KR100279317B1 - 단일클론항체 - Google Patents

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에베린네 잔케크
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더블류. 하링, 지. 보이롤
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Abstract

단일클론 항체 BR55-2(Ab1)에 대한 단일클론 뮤린 내부상 항-이디오타이프(Ab2), 이들의 생산 방법 및 HIV-감염, 상피 계통의 암 및 스몰 셀 폐암에 대한 예방적 및/또는 치료적 면역을 위한 용도.

Description

단일클론 항체
[발명의 상세한 설명]
면역 시스템을 조작하는 데 대한 한 연구 방법은 이디오타이프(idiotype) 상호작용에 기초한다. 한 항체를 다른 항체와 뚜렷하게 구별짓는 Ig 분자의 항원-결합 부위내 및 그 주위의 톡특한 항원 결정기는 이디오토프(idiotope)로 정의된다. 특정 항체의 가변부에 존재하는 모든 이디오토프의 총체성은 그의 이디오타이프(id)로 언급된다. 이디오타이프의 분자 구조는 상보성 결정 영역 및 가변 도메인의 골격 영역에 위치하며 일반적으로 특정 결합에서 H- 및 L-사슬 둘다에 의하여 항상 기여되는 것은 아니다.
이디오타이프는 동계, 동종 또는 이종 수용체에 항체(주로 Abl으로 언급)가 주입되면 항-이디오타이프 항체(주로 Ab2로 언급)의 형성이 유도되기 때문에 혈청학적으로 정의된 개념이다. 이디오타이프/항-이디오타이프 상호작용이 존재한다는 가정에 기초하여, 생리학적으로 면역 시스템의 수용체-기초한 조절 작용이 닐스 제른에 의하여 제시되었다[Neils Jerne, Ann. Immunol. 125C, 373, 1974]. 그의 네트워크 이론은 면역 시스템을 T-임파구상의 수용체와 Ig 분자의 결집으로 보며, 이들 각각은 결합 부위(파라토프)를 통하여 항원 결정기(에피토프)를 인식할 수 있으며, 표출하는 이디오타이프를 통하여 시스템의 세포-표면 수용체 또는 다른 항체에 의하여 인식될 수 있다. 많은 연구 결과 이디오타이프 및 항-이디오타이프 수용체는 분비된 항체뿐만 아니라 B- 및 T-임파구의 표면상에 존재한다.
Ab1과 Ab2 사이의 결합이 Ab1에 대항된 항원에 의하여 억제될 때 이디오타이프는 항원 인식과 연관이 있는 항체 가변 도메인 상의 부위와 관련하기 때문에 결합-부위 관련성으로 여겨진다. 항원 에피토프를 구조적으로 모방하는 이들 이디오타이프는 그 에피토프의 내부상(internal image)으로 불려진다. Ab2와 항원 둘다가 관련 Ab1에 결합하기 때문에 이들은 주어진 항원의 내부상을 표출하는 유사한 3차원 구조를 공유할 수도 있다. 원칙적으로 내부상 항-이디오타이프 항체는 이디오타이프 네트워크를 통하여 이들이 유도되어진 항원의 치환체로 보여질 수 있다. 그러므로 이들 대용 항원은 활성 면역 프로토콜에 사용될 수 있다. 예컨대 이들은 원 항원이 상당한 면역 반응을 유도하기에 면역원성으로 충분하지 않을 경우에 장점을 제공할 수 있다. 따라서 비-면역원성 탄수화물 항원을 모방한 적당한 내부상 항-이디오타이프 항체는 특정 백신 연구에 특히 유용하다. 이하 이러한 내용을 좀더 구체적으로 설명한다.
하이브리도마 기술 도입의 결과로서, 주로 쥐로부터 유래된 단일클론 항체(Mabs)가 다양한 종류의 인간 암에 대해 만들어 졌다. 이종 Mabs로 한정되는 표지의 거의 대부분은 엄격히 종양 특이적이지 않지만 종양 및 특정 정상 및/또는 태아 조직에 의해 공유되는 분화 항원이다. 그러므로 이들은 종양 관련 항원(TAAs)으로서 언급하는 것이 가장 바람직하다. 이종 Mabs 의해 검출되는 인간 종양 표지가 암 환자에서 항종양 반응을 일으킬 수 있는지의 여부 및 이와 같은 항원이 암환자에서 자가유래 종양에 대한 반응에 진실로 관련되는 지의 여부는 개개 TAA의 성질에 좌우되며 아직 완전하게 밝혀지지는 않았다. 동계 숙주에서 천연적으로 면역원성을 가지거나 또는 면역원성을 가지도록 만들어진 TAAs는 치료 및 가능하면 예방 목적으로 항종양 면역성을 유도하는 데 유력하게 사용될 수 있을 것이다.
종양 관련 항원은 종종 "자기"의 일부이며 암 환자에서 매우 미약한 면역 반응을 일으킨다. 이와는 대조적으로 개개 TAA의 구조적 에피토프를 닮은 3 차원 형상을 발현하는 내부상 항-이디오타이프 항원은 종양을 가진 숙주에서 외부 분자로서 인식된다. 그러므로 적당한 항-id Mabs로 치료적 또는 예방적 면역화시킴으로써 형성된 면역 반응은 항종양 면역성을 야기할 수 있다.
항-id Mabs로 암에 대한 치료적 면역화는 질환의 초기 단계에 특히 성공적이다: 원발성 종양의 수술시점에는 흔히 잠재성 단일 종양 세포는 이미 환자의 다양한 기관에 전파되었다. 이들 미소전이 세포는 전이의 후기 성장, 종종 모든 임상적으로 증명된 종양 조직의 수년후 진단 및 수술적 제거의 원인으로 알려져 있다. 따라서 지금까지 거의 모든 경우 상피 기관의 전이성 암은 치료불가능하다. 그러므로 거대전이의 성장을 방지하기 위하여 "최소 잔류 암"의 효과적인 치료, 예컨대 잠재성 미소전이 세포의 파괴가 의학적으로 긴급히 요망된다. 이러한 단계의 질환(면역 보강제 주입)에서, 기존의 화학요법적 연구는 비교적 성공적이지 못하였다. 그러나 적당한 내부상 항-id Mabs로 면역화시킴으로써 최소 잔류 질환의 시점에 특정 항종양 면역성을 도입하면 면역 시스템에 의하여 미소전이 세포가 선택적으로 제거됨으로써 재발하지 않는 생존 기간이 길어질 수 있다.
BR55-2(예컨대, Wistar EP 285 059, M. Blaszcyk-Thurin et al., J. Biol Chem. 262(1987) 372-379 또는 Z. Steplewski et al., Hybridoma 9(1990) 201-210)의 특이성을 가지는 단일클론 항체는 대부분의 인간 충실성 종양상에서 선택적으로 발현되는 탄수화물 항원결정 기인 루이스 Y6(Lewis Y6) 항원을 한정한다. 이들의 성질에 기초하여 항체 BR55-2는 기본적으로는 상피 암의 수동 면역요법에 사용될 수 있다.
배 발생의 특정 단계동안에도 발현되는 종양 관련 루이스 Y올리고사카라이드 항원결정기는 그 자체로는 거의 면역원성이 없다. 그러나 루이스 Y 항원의 구조적 에피토프를 모방함으로써 내부상 성질을 가지는 BR55-2에 대한 단일클론 항-이디오타이프 항체(Ab2)는 특히 질환의 초기 단계에 보호성 항종양 면역을 도입하는데 유용하다.
상피 조직에서 유래된 암에서의 발현이외에 루이스 Y 탄화수화물 항원은 또한 인간 면역결핍증 바이러스(HIV)에 감염된 병인론에 관련된다. 후천성 면역 결핍증(AIDS)은 그의 병인론이 림프향성 레트로 바이러스(HIV)의 감염과 관련되는 것으로 인식되는 뚜렷한 질환으로 알려져 있다. 이 질병은 손상된 세포-매개된 면역 및 절대 림프구 감소증, 특히 감소된 헬퍼 T-림프구(CD4)와 관련된 질환으로 특징지워진다 AIDS는 명시된 임상적 특징 및 헬퍼 T-림프구감소증의 복합적 작용에 의해 일반적으로 분명해 지는 전증이 앞서서 일어난다. 이러한 전증은 AIDS-관련 합병증(ARC)로 불려진다.
HIV는 지난 20년동안 많이 연구되어온 바이러스 군에 속한다. 레트로바이러스가 인간 또는 동물 세포에 침입할 경우 RNA는 DNA로 전환되어 숙주 세포에 삽입된 다음 바이러스 유전자를 자신의 유전자로 처리하도록 속인다. HIV는 이들 세포에서 수년간 잠재적으로 남아 신체의 면역 시스템에 의한 공격에 안전하며 숙주 세포가 분열할 때 매 회 맹목적으로 복사된다. 감염 세포의 활성화에 의하여 신속한 바이러스 복제를 촉진하는 경우에만 생성된 바이러스 입자는 이들 세포를 사멸시키고 혈액으로 방출된다.
HIV의 특이적인 성질때문에, 이미 감염된 환자의 인간 게놈에 이미 전사된 바이러스 및 프로바이러스 유전 정보의 둘다를 제거함으로써 병을 치료하는 것은 달성하기 어렵다. 그러므로 대부분의 치료적인 노력은 바이러스 복제의 필수적인 단계를 방해함으로써 질병의 발생을 지연시키는 제제에 집중되고 있다.
안전하고 효과적인 백신을 이용하여 이미 감염된 환자에 HIV-감염의 예방 및 치료적 방해가 주 목적이다. 일부 백신 연구는 임상전 또는 초기 임상 단계에서 실험한다. 이러한 연구는 주로 항원으로서 바이러스 구조, 특히 주요 외피 당단백질 gp 120에 기초한다.
바이러스에 디한 천연 면역 반응은 세포 면역의 활성화뿐만 아니라 모든 바이러스 단백질에 대한 항체로 구성된다. 그러나 HIV-감염에 대한 이러한 숙주 반응은 흔히 수년간 지속되는 무증후 단계후에 질병의 진행을 최종적으로 중지시키는 것으로는 보이지 않는다. 그러므로 천연적으로 발생하고 최종적으로는 비보호성인 면역 반응을 야기하는 동일한 항원에 기초한 백신 연구는 의문점이 남아 있다. 주요한 한문제점은 유형-특이성 중화 항-gp 120 항체의 공격으로부터 이 바이러스가 피할수 있는 강력한 HIV의 이질성이다.
백신에 의한 HIV의 효과적인 보호는 두개의 방어 전략을 필요로 한다: 혈액중에 떠돌아 다니는 자유 바이러스에 대한 전략과 이미 감염된 세포에 대한 방어 전략이다. 시험관내 및 생체내에서 HIV-감염된 세포는 이들의 표면에서 변화된 당화 패턴, 즉 루이스 Y 탄수화물 항원결정기를 발현하는 것으로 알려져 있다. 이 항원은 정상적으로 특정 배 형성 단계동안에만 발생하며 또한 다양한 악성종양과 관련되기 때문에 HIV-감염 세포상의 발현은 레트로바이러스 형질전환에 의하여 유도된 이들의 변화된 분화 상태를 반영할 수 있다. 그러므로 이 표면 표현형은 HIV에 의한 인간 게놈의 형질감염에 대한 톡특한 세포 숙주 반응을 닮는다.
