JPH07507207A - ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ルイスＹ−特異的モツクローナル抗体ＢＲ５５−２に対する抗イデイオタイプモ ノクローナル抗体およびその使用１、背景および導入 免疫系を使用する一つの研究は、イディオタイプ的相互作用を基本にしている。

一つの抗体を他のものと区別する、ｒｇ分子の抗原結合部位中および回りの独特 な抗原決定基はイディオトープとして定義されている。与えられた抗体の可変領 域に存在する全てのイディオトーブを合わせてそのイディオタイプ（ｉｄ）と呼 ぶ。

イディオタイプの分子構造は相補性決定領域および可変領域のフレームワーク領 域の両方に局所的であり、常にではないが一般的に、特異的に関連する重および 軽鎖の両方からなる。

イディオタイプは、同系、同種異系または異種受容体中への抗体（しばしばＡｂ ｌと呼ぶ）の注射が抗イデイオタイプ抗体（しばしばＡｂ２と呼ぶ）の産生を誘 発するため、血清学的に定義された実在物である。イディオタイプ／抗イデイオ タイプ相互作用が存在するという仮定を基にして、生理学的に免疫系の受容体基 本制御は、ニールス・ジェルネ（アナリテイカル・イムノロジー、１２５Ｃ，３ ７３，１９７４）により仮定されている。彼のネットワーク理論は、免疫系を、 各々抗原決定基（エピトープ）をその結合部位（パラトープ）を通して認識でき 、各々本系の他の抗体または細胞表面受容体をそれを表示するイデイオトーブを 通して認識できる１ｇ分子およびＴ−リンパ球上の受容体の収集物として見なす 。多くの研究が、イディオタイプおよび抗イデイオタイプ受容体がＢ−およびＴ −リンパ球の表面およびその分泌する抗体に存在することを実際証明している。

ＡｂｌおよびＡｂ２の間の結合がＡｂｌが引き寄せられる抗原により阻害される 場合、抗原認識を司る抗体可変領域を含むため、イディオタイプは結合部位関連 と見なされる。これらの形態的には疑似抗原エピトープであるイディオタイプは 、これらのエピトープの内部像と言われる。Ａｂ２および抗原の両方が関連Ａｂ １に結合しているため、それらは与えられた抗原の内部像を意味する同様の三次 元構造を分は合っている。原則として内部像抗イデイオタイプ抗体は、それらが イディオタイプネットワークを経由して派生した抗原の置換基として見ることが できる。従って、これらの代用抗原は活性免疫化プロトコールにおいて使用し得 る。例えば、それらは、起源の抗原が明白な免疫反応を誘発するのに充分に免疫 化されていなければ、利点を提供する。このように、非免疫源性炭化水素抗原に 疑似の好適な内部像抗イデイオタイプ抗体は、特にあるワクチン研究に有用であ る。下記に、これらの論題を更に具体的に扱う。

ハイブリドーマ技術の導入の結果、はとんどマウス起源であるモノクローナル抗 体（Ｍａｂ）は、多くの人の癌の型に対して作られた。はとんど全ての異種Ｍａ ｂにより検出されるマーカーは、厳密には癌特異的ではないが、癌およびある正 常および／または胎児組織に分離する分化抗原である。従って、それらは癌関連 抗原（ＴＡＡ）と最も良く呼ばれる。異種Ｍａｂにより検出された人癌マーカー が癌患者の抗癌反応を引き起こせるかどうか、このような抗原が、実際がん患者 の自己の癌に対する反応に実際関連するかどうか、各々のＴＡＡの性質に依存す るが、まだ充分には理解されてない。同系宿主内で天然に免疫源か、免疫源を製 造できるいずれかのＴＡＡは、治療のためにおよび恐らくは予防的利点で抗癌免 疫を誘発するのに有効である。

癌関連抗原は、しばしば“自己”の一部であり、癌患者における非常に乏しい免 疫反応を誘発する。比較して、各々のＴＡＡの構造的エピトープに似ている三次 元形を示す内部像抗イデイオタイプ抗体は、癌をもつ宿主内では外部分子として 認識される。従って、好適な抗−ｉｄＭａｂによる治療的または予防的でさえあ る免疫化により上昇した免疫反応は、抗癌免疫の原因となり得る。

抗−ｉｄＭａｂによる癌に対する治療的免疫化は、特に疾病の初期段階で好結果 である。初期癌の手術の時、しばしば隠れた一つの癌細胞が既に患者の種々の器 官内に転移している。これらの微小転移細胞は、転移癌の後、しばしば臨床的に 証明された癌組織診断および外科的手術による除去の数年後の大きな転移の原因 となることは知られている。これまで、はとんど全ての場合において、上皮細胞 起源の転移癌が治療不可能である。従って、“最小残余癌”の処置、例えば、巨 大転移癌へ成長するのを予防する代わりの隠れている微小転移細胞の破壊は、緊 急の医学的要求である。病気のこの段階（アジュバント位置付け）において、既 知の化学療法研究はむしろ悪結果である。しかしながら、最小残余病の段階にお ける好適な内部像抗−ｉｄＭａｂによる免疫化による特異的抗癌免疫は、免疫系 により微小転移細胞を選択的に除去し得、増加した再発のない生存期間をもたら す。

ＢＲ５５−２（例えば、ウィスター、欧州特許第２８５０５９号、エム・プラス チクースリンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６２（ １９８７）３７２−３７９またはゼット・ステプルスキーら、ハイブリドーマ、 ９（１９９０）２０１−２１０参照）に選択性のあるモノクローナル抗体は、ル イスＹ６抗原、人の固体癌に選択的に発生する炭化水素決定基と定義される。そ の特性を基本にして、ＢＲ５５−２は、基本的に上皮癌の受動免疫治療に使用で きる。

胚発生のある段階の間にもまた発生するルイスＹオリゴサツカライド決定基関連 癌はそれ自身はとんど免疫源性ではない。しかしながら、ルイスＹ抗原の構造エ ピトープに似せることにより内部像特性を伴う、ＢＲ５５−２（Ａｂｌ）に対す るモノクローナル抗イデイオタイプ抗体（Ａｂ２）は、特に疾患の初期段階で、 保護的抗癌免疫性を導入するのに有用である。

上皮起源の蒸上への発現に加えて、ルイスＹ炭化水素抗原はまた人免疫不全ウィ ルス（ＨＩＶ）の感染の病理発生にもまた含まれる。後天性免疫不全症候群（Ａ ＩＤＳ）は、その病因がリンパ栄養性レトロウィルス（ＨＩ　Ｖ）の感染に関連 するものとして証明されている明瞭な疾病として認識されている。本疾病は損な われた細胞媒介免疫および完全な血中リンパ球減少症、特に減少したヘルパーニ ーリンパ球（ＣＤ４）に関連する疾患により特徴付けられる疾病である。ＡＩＤ Ｓは、指定された臨床的特性のコンプレックスおよび血中Ｔ−リンパ球減少症に より通常明示された前症候群が先である。前症候群は、ＡＩＤＳ関連コンプレッ クス（ＡＲＣ）と呼ばれる。

ＨＩＶは、過去２０年にわたって徹底的に研究されているウィルスの群に属する 。レトロウィルスが大または動物細胞に侵入した場合、ＲＮＡはＤＮＡに変わり 、宿生細胞内へ挿入し、次いで細胞自身のものであるかのようにウィルスの遺伝 子を処置してしまう。ＨＩＶは数年間この細胞内に潜んで残り、体内の免疫系か らの攻撃から安全で、宿主細胞が分裂する度に盲目的に複写されることができる 。感染された細胞の活性化により急速なウィルス複写の引金が引かれた場合のみ 、産生されたウィルス分子が細胞を殺し、血流中へ流れ出す。

ＨＩＶの特定特性のため、既に人ゲノム中へ転写されたウィルスおよびプロウィ ルス両方の遺伝子情報を、既に感染した患者から除（ことによる治療は成し遂げ るのが難しい。従って、はとんどの治療の試みは、ウィルス複製の本質的な段階 を妨げることにより病気の進行を遅くする薬剤に集まっている。

安全で有効的なワクチンの手段によるＨＩＶ−感染の予防および既に感染した患 者の治療的介在が主要なゴールである。幾つかのワクチン研究が、前臨床または 初期臨床段階で試験されている。それらは主に抗原としてのウィルス構造、特に 、主要エンベロープグリコプロティンｇｐ１２０を基本にしている。

ウィルスに対して自然に発生する免疫反応はすべてのウィルスタンパク質に対す る抗体および細胞性免疫の活性化からなる。しかしながら、ＨＩＶ−感染に対す るこの宿主反応は、しばしば数年にわたり持続する無症候期間後の病気の進行を 最終的に停止させるようには思えない。したがって、自然に発生し、最終的には 非保護免疫反応の原因となる同じ抗原を基本にしたワクチン研究は、疑わしいま まである。一つの主要な問題は、それによりウィルスがタイプ特異的中和抗−ｇ ｐ１２０抗体の攻撃から逃れられるＨＩＶの広範な異質性である。

ワクチンによる有効なＨＩＶの防御は、２つニ一つは血流中のウィルスの自由な 移動に対して、もう一つは既に感染された細胞に対しての防御方法が必要である 。インビトロおよびインビボＨＩＶ感染細胞は、その表面に変化したグリコプロ ティンパターン、すなわちルイスＹ炭化水素決定基を示すことは知られている。

本抗原が通常ある胎児発育段階の間においてのみ発生し、種々の悪性度にまた関 連するため、ＨＩＶ−感染細胞上の発現は、レトロウィルス形質転換により誘発 されたその別の分化状態を反映し得る。したがりて、この表面表現型は、人ゲノ ムのＨＩＶによる形質転換に対する独特な細胞性宿主反応に似ている。

ＨＩＶ外被グリコプロティンは、感染細胞の機械的グリコジル化により行われる 。従って、ＨＩＶにより製造される感染細胞のグリコジル化パターンの変化はま たウィルス分子から自由に遊離される根拠である。結果として、このような細胞 内で発生するＨＩＶの外被グリコプロティンは、またルイスＹ炭化水素決定基か らなる。従って、ルイスＹオリゴサツカライドは、ＨＩＶ感染細胞および遊離Ｈ ＩＶ−分子の両方に発現される特異的宿主反応を示す。

上記の考慮を基にして、ルイスＹ構造は、遊離ウィルスおよびＨＩＶ−感染細胞 の両方に対するワクチン化法の使用の重要な必要性を満たす。更に、一般に、宿 主がＨＩＶに対して反応するため、ルイスＹ抗原はＨＩＶ種から独立して、その ウィルスの遺伝的変異性により影響を受けない。不幸にも、その炭化水素構造お よびその胎児分化抗原としての“自己”特性を基本にして、ルイスＹはそれ自身 はとんど免疫源性ではない。この抗原に対する自然の免疫反応は人では検出され ていない。しかしながら、ルイスＹ抗原の構造エピトープに似せることにより内 部像特性を有するＢＲ５５−２（Ａｂｌ）に対するモノクローナル抗イデイオタ イプ抗体（Ａｂ２）は、ウィルス種と無関係な、遊離ＨＩＶおよびＨＩＶ感染細 胞に対する予防的および治療的免疫の導入に有用であり得る。

独特なワクチンとしてのその予防的および治療的使用に加えて、モノクローナル 内部像抗−４ｄ抗体は、それが発生した抗体のイディオタイプに対して非常に特 異的な試薬である。それらはほとんどＡｂｌの結合領域を排他的に認識する。

この認識パターンはＡｂｌの他の法定基とは無関係である。言い換えると、好適 な抗−ｉｄＭａｂ選択性が、その正確な三次元構造中がＡｂｌの独特なイディオ タイプからなる任意の分子を明確にする。従って、これらの抗−ｉｄＭａｂは、 ＡｂｌのＦ（ａｂ’）＝−１Ｆａｂ−およびＦｖ−断片およびその変更変異体（ 変更変異体は異なった定常領域、例えばマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ １からなるが、同一のイディオタイプを分けあっている）に、同等の親和性で結 合する。加えて、内部像抗−ｉｄＭａｂのこの高い特異的認識パターンはまた組 み換えＤＮＡ技術により得られた親マウスＭａｂの変異体を含む。

人の受動免疫治療におけるマウス抗体の反復使用により可能性のある問題に打ち 勝つために、マウス７人キメラＭａｂが、選択した親マウスＭａｂの可変領域と 人の定常領域を結合させることにより産生できる。人血清におけるこのようなマ ウス７人キメラＭａｂの検出のために、これらのキメラＭａｂが人の免疫グロブ リンで自然に発生するのと同じ定常領域を有するため、非常に特異的な反応が必 要である。親マウスＡｂｌに対して発生した内部像抗−ｉｄＭａｂは、それ由来 のキメラ抗体をまた認識する。これにより、このような抗−イディオタイプＭａ ｂが、例えば大過剰の正常人免疫グロブリンの存在下、マウス７人キメラＭａｂ の血清濃度の特異的および感受性定量的測定に有用な試薬である。受動免疫治療 に使用するための臨床的に興味深い特性によりＭａｂの特性を更に改善するため に、親マウス抗体の最小必要部分、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが人可変領域 フレームワークおよび人定常領域と結合している°完全に人化した”抗体が、組 み換えＤＮＡ技術により構築できる。これらの“完全に人化した”Ｍａｂの設計 および構築のために、配列相同性および分子造形モデルが、更に免疫源性は減少 しているが、結合特性は有するマウスおよび人配列要素の組み合わせに使用され る。親マウスＡｂｌのイディオタイプに対して発生したある内部像抗−ｉ　ｄＭ ａｂは、もし以下の要求： ａ）人化変異体の結合領域の三次元構造が、親マウス抗体のものと非常に似てい る ｂ）特異的な抗＝ｉｄ抗体が、正確にこの結合領域の三次元構造を認識する（“ 真正内部像抗体”） が満たされていれば、ＣＤＲ−移植人化変異体に結合し得る。

従って、上記特性を有する抗−イディオタイプＭａｂは、例えば大過剰の正常人 免疫グロブリンの存在下、完全に人化した（ＣＤＲ−移植）Ｍａｂの血清濃度の 特異的および感受性定量的測定に特に有用な試薬である。

本発明は、モノクローナル抗体ＢＲ５５−２（Ａｂｌ）に対するマウスモノクロ ーナル内部像抗−イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の発生、産生および特徴付に関 する。本発明の更なる部分はこれらの抗−イディオタイプＭａｂの、上皮起源の 癌および小細胞肺癌およびＨＩＶ−感染が原因の疾病の有効な治療および予防的 免疫化のための使用である。更に、これらの抗−イディオタイプＭａｂの、キメ ラおよび完全に人化された変異体（Ｗ０９２１０３１６５に記載のような）を含 むＢＲ５５−２の特性を有する抗体またはその断片および誘導体の高い選択的お よび定量的測定およびＢＲ５５−２の特性を有する分子に一般に適応可能な選択 的免疫親和精製法への使用もまた本発明の一部である。

２、抗体ＢＲ５５−２のイディオタイプに対するマウスモノクローナル抗−イデ ィオタイプ抗体の発生および特徴付 望ましくない抗−イツタイブ免疫反応を最少にする試みにおいて、ＢＲ５５−２ 、マウスＩｇＧ３のＦ（ａｂ’）を−断片を免疫化のために選択した。マウスＭ ａｂＢＲ５５−２のイディオタイプに対するマウス抗−ｉｄＭａｂの充分な発生 のために、同系宿主における好適な免疫反応を上昇させるために、免疫源性を最 大にすることが重要である。したがって、Ｆｃ一部分が欠けている（開裂および 精製は欧州特許出願第５２８．７６７号に記載）Ｆ（ａｂ’）を−断片を、免疫 源担体としてのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に、記述された方 法（ジエー・カールソンら、バイオケミカル・ジャーナル、１７３．７２３．１ ９７８）にしたがって、異種二機能性すンカーＮ−サクシンイミジルー３（２− ピリジルジチオ）プロピオネ−）（＝ＳＰＤＰ）を使用して結合した。

Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、マウスＭａｂを発生させるのに典型的なプロトコールを 基本にして、フロイント完全アジュバントを使用してＢＲ５５−２／マウスＩｇ Ｇ３　Ｆ（ａｂ’）！−ＫＬＨ−接合体で免疫化した。反復免疫化に続いて、マ ウス膵臓細胞を、マウスミエローマ細胞系Ｓ　Ｐ　２１０で融合した（実験の詳 細は実施例１参照）。

培養されたハイブリドーマ細胞の好適な選択のために、その上清の連続した試験 を行った。選択は以下の基準： ａ）上清中のマウスＩｇＧの濃度を測定することによるハイブリドーマの分泌率 （実験の詳細は実施例２参照）。大量のマウスＩｇＧを産生する細胞は、単一細 胞培養にサブクローン化した。

ｂ）ＢＲ５５−２／７ウスＩｇＧ３のＦ（ａｂ’）を−断片に対する選択した上 清の結合（実験の詳細は実施例３参照）。

Ｃ）選択した上清による、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａのルイスＹ抗原陽性 ５ＫＢＲ５人乳癌細胞の結合の阻害（実験の詳細は実施例４参照）。

を基本にした。

後者の試験は、Ａｂ２°の内部像特性を示すために考案される。免疫化に使用し たＢＲ５５−２／７ウスＩｇＧ３のＦ（ａｂ’）を−断片＋７１Ａ　ｂ　２’認 識残存定を領域の検出を最少にするために、ＢＲ５５−２のマウスＩｇＧ２ａ変 更変異体を結合に使用した。本試験は、試験ａ）のＩｇＧ濃度測定試験を基本に した定量法で行った（実施例２）。更に、過剰の非特異的マウス−ＩｇＧを、Ｂ Ｒ５５−２のイディオタイプに特異的でないＡｂ２’の検出を避けるために、本 阻害実験に加えた。９５％以上の阻害能力（ＢＲ５５−２／？ウスＩｇＧ２ａの ５ＫＢＲ５細胞系への結合の阻害）を有するＩｇＧを産生ずるハイブリドーマを 選択した。

上記の試験法を使用して、６種の異なったハイブリドーマが最終的に選択され、 発展させた（Ｅ４、Ｃ１ｌ、Ｂａ、Ｂ９、Ｇ６、Ｃ９）。すべての６種のハイブ リドーマは、マウスＩｇＧ１を、ウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ１／ペルオキシダ ーゼ（ツィメッドのような試薬）を使用したサブタイプＥＬＩＳＡで検出された ように産生ずる。

全ての６種のハイブリドーマを、ローラーフラスコ（Ｇ培地中３７℃、５％ＣＯ ！；３．４日毎に培地を変える）中で培養し、上演を回収し、続いて精製した。

各々抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂを含有する各々の上清を、免疫親和性クロマト グラフィーを使用して精製した。一般に、親和性クロマトグラフィーは非動化配 位子と興味の対象の物質の間の相互作用を基本にしている。抗−イディオタイプ 抗体ＢＲ５５−２の場合、親和性カラムのための非常特異的な配位子は、選択し た抗−イディオタイプＭａｂに結合するＭａｂＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａ である（実験の詳細は実施例５参照）。

単離された抗−４ｄＢＲ５５−２Ｍａｂ（Ｅ４、Ｃ１ｌ、Ｂａ、Ｂ９、Ｇ６、Ｃ ９）の精製度は、分析的ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除ク ロマトグラフィー、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動により試験した。

全ての６種の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂは〉９５％であった（実験の詳細は実 施例６参照、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動は図１および２に示す）。

精製抗−ｉｄＭａｂを、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のルイスＹ抗原陽性５Ｋ ＢＲ５細胞系への結合を阻害する能力を測定することにより、定量的に特徴付け た。全ての抗−ｉ　ｄＭａｂは、１：１化学量論を基本にしてＡｂｌのその抗原 への結合を阻害する（実験の詳細は実施例７参照二代表的な結果を図３に示す） 。

上記の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの内部像特性およびその代用癌抗原としての 使用の決定的な確証は、異なった種の癌関連抗原に対するＡｂ３反応を発生する 能力に基づ（。エヌ・ジエルネのネットワーク理論に従って、内部像抗−ｉｄＭ ａｂ（Ａｂ２）による免疫化により誘発される抗体（Ａｂ３）は、Ａｂｌと同様 の結合特性を有する。従って、抗−１ｄＢＲ５５２Ｍａｂにより引き起こされる 免疫反応は、ルイスＹ抗原陽性癌細胞に特異的である。結果として、防御抗癌免 疫は人において抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる免疫化により誘発し得る。

Ａｂ３反応の特性の調査のために、ウサギおよびアカゲザルを、抗−１ｄＢＲ５ ５−２＃４および担体およびアジュバントとしての水酸化アルミニウムで免疫化 した。この緩和アジュバントは、人に使用する異なったワクチンに広く使用され ている。陰性対照として、動物をまた同量の非特異的マウス−１ｇＧ１で免疫化 した。５週間の間の４回の免疫化の後、血清を９週目で回収した（実験の詳細は 実施例８参照）。血清ＩｇのルイスＹ抗原陽性５ＫＲＢ５乳癌細胞系およびルイ スＹ抗原陰性ＷＭ９ミエローマ細胞系への結合を測定した（実験の詳細は実施例 ９および１０参照）。

抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４は、ウサギおよびアカゲザルの両方において、高抗 体価液性免疫反応を示す。抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した動物の血清 １ｇは、ルイスＹ抗原陽性５ＫＲＢ５細胞系に選択的に結合するが、ルイスＹ抗 原陰性ＷＭ９ミエローマ細胞系には結合しない。比較して、非特異的マウス−Ｉ ｇＧ１で免疫化物は、はとんど全く癌細胞結合血清１ｇは検出されない。これら の結果は表１に要約する。図４および５において、ウサギおよびアカゲザルの免 疫化前および免疫化活性により、細胞−ＥＬＩＳＡ中で（ＳＫＲＢ５細胞）得ら れた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した 動物の血清１ｇの５ＫＲＢ５細胞への結合は、血清の１　：　１００００希釈で もまだ検出できる。

最初の免疫化課程の２年後、各々のアカゲザルは、抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４ または非特異的マウス−１ｇＧ１の最初の単一追加抗原注射を受ける。同様の方 法で、２回目の単一追加抗原注射を、最初の免疫化の３年後（＝最初の追加免疫 の１年後）に受ける（実験の詳細は実施例８参照）。血清をこれらの追加免疫の 前および後に回収する。

抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの全液性免疫反応を 、マイクロタイタープレートで覆った抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にした ＥＬＩＳＡを使用して測定した（実験の詳細は実施例１３参照）。全てのアカゲ ザルの血清において、最初の免疫化工程および最初および２回目の免疫追加の後 に、非常に高い抗体価免疫反応が見られる。Ｉｇの抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４ への結合は、血清の１：５００００希釈でもまだ観察できる。幾分低いが、まだ 非常に明白な抗体価が、免疫追加の前にも血清で見られる。これらの結果は図６ −８に示す。

非特異的マウス−１ｇＧ１でワクチン処理したアカゲザルの液性免疫反応もまた 上記と同じＥＬＩＳＡを使用して検出した（実験の詳細は実施例１３参照）。期 待されるように、Ｉｇの抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に結合する血清抗体価は、 抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの血清で見られる抗 体価より低い。非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの免疫反応が 、抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の定常領域と交差反応するが、抗−ｉｄの超可変 領域を指向する免疫反応の部分が欠けている。これらの結果は図９−１０に示す 。

免疫反応の癌特性の証明のために、最初の免疫工程後および追加免疫の前および 後、サル血清１ｇの数種のルイスＹ抗原陽性癌細胞系（乳、胃、腸および小細胞 肺癌）およびルイスＹ陰性ミエローマ細胞系への結合を測定したく実験の詳細は ′実施例１０参照）。最初の免疫化の２年後および最初の追加免疫前の抗−１ｄ ＢＲ５５−２＃Ｅ４で処置したアカゲザルにおいて、ルイスＹ抗原陽性癌細胞へ 結合する血清１ｇはまだ検出できる。最初の追加免疫に続いて、抗−１ｄＢＲ５ ５−２＃Ｅ４で免疫化した動物において、特異的にルイスＹ抗原陽性癌細胞に結 合する血清１ｇの途方もなく上昇した抗体価が観察されるが、抗原陰性細胞系へ の結合はほとんど全く観察されない。非特異的マウスＩｇＧ１で免疫化したアカ ゲザルの血清において、どの時点でも特異的結合は観察されない。同様な結果が ２回目の追加免疫の前および後で見られる。種々の時点での、数種の癌細胞系を 使用した細胞−ＥＬＩＳＡを使用におけるこれらの結果は、図１１−２０に示す 。

最初の免疫化工程の前および後および最初の追加免疫の前および後の異なったサ ル血清でも同様のＩｇの免疫反応が、ルイスＹ抗原陽性５ＫＢＲ５細胞の膜調整 物への結合実験で証明できる（実験の詳細は実施例１１参照）。結果は表２に要 約する。

更なる詳細を更に分析するために、抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４、ワクチン処理 したサルの異なった血清で免疫化することによりアカゲザルで誘発された液性免 疫反応を、セファ０−スと組み合わせた抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を導入した カラムで免疫精製した（実験の詳細は実施例１２参照）。この選択的一工程法に より、抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に対する完全な液性免疫反応が、全ての他 の妨害血清タンパク質から分離される。最初の実験において、抗−１ｄＢＲ５５ −２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルのＩｇを、最初の免疫化工程の９週間後に得 られた血清から免疫精製した。第２の実験において、抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ ４で免疫化したアカゲザルのＩｇを、２回目の免疫追加の４及び９週間後に得た 溜だ血清から免疫精製した。その抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４カラム上での保持 を基本にして、得られたＩｇ−フラクションは、抗−３ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４抗 体分子の種々のエピトープに、特異的に結合した。これらのＩｇ−フラクション は、抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の定常領域に対する抗体（抗−アイソタイプ免 疫反応）および、抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域を含む可変領域に対す る抗体（抗−イディオタオブ免疫反応）を含む。導入部で述べたイデイオタオブ ネットワーク理論を基にして、後者の部分（ＡＢ３）は、ＢＲ５５−２（ＡＢＩ ）特異性を有Ｔる抗体と同等な結合特性を示すため、特に重要である。

２回目の免疫追加４および９週間後に得た溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクシ■ ンおよび抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を経由した流れの結合を測定した（実験の 詳細は、実施例１３参照）。免疫精製１ｇ−フラクションは、強く抗−１ｄＢＲ ５５−２＃Ｅ４に結合するが、フラクションを経由した流れでは結合は検出され ない。この結果により、本免疫精製法の選択性および効力が証明される（結果は 図２１に示す）。

次に、２回目の免疫追加４および９週間後に得た溜た血清の免疫精製１ｇ−フラ クションおよびフラクションを経由した流れおよび親マウスＭａｂ（ＡＢＩ）の 大化変形の結合特性を、５ＫＢＲ５乳癌細胞で比較した。本人化ＡＢＩ変形（Ｂ Ｒ５５１／人化１　ｇＧ　１）を、アカゲザルＩｇ（非常に緊密なアカゲザルＩ ｇにまた結合するヤギー抗−人＝Ｉｇ／ペルオキシダーゼ）の検出にまた使用し た同じ試薬で検出できるため、比較を容易にするために選択した。はとんど全て の癌細胞結合反応性は、免疫精製１ｇ−フラクション中で促進される。この結果 により、抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の免疫化により誘発されたアカゲザル！ｇ とルイスＹ抗原陽性癌細胞系の交差反応性が証明される。更に、重量を基本にし て、免疫精製１ｇ−フラクションの結合強度は、ＢＲ５５−２／人化１ｇＧ１（ ＡＢｌ）より僅か５倍少ないだけである。免疫精製１ｇ−フラクションのある部 分のみが抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域を指向し、本ネットワーク理 論に従うとこの部分のみがＡＢＩと同等な結合特性を有することを考慮に入れる と、この結果は注目すべきである。アカゲザル血清の免疫親和性精製の収率を基 にして、免疫精製１ｇ−分画の抗体価量は約２００μｇ／ｍｌ血清であり、ＢＲ ５５−２／人化１ｇＧ１と同等な約４０μｇ／ｍｌのＩｇと癌細胞結合特性に対 応する（結果は図２２に示し、実験の詳細は実施例１０および１２参照）。

免疫精製サルＩｇ（ＡＢ３）とＢＲ５５−２／人化１ｇＧ１のルイスＹ陽性乳癌 細胞系５ＫＢＲ５およびルイスＹ陰性ミエローマ細胞系ＷＭ９に対する結合特性 の比較を図２３に示す（実験の詳細は実施例１０参照）。ＡＢ３フラクションお よびＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の両方が上記のルイスＹ陽性細胞系に強く結合 するが、両方の抗体はルイスＹ陰性細胞系には特異的に結合しない。これらの結 果により、ＡＢ３−フラクションおよび大化ＡＢＩ変形の結合パターンの類似性 が証明される。

ＡＢ３−フラクションの同様な免疫反応性は、ルイスＹｌｌ＃性５ＫＢＲ５細胞 系およびルイスＹ陰性ＷＭ９の膜フラクションを使用したＥＬＩ　ＳＡによりま た観察される。ＡＢ３−フラクションの実質的な結合は、ルイスＹ陽性細胞膜に 対してのみ検出される（結果は図２４に示し、実験の詳細は実施例１１参照）。

免疫精製サルＩｇ（ＡＢ３）の結合特性は、更に実質的に数種のルイスＹ陽性人 癌細胞系（小細胞肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌）で実証された。免疫精製サルＩｇ は、試験した細胞系に強く結合する（結果は図２５に示し、実験の詳細は実施例 １０参照）。

ＡＢＩ抗体ＢＲ５５−２／マウスＩ　ｇＧ３は、人工フェクター機構の活性化を 経由した癌細胞媒介癌細胞破壊に続いて結合する。抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ ４で免疫化して誘発したアカゲザルＩｇの癌細胞破壊の能力を試験するために、 免疫精製サルＩｇ（ＡＢ３）を使用した。この実験のために、ＡＢ３−フラクシ ョンを最初の抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による免疫化工程の９週間後に得た アカゲザルの血清から精製した（上記参照）。このＡＢ３−フラクションを、人 Ｐ　ＢＭＣをエフェクター細胞として使用した実験において、ＢＲ５５−２／マ ウスＩｇＧ３（ＡＢｌ）と比較した（結果は図２６に示し、実験の詳細は実施例 １４参照）。免疫精製ＡＢ３−フラクションの人工フェクター細胞の活性化によ る高濃度媒介癌細胞破壊は、マウスＡＢＩと同等である。この結果により、抗− １ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でのワクチン処理による選択的癌細胞細胞毒性の示唆が 証明される。免疫精製１ｇ−フラクションのある部分のみしか、抗−ｉ　ｄＢＲ ５５−２＃Ｅ４の結合領域を指向せず、この部分が癌細胞に結合し、ＡＤＣＣを 媒介すると思われるため、高濃度のＡＢ３が必要である。

導入部で述べたように、ルイスＹ炭化水素抗原はまたＨＩＶに感染した大白血球 上に発現することが知られている。抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的 マウスＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清１ｇのＨＩＶ感染細胞に対する結 合行動を調べるため、最初の免疫化工程前および９週間後に得られたサル血清を 、人血清中のＨＩＶ−陽性性を検出するために作られた商業的に入手可能な試験 キットで試験した。本試験は、抗−人ＩｇＧ−ＦＩＴＣを使用した間接免疫蛍光 により検出された人血清１ｇのＨＩＶ−感染人Ｔ細胞系ＦＡＬＬへ結合する能力 を基本にしている。人およびアカケザルのＩｇの大きな類似性のため、試験キッ トの本来の試薬はまたアカケザルＩｇにも適応できる。非感染ＰＡＬＬ細胞を対 照として使用する（実験の詳細は実施例１５参照）。

正常アカケザル血清では、ＨＩＶ感染および非感染ＰＡＬＬ細胞の両方のバック グラウンド免疫蛍光は、正常人血清で検出されたバックグラウンド免疫蛍光より 僅かに高い。しかしながら、抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザ ルの血清Ｉｇのみが実質的にＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞と実質的に結合するが、 非感染ＰＡＬＬ細胞への結合はほとんど全く検出されない。非特異的マウス−Ｉ ｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清ＩｇのＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞に対する 反応性は、明白に、正常サル血清で見られるバックグラウンドの免疫蛍光と殆ど 。

明白でなく、非常に近い（結果は表３に要約する）。

抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルのＩｇは、２回目の免疫追 加の４及び９週間後に得た貯蔵血清から、抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４カラム（ 上記参照）を使用して免疫精製した。本免疫精製Ｉｇ（ＡＢ３）の結合特性は、 ＢＲ５５−２／ｖｆｙ７．１ｇＧ３（ＡＢｌ）と、既に述ヘタ人血清中（７）Ｈ ＩＶ−血清１１１性性を検出するために設計された商業的に入手可能な試験キッ ト中で同等であった（実験の詳細は実施例１５参照）。免疫精製Ｉｇ−分画（Ａ Ｂ３）は選択的にＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞に結合するが、非感染ＦＡＬＬ細胞 への結合は検出されない。同様な結合パターンがＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３ （ＡＢＩ）で見られる。

これらの結果は表４に要約する。

種々の癌およびＨＩＶが原因である疾病の予防および処置のだめの独特なワクチ ンとしての使用に加えて、本発明で記載のＢＲ５５−２の結合領域に対して発生 した内部像抗−イディオタイプＭａｂは、ＢＲ５５−２への結合特性を有するモ ノクローナル抗体、その誘導体または断片の定量的測定の有力な道具である。

例えば、人血清中の全てのマウスのＢＲ５５−２のサブタイプの濃度を選択的に 測定するのに使用できる。ＢＲ５５−２の結合領域の三次元構造の認識のため、 これらの抗−ｉｄＭａｂは免疫反応性ＢＲ５５−２構造のみに結合する。この特 性は、既知の抗一定常領域剤を基本にしたものより優れた検出系を導く。免疫反 応性ＢＲ５５−２／７ウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／？ウスＩｇＧ２ａの定 量的測定のためのＥＬＩＳＡ系は、実施例１６に記載され、人血清中のＭａｂの 典型的な標準曲線は図２７に示す。

本発明で記載の抗−ｉｄＭａｂを基にした同様なＥＬＩＳＡ系が、人血清中のＢ Ｒ５５−２の免疫反応性マウス７人キメラの高度に選択的な定量的測定に適用で きる。これらのキメラはＢＲ５５−２の可変領域および人定常領域からなる（例 えば人ＩｇＧ１または人ＩｇＧ３）。人血清中での大量に過剰な正常人１ｇのた め（＞　１０＋＋ｇ／＋１）、このような７９１７人キメラは、血清に存在する 任意の人Ｉｇに結合する既知の抗−人−Ｆｃ剤を使用して人血清中では検出でき ない。選択的ＥＬＩＳＡ系は実施例１７および１８に記載し、人血清中での典型 的な標準曲線は図２８および１９に示す。

完全に人化したＢＲ５５−２の変異体は、マウス親Ｍａｂの相補性確定領域（Ｃ ＤＲ）を、人のフレームワークおよび定常領域へ融合させることにより構築する 。

コンピューター造形の手段により、選択した人フレームワークのある点変異が、 親マウスＭａｂと比較してルイスＹ陽性癌細胞に対する結合親和性を実質的に損 失する異なる大化変異体を導く。従って、本来のマウスアミノ酸配列の少しの部 分のみのこれらの大化変異体は、結合特性が未変化で残っていることを測定する 。

著しく、本発明で記載の全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂはまたこれらの親マ ウスＩｇＧ３Ｍａｂの人化１ｇＧ１変異体のイディオタイプに強く結合する。抗 −ｉｄＭａｂのＡＢ１Ｂ１変化変異体結合行動は、上記の７９１７人キメラＭａ ｂと同等である。これは、ファルマシアのＢＩＡｃｏｒｅ（商標）系を使用した 生物特異的相互作用分析により証明される。殆どの場合、高濃度で、抗−１ｄＢ Ｒ５５−２およびＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧまたはＢＲ５５−２／人化１ｇ Ｇ１の間で殆ど１：１化学量論が観察される。実験データは実施例１９に示し、 抗体価曲線は図３０−３５に示す。これらの発見は抗−ｉｄＭａｂの、全てのＢ Ｒ５５−２の変異体の超可変領域の無傷三次元形への結合の結合特性の最重要点 であり、その内部像特性を証明する。

この独特および選択的認識パターンを基にして、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂは また、人血清中で、血清中に存在する大過剰の人免疫グロブリンにもかかわらず 、ＢＲ５５−２に特性を有する免疫反応性人化抗体の高度に選択的定量測定に使 用できる。同じＥＬＩＳＡ系がまたサル血清中でのＢＲ５５−２に特性を有する 大化抗体の定量的測定に有用である。例えば、人化ＢＲ５５−２Ｍａｂの受動免 疫治療のための、サル毒性および前臨床試験間に必要な薬物動態の研究に非常に 重要である。ＥＬＩＳＡ系は実施例２０に記載し、人血清における典型的標準曲 線は図３６に示す。

ＢＲ５５−２全ての変異体の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる結合領域の認識 はまたＢＲ５５−２／マウス１　ｇＧ３の抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合 とＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１とＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ３の結合を 比較することにより証明される。両方のキメラは、一定量の親マウスＭａｂの抗 −１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合を用量依存的に競合阻害する。この競合ＥＬ ＩＳＡは実施例２１に記載し、結果は図３７に示す。

ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗原陽性癌細胞系への結合は、補体媒介破壊に 必須である。従って、癌細胞毒性の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる阻害は、 Ａｂｌの細胞表面上のその抗原への結合を阻止する能力を反映する。５ＫＢＲ５ 人乳癌細胞系に対するＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介された補体依存 細胞毒性の抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による有効な中和を図３７に３８に示 し、実験の詳細は実施例２２参照。

ＢＲ５５−２の無傷結合領域の全ての構造の非常に特異的な認識のため、抗−ｉ ｄＢＲ５５−２Ｍａｂは、全てのＢＲ５５−２の変異体の単一工程免疫精製法に 使用できる。抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４はＣＨ−セファロース４Ｂと結合する 。この免疫親和性材料は、例えばインビトロで培養されたＢＲ５５−２／キメラ 人ＩｇＧ１の直接の精製に使用できる。キーラＭａｂは、純度〉９５％で、収率 ７５％で得られた。非常に選択性のため、本免疫精製法はプロティンＡを使用し た親和性精製より優れている。実験の詳細は実施例２３．５ＤＳ−ＰＡＧＥは図 ３７に３９に示す。不純物は検出されない。同じ方法が、同様の好結果で、非常 に有効なＣＤＨの結合により得たＢＲ５５−２の大化変異体の細胞培養上清の一 工程精製に適応できる。

結論として、ウサギおよびアカゲザルのマウスモノクローナルＩｇＧ１抗−イデ ィオタイプ抗体によるＢＲ５５−２（抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４）に特性を有 する抗体のイディオタイプに対する免疫化は、ルイスＹ陽性人癌細胞に特異的に 結合する高い抗体価免疫反応を導く。アカゲザルの実験で証明されるように、反 復追加免疫化により、抗−癌免疫性が数年維持される。これらの免疫化により人 工フェクター細胞存在下で誘発されたＩｇは、癌細胞毒性をＡＤＣＣ中で示す。

抗−ｉｄ免疫化の特異性は、アカゲザルの対照群の非特異的マウスＩｇＧ１によ る免疫化により証明される。非特異的マウスＩｇＧ１に対する実質的免疫反応に もかかわらず、任意の種類の癌細胞への特異的結合は検出されない。

これらの結果により、人における保護的抗癌免疫性の誘発を目的とする治療およ び予防的活性免疫化のための抗−ｉｄＢＲ５５−２ＭａｂのルイスＹ癌関連抗原 の代替物としての使用は、最重要点である。

更に、アカゲザルの抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる免疫化は、選択的にＨＩ Ｖ−感染陽性細胞に特異的にまた結合する高い抗体価免疫反応を導く。これらの 細胞は、ルイスＹを発現することが知られている。比較して、アカゲザルの非特 異的マウスＩｇＧ１による免疫化は、ＨＩＶ−陽性または陰性細胞への特異的結 合を導かない。

これらの結果から、人における保護的抗ＨＴＶおよびＨＩＶ感染が原因である疾 病の保護的免疫性の誘発を目的とする治療および予防的活性ワクチン処理のため の抗−４ｄＢＲ５５−２ＭａｂのルイスＹ癌関連抗原の代替物としての使用は、 最重要点である。

抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの予防的および治療的ワクチンとしての使用に加え て、これらの内部像抗−ｉｄＭａｂは、キメラおよび人化変異体を含むＢＲ５５ −２に特異性を有する分子の、血清中または他の体液中における非常に選択的お よび定量的測定に有用な試薬である。好適なマトリックスと共有結合したこれら の抗−ｉｄＭａｂは、ＢＲ５５−２に特異性を有するすべての分子の高収率で非 常に選択的な単一工程免疫親和性精製にまた使用できる。

以下の実施例は本発明を説明する。略語は以下の意味を有する：ＡＤＣＣ：　抗 体依存性細胞性細胞毒性ＢＳＡ　：　牛血清アルブミン ＣＤＣ：　補体依存細胞毒性 ＤＭＥＭ：　ダルベツコ修飾イーグル培地ＥＤＣ：　Ｎ−エチル−Ｎ’−（３− ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド ＥＬＩ　ＳＡ：　酵素結合免疫吸着測定ＦＣ３：　牛胎児血清 ＨＢＳ：　へベス緩衝化食塩水 Ｍａｂ：　モノクローナル抗体 ＮＨＳ：　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドＰＢＭＳ　：　抹消血単核細胞 ＰＢＳ：　リン酸緩衝化食塩水 ＲＡＭ−ＩｇＧ１　：　ウサギ抗マウスＩｇＧ１免疫グロブリンＲＰＭＴ：　ロ スウェル・パーク・メモリアル・インスチテユートＳＤＳ　：　ドデシル硫酸ナ トリウム ＫＬＨ：　キーホルリンベットヘモシアニン５ＰＤＰ：　Ｎ−サクシンイミジル −３−（２−ビリジルージチオプロピオン酸） ＰＡＧＥ　：　ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＩＥＦ：　等電点電気泳動 ＰＥＧ　：　ポリエチレングリコール ＦＩＴＣ：　フルオリンイソチオシアネートＩＦＡ：　免疫蛍光測定。

実施例中で記載される材料は以下の通りである：マイクロタイタープレート：イ ムノプレートＩＩ（タンク）細胞系： ５ＫＢＲ５：　人乳癌細胞系 ＣＡＴＯ：　人乳癌細胞系 ＳＷ９４８　：　人乳癌細胞系 ＳＷ２　：　人手細胞肺癌系 ＷＭ９：　人ミエローマ細胞系 ＰＡＬＬ　：　人乳癌細胞系 ＳＰ２　：　マウスミエローマ細胞系 培地Ａ：　ＲＰＭＩ　１６４０＋２ｇ／１ＮａＨｃＯｓ１００　Ｕ／ｍｌペニシ リンＧ １００μｇ硫酸ストレプトマイシン ４ＩＩＩＭグルタミン １０％ＦＣ３（熱不活性、γ−グロブリンー不存在）培地Ｂ：　ＲＰＭＩ　１６ ４０＋２ｇ／ＩＮａＨＣＯｓ１００　Ｕ／ｍｌペニソリンＧ １００μｇ硫酸ストレプトマイシン ４ｍＭグルタミン １０％ＦＣ３（熱不活性） 培地Ｃ：　ＤＭＥＭ １０％ＮＣＴＣ−１３５（合成培地、ギブコ）１％ＭＥＭ不必須アミノ酸（ギブ コ） ０．５％ピルビン酸ナトリウム ０．５％才キサロ酢酸（シグマ） ２０％熱不活性ＦＣ５ ４ｍＭグルタミン １００Ｕ／＠ｌペニシリンＧ １００μｇ硫酸ストレプトマイシン 培地Ｄ＝　培地Ｃ＋１．３６ｍｇ／ｌヒボキサンチン０、３９ｍｇ／　ｌチミジ ン 培地Ｅ：　培地Ｄ＋０．４ｍｇ／ｌアミノプテリン培地Ｆ：　培地Ｃ＋マウス胸 腺細胞（２５■ｌ培地Ｃに懸濁した一匹のＢａＩｂ／ｃマウスの胸腺細胞） 培地Ｇ：　ＤＭＥＭ １０％熱不活性ＦＣ３ ４ｍＭグルタミン １００　Ｕ／ｍｌペニシリンＧ １００μｇ硫酸ストレプトマイシン 培地Ｈ：　１０ｍＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎｏ−エタンス ルホン酸 ３．４ｎＭエチレンジニトロテトラ酢酸０．１５Ｍ　ＮａＣＩ ０．００５％Ｐ２０（ファルマシア・バイオセンサー・アクチェボラーク、ウプ サラ、スウェーデン） ＰＥＧ、　ポリ一二チレンーブＩ）　：ｌ　−ル（ＭＷ＝　３４００）１ｇがｌ ＋ｌＤＭＥＭに溶解 ＰＢＳ欠乏：　１３８．ＯｍＭ　ＮａＣ１１，５ｍＭ　ＫＯＨ ２，７ｍＭ　ＫＣｌ ６、５ｍＭ　Ｎ　ａ　２８　Ｐ　０ａ ｐＨ７，２ コーチインク゛緩衝液　：　１５ｍＭ　ＮａｔＣＯ１３５ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ ３＋ａＭ　ＮａＮ３ ｐＨ９゜６ 染色緩衝液：　２４．３１１１Ｍクエン酸５１．４ｍＭ　ＮａｚＨＰＯ＜ ｐＨ５，０ 洗浄用緩衝液：　ＰＢＳ欠乏中 ２％　ＮａＣＩ ０．２％トリトンＸ−１００ 基質溶液：　４０ｍｇｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド１００ｍ１開始 緩衝液 ２０μｔ　ＨｔＣｈ　３０％ 結合緩衝液＋０．１Ｍ）リス／ＨＣｌ ０．２Ｍ　ＮａＣ１ ｐＨ７，５ 溶出緩衝液：　０．１５Ｍ　グリシン／ＨＣｌ０，２Ｍ　ＮａＣ１ ｐＨ２，８ 連結緩衝液：　Ｑ、ＩＭ　ＮａＨＣ○３０．４５Ｍ　ＮａＣＩ ｐ）（ｓ、。

実施例１：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ（７）発生１．１＝マウスの免疫化 Ｂａ１ｂ／ｃマウスを各々、５ＰＤＰを経由してＫＬＨと組み合わせたＢＲ５５ −２／ｖウスＩｇＧ３のＦ（ａ　ｂ’）−断片１００μｌで、記載のように（ジ ェー・カルソンら、バイオケミカル・ジャーナル、１７３．７２３．１９７８） 、以下の計画の腹腔内注射により免疫化する：０日：接合体１００μｇ（ＰＢＳ 欠乏中ｌａｇ／ｍｌ）＋フロイント完全アジュバント１００μ１ ７および２８日：接合体１００μｇ（ＰＢＳ欠乏中１■ｇ／■ｌ）＋フロインド 不完全アジュバント１００μｍ 最初の免疫化ｉ、ｖ、の８．９．１０および１１日後、全４回の追加免疫（各々 ＰＢＳ欠乏中１００μｍ中接合体１００μｇ）を与える。１２日に膵臓を無菌的 に取り出し、ＰＢＳ欠乏に懸濁し、３回ＰＢＳ欠乏で洗浄する。

１．２：ハイブリダイゼーシヨン これらの膵臓細胞をＳ　Ｐ　２１０細胞中に１＝１の比で加え、９００ｇで５分 遠心する。ＰＥＧ−溶液１ｍ１（３７℃）を細胞ペレットに１分以内に滴下し、 ＰＢＳ欠乏ＩＪＩ（３７℃）で翌分以内に希釈する。培地Ｃ１Ｏ＋１を穏やかに 攪拌しながら加え、懸濁液をＰＢＳ欠乏で５０ｍ１に希釈する。懸濁液を８００ ｇで５分遠心し、ペレットを培地りに再懸濁し、細胞をマイクロタイタープレー ト（タンク９６）のウェルに、２．５Ｘ１０’細胞／ウエルの濃度で移す。−晩 、３７℃、５％ＣＯ２でのインキュベーションの後、培地え１００μｍ／ウェル を加える。７２時間後および４日毎に培地を新しい培地りに代える。

実施例２．ハイブリドーマ上清中のマウスＩｇＧの定量的測定ウサギ−抗−マウ ス−ＩｇＧ（ノルディック試薬のようなもの：コーティング緩衝液中１　：　１ ０００）の１００μｍのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え 、３７℃で６０分インキュベーションする。プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄 し、ＰＢＳ欠乏１５％ＦＣ３２００μｍを加え、３０分、３７℃でインキュベー ションする。プレートを上記のように洗浄する。培養２週間後に得られたハイブ リドーマ上清の１００μｌのアリコートを加え、プレートを３７℃で６０分イン キュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ− 結合抗体（ディアノヴアの試薬のようなウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ／ペルオキ シダーゼ、ＰＢＳ／２％ＦＣ８中１：１０００）の１００μｍのアリコートを加 える。３０分、３７℃でインキュベーションの後、プレートを４回洗浄用緩衝液 、２回染色緩衝液で洗浄する。基質溶液の１００μｍのアリコートを加え、色の 濃くなるのを５分後に４Ｎ　Ｈ，ＳＯ２を加えることにより停止させる。

光学的励起を４９２ｎｍで測定する（参考測定６２０ｒ＋＋ｓ）。

実施例３：ハイブリドーマ上清−ＩｇＧのＢＨ５５−２Ｆ（ａｂ’）を−断片に 対する特異的結合（ＥＬＩＳＡ） 充分なマウスＩ　ｇＧ（即ち培地ブランクより１０倍以上光学密度が高い）を産 生ずるマウスを、培地Ｆ中の単一細胞培養にサブクローン化し、培地Ｃ内で更に ２週間培養する。上清を、ＢＨ５５−２のＦ（ａ　ｂ’）−断片（１０ｕｔｔ／ ｍｌ　；コーティング緩衝液中の希釈）の１００μｌのアリコートを使用して実 施例２に記載のように試験する。

実施例４　：ＢＨ５５−２／マウスＩｇＧ２ａの５ＫＢＲ５人乳癌細胞への結合 のハイブリドーマ上清−ＩｇＧによる阻害上記測定で陽性の全てのハイブリドー マ上清を、以下のように試験する二マイクロタイタブレートをポリーＬ−リジン ヒドロプロミド（２０−３０ｋＤ。

ＰＢＳ欠乏中２０μｇ／＋ａｌ：　１０（ｂｚｌ／ウェル；３０分、室温）で予 備処理し、２回ＰＢＳ欠乏（２００μｌ／ウエル）で洗浄し、次いで、培地Ｂ中 の５ＫＢＲ５細胞懸濁液（４Ｘ　１０　’／ｍｌ）　５０μｌ／ウエルと共に一 晩４℃でインキュベージコンする。上清を除去した後、ゲルタールジアルデヒド ／ウェル（生理食塩水中０゜１％）５０μｌで５分間、室温で固定し、上清を除 去し、細胞をＰＢＳ欠乏／１％ＥＳＡ１０．１％ＮａＮ５２００μｌ／ウエル中 に再懸濁し、１時間室温に置く。

上清を除去し、プレートを２回０．０５％トウイン２０含有ＰＢＳ２００μｍ／ ウェルで洗浄する。

１μｇ／ｍｌマウスー１ｇＧに調整したハイブリドーマ上清を１０倍過剰の非特 異的マウス−ＩｇＧと共に３０分、３７℃でインキュベーションする。これらの サンプルを０．５μｇ／ｉ＋ＩＢＲ５５−２／７ウスＩｇ０２ａと共に３０分、 ３７℃でインキュベーションする。本混合物１００μｌを細胞に加え、プレート を１時間、３７℃でインキュベーションする。

混合物の後処理；非結合抗体を２回１００μｍ／ウェル水冷０．０５％トゆイン ２０含有ＰＢＳで洗い出す。ペルオキシダーゼ−結合抗体（ツィメッド試薬のよ うなウサギ−抗−マウスＩｇＧ２ａ／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣ ８中１＋１０００）の１００μｍのアリコートを加える。４５分、３７℃でイン キュベーションした後、ウェルを３回上記ＰＢＳ／）ウィン２０溶液で洗浄し、 次いで基質溶液１００μｍを各々のウェルに加える。５分後、色の濃（なるのを ４ＮＨ！　Ｓ　Ｏ４を加えることにより停止させる。抗体の細胞への結合を４９ ２ｎ■の光学的励起を測定することにより決定する（参考測定６２０ｎｍ）。

実施例５：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの免疫親和精製５．１　：　ＢＨ５５− ２／７ウスＩｇＧ２ａセフ７０−７．（７）調製凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロ ース４Ｂ１０ｇを１１ＭＨＣｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１＋Ｍ 　ＨＣＩ　２１で１５分洗浄する。配位子（ＢＨ５５−２／マウスＩｇＧ２ａ　 １２０１Ｑｇ）を連結緩衝液５Ｑ＋ａｌに溶解し、栓をした容器内で洗浄したゲ ルと混合し、１時間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１ 時間ＩＭエタノールアミン５０−１とインキュベーションし、残存活性基を遮断 する。次いで、親和性収着媒を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイク ルは、ｐＨ４（０，１Ｍ酢酸、０．５Ｍ　ＮａＣりでの洗浄、続＜ｐＨ８（０， １Ｍ　）リス、０．５Ｍ　ＮａＣ１）での洗浄から成る。

５．２：抗−１ｄＢＲ５５２Ｍａｂの単離クロマトグラフィーを４℃で行う。カ ラム（ＢＩＯＲＥＸ　ＭＰカラム直径１．５Ｃ１１）をＭａｂＢＲ５５−２／７ ウスＩｇＧ２ａセファＣＩ−ス（容量３５８１）で満たす。ゲルを結合緩衝液お よび溶出緩衝液で洗浄する。結合緩衝液による平衡化の後、抗−１ｄＢＲ５５− ２含有条件媒質をカラムに流速１５■１／分でかける。

エスチーパー分画の溶出の後、結合抗−ｊｄＢＲ５５２が溶出緩衝液と共に脱着 し、脱着後すぐにＩＭ　トリス／ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，５で中和する。

５．３＝抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの濃縮溶出抗体溶液（０，１２ｍｇ／ｍｌ ）の濃縮を、ＰＭＩＯシアフロ膜を使用した攪拌アミコン超濾過セル中で行う。

ＩｇＧに対する溶質拒否は９８％以上であり、ＩｇＧの最終濃縮は３．７１１ｇ ／ｍｌＴある。

実施例６：精製抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの特徴付け６．１　：Ｍｏｎｏ−Ｑ イオン交換クロマトグラフィーカラム：　Ｍｏｎｏ−ＱＨＲ５１５（ファルマシ ア）緩衝液Ａ・　２０１Ｍ）リエタノールアミン、ｐＨ７，７緩衝液Ｂ：　２０ ｍＭ１−リエタノールアミン、ＩＭ　ＮａＣＬ　ｐＨ７，７流速＝　１閣１／分 検出：　ＵＶ２８０止 勾配：　直線２％／分 結果二　全での抗−ｉ　ｄ　ＢＨ３５−２Ｍａ　ｂにおいて〉９５％純度と分か った ６、２：高速サイズ排除クロマトグラフィーカラム：　ゾルパックスＧＦ２５０ ．９．４Ｘ２５０ｍｍ緩衝液：　０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ　ＮａＣ １、ｐＨ７，０流速：　１ｍｌ／分 検出：　ＵＶ２８０止ｍ 結果・　全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂにおいて〉９５％純度と分かった ６、３　：　５ＤＳ−ＰＡＧＥ 実験は、１０％アクリルアミドゲルを使用して、レミリーの方法に従って、還元 および非還元の両方で行う。不純物は検出されない（結果は図１に示す丸６．４ ：等電点電気泳動 分析は、ｐＨ勾配３−９（ファストゲルＩＥＦ３−９）を使用してファスト−シ ステム（ファルマシア）および銀染色で行う（結果は図２に示す）。

実施例７　：　ＢＨ５５−２／マウスＩｇＧ３の５ＫＢＲ５人乳癌細胞系への結 合（細胞−ＥＬＩＳＡ）−精製抗−ｊｄＭａｂによる阻害マイクロタイタブレー トの予備処理を実施例４に記載のように行う。各々抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ を２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ欠乏で希釈する（１０がら０．５μｇ／ｍｌ）。各々の これらの希釈に、１Ｍｇ／■ＩＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３を加える。本混合 物の１００μｍを細胞に加え、プレートを１時間、３７℃でインキュベーション する。本混合物を実施例４に記載のように後処理する。抗体の細胞への結合の程 度を４９２正の光学的励起を測定することにより決定する（参考測定６２０止） 。

実施例８：抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるウサギおよびアカゲザルの免疫化 ８．１：抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるウサギの免疫化３匹の雌チンチラ ウサギを、水酸化アルミニウムに吸着した抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４（抗体１ ｍｇ＋Ａｌ（ＯＨ）３３．３＋ｇ／ＰＢＳ欠乏ｌｌ１ｌ）　３００Ｍｇの皮肉投 与により、１．８．１５および３６日に免疫化する。３匹のウサギを、陰性対照 として、同様の条件下、同量の非特異的マウス−１ｇＧ１で免疫化する。血清を 免疫化前および最初の免疫９週間後に回収した。

８．２．抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるアカゲザルの免疫化３匹アカゲザル を、水酸化アルミニウムに吸着した抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４（抗体１ｍｇ＋ ＡＩ（ＯＨ）ｓ３．３ａ＋ｇ／ＰＢＳ欠乏ｍ１）０．１ｍｇ／ｋｇの皮下（ｓ、 　ｃ、　）投与により、１．８．１５および３６日に免疫化する。２匹のアカゲ ザルを、陰性対照として、同様の条件下、同量の非特異的マウス−１ｇＧ１で免 疫化する。血清を免疫化前および最初の免疫４および９週間後に回収した。

最初の免疫化過程の２年後、同じサルは、各々抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４また は非特異的マウス−ＩｇＧ（上記と同量および同製剤）の最初の追加免疫注射を 受ける。血清を最初の追加免疫化の前および１および４週間後に集める。

最初の免疫化過程の３年後（＝最初の追加免疫注射の１年後）、同じサルは、各 々抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウス−ＩｇＧ（上記と同量およ び同製剤）の２回目の追加免疫注射を受ける。血清を２回目の追加免疫化の前お よび１．４および９週間後に集める。

実施例９　：　５ＫＢＲ５またはＷＭ９細胞系へのウサギ血清１ｇの結合（細胞 −ＥＬＩＳＡ） マイクロタイタープレートの前処理は実施例４に記載のように行う。好適な予備 希釈したウサギ血清の１００μｍのアリコートを細胞に加え、プレートを３７℃ で１時間インキュベーションする。抗体の細胞への結合を、４９２ｎｍの励起を 測定することにより決定する（参考測定６２０ｎ■）。

実施例１０　：　５ＫＢＲ５、ＣＡＴＯ，５Ｗ９４８、ＳＷ２およびＷＭ９人細 胞系へのアカゲザル血清Ｉｇまたは免疫精製１ｇ（ＡＢ３）の結合（細胞−ＥＬ ＩＳＡ）マイクロタイタープレートの前処理は実施例４に記載のように行う。好 適な予備希釈したアカゲザル血清１ｇ（実施例１２をまた参考）および対照とし て好適な予備希釈したＢＲ５５−２入代ＩｇＧ１の１００μｌのアリコートを細 胞に加え、プレートを３７℃で１時間インキュベーションする。混合物を実施例 ４に記載のように後処理する。抗体の細胞への結合を、４９２ｎｌｌｌの励起を 測定することにより決定する（参考測定６２０ｎｍ）。

実施例１１：アカゲザルＩｇまたは免疫精製１ｇ（ＡＢ３）の５ＫＢＲ５−また はＷＭ９−癌細胞一膜調製物への結合（ＥＬＩＳＡ）ルイスＹ抗原陽性５ＫＢＲ ５人乳癌細胞系およびルイスＹ陰性ＷＭ９ミエローマ細胞系の膜を、ディー・ト ムら、バイオケミカル・ジャーナル、１６８．１８７−１９４（１９７７）に記 載のように調製した。各々の膜調製物（１０ｇｇ／ｌｌ１ｌ；コーティング緩衝 液中希釈）の１００μｍのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加 え、＋４℃で一晩インキユベーションする。プレートを４回洗浄用緩衝液で洗浄 し、ＰＢＳ欠乏１５％ＦＣ３２００μｌを加え、３０分、３７℃でインキュベー ションする。プレートを上記のように洗浄する。ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣ３中、好 適な希釈のアカゲザル血清または免疫精製アカゲザルＩ　ｇ（２をまた参照）の １００μｌのアリコートを加え、プレートを６０分、３７℃でインキュベーショ ンする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体（ケ ミコン％コーポレイテッドの試薬のようなりギー抗−人−１ｇ／ベルオキシター セ、ＰＢＳ／２ＸＦＣＳ中１　：　１０００）の１００μ１ｃＤ７シコートを加 える。３０分、３７℃でインキュベーションの後、プレートを２回洗浄用緩衝液 、２回染色緩衝液で洗浄する。

基質溶液１００μｌのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ　Ｈ！ Ｓ０４を加えることにより停止させる。光学密度Ｃ０Ｄ）を４９２１■で測定す る（参考測定６２０ｎｓ）。

実施例１２：抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４（ＡＢ３）で免疫化したアカゲザルの 血清１ｇの抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファ