun reesusapinan Ig:n immunoaffiniteettipuhdistus käyttäen anti-id BR55-2#E4-Sepharosea 25 12.1: Anti-id BR55-2#E4-Sepharosen valmistus 9 g kylmäkuivattua aktivoitua CH-Sepharose 4B:tä suspendoidaan 1 mM HCl-liuokseen, siirretään sintterilasisuotimeen ja pestään 2 1:11a 1 mM HC1 15 30 minuutin ajan. Ligandi (95 mg anti-id BR55-2#E4) liuo-T tetaan 50 ml kytkentäpuskuria, sekoitetaan pestyn gee lin kanssa suljetussa astiassa ylösalaisin huoneenlämmössä. Geeli pestään kytkentäpuskurilla ja inkuboidaan yhden tunnin ajan 50 ml 1 M etanoliamiinia jäljelle 35 jäävien aktiivisten ryhmien inaktivoimiseksi. Affini-teettisorbentti pestään kolmessa vaiheessa vaihtele- 38 111518 villa pH-arvoilla. Jokaisessa vaiheessa on pesu pH:ssa 4 (0.1 M asetaatti, 0.5 M NaCl) jota seuraa pesu pH:ssa 8 (0.1 M Tris, 0.5 NaCl).
5 12.2: Anti-id BR55-2#E4:11a immunisoidun reesusapinan seerumin Ig (AB3) eristäminen
Kromatografia tehdään 4 °C lämpötilassa. Ko-lonni (Pharmacia kolonni HR5/2, alustan koko 5 x 25 mm) 10 täytetään anti-id BR55-2#E4-Sepharose-täytteellä (tilavuus 0,5 ml). Geeli pestään sitovalla puskurilla ja eluutiopuskurilla. Lähtöaineet ovat 2 ml anti-id BR55-2#E4 immunisoidun reesusapinan seerumia, joka on saatu 9 viikkoa immunisaation jälkeen. Toiseen koesarjaan 15 otettiin 4 ja 9 viikkoa toisen tehosteen jälkeen kerättyä ja yhdistettyä reesusapinan seerumia 2 ml. Tämä seerumi laimennettiin 1:2 sitovassa puskurissa ja laitetaan kolonniin. Läpimenneen fraktion eluution jälkeen sitoutunut reesusapinan immunoglobuliini desorboidaan 20 eluutiopuskurilla ja neutralisoidaan välittömästi desorption jälkeen 1 M Tris/HCL puskurilla pH 7.5.
Esimerkki 13: Anti-id BR55-2#E4:11a tai epäspesifisellä hiiri-IgGl:llä immunisoidun reesusapinan seerumin Ig:n ·· 25 tai immunologisesti puhdistetun Ig:n sitoutuminen anti- id BR55-2#E4:ään (ELISA) 100 μΐ anti-id BR55-2#E4 (10 pg/ml; laimennus peitepuskuriin) lisätään mikrotiitterilevyn kuoppiin ja 30 inkuboitiin 37 °C lämpötilassa 60 minuuttia. Levyt pestään 6 kertaa pesupuskurilla, 200 μΐ epätäydellistä * PBS-puskuria/5% FCS lisätään ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C lämpötilassa. Levyt pestään kuten aiemmin on esitetty. Apinan seerumi tai immunologisesti puhdistet-35 tu apinan Ig laimennetaan epätäydellisellä PBS/5% FCS-liuoksella. 100 μΐ näitä näytteitä lisätään mikrotiit- 39 111518 terilevyn kuoppiin ja inkuboidaan 60 minuuttia 37 °C lämpötilassa. Sitoutumaton vasta-aine pestään pois kuten on aiemmin esitetty ja 100 μΐ peroksidaasiin konjugoitua vasta-ainetta (vuohi-anti-ihminen Ig/perok-5 sidaasi, esim Chemicon & Co reagenssit, 1:1000 PBS/2%-FCS-liuoksessa) lisätään. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C lämpötilassa levyt pestään 4 kertaa pesu-puskurilla ja kahdesti värjäävällä puskurilla. 100 μΐ substraattiliuosta lisätään, värinmuodostus lopetetaan 10 5 minuutin jälkeen 50 plrlla 4 N H2SC>4-liuosta. Optinen tiheys mitataan aallonpituudella 492 nm (referenssi mitataan aallonpituudella 620nm).