HIV 외피 당단백질은 감염된 세포의 당화 기작에 의하여 이루어 진다. 그러므로 HIV를 생성하는 감염된 세포의 당화 패턴의 변화는 또한 자유 방출된 바이러스 입자상에서 발견된다. 결과적으로 이와 같은 세포에서 형성된 HIV의 외피 당단백질도 루이스 Y 탄수화물 항원결정기로 구성된다. 따라서 루이스 Y 올리고사카라이드는 HIV-감염된 세포 및 자유 HIV-입자상에서 발현된 특정 숙주 반응을 나타낸다.
상기의 고려사항에 기초하여 루이스 Y 구조는 자유 바이러스 및 HIV-감염된 세포 둘다에 대한 백신화 전략에 사용하기 위한 중요한 요구 사항을 충족한다. 더욱이 일반적으로 HIV에 대한 숙주 반응을 일으키면서 루이스 Y 항원은 HIV 균주에 독립적이며 이 바이러스의 유전적 가변성에 영향을 받지 않는다. 불행하게도 배 분화 항원으로서 그의 탄수화물 구조 및 그의 자체 성질에 기초하여 루이스 Y 는 그 자체로서는 거의 면역원성이 아니다. 이 항원에 대한 천연 면역 반응은 인간에서 발견되지 않는다. 그러나 루이스 Y 항원이 구조적 에피토프를 닮음으로써 내부상 성질을 가지는 BR55-2 (Ab1)에 대한 단일클론 항-이디오타이프 항체(Ab2)는 바이러스 균주에 독립적인 자유 HIV 및 HIV-감염된 세포에 대하여 예방적 및 치료적 면역성을 도입하는 데 유용할 수 있다.
독특한 백신으로서 예방적 및 치료적 사용이외에 단일클론 내부상 항-id 항체는 이들이 발생되는 항체의 이디오타이프에 매우 특이적인 시약이다. 이들은 Ab1의 결합 영역을 거의 독점적으로 인식한다. 이러한 인식 패턴은 Ab1의 다른 항원결정기에 독립적이다. 다른 말로는 적당한 항-id Mabs는 올바른 3차원 형상으로 Ab1의 독특한 이디오타이프로 구성되는 분자를 한정한다. 그러므로 이들 항-id Mabs는 그의 스위치 가변 영역(스위치 가변 영역은 다른 불변 영역, 예컨대 뮤린 IgG2a, IgG2b, IgG1으로 구성되지만 동일한 이디오타이프를 공유한다)에 대해서 뿐만아니라 Ab1의 F(ab')2-, Fab- 및 Fv-단편에 상당한 친화력으로 결합한다. 또한 내부상 항-id Mabs의 이와 같은 매우 특이적인 인식 패턴은 재조합 DNA 기술에 의하여 얻어진 제 1 세대(parent) 뮤린 Mab의 변이체를 포함한다.
인간에 있어 수동 면역요법을 위한 뮤린 항체의 반복적인 사용으로 인한 있을 수 있는 문제점을 극복하기 위하여, 마우스/인간 키메릭 Mabs는 선택한 제 1 세대 뮤린 Mab의 가변 도메인을 인간의 불변 영역과 결합시킴으로써 형성할 수 있다. 키메릭 Mabs는 인간의 천연 발생 면역글로불린의 불변 영역과 동일한 불변 영역을 가지기 때문에 인간의 혈청에서 이와 같은 마우스/인간 키메릭 Mabs을 검출하기 위해서는 매우 특이적인 시약이 필요하다. 또한 제 1 세대 뮤린 Ab1에 대하여 생성된 내부상 항-id Mabs는 이들로부터 유도된 키메릭 항체를 인식한다. 따라서 항-이디오타이프 Mabs는 예컨대 정상적인 인간 면역글로불린의 과량의 존재하에서 마우스/인간 키메릭 Mabs의 혈청 농도를 측정하기 위한 특이적이고 민감한 정량 분석을 위한 유용한 시약이다.
수동 면역요법에 사용하기 위한 치료적으로 유용한 성질을 가지는 Mabs의 성질을 더욱 개선시키기 위하여 "완전하게 인간화된" 항체는 1 세대 마우스 항체의 최소 필수 부분인 상보성 결정 영역(CDRs)만을 인간 가변 영역 프레임 및 인간 불변 영역과 결합시키는 재조합 DNA 기술에 의하여 제작할 수 있다. 이들 "완전하게 인간화된" Mabs의 설계 및 제작을 위해서는 서열 상동성 및 분자 모델링을 이용하여 결합성을 보유하지만 면역원성을 감소시킬 수 있는 마우스 및 인간 서열 요소의 결합체를 선택한다. 1 세대 뮤린 Ab1의 이디오타이프에 대하여 생성된 특정 내부상 항-id Mabs는 하기와 같은 요건이 충족될 경우 CDR-이식된 인간화된 변이체에 여전히 결합할 수 있다:
a) 인간화된 변이체의 결합 영역의 3 차원 구조는 1 세대 마우스 항체의 구조와 매우 유사하다.
b) 특정 항-id 항체는 결합 영역의 3-차원 형태("진정한 내부상 항체")를 정확하게 인식한다.
따라서, 상기 성질을 가지는 항-이디오타이프 Mabs는 과량의 정상적인 인간 면역글로불린의 존재하에 완전하게 인간화된(CDR-이식된) Mabs의 혈정 농도를 특이적이고 민감하게 정량 분석하기 위한 특히 유용한 시약이다.
본 발명은 단일클론 항체 BR55-2(Ab1)에 대한 뮤린 단일클론 내부상 항-이디오타이프 항체(Ab2)의 생산, 제조 및 특성 확인에 관한 것이다. 본 발명의 일부는 HIV 감염에 의해 야기되는 질병에 대해서뿐만 아니라 스몰 셀(small cell) 폐암 및 상피조직의 암에 대한 활성적 예방 및 치료적 면역을 위한 항-이디오타이프 Mabs의 이용에 관한 것이다. 또한 키메라화되고 완전하게 인간화된 변이체를 포함한 BR55-2의 특이성을 가지는 항체 또는 이들의 단편 및 유도체의 매우 선택적인 정량 분석을 위한 이들 항-이디오타이프 Mabs의 이용뿐만 아니라 BR55-2의 특이성을 가지는 분자의 선택적 면역-친화성 정제를 위한 일반적인 방법도 본 발명의 일부이다.
2. 항체 BR55-2의 이디오타이프에 대한 뮤린 단일클론 항-이디오타이프 항체의 생산 및 특성확인
원하지 않는 항-이소타이프 면역 반응을 최소화하려는 시도에 있어서, BR55-2, 뮤린 IgG3의 F(ab')2-단편을 면역화를 위하여 선택하였다. 뮤린 Mab BR55-2의 이디오타이프에 대한 뮤린 항-id Mabs의 성공적인 선택을 위하여서는, 동계 숙주에서 적당한 면역 반응을 일으키기 위하여 면역원성을 최대화하는 것이 중요하다. 그러므로 Fc-부가 없는 F(ab')2-단편(절단 및 정제는 유럽 특허출원 제 528,767 호에 기술되어 있음)을 상기 방법(J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 723, 1978)에 따라 헤테로이작용성 링커 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(=SPDP)를 이용하여 면역성 담체로서 케이홀 림페트 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH)에 커플링시킨다.
뮤린 Mabs의 생산을 위한 전형적인 프로토콜에 근거하여 프로인드 완전 보조제(Freund complete adjuvant)를 이용하여 BR55-2/뮤린 IgG3-F(ab')2-KLH-결합체로 Balb/c 마우스를 면역시켰다. 면역을 반복한 후 뮤린 췌장 세포를 뮤린 골수종 세포주 SP2/0와 융합시켰다(자세한 실험 내용에 대해서는 실시예 1 참조).
배양된 하이브리도마 세포의 적당한 선택을 위하여 이들의 상청액에 대한 일련의 실험을 실시하였다. 이 선택은 하기 기준에 기초한다:
a) 상청액중의 뮤린 IgG의 농도를 측정함에 의한 하이브리도마의 분비율(자세한 실험에 대해서는 실시예 2 참조) 높은 양의 뮤린 IgG을 생산하는 세포를 단일 세포 배양물에 서브클로닝한다.
b) BR55-2/뮤린 IgG3의 F(ab')2-단편에 대한 선택된 상청액의 결합(자세한 실험에 대해서는 실시예 3 참조).
c) 선택된 상청액에 의한 루이스 Y 양성 항원 SKBR5 인간 유방암 세포에 BR55-2/뮤린 IgG2a의 결합의 억제(자세한 실험에 대해서는 실시예 4 참조).
후자의 실험은 Ab2's의 내부상 성질을 표시하는 것으로 설계한다. 면역에 사용된 BR55-2/뮤린 IgG3의 F(ab')2-단편의 잔류 불변 영역을 인식하는 Ab2's의 검출을 최소화하기 위하여 BR55-2의 뮤린 IgG2a 스위치 변이체를 결합에 사용한다. 이 실험은 실험 a)에서 측정된 IgG 농도에 근거하여 정량분석으로 실시한다(실시예 2). 또한 BR55-2의 이디오타이프에 특이적이지 않은 Ab2's의 검출을 피하기 위하여 과량의 비특이적인 마우스-IgG을 이 억제 실험에 첨가한다. 95% 이상의 억제능을 가지는 IgG 를 생산하는 하이브리도마를 선택한다(SKBR5 세포주에 대한 BR55-2/뮤린 IgG2a의 결합의 억제).
상기에서 언급한 실험 과정을 이용하여 6개의 다른 하이브리도마를 최종적으로 선택하고 증폭시켰다(E4, C11, B3, B9, G6 G9). 모든 6 개의 하이브리도마는 토끼-항-마우스-IgG1/퍼옥사이드(예컨대 자이메드(Zymed)의 시약)을 이용한 서브타입 ELISA로 검출되는 바와 같은 뮤린 IgG1을 생산한다.
6 개의 모든 하이브리도마를 롤러 플라스크(37℃, 배지 G에서 5% CO2; 매 3 내지 4 일마다 배지 교환)에서 배양하고 후속적인 정제를 위하여 상청액을 모았다.
개개 항-id BR55-2 Mab을 함유하는 각 상청액을 면역친화성 크로마토그래피로 정제한다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피는 해당 물질과 고정화된 리간드사이의 상호작용에 기초한다. 항-이디오타이프 항체 BR55-2의 경우에 친화성 컬럼에 대하여 매우 특이적인 리간드는 선택한 항-이디오타이프 Mab와 결합하는 Mab BR55-2/뮤린 IgG2a이다(상세한 실험 내용은 실시예 5를 참조).
단리된 항-id BR55-2 Mabs(E4, C11, B3, B9, G6, G9)의 순도는 분석 FPLC 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및 등전 포커싱(isoeletric focussing)으로 시험한다. 6개의 항-id BR55-2 Mabs의 순도는 95% 이상이다(상세한 실험에 대해서는 실시예 6 참조, SDS-PAGE 및 등전 포커싱은 제 1 도 및 제 2 도에 도시되어 있다).
정제된 항-id Mabs는 루이스 Y 항원 양성 SKBR5 세포주에 대한 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합을 억제하는 능력을 측정함으로써 정량적으로 특성확인한다. 모든 항-id Mabs는 1:1 화학양론에 기초하여 항원에 대한 Ab1의 결합을 억제한다(자세한 실험에 대해서는 실시예 7 참조, 대표적인 결과는 제 3 도에 도시되어 있음).
