PL175651B1 - Antyidiotypowe mysie przeciwciała monoklonalne oraz sposób wytwarzania antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych - Google Patents
Antyidiotypowe mysie przeciwciała monoklonalne oraz sposób wytwarzania antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnychInfo
- Publication number
- PL175651B1 PL175651B1 PL93306001A PL30600193A PL175651B1 PL 175651 B1 PL175651 B1 PL 175651B1 PL 93306001 A PL93306001 A PL 93306001A PL 30600193 A PL30600193 A PL 30600193A PL 175651 B1 PL175651 B1 PL 175651B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibodies
- cells
- human
- binding
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]3O)O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 107
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 59
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 claims description 50
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 claims description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 82
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 81
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 69
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 45
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 45
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 44
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 44
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 29
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 17
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 14
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 5
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 5
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GHCVXTFBVDVFGE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-6-chloro-1,3,5-triazin-2-ol Chemical compound NC1=NC(O)=NC(Cl)=N1 GHCVXTFBVDVFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 208000007521 HIV Seropositivity Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound OCCN1CCNCC1 WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000287127 Passeridae Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- -1 SW948 Chemical compound 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000036260 idiopathic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- VPKDCDLSJZCGKE-UHFFFAOYSA-N methanediimine Chemical compound N=C=N VPKDCDLSJZCGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- FNGYBCWZUBEMNP-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-ylsulfanyl propanoate Chemical compound CCC(=O)OSC1=CC=CC=N1 FNGYBCWZUBEMNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3053—Skin, nerves, brain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
- C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
- C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
Abstract
1. Antyidiotypowe mysie przeciwciala monoklonalne (Ab2), znamienne tym, ze nosza obraz wewnetrzny antygenu Lewis Y i skierowane sa przeciwko przeciwcialom monoklonalnym BR55-2 (Ab1). F ig u r a 1 PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są antyidiotypowe mysie przeciwciała monoklonalne oraz sposób wytwarzania antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych.
Jedną z możliwości wpływania na układ odpornościowy opierać można na oddziaływaniach idiotypowych. Poszczególne przeciwciała różnią się między sobą idiotopami unikalnymi determinantami antygenowymi wewnątrz i w pobliżu miejsc wiążących cząsteczek immunoglobulin. Suma wszystkich idiotopów występująca w części zmiennej określonego przeciwciała określana jest jako idiotyp (id). Struktura molekularna idiotypu zlokalizowana jest zarówno w regionach odpowiedzialnych za swoistość przeciwciała (CDR) jak i regionów szkieletowych (FR) części zmiennej. Zwykle, chociaż nie w każdym przypadku, idiotyp tworzony jest przez oba łańcuchy przeciwciała - ciężki jak i lekki - będące w określonym zestawieniu.
Idiotypy są jednostkami określonymi serologicznie ponieważ wstrzyknięcie danego przeciwciała (często określonego jako Ab1), syngenicznemu, allogenicznemu czy ksenogenicznemu biorcy indukuje wytworzenie przeciwciał antyidiotypowych (określanych często jako Ab2). Opierając się na przyjęciu istnienia oddziaływań antyidiotypowych, Niels Jerne (Ann. Immunol. l25C, 373,1974) zaproponował istnienie zależnej od receptorów, fizjologicznej regulacji w obrębie systemu odpornościowego. Teoria sieci antyidiotypowej Jernego przedstawia układ odpornościowy jako zbiór cząsteczek immunoglobulin oraz receptorów limfocytów T, z których każdy może rozpoznawać określoną determinantę antygenową (epitop) swoim miejscem wiążącym (paratop), a jednocześnie sama może być rozpoznawana przez inne przeciwciała oraz błonowe receptory układu odpornościowego, wykazując określony idiotyp. Rzeczywiście, liczne badania wykazały obecność receptorów idiotypowych i antyidiotypowych na powierzchni limfocytów, tak B jak i T, oraz w obrębie cząsteczek wydzielanych przeciwciał.
Kiedy wiązanie między Ab1, a Ab2 jest hamowane przez antygen, przeciw któremu skierowane jest Abl, uważa się że idiotyp jest związany z miejscem wiążącym, jako że obejmuje fragment domeny zmiennej przeciwciała biorący udział w wiązaniu antygenu. Idiotypy naśladujące konformację epitopu antygenowego określane są jako wewnętrzny obraz owego epitopu. Ponieważ zarówno Ab2 jak i antygen wiążą się z odpowiednim Ab1, mogą one mieć podobną trójwymiarową konformację, co stanowi o istnieniu wewnętrznego
175 651 obrazu danego antygenu. Ten wewnętrzny obraz obecny w cząsteczce przeciwciała może w zasadzie służyć jako substytut antygenu, który był wzorcem dla jego wytworzenia w serii oddziaływań antyidiotypowych. Dlatego też tego typu substytuty antygenów mogą być użyte w postępowaniu dla przeprowadzenia aktywnej immunizacji. Mogą -one przykładowo być przydatne w sytuacjach, gdy właściwy antygen nie jest -wystarczająco immunogenny by zapoczątkować istotną odpowiedź odpornościową. Tak więc odpowiednie przeciwciała antyidiotypowe noszące obraz wewnętrzny antygenu węglowodanowego o niskiej immunogenności, mogą okazać się szczególnie użyteczne w przypadkach pewnych typów szczepień. W dalszej części temat, ten zostanie omówiony bardziej szczegółowo.
Wskutek wprowadzenia technologii.- hybrydoma uzyskano szereg przeciwciał monoklonalnych (Mabs), głównie mysiego, pochodzenia, skierowanych przeciwko wielu typom ludzkich nowotworów. Prawie wszystkie, z markerów rozpoznawanych przez te przeciwciała nie są ściśle specyficzne względem nowotworu, lecz są antygenami różnicowania obecnymi tak na komórkach nowotworowych jak i na niektórych normalnych czy też płodowych tkankach. Wobec tego mogą być co najwyżej określane jako antygeny związane z nowotworem (TAA). To czy ludzkie markery nowotworowe, rozpoznawane przez obcogatunkowe przeciwciała monoklonalne, są zdolne do indukowania odpowiedzi odpornościowej w organizmach pacjentów z nowotworami, oraz to czy antygeny te są rzeczywiście związane z toczącą się odpowiedzią na autologiczne nowotwory w organizmach tych pacjentów, zależy od charakteru poszczególnych TAA i ciągle nie jest ostatecznie zrozumiane. Te z TAA, które są naturalnie immunogenne, lub które można uczynić immunogennymi, mogą być potencjalnie użyte dla uzyskania immunizacji na nowotwór w zastosowaniach leczniczych, a być może i zapobiegawczych.
TAA są często postrzegane przez układ odpornościowy pacjentów z nowotworami jako własne i indukują słabą odpowiedź odpornościową. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała antyidiotypowe, noszące wewnętrzne obrazy antygenów, których przestrzenne ukształtowanie przypomina strukturę epitopów odpowiednich TAA, rozpoznawane są jako cząsteczki obce w organizmach noszących nowotwór. Tak więc, odpowiedź odpornościowa zapoczątkowana przez terapeutyczną czy nawet profilaktyczną immunizację z użyciem odpowiednich monoklonalnych przeciwciał antyidiotypowych może indukować odporność przeciwnowotworową.
Immunizacja terapeutyczna przeciw nowotworowi z użyciem antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych może być szczególnie użyteczna we wczesnych etapach choroby': W momencie operacyjnego usunięcia ogniska pierwotnego często pojedyncze komórki nowotworowe skrycie rozsiewają się do rozmaitych narządów pacjenta. Te komórki mikroprzerzutów są znaną przyczyną powstawania następnie przerzutów, często po latach od postawienia diagnozy i usunięcia chirurgicznego w całości wykazanej klinicznie masy guza. Jak dotychczas, prawie wszystkie przypadki przerzutów nowotworów pochodzenia nabłonkowego są nieuleczalne. Tak więc istnieje pilna potrzeba znalezienia skutecznych środków niszczenia niewidocznych komórek mikroprzerzutów czyli tzw. resztkowej choroby nowotworowej, dla zapobiegania rozwojowi przerzutów pojawiających się w skali makro. W tych etapach choroby konwencjonalne podejście chemioterapeutyczne (adjuwantowe) jest ciągle raczej nieskuteczne. Jednakże indukcja specyficznej odporności przeciwnowotworowej, na etapie występowania resztkowej choroby nowotworowej, poprzez zastosowanie odpowiednich monoklonalnych przeciwciał anty-id, może prowadzić do selektywnej eliminacji komórek mikroprzerzutów poprzez układ odpornościowy, pozwalając na wydłużenie wolnego od choroby okresu przeżycia.
Przeciwciała monoklonalne o swoistości BR55-2 (opisane u Wistar EP 285 059, M. Blaszcyk-Thurin et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 372-397, lub Z. Steplewski et al., Hybrydoma 9 (1990) 201-210) rozpoznają antygen Lewis Y6, determinantę węglowodanową selektywnie obecną na większości ludzkich guzów nowotworowych. Dzięki swoim własnościom, przeciwciała BR55-2 mogą być wykorzystane dla biernej immunoterapii nowotworów, głównie nabłonkowych.
175 651
Związana z nowotworem determinanta oligocukrowa Lewis Y6, która jest również obecna w niektórych stadiach rozwoju zarodkowego, sama w sobie jest prawie nieimmunogenna. Jednakże monoklonalne przeciwciała antyidiotypowe (Ab2), skierowane przeciw BR55-2 (Ab1), noszące wewnętrzny obraz antygenu, przypominając strukturalne epitopy antygenu Lewis Y, są użyteczne dla indukcji ochronnej odporności przeciwnowotworowej, szczególnie na wczesnych etapach choroby.
Poza jego występowaniem na nowotworach pochodzenia nabłonkowego, antygen oligocukrowy Lewis Y ma również udział w patogenezie zakażenia HIV, czyli wirusem Zespołu Nabytego Niedoboru Odporności. Zespół Nabytego Niedoboru Odporności (AIDS) jest samoistną jednostką chorobową, której etiologię powiązano z zakażeniem retrowirusem HIV mającym powinowactwo do układu chłonnego. Choroba charakteryzuje się zaburzeniami związanymi z upośledzoną odpornością komórkową i ogólną limfopenią, szczególnie z obniżeniem liczby limfocytów pomocniczych T (CD4). Wystąpienie AIDS może być poprzedzone zespołem wstępnych objawów, manifestującym się zestawem określonych cech klinicznych i obniżeniem liczby limfocytów pomocniczych T. Nazywany on jest zespołem związanym z AIDS (ARC).
HIV należy do grupy wirusów intensywnie badanej w przeciągu ostatnich dwóch dekad. Po wtargnięciu retrowirusa do komórki ludzkiej, czy zwierzęcej, wirusowy RNA zostaje przepisany na DNA i w tej postaci wbudowany do komórki gospodarza, która zaczyna traktować geny wirusowe jak swoje własne. HIV może pozostawać w latencji w obrębie tych komórek przez całe lata, będąc bezpiecznym przed atakiem ze strony układu odpornościowego organizmu, ulegając powieleniu przy każdym podziale komórki gospodarza. Jedynie w przypadku spowodowania szybkiej replikacji wirusa przez aktywację zakażonych komórek, wytworzone cząstki wirusa zabijają komórkę i wysiewają się do krwiobiegu.
Z przyczyny swoistych cech HIV ciężko jest uzyskać wyleczenie poprzez eliminację zarówno wirusa jak i prowirusowej informacji genetycznej, wpisanej do genomu ludzkiego u zakażonych pacjentów. W związku z tym większość wysiłków leczniczych nakierowana jest na spowolnienie rozwoju choroby poprzez interferencję z kluczowymi etapami replikacji wirusa.
Podstawowym celem jest zapobieganie zakażeniu HIV oraz możliwość interwencji terapeutycznej u już zarażonych pacjentów poprzez efektywne i bezpieczne szczepienia ochronne. Na etapie prób klinicznych i wczesnych prób klinicznych testowanych jest obecnie kilka protokołów szczepień. Badane szczepionki powstały głównie w oparciu o użycie jako antygenu, struktur wirusowych, szczególnie podstawowej glikoproteiny otoczkowej gpl20.
Naturalnie występująca odpowiedź przeciwwirusowa obejmuje wytworzenie przeciwciał dla wszystkich białek wirusa oraz aktywacji odporności komórkowej. Jednak powstająca odpowiedź gospodarza nie wydaje się zatrzymywać postępów choroby po przejściu okresu bezobjawowego, który częstokroć trwa latami. Wobec tego próby szczepień opierające się na tych samych antygenach, które wzbudzają odpowiedź naturalną, nieskuteczną w ostatecznym rozrachunku, napawają wątpliwościami. Jednym z istotnych problemów jest duża skala zmienności HIV, dzięki której to wirus może unikać ataku ze strony swoistych względem określonego jego typu przeciwciał anty-gp120.
Skuteczna ochrona przed HiV na drodze szczepienia wymaga przyjęcia podwójnej strategii obronnej: po pierwsze skierowanej przeciw wolnej formie wirusa, przenoszonej w układzie krwionośnym, po drugie przeciwko już zarażonym komórkom. Wiadomo, że zarażone przez HIV komórki in vitro i in vivo noszą na powierzchni zmieniony wzór glikozylacji, mianowicie determinantę węglowodanową Lewis Y. Jako, że antygen ten występuje normalnie na pewnych etapach rozwoju zarodkowego oraz wiąże się z różnymi postaciami nowotworów, jego obecność na zakażonych przez HIV komórkach odzwierciedlać może ich zmieniony stan różnicowania spowodowany transformacją retrowirusową. W takim razie ten powierzchniowy fenotyp przypomina unikalną reakcję komórki gospodarza na transfekcję genomu ludzkiego przez HIV.
175 651
Glikolizacja białek otoczki HIV ma miejsce w obrębie aparatu glikozylującego zakażonych komórek. Wobec tego, zmiany obrazu glikozylacji komórek zakażonych HIV odnoszą się także do uwalnianych cząsteczek wirusa. W konsekwencji, glikoproteiny otoczkowe HIV, wytworzonego w takich komórkach, również zawierają wodorowęglanowe determinanty Lewis Y. Tak więc oligosacharyd Lewis Y jest przykładem swoistej odpowiedzi gospodarza dotyczącej zarówno komórek zakażonych przez HIV, jak i wolnych cząsteczek HIV.
W oparciu o powyższe rozważania, struktura Lewis Y spełnia ważne wymagania dla jej użycia w strategii szczepienia przeciwko zarówno wolnemu wirusowi jak i komórkom zarażonym HIV. Co więcej, będąc ogólną reakcją gospodarza na zakażenie HIV, antygen Lewis Y, nie jest zależny od szczepu HIV jak i od zmienności genetycznej wirusa. Niestety, poprzez swą węglowodanową budowę, jak i w efekcie traktowania go jako element własny przez układ odpornościowy, wskutek jego obecności w rozwoju zarodkowym, antygen Lewis Y sam nie jest immunogenny. Nie wykryto jakiejkolwiek odpowiedzi na ten antygen w organizmie człowieka. Jednakże monoklonalne przeciwciała antyidiotypowe (Ab2) przeciwko BR55-2 (Ab1) noszące obraz wewnętrzny tego antygenu, przez podobieństwo strukturalne do epitopów Lewis Y, mogą być użyteczne dla indukcji odporności w profilaktyce i leczeniu, działając zarówno na wolną cząsteczkę HIV, jak i na zakażone przez HIV komórki, niezależnie od szczepu wirusa.
W dodatku do możliwości ich użycia jako szczepionek, zapobiegawczo, czy leczniczo, monoklonalne przeciwciała antyidiotypowe, noszące obraz wewnętrzny antygenu, interesujące są przez ich wysoką swoistość dla idiotypu przeciwciała w odpowiedzi, na które powstały. Prawie wyłącznie rozpoznają fragment wiążący Ab1. Rozpoznanie to jest niezależne od innych determinant w obrębie Ab1. Innymi słowy odpowiednie antyidiotypowe przeciwciało monoklonalne rozpoznaje każdą cząsteczkę obejmującą unikalny idiotyp Ab1 w jego prawidłowym przestrzennym ukształtowaniu. W związku z tym przeciwciała owe mają podobne powinowactwo do fragmentów F(ab')2, Fab, czy Fv przeciwciała Ab1, podobnie jak i do odmiennych izotypów (każdy wariant izotypowy zawiera odmienne regiony stałe (Fc) np. mysie IgG2a, IgG2b, IgG1, lecz identyczny idiotyp) tego samego przeciwciała. Dodatkowo, ten wysoce swoisty sposób rozpoznawania przeciwciał monoklonalnych noszących obraz wewnętrzny antygenu odnosi się też do wariantów mysiego macierzystego przeciwciała, uzyskanych drogą rekombinacji DNA.