Esimerkki 14: Vasta-aineesta riippuva soluvälitteinen 15 sytotoksisuus (ADCC) käyttäen ihmisen PBMC:tä SKBR5-soluihin välittäjänä toimiessa immunologisesti puhdistettu apina-Ig (AB3) tai BR55-2/hiiri IgG3
Koetta edeltävänä päivänä SKBR5 solut siirre-20 tään tuoreeseen kasvualustaan A ja pidetään 37 °C läm-pötilassa/5% CO2 solukasvatusastiassa.
Kohdesolujen 51Cr leimaus:
Solut kerätään solukasvatusastiasta ja inku-··· 25 boidaan konsentraatiolla 5 x 106 solua 800 μϊ^εβ kasvatusalustaa A 37 °C lämpötilassa /5% CO2 yhden tunnin ajan yhdessä 100 pCi Na251Cr04 kanssa. Sen jälkeen solut pestään kasvatusliuoksella A 51Cr-ylimäärän poistamiseksi, liuotetaan tuoreeseen alustaan 30 A, ja niiden konsentraatio asetettiin 2.5xl05 solua/ml.
• PBMC:n eristäminen: 50 ml heparinisoitua tuoretta ihmisen verta laimennetaan 60 ml :11a täydellistä PBS-liuosta, joka 35 sisältää 0.1% glukoosia. 15 ml tätä liuosta asetetaan 15ml:n Ficoll-Paque liuoksen päälle ja putkia sentrifu- 40 111518 goidaan 400 x g kolmestakymmenestä kuuteenkymmeneen mi-nuttiin. Plasmasupernatantit heitetään pois, PBMC kerrokset kerätään ja laimennetaan 50 ml:aan täydellistä PBS-liuosta + 0.1% glukoosia. 80 x g sentrifugoinnin 5 (10 minuuttia) jälkeen pelletti liuotetaan 25-30 ml:aan täydellistä PBS-liuosta + 0.1 % glukoosia, ja sentrifu-goidaan uudelleen (80 x g, 10 minuuttia), pelletti kerätään, suspendoidaan kasvatusalustaan A, solut lasketaan ja suspensio laimennetaan kasvatusliuoksella A 10 konsentraatioon noin 2xl06 - 9xl06solua/ml. 100 μΐ liuosta pipetoidaan jokaiseen mikrotiitterilevyn kuoppaan ja effektorisoluja inkuboidaan yön yli 37 °C lämpöti-lassa/5% CO2.
15 ADCC: 100 μΐ 51Cr-leimnattuja kohdesoluja lisätään esikasvatettuhin effektorisoluihin halutussa suhteessa effektorisoluja/kohdesoluja. 50 μΐ immunologisesti puhdistettua apina-Ig (AB3) tai BR55-2/hiiri IgG3 epä-20 täydellisellä PBS-liuoksella haluttuun konsentraatioon laimennettuna lisätään ja levyä inkuboidaan yön yli (noin 18 tuntia) 37 °C lämpötilassa/5% CO2. Tämän jälkeen supernatantit kerätään Skatron-Harvesting Press-laitteella ja lasketaan γ-laskurilla. Tällöin saadaan ·· 25 kokeellisen vapautumisen arvo (= experimental release).
Kokonais 51Cr vapautuminen määritetään kuten edellä korvaamalla PBMC 100 pl:lla 2 %SDS, 50mM Na2C03 ja lOmM EDTA ja korvaamalla vasta-aineliuos 50 pl:lla epätäydellistä PBS-liuosta. Spontaani 51Cr-vapautuminen 30 saadaan korvaamalla PBMC 100 plrlla kasvatusalustaa A .* ja korvaamalla vasta-aineliuos 50 pl:lla epätäydellistä PBS-liuosta.