상기 항-id BR55-2 Mabs의 내부상 성질의 결정적인 증거 및 대용 종양 항원으로서의 이들의 이용은 다른 종에서 종양 관련 항원에 대한 Ab3 반응을 일으키는 능력에 기초한다. 엔. 제른(N. Jerne)의 네트워크 이론에 따라 내부상 항-id Mabs(Ab2)로 면역시켜 유도된 항체(Ab3)는 Ab1의 특이성과 유사한 결합 특이성을 가진다. 그러므로 항-id BR55-2로의 면역에 의하여 일어난 면역 반응은 루이스 Y 항원 양성 종양 세포에 특이적이어야 한다. 결론적으로 항종양 면역성은 항-id BR55-2 Mabs로의 면역에 의하여 인간에서 유도될 수 있다.
Ab3 반응의 성질을 조사하기 위하여 레서스(rhesus) 원숭이 뿐만 아니라 토끼를 담체 및 보조제로서 항-id BR55-2 #E4 및 수산화 알루미늄을 사용하여 면역시켰다. 이와 같은 온화한 보조제는 인간에 사용하기 위한 다른 백신에 광범위하게 이용되고 있다. 음성 대조군으로서 또한 동일한 양의 비특이적 마우스-IgG1으로 시험 동물을 면역시킨다. 5주동안 4회 면역시킨 후 9주째에 혈청을 모은다(자세한 실험 내용에 대해서는 실시예 8 참조). 루이스 Y 항원 양성 SKBR5 유방암 세포주 및 루이스 Y 항원 음성 WM9 흑색종 세포주에 대한 헐청 Ig의 결합을 측정한다(자세한 실험에 대해서는 실시예 9 및 10 참조).
항-id BR55-2 #E4는 토끼 및 레서스 원숭이 둘다에서 높은 역가의 체액성 면역 반응을 일으킨다. 항-id BR55-2 #E4로 면역된 동물의 혈청 Ig은 루이스 Y 항원 양성 SKBR5 세포주에는 선택적으로 결합하나 루이스 Y 항원 음성 WM9 세포주에는 결합하지 않는다. 이와는 대조적으로 비특이적 마우스-IgG1으로의 면역화에 의해서는 종양 세포 결합 혈청 Ig은 거의 검출되지 않는다. 이러한 결과는 표 1에 요약하였다. 제 4 도 및 제 5 도에는 세포-ELISA(SKBR5 세포)에서 토끼- 및 레서스 원숭이의 면역전 혈청 및 면역 혈청으로 얻어진 대표적인 Ig-결합 곡선을 도시한다. 항-id BR55-2 #E4로 면역된 동물의 혈청 Ig의 SKBR5 세포에의 결합은 여전히 1:10,000의 혈청 희석율에서 검출될 수 있다.
초기 면역 단계 2 년후 개개 레서스 원숭이에 비특이적 마우스-IgG1 또는 항-id BR55-2 #E4의 최초 단일 보조 주사를 투여한다. 동일한 방법으로 초기 면역 3년후에 제 2의 단일 보조 주사를 투여한다(제 1 보조 주사후 1 년; 상세한 실험에 대해서는 실시예 8 참조). 이들 보조 주사 전 및 후에 혈청을 채취한다.
항-id BR55-2 #E4로 접종된 레서스 원숭이의 총 체액성 면역 반응은 미세적정플레이트에 피복된 항-id BR55-2 #E4 상에 기초한 ELISA를 이용하여 측정하였다(자세한 실험에 대해서는 실시예 13 참조). 모든 레서스 원숭이 혈청에서 매우 높은 역가의 면역 반응이 제 1 및 제 2 보조 주사후뿐만 아니라 제 1 면역 단계후에 발견되었다. 항-id BR55-2 #E4에의 Ig의 결합은 1:50,000 혈청 희석율에서 검출된다. 다소 낮지만 여전히 매우 높은 역가가 보조 주사전의 혈청에서 발견된다. 이들 결과는 제 6 도 내지 제 8 도에 도시되어 있다.
또한 비특이적 마우스-IgG1으로 접종된 레서스 원숭이의 체액성 면역 반응을 상기와 동일한 ELISA를 이용하여 측정하였다(상세한 실험 내용은 실시예 13 참조). 예상했던 바와 같이 항-id BR55-2 #E4에 대한 Ig 결합의 혈청 역가는 항-id BR55-2 #E4로 접종된 원숭이의 혈청에서 발견되는 역가보다 낮다. 비특이적 마우스-IgG1으로 접종된 레서스 원숭이의 면역 반응이 항-id BR55-2 #E4의 불변 영역과 교차 반응할지라도 항-id의 초가변 영역에 대한 면역 반응의 분획은 명백히 없어진다. 이러한 결과는 제 9 도 및 제 10 도에 도시되어 있다.
보조 면역 전 및 후뿐만 아니라 초기 면역과 과정후 면역 반응의 종양 특이성을 증명하기 위하여 루이스 Y 음성 흑색종 세포주뿐만 아니라 일부 루이스 Y 항원 양성 암 세포주(유방, 위, 대장 및 스몰 셀 폐암)에 대한 원숭이 혈청 Ig의 결합을 측정한다(상세한 실험 내용은 실시예 10 참조). 제 1 보조 면역 2 년후 및 제 1 보조 면역전 항-Id BR55-2 #E4로 처리된 레서스 원숭이에서 루이스 Y 항원 양성 종양 세포에 결합하는 혈청-Ig가 여전히 검출될 수 있다. 제 1 보조 면역후 루이스 Y 항원 양성 종양 세포에 특이적으로 결합하는 혈청-Ig의 매우 높은 역가가 항-id BR55-2 #E4로 면역된 동물에서 발견되나 항원 음성 세포주에의 결합은 검출되지 않는다. 비특이적 마우스 IgG1으로 면역된 레서스 원숭이의 혈청에서 어느 시점에서도 특이적 결합은 관찰되지 않는다. 제 2 보조 면역 전 및 후에 얻어진 혈청에서도 유사한 결과가 발견된다. 일부 종양 세포주를 이용한 세포-ELISAS에서 다양한 시점에서 얻어진 혈청을 적정한 이들 결과는 제 11 도 내지 제 20 도에 나타나 있다.
또한 제 1 보조 면역 전 및 후뿐만 아니라 제 1 면역 과정 전 및 후에 다른 원숭이 혈청의 Ig의 면역반응성의 유사한 패턴이 루이스 Y 항원 양성 SKBR5 세포의 막 제조에 대한 결합 실험에 의하여 밝혀질 수 있다(자세한 실험에 대해서는 실시예 11 참조). 이들 결과는 표 2에 요약되어 있다.
항-id BR55-2 #E4로 면역시켜 레서스 원숭이에서 유도된 체액성 면역 반응을 좀 더 상세하게 분석하기 위하여 접종된 원숭이의 다른 혈청을 세파로스에 결합된 항 항-id BR55-2 #E4가 로딩된 컬럼상에서 면역정제하였다(자세한 실험 내용에 대해서는 실시예 12 참조). 이와같은 선택적은 단일-단계 공정에 의하여 항-id BR55-2 #E4에 대한 완전한 체액성 면역 반응을 모든 다른 비가역적 혈청 단백질으로부터 분리한다. 제 1 실험에서 항-id BR55-2 #E4로 면역된 레서스 원숭이의 Ig을 초기 면역 과정 9주후에 얻어진 혈청으로부터 면역정제하였다. 제2실험에서 항-id BR55-2 #E4로 면역된 레서스 원숭이의 Ig을 제 2 보조 면역 4 및 9주후에 얻어진 모여진 혈청으로부터 면역정제하였다. 항-id BR55-2 #E4-컬럼상에서의 체류에 기초하여, 얻어진 Ig-분획은 항-id BR55-2 #E4 항체 분자의 다양한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이들 Ig-분획은 항-id BR55-2 #E4의 결합 영역을 포함한 다양한 영역에 대한 항체(항-이디오타이프 면역 반응)뿐만 아니라 항-id BR55-2 #E4의 불변 영역에 대한 항체(항-이소타이프 면역 반응)를 함유한다. 도입부에서 언급한 이디오타이프 네트워크 이론에 기초하여 후자부(AB3)는 BR55-2(AB1)의 특이성을 가지는 항체의 결합성에 버금 가는 결합성을 나타내기 때문에 특히 중요하다.
관통류 분획(flow through fraction) 및 제 2 보조 면역 4 및 9 주후에 얻어진 모여진 혈청으로부터의 면역정제된 Ig-분획의 항-id BR55-2 #E4에 대한 결합을 측정한다(자세한 실험 내용은 실시예 13 참조). 면역정제된 Ig-분획이 항-id BR55-2 #E4에 강하게 결합하지만 관통류 분획에 대해서는 결합이 검출되지 않는다. 이러한 결과에 의하여 이와 같은 면역 정제 방법의 선택성 및 효율이 증명된다(결과는 제 21 도에 도시되어 있다).
그 다음 제 2 보조 면역 4 및 9 주후에 얻어진 모여진 혈청으로부터의 면역정제된 Ig-분획, 관통류 분획 및 제 1 세대 뮤린 Mab(AB1)의 인간화된 형의 결합성을 SKBR5 유방암 세포에서 비교하였다. 이와 같은 인간화된 AB1 변이체(BR55-2/인간화된 IgG1)는 레서스 원숭이 Ig(매우 근친한 레서스 원숭이 Ig에 대해 유사하게 결합하는 염소-항-인간-Ig/퍼옥시다제)에 대해서 사용된 시약과 동일한 시약으로 검출될 수 있기 때문에 비교를 용이하게 하기 위하여 선택하였다. 거의 모든 종양 세포 결합 반응성은 면역정제된 Ig-분획에 축적된다. 이러한 결과에 의하여 루이스 Y 항원 양성 종양 세포주의 항-id BR55-2 #E4로 면역시켜 유도된 레서스 원숭이 Ig의 교차반응성이 증명된다. 또한 중량 대 중량 기준에서, 면역정제된 Ig-분획의 결합 세기는 BR55-2/인간화된 IgG1(AB1)의 결합 세기보다 5 배정도 낮다. 면역정제된 Ig-분획의 특정 일부만이 항-id BR55-2 #E4의 결합 영역에 대한 것이며 네트워크 이론에 따라서, 이 부분만이 AB1에 상응하는 결합성을 나타낸다는 점을 고려하면 이러한 결과는 주목할만 하다. 레서스 원숭이 혈청의 면역-친화성 정제의 수율에 기초하여 면역정제된 Ig-분획의 역가는 약 200㎍/㎖ 혈청에 상당하며 이는 BR55-2/인간화된 IgG1의 종양 세포 결합성과 유사한 결합성을 가지는 Ig의 약 40㎍/㎖에 해당한다(그 결과는 제 22 도에 도시되어 있으며 상세한 실험 내용은 실시예 10 및 12를 참조한다).
루이스 Y 양성 유방 암 세포주 SKBR5 및 루이스 Y 음성 흑색종 세포주 WM9 상에서 BR55-2/인간화된 IgG1의 결합성과 면역정제된 원숭이 Ig(AB3)의 결합성의 비교는 제 23 도에 도시되어 있다(자세한 실험 내용에 대해서는 실시예 10 참조). AB3 분획 및 BR55-2/인간화된 IgG1 둘다는 상기한 바와 같이 루이스 Y 양성 세포주에 강하게 결합하고 두 항체 모두는 루이스 Y 음성 세포주에 특이적으로 결합하지 않는다. 이러한 결과에 의하여 AB3-분획과 인간화된 AB1 변이체의 결합 패턴의 유사성이 증명된다.