Dla przezwyciężenia możliwych problemów związanych z powtarzalnym użyciem mysich przeciwciał dla biernej immunoterapii u ludzi można wytworzyć mysio-ludzkie monoklonalne przeciwciała chimeryczne przez połączenie domen zmiennych wybranych macierzystych przeciwciał mysich z ludzkimi fragmentami stałymi. Dla wykrycia takich chimerycznych mysio-ludzkich przeciwciał w surowicy człowieka konieczne są wysoko swoiste odczynniki, ponieważ przeciwciała te mają fragmenty stałe identyczne z przeciwciałami naturalnie występującymi u człowieka. Przeciwciała monoklonalne noszące obraz wewnętrzny antygenu, wytworzone przeciwko Ab1 rozpoznają również przeciwciała chimeryczne uzyskane w opisany wyżej sposób. Tak więc przeciwciała antyidiotypowe tego rodzaju są użytecznymi odczynnikami dla swoistego i czułego oznaczania ilościowego, np. stężeń mysio-ludzkich monoklonalnych przeciwciał chimerycznych w surowicy, w obecności dużego nadmiaru normalnych immunoglobulin człowieka.
Dla dodatkowego ulepszenia właściwości przeciwciał monoklonalnych o właściwościach interesujących z punktu widzenia biernej immunoterapii, drogą inżynierii genetycznej można wytworzyć w pełni humanizowane przeciwciała, w których jedynie najmniejsze konieczne części macierzystego mysiego przeciwciała - regiony określające komplementamość (CDR) połączone są z ludzkimi regionami szkieletowymi fragmentów zmiennych, oraz z ludzkimi fragmentami stałymi. W zaprojektowaniu i konstruowaniu tych ”v pełni humanizowanych przeciwciał monoklonalnych istotna jest homologia sekwencji i modelowanie cząsteczkowe dla wyboru najlepszej kombinacji sekwencji mysich i ludzkich pozwalając na dalsze zmniejszenia immunogenności, przy zachowaniu ich zdol6
175 651 ności wiążących. Niektóre z przeciwciał monoklonalnych noszących obraz wewnętrzny antygenu wytworzone przeciwko idiotypowi macierzystego mysiego Ab1 mogą w dalszym ciągu wiązać się z humanizowanymi wariantami o przeszczepionych CDR pod warunkiem spełnienia następujących wymagań:
a) Struktura przestrzenna regionu wiążącego wariantu humanizowanego jest bardzo podobna do występującego w macierzystej immunoglobulinie mysiej.
b) Odpowiednie przeciwciało antyidiotypowe dokładnie rozpoznaje ten przestrzenny kształt regionu wiążącego ('przeciwciało noszące prawdziwy obraz wewnętrzny antygenu).
Tak więc, przeciwciała antyidiotypowe o wymienionych powyżej cechach są szczególnie istotnymi odczynnikami dla swoistego i wysoce czułego ilościowego oznaczania np. stężeń w surowicy mysio-ludzkich monoklonalnych przeciwciał chimerycznych w obecności dużego nadmiaru normalnych immunoglobulin człowieka.
Przedmiotem wynalazku są antyidiotypowe mysie przeciwciała monoklonalne (Ab2), noszące obraz wewnętrzny antygenu Lewis Y i skierowane są przeciwko przeciwciałom monoklonalnym BR55-2 (Ab1).
W szczególnym przypadku antyidiotypowe przeciwciała monoklonalne (Ab2) stanowi przeciwciało nr E4 skierowane przeciwko przeciwciałom monoklonalnym BR55-2.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania antyidiotypowych mysich przeciwciał monoklonalnych (Ab2), polegający na tym, że immunizuje się myszy fragmentem F(ab’)2BR55-2/mysiej IgG3 sprzężonym z KLH, poddaje się mysie splenocyty fuzji z komórkami mysiego szpiczaka SP 2/0, wyselekcjonowuje się komórki hybrydoma produkujące IgG o zdolności do hamowania kompetycyjnego wiązania mysiej IgG2a o swoistości BR55-2 z linią komórkową SKBR5, przekraczającej 95% i oczyszcza się oraz izoluje się otrzymane przeciwciała antyidiotypowe.
Poniżej przedstawiono wytwarzanie i charakterystykę mysich antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych przeciwko idiotypowi przeciwciał BR55-2 nr 4. Dla minimalizacji antyizotypowej niepożądanej odpowiedzi odpornościowej do immunizacji wybrano fragment F(ab')2 z BR55-2 mysiej IgG3. Dla pomyślnego wytworzenia mysiego przeciwciała antyidiotypowego przeciwko idiotypowi mysiego przeciwciała monoklonalnego BR55-2 ważne było zmaksymalizowanie jego immunogenności w celu wzmożenia właściwej odpowiedzi odpornościowej u syngenicznego gospodarza. W tym celu fragment F(ab')2, pozbawiony fragmentu Fc (trawienie i oczyszczanie opisano w EPA 528.767) połączono z nośnikiem wzmagającym odpowiedź odpornościową - KLH (hemocyjanina ślimaka, immunogenne białko nośnikowe), za pomocą heterobifunkcjonalnego łącznika N-sukcynylimidylo-3-(2-pirydylotio) propionianu (=SPDP), metodą jak opisano (J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 723, l978). Przedstawionym koniugatem fr^ig;n^^n'ti^^l^(ab')2 BR55-2/mysiej IgG3 z KLH, immunizowano myszy Balb/c, przy użyciu kompletnego adjuwantu Freunda według typowego schematu wytwarzania mysich przeciwciał monoklonalnych. Po kilku immunizacjach mysie splenocyty poddano fuzji z komórkami mysiej linii szpiczaka SP2/0 (szczegóły doświadczenia patrz przykład 1). Dla właściwej selekcji wyhodowanych komórek hybrydoma przeprowadzono serię testów ich nadsączy. Selekcji dokonano w oparciu o następujące kryteria:
a) Natężenia wydzielania komórek hybrydoma, określając stężenie mysich IgG w nadsączach z hodowli (szczegóły doświadczenia patrz przykład 2). Komórki wytwarzające duże ilości mysich IgG subklonowano w hodowlach pojedynczych komórek.
b) Wiązania wybranych nadsączy z fragmentem F(ab')2 BR55-2 mysiej IgG3 (szczegóły doświadczenia patrz przykład 3).
c) Hamowania wiązania BR55-2/mysiej IgG2a z komórkami ludzkiego raka sutka SKBR5, noszącymi antygen Lewis Y, przez wybrane nadsącze (szczegóły doświadczenia patrz przykład 4).
Ostatni test zaprojektowano dla wykazania istnienia obrazu wewnętrznego antygenu w cząsteczkach przeciwciał Ab2. Użyto wariantu IgG2a przeciwciała BR55-2 aby zminimalizować wykrywanie przeciwciał Ab2 rozpoznających pozostałości fragmentu stałego
175 651 w użytym dla immunizacji fragmencie F(ab ')2 BR55-2/mysiej IgG3. Test ten wykonano w sposób ilościowy, w oparciu o stężenia IgG określone w teście a) (przykład 2). Ponadto w tym samym eksperymencie hamowania dodawano · nadmiaru niespecyficznej mysiej IgG dla zapobieżenia wykrywania Ab2, które nie byłyby swoiste względem idiotypu BR55-2. Wybrano te z hybrydoma, które wytwarzają IgG o zdolności do hamowania przekraczającej 95% (hamowanie wiązania mysiej IgG2a BR55-2 z linią komórkową SKBR5).
W oparciu o powyżej przedstawione testy wybrano i namnożono sześć różnych hybrydom (E4, C11, B3, B9, G6, G9). Wszystkie sześć wytwarzają mysie IgG1, co stwierdzono swoistym względem podklas testem ELISA z użyciem przeciwciał króliczych sprzężonych z peroksydazą, rozpoznających przeciwciała mysie (tak jak na przykład przeciwciała firmy ZYMED).
Wszystkie sześć hybrydom hodowano w butelkach obrotowych (37°C, 5% CO2, w pożywce G; pożywkę zmieniano co 3 do 4 dni), a nadsącza zbierano w celu dalszego oczyszczenia.
Każdy z nadsączy zawierających poszczególne przeciwciała antyidiotypowe anty-id BR55-2 oczyszczano z użyciem chromatografii immunopowinowactwa. Ogólnie, chromatografia opiera się na interakcji pomiędzy unieruchomionym ligandem, a substancją, która nas interesuje. W przypadku przeciwciał anty-id BR55-2, wysoce swoistym ligandem dla immunoadsorbcji jest przeciwciało monoklonalne BR55-2 będące mysim IgG2a, które wiąże dowolne z monoklonalnych przeciwciał antyidiotypowych (szczegóły doświadczalne przykład 5). Stopień czystości wyizolowanych monoklonalnych przeciwciał antyidiotypowych (E4, C11, B3, B9, G6, G9) określono przy pomocy analitycznej chromatografii jonowymiennej FPLC, chromatografii sita molekularnego, SDS - PAGE, oraz ogniskowania izoelektrycznego. Czystość wszystkich sześciu przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2 była wyższa od 95% (szczegóły doświadczalne przykład 6; SDS-PAGE i ogniskowanie izoelektryczne przedstawiono na fig. 1 i fig. 2).
Oczyszczone antyidiotypowe przeciwciała monoklonalne scharakteryzowano ilościowo przez określenie ich zdolności do hamowania wiązania BR55-5/mysich IgG3 do komórek SKBR5 noszących antygen Lewis Y. Wszystkie z przeciwciał antyidiotypowych hamują wiązanie Ab1 do antygenu w oparciu o stechiometrię 1:1 (szczegóły doświadczalne przykład 7, reprezentatywne wyniki pokazano na fig. 3).
Kluczowym dowodem na istnienie obrazu wewnętrznego antygenu w cząsteczkach wyżej opisanych przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2 jest ich zdolność do wzbudzania odpowiedzi Ab3 na antygen związany z nowotworem próżnych gatunków. Według teorii sieci antyidiotypowej Jerne'go przeciwciała (Ab3) wzbudzone przez immunizację monoklonalnymi przeciwciałami antyidiotypowymi noszącymi obraz wewnętrzny antygenu mają swoistość podobną do swoistości Ab1. Wobec tego odpowiedź odpornościowa wzniecona immunizacją przeciwciałami monoklonalnymi anty-id BR55-2 winna być swoista względem komórek nowotworowych noszących antygen Lewis Y. W konsekwencji, przez immunizację człowieka przeciwciałami monoklonalnymi anty-id BR55-2 można wyindukować chroniącą go odpowiedź przeciwnowotworową.
Dla zbadania cech odpowiedzi Ab3 immunizowano króliki oraz małpy rezus z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55 -2 nr E4 i wodorotlenku glinu, jako nośnika i adjuwantu. Ten delikatny adjuwant jest w szerokim zastosowaniu w wielu szczepionkach stosowanych u człowieka. Jako kontrola negatywna posłużyły zwierzęta immunizowane taką samą ilością nieswoistej mysiej IgG1. Po czterech immunizacjach w przeciągu 5 tygodni zebrano surowicę w 9 tygodniu (szczegóły doświadczalne - przykład 8). Określono wiązanie przeciwciał obecnych w surowicach z linią komórek raka sutka SKBR5 noszącymi antygen Lewis Y oraz ich wiązanie z linią komórek czerniaka WM9 nie mającymi antygenu Lewis Y (szczegóły doświadczalne - przykłady 9 i 10).
Przeciwciała monoklonalne anty-id BR55-2 nr E4 wzbudzają odpowiedź humoralną o wysokim natężeniu zarówno w przypadku królików jak i małp rezus. Surowicze Ig zwierząt immunizowanych anty-id BR55-2 nr E4 wybiórczo wiążą się z Lewis Y pozytywną linią
175 651 komórkową SKBR5, ale nie z linią komórkową WM9, nie mającą tego antygenu. Dla przeciwieństwa, przy immunizacji nieswoistą mysią IgG1 prawie się nie wykrywa surowiczych Ig wiążących komórki nowotworowe. Wyniki te są zebrane w tabeli 1. Na fig. 4 i 5 pokazane są odpowiednie krzywe wiązania uzyskane przy użyciu testu cell-ELISA dla surowic z przed i po immunizacji królików i małp rezus przeciwciałami anty-Id BR55-2 nr E4. Wiązanie surowiczych przeciwciał zwierząt immunizowanych anty-id BR55-2 nr E4 z komórkami SKBR5 można nadal wykazać przy rozcieńczeniu surowicy 1:10 000.
Dwa lata po wstępnym kursie immunizacji odpowiednie małpy rezus otrzymały pierwszą z pojedynczych dawek przypominających: anty-id BR55-2 nr E4 lub nieswoistą mysią IgG1. W ten sam sposób otrzymały drugą dawkę przypominającą w trzy lata po pierwotnej immunizacji (czyli rok po pierwszej dawce przypominającej; szczegóły doświadczalne - przykład 8). Zebrano surowice z przed i po podaniu obu dawek przypominających.
Natężenie całkowitej odpowiedzi humoralnej u małp rezus zaszczepionych anty-id BR55-2 nr E4 oceniono z użyciem testu ELISA opartego na przeciwciałach anty-id BR55-2 pokrytych na płytkach 96-dołkowych (szczegóły doświadczalne - przykład 13). W surowicy wszystkich małp rezus wykryto odpowiedzi odpornościowe o bardzo wysokim natężeniu po pierwszej immunizacji, jak i po pierwszej oraz drugiej dawce przypominającej. Wiązanie przeciwciał do unieruchomionych na płytce anty-id BR55-2 nr E4 można było ciągle wykazać przy rozcieńczeniach surowic 1:50 000. Nieco niższe, lecz w dalszym ciągu wysoce znamienne miana przeciwciał znajdowano w surowicach uzyskanych przed podaniem obu dawek przypominających. Wyniki te przedstawione są na fig. 6-81.
Oceniono też humoralną odpowiedź odpornościową u małp rezus zaszczepionych niespecyficzną mysią IgG1, używając w tym celu tego samego co opisany powyżej testu ELISA (szczegóły doświadczalne - przykład 13). Jak oczekiwano, miana surowiczych przeciwciał wiążących się z anty-id BR55-2 nr E4 są niższe niż miana znajdywane w surowicach małp szczepionych anty-id BR55-2 nr E4. Podczas gdy odpowiedź odpornościowa u małp szczepionych nieswoistą mysią IgG1 jest krzyżowo skierowana przeciw fragmentom stałym przeciwciał anty-id BR55-2 nr E4, w oczywisty sposób nie występuje tu komponenta odpowiedzi nakierowana na regiony hiperzmienne powyższych przeciwciał antyidiotypowych. Wyniki te pokazano na fig. 9 -10.
Dla udowodnienia swoistości względem nowotworu przeciwciał uzyskanych po pierwotnej immunizacji, jak i przed i po immunizacjach przypominających, określono wiązanie surowic małpich z kilkoma nowotworowymi liniami komórkowymi (sutka, żołądka, jelita i raka drobnokomórkowego płuca), noszącymi antygen Lewis Y, oraz z linią czerniaka, której brak antygenu Lewis Y (szczegóły doświadczalne - przykład 10). U małp rezus traktowanych anty-id BR55-2 nr 4 można w dalszym ciągu wykryć przeciwciała surowicze mogące wiązać komórki linii nowotworowej, noszące antygen Lewis Y w dwa lata po pierwszej immunizacji, a przed podaniem dawki przypominającej. Po podaniu pierwszej dawki przypominającej zwierzętom immunizowanym anty-id BR55-2, dramatycznie zwiększa się miano przeciwciał surowiczych mogących wiązać się z komórkami linii nowotworowej, noszącej antygen Lewis Y, przy prawie całkowitym braku wiązania z linią komórkową nie posiadającą tego antygenu. W żadnym momencie nie obserwowano pojawienia się przeciwciał swoiście wiążących u małp rezus immunizowanych nieswoistą mysią IgG1.
Podobne wyniki uzyskano w przypadku surowic otrzymanych przed i po drugiej immunizacji przypominającej. Powyższe wyniki miareczkowania surowic otrzymanych w różnych punktach czasowych, uzyskane za pomocą testu cell-ELISA z wykorzystaniem kilku linii nowotworowych pokazano na fig. 11 - 20.
Podobny wzór immunoreaktywności przeciwciał z surowic różnych małp przed i po pierwszym kursie immunizacji mógł być również wykazany w doświadczeniach ich wiązania z ekstraktem uzyskanym z błon komórkowych komórek SKBR5 noszących antygen Lewis Y (szczegóły doświadczalne - przykład 11). Rezultaty zebrano w tabeli 2.