Tulostenlaskemisen jälkeen lasketaan seuraavasti: 35 41 111518
Hajoaminen % =
Kokeellinen vapautuminen - spontaani vapautuminen -------------------------------------------------- % 5 Kokonaisvapautuminen - spontaani vapautuminen
Esimerkki 15: Reesusapinan seerumin, immunologisesti puhdistetun reesusapinan Ig:n tai BR55-2/hiiri IgG3:n sitoutuminen HIV-infektoituneisiin/ei-infektoituneisiin 10 PALL-soluihin (epäsuora immunofluoresenssi, IFA-anti-HlVl-pakkaus Waldheim)
Kaupallisesti saatavissa olevassa testipakkauksessa (Waldheim & Co; tarkoitettu HIV-seropositii-15 visuuden määrittämiseen) HIV-infektoidut ja ei-infek-toidut PALL-solut (ihmisen T solulinja) on kiinnitetty objektilaseihin. Koejärjestelyt perustuvat valmistajan ohjeisiin. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C lämpötilassa 1 % BSA-liuoksen kanssa, objektilaseja inkuboi-20 daan reesuapainan seerumin (konsentroitu ja laimennettu 1:10 epätäydellisessä PBS-liuoksessa) tai immunologisesti puhdistetun reesusapinan Ig:n (AB3) kanssa, joka on laimennettu tavalliseen ihmisen seerumiin, tai BR55-2/hiiri IgG3:n kanssa yhden tunnin ajan 37 °C lämpöti-25 lassa. HIV positiivinen ihmisen seerumi (mukana osana testipakkausta) on positiivinen kontrolli, normaali ihmisen seerumi taas negatiivinen kontrolli. Testinäyt-teiden sitoutumattomat determinantit poistetaan pesemällä kolmesti epätäydellisellä PBS-liuoksella ja 1:20 30 laimennettua anti-ihminen-IgG-FITC reagenssia (osa testipakkausta) epätäydellisessä PBS-liuoksessa, joka sisältää 2% FCS tai anti-hiiri-IgG-FITC (hiiri mono-klonaalisten vasta-aineiden tunnistamista varten) lisätään. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37°C lämpötilas-35 sa, kolmen epätäydellisellä PBS-liuoksella pesun jälkeen ja levyjen upottamisen jälkeen, immunofluoresenssi mitataan fluoresenssimikroskoopissa ja pisteytetään (0= 42 111518 ei fluoresenssia, 5= maksimifluoresenssi)
Esimerkki 16: ELISA-menetelmä immunoreaktiivisen BR55-2/hiiri IgG3:n tai BR55-2/hiiri IgG2a:n määrittämiseen 5 ihmisen seerumista käyttäen anti-id BR55-2#E4 100 μΐ anti-id BR55-2#E4 vasta-ainetta (10pg/-ml;laimennus peitepuskurissa) lisätään mikrotiitteri-levyjen kuoppiin ja inkuboidaan 37°C lämpötilassa 60 10 minuuttia. Levyt pestään 6 kertaa pesupuskurilla, 200 μΐ epätäydellistä PBS-liuosta/5% FCS lisätään ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C lämpötilassa. Levyt pestään kuten aiemmin on kuvattu. Ihmisen seerumia, jossa on joko BR55-2/hiiri-IgG3 tai BR55-2/hiiri-IgG2a-vasta-15 ainetta sopivissa laimennoksissa epätydellisessä PBS/2% FCS-liuoksessa, testataan. 100 μΐ näitä näytteitä lisätään mikrotiitterilevyn kuoppiin ja inkuboidaan 60 minuuttia 37 °C lämpötilassa. Standardina käytetään BR55-2/hiiri-IgG3 tai BR55-2/hiiri-IgG2a laimennettuna 20 normaaliin ihmisen seerumiin konsentraatioon 10 μΐ/ml. Sopivat laimennukset epätäydellisessä PBS/2% FCS-liuoksessa käsitellään kuten edellä on esitetty. Sitoutumaton vasta-aine pestään pois kuten esitetty aiemmin ja 100 μΐ peroksidaasiin konjugoitua vasta-ainetta (kani-·· 25 anti-hiiri IgG3/peroksidaasi tai kani-anti-hiiri-IgG2a- /peroksidaasi, esim. Zymedin reagenssit, 1:1000 PBS/2% FCS-liuoksessa) lisätään. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C lämpötilassa, levyt pestään 4 kertaa pesu-puskurilla ja kahdesti värjäyspuskurilla.