또한 AB3-분획의 면역반응성의 유사한 패턴은 루이스 Y 양성 SKBR5 세포주 및 루이스 Y 음성 세포주 WM9의 막 분획을 이용한 ELISA에서도 관찰된다. AB3-분획의 실제적인 결합은 루이스 Y 양성 세포막에 대해서만 검출된다(그 결과는 제 24 도에 도시되어 있으며 자세한 실험은 실시예 11 참조).
면역정제된 원숭이 Ig(AB3)의 결합성은 또한 몇몇 루이스 Y 양성 인간 종양 세포주(스몰 셀 폐암, 위암, 대장암, 유방암)상에서 또한 실험하였다. 면역정제된 원숭이 Ig은 모든 시험된 세포주에 강하게 결합한다(그 결과는 제 25 도에 도시되어 있으며 자세한 실험은 실시예 10 참조).
AB1 항체 BR55-2/뮤린 IgG3는 종양 세포에 결합후 인간 이펙터 메카니즘의 활성화를 통하여 종양 세포 파괴를 매개한다. 항-id BR55-2 #E4로 면역시켜 유도된 레서스 원숭이 Ig의 종양 세포 파괴능을 시험하기 위하여 면역정제된 원숭이 Ig(AB3)을 사용하였다. 이 실험을 위하여 항-id BR55-2 #E4로 초기 면역화 과정 9주후에 얻어진 레서스 원숭이의 혈청으로부터 AB3 분획을 면역정제하였다(상기 참조). 이펙터 세포로서 인간 PBMC을 이용하는 ADCC 실험에서 AB3-분획을 BR55-2/뮤린 IgG3(AB1)과 비교하였다(그 결과는 제 26도에 도시되어 있으며 상세한 실험 내용 실시예 14 참조). 높은 농도에서 면역정제된 AB3 분획은 뮤린 AB1에 상당하게 인간 이펙터 세포의 활성화를 통하여 종양 세포 파괴를 매개한다. 이러한 결과에 의하여 항-id BR55-2 #E4로의 접종에 의한 선택적 종양 세포 세포독성의 유도가 밝혀졌다. 면역정제된 Ig-분획의 특정 일부만이 항-id BR55-2 #E4의 결합 영역에 대한 것이고 이 부분만이 종양 세포에 결합하고 ADCC를 매개하는 것으로 기대되기 때문에 높은 농도의 AB3이 필요하다.
도입부에서 언급한 바와 같이 루이스 Y 탄수화물 항원은 또한 HIV로 감염된 인간 백혈구 세포상에서 발현된다. HIV-감염된 세포에 비특이적인 마우스 IgG1 또는 항-id BR55-2 #E4로 면역된 레서스 원숭이의 혈청 Ig의 결합 행동을 조사하기 위하여 인간 혈청에서 HIV-혈청 양성반응을 검출하도록 원천적으로 설계된 상업적 진단 킷트에서 최초 면역화 과정 전 및 9 주후에 얻어진 원숭이 혈청을 시험하였다. 이 시험은 항-인간 IgG-FITC을 이용한 간접적 면역형광성으로 검출되는 바와 같은 HIV-감염된 인간 T 세포주 PALL에 결합하는 인간 혈청 Ig의 능력에 기초한다. 인간 및 레서스 원숭이 Ig의 상당한 유사성으로 인하여 시험 킷트의 원래 시약은 레서스 원숭이 Ig에 대해서 적용될 수 있다. 감염되지 않은 PALL 세포에의 결합은 대조군으로 작용한다(상세한 실험 내용에 대해서는 실시예 15 참조).
정상 인간 혈청으로 검출된 기초 면역형광성보다 정상 레서스 원숭이 혈청으로 HIV-감염된 PALL 세포 및 감염되지 않은 PALL 세포에 대한 기초 면역형광성이 약간 높다. 그러나 항-id BR55-2 #E4 로 면역된 레서스 원숭이의 혈청 Ig는 HIV-감염된 PALL 세포에 실질적으로 결합하지만 감염되지 않은 PALL 세포에의 결합은 검출되지 않는다. HIV-감염된 PALL 세포에 비특이적인 마우스-IgG1으로 면역된 레서스 원숭이의 혈청 Ig의 반응성은 분명하게 낮게 나타나며 정상 원숭이 혈청으로 관찰된 기초 면역형광성에 근접한다(그 결과는 표 3에 요약되어 있다).
항-id BR55-2 #E4로 면역된 레서스 원숭이의 Ig는 항-id BR55-2 #E4 컬럼을 이용한 제 2 보조 면역 4 및 9 주후에 얻어진 모여진 혈청으로부터 면역정제하였다(상기 참조). 인간 혈청에서 HIV-혈청 양성 반응의 검출을 위해 디자인된 상기의 시중 시험 킷트에서 BR55-2/뮤린 IgG3(AB1)의 결합성과 이와 같이 면역정제된 Ig(AB3)의 결합성을 비교하였다(자세한 실험 내용은 실시예 15 참조). 면역정제된 Ig-분획(AB3)은 HIV-감염된 PALL 세포에 선택적으로 결합하나 감염되지 않은 PALL 세포에는 결합이 검출되지 않았다. BR55-2/뮤린 IgG3(AB1)에 대해서 유사한 결합 패턴이 관찰되었다. 이들 결과는 표 4에 요약되어 있다.
HIV에 의하여 야기되는 다양한 암 및 질환의 예방 및 치료를 위한 톡특한 백신으로서의 이들의 용도 이외에, 본 발명에 기술된 BR55-2의 결합 영역에 대한 내부상 항-이디오타이프 Mabs 는 단일 클론 항체, 이들의 유도체 또는 BR55-2의 결합 특이성을 가지는 단편의 정량 분석을 위한 강력한 수단이다. 예컨대 이들은 인간 혈청에서 BR55-2의 모든 뮤린 서브타입의 농도를 선택적으로 측정하는 데 사용할 수 있다. BR55-2의 결합 영역의 3 차원 형태를 인식하기 때문에 이들 항-id Mabs는 면역반응성 BR55-2 구조에만 결합한다. 이러한 성질은 기존의 항-불변 영역 시약상에 기초한 검출 시스템보다 우수한 검출 시스템을 초래한다. 면역반응성 BR55-2/뮤린 IgG3 또는 BR55-2/뮤린 IgG2a의 정량적 분석을 위한 ELISA 시스템은 실시예 16에 기술되어 있으며 인간 혈청에서 이들 MAbs의 전형적인 표준 곡선은 제 27도에 도시되어 있다.
본 발명에 기술된 항-id Mabs 상에 기초한 유사한 ELISA-시스템은 인간 혈청에서 BR55-2의 면역반응성 마우스/인간 키메라의 매우 높은 선택적 정량 분석에 적용할 수 있다. 이들 키메라는 인간 불변 영역 및 BR55-2의 가변 도메인(예컨대 인간 IgG1 또는 인간 IgG3)으로 구성된다. 인간 혈청에서 매우 과량의 정상 인간 Ig(> 10㎎/㎖)으로 인하여 이와 같은 마우스/인간 키메라는 혈청중에 존재하는 인간 Ig에 결합하는 기존의 항-인간-Fc 시약을 이용하여 인간 혈청에서 검출할 수 없다. 선택적인 ELISA-시스템은 실시예 17 및 18에 기술되어 있고 인간 혈청에서의 전형적인 표준 곡선은 제 28도 및 제 29 도에 도시되어 있다.
뮤린 제 1 세대 Mab의 상보성 결정 영역(CDRs)을 인간 골격부 및 불변 영역에 그라프팅함으로써 BR55-2의 완전하게 인간화된 변이체를 제조하였다. 컴퓨터 모델링을 수단으로 하여, 선택된 인간 골격부에서의 일부 점 변이는 제 1 세대 뮤린 Mab와 비교하여 루이스 Y 양성 종양 세포에 대한 결합 친화성의 실질적 손실이 없는 인간화된 변이체를 초래한다. 따라서 이들 인간화된 변이체에서 결합 특성을 결정하는 원래의 뮤린 아미노산 서열의 작은 일부만이 변하지 않고 남아 있다. 또한 본 발명에 기술된 모든 항-id BR55-2 Mabs는 제 1 세대 마우스 IgG3 Mab 의 이들 인간화된 IgG1 변이체의 이디오타이프에 강하게 결합한다. 항-id Mabs가 AB1의 인간화된 변이체에 대한 결합 행동은 상기한 바와 같이 마우스/인간 키메릭 MabS의 결합 행동에 상당한다. 이는 파마시아사의 BIAcore시스템을 이용하여 생물특이적 상호작용 분석에 의하여 밝혀진다. 더 높은 농도에서 대부분의 경우에 항-id BR55-2와 BR55-2/키메릭 인간 IgG1 또는 BR55-2/인간화된 IgG1 사이에 거의 1:1 화학양론이 관찰되었다. 상세한 실험 내용은 실시예 19에 기술되어 있으며 적정 곡선은 제 30 도 내지 제 35 도에 도시되어 있다. 이들 결과는 BR55-2의 모든 변이체의 초가변 영역의 완전한 3 차원 형태에 대한 항-id Mabs 의 결합 특이성을 부각시키며 이들의 내부상 성질을 증명한다.
이와 같은 톡특하고 선택적인 인식 패턴에 기초하여 항-id BR55-2 Mabs는 혈청중에 존재하는 과량의 인간 면역글로불린에도 불구하고 인간 혈청에서 BR55-2의 특이성을 가지는 면역반응성 인간화된 항체의 매우 선택적인 정량 분석에 사용할 수 있다. 또한 동일한 ELISA-시스템도 원숭이 혈청에서 BR55-2의 특이성을 가지는 인간화 된 항체의 정량적 분석에 이용할 수 있다. 이는 예컨대 수동적 면역 요법을 위한 인간화된 BR55-2 Mab의 임상전 형성동안에 필요한 원숭이 독성- 및 약력학 연구에 중요하다. ELISA-시스템은 실시예 20에 기술되어 있으며 인간 혈청에서 전형적인 표준 곡선은 제 36 도에 도시되어 있다.
항-id BR55-2 Mabs에 의한 BR55-2의 모든 변이체의 결합영역의 인식은 또한 BR55-2/키메릭 인간 IgG1 및 BR55-2/키메릭 인간 IgG3에 의한 항-id BR55-2 #E4에의 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합 경쟁에 의하여 밝혀졌다. 두 키메라 모두는 투여량 의존 방식에서 일정 농도의 제 1 세대 뮤린 Mab의 항-id BR55-2 #E4에의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 이 경쟁적 ELISA는 실시예 21에 기술되어 있고 그 결과는 제 37도에 도시되어 있다.
항원 양성 종양 세포주에의 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합은 상보성 매개된 파괴에 필수적이다. 따라서 항-id BR55-2 Mabs에 의한 종양 세포독성의 억제는 세포 표면상의 항원에 대한 Ab1의 결합을 차단하는 이들의 능력을 반영한다. BR55-2/뮤린 IgG 3에 의해 매개되는 SKBR5 인간 유방암 세포에 대한 상보적 의존 세포독성의 항-id BR55-2 #E4의 강력한 중화작용은 제 38 도에 도시되어 있으며 자세한 실험 내용은 실시예 22를 참조한다.