175 651
W celu dalszej, bardziej szczegółowej analizy odpowiedzi odpornościowej wyindukowanej u małp rezus przy użyciu przeciwciał anty-id BR55-2 nr E4 oczyszczono surowice od poszczególnych immunizowanych małp, przy użyciu chromatografii immunopowinowactwa z przeciwciałami anty-id BR55-2 nr E4 przytwierdzonymi do Sefarozy (szczegóły doświadczalne - przykład 12). W tej jednostopniowej procedurze rozdziału, przeciwciała odpornościowe przeciw idiotypowi anty-id BR55-2 nr E4 odizolowano od innych nieistotnych białek surowicy. W pierwszym doświadczeniu przeciwciała małpy rezus immunizowanej anty-id BR55-2 nr E4 wyizolowano z surowicy uzyskanej w 9 tygodniu po pierwotnym kursie immunizacji. W drugim doświadczeniu przeciwciała małpy rezus immunizowanej anty-id BR55-2 nr E4 wyizolowano ze spulowanych surowic uzyskanych w 4 i 9 tygodniu po drugiej immunizacji przypominającej. W oparciu o ich zatrzymywanie na kolumnie anty-id BR55-2 nr E4 stwierdzono, że uzyskane frakcje przeciwciał wiążą się swoiście do różnych epitopów w obrębie cząsteczki przeciwciała anty-id BR55-2 nr E4. Owe frakcje przeciwciał zawierają cząsteczki przeciwko fragmentom stałym anty-id BR55-2 nr E4 (odpowiedź odpornościowa antyizotypowa) jak i przeciwciała skierowane przeciwko regionom zmiennym, włączając w to miejsce wiążące anty-id BR55-2 nr E4 (odpowiedź odpornościowa antyidiotypowa). Opierając się na teorii sieci antyidiotypowej, wspomnianej we wstępie ostatnia grupa (Ab3) jest szczególnie istotna, ponieważ wykazuje właściwości wiązania podobne do przeciwciał o swoistości BR55 (Ab1).
Oznaczono wiązanie oczyszczonej przez immunopowinowactwo frakcji przeciwciał z zebranych surowic z 4 i 9 tygodnia po drugiej dawce przypominającej, oraz frakcji nie zatrzymanej na kolumnie, do anty-id BR55-2 nr E4 (szczegóły doświadczalne - przykład 13). Podczas gdy frakcja oczyszczona przez immunopowinowactwo wiąże się silnie z anty-id BR55-2 nr E4, nie obserwuje się wiązania w przypadku frakcji przepływającej swobodnie przez kolumnę. Tym wynikiem udowodniona zostaje selektywność oraz wydajność tej metody oczyszczania (wyniki przedstawiono na fig. 21).
Następnie, przy użyciu komórek raka sutka SKBR5, porównano zdolność do wiązania anty-id BR55-2 nr E4 frakcji wyizolowanej przez immunoadsorbcję spulowanej surowicy z 4 i 9 tygodnia po drugiej dawce przypominającej z frakcją przepływową oraz z humanizowaną wersją rodzicielskiego przeciwciała mysiego (Ab1). Ten humanizowany wariant Ab1 (BR55-2/humanizowana IgG1) wybrano dla ułatwienia porównania, jako że może ono być wykryte tym samym odczynnikiem co używany dla wykrywania przeciwciał małpy rezus (kozie przeciwciało sprzężone z peroksydazą przeciwko ludzkiej immunoglobulinie, które podobnie wiąże się z blisko spokrewnioną immunoglobuliną małpy rezus). Prawie cała aktywność wiązania komórek nowotworowych wiąże się z frakcją oczyszczoną przez immunoadsorbcję. Tym wynikiem udowodnione zostało krzyżowe wiązanie przeciwciał rezusa wyindukowanych przez immunizację anty-id BR55-2 nr E4, linią komórek nowotworowych noszących antygen Lewis Y. Co więcej, siła wiązania (na bazie ilościowej) frakcji przeciwciał oczyszczonej przez immunopowinowactwo jest tylko 5 razy mniejsza niż BR55-2/humanizowanej IgG1 (Ab1). Wziąwszy pod uwagę, że tylko pewna część wyizolowanej frakcji skierowana jest przeciwko fragmentowi wiążącemu anty-id BR55-2 nr E4, a opierając się na teorii sieci antyidiotypowej, tylko ta część wykazuje właściwości wiążące podobne do Ab1, wynik ten jest godny odnotowania. W oparciu o wydajność oczyszczania przez immunopowinowactwo surowicy rezusa, miano oczyszczonej frakcji ma wartość w przybliżeniu 200 ^g/ml surowicy, odpowiadając w przybliżeniu 40 ^g/ml przeciwciała o własnościach wiązania nowotworu podobnych do BR55-2/humanizowana IgG1 (wyniki przedstawiono na fig. 22, szczegóły doświadczalne - przykłady 10 i 12).
Figura 23 (szczegóły doświadczalne - przykład 10) przedstawia porównanie własności wiązania komórek linii raka sutka SKBR5, noszących antygen Lewis Y, oraz komórek nie posiadających tego antygenu linii czerniaka WM9, przez oczyszczone immunoadsorbcyjnie małpie przeciwciała (Ab3) z właściwościami BR55-2/humanizowanej IgG1 w tym zakresie. Podczas gdy zarówno frakcja Ab3 jak i BR55-2/humanizowana IgG1 silnie wiążą komórki noszące antygen Lewis Y, żadne z przeciwciał nie wykazuje swoistego wiązania w
175 651 stosunku do komórek nie noszących tego antygenu. Wynik ten dowodzi podobieństwa wzoru wiązania frakcji Ab3 i humanizowanego wariantu Ab1.
Podobny wzór immunoreaktywności frakcji Ab3 obserwuje się też w teście ELISA z użyciem frakcji błonowej linii komórkowych SKBR5 i WM9 odpowiednio posiadającej i nie posiadającej antygenu Lewis Y. Istotne wiązanie frakcji Ab3 obserwuje się wyłącznie z błonami komórkowymi, które noszą antygen Lewis Y (wyniki przedstawiono na fig. 24, szczegóły doświadczalne - przykład 11).
Właściwości wiążące oczyszczonych przez immunopowinowactwo małpich przeciwciał (Ab3) potwierdzono dalej używając szeregu ludzkich linii nowotworowych, noszących antygen Lewis Y (rak drobnokomórkowy płuca, rak żołądka, rak jelita grubego, rak sutka). Oczyszczone przeciwciała małpie silnie wiążą się ze wszystkimi z testowanych linii (wyniki przedstawiono na fig. 25, szczegóły doświadczalne - przykład 10).
Po związaniu się z komórkami nowotworowymi, przeciwciało Ab1 BR55-2/mysia IgG3 prowadzi do zniszczenia komórki poprzez aktywację ludzkich mechanizmów efektorowych. Dla sprawdzenia zdolności przeciwciał małpy rezus wzbudzonych immunizacją BR55-2 nr E4, do niszczenia komórek nowotworowych, użyto oczyszczonego przez immunoadsorbcję przeciwciała małpiego Ab3. Dla celów tego doświadczenia użyto frakcji Ab3 oczyszczonej (patrz wyżej) z surowicy małpy rezus uzyskanej w 9 tygodniu po początkowym kursie immunizacji anty-id BR55-2 nr E4. Tę frakcję Ab3 porównano z BR55-2/mysia IgG3 (Ab1) w teście ADCC (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał) z użyciem ludzkich PBMC, jako komórek efektorowych (wyniki przedstawiono na fig. 26, szczegóły doświadczalne - przykład 14). W wyższych stężeniach, oczyszczona przez immunopowinowactwo frakcja Ab3 powoduje porównywalne z mysim Ab1 niszczenie komórek nowotworowych poprzez aktywację ludzkich komórek efektorowych. Wynik ten pokazuje indukcję swoistej cytotoksyczności przeciwnowotworowej przez szczepienie anty-id BR55-2 nr E4. Wymagania dla wyższego stężenia Ab3 wynikają stąd, iż jedynie pewna część oczyszczonej immunoadsorbcyjnie frakcji przeciwciał jest skierowana przeciw miejscu wiążącemu antyid BR55-2 nr E4, a jedynie ta część może wiązać się z komórkami nowotworowymi i powodować ADCC.
Jak wzmiankowano we wstępie, wiadomo że antygen węglowodanowy Lewis Y występuje też na ludzkich leukocytach zarażonych HIV. W celu zbadania wiązania surowiczych przeciwciał małp rezus immunizowanych anty-id BR55-2 nr E4 lub nieswoistą mysią IgG1, z komórkami zarażonymi HIV, przebadano małpie surowice otrzymane wcześniej i 9 tygodni po pierwotnym kursie immunizacji, z pomocą dostępnego w handlu testu przeznaczonego dla wykrywania seropozytywności surowic ludzkich. Test ten oparty jest na zdolności przeciwciał ludzkiej surowicy do wiązania zakażonych HIV komórek ludzkiej linii T-limfocytaraej PALL, co wykazuje się immunofluorescencją pośrednią z użyciem IgG-FITC przeciwko ludzkiej immunoglobulinie. Wskutek wielkiego podobieństwa immunoglobuliny ludzkiej i małpy rezus oryginalne odczynniki testu mogą być zastosowane dla przeciwciał małpy rezus. Jako kontrola służy wiązanie z niezakażonymi komórkami PALL (szczegóły doświadczalne - przykład 15).
Dla zwykłej surowicy małpy rezus immunofluorescencją tła jest nieco wyższa od tła dla surowicy ludzkiej, zarówno w przypadku komórek zakażonych HIV jak i niezakażonych komórek PALL Jednakże jedynie surowicze przeciwciała małpy rezus immunizowanej anty-id BR55-2 nr E4 w istotnym stopniu wiążą się z komórkami PALL zakażonymi HIV, podczas gdy prawie w ogóle nie wykrywa się wiązania z niezakażonymi komórkami PALL. Reaktywność przeciwciał surowiczych małpy rezus immunizowanej nieswoistymi mysimi IgG1, z zakażonymi HIV komórkami PALL jest wyraźnie słabiej zaznaczona i zbliżona do tła obserwowanego ze zwykłą małpią surowicą (wyniki podsumowano w tabeli 3).
Przeciwciała małpy rezus immunizowanej anty-id BR55-2 nr E4 wyizolowano ze spulowanej surowicy otrzymanej w 4 i 9 tygodniu po drugiej dawce przypominającej, z użyciem kolumny anty-id BR55-2 nr E4 (patrz wyżej). Właściwości wiążące tego oczy175 651 szczonego immunoadsorbcyjnie przeciwciała (Ab3) porównano z BR55-2/mysią IgG3 (Ab1), przy użyciu wspomnianego już dostępnego na rynku testu przeznaczonego dla wykrywania seropozytywności HIV w surowicy człowieka (szczegófy doświadczalne - przykład 15).
Oczyszczona immunoadsorbcyjnie frakcja Ab3 swoiście wiąże zakażone przez HIV komórki PALL, przy braku wiązania niezakażonych komórek PALL. Podobny wzór wiązania znaleziono dla BR55-2/mysiego IgG3 (Ab1). Wyniki te podsumowano w tabeli 4.
Poza użyciem ich jako unikalnych szczepionek dla zapobiegania i leczenia rozmaitych nowotworów i chorób wywołanych HIV, przedstawione w tym wynalazku monoklonalne przeciwciała antyidiotypowe noszące obraz wewnętrzny antygenu, wytworzone przeciwko fragmentowi wiążącemu antygen przeciwciała BR55-2, są doskonałym narzędziem dla oznaczania ilościowego przeciwciał monoklonalnych, ich pochodnych czy fragmentów o swoistości BR55-2. Przykładowo, mogą być używane dla swoistego określenia stężeń wszystkich mysich podtypów BR55-2 w ludzkiej surowicy. Z powodu rozpoznawania przestrzennej struktury fragmentu wiążącego BR55-2 owe przeciwciała antyidiotypowe wiążą jedynie aktywne immunologicznie struktury BR55-2. Właściwość ta wiedzie ku systemom wykrywania wykazującym wyższość nad konwencjonalnie stosowanymi odczynnikami przeciwko fragmentom stałym przeciwciał. W przykładzie 16 opisano układ ELISA dla ilościowego oznaczania immunoreaktywnych BR55-2/mysich IgG3 lub BR55-2 mysich IgG2a. Na fig. 27 przedstawiono typową krzywą standardową dla takich przeciwciał w surowicy ludzkiej.
Podobny układ ELISA, oparty na przeciwciałach antyidiotypowych opisanych w niniejszym wynalazku, może być zastosowany dla wysoce swoistego oznaczania ilościowego immunoreaktywnych chimerycznych mysio-ludzkich przeciwciał BR55-2 w surowicy człowieka. Takie przeciwciała chimeryczne składają się z domen zmiennych BR55-2 i z ludzkich fragmentów stałych (np. ludzkiego IgG1 lub ludzkiego IgG3). Z powodu dużego nadmiaru normalnej immunoglobuliny w surowicy człowieka (>10 mg/ml), takie przeciwciała chimeryczne nie mogą być wykrywane w ludzkiej surowicy przy użyciu konwencjonalnych odczynników przeciwko ludzkim Fc, które mogą wiązać się z dowolnym przeciwciałem obecnym w surowicy. Selektywne układy ELISA przedstawiono w przykładach 17 i 18, typowe krzywe standardowe w surowicy ludzkiej pokazano na fig. 28 i 29.
Przeszczepiając regiony określające komplementamość (CDR) macierzystych mysich przeciwciał monoklonalnych na regiony szkieletowe i fragmenty stałe przeciwciał ludzkich uzyskano w pełni humanizowane warianty BR55-2. Określone drogą komputerowego modelowania, pewne mutacje punktowe w ludzkich regionach szkieletowych prowadzą do wytworzenia wariantów humanizowanych bez istotnego obniżenia powinowactwa do komórek nowotworowych noszących antygen Lewis Y, w porównaniu do macierzystych przeciwciał mysich. Tak więc, w takich humanizowanych odmianach niezmieniony pozostaje jedynie niewielki fragment oryginalnej mysiej sekwencji aminokwasowej, określającej swoistość przeciwciała. Co godne podkreślenia, wszystkie przeciwciała monoklonalne anty-id BR55-2 opisane w niniejszym· wynalazku również wiążą się silnie z owymi humanizowanymi odmianami IgG1 mysiego przeciwciała monoklonalnego IgG3. Charakter wiązania przeciwciał antyidiotypowych do odmian humanizowanych przeciwciała Ab1 jest porównywalny do monoklonalnego mysio-ludzkiego przeciwciała chimerycznego wzmiankowanego powyżej. Wykazano to analizą bioswoistej interakcji przy użyciu systemu BIAcore® firmy Pharmacia. W większości przypadków obserwuje się przy wyższych stężeniach stosunek stechiometryczny pomiędzy anty-id BR55-2, BR55-2/chimeryczną ludzką IgG1 i BR55-2/humanizowaną IgG1 zbliżony do 1:1. Szczegóły doświadczalne przedstawione są w przykładzie 19, zaś krzywe miareczkowania na fig. 30 - 35. Wyniki te podkreślają swoistość wiązania antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych do nietkniętej struktury przestrzennej regionu hiperzmiennego każdego z wariantów BR55-2 i dowodzą istnienia w tych przeciwciałach obrazu wewnętrznego antygenu.
175 651
Dzięki unikalnemu i swoistemu wzorcowi rozpoznawania przeciwciał monoklonalnych anty-id 55-2 mogą one być też używane do wysoko swoistego ilościowego oznaczania immunoreaktywnych humanizowanych przeciwciał o swoistości BR55-2 w ludzkiej surowicy, przy obecności tam wysokiego nadmiaru ludzkich przeciwciał. Ten sam system ELISA jest też użyteczny dla ilościowego oznaczania humanizowanych przeciwciał o swoistości BR55-2 w surowicy małpy. Jest to przykładowo ważne dla badań nad toksycznością i farmakokinetyką w trakcie przedklinicznych testów humanizowanych przeciwciał monoklonalnych dla zastosowania w biernej immunoterapii. Ten system ELISA jest opisany w przykładzie 20, typowa krzywa standardowa dla surowicy ludzkiej na fig. 36.
Rozpoznawanie regionu wiążącego każdego z wariantów BR55-2 przez anty-id BR55-2 jest dodatkowo wykazane w badaniach nad kompetycyjnym hamowaniem wiązania BR55-2/mysiej IgG3 z anty-id BR55-2 nr E4 przez BR55-2/chimeryczna ludzka IgG1 i przez BR55-2/chimeryczna ludzka IgG3. Oba przeciwciała chimeryczne hamują kompetycyjnie wiązanie stałego stężenia macierzystego mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-id BR55-2 nr E4 z anty-id BR55-2 w stopniu zależnym od ich stężenia. Kompetycyjna ELISA została opisana w przykładzie 21, a wyniki przedstawiono na fig. 37.
Warunkiem wstępnym niszczenia komórek linii nowotworowych przez układ dopełniacza jest wiązanie BR55/mysiej IgG3 z antygenem obecnym na powierzchni komórek. Tak więc hamowanie cytotoksyczności względem nowotworu przez przeciwciała monoklonalne anty-id BR55-2 odzwierciedla ich zdolność do blokowania wiązania Ab1 z jego antygenem na powierzchni komórki. Silna neutralizacja cytotoksyczności z udziałem dopełniacza względem komórek raka sutka człowieka SKBR5 zależnej od BR55-2/mysiej IgG3 poprzez anty-id BR55-2 nr E4 jest udokumentowana na fig. 38, szczegóły doświadczalne przedstawiono w przykładzie 22.