30 100 μΐ substraattiliuosta lisätään ja värin- muodostus lopetetaan 5 minuutin jälkeen 50 piillä 4 N H2SO4. Optinen tiheys (OD) mitataan aallonpituudella 492 nm (referenssi mitataan aallonpituudella 620 nm)
Seeruminäytteiden optisen tiheyden arvot lue-35 taanstandardikäyrältä ja ilmoitetaan pitoisuutena pg-/ml.
43 111518
Esimerkki 17: ELISA-menetelmä immunoreaktiivisen BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl:n määrittämiseksi ihmisen seerumista käyttäen anti-id BR55-2#E4 5 BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl sisältävää ihmisen seerumia testataan kuten on kuvattu esimerkissä 16, käyttäen peroksidaasikonjugoitua vasta-ainetta (vuohi-anti-ihminen IgG/peroksidaasi, esim. Chemicon & Corn 10 reagenssit, 1:1000 PBS/2%FCS-liuoksessa).
Esimerkki 18: ELISA-menetelmä immunoreaktiivisen BR55-2/kimeerinen ihmisen IgG3:n määritys ihmisen seerumissa käyttäen anti-id BR55-2#E4 15 BR55-2/kimeerinen ihmis-IgG3 vasta-ainetta sisältävä ihmisen seerumi testataan kuten on kuvattu esimerkissä 17.
20 Esimerkki 19: BR55-2/kimeerinen ihmis-IgGl ja BR55- 2/humanisoitu IgGl-vasta-aineen reaaliaikainen bios-pesifinen vuorovaikutusanalyysi anti-id BR55-2 mono-klonaalisten vasta-aineiden kanssa ·· 25 Kokeet suoritettiin Pharmacia Biosensor AB:n (Uppsala, Ruotsi) BIAcore™-laitteella. BR55-2/kimeeri-nen ihmis-IgGl:n tai BR55-2/humanisoitu IgGlrn sitoutuminen erilaisiin hiiri-IgGl anti-id BR55-2 monoklo-naalisiin vasta-aineisiin, jotka tarttuvat immobilisoi-30 tuun RAM-IgGl:iin (esim. reagenssi Pharmacialta Biosensor AB, Uppsala,Ruotsi) määritettiin käyttäen reaaliaikaista biospesifistä vuorovaikutusanalyysia.
Järjestelmän virtausnopeudeksi asetettiin 5 μΐ/minuutti. Anturisiru aktivoitiin seoksella 0.201 mg 35 NHS ja 1.313 mg EDC liuotettuna tislattuun veteen. RAM-IgGl liuotettuna 35 pl:aan lOmM natriumasetaattipusku- 44 111518 ria pH 5.0 konsentraatiolla 30 pg/ml reagoi aktivoidun anturin pinnan kanssa. Jäljelle jäävät aktivoidut koh-. dat suljettiin 35 plrlla 1 M etanoliamiinihydroklori-di/NaOH pH 8.5.
5
Analyysi tehtiin kolmessa vaiheessa: . 1) Vastaava anti-id BR55-2 monoklonaalinen vasta-aine (E4,C11,B3,B9,G6,G9) liuotettiin alustaan H lopullisen 10 konsentraation ollessa 10 - 17 pg/ml. Jokaisessa analyysissä anti-idiotyyppinen vasta-aine sidottiin RAM-IgGl:een, laskemalla 35 μΐ tätä liuosta sensoripinnan ylle. "Vaste yksiköt", jotka ovat verrannollisia sito-tuneen anti-id BR55-2 monoklonaalisen vasta-aineen 15 massaan mitattiin ja tallennettiin.
2) 20μ1 hiiri/ihmis-kimeerinen-IgGl ja humanisoitu IgGl laimennosta alustassa H, konsentraatiolla 1 - 100 μg/ml injektoitiin ja annettiin sitoutua saatuun anti-id:hen.
20 "Vaste yksiköt", jotka ovat verrannollisia sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen massaan mitattiin ja tallennettiin.
3) Sensorin pinta regeneroitiin seuraavaa analyysiä
-·· 25 varten 5 pl:lla 1 M muurahaishappo ja 5 pl:lla 8 M
ureaa.