BR55-2의 완전한 결합 영역에 의한 모든 구조의 매우 특이적인 인식에 기인하여 항-id BR55-2 Mabs는 BR55-2의 모든 변이체의 단일 단계 면역정제 과정에 사용될 수 있다. 항-id BR55-2 #E4는 CH-세파로스 4B에 결합한다. 예컨대, 면역친화성 물질은 생체내에서 배양된 BR55-2/키메릭 인간 IgG1의 직접적인 정제에 사용될 수 있다. 키메릭 Mab는 95% 이상의 순도로 75% 이상의 수율로 얻어진다. 매우 높은 선택성으로 인하여 이와 같은 면역-정제 방법은 단백질 A를 이용한 친화성 정제보다 우수하다. 자세한 실험 내용은 실시예 23에 기술되어 있으며 SDS-PAGE는 제 39 도에 도시되어 있다. 불순물은 검출되지 않았다. CDR의 그라프팅에 의해 얻어진 BR55-2의 인간화된 변이체 세포 배양물 상청액의 매우 효율적인 단일 단계 정제에 유사한 결과로서 동일한 방법이 성공적으로 적용될 수 있다.
결론적으로, BR55-2의 특이성을 가지는 항체의 이디오타이프(항-id BR55-2 #E4)에 대한 뮤린 단일클론 IgG1 항-이디오타이프 항체로 토끼 및 레서스 원숭이를 면역시키면 루이스 Y 양성 인간 종양 세포에 특이적으로 결합하는 높은 역가의 면역 반응을 초래한다. 반복적인 보조 면역에 의한 레서스 원숭이에서의 실험으로 밝혀진 바와 같은 항-종양 면역성이 수년간 유지된다. 인간 이펙터 세포의 존재하에서 이들 면역에 의해 유도된 Ig은 ADCC에서 종양 세포독성을 나타낸다. 항-id 면역의 특이성은 비특이적 마우스 IgG1으로 레서스 원숭이의 대조군의 면역에 의해 증명된다. 비특이적 마우스 IgG1에 대한 실질적인 면역 반응에도 불구하고 어떠한 종류의 종양 세포에 대한 비특이적 결합도 검출되지 않는다.
이들 결과에 의하여 인간에서 보호적인 항종양 면역을 도입할 목적으로 치료적 및 예방적 활성 면역을 위한 루이스 Y 종양 관련 항원의 대용물로서 항-id BR55-2 Mabs의 이용이 부각된다.
또한 항-id BR55-2 Mabs 레서스 원숭이를 면역시키면 HIV-감염된 양성 세포에 선택적으로 결합하는 매우 높은 역가의 면역 반응을 초래한다. 이들 세포는 루이스 Y를 발현하는 것으로 알려져 있다. 이와는 대조적으로 비특이적인 마우스 IgG1으로 레서스 원숭이를 면역시키면 HIV-양성 또는 음성 세포에의 특이적 결합은 초래하지 않는다.
이러한 결과에 의하여 HIV-감염에 의하여 야기되는 질환 및 HIV에 대한 보호적 면역성을 도입할 목적으로 인간의 치료적 및 예방적 접종을 위한 루이스 Y 탄수화물 항원의 대용물로서 항-id BR55-2 Mabs의 이용이 부각된다.
예방적 및 치료적 백신으로서 항-id BR55-2 Mabs의 이용이외에 이들 내부상 항-id Mabs는 혈청 또는 기타 체액에서 키메라화되고 인간화된 변이체를 포함한 BR55-2의 특이성을 가지는 분자의 매우 선택적이고 정량적인 분석을 위한 유용한 시약이다. 적당한 매트릭스에 공유결합된 이들 항-id Mabs는 또한 높은 수율로 BR55-2의 특이성을 가지는 모든 분자의 매우 선택적인 단일 단계 면역 친화성 정제에 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 예시한다. 약어는 하기를 의미한다:
ADCC: 항체 의존성 세포의 세포독성
BSA: 소 혈청 알부민
CDC: 상보적 의존성 세포독성
DMEM: 둘베코 변성된 이글 배지(Dulbecco modified Eagle Medium)
EDC: N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드
ELISA: 효소-결합된 면역흡착 분석
FCS: 소 배 혈청
HBS: 헤페스-완충된 식염수
Mab: 단일클론 항체
NHS: N-하이드록시숙신이미드
PBMC: 말초 혈액 단핵 세포
PBS: 포스페이트-완충된 식염수
RAM-IgG1: 토끼 항 마우스 IgG1 면역글로불린
RPMI: 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Rosweel Park Memorial Institute)
SDS: 도데실 황산 나트륨
KLH: 케이홀 림페트 헤모시아닌
SPDP: N-숙신이미딜-3-(2-피리딜-디티오-프로피오네이트)
PAGE: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
IEF: 등전 포커싱
PEG: 폴리-에틸렌-글리콜
FITC: 플루오레인 이소티오시아네이트
IFA: 면역형광 분석
실시예에서 언급되는 물질은 다음과 같다:
미세적정 플레이트: 면역플레이트 II(Nunc)
세포주:
SKBR5: 인간 유방암 세포주
CATO: 인간 위암 세포주
SW948: 인간 대장암 세포주
SW2: 인간 스몰 셀 폐암 세포주
WM9: 인간 흑색종 세포주
PALL: 인간 T- 세포주
SP2: 마우스 골수종 세포주
배지 A:
RPMI 1640 + 2 g/ℓ NaCHO3
100 U/㎖ 페니실린 G
100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트
4 mM 글루타민
10% FCS (열-불활성화, γ-글로불린-무함유)
배지 B:
RPMI 1640 + 2 g/ℓ NaHCO3
100 U/㎖ 페니실린 G
100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트
4 mM 글루타민
5% FCS (열-불활성화)
배지 C:
DMEM
10% NCTC-135(합성 배지, Gibco)
1% MEM 비필수 아미노산(Gibco)
0.5% 피루브산 나트륨
0.5% 옥살아세트산(Sigma)
20% FCS 열 불활성화
4 mM 글루타민
100 U/㎖ 페니실린 G
100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트
배지 D:
배지 C + 1.36 ㎎/ℓ 하이포크산틴
0.39 ㎎/ℓ 티미딘
배지 E:
배지 D + 0.4 ㎎/ℓ 아미노프테린
배지 F:
배지 C + 마우스 티모사이트(배지 C 25 ㎎에 재현탁된 Balb/c 마우스의 흉선세포)
배지 G :
DMEM
10% FCS 열 불활성화
4 mM 글루타민
100 U/㎖ 페니실린 G
100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트
배지 H:
10 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-2-에탄설폰산
3,4 mM 에틸렌디니트릴로 테트라아세트산
0.15 M NaCl
0.005% P20(파마시아 바이오센서 AB(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)
PEG:
폴리-에틸렌-글리콜(MW = 3400)
1 ㎖ DMEM에 1g이 용해됨
PBS 결핍액:
138.0 mM NaCl
1.5 mM KOH
2.7 mM KCl
6.5 mM Na2HPO4
pH 7.2
피복 완충액:
15 mM Na2CO3
35 mM NaHCO3
3 mM NaN3
pH 9.6
염색 완충액:
24.3 mM 시트르산
51.4 mM Na2HPO4
pH 5.0
세척 완충액:
2% NaCl
0.2% 트리톤 X-100
PBS 결핍액
기질 용액:
40㎎ o-페닐렌디아민디하이드로클로라이드
100 ㎖ 염색 완충액
20 ㎕ H2O230%
결합 완충액:
0.1 M 트리스/HCl
0.2M NaCl
pH 7.5
용출 완충액:
0.15 M 글리신/HCl
0.2 M NaCl
pH 2.8
커플링 완충액:
0.1 M NaHCO3
0.5 M NaCl
pH 8.0
[실시예 1] 항-id BR55-2 Mabs의 생산
1.1: 마우스의 면역화
기술한 바와 같이(J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 723, 1978) SPDP을 통하여 KLH에 결합된 BR55-2/뮤린 IgG3의 F(ab')2-단편 100 ㎍을 하기 계획에 따라 복강내 주사로 Balb/c 마우스에 투여하여 면역시켰다:
투여일: 100㎍ 접합체(PBS 결핍액중의 1 ㎎/㎖) + 100㎕ 프로인드 완전 보조액
7 일 및 28일째: 100㎍ 접합체(PBS 결핍액중의 1 ㎎/㎖) + 100㎕ 프로인드 불완전 보조액
정맥내 1 차 면역후 8, 9, 10 및 11 일째에 총 4회의 보조 주사(각각 PBS 결핍액 100 ㎕ 중의 100㎍접합체)를 투여하였다. 12 일째에 췌장을 멸균 적출하고 PBS 결핍액에 현탁하고 PBS 결핍액에서 3회 세척하였다.
1.2: 혼성화
이들 췌장 세포를 1:1의 비율로 SP2/0 세포의 현탁액에 첨가하고 900g 에서 5분간 원심분리하였다. 1㎖ PEG-용액(37℃)을 세포 펠리트에 1 분간에 걸쳐 적가하고 그 다음 1 분내에 1 ㎖ PBS 결핍액(37℃)으로 희석하였다. 배지 C 10 ㎖을 천천히 진탕시키면서 첨가하고 이 현탁액을 PBS 결핍액 50 ㎖까지 현탁하였다. 이 현탁액을 800g에서 5분간 원심분리하고 펠리트를 배지 D에 재현탁하고 세포를 2.5 × 105세포/웰의 농도로 미세적정플레이트(Nunc 96)의 웰에 넣었다. 37℃에서 하룻밤동안 배양한 후 배지 E의 5% CO2100 ㎕/웰을 첨가하였다. 그 다음 72시간후 매 4 일마다 배지를 배지 D로 대체하였다.
[실시예 2] 하이브리도마 상청액중의 마우스 IgG의 정량적 분석
토기-항-마우스-IgG (예컨대 노르딕의 시약; 피복 완충액중의 1:1000) 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고 PBS 결핍액/5% FCS 200㎕을 첨가하고 37℃ 에서 30분간 배양하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고 배양 2 주후에 얻어진 하이브리도마 상청액 100 분취량을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 항체를 상기한 바와 같이 세척하고 퍼옥시다제-접합된 항체(디아노바의 시약과 같은 토끼-항-마우스-IgG/퍼옥시다제; PBS/2% FCS 중의 1:1000) 100㎕ 분취량을 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하고 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 기질 용액 100 ㎕ 분취량을 첨가하고 4N H2SO4의 50㎕ 분취량으로 5분후 발색을 중지시켰다. 492㎚에서 측광흡광도를 측정하였다(기준 측정 620 ㎚).
[실시예 3] BR55-2 F(ab')2-단편에 대한 하이브리도마 상청액-IgG의 특이적 결합(ELISA)
충분한 마우스 IgG(즉, 배지-블랭크보다 10 배 이상의 광학밀도)을 생성하는 하이브리도마를 배지 F 내의 단일 세포 배양에 서브클로닝하고 추가로 2 주간 배지 C 에서 배양하였다. BR55-2의 F(ab')2-단편(10 ㎍/㎖; 피복 완충액에 희석) 100㎕을 이용하여 실시예 2에서와 같이 상청액을 시험하였다.