Dzięki wysoko swoistemu rozpoznawaniu wszystkich struktur w obrębie miejsca wiążącego BR55-2 przeciwciała monoklonalne anty-id BR55-2 mogą zostać użyte dla immunoadsorbcyjnego oczyszczania każdego z wariantów BR55-2. W tym celu przeciwciała anty-id BR55-2 nr E4 unieruchomiono na CH-Sefarozie B4. Taki materiał do immunoadsorbcji może być przykładowo użyty bezpośrednio do oczyszczenia BR55-2 chimerycznych ludzkich IgG1 uzyskanych w hodowlach in vitro. Uzyskuje się przeciwciała chimeryczne z wydajnością 75%, o stopniu czystości >95%. Dzięki znacznie podwyższonej selektywności ta metoda oczyszczania przez immunopowinowactwo jest znacznie lepsza od oczyszczania przez powinowactwo z użyciem białka A. Szczegóły doświadczalne podano w przykładzie 23. Obraz z SDS-PAGE przedstawiono na fig. 39. Nie wykryto zanieczyszczeń. Ta sama metoda może być z powodzeniem zastosowana (z podobnymi efektami) dla jednostopniowego oczyszczania humanizowanych wariantów BR55-2 uzyskanych po przeszczepieniu fragmentów CDR komórkom w hodowlach.
W podsumowaniu, immunizacja królików lub małp rezus mysim antyidiotypowym przeciwciałem monoklonalnym klasy IgG1 przeciw idiotypowi przeciwciał o swoistości BR55-2 (anty-id BR55-2 nr E4) prowadzi do wytworzenia wysokiego miana przeciwciał wiążących komórek nowotworowych, noszących antygen powierzchniowy Lewis Y. Jak wykazano w doświadczeniach na małpach rezus, przez powtarzalne szczepienia dawkami przypominającymi można uzyskać stan immunizacji trwający latami. Przeciwciała wytworzone w odpowiedzi, pośredniczą w powstawaniu cytotoksyczności limfocytaraej względem nowotworu w mechanizmie ADCC. Swoistość immunizacji przez przeciwciała antyidiotypowe potwierdzono szczepiąc grupę kontrolną małp rezus nieswoistą immunoglobuliną klasy IgG1. Pomimo istotnej odpowiedzi odpornościowej na nieswoistą mysią IgG1, nie wykrywa się w tym przypadku swoistego wiązania z komórkami nowotworowymi jakiegokolwiek typu.
Wyniki te podkreślają użyteczność przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-, jako substytutu antygenu związanego z nowotworami Lewis Y przy terapeutycznej i zapobiegawczej immunizacji w celu indukcji u człowieka zabezpieczającej go odporności przeciwnowotworowej.
175 651
Co więcej, immunizacja małp rezus przeciwciałami monoklonalnymi anty-id BR55-2 prowadzi do powstania w surowicy wysokiego miana przeciwciał swoiście wiążących komórki zakażone wirusem HIV. Wiadomo, że komórki te noszą powierzchniowy antygen Lewis Y. W przeciwieństwie, immunizacja małp rezus nieswoistymi mysimi przeciwciałami klasy IgG1 nie powoduje powstania przeciwciał wiążących swoiście ani komórek zakażonych HIV, ani też komórek niezarażonych.
Wyniki te podkreślają użyteczność przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2 jako substytutu antygenu węglowodanowego Lewis Y, w celu indukcji u człowieka zabezpieczającej go odporności przeciwko HIV i chorobom przezeń wywoływanym.
Poza użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2 w celach zapobiegawczych i terapeutycznych szczepień, owe antyidiotypowe przeciwciała monoklonalne noszące obraz wewnętrzny antygenu, są użytecznymi odczynnikami dla wysoko swoistego ilościowego oznaczania cząsteczek o swoistości BR55-2, włączając w to chimeryczne i humanizowane warianty w surowicy i innych płynach ustrojowych. Możliwe jest też użycie tych antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych, poprzez unieruchomienie ich na odpowiednim podłożu, dla celów wysoko selektywnej i wysoko wydajnej jednostopniowej metody immunoadsorbcyjnego oczyszczania jakichkolwiek cząsteczek o swoistości BR55-2.
Niniejszy wynalazek jest przedstawiony następującymi przykładami. Użyto następujących skrótów:
ADCC : cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał
BSA : albumina surowicy bydlęcej
CDC : cytotoksyczność zależna od układu dopełniacza
DMEM: pożywka Eagle w modyfikacji Dulbecco
EDC : chlorowodorek N-etylo-N'-(3'-dimetyloaminopropylo) karbodimidu
ELISA : tett immunoenzmnttyczny
FCS : płodowa surowica delęra
HBS : sót fżjjoo^gic^:^r^a z buforem HEPES
Mab : przeciwciało(at monokfonalne
NHS : mid Iwassu N-hydroktybursztyzowego
PBMC : komórki jednojądrzaste krwi obwodowej
PBS : sól fizjologiczna buforowana fosforanami
RAM-IgG1 : królicze przeciwciała(o) przeciw mysim IgG1
RPMI : medium RPMI (od RosweU Park Memoriał Institute)
SDS : oodowa sól saacczanu dodezySu
KLH : immunogermy noźnik Hakkow^ (łtemozyianma ślimaka)
SPDP : N-sukczzlmidylo-3-(2-pirydylo-ditio-propioniaz)
PAGE : elektroforeza w żelu poliakiylamidowym
IEF : ogniskowanie izoelektrzczze
PEG : glikol polietylenowy
FITC : icotiocyjaziaz fluoresceiny
IFA : test lmmuzofluorescencyjzy W przykładach mowa o następujących materiałach:
| Płytki 96-dołkowe | : Py/tki I | [nlmuzopiates I (firmy INUNC) |
| Linie komórkowe: | ||
| SKBR5 | : ludzka | lima raka uutka |
| CATO | : ludzka | nma maa łołąaka |
| SW948 | : ludzka | Ιι™ ^a tetka guubgoo |
| SW2 | : ludzka | linia raka drobnokomórkowego płuca |
| WM9 | : uudzka | iżna czermaka ztośiiwego |
| PALL | : uudzka | iinia Tśiimfozyiarna |
| SP2 | : ny^a iima szpćczaka |
175 651
| Pożywka A | : RPMI + 2 g/l NaHCO3 100 U/ml penicyliny G |
| Pożywka B | 100 μ g/ml siarczanu streptomycyny 4 mM glutaminy 10% FCS (inaktywowanej cieplnie, wolnej od γ-globulin) : RPMI + 2 gC NaHCO3 100 U/ml penicyliny G |
| Pożywka C | 100 μ g/ml siarczanu streptomycyny 4 mM glutaminy 5% FCS (inaktywowanej cieplnie) : DMEM 10% NCTC-135 (pożywka syntetyczna, GIBCO) 1% MEM bez aminokwasów niezbędnych (GIBCO) 0.5% pirogronianu sodowego 0.5% kwasu oksaloctowego (Sigma) 20% FCS (inaktywowanej cieplnie) 4 mM glutaminy 100 U/ml penicyliny G |
| Pożywka D | 100 μ g/ml siarczanu streptomycyny : Pożywka C + 1.36 mg/l hipoksantyny 0.39 mg/l tymidyny |
| Pożywka E Pożywka G | : Pożywka D + 0.4 mg/l aminopteryny : DMEM 10% FCS (inaktywowanej cieplnie) 4 mM glutaminy 100 U/ml penicyliny G |
| Pożywka H | 100 μ g/ml siarczanu streptomycyny : 10 mM kwasu N-(2-hydroksyetylo)piperazyno- N' -2-etanosulfonowego 3.4 mM kwasu etylenodinitryloczterooctowy 0.15 M NaCl |
| PEG | 0.005% P20 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja) : glikol polietylenowy (masa cząsteczkowa = 3400) 1 g rozpuszczono w 1 ml DMEM PBS def: 138.0 mM NaCl 1.5 mM KOH 2.7 mM KCl 6.5 mM Na^HPOi |
pH 7.2
Bufor do opłaszczania : 15 mM Na2CO3 35 mM NaHCO3
| Bufor barwiący | 3 mM NaN3 pH 9.6 : 24.3 mM kwasu cytrynowego 51.4 mM Na2HPC>4 |
pH 5.0
Bufor do płukania : 2% NaCl
0.2% Triton Χ-100 w niezupełnym PBS
Roztwór substratu : 40 mg dwuchlorowodorku Offenylenodiaminy (OPD) 100 ml bufor barwiący 20 μ 1 30% H2O2
175 651
Bufor do adsorbcji : 0.1 M TrisHICl 0.2 M NaCl pH 7.5
Bufor do elucji : 0.15 M ghcjrnaHICl
0.2 M NaCl pH 2.8
Bufor do przyłączania : 0.1 M NaHCO3
0.5 M NaCl pH 8.0
Przykład 1: Wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał anty-id BR55-2
1.1 Immunizacja myszy
Myszy Balb/c immunizowano podając w każdym przypadku dootrzewnowo 100 μ g fragmentu F(ab')2 BR55-2/mysiej IgG3 sprzężonego z KLH poprzez SPDP jak opisano (J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 723,1978), według następującego schematu:
dzień 0 : 100 ,wg koniugatu (1 mg/ml w PBS def.) + 100 ^g kompletnego adjuwantu Freunda dzień 7 i 28 : 100 ^g koniugatu (1 mg/ml w PBS deb) + 100 ^g niekompletnego adjuwantu Freunda
W dniach 8, 9, 10 i 11 po pierwotnej immunizacji podawano i.v. w sumie 4 dawki przypominające (każda-100 μg koniugatu w 100 μ 1 PBS def.). W dniu 12 usunięto śledziony w warunkach aseptycznych, komórki zawieszono w PBS def. i przepłukano 3 razy w PBS def.
1.2: Hybrydyzacja
Splenocyty dodawano do zawiesiny komórek SP2/0 w stosunku 1:1 i żwirowano przy 900 g przez 5 min. Do peletki kroplami dodano 1 ml roztworu PEG (37°C) w przeciągu 1 min. i rozcieńczono 1 ml PBS def. (37°C) w ciągu kolejnej minuty. Następnie dodano 10 ml pożywki C, delikatnie- obracając próbkę, a następnie zawiesinę rozcieńczono w 50 ml PBS def. Po żwirowaniu przy 800 g przez 5 min., peletkę zawieszono w pożywce D i przeniesiono komórki do studzienek płytki 96-dołkowej (Nunc 96) przy gęstości 2.5 x 105 komórek/studzienkę. Po inkubacji przez noc w 37°C, 5% CO2, do każdej studzienki dodano 100 μg pożywki E. Po 72 godzinach, a następnie co 4 dni wymieniano pożywkę na pożywkę D.
Przykład 2: Ilościowe oznaczanie mysiej IgG w nadsączach z hodowli hybrydoma
Porcje 100 μ 1 króliczych przeciwciał przeciwko mysiej IgG (jak np. odczynnik firmy Nordic, 1:1000, w buforze do opłaszczania) dodano do studzienek płytki 96-dołkowej, inkubując przy 37°C przez 60 minut. Płytki płukano 6 - krotnie buforem do płukania, dodano 200 μ1 FCS w PBS def. i inubowano przez 30 min. w temp. 37°C. Płukano płytki tak jak podano powyżej. Dodano (po 100 μΐ) próbki super^antów z dwutygodniowej hodowli hybrydoma i inkubowano w 37°C przez 60 min. Niezwiązane przeciwciała usunięto płucząc, jak podano poprzednio. Następnie dodano po 100 μ1 przeciwciała skoniugowanego z peroksydazą (przeciwciało królicze przeciwko mysiej IgG/peroksydaza, takie jak np. odczynniki firmy Dianova; 1:100 w 2% FCS/PBS. Po inkubacji 30 minutowej w 37°C, przepłukano płytki 4 - krotnie buforem do płukania, i 2 razy buforem barwiącym. Dodano po 100 μ 1 roztworu substratu i po 5 min. zatrzymano reakcję barwną za pomocą 50 μ 1 4N H2SO4. Pomiaru ekstynkcji dokonywano przy długości światła 492 nm przy pomiarze odniesienia 620 nm.
Przykład 3: Swoiste wiązanie IgG z nadsączy hodowli hybrydoma z fragmentem F(ab')2 BR55-2. (ELISA).
Hybrydoma wytwarzające dostateczne ilości mysiej IgG (dającej powyżej 10 - krotną gęstość optyczną w porównaniu z kontrolą negatywną - pożywka) subklonowano w hodowlach jednokomórkowych w pożywce F, hodując następnie przez dalsze 2 tygodnie w pożywce C. Badano nadsącza, jak opisano w przykładzie 2, z użyciem po 100 μ 1 fragmentu F(ab')2 BR55-2 (10 μg/ml; w buforze do opłaszczania).
175 651
Przykład 4: Hamowanie wiązania BR55-2/mysiej IgG2a z komórkami ludzkiego raka sutka SKBR5 przez IgG obecne w nadsączach hodowli hybrydoma (cell-ELISA)
Wszystkie nadsącza, które okazały się dodatnie w teście opisanym powyżej, sprawdzano jak następuje:
Płytki 96 dołkowe pokryte bromowodorkiem poli-L-lizyny (20-30 kD; 20 μ g/ml w PBS def. 200 μΐ/studzienkę; 30 min.; temperatura pokojowa), przepłukano dwukrotnie PBS def. (200 μΐ/studzienkę) i inkubowano przez noc w 4°C z 50 μΐ zawiesiny komórek SKBR5 w medium B (4 x 10 6 komórek/studzienkę). Po usunięciu nadsączy komórki utrwalono 50 μ l/studzienkę glutaraldehydu (0.1% w soli fizjologicznej) przez 5 min. w temperaturze pokojowej, i po usunięciu nadsączy, zawieszono komórki w 200 μ l/studzienkę 1% BSA, 0.1% NaN3 w PBS def. i pozostawiono w temperaturze pokojowej na okres 1 godziny. Usunięto nadsącza i dwukrotnie płukano płytki 200 μ l/studzienkę 0.05% Tween 20/PBS.
Nadsącza hodowli hybrydoma, o stałym stężeniu mysiej IgG (1 μ g/mł) preinkubowano z 10 - krotnym nadmiarem niespecyficznej mysiej IgG w temperaturze 37°C przez 30 min. Następnie próbki te preinkubowano z 0.5 μ g/ml BR55-2/mysiej IgG2a w temp. 37°C, przez 30 min. Po 100 μ 1 tej mieszaniny dodawano do komórek i inkubowano płytki przez 60 min. w temp. 37°C. Opracowanie powyższej mieszaniny: Niezwiązane przeciwciała wymywa się dwukrotnie 100 μ l/studzienkę zimnego PBS z dodatkiem 0.05% Tween 20. Dodaje się następnie po 100 μ 1 przeciwciała sprzężonego z peroksydazą (przeciwciało królicze przeciw mysiej IgG2a/peroksydaza, tak jak np. przeciwciało firmy Zymed; 1:1000 w 2% FCS/PBS def. Po inkubacji w 37°C przez 45 min. przepłukuje się każdą studzienkę trzy razy wspomnianym powyżej roztworem PBS/Tween 20, następnie dodaje się po 100 μ 1 roztworu substratu. Reakcję barwną zatrzymuje się po 5 min. przez dodanie 50 μ1 4N H2SO4 do wszystkich studzienek. Wiązanie przeciwciał do komórek określone zostaje poprzez pomiar ekstynkcji przy 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 5: Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2 poprzez chromatografię immunopowinowactwa.
5.1: Przygotowane BR55-2lmysiej IgG2a - Sefaroza g liofilizowanej antywowanej CH-Sefarozy zawieszono w 1 mM HCl, przeniesiono na szklany filtr i przemyto 2 litrami 1 mM HCl w przeciągu 15 min. Ligand (120 mg BR55-2/mysiej IgG2a) rozpuszczony w 50 ml buforu do przyłączania mieszano w zamkniętym naczyniu z przepłukanym żelem, następnie mieszano w mieszadle obrotowym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie przepłukano żel buforem do przyłączania i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej z 50 ml 1M etanolaminy dla zablokowania wolnych grup aktywnych. Następnie sorbent przepłukano w trzech cyklach zmiennego pH. Każdy z nich składał się z płukania w pH 4 (0.1 M kwas octowy, 0.5 M NaCl) z następowym płukaniem w pH 8 (0.1 M Tris, 0.5 M NaCl).