Sitoutumisaste määritettiin laskemalla "vas-teyksikköjen" maksimin, joka oli saatu toisella vasta-aineella (BR55-2/kimeerinen ihmisen IgGl tai BR55-2/hu-30 manisoitu IgGl) ja "vasteyksikköjen" maksimin, jotka oli saatu ensimmäisellä vasta-aineella (vastaava anti-idiotyyppinen monoklonaalinen vasta-aine), suhde.
Esimerkki 20: ELISA-menetelmä immunoreaktiivisen BR55-35 2/humanisoitu IgGl määrittämiseen ihmisen seerumista anti-id BR55-2#E4 käyttäen 45 111518 BR55-2/humanisoitu IgGl sisältävä ihmisen . seerumi testataan kuten on kuvattu esimerkissä 17.
5 Esimerkki 21: BR55-2/hiiri IgG3 sitoutumisen kilpailu anti-id BR55-2#E4:ään BR55-2 kimeerinen-ihmis-IgGl:11a tai BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgG3:11a 100 μΐ anti-id BR55-2#E4 (10 pg/ml; laimennus 10 peitepuskurissa) lisätään mikrotiitterilevyn kuoppiin ja inkuboidaan 37 °C lämpötilassa 60 minuuttia.
Levyt pestään 6 kertaa pesupuskurilla, 200 μΐ epätäydellistä PBS/5% FCS-liuosta lisätään ja inkuboidaan 30 minuuttia 37 °C lämpötilassa. Levyt pestään 15 kuten aiemmin on esitetty. Kimeerinen ihmis-IgGl tai kimeerinen ihmis-IgG3 laimennettiin epätäydellisessä PBS/2% FCS-liuoksessa (0.5 pg/ml - 3 ng/ml). Jokaiseen laimennokseen lisätään 0.05 pg/ml BR55-2/hiiri-IgG3. 100 μΐ näitä seoksia lisätään mikrotiitterilevyn kuop-20 piin ja inkuboidaan 60 minuuttia 37 °C lämpötilassa. Sitoutumaton vasta-aine pestään pois kuten aiemmin on kuvattu ja 100 μΐ peroksidaasikonjugoitua vasta-ainetta (vuohi-anti-ihmis-IgG3/peroksidaasi, esim. Chemicon reagenssi; 1:1000 PBS/2% FCS-liuoksessa) lisätään.
... 25 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C lämpöti lassa, levyt pestään 4 kertaa pesupuskurilla ja kahdesti värjäyspuskurilla.
100 μΐ substraattiliuosta lisätään ja värin-muodostus lopetetaan 5 minuutin kuluttua 50 plrlla 4 N 30 H2SO4. Optinen tiheys määritetään aallonpituudella 492 nm (referenssi mitataan aallonpituudella 620nm).
Esimerkki 22: BR55-2/hiiri-IgG3:n välittämä komplementti riippuva sytotoksisuus (CDC) SKBR5 solulinjaan -35 Anti-id BR55-2#E4:n aiheuttama inhibitio 46 111518
Testiä edeltävänä päivänä SKBR5 solut siirretään tuoreeseen alustaan A ja pidetään solukasvatusas-tiassa 37 °C/5% CO2.
5 Kohdesolujen 51Cr-leimaus
Solut kerätään solukasvatusastiasta ja inku-boidaan konsentraatiolla 5xl06 solua 800 piissä alustaa A 37 °C/5%CÖ2 tunnin ajan yhdessä 100 pCi Na251Cr04 kanssa. Solut pestään kasvatusliuoksella A 51Cr-ylimää-10 rän poistamiseksi, liuotetaan alustaan A ja niiden konsentraatioksi sovitetaan 2.5xl05solua/ml.
CDC (= comlement dependent cytotoxity): 100 μΐ kohdesolujen suspensiota pipetoidaan 15 mikrotiitterilevyjen kuoppiin. 50 μΐ anti-id BR55-2#E4 liuosta laimennettuna haluttuun konsentraatioon epätäydellisessä PBS-liuoksessa lisätään. Sen jälkeen 100 μΐ ihmisen seerumia, jossa on 2 pg/ml BR55-2/IgG3, lisätään kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboidaan yön yli 20 37°C/5% CO2. Supernatantit kerätään Skatron-Harvesting-Press-laitteella ja lasketaan γ-laskurilla. Tämä antaa kokeellisen vapautumisen arvot.
Kokonais 51Cr vapautumisen määrittämiseksi, solut käsitellään kuten edellä on esitetty, korvaamalla ·· 25 ihmisen seerumi liuoksella, jossa on 2% SDS, 50 mM
Na2CC>3 ja 10 mM EDTA ja korvaamalla anti-id BR55-2#E4-liuos 50 piillä epätäydellistä PBS-liuosta. Spontaanin 51Cr vapautumisen arvo saadaan korvaamalla ihmisen seerumi alustalla A ja anti-id BR55-2#E4-liuos 50 piillä 30 epätäydellistä PBS-liuosta.
«
Laskemisen jälkeen tulos saadaan seuraavasti 1 35 47 111518 hajoaminen % =
Kokeellinen vapautuminen - spontaani vapautuminen --------------------------------------------------% 5 Kokonaisvapautuminen - spontaani vapautuminen
Esimerkki 23: BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl:n im- munoaffiniteettipuhdistus käyttäen anti-id BR55-2IE4-Sepharosea 10 23.1: BR55-2#E4-Sepharosen valmistus 9 g kylmäkuivattua aktivoitua CH-Sepharosea suspendoidaan 1 mM HCl, siirretään sintterilasisuoti-15 meen ja pestään 2 1:11a 1 mM HCl 15 minuutin ajan. Ligandi (95 mg anti-id BR55-2#E4) liuotettuna 50 ml:aan kytkentäpuskuria sekoitetaan pestyyn geeliin suljetussa astiassa ja sekoitetaan ylösalaisin yhden tunnin ajan huoneenlämmössä. Geeli pestään kytkentäpuskurilla ja 20 inkuboidaan tunnin ajan 50 ml:n etanoliamiinin kanssa jäljelle jäävien aktiivisten ryhmien sulkemiseksi. Affiniteettisorbentti pestään kolmessa vaiheessa vaih-televilla pH-arvoilla. Jokaiseen vaiheeseen kuuluu pesu pH-arvolla 4 (0.1 M asetaatti, 0.5 m NaCl), jota seuraa 25 pesu pH-arvolla 8 (0.1 M Tris, 0.5 M NaCl).
• *« 23.2 BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl:n eristäminen
Kromatografia tehtiin 4 °C lämpötilassa. Ko-30 lonni (BIO REX kolonni, halkaisija 1.5 cm) täytetään anti-id BR55-2#E4-Sepharosella (tilavuus 35 ml) . Geeli * ·. pestään sitomispuskurilla ja eluutiopuskurilla. Lähtö- materiaali on 100 1 alustaa, jossa on BR55-2/kimeeri-nen-ihmis-IgGl:a. Käyttämällä Amicon DC2 konsentrointi-35 laitetta, joka on varustettu ontelokuitupatruunalla P 10, saadaan konsentraatio 5:1, jonka jälkeen konsent-raatti asetetaan kolonniin. Läpimenneen fraktion eluu- 48 111518 tion jälkeen, sitoutunut BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl desorboidaan eluutiopuskurilla ja neutralisoidaan välittömästi desorption jälkeen 1 M Tris/HCl-puskurilla pH 7.5.
5 23.3. BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl:n konsentrointi
Eluoidun vasta-aineliuoksen konsentrointi tehdään sekoitetussa Amicon ultrasuodatuskennossa käyttäen 10 PM 10 Diaflo membraania. Liuoterejekti IgG:n suhteen on yli 98%, IgG:n lopullisen konsentraation noustessa 3.36 mg/ml:aan.
23.4: Puhdistetun BR55-2/kimeerinen-ihmis-IgGl:n karak-15 terisointi 23.4.1: Ioninvaihtokromatografia MonoQ:lla:
Kolonni: · Mono-Q HR5/5 (Pharmacia) 20 PuskuriA: 20 mM TEA, ph 7.7
Puskuri B: 20 mM TEA, IM NaCl, pH 7.7 Virtaus: Imi/min
Detektio: UV 280 nm
Gradientti: lineaarinen 2%/min ·“ 25 Tulos: >95% puhtaus 23.4.2: Korkean erotuskyvyn kokoekskluusiokromatografia 30 Kolonni: Zorbax GF250, 9.4x250 mm
Puskuri: Natriumfosfaatti 0.1 M, 0.2 M NaCl, pH
7.0
Virtaus: 1 ml/min 35 Detektio: UV 280 nm
Tulos: >95% puhtaus 49 111518
23.4.3: SDS-PAGE
Kokeet tehtiin pelkistävissä olosuhteissa 5 Laemmli'n menetelmän mukaan käyttäen 10% akryyliamidi-geelejä (tulokset esitetty kuvassa 10).
Lähtöaineet
Hiiri monoklonaaliset vasta-aineet BR55-2 ovat 10 saatavissa esim. hybridoomista BR55.2 (BR55-2/lgG3) ja vastaavasti BR55.2S2a (BR-55-2/IgG2a).
Nämä hybridoomat talletettiin 17.2 1987 ja 10.3 1987 American Tupe Culture Collection:iin, Rockville, MD 20852, USA, Budapestin sopimuksen mukaisesti 15 talletusnumeroilla ATCC HB 9324 ja ATCC HB 9347.
« ·

Claims (4)

111518
1. Menetelmä monoklonaalisten hiiren sisäkuva anti-idiotyyppisten vasta-aineiden (Ab2) 5 valmistamiseksi hybridoomatekniikalla monoklonaalisia vasta-aineita BR55-2 [(ATCC HB 9324) (Abi)] vastaan.
2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisten anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että immunisoidaan hiiri BR55- 10 2/hiiri IgG3-F (ab') 2-KLH-konjugaatilla, fuusioidaan hiiren pernasolut hiiren myeloomasolulinjaan SP2/0, valitaan kasvatetut hybridoomasolut, jotka tuottavat IgG:a, joiden inhibitiokyky on yli 95% (BR55-2 hiiri Ig2a:n sitoutumisen inhibitio SKBR5 solulinjaan), puh-15 distetaan ja eristetään anti-idiotyyppinen vasta-aine.
3. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä anti-idiotyyppistä vasta-ainetta ja 20 yhdistetään se farmaseuttisesti hyväksyttävän adjuvantin, kantajan tai laimentimen kanssa, käytettäväksi ennaltaehkäisevään ja/tai terapeuttiseen immunisaatioon HIV-infektioita vastaan.
4. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen ·· 25 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä anti-idiotyyppistä monoklonaalista vasta-ainetta ja yhdistetään se farmaseuttisesti hyväksyttävän adjuvantin, kantajan tai laimentimen 30 kanssa, immunisointiin epiteeliperäistä syöpää ja • pienisolukeuhkosyöpää vastaan. 111518
FI945485A 1992-05-22 1994-11-22 Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden ja vasta-ainetta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi FI111518B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929210929A GB9210929D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
GB929210930A GB9210930D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
GB9210929 1992-05-22
GB9210944 1992-05-22
GB9210930 1992-05-22
GB929210944A GB9210944D0 (en) 1992-05-22 1992-05-22 Monoclonal antibodies and their use
PCT/EP1993/001215 WO1993024647A1 (en) 1992-05-22 1993-05-14 Anti-idiotypic monoclonal antibodies against the lewis y-specific monoclonal antibody br55-2 and their uses
EP9301215 1993-05-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI945485A FI945485A (fi) 1994-11-22
FI945485A0 FI945485A0 (fi) 1994-11-22
FI111518B true FI111518B (fi) 2003-08-15

Family

ID=27266199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI945485A FI111518B (fi) 1992-05-22 1994-11-22 Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden ja vasta-ainetta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0644947B1 (fi)
JP (3) JPH07507207A (fi)
KR (1) KR100279317B1 (fi)
AT (1) ATE179214T1 (fi)
AU (1) AU678160B2 (fi)