[실시예 4] 하이브리도마 상청액-IgG에 의한 SKBR5 인간 유방 암세포에의 BR55-2/뮤린 IgG2a의 결합의 억제
상기의 분석에서 양성으로 나타난 모든 하이브리도마 상청액을 하기와 같이 시험하였다:
미세적정 플레이트를 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(20 내지 30 kD, PBS 결핍액중의 20 ㎍/㎖; 100 ㎕/웰; 30분, 실온)로 예비 처리하고, PBS 결핍액(200 ㎕/웰)으로 2 회 세척한 다음 배지 B(4 × 106 세포/㎖)중의 SKBR5 세포 현탁액 50 ㎕/웰로 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 상청액을 제거한 후 세포를 실온에서 50 ㎕ 글루타르디알데하이드/웰(생리식염수중의 0.1%)로 5 분간 고정시키고 상청액을 제거하고 세포를 PBS 결핍액/1% BSA/0.1% NaN3의 200 ㎕/웰에 재현탁하고 실온에서 1 시간동안 방치하였다. 상청액을 제거하고 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 200 ㎕/웰로 2 회 세척하였다.
1 ㎍/㎖ 마우스-IgG로 조정된 하이브리도마 상청액을 10 배과량의 비특이적 마우스-IgG와 함께 37℃에서 30분간 예비배양하였다. 이후, 이 샘플을 37℃에서 30분간 0.5 ㎍/㎖ BR55-2/뮤린 IgG2a와 함께 예비배양하였다. 이 혼합물 100㎕을 세포에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
혼합물의 처리: 비결합된 항체는 0.05% 트윈 20를 함유하는 빙냉 PBS 100 ㎕/웰로 2회 세척하였다. 퍼옥시다제-접합된 항체(지메드(Zymed)의 시약과 같은 토끼-항-마우스-IgG2a/퍼옥시다제; PBS 결핍액/2% FCS 중의 1:1000) 100㎕분취량을 첨가하였다. 37℃에서 45분간 배양한 후 웰을 상기한 PBS/트윈 20 용액으로 3회 세척한 다음 각 웰이 기질 용액 100㎕을 첨가하였다. 5분후 4N H2SO4/웰의 50㎕ 분취량을 첨가하여 발색을 중지시켰다. 492㎚(기준 측정 620㎚)에서 측광흡광도를 측정함으로써 세포에 대한 항체의 결합을 측정하였다.
[실시예 5] 항-id BR55-2 Mabs의 면역친화성 정제
5.1: BR55-2/뮤린 IgG2a 세파로스의 제조
동결 건조된 활성화 CH-세파로스 4B 10g을 1mM HCl에 현탁하고 소성 유리 필터에 옮기고 1mM HCl 2ℓ로 15분간 세척하였다. 50㎖커플링 완충액에 용해된 리간드(120㎎ BR55-2/뮤린 IgG2a)를 막혀진 용기에서 세척 겔과 혼합하고 실온에서 1 시간동안 꺼꾸로 회전시켰다. 겔을 커플링 완충액으로 세척하고 남아 있는 활성 그룹의 차단을 위하여 1M 에탄올아민 50㎖로 1 시간동안 배양하였다. 그 다음 pH를 바꿔가며 3회 사이클로 세척하였다. 각 pH 사이클은 pH 4(0.1 M 아세테이트, 0.5 NaCl)에서, 이어 pH 8(0.1 M 트리스, 0.5 M NaCl)에서의 세척으로 구성된다.
5.2: 항-id BR55-2 Mabs의 단리
크로마토그래피는 4℃에서 실시하였다. 컬럼(BIO REX MP 컬럼 직경 1.5㎝)에는 Mab BR55-2/뮤린 IgG2a 세파로스(부피 35㎖)를 충전하였다. 겔을 결합-완충액 및 용출 완충액으로 세척하였다. 조절된 결합 완충액으로 평형시킨 후 항-id BR55-2를 함유하는 배지를 15㎖/분의 유속으로 컬럼에 로딩시켰다. 통과 분획의 용출후, 결합된 항-id BR55-2는 용출 완충액으로 탈착시키고 탈착후 바로 1M 트리스/HCl 완충액 pH 7.5로 중화시켰다.
5.3: 항-id BR55-2 Mabs의 농도
용출된 항체 용액(0.12 ㎎/㎖)의 농축은 PM 10 디아플로(Diaflo) 막을 이용한 교반된 아미콘(Amicon) 한외여과 세포에서 실시하였다. IgG에 대한 용질 배제는 98% 이상이며 IgG의 최종 농도는 3.7㎎/㎖에 해당한다.
[실시예 6] 정제된 항-id BR55-2 Mabs의 특성 확인
6.1: Mono-Q 상의 이온-교환 크로마토그래피
컬럼: Mono-Q HR5/5(Pharmacia)
완충액 A: 20 mM 트리-에탄올아민, pH 7.7
완충액 B: 20 mM 트리-에탄올아민, 1M NaCl, pH 7.7
유속: 1㎖/분
검출: UV 280㎚
구배: 선형 2%/분
결과: 모든 항-id BR55-2 Mabs에 대해 밝혀진 95%보다 큰 순도
6.2: 고성능 크기 배제 크로마토그래피.
컬럼: Zorbax GF250, 9.4 × 250㎜
완충액: 인산 나트륨 0.1 M, 0.2 M NaCl, pH 7.0
유속: 1㎖/분
검출: UV 280㎚
결과: 모든 항-id BR55-2 Mabs에 대해 밝혀진 95%보다 큰 순도
6.3: SDS-PAGE
10% 아크릴아미드 겔을 이용한 램리(Laemmli)의 방법에 따라 환원 및 비-환원 조건하에서 실험을 실시하였다. 불순물은 검출되지 않았다(결과는 제 1 도에 도시한다).
6.4: 등전 포커싱
은 염색 및 pH 구배 3 내지 9(파스트(Phast) 겔 IEF 3-9)을 이용하는 파스트-시스템(Pharmacia)으로 분석을 실시하였다(결과는 제 2 도에 도시되어 있다).
[실시예 7] SKBR5 세포주(세포-ELISA)에 대한 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합-정제된 항-id Mabs에 의한 억제
미세적정 플레이트의 예비 처리는 실시예 4에 기술된 바와 같이 실시하였다. 개개 항-id BR55-2 Mabs는 2% FCS(10 내지 0.5 ㎍/㎖)을 함유하는 PBS 결핍액에 희석하였다. 이들 희석용액 각각에 1㎍/㎖ BR55-2/뮤린 IgG3을 첨가하였다. 이 혼합물 100㎕을 세포에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1 시간동안 배양하였다. 혼합물을 실시예 4에서 기술한 바와 같이 처리하였다. 세포에 결합하는 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합 정도는 492㎚(기준 측정 620㎚)에서 측광흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
[실시예 8] 항-id BR55-2 #E4에 의한 토끼 및 레서스 원숭이의 면역화
8.1: 항-id BR55-2 #E4에 의한 토끼의 면역
1, 8, 15 및 36일째에 수산화 알루미늄(1㎎ 항체 ＋ 3.3㎎ Al(OH)3/㎖ PBS 결핍액)상에 흡착된 항-id BR55-2 #E4 300 ㎍을 표피내에 투여함으로 3마리의 암컷 친칠라 토끼를 면역시켰다. 동일한 조건에서 음성 대조군으로서 동일한 양의 비특이적 마우스-IgG1으로 3마리의 토끼를 면역시켰다. 면역전 및 제 1 면역 9 주후에 혈청을 모았다.
8.2: 항-id BR55-2 #E4에 의한 레서스 원숭이의 면역화
1, 8, 15 및 36일째에 수산화 알루미늄(1㎎ 항체 ＋ 3.3㎎ Al(OH)3/㎖ PBS 결핍액)상에 흡착된 항-id BR55-2 #E4/㎏ 0.1㎎를 피하주사함으로써 3 마리의 레서스 원숭이를 면역시켰다. 동일한 조건에서 음성 대조군으로서 동일한 양의 비특이적 마우스-IgG1으로 2 마리의 레서스 원숭이를 면역시켰다. 면역전 및 제 1 면역 4 및 9 주후에 혈청을 모았다.
초기 면역 과정후 2 년째 동일한 원숭이에 각각 항-id BR55-2 #E4 또는 비특이적 마우스-IgG1으로 제 1 피하 보조 주사를 투여하였다(상기와 동일한 양 및 조성). 제 1 보조 면역 전, 및 1 주 및 4 주후에 혈청을 모았다.
초기 면역 과정 3년째(=제 1 보조 주사 투여후 1 년째) 동일한 원숭이에 각각 항-id BR55-2 #E4 또는 비특이적 마우스-IgG1으로 제 2 피하 보조 주사를 투여하였다(상기와 동일한 양 및 조성). 제 2 보조 면역 전 및 1 주, 4 주 및 9 주후에 혈청을 모았다.
[실시예 9] SKBR5 또는 WM9 세포주에의 토끼 혈청의 결합(세포-ELISA)
미세적정 플레이트의 예비처리는 실시예 4에서와 같이 실시하였다. 적당한 예비희석으로 토끼 혈청의 100㎕ 분취량을 세포에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1 시간동안 배양하였다. 세포에의 항체의 결합은 492㎚(기준 측정은 620㎚)에서 측광흡광도를 측정함으로써 결정한다.
[실시예 10] SKBR5, CATO, SW948, SW2 및 WM9 인간 종양 세포주에의 레서스 원숭이 혈청 Ig 또는 면역정제된 Ig(AB3)의 결합(세포-ELISA)
미세적정 플레이트의 예비처리는 실시예 4에서와 같이 실시하였다. 적당한 예비희석으로 레서스 원숭이 혈청 또는 면역정제된 레서스 원숭이 Ig(또한 실시예 12 참조) 및 대조군으로서 BR55-2 인간화된 IgG1의 100㎕ 분취량을 세포에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1 시간동안 배양하였다. 혼합물을 실시예 4에서 기술된 바와 같이 처리하였다. 세포에의 항체의 결합은 492㎚(기준 측정은 620㎚)에서 측광흡광도를 측정함으로써 결정한다.
[실시예 11] SKBR5- 또는 WM9-종양 세포-막 제제에 대한 레서스 원숭이 혈청 Ig 또는 면역정제된 Ig (AB3)의 결합(ELISA)
루이스 Y 항원 양성 SKBR5 인간 유방암 세포주 및 루이스 Y 항원 음성 WM9 흑생종 세포주의 막을 문헌에 기술된 바와 같이 준비하였다[D. Thom et al., Biochem. J. 168, 187-194(1977)]. 개개 막 제제(10㎍/㎖; 피복 완충액중에 희석) 100㎕을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하고 PBS 결핍액/5% FCS 200㎕을 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하였다. PBS 결핍액/2% FCS중의 적당한 희석으로 레서스 원숭이 혈청 또는 면역 정제된 레서스 원숭이 Ig(또한 2 참조)의 100㎕ 분취량을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 60분간 배양하였다. 비결합된 항체를 상기와 같이 세척하고 퍼옥시다제-접합된 항체(케미콘사의 시약과 같은 염소-항-인간-Ig/퍼옥시다제, PBS/2% FCS 중의 1:1000) 100 ㎕ 분취량을 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후 플레이트를 세척 완충액으로 2회 세척하고 염색 완충액으로 2회 세척하였다.
기질 용액 100㎕ 분취량을 첨가하고 4 N H2SO450㎕ 분취량으로 5 분후 발색을 중지시켰다. 492㎚(기준 측정은 620㎚)에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
[실시예 12] 항-id BR55-2 #E4-세파로스를 이용한 항-id BR55-2 #E4(AB3)로 면역된 레서스 원숭이의 혈청 Ig의 면역친화성 정제
12.1: 항-id BR55-2 #E4-세파로스의 제조
동결 건조된 활성 CH-세파로스 4B 9g을 1 mM HCl에 현탁하고 소성 유리 필터에 옮기고 1 mM HCl 2ℓ로 15분간 세척하였다. 50㎖ 커플링 완충액에 용해된 리간드(95㎎ 항-id BR55-2 #E4)를 막혀진 용기에서 세척 겔과 혼합하고 실온에서 1 시간동안 꺼꾸로 회전시켰다. 겔을 커플링 완충액으로 세척하고 남아 있는 활성 그룹의 차단을 위하여 1 M 에탄올아민 50㎖와 함께 1 시간동안 배양하였다. 그 다음 pH를 바꿔가며 3 회 사이클로 친화성 흡착물을 세척하였다. 각 사이클은 pH 4 (0.1 M 아세테이트, 0.5 NaCl)에서, 이어 pH 8(0.1 M 트리스, 0.5 M NaCl)에서의 세척으로 구성된다.
12.2: 항-id BR55-2 #E4로 면역된 레서스 원숭이(AB3)의 혈청 Ig의 단리
크로마토그래피는 4℃에서 실시하였다. 컬럼(파마시아 컬럼 HR 5/2, 베트 크기 5 × 25㎜)에는 항-id BR55-2 #E4-세파로스(부피 0.5㎖)을 충전시켰다. 겔을 결합 완충액 및 용출 완충액으로 세척하였다. 출발 물질은 면역 시작 9 주후에 얻어진 항-id BR55-2 #E4로 면역된 레서스 원숭이의 혈청 2㎖이다. 다른 일련의 실험을 위하여 제 2 보조 면역주사 4 및 9 주후에 얻어진 항-id BR55-2 #E4로 면역시킨 레서스 원숭이의 모여진 혈청 2㎖를 사용하였다. 개개 혈청은 결합 완충액에 1:2로 희석하고 컬럼에 로딩하였다. 통과 분획의 용출후, 결합된 레서스 원숭이 면역글로불린은 용출 완충액으로 탈착시키고 탈착 후 바로 1M 트리스/HCL 완충액으로 pH 7.5로 중화시켰다.
[실시예 13] 항-id BR55-2 #E4 또는 비특이적 마우스 IgG1으로 면역된 레서스 원숭이의 혈청 Ig 또는 면역정제된 Ig의 항-id BR55-2 #E4에 대한 결합(ELISA)
항-id BR55-2 #E4 (10㎍/㎖; 피복 완충액으로 희석( 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고 PBS 결핍액/5% FCS 200㎕을 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 원숭이 혈청 또는 면역정제된 원숭이 Ig을 PBS 결핍액/2% FCS에 희석하였다. 이들 샘플 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 비결합 항체는 상기한 바와 같이 세척하고 퍼옥시다제-접합된 항체(케미콘사의 시약과 같은 염소-항-인간 Ig/퍼옥시다제, PBS/2% FCS 중의 1:1000)을 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후 플레이트를 세척완충액으로 4회 세척하고 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 기질 용액 100㎕를 첨가하고 5분후 4N H2SO450㎕ 분취량을 사용하여 발색을 중지시켰다. 492㎚(기준 측정은 620㎚)에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
[실시예 14] 면역정제된 원숭이 Ig(AB3) 또는 BR55-2/뮤린 IgG3에 의해 매개되는 인간 PBMC 내지 SKBR5 세포를 이용한 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)
분석을 하는 날, SKBR5 세포를 신선한 배지 A에 옮기고 세포 배양 플라스크에서 37℃/5% CO2에 유지하였다.
표적 세포의51C 표지화:
배양 플라스크로부터 세포를 모으고 100 μCi Na251CrO4로 1 시간동안 37℃/5% CO2에서 배지 A 800㎕ 중에 5 × 106세포 농도로 배양하였다. 그 다음 세포를 배지 A로 세척하여 과량의51Cr을 제거하고 신선한 배지 A에 재현탁하고 이들의 농도를 2.5 × 105세포/㎖로 조정하였다.
PBMC의 단리:
0.1 % 글루코스를 함유하는 PBS 완전 용액 60㎖로 헤파린 처리된 신선한 인간 혈액 50㎖을 희석하였다. 이 용액 15㎖ 분취량을 피콜-파크(Ficoll-Paque) 용액 15㎖의 상단에 층상화하고 튜브를 400g에서 30 내지 60분간 원심분리하였다. 혈장 상청액을 버리고 PBMC 층을 모으고 PBS 완전 용액 ＋ 0.1% 글루코스로 50㎖로 희석하였다. 약 80g(10분)에서 원심분리를 한 후, PBS 완전용액 + 0.1% 글루코스 25 내지 30㎖에서 펠리트를 재현탁시키고, 재원심분리(80g, 10분)하고 펠리트를 모으고 배지 A에 현탁하고 세포수를 계산하고 현탁액을 배지 A로 약 2 × 106내지 9 × 106세포/㎖ 농도로 희석하였다. 미세적정 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 분취량을 적정하고 이펙터 세포를 37℃/5% CO2에서 하룻밤동안 배양하였다.
ADCC:
51Cr-표지화된 표적 세포 100㎕을 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 원하는 비율로 예비배양된 이펙터 세포에 첨가하였다. PBS 결핍액에 의해 원하는 농도로 희석된 면역정제된 원숭이 Ig(AB3) 또는 BR55-2/뮤린 IgG3 50㎕을 첨가하고 플레이트를 37℃/5% CO2에서 하룻밤동안(약 18 시간) 배양하였다. 그 다음 상청액을 스카트론-하베스팅 프레스(Skatron-Harvesting Press)로 수확하고 γ-계수기로 계수하였다. 이는 실험적 방출을 위한 수치를 나타낸다. 총51Cr 방출은 PBMC를 2% SDS, 50 mM Na2CO3및 10 mM EDTA 100㎕로 대체하고 항체 용액을 PBS 결핍액 50㎕로 대체함으로써 상기와 같이 측정하였다. 자연적인51Cr 방출은 PBMC를 배지 A 100㎕로 대체하고 항체 용액을 PBS 결핍액 50㎕로 대체함으로써 얻어진다.
계수후 결과는 다음과 같이 계산하였다:
[실시예 15] HIV-감염/비-감염된 PALL-세포에 대한 레서스 원숭이 혈청, 면역정제된 레서스 원숭이 Ig 또는 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합(간접적 면역형광 IFA-항-HIV1-킷트 왈트하임(Waldheim))
시중에서 구입가능한 면역형광 분석 킷트(Waldheim & Co, HIV 혈청 양성반응을 측정하기 위해 구입)에서, HIV-감염 및 비-감염된 PALL 세포(인간 T 세포주)를 슬라이드 유리에 고정시켰다. 실험과정은 원칙적으로 공급자의 지시 내용에 따른다. 37℃에서 30분간 1% BSA로 배양한 후 슬라이드 유리를 정상 인간 혈청 또는 BR55-2/뮤린 IgG3에서 희석된 레서스 원숭이 혈청(농축하고 PBS 결핍액에 1:10으로 희석) 또는 면역정제된 레서스 원숭이 Ig(AB3)로 37℃에서 1시간동안 배양하였다. HIV 양성 인간 혈청(시험 킷트의 일부로서 제공됨)은 양성 대조로 작용하고 정상 인간 혈청은 음성 대조로 작용한다. 시험 샘플의 비결합된 항원 결정기는 PBS 결핍액으로 3회 세척하고 2% FCS 또는 항-뮤린-IgG-FITC(뮤린 Mab의 검출을 위함)을 함유하는 PBS 결핍액에서 항-인간-IgG-FITC 시약(시험 킷트의 일부)의 1:20 희석액을 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양하고 PBS 결핍액으로 3회 세척하고 슬라이드 유리를 묻은 후 형광 현미경으로 면역형광성을 관찰하고 등급화하였다(0 = 면역형광성 없음, 5 = 최대 면역형광성).
[실시예 16] 항-id BR55-2 #E4를 이용한 인간 혈청에서 면역활성 BR55-2/뮤린 IgG3 또는 BR55-2/뮤린 IgG2a의 측정을 위한 ELISA
항-id BR55-2 #E4 (10㎍/㎖; 피복 완충액중에 희석) 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 60 분간 배양하였다.
플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고 PBS 결핍액/5% FCS 200㎕을 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. BR55-2/뮤린 IgG3 또는 BR55-2/뮤린 IgG2a를 함유하는 인간 혈청을 PBS 결핍액/2% FCS 중의 적당한 희석액에서 시험하였다. 이들 샘플 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 표준으로서 BR55-2/뮤린 IgG3 또는 BR55-2/뮤린 IgG2a을 정상 인간 혈청에서 10㎍/㎖ 농도로 예비희석하였다. PBS 결립액/2% FCS 중의 적당한 희석액을 상기와 같이 처리하였다. 결합되지 않은 항체를 상기와 같이 세척하고 퍼옥시다제-접합된 항체(지메드의 시약과 같은 토끼-항-마우스 IgG3/퍼옥시다제 또는 토끼-항-마우스 IgG2a/퍼옥시다제, PBS/2% FCS 중의 1:1000)를 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 다음 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하고 염색 완충액으로 2회 세척하였다.
기질 용액 100㎕ 분취량을 첨가하고 5분후 4 N H2SO450㎕ 분취량으로 발색을 중지시켰다. 492㎚(기준 측정은 620㎚)에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
혈청 샘플의 OD 값은 표준 곡선으로부터 읽어 ㎍/㎖ 단위로 표시하였다.
[실시예 17] 항-id BR55-2 #E4를 이용한 인간 혈청에서 면역활성 BR55-2/키메릭 인간 IgG1의 측정을 위한 ELISA
퍼옥시다제-접합된 항체(케미콘사의 시약과 같은 염소-항- 인간 IgG/퍼옥시다제, PBS 결핍액/2% FCS 중에 1:1000)를 이용하여 BR55-2/키메릭 인간 IgG1을 함유하는 인간 혈청을 실시예 16에서와 같이 시험하였다.
[실시예 18] 항-id BR55-2 #E4을 이용한 인간 혈청에서 면역활성 BR55-2/키메릭 인간 IgG3의 측정을 위한 ELISA
BR55-2/키메릭 인간 IgG3을 함유하는 인간 혈청을 실시예 17에서와 같이 시험하였다.
[실시예 19] 항-id BR55-2 Mabs로 BR55-2/키메릭 인간 IgG1 및 BR55-2/인간화된 IgG1의 실제-시간 생물특이적 상호작용 분석
BIAcoreTM시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)으로 실험을 실시하였다. 고정화된 RAM-IgG1(예: Pharmacia Biosensor AB의 시약, Uppsala, Sweden)에 포획된 다양한 뮤린 IgG1 항-id BR55-2 Mabs에 대한 BR55-2/키메릭 인간 IgG1 또는 BR55-2/인간화된 IgG1의 결합은 실제-시간 비특이적 상호작용 분석을 이용하여 측정하였다.