5.2: Izolacja monoklonalnych przeciwciał anty-id BR55-2
Chromatografię przeprowadzano w 4°C. Kolumnę (BIO REX MP średnica 1.5 cm) wypełniono 35 ml BR55-2/mysia IgG2a - Sefaroza. Żel przepłukano buforem do wiązania i buforem do elucji. Po zrównoważeniu buforem do wiązania przepuszczono przez kolumnę pożywkę zawierającą przeciwciało anty-id BR55-2 z prędkością przepływu 15 ml/min. Po wymyciu resztek frakcji niezwiązanej, związane anty-id BR55-2 eluowano buforem do elucji, zaraz po tym przeprowadzając neutralizację 1M buforem Tris/HCl pH 7.5.
5.3: Zatężanie przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2
Zatężanie przeprowadzono w komorze do ultrafiltracji Amicon przy użyciu błony Diaflo PM 10. Oddzielono ponad 98% solutu. Ostateczne stężenie IgG wyniosło 3.7 mg/ml.
Przykład 6: Charakteryzacja oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych anty-id BR55-2
6.1: Chromatografia jonowymienna na Mono-Q
Kolumna : Mt^i^[-Q fR55/5 ^Phirra^acka)
Bufor A : 20 nM5 trieianoinmina, pH 7.7
175 651
Bufor B : 20 mM trietanolaminai IM NaCl, pH 7.7
Prędkość przepływu : 1 ml/min.
Detekcja : UV 280 rnn
Gradient : llniowy, 2%//mn.
Wyniki : czystość dla wszystkich monoklonalnych przeciwciał anty-id BR55-2 >95%
6.2: Wysokowydajna chromatografia sita molekularnego
Kolumna Bufor
Prędkość przepływu
Detekcja
Wyniki
6.3: SDS-PAGE
Zorbax GF259i 9.4 x 250 mm fosforan sodowy 0.1 Mi 0.2 M NaC, pH 1 ml/min.
UV 280 nm dla wf^^^t^^i<elh monoklonalnych przeciwciał anty-id BR55-2 >95%
Doświadczenia wykonano zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących, zgodnie z metodą Laemmli, stosując 10% żele akrylamidowe. Nie wykrywano jakichkolwiek zanieczyszczeń (wyniki przedstawiono na fig. 1).
6.4: Ogniskowanie izoelektryczne
Analizę przeprowadzono w systemie Phast (Pharmacia) stosując gradient pH 3 - 9 (żel Phast IEF 3-9, z wybarwianiem srebrem (wyniki przedstawiono na fig. 2).
Przykład 7: Wiązanie BR55-2/mysiej IgG3 z komórkami imii SKBR5 (cell-ELISA) - Hamowanie przez oczyszczone antyidiotypowe przeciwciała monoklonalne
Przygotowanie płytek 96 - dołkowych przeprowadzono jak opisano w przykładzie 4. Odpowiednie przeciwciała anty-id BR55-2 rozcieńczano w 2% FCS/PBSdef. (10 do 0.5 /ig/ml). Do każdego z rozcieńczeń dodano po 1 μ g/ml BR55-2 mysiej IgG3. Do komórek dodawano po 100 μΐ tej mieszaniny i inkubowano płytki przez 1 godzinę w temp. 37°C. Opracowanie mieszaniny przedstawiono w przykładzie 4. Zasięg wiązania BR55-2/mysiej IgG3 z komórkami oceniano poprzez pomiar ekstynkcji przy długości światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 8: Immunizajja króiików i map rezus ćuty--kl BR55-2 nr E4
8.1: Immunizacja królików anty-id BR55-2 nr E4
Trzy samice królika chinchilla poddano immunizacji przez śródskórne wstrzyknięcie 300 μ g anty-id BR55-2 nr E4 zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu (1 mg przeciwciała plus 3.3 mg Al(OH)3/ml PBD def.) w dniach 1,8,15 i 36. Dla kontroli trzy króhki immunizowano nieswoistą mysią IgG1, w tej samej dawce, i sposobie podania. Przed immunizacją i w 9 tygodniu po pierwszej immunizacji zebrano surowice.
8.2: Immunizacja małp rezus anty-id BR55-2 nr E4
Trzy małpy rezus immunizowano przez podskórne (s. c.) podanie 0.1 mg anty-id BR55-2 nr E4/kg zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu (1 mg przeciwciała plus 33 mg Al(OH)3/ml PBD def.) w dniach 1, 8,15 i 36. Dla kontroli dwie małpy immunizowano nieswoistą mysią IgGl, w tej samej dawce, i sposobie podania. Przed immun-zaceą oraz w 4 i 9 tygodniu po pierwszej immumzacei zebrano surowice.
Dwa lata po pierwszym kursie immunizacei te same małpy dostały s.c. pierwszą z dawek przypominających: odpowiednio anty-id BR55-2 nr E4 lub nieswoistą mysią IgG1, w tej samej dawce, i formie jak poprzednio. Przed oraz w 1, 4 i 9 tygodniu po pierwszej dawce przypominającej zebrano surowice; Trzy lata po pierwszym kursie immun-zacj'i (=1 rok po pierwszej dawce przypominającej) te same małpy dostały s.c. drugą dawką przypominającą: odpowiednio anty-id BR55-2 nr E4 lub nieswoistą mysią IgGl, w tej samej dawce i formie jak poprzednio. Przed jej podaniem, oraz w 1, 4 i 9 tygodniu po drugiej dawce przypominającej ponownie zebrano surowice.
175 651
Przykład 9: Wiązanie przeciwciał surowicy królika z komórkami Unii
SKBR5 i nr M9 (cell-ELISA)
Przygotowanie płytek 96 - dołkowych przeprowadzono jak opisano w przykładzie 4. Do komórek dodawano po 100 μΐ odpowiednio rozcieńczonych próbek surowic i inkubowano płytki przez 1 godzinę w temp. 37°C. Stopień wiązania przeciwciał z komórkami oceniano poprzez pomiar ekstynkcji przy długości światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 10: Wiązanie przeciwciał surowćczych map rezus, lub oczyszczonych przez immunopowinowactwo przeciwciał (Ab3) z komórkami linii SKBR5, CATO, SW948, SW2 i WM9 (cell-ELISA)
Przygotowanie płytek 96 - dołkowych przeprowadzono jak opisano w przykładzie 4. Do komórek dodawano po 100μΐ przeciwciał surowiczych lub oczyszczonych przez immunopowinowactwo przeciwciał małp rezus (zobacz też przykład 12), w odpowiednich rozcieńczeniach, i inkubowano płytki przez 1 godzinę w temp. 37°C. Opracowanie mieszaniny przedstawiono w przykładzie 4. Stopień wiązania przeciwciał z komórkami oceniano poprzez pomiar ekstynkcji przy długości światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 11: Wiązanie przeciwciał surowiczych małp rezus, lub oczyszczonych przez immunopowinowactwo przeciwciał (Ab3) z preparatami błon komórkowych linii nowotworowych SKBR5 i WM9 (ELISA)
Błony komórkowe ludzkiej linii nowotworowej SKBR5, noszącej antygen Lewis Y, i linii czerniaka złośliwego, nie posiadającej tego antygenu, przygotowano zgodnie z literaturą (D. Thom et al., Biochem. J. 168, 187-194 (1977). Próbki po 100 μΐ odpowiednich preparatów błon komórkowych (10 μg/ml, rozcieńczone w buforze do opłaszczania) dodano do studzienek płytki 96 - dołkowej i inkubowano przez noc w 4°C. Płytki przemyto 4 razy buforem płuczącym, po czym inkubowano przez 30 minut w 37°C z 200 μl 5% FCS/PBS def. Przepłukano płytki jak powyżej. Do studzienek dodano po 100 μ l małpich surowic lub oczyszczonych przeciwciał (patrz także 2), odpowiednio rozcieńczonych w 2% FCS/PBF def., i inkubowano przez 60 minut w 37°C. Wymyto następnie niezwiązane przeciwciała, jak podano powyżej, i dodano po 100 μΐ przeciwciała sprzężonego z peroksydazą (kozia Ig przeciw ludzkiej Ig/peroksydaza, tak jak np. odczynniki firmy Chemicon & Co., 1:1000 w 2% FCS/PBS def.). Po 30 min. inkubacji w 37°C przemyto płytki dwukrotnie buforem płuczącym, po czym dwukrotnie buforem barwiącym. Dodano po 100 μ- roztworu substratu i po 5 min. zatrzymano reakcję barwną przez dodanie po 50 μΐ 4N H2SO4. Ekstynkcję mierzono przy długości światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 12: Oczyszczanie surowiczych przeciwciał małp rezus immunizowanych anty-id BR55-2 nr E4 (Ab3) poprzez immunopowinowactwo, z użyciem anty-id BR55-2 nr E4 - Sefarozy
12.1: Przygotowanie anty-id BR55-2 nr E4 - Sefarozy g liofilizowanej aktywowanej CH-Sefarozy 4B zawieszono w 1 mM HCl, przeniesiono na szklany filtr i przemyto 2 litrami 1 mM HCl w przeciągu 15 min. Ligand (95 mg anty-id BR55-2 nr E4) rozpuszczony w 50 ml buforu do przyłączania mieszano w zamkniętym naczyniu z przepłukanym żelem, następnie mieszano w mieszadle obrotowym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie przepłukano żel buforem do przyłączania i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej z 50 ml. 1M etanolaminy dla zablokowania wolnych grup aktywnych. Następnie sorbent przepłukano w trzech cyklach zmiennego pH. Każdy z nich składał się z płukania w pH 4 (0.1 M kwas octowy, 0.5 M NaCl) z następowym płukaniem w pH 8 (0.1 M Tris, 0.5 M NaCl).
175 651
12.2: Izolacja surowiczych przeciwciał (Ab3) małp rezus immunizowanych anty-id BR55-2 nr E4
Chromatografię przeprowadzano w 4°C. Kolumnę (Pharmacia HR 5/2, wymiary komory 5 x 25 mm) wypełniono 35 ml anty-id BR55-2 nr E4 - Sefaroza. Żel przepłukano buforem do wiązania i buforem do elucji. Materiałem wyjściowym jest 2 ml surowicy małpy rezus immunizowanej anty-id BR55-2 nr E4 uzyskanej w 9 tygodniu od rozpoczęcia cyklu immunizacji. W innej serii doświadczeń użyto 2 ml spulowanej surowicy uzyskanej od małpy rezus w 4 i 9 tygodniach po podaniu drugiej dawki przypominającej. Odpowiednią surowicę rozcieńczano w stosunku 1:2 w buforze do wiązania i nanoszono na kolumnę. Po usunięciu resztek frakcji niezwiązanej, związane przeciwciała małpy rezus eluowano buforem do elucji, zaraz po tym przeprowadzając neutralizację 1M buforem Tris/HCl pH 7.5.
Przykład 13: Wiązanie przeciwciał surowiczych, lub oczyszczonych przez immunopowinowactwo przeciwciał małp rezus immunizowanych anty-id BR55-2 nr E4 lub nieswoistą mysią IgG1 z anty-id BR55-2 nr E4 (ELISA)
Próbki po 100 μ 1 anty-id BR55-2 (10 μg/ml, rozcieńczone w buforze do opłaszczania), dodano do studzienek płytki 96 - dołkowej i inkubowano przez 60 min. w 37°C. Płytki przemyto 6 razy buforem płuczącym, po czym inkubowano przez 30 min. w 37°C z 200 fil 5%. FCS/PBS def. Przepłukano płytki jak powyżej. Do studzienek dodano po 100 μ 1 małpich surowic lub oczyszczonych przeciwciał (patrz także 2), odpowiednio rozcieńczonych w 2% FCS/PBF def., i inkubowano przez 60 min. w 37°C. Wymyto następnie niezwiązane przeciwciała, jak podano powyżej, i dodano po 100 μΐ przeciwciała sprzężonego z peroksydazą (kozia Ig przeciw ludzkiej Ig/peroksydaza, tak jak np. odczynniki firmy Chemicon & Co., 1:1000 w 2% FCS/PBS def.). Po 30 min. inkubacji w 37°C przemyto płytki czterokrotnie buforem płuczącym, po czym dwukrotnie buforem barwiącym. Dodano po 100 fil roztworu substratu i po 5 min. zatrzymano reakcję barwną przez dodanie po 50 μ 1 4N H2SO4. Gęstość optyczną (OD) mierzono przy długości fali światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 14: Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC) BR55-2/mysia IgG3 lub oczyszczonych przez immunopowinowactwo przeciwciał małpy (Ab3), realizowana przez ludzkie PBMC przeciw komórkom SKBR5
W dniu poprzedzającym test komórki SKBR5 przeniesiono do świeżej pożywki A i trzymano w 5% CO2 w 37°C w butelce do hodowli komórkowych.
Znakowanie komórek docelowych 51Cr:
Zebrane z butelki hodowlanej komórki inkubowano z 100 μ Ci Na251CrO4 w 5% CO2 w temp. 37°C, przy gęstości 5 x 106 komórek w 800 μ 1 pożywki A. Następnie komórki przepłukano pożywką A dla usunięcia nadmiaru 51Cr, zawieszono w świeżej pożywce A i doprowadzono do gęstości 2.5 x 10* komórek/ml.
Izolacja PBMC:
ml świeżej heparynizowanej krwi ludzkiej rozcieńczono 60 ml kompletnego PBS z zawartością 0.1% glukozy. Porcje po 15 ml nawarstwiano na roztwór Fico11-Paque i wirowano przy 400 g przez 30 - 60 minut. Nadsącza z osocza odrzucano, a warstwy PBMC po zebraniu zawieszano w 50 ml kompletnego PBS z 0.1% glukozą. Po żwirowaniu przy ok. 80 g (przez 10 min.) przepłukaniu peletki 25 - 30 ml kompletnego PBS z 0.1% glukozy i ponownym żwirowaniu (80 g, 10 min.), peletkę zawieszono w pożywce A, liczono komórki i rozcieńczono je, doprowadzając do gęstości około od 2 x 106 do 9 x 106 komórek na mililitr. Rozpipetowano po 100 μΐ do studzienek płytki 96 - dołkowej i tak przygotowane komórki efektorowe inkubowano przez noc w 5% CO2, 37°C.
ADCC
Porcje po 100 μΐ komórek docelowych znakowanych 51Cr dodawano do przygotowanych dzień wcześniej komórek efektorowych w pożądanym stosunku komórek efektorowych do
175 651 docelowych (E/T ratio). Po dodaniu do studzienek odpowiednich stężeń przeciwciał rozpuszczonych w PBS def. (oczyszczone przez immunopowinowactwo przeciwciała małpy (Ab3) lub BR55-2/mysie IgG3), płytkę inkubowano przez noc (ok. 18 godzin) w 5% CO2, 37°C. Następnie zebrano nadsącza przy pomocy Skatron - Harvesting Press i zliczono w liczniku gamma. Dało to wartość uwalniania doświadczalnego. Maksymalne uwalnianie 51Cr określono w podobny sposób, w miejsce PBMC dodając 100 μ 1 2%o SDS, 50 mM Na2CO3 i 10 mM EDTA, a w miejsce roztworu przeciwciał - 50 μ l PBS def. Uwalnianie spontaniczne 5JCr okrellono dodając w miej‘sce PBMC - 100 μ 1 pożwkki A, a w miejsce przeciwciał - 50 μ 1 PBS def.
Po zliczeniu, wyniki skalkulowano według następującego wzoru:
% lizy uwalnianie doświadczalne uwalnianie anoctneiczne x 100 uwalnianie zupełne uwaieianie snentaniczne
Przykład 15: Wiązanie małpich przeciwciał surowiczych, oczyszczonych przez immunopowinowactwo przeciwciał małpy, i BR55-2/mysiej IgG3 z komórkami PALL zakażonymi/niezakażonymi przez HIV (immunofluorescencja pośrednia, test Waldheim IFA- Anti-HIVl)
W dostępnym w sprzedaży zestawie do testu immunofluorescencji (Waldheim & Co; nabywanym dla określania seropozytywności względem HIV) znajdują się zakażone i niezakażone HIV komórki PALL (ludzka linia limfocytów T) utrwalone na osobnych szkiełkach podstawowych. Warunki doświadczenia ustawiono w oparciu o wytyczne dostarczone przez producenta. Po inkubacji z 1% BSA przez 30 min. w 37°C, szkiełka inkubowano z surowicami małp rezus (zagęszczonych oraz rozcieńczonych 1:10 w PBS def.), lub z oczyszczonymi przez immunopowinowactwo przeciwciałami małpy (Ab3) rozcieńczonymi w normalnej surowicy ludzkiej, lub z BR55-2/mysią IgG3 przez 1 godz. w temp. 37°C. Jako pozytywną kontrolę użyto ludzką HIV(+) surowicę, jako kontrolę negatywną - surowicę ludzką HIV(-). Niezwiązane elementy testowanych próbek wymywano trzykrotnie PBS def. i dodawano 20 - krotnie rozcieńczony w 2% FCS/PBS def. odczynnik przeciwko ludzkiej IgG sprzężony z FITC (obecny w zestawie), lub (dla wykazania mysich przeciwciał) przeciwciało przeciw mysiej IgG, sprzężone z FITC. Po 30 minutowej inkubacji w 37°C i trzykrotnym płukaniu i zatopieniu preparatów oglądano je w mikroskopie- fluorescencyjnym, oceniając je w skali 0 (brak fluorescencji) do 5 (maksymalna fluorescencja).