CA (1) CA2134751C (fi)
CZ (1) CZ286547B6 (fi)
DE (1) DE69324584T2 (fi)
DK (1) DK0644947T3 (fi)
ES (1) ES2133395T3 (fi)
FI (1) FI111518B (fi)
GR (1) GR3030701T3 (fi)
HU (1) HU219055B (fi)
NO (1) NO316120B1 (fi)
NZ (1) NZ252161A (fi)
PL (1) PL175651B1 (fi)
RU (1) RU2208642C2 (fi)
SG (1) SG50721A1 (fi)
SK (1) SK281086B6 (fi)
WO (1) WO1993024647A1 (fi)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT500650B1 (de) 2003-04-17 2009-11-15 Altropus Gmbh Immunogener rekombinanter antikörper
US20080268459A1 (en) * 2003-08-14 2008-10-30 Wyeth Ludwig Institute For Cancer Anti-Lewis Y Anti-Idiotypic Antibodies and Uses Thereof
AT504231A1 (de) 2006-10-03 2008-04-15 Hans Dr Loibner Prädiktive parameter
DK2611834T3 (en) 2010-09-01 2018-06-18 Biogen Ma Inc QUICK GENERATION OF ANTIIDIOTYPIC ANTIBODIES
RU2735653C2 (ru) * 2016-08-23 2020-11-05 Тран-Сцелл Биологицс Привате Лимитед Платформа с клетками-предшественниками человека для поиска активных веществ лекарственных препаратов

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0423198B1 (en) * 1988-07-06 1996-05-08 VERIGEN, INC. (a Corporation of Delaware) Antibodies specific towards hiv 1 gp 48
DE4006308A1 (de) * 1990-02-28 1991-08-29 Sandoz Ag Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom
DE4025499A1 (de) * 1990-08-11 1992-02-13 Sandoz Ag Verwendung der antikoerper br55-2, deren derivate, konjugate und fragmente zur bekaempfung von hiv-infektionen
DK0528767T3 (da) * 1991-08-21 2000-04-17 Novartis Ag antistofderivater

Also Published As

Publication number Publication date
NO944443L (no) 1995-01-20
RU2208642C2 (ru) 2003-07-20
WO1993024647A1 (en) 1993-12-09
JPH11178594A (ja) 1999-07-06
NO944443D0 (no) 1994-11-21
DE69324584T2 (de) 1999-09-23
AU4068893A (en) 1993-12-30
ATE179214T1 (de) 1999-05-15
ES2133395T3 (es) 1999-09-16
KR950701685A (ko) 1995-04-28
NZ252161A (en) 1996-10-28
DK0644947T3 (da) 1999-11-01
NO316120B1 (no) 2003-12-15
RU94046321A (ru) 1997-01-27
EP0644947B1 (en) 1999-04-21
FI945485A (fi) 1994-11-22
JPH07507207A (ja) 1995-08-10
CA2134751C (en) 2003-12-16
HU219055B (hu) 2001-02-28
GR3030701T3 (en) 1999-11-30
FI945485A0 (fi) 1994-11-22
AU678160B2 (en) 1997-05-22
SK139894A3 (en) 1995-07-11
JP2006143738A (ja) 2006-06-08
EP0644947A1 (en) 1995-03-29
HUT71311A (en) 1995-11-28
SG50721A1 (en) 2000-11-21
CA2134751A1 (en) 1993-12-09
CZ286547B6 (cs) 2000-05-17
CZ285194A3 (en) 1995-05-17
SK281086B6 (sk) 2000-11-07
PL175651B1 (pl) 1999-01-29
DE69324584D1 (de) 1999-05-27
KR100279317B1 (ko) 2001-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070036798A1 (en) Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
JP2633807B2 (ja) 抗イデイオタイプ抗体を産生するイモータルリンパ球
EP1241264A1 (en) Monoclonal antibodies to colon cancer antigen
US5653977A (en) Anti-idiotypic antibody that mimics the GD2 antigen
US20050163768A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
FI111518B (fi) Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden ja vasta-ainetta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi
US20070092522A1 (en) Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
EP0370090B1 (en) Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens
CA1341566C (en) Immune response to tumors induced by anti-idiotype antibodies
AU711270C (en) Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
NZ503032A (en) Use of a binding agent to reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
MXPA98009586A (en) Method and composition for the reconformation of multi-peptide antigens to start an animal response

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: NOVARTIS AG

MA Patent expired