시스템의 유속은 5㎕/분으로 설정하였다. 센서 칩은 35㎕ 증류수에 용해된 0.201㎎ NHS와 1.313㎎ EDC의 혼합물로 활성화하였다. 30㎍/㎖의 농도로 10mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0) 35㎕에 용해된 RAM-IgG1을 활성화된 센서 표면과 반응시켰다. 남아 있는 자유 활성화된 부위를 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드/NaOH(pH 8.5) 35㎕로 차단하였다.
분석은 하기 3 단계로 실시하였다:
1) 개개 항-id BR55-2 Mab (E4, C11, B3, B9, G6, G9)을 10 내지 17㎍/㎖의 최종 농도로 배지 H으로 희석하였다. 각 분석을 위하여 센서 표면위로 이 용액 35㎕를 통과시킴으로써 RAM-IgG1에 항-이디오타이프 항체를 결합시켰다. 결합된 항-id BR55-2 Mab의 질량에 비례하는 "반응 유니트"를 기록하고 저장하였다.
2) 그 다음 1 내지 100㎍/㎖의 농도에서 배지 H 중의 인간화된 IgG1 및 마우스/인간 키메릭 IgG1의 희석액 20㎕을 주입하고 포획된 항-id에 결합시켰다. 결합된 Mab의 질양에 비례하는 "반응 유니트"를 기록하고 저장하였다.
3) 그 다음 1M 포름산 5㎕ 및 8M 우레아 5㎕을 후속 주입하여 다음 분석을 위하여 센서 표면을 재생시켰다.
결합율은 제 2 항체(BR55-2/키메릭 인간 IgG1 또는 BR55-2/인간화된 IgG1)로 얻어진 최대 반응 유니트 대 제 1 항체(개개 항-이디오타이프 Mab)로 얻어진 최대 반응 유니트의 비를 계산함으로써 결정하였다.
[실시예 20] 항-id BR55-2 #E4을 이용한 인간 혈청에서 면역 활성 BR55-2/인간화된 IgG1의 측정을 위한 ELISA
BR55-2/인간화된 IgG1을 함유하는 인간 혈청을 실시예 17에서 기술된 바와 같이 시험하였다.
[실시예 21] BR55-2/키메릭 인간 IgG1 또는 BR55-2/키메릭 인간 IgG3에 의한 항-id BR55-2 #E4 에의 BR55-2/뮤린 IgG3의 결합의 경쟁
항-id BR55-2 #E4(10 ㎍/㎖; 피복 완충액중에 희석)의 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다.
플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고 PBS 결핍액/5% FCS 200㎕을 첨가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하였다. 키메릭 인간 IgG1 또는 키메릭 인간 IgG3을 PBS 결핍액/2% FCS에 희석하였다(0.5 ㎍/㎖ 내지 3ng/㎖). 이 희석액에 BR55-2/뮤린 IgG3 0.05 ㎍/㎖을 첨가하였다. 이들 혼합물 100㎕ 분취량을 미세적정 플레이트의 웰이 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 결합되지 않은 항체는 상기한 바와 같이 세척하고 퍼옥시다제-접합된 항체(케미콘사의 시약과 같은 염소-항-인간 IgG/퍼옥시다제; PBS/2% FCS 중에서 1:1000) 100 분취량을 첨가하였다.
37℃에서 30분간 배양한 후 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하고 염색 완충액으로 2회 세척하였다.
기질 용액 100㎕ 분취량을 첨가하고 5 분후 4N H2SO450㎕로 발색을 중지시켰다. 492㎚(기준 측정 620㎚)에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
[실시예 22] BR55-2/뮤린 IgG3에 의해 매개된 SKBR5 세포주에 대한 상보적 의존성 세포독성(CDC)- 항-id BR55-2 #E4에 의한 억제
분석 실시일에 SKBR5 세포를 신선한 배지 A에 옮기고 세포 배양 플라스크에서 37℃/5% CO2에서 유지하였다.
표적 세포의51Cr 표지화:
세포를 배양 플라스크로부터 모으고 100 μCi Na251CrO4로 배지 A 800㎕중의 5 × 106세포 농도로 37℃/5% CO2에서 1시간동안 배양하였다. 그 다음 세포를 배지 A로부터 세척하여 과량의51Cr를 제거하고 신선한 배지 A에 재현탁하고 이들의 농도를 2.5 × 105세포/㎖로 조정하였다.
CDC:
표적 세포의 이와 같은 현탁액 100㎕을 미세적정 플레이트의 웰에 피펫으로 옮겼다. PBS 결핍액중의 원하는 농도로 희석된 항-id BR55-2 #E4의 50㎕ 분취량을 첨가하였다. 그 다음 2㎍/㎖ BR55-2/IgG3를 함유하는 인간 혈청 100㎕ 분취량을 각 웰에 첨가하고 세포를 37℃/5% CO2에서 하룻밤동안 배양하였다. 상청액을 스카트론-하베스팅-프레스로 수확하고 γ-계수기로 계측하였다. 이 수치는 실험적 방출에 대한 값을 산출한다.
총51Cr 방출을 결정하기 위하여 인간 혈청을 2% SDS, 50 mM Na2CO3및 10 mM EDTA의 용액으로 대체하고 항-id BR55-2 #E4 용액을 50㎕ PBS 결핍액으로 대체함으로써 세포를 상기와 같이 처리하였다. 자연적51Cr 방출에 대한 수치는 인간 혈청을 배지 A로 대체하고 항-id BR55-2 #E4 용액을 50㎕ PBS 결핍액으로 대체함으로써 얻었다.
계측후 결과는 하기에 따라 계산하였다:
[실시예 23] 항-id BR55-2 #E4-세파로스를 이용한 BR55-2/키메릭 인간 IgG3의 면역친화성 정제
23.1: 항-id BR55-2 #E4-세파로스의 제조
동결 건조된 활성 CH-세파로스 4B 9g을 1 mM HCl에 현탁하고 소성 유리 필터에 옮기고 1 mM HCl 2ℓ로 15분간 세척하였다. 50㎖ 커플링 완충액에 용해된 리간드(95㎎ 항-id BR55-2 #E4)를 막혀진 용기에서 세척 겔과 혼합하고 실온에서 1 시간동안 거꾸로 회전시켰다. 겔을 커플링 완충액으로 세척하고 남아 있는 활성 그룹의 차단을 위하여 1M 에탄올아민 50㎖로 1 시간동안 배양하였다. 그 다음 pH를 바꿔가며 3회 사이클로 친화성 흡착물을 세척하였다. 각 사이클은 pH 4(0.1 M 아세테이트, 0.5 NaCl)에서, 이어 pH 8(0.1 M 트리스, 0.5 M NaCl)에서의 세척으로 구성된다.
23.2: BR55-2/키메릭 인간 IgG1의 단리
크로마토그래피는 4℃에서 실시하였다. 컬럼(BIO REX MP 컬럼 직경 1.5㎝)에는 항-id BR55-2 #E4-세파로스(부피 35㎖)를 충전하였다. 겔을 결합 완충액 및 용출 완충액으로 세척하였다. 출발 물질은 BR55-2/키메릭 인간 IgG1 조절된 배지 100ℓ 이다. 속이 빈 섬유 카트리지 P10이 장착된 아미콘 DC2 농축 시스템을 이용하여 5:1로 농축시킨후 농축물을 컬럼에 로딩시켰다. 통과 분획의 용출후 결합된 BR55-2/키메릭 인간 IgG1은 용출 완충액으로 탈착시키고 탈착후 바로 1 M 트리스/HCl 완충액 pH 7.5로 중화시켰다.
23.3: BR55-2/키메릭 인간 IgG1의 농축
용출된 항체 용액의 농축은 PM 10 디아플로(Diaflo) 막을 이용한 교반된 아미콘 한외여과 세포에서 실시하였다. IgG에 대한 용질 배제는 98% 이상이었으며 IgG의 최종 농도는 3.36㎎/㎖이었다.
23.4: 정제된 BR55-2/키메릭 인간 IgG1의 특성확인
23.4.1: Mono-Q 상에의 이온-교환-크로마토그래피
컬럼: Mono-Q HR5/5(Pharmacia)
완충액 A: 20 mM TEA, pH 7.7
완충액 B: 20 mM TEA, 1M NaCl, pH 7.7
유속: 1㎖/분
검출: UV 280㎚
구배: 선형 2%/분
결과: 순도 95%보다 큼
23.4.2: 고성능 크기 배제 크로마토그래피
컬럼: Zorbax GF250, 9.4 × 250㎜
완충액: 인산 나트륨 0.1 M, 0.2 M NaCl, pH 7.0
유속: 1㎖/분
검출: UV 280㎚
결과: 순도 95%보다 큼
23.4.3: SDS-PAGE
10% 아크릴아미드 겔을 이용한 램리의 방법에 따라 환원 조건하에서 실험을 실시하였다(결과는 제 10도에 도시되어 있다).
출발 물질
뮤린 단일클론 항체 BR55-2는 예컨대 하이브리도마 BR552(BR55-2/IgG3) 및 BR552.S2a(BR55-2/IgG2a)로부터 각각 입수할 수 있다.
이들 하이브리도마는 부다페스트 조약하의 국제 기탁 기관인 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852, USA)에 각각 수탁번호 ATCC HB 9324(1987년 2월 17일 기탁) 및 ATCC HB 9347(1987년 3월 10일 기탁)로 처음 기탁되었다.

Claims (7)

  1. 하이브리도마 BR55.2(ATCC HB9324) 또는 BR55.2S2a(ATCC HB9347)로부터 수득되는 단일클론 항체(Ab1)에 대한 단일클론 뮤린 내부상(internal image) 항-이디오타이프 항체(Ab2).
  2. BR55-2/뮤린 IgG3-F(ab')2-KLH-접합체로 마우스를 면역시키고, 뮤린 췌장 세포를 뮤린 골수종 세포주 SP 2/O와 융합시키고, 95%이상의 억제능(SKBR5 세포주에 대한 BR55-2 뮤린 IgG2a의 결합을 억제하는 것)을 가지는 IgG을 생산하는 배양된 하이브리도마 세포를 선택하고, 항-이디오타이프 항체를 정제 및 단리함을 포함하는, 제 1 항에 따른 항-이디오타이프 항체의 생산 방법.
  3. 약학적으로 허용가능한 보조제, 담체 또는 희석제와 함께 활성 성분으로서 제 1 항에 따른 항-이디오타이프 항체를 포함하는, HIV-감염에 대한 예방적 및/또는 치료적 면역에 이용하기 위한 약학 조성물.
  4. 약학적으로 허용가능한 보조제, 담체 또는 희석제와 함께 제 1 항에서 정의된 바와 같은 항-이디오타이프 단일클론 항체를 포함하는, 상피 계통의 암 및 스몰 셀(small cell) 폐암에 대하여 면역시키기 위한 약학 조성물.
  5. 제1항에 따른 항-이디오타이프 항체를 사용함을 특징으로 하는, BR55-2의 결합 특이성을 가지는 단일클론 항체, 이들의 유도체 또는 그의 단편의 정량 분석 방법.
  6. 제1항에 따른 항-이디오타이프 항체를 사용함을 특징으로 하는, BR55-2의 단일클론 마우스/인간 키메라 및 BR55-2의 완전하게 인간화된 변이체의 정량 분석 방법.
  7. 제 1 항에 따른 항-이디오타이프 항체를 사용함을 특징으로 하는, BR55-2의 변이체의 단일 단계 면역-정제 방법.
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