Przykład 16: ELISA z użyciem anty-id BR55-2 nr E4 dla oznaczania immunoreaktywnej BR55-2/mysiej IgG3 lub BR55-2/mysiej IgG2a w ludzkiej surowicy
Próbki po 100 μ 1 anty-id BR55-2 nr E4 (10 μ g/ml, rozcieńczone w buforze do opłaszczania) dodano do studzienek płytki 96 - dołkowej i inkubowano przez 60 min. w 37°C. Płytki przemyto 6 razy buforem płuczącym, po czym inkubowano przez 30 min. w 37°C z 200 μ 1 5% FCS/PBS def. Przepłukano płytki jak powyżej. Do studzienek dodano po 100 μ 1 testowanych ludzkich surowic, zawierających BR55-2/mysią IgG3 lub BR55-2/mysią IgG2a (rozcieńczonych uprzednio w 2% FCS/PBS def. w pożądanym stosunku) i inkubowano przez 60 min. w 37°C. Jako standard używano BR55-2/mysią IgG3 lub BR55-2/mysią IgG2a, rozcieńczone uprzednio w ludzkiej surowicy do stężenia 10 μ g/ml. Ich odpowiednie stężenia w 2% FCS/PBS def. traktowano jak wyżej. Wymyto następnie niezwiązane przeciwciała, jak podano poprzednio, i dodano po 100 μ 1 przeciwciała sprzężonego z peroksydazą (królicze przeciw mysiej Ig/peroksydaza, tak jak np. odczynniki firmy Zymed, 1:1000
175 651 w 2% FCS/PBS def. Po 30 minutach inkubacji w 37°C przemyto płytki czterokrotnie buforem płuczącym, po czym dwukrotnie buforem barwiącym.
Dodano po 100 μ\ roztworu substratu i po 5 min. zatrzymano reakcję barwną przez dodanie po 50 μ 1 4N H2SO4. Gęstość optyczną (OD) mierzono przy długości fali światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Wartości OD (gęstość optyczna) próbek surowic porównano z krzywą standardową i wyrażono w μ g/ml.
Przykład 17: ELISA z użyciem kntz-ir BR55-2 nr E4 dla oceaczazik lmmunoreaktzwzej BR55-2/chfmegycznej ludzkiej IgG1 w ludzkiej surowicy
Próbki surowicy ludzkiej zawierające BRd5-2/zhfmegyczzą ludzką IgG1 zbadano adekwatnie do opisu w przykładzie 16 z użyciem przeciwciała sprzężonego z pegokszdacą (kozie przeciw ludzkiej .^G/peroksydaza; tak jak np. odczynniki firmy Chemicon & Co., w 1:1000 w 2% FCS/PBS).
Przykład 18: ELISA z umyimy mty-id BRnr-2 nr E4 da (zmaczania immunogbaktzwzej BR55-2/zhlmbgyzzzej ludzkiej IgG3 w ludzkiej surowicy
Próbki surowicy ludzkiej zawierające BR55-2/chimerycmą ludzką IgG3 zbadano adekwatnie do opisu w przykładzie 17.
Przykład 19: Anailza biospecyffcznej między
BR55-2/chimeiyzzzą ludzką IgG1 i BR55-2/humanizowazą IgG1, a przeciwciałami monoklonalnymi anty-id BR55-2 w czasie rzeczywistym
Doświadczenia przeprowadzono z pomocą systemu BIAcore® firmy PŁamicia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja. Wiązanie BR55-2/chfmerzczzej ludzkiej IgGl i BR552/humazlzowanej IgGl z szeregiem mysich przeciwciał monokśozalzyzh anty-id BR55-2, klasy IgGl, wiązanych przez unieruchomione przeciwciała królicze przeciwko mysiej IgGl (RAM-IgGl) (tak jak np. odczynniki firmy PharmEcia Biosezsog AB, Upssala, Szwecja) zostało ocenione poprzez analizę biospectUiczzej interakcji przeprowadzoną w czasie rzeczywistym.
Prędkość przepływu w obrębie systemu ustawiono na 5 μl/minutę. Moduł czujnika aktywowany był miescazizą 0.201 mg NHS i 1.313 mg EDC rozpuszczonych w 35 μΐ wody destylowanej. Następnie RAM-Ig^l (30 μ g/ml) rozpuszczone w 34 μ g 10 mM buforu octanowego pH 5.0 poddano reakcji ze zaktywowaną powierzchnią czujnika. Pozostające wolne miejsca aktywne zablokowano 35 μΐ 1M chlorowodorku etazolamlny/NaOH, pH 8.5.
Analizę przeprowadzono w trzech etapach:
1. Odpowiednie przeciwciało monoklozalze anty-id BR55-2 (E4, C11, B3, B9, G6, G9) rozcieńczano w pożywce H do końcowego stężenia 10 -17 μ g/ml. W każdym badaniu przeciwciało antyidiotypowe było wiązane do RAM-IgG1 w czasie przepływu nad powierzchnią czujnika. Jednostki odpowiedzi, proporcjonalne do masy związanego przeciwciała anty idio typowego były rejestrowane i przechowywane w pamięci.
2. Następnie wstrzykiwano 20 μΐ roztworów mysio/ludzkiej chimerycznej IgG1 i humanizowanej IgG1 w medium H w stężeniach 1 -100 t<l/ml i pozwalano im wiązać się ze związanymi powierzchniowo anty-id. Jednostki odpowiedzi, proporcjonalne do masy związanego przeciwciała mozoklozalzego były rejestrowane i przechowywane w pamięci.
3. Powierzchnię czujnika następnie regenerowano dla kolejnej analizy poprzez następujące po sobie wstrzyknięcia 5 μ 1 1M kwrsu mrówkowego i 5 μΐ 8M mocznika.
Współczynnik wiązania określano przez obliczenie stosunku maksimum Jednostek Odpowiedzi uzyskanego dla drugiego przeciwciała (mysio/ludzkiej chimerycznej IgG1 lub humanizowanej IgG1) do adekwatnej wartości dla pierwszego przeciwciała (odpowiednie kztyidiotypowe przeciwciało monokśozklzb).
175 651
Przykład 20: ELISA z użyciem anty-id BR55-2 nr E4 dla oznaczania immunoreaktywnej BR55-2/chimerycznej ludzkiej IgGl w ludzkiej surowicy
Badane ludzkie surowice badano na zawartość BR55-2 nr E4 według opisu w przykładzie 17.
Przykład 21: Hamowanie kompeyycyjne wiązama BR5ó^/mys! Ig^G^3 z anty-id BR55-2 nr E4 przez BR55-2/chimeryczną ludzką IgGl lub BR55-2/chimeryczną ludzką IgG3
Próbki po 100 μ 1 anty-id BR55-2 nr E4 (10 μg/ml, rozcieńczone w buforze do opłaszczania) dodano do studzienek płytki 96 - dołkowej i inkubowano przez 60 min. w 37°C.
Płytki przemyto 6 razy buforem płuczącym, po czym inkubowano przez 30 min. w 37°C z 200 μ 1 5% FCS/PBS def. Przepłukano płytki jak powyżej. Chimeryczne ludzkie IgGl lub chimeryczne ludzkie IgG3 rozcieńczano w 2% FCS/PBS def. (szereg od 0.5 μ g/ml do 3 ng/ml). Do każdego z rozcieńczeń dodano po 0.05 μg/ml BR55-2/mysiej IgG3. Do studzienek dodano po 100μ 1 przygotowanych mieszanin i inkubowano przez 60 min. w 37°C. Wymyto następnie niezwiązane przeciwciała, jak podano poprzednio, i dodano po 100 μ 1 przeciwciała sprzężonego z peroksydazą (kozie przeciw ludzkiej Ig/peroksydaza, tak jak np. odczynniki firmy Chemicon Co., 1:1000 w 2% FCS/PBS def.
Po 30 min. inkubacji w 37°C przemyto płytki czterokrotnie buforem płuczącym, po czym dwukrotnie buforem barwiącym.
Dodano po 100 μ 1 roztworu substratu i po 5 min. zatrzymano reakcję barwną przez dodanie po 50 μ 1 4N H2SO4. Ekstynkcję mierzono przy długości światła 492 nm (pomiar odniesienia przy 620 nm).
Przykład 22: Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) z udziałem przeciwciał BR55-2/mysia IgG3 przeciw komórkom SKBR5 - Hamowanie przez anty-id BR55-2 nr E4
W dniu poprzedzającym test komórki SKBR5 przeniesiono do świeżej pożywki A i trzymano w5% CO2 w 3rC w butelce do hodowli komórkowych.
Znakowanie komórek docelowych 51Cr:
Zebrane z butelki hodowlanej komórki inkubowano z 100 μ Ci Na251CrO4 w 5% CO2 w temp. 37°C, przy gęstości 5 x 106 komórek w 800 μ 1 pożywki A. Następnie komórki przepłukano pożywką A dla usunięcia nadmiaru 51Cr, zawieszono w świeżej pożywce A i doprowadzono do gęstości 2.5 x 1(r5 komórek/ml.
CDC:
Porcje po 100 μ 1 komórek docelowych znakowanych Cr rozpipetowano do studzienek. Następnie dodano odpowiednie stężenie przeciwciał anty-id BR55-2 nr E4 w PBS def. Z kolei dodano po 100 μ 1 ludzkiej surowicy zawierającej 2 μ g/ml BR55-2/IgG3 i inkubowano przez noc w 5% CO2, 37°C. Następnie zebrano nadsącza przy pomocy Skatron - Harvesting Press i zliczono w liczniku gamma. Dało to wartość uwalniania doświadczalnego. Maksymalne uwalnianie 51Cr określono w podobny sposób, w miejsce ludzkiej surowicy dodając po 100 μ 1 2% SDS, 50 mM Na2CO3 i 10 mM EDTA, a w miejsce anty-id BR55-2 nr E4 - 50 μ 1 PBS def. Uwalnianie spontaniczne 51Cr określono dodając w miejsce surowicy ludzkiej - pożywka A, a w miejsce roztworu anty-id BR55-2 nr E4 - 50 μ 1 PBS def.
Po zliczeniu wyniki skalkulowano według następującego wzoru:
% lizy = uwalnianie doświadczalne uwninianie spontaniczne uwalnianie zupełne x 100 uwalnianie spontaniczne
175 651
Przykład 23: Oczyszczanie BR55-2/chimerycznej ludzkiej IgG1 przez immunopowinowactwo, z użyciem anty-id BR55-2 nr E4 - Sefarozy
23.1: Przygotowanie anty-id BR55-2 nr E4 - Sefarozy g liofilizowanej aktywowanej CH-Sefarozy 4B zawieszono w 1 mM HCl, przeniesiono na szklany filtr i przemyto 2 litrami 1 mM HCl w przeciągu 15 min. Ligand (95 mg anty-id BR55-2 nr E4) rozpuszczony w 50 ml buforu do przyłączania mieszano w zamkniętym naczyniu z przepłukanym żelem, następnie mieszano w mieszadle obrotowym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie przepłukano żel buforem do przyłączania i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej z 50 ml. 1 M etanolaminy dla zablokowania wolnych grup aktywnych. Następnie sorbent przepłukano w trzech cyklach zmiennego pH. Każdy z nich składał się z płukania w pH 4 (0.1 M kwas octowy, 0.5 M NaCl) z następowym płukaniem w pH 8 (0.1 M Tris, 0.5 M NaCl).
23.2: Izolacja BR^55-2/chim^erycznej ludzkiej IgG1
Chromatografię przeprowadzano w 4 C. Kolumnę (BIO REX MP, średnica 1.5 cm) wypełniono 35 ml anty-id BR55-2 nr E4 - Sefaroza. Żel przepłukano buforem do wiązania i buforem do elucji. Materiałem wyjściowym jest 100 5 pożywki zawierającej BR55-2. Materiał zatężano 5:1 przy użyciu systemu Amicon z wkładem włóknistym P 10 i nakładano na kolumnę. Po usunięciu resztek frakcji niecwCącanej, związane przeciwciała małpy rezus eluowano buforem do elucji, zaraz po tym przeprowadzając neutralizację 1 M buforem Tris/HCl pH 7.5.
23.3: Zatężanie BR55-2/chimer^^(^:^nej ludzkiej IgG1
Zatężanie przeprowadzono w komorze do ultrafiltracji .Amicon przy użyciu błony Diaflo PM 10. Oddzielono ponad 98% solutu. Ostateczne stężenie IgG wyniosło 3.36 mg/ml.
23.4: Charakteryzacja oczyszczonej BR55-2|chimerycznej ludzkiej IgGl
23.4.1: Chromatografia jonowymienna na Mono-Q
Mono-Q HR5/5 (Pharmacia) mM trietanolamina (EEA), pH 7.7 20 mM (TEA), 1 M NaCl, pH 7.7 1 ml/min.
UV 280 nm liniowy, 2%/min. czystość >95 %
Kolumna Bufor A Bufor B
Prędkość przepływu Detekcja Gradient Wyniki
23.4.2: Wysoko wydajna chromatografia sita molekularnego
Zorbax GF250, 9.4 x 250 mm fosforan 5odo\M 0.1M, 0.H M NaCl, pH 7,0 ml/min.
UV 280 nm czystość >95%
Kolumna Bufor
Prędkość przepływu Detekcja Wyniki
23.4.3: SDS-PAGE
Doświadczenia wykonano w warunkach redukujących, zgodnie z metodą Laemmli, stosując 10% żele akrylamidowe (wyniki przedstawiono na fig. 10).
MATERIAŁ POCZĄTKOWY
Mysie monoklonalne przeciwciała BR55-2 są dostępne np. z hybrydoma BR55.2 (BR55-0/IgG3) i odpowiednio BR05.2S2a (BR-05-2/IgGOa).
Powyższe hybrydoma były pierwotnie zdeponowane 17 lutego 1987 r. i odpowiednio 10 marca 1987 r. w American Type Culture Collectim, Rockville, MD 20852, USA, zgodnie z postanowieniami Układu Budapeszteńskiego, pod numerami depozytu ATCC HB 9324 i odpowiednio ATC HB 9347.
175 651
0· <0*
Ο
Ν υ
*3 β
Μ υ
Ν
Ο
U «ί ω
u β
Ν
I ιη ιη
CH β
Ό Η U ι 0>
>ιΗ +4 ·* <0 S
01 3 S ν ε u
Μ -4
Λ £ •Μ +J 10 01 ε μ
Ο •Η 3 01 » «1 *Ο Μ 40 3 υ
(0
Ν •Η
Ο
U (0 ·<-ι
U
Ν
<Λ
Ο
Ν >
>ι
Ο
J>
σ>
Ν
3:
| Królik. Małpa anty-id BR55—k mysik IgGk anty-ik BR55-k mysik IgG1 | SKBRk (Y+) 1000 16 1000 8 | WMk (Y-) 3 nie testowane — k nik testowane |
175 651 w
u c
N
I
U) in «
a
I >1 c
Id ε
u u
•H
U
V
N
U
O.
N
U b
>.
O.
(0 ε
ii u nr m (0 C ·—I ε
o
o.
>1
N
U
O.
U ii
N
4) c
— o «4 N W U H 'C <4 4) U -4 — U N
Ul O « U
W ΤΊ u
O (ti O* N 4) -4 > ε o 5 S § o ε
| γΗ | Ό | |
| ta | 0 | 4) |
| ο> | 4J | Ν |
| Η | 44 | h |
(β α
| •Η | h | |
| ε | 4J | Ν |
| —4 | 01 | |
| 01 | 44 | >1 |
| >1 | 41 | υ |
| ε | •Η | |
| Ο | S | |
| •Η | Ό | 0 |
| ε | Μ | |
| & | ιΜ | 0 |
| +j | id | 01 |
| 01 |
O s
υ ο > -ο υ ο 41 —4 Ν C w ιβ Ο. C
Ό U U >ι Ο C Ο. Ν υ » •Η > Λ Ο C U Id Ο -4 οι ε
4) 4-> —4 01 C Ο id μ Ν Ν θ'» —4 » >ι C Ό 4Η -I Ο< Ν
| 9 tygodni po 2 lata po 1 tydzień po pierwszej 4 tygodnie po pierwszej pierwszym pierwszym dawce przypominającej dawce przypominającej kursie kursie | anty-id BR55-2 40 1 80 50 | mlgGl 1 2 nie testowane 2 |
175 651
ΓΌ
TABELA
*
N
Ό □
φ ν
Μ &
Ο >Μ α
Ή ϋ
•Η □ Φ Ν Cl ϋ
C
Φ
U
Μ
Φ
Μ
Ο
Η
Μ~Ι
Φ
Ή
Φ •Ν
-μ (0 c
ιη ο
ιϋ π
U
C φ
u
| ΙΛ •Η φ •ΓΊ Μ | ||
| 0 | 0 | |
| ο | C | 3 |
| Ε-» | φ | Ή |
| Η | υ | Μ-Ι |
| w | ||
| φ | (ΰ | |
| Ν | μ | C |
| 0 | φ | |
| ω | 3 | rd |
| C | γΗ | ίΰ |
| 0 | <w | S |
| •Ν | £ΐ | |
| ΟΡ | X | W |
| Ν | (0 | 44 |
| μι | μ | id |
| & | Λ | e |
| ω | II | 11 |
| tn | ||
| Η | ο | ιη |
175 651
Ν
Ο b
►.
Ο.
•Μ id ε
ιΜ
Ιΰ
Ή υ
s ο
ο
Ν b
Ο,
Φ ω
u fi
Ν
I ιη ιη (Α η
•ν „ — id*
Η c *1 σ, fi2 S>>* “i.* ca
Ν·Ν 5 ι
►.
+J c
id ο
β
C
Α
U >ι
C ο
Ν υ
Ν >1
Ν
U
Ο ca ε ή c
Ν -Η ιΰ b
Ο Μ ε id b
Ό ε
ο
C id
Ν nr •Η •ο
V b
Ό]
Ο
Ο,
Ο
Εη
Η &4
Ν
Φ
C ο
•Ν φ*
Ν b
a ω
ίτ>
ΤΊ
Φ •Η
Ν
Ό γΗ
Η
Ο
V
Ν b
a ο
Al •Η
Ο •Η
Ο ω
Ν b
a u
c φ
o ω
φ ·Η b ·π Ο u 3 C Η Φ tb U
Ul
Φ Φ -Η b C Ο Φ 3 -Ν ι-Ι α>,<ι_ι ρ
id 24 C ιο b
II XI ιη ιι ι ο ο
Φ •γί
Ο
C φ
ο
Μ
Φ b
Ο γΗ
4-1 ιΰ
C id rd £
ια λ:
nJ
S
II ιη
175 651 <D c σι η
O 10 C ' O
VO r-l
O 34 O σι O
| >, | a e ot |
| Ό | 1 |
| μ | '(Om |
| (0 | n m |
| T3 | CO (0 ta |
| c | cn |
| (0 | ' 0 |
| μ | H S T3 |
| m | rl Ή -rl O 0 1 |
| II | ® >1 - n μ |
| μ | Ί* M fi |
| cn | H ft(0 |
Figura 1 SDS - PAGE
C11 B3 B9 G6 G9 St E4 Cl 1 B3 B9 G6 G!
warunki redukujące warunki nieredukujące
Ul
AJ w
175 651
Figura 2
Ogniskowanie izoelektryczne
PH
St R E4 C11 B3 B9 G6 G9
St = standard
R = przeciwciało odniesienia E4, Cli, B3, B9, G6 i G9 = przeciwciała anty-id BR55-2
175 651 ιη
Κ aa *
w
-Η -3· c w •Η •Η Μ C
I ιη ιη
Κ (Ο α:
Μ Ό Β Ο Αί Ό
| η | N | Ή 1 |
| >. | ||
| Μ | n | 4J |
| 3 | O | c |
| σ» | σ> ιο | |
| •η | H | |
| Pm | N | |
| Φ | Φ | |
| •H | N |
ω Μ > Λ Β
Φ
Ο) -Η I C ιη ιβ ιη «
Ο Β ιΟ Φ 35 •Η C (0 πΤ
Η »
gg/ml anty-id BR 55-2 nr E4
Β
3.
Ο ο ο ο co <ο ο
Q «Μ
175 651 □
<β
Ν
C g ~ g < -η cn
Η Ο UI aa ι
Τ3 Φ Ν β (X Ί· W τΤ ιΰ β
σ<
•Η
IX w « « ω μ ι
Ο ιη Ό m
0ί -Μ 03 3
Ή Ό Ο -Η >ι
4J
C
Ο Φ Ν Μ (X g Φ
Λ X ϋ ίθ >ί·Η Ν ϋ ϋ
•Η rd ο
u λ;
φ •Η β
<0 •Η □
φ
Ν
Li
SX
Ν nr •Η
S
ο ο
ο ο
ο ο
ο ο
ο >, α
Ή ο
Μ
Ν □
β φ
•Η
Ο
Ν
Ο
Li •Η
ΤΙ □
<0
Ν •Η
C (X β
Ό
4J σι nr •η □
<0
Ν •Η
C
Ό
Φ
Ν β
Οι
175 651
ΙΛ rtJ
Μ ίρ •Η
Cu
ο ο
ο ο
ο ο
ο ο
ο _ ο ο
ο ο
ο ο
>1 ο
•Η ο
Μ (0 β
Φ
Ν
Ο β
φ •Η
Ο
Ν
Ο β
ο
Ν
-Η
C
Ο
Ο.
β φ
Μ
Ν
Ό >ι +>
(0* τι
Ο
Ν •Η
C
Ό
Φ
Ν »4
Λ
| ο | ο | ο | Ο | ο | ο | Ο |
| ο | ο | ο | Ο | ο | ο | |
| ο | ŁO | σ | «ο | ο | ιθ | |
| ω | 04 | 04 | τ·· |
175 651
Cd
U c
N
I in in
Qi m
Ό
Cd
Ij c
N
in in
Pi
Λ
Ό >, μ
C (0
N
Λ
U r>,< N W U M μ
(0 μ
U >
μ
O
Φ
N
U a
c rt
N nr
rozcieńczenie
175 651
Figura 7
175 651
Figura 8
175 651
Figura 9
175 651 <ϋ
Μ
CP
Ή b
ω μ
Ν
J3
U —
Ν W U Η
Ν ιη
Ν >.
ο.
ΛΗ
Λ ε
> t Ο ' μ 3 η
Μ
Φ •μ ϋ
•μ
Ο
Φ
Ν μ
Λ
Φ
Ν
Φ*
Ε c
ο <3 σι φ·
Μβ»
Ο ο
ο ο
ο φ·
ο ο
Ο
Ο ca ο
ο ω
ο ο
ο ο
ο
5Γ ο
ο ο
100 1000 10000 100000 1000000
175 651
Figura 11
175 651
ir>
« w
(0 β
«# 3 a u β 10 C 40
Ν β ιη -η a £
Oi 10 0 40 β
Ό O •β ε o _ * < Νί2
Immunizacja małpy 287 antyν:
'5 5 ο β
η (0 η
υ •β
U
Φ
Ν β
Ο,
Φ •β
Ν
10* •Η
Ε c
ο <Ο οΐ cn »
ο ο
ο το
Ο
Ο
Ο
rozcieńczenie
| ο | ο | Ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο |
| ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | |
| C0 | «3 | ’Γ | οι | ο | co | CO | 04 |
175 651
Immunizacja małpy E23 anty-id BR55-2 nr E4 Wiązanie przeciwciał surowiczych z komórkami raka sutka SKBR5
E c
o
CO
C\j σ>
xr o
o o
| /7 | i | ||||||||
| & | / # J | Z I* 0 T | |||||||
| - | |||||||||
| 1 1 1 | 1 'Γ^ |
o o
o o
o o
o o
o
| O | o | o | o | o | o | o | o | o | O |
| o | o | o | o | o | o | o | o | o | |
| co | co | CU | o | co | co | •’ί· | 04 | ||
| Y— | T“ | Τ’ |
rozcieńczenie
175 651
| Φ ττ | TT | TT | |||
| αΤ | Ν Φ | ττ φ | •η φ | ||
| X | 0 u | Φ 0 | Φ 0 | ||
| 3 | 3 «τ | •w «r | •h er | ||
| (0 | U tt | ttf* | θ'» tt | &>ττ | |
| Ό | Φ (0 | 3 (0 | 5 φ | ||
| •H C | 3 | U c | C c | ||
| «Γ βΤ | a-^ | <0 «r | O«H | Ό -H | |
| Ν □ | & | Ό o | a | s | |
| w nr | o 0 | flT | 0 o | 0 0 | |
| 5-π | aa | «Τττ | a a | a a | |
| U «5 | Ot «1 | >♦ | >. | ||
| 'β | Φ C | 'β N | 3 C | 'β M | 'β N |
| 0 | Ή ·Η | Φ u | U-H | Φ u | Φ Ul |
| •Η | αβ | •h a | ό a | •h a | •h a |
| Ν | 0 | N | 0 | N | N |
| Ό | Ό 0. | Ό Φ | ό a | Ό 0) | Ό Φ |
| >, | Φ > | > ϋ | Φ > | > o | >1 0 |
| +1 | Ν Ν | -P 3 | N N | P 5 | «Ρ 3 |
| U u | fd | U P | Kj | rtJ | |
| στ | a a | «r Ό | a a | *r Ό | στ ό |
ł I Η Η ίϋ
Ul ζΡ •Η fc.
rozcieńczenie
175 651
Figura 15
175 651
Figura 16 o
E*
U
Λ
Λ
Ό ι-ι nr O Ad σ o I-d -N
| ♦Η (β | |
| ε a | |
| •Η | ηΐ |
| W >1 | β |
| ε | •β ε |
| •Η | « χί β |
| Ρ | ο |
| w | ε |
| •Η | ο — |
| 0 | Χί < |
| Μ | |
| ca | Ν I-d |
| υ | U |
| •Η | £ ω |
| C | U I -Ν Ή |
| ιη | Ν X |
| Η | U φ |
| Ν | -β U > <- |
| >1 0 | |
| (X β | |
| «Μ | 3 |
| Λ3 ε | ca *4 |
| ίΰ | |
| τη | ♦Η |
| ϋ | □ |
| > | |
| Ν | Η |
| •Η | 0 |
| C | 4) |
| Ν β Ο. |
I-d
4) β
C (β
N nT *β
E c
o
CM
CO
CM
O
O o
o
Q
O
| πΤ | τη φ | τη φ | |||
| Λί | Φ 0 | Φ U | |||
| 3 | μ ar | -Η «Τ | |||
| ηί* | (0 | ϋ»τη | «Τ | θ'τη | |
| Τη | Ό | 3 ιΰ | X | 3 α) | |
| ϋ | U C | 3 | Ρ 3 | ||
| <0 | ίΤ σΤ | Ό Ή | «σ «τ | Ό Ή | |
| Μ | Ν ϋ | S | Ό ο | a | |
| •*4 | Φ πί* | Ο 0 | & | 0 ο | |
| C | 3 ΤΊ | Λ a | «Γτη | a a | |
| 3 | >, | σ φ | S | ||
| S | *c | Φ C | 'fi Ν | 3 C | 'fi Ν |
| S | φ | •Η ·Η | Φ (4 | Μ «Η | Φ p |
| •Η | •Η | Ή Λ | ό e | Ή 0« | |
| Ν | 0 | Μ | ο | Ν | |
| Ό | Ό | •ΰ a | Ό Φ | 'ύ a | Ό 0 |
| Φ | >1 | φ > | > 0 | 0 >5 | > Ο |
| Ν | Ρ | Ν Ν | Ρ 3 | Ν Ν | Ρ 3 |
| Ρ | k Η | (0 | Ρ Ρ | (0 | |
| a | σι | a α | <ί· Ό | a a | σ» -σ |
Η Η H
| -Ε 1 ι i | 3- ϊ i ? | ||||||||
| ί S Β | 1 i 1 | ||||||||
| ? I | i 5 | ||||||||
| •τι 1 | 1 ΓΊ- |
a o
'T
O
100 1000 10000 100000 rozcieńczenie 1:
| Ο | ο | ο | ο | Ο | Ο | ο |
| ο | ο | ο | ο | Ο | ο | ο |
| co | <ο | ''Τ | CM | Ο | C0 | CO |
o o
CM
Immunizacja małpy E 23 anty-id BR55-2 nr E4 Wiązanie przeciwciał surowiczych z komórkami drobnokomórkowego raka płuca SW2 (cell-ELISA)
OD/1000 (492/620nm) o
o o
o
O
O
O
O
O
O
O
O
I -I I —I—r-T— I I '1 l 1 1 1 1 -1—1 I III1 I ' IIII” i-1—Γ
| o | O | o | o | o | o | o | o | o | o |
| o | o | o | o | o | o | o | o | o | |
| co | CD | •'T | CM | o | co | <o | OJ |
rozcieńczenie
175 651
Immunizacja małpy 215 nieswoistymi mysimi IgGl Wiązanie przeciwciał surowiczych z komórkami drobnokomórkowego
M
W
J
W
N s
w rt o
AH
o.
Φ a
rt u
rozcieńczenie
175 651
Figura 19
175 651 o\
X
3:
<β id
Ί· -b ω c b
b 1) C N u
Ή ε
id 24 b Ό ε o 24
Immunizacja małpy E 23 anty-id BR55-
b n
id •b
O •b υ
m
N b
a <U •b c
id
N (d·
Ή
O
O
O o
o o
o o
o rozcieńczenie
175 651
Figura 21
175 651
σι di •H O 3
0· IB Ό
N
| «· | nT Q) |
| □ -Η 1—> | |
| •H o> <D | |
| CN | 3 3 0 |
| o β nr | |
| m | β Ό -i-i |
| a | 3 nS |
| N | 10 | O c |
| 0) | Q<“H | |
| β | ta | c |
| c | (C Ή |
«ι ίο β e ft 3 C O β Ofl Qi «Η O >, £ 3 Οι N a >, β * m +j a anie przeciwciał małpy rezus oczyszczonych na kolumnie Ίί anty-id BR55-2 nr E4 z komórkami raka sutka SKBR5
N nr •η
ε
CT
ZL
100 200
175 651
σι α>
•h o 3 10 Ό
N ·· uf* o)
Ό Ο·Η·η Μ* -H tP <D oj 3 3 U O O (tf* W O Ό ΤΊ Λ C o a-H c ιϋ -h H B c o
3 ν ω v
M (d c (B <B 0.3 -μ o ό a <B i—I O >i g 3 CPN a >. p « co -p a
Wiązanie przeciwciał małpy rezus oczyszczonych na kolumnie anty-id BR55-2 nr E4* z komórkami WM9 (czerniak) i SKBR5 (rak
ε
CT a
o o_ ó
100 200
175 651
| 1 φ | 1 φ |
| ν tn | Ν |
| Μ « | Μ ~ |
| 0.(0 | Ο.σι |
| 0) w | 1) 3 |
| C | C |
| 0 | 0 |
| ν | Ν φ |
| □ | ϋ |
| Ν (0 | Ν Λ |
| ω ή | ω ή |
| >ι U | >1 ϋ |
| Ν 3 | Ν 3 |
| 0 -Η | □ Ή |
| 0 Ο + | 0 Ο Φ |
σι φ
-η u 5
Β· <0 Ό
Ν •ΓΊ ·· 3· φ
| 0 | Η τ-ι | |
| Μ* | Ή | Οι Φ |
| (Μ | 3 | 3 ϋ |
| Ο | Ο 3* | |
| Ώ | Ο | Ό ·γ-ι |
| 3 | 3 | 3 |
| Ν | ω | Ο 3 |
| Φ | ο.-η | |
| Μ | 3 | C |
C 3 Ή
| 3 3 -Η | 8 |
| 0.5 C | 0 |
| Η 03 | ο. |
| 3Η Ο | >1 |
| S 3 Ο> | Ν |
| Ο. >, Ο | |
| * ω -Ρ | 0. |
Przeciwciała małpy rezus oczyszczone na kolumnie anty-id ★
BR55-2 nr E4 : wiązanie z błonami komórkowymi SKBR5 i WM9 (ELISA)
OD/1000 (492/620nm)
OJ Ο C0 <Ο -Ό <Μ
0,01 0,1 1 10 100 200 pg/ml
175 651
| tn oo O CE §! H CO § ? < § ω o ω w I |
| Φ | |||
| •H | 0 | ||
| z | |||
| flj | |||
| Ό | |||
| N | •n | ||
| • o | co* a) | ||
| <43 | U -H | n | |
| -H | cn | <U | |
| OJ | s | O |
o .. ..
il Ό T”>
n u o q ® Oj-H il <0 C
C 10-H CO CO -H g as c o •m o O a «Η o > g 3 tn n a >» ii * ra +» a
Przeciwciała małpy rezus oczyszczone na kolumnie anty-id BR55-2 nr E4 : wiązanie do różnych linii komórkowych rtl
W
H
J
U i
4)
U
0,01 0,1 1 10 100 200
175 651
| l cn •o CO | |
| >1 < o ·— Λ | |
| β a | O—* |
| O β | rH |
| ta a | ffl |
| Ό -H | |
| a o | |
| O 3 | |
| C-β | m |
| 3 0 | O |
| ε oi | ΙΡ |
| ε ν | Η |
ADDC komórek linii raka sutka SKBR5 realizowana przez ludzkie leukoa ω aj -η
| C 0 | |
| Ο-Η | >1 |
| ν a | |
| Ο -Μ | |
| ν a | 04 |
| 01 8 | 1 |
| ιη | |
| ν αι | ιη |
| Ο-β | |
| 0 C | co |
| Η | Ε |
o
| a-β •η a □ -β a C Ν η -η | |
| νο | ο C |
| CP 3 | |
| 04 | >18 |
| ω | β ε •Η |
| 3 | Φ |
| Ν | 3 |
| Φ | Ν Ή |
| 0 |
IC a o a-H •M 3 a o £ β * oi o
N
O
O a
N
O β
iii
II l·- iii
pg/ml
175 651
Figura 27
ELISA dla oznaczania BR55-2/mysich IgG3 w ludzkiej surowicy Krzywa standardowa
OD/1000 (492nm)
gg/ml BR 55-2/mysie IgG3
175 651
Figura 28
ELISA dla oznaczania BR55-2/chimerycznego przeciwciała ludzkiego klasy IgGl w ludzkiej surowicy Krzywa standardowa
175 651
Figura 29
ELISA dla oznaczania BR55-2/chimerycznego przeciwciała ludzkiego klasy IgG3 w ludzkiej surowicy Krzywa standardowa
OD/1000 (492nm)
pg/ml BR 55-2/chimeryczne ludzkie IgG3
175 651
Wiązanie BR55-2/chimerycznego IgGl i BR55-2/humanizowanego IgGl z przeciwciałem anty-id BR55-2 nr E4
O pg/ml
175 651
Figura 31
175 651 rd O O tP tu c
Ν
U >, b
Φ e
•H
A
O
N in in
CA ca φ
c «
O
N
-b
C m
ε •fi
IN in w
Pi «
Figura 32
| 0 | |||
| θ' | |||
| Φ | |||
| c | |||
| <0 | |||
| 3 | |||
| 0 | |||
| N | |||
| •b | |||
| C | |||
| (0 | |||
| Λ | |||
| \ | |||
| N 1 10 | CC « | T w | |
| 10 | b | ||
| CA | M | rM | c |
| « | u | «5 | |
| Ή | N 1 in | Ή O | CN |
| i-ł | •H | w tn | |
| o | m | □ | CA |
| cn Ib | K ffl | Φ N | m |
| o Ο» | Ό Ή | b Ό a-H 1 | |
| u | s_ | 24 | >1 |
| c | ?Ί | Φ | +J |
| N | ** | 42 | C |
| U | C | W | (0 |
| >d | <0 | O | |
| Id | N | c | (0 |
| Φ | Ό | fM | |
| ε | r*4 | Φ | (U |
| •W | O Oł | •ΓΊ | Ή |
| A U | A | □ | |
| \ | w | □ | |
| N | >1 O | ||
| | | c | 0) | |
| 10 | Ό | N | |
| W | Φ- b | ||
| CA | r-ł | a | |
| ca | CP | ||
| N | 0 | ||
| φ | 3 Ό | ||
| •b | |||
| c | 24 Λ | ||
| ιβ | Φ | u | |
| N | C | s | |
| «r | 3 | c | |
| -b | tn | io | |
| 3 | 0 | Ό | |
| 42 | (0 | ||
| w | A |
O pg/ml
175 651 o
ot u
c iB
N •A c
IB
Figura 33
| 43 | ||
| \ | ||
| N 1 w | σ\ | TT Cd |
| in | P | |
| tó | M | Ά C |
| β | u« | Λ |
| •a | 03 1 | -A CN O 1 |
| tA | in | 3 in -A cn |
| O | W & « | □ OS |
| θ' H | Φ 03 N | |
| Ό •H | | P Ό | |
| O ot | a· a 1 | |
| u | 1 S- | A! >i |
| c | »^Ί | Φ P |
| N | ęj | -P C |
| U | Λ | CO (B |
| ►. | O | |
| U | N | C IB |
| U | Ό P | |
| E | fM | Φ Λ |
| •A | u o> | •n-A |
| a u | O 43 3 | |
| \ | 0 *A | |
| N | >i O | |
| 1 | C Φ | |
| cn | Ό N | |
| w | Φ- P | |
| o< | I-C Pi | |
| O | Ot | |
| N 0 | ||
| 1) | 3 Ό | |
| •A | ||
| c | AS 43 | |
| (B | CU 0 | |
| N | C >1 | |
| nr | 3 C | |
| •A | CO (B | |
| 3 | O Ό P (8 | |
| W 43 |
| rH | rH Ο |
| O | θ' |
| θ' | w |
| H Φ | φ C |
| c | (Β |
| N | 3 |
| 0 | Ο |
| >1 | Ν |
| P | Ή |
| V | C |
| s | <Β |
| •H | ε |
| Λ | 3 |
| ϋ | 43 |
| 03 I | <Ν I |
| 1 ιη | 1 ιη |
| ιη | ιη |
| PS | 0S |
| CQ | ca |
O pg / ml
175 651
Figura 34
175 651
pg/ml
175 651
Figura 36
ELISA dla oznaczania BR55-2/humanizowanego IgGl w ludzkiej surowicy
Krzywa standardowa
OD/1000 (492nm)
gg/ml BR 55-2/humanizowane IgGl
175 651 o o tP (p
Η H
N 4) C N U ►, U 4) ε
Ή Λ υ
Ν ιη ιη (X η
Ν 41 Ν U a ompetycyjne wiązania BR55-2/mysie lgG3 anty-id BR55rt
U
CP
4) •H
N
Ό
CO
O
3>
N
Ό
4) 4)
| (0 | Ή | •H | ||
| O | 44 | 44 | ||
| tP | N | n | N | n |
| H | Ό | O | Ό | O |
| 3 | o* | 3 | tP | |
| 4) | rH | rH | rd | rH |
| H | s | |||
| 01 | 41 | 41 | ||
| >1 | C | C | rH | |
| ε | N | s | N | 6 |
| 0 | 0 | **·> | ||
| Ol | >, | ΪΡ | >» | tP |
| 1 | il | a. | a. | |
| tn | 4} | 4) | ||
| in | ε | w | ε | w |
| -H | o | •H | o | |
| a | 43 | 43 | ||
| m | □ | o | 0 | o |
+ ł ł
4) C N U >« U 4) ε
•H Λ U \ N 44 I in
4) in •h « c 10 s o ε (0 a
N
W
N
U a
Mg/ml przeciwciała
175 651
Cytotoksyczność zależna od dopełniacza z udziałem BR 55-2/myslego ZgG3 *
u
M
C
N
I tn
A tn (4 ca
Sn
N
Λ»
Mg/ml anty-id BR 55-2 E4
Ο» a
(Ώ
O θ'
H
Cł i
in tn
175 651
Figura 39
SDS-PAGE Warunki redukujące
St = standardy
R = przeciwciało odniesienia
Ch = BR55-2/chimeryczne ludzkie IgGl
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Antyidiotypowe mysie przeciwciała monoklonalne (Ab2), znamienne tym, że noszą obraz wewnętrzny antygenu Lewis Y i skierowane są przeciwko przeciwciałom monoklonalnym BR55-2 (Ab1).
- 2. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je przeciwciało nr E4 skierowane przeciwko przeciwciałom monoklonalnym BR55-2 (Ab1).
- 3. Sposób wytwarzania antyidiotypowych mysich przeciwciał monoklonalnych (Ab2), znamienny tym, że immunizuje się myszy fragmentem F(ab’)2BR55-2/mysiej IgG3 sprzężonym z KLH, poddaje się mysie splenocyty fuzji z komórkami mysiego szpiczaka SP 2/0, wyselekcjonowuje się komórki hybrydoma produkujące IgG o zdolności do hamowania kompetycyjnego wiązania mysiej IgG2a o swoistości BR55-2 z linią komórkową SKBR5, przekraczającej 95% i oczyszcza się oraz izoluje się otrzymane przeciwciała antyidiotypowe.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929210944A GB9210944D0 (en) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | Monoclonal antibodies and their use |
| GB929210930A GB9210930D0 (en) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | Monoclonal antibodies and their use |
| GB929210929A GB9210929D0 (en) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | Monoclonal antibodies and their use |
| PCT/EP1993/001215 WO1993024647A1 (en) | 1992-05-22 | 1993-05-14 | Anti-idiotypic monoclonal antibodies against the lewis y-specific monoclonal antibody br55-2 and their uses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL175651B1 true PL175651B1 (pl) | 1999-01-29 |
Family
ID=27266199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL93306001A PL175651B1 (pl) | 1992-05-22 | 1993-05-14 | Antyidiotypowe mysie przeciwciała monoklonalne oraz sposób wytwarzania antyidiotypowych przeciwciał monoklonalnych |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0644947B1 (pl) |
| JP (3) | JPH07507207A (pl) |
| KR (1) | KR100279317B1 (pl) |
| AT (1) | ATE179214T1 (pl) |
| AU (1) | AU678160B2 (pl) |
| CA (1) | CA2134751C (pl) |
| CZ (1) | CZ286547B6 (pl) |
| DE (1) | DE69324584T2 (pl) |
| DK (1) | DK0644947T3 (pl) |
| ES (1) | ES2133395T3 (pl) |
| FI (1) | FI111518B (pl) |
| GR (1) | GR3030701T3 (pl) |
| HU (1) | HU219055B (pl) |
| NO (1) | NO316120B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ252161A (pl) |
| PL (1) | PL175651B1 (pl) |
| RU (1) | RU2208642C2 (pl) |
| SG (1) | SG50721A1 (pl) |
| SK (1) | SK281086B6 (pl) |
| WO (1) | WO1993024647A1 (pl) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT500650B1 (de) | 2003-04-17 | 2009-11-15 | Altropus Gmbh | Immunogener rekombinanter antikörper |
| US20080268459A1 (en) * | 2003-08-14 | 2008-10-30 | Wyeth Ludwig Institute For Cancer | Anti-Lewis Y Anti-Idiotypic Antibodies and Uses Thereof |
| AT504231A1 (de) | 2006-10-03 | 2008-04-15 | Hans Dr Loibner | Prädiktive parameter |
| EP2611834B1 (en) * | 2010-09-01 | 2018-03-07 | Biogen MA Inc. | Rapid generation of anti-idiotypic antibodies |
| RU2735653C2 (ru) * | 2016-08-23 | 2020-11-05 | Тран-Сцелл Биологицс Привате Лимитед | Платформа с клетками-предшественниками человека для поиска активных веществ лекарственных препаратов |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990000617A1 (en) * | 1988-07-06 | 1990-01-25 | Bio-Research Laboratories, Inc. | Antibodies specific towards gp 48 |
| DE4006308A1 (de) * | 1990-02-28 | 1991-08-29 | Sandoz Ag | Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom |
| DE4025499A1 (de) * | 1990-08-11 | 1992-02-13 | Sandoz Ag | Verwendung der antikoerper br55-2, deren derivate, konjugate und fragmente zur bekaempfung von hiv-infektionen |
| PT528767E (pt) * | 1991-08-21 | 2000-06-30 | Novartis Ag | Derivados de anticorpos |
-
1993
- 1993-05-14 WO PCT/EP1993/001215 patent/WO1993024647A1/en active IP Right Grant
- 1993-05-14 ES ES93909997T patent/ES2133395T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 KR KR1019940704163A patent/KR100279317B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 DE DE69324584T patent/DE69324584T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-14 DK DK93909997T patent/DK0644947T3/da active
- 1993-05-14 CA CA002134751A patent/CA2134751C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-14 NZ NZ252161A patent/NZ252161A/en unknown
- 1993-05-14 SK SK1398-94A patent/SK281086B6/sk unknown
- 1993-05-14 AT AT93909997T patent/ATE179214T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 HU HU9403337A patent/HU219055B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 RU RU94046321/13A patent/RU2208642C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 AU AU40688/93A patent/AU678160B2/en not_active Ceased
- 1993-05-14 SG SG1996009665A patent/SG50721A1/en unknown
- 1993-05-14 CZ CZ19942851A patent/CZ286547B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 PL PL93306001A patent/PL175651B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-05-14 EP EP93909997A patent/EP0644947B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 JP JP6500128A patent/JPH07507207A/ja active Pending
-
1994
- 1994-11-21 NO NO19944443A patent/NO316120B1/no unknown
- 1994-11-22 FI FI945485A patent/FI111518B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-09-03 JP JP10249573A patent/JPH11178594A/ja active Pending
-
1999
- 1999-07-07 GR GR990401784T patent/GR3030701T3/el unknown
-
2005
- 2005-11-30 JP JP2005346456A patent/JP2006143738A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94046321A (ru) | 1997-01-27 |
| DE69324584D1 (de) | 1999-05-27 |
| NO316120B1 (no) | 2003-12-15 |
| RU2208642C2 (ru) | 2003-07-20 |
| FI111518B (fi) | 2003-08-15 |
| EP0644947A1 (en) | 1995-03-29 |
| CA2134751A1 (en) | 1993-12-09 |
| NO944443D0 (no) | 1994-11-21 |
| FI945485A (fi) | 1994-11-22 |
| JP2006143738A (ja) | 2006-06-08 |
| SK281086B6 (sk) | 2000-11-07 |
| CZ286547B6 (cs) | 2000-05-17 |
| ATE179214T1 (de) | 1999-05-15 |
| EP0644947B1 (en) | 1999-04-21 |
| JPH11178594A (ja) | 1999-07-06 |
| AU4068893A (en) | 1993-12-30 |
| SK139894A3 (en) | 1995-07-11 |
| WO1993024647A1 (en) | 1993-12-09 |
| DK0644947T3 (da) | 1999-11-01 |
| JPH07507207A (ja) | 1995-08-10 |
| SG50721A1 (en) | 2000-11-21 |
| CA2134751C (en) | 2003-12-16 |
| NZ252161A (en) | 1996-10-28 |
| KR100279317B1 (ko) | 2001-01-15 |
| GR3030701T3 (en) | 1999-11-30 |
| ES2133395T3 (es) | 1999-09-16 |
| DE69324584T2 (de) | 1999-09-23 |
| CZ285194A3 (en) | 1995-05-17 |
| HU219055B (hu) | 2001-02-28 |
| AU678160B2 (en) | 1997-05-22 |
| FI945485A0 (fi) | 1994-11-22 |
| HUT71311A (en) | 1995-11-28 |
| NO944443L (no) | 1995-01-20 |
| KR950701685A (ko) | 1995-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4716350B2 (ja) | 潜伏期膜タンパク質に対する抗体およびそれらの使用 | |
| Raychaudhuri et al. | Tumor-specific idiotype vaccines. II. Analysis of the tumor-related network response induced by the tumor and by internal image antigens (Ab2 beta). | |
| AU596070B2 (en) | Anti-idiotype antibodies & their use in inducing immulogical response to viruses & tumours | |
| EP1241264A1 (en) | Monoclonal antibodies to colon cancer antigen | |
| CA2253602A1 (en) | Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response | |
| Steinitz et al. | Human monoclonal anti-idiotypic antibodies. I. Establishment of immortalized cell lines from a tumor patient treated with mouse monoclonal antibodies. | |
| SCHLEBUSCH et al. | A monoclonal antiidiotypic antibody ACA 125 mimicking the tumor-associated antigen CA 125 for immunotherapy of ovarian cancer | |
| US20050163768A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| JP2006143738A (ja) | ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用 | |
| WO1988000472A1 (en) | Immunogens and improved methods of making immunogens | |
| Chatterjee et al. | Anti-idiotype monoclonal antibodies as vaccines for human cancer | |
| Smorodinsky et al. | Towards an idiotype vaccine against mammary tumors. Induction of an immune response to breast cancer‐associated antigens by anti‐idiotypic antibodies | |
| JPH04501061A (ja) | 抗イディオタイプ抗体による抗腫瘍応答の誘導 | |
| Sugiyama et al. | Conformational structure of a monoclonal anti-idiotypic antibody to the monoclonal anti-adenocarcinoma-associated carbohydrate antibody YH206. | |
| CA1341566C (en) | Immune response to tumors induced by anti-idiotype antibodies | |
| JP7392200B2 (ja) | グリコシル化ｃｅａｃａｍ５に特異的に結合した抗体 | |
| CA2074512A1 (en) | Medicaments and methods for treating acquired immune deficiency syndrome (aids) and aids-related complex (arc) employing anti-carbohydrate antibodies and carbohydrate antigens | |
| Cazenave | Anti-idiotypic vaccines | |
| RU2014845C1 (ru) | Способ получения вакцины против спида | |
| Yildirim et al. | Generation of anti-idiotypic antibodies that mimic HBsAg and vaccination against hepatitis B virus | |
| CA1339469C (en) | Production and characteristics of anti-anti-cea antibody | |
| Hanzawa et al. | Detection of xenogeneic anti-idiotypic antibodies specific to murine monoclonal antibody 17-1A in patients with gastrointestinal cancer | |
| JPH03504323A (ja) | 抗体 | |
| Powell Jr | Idiotypic manipulation of the antibody response to Moloney murine leukemia virus | |
| MXPA98009586A (en) | Method and composition for the reconformation of multi-peptide antigens to start an animal response |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20060514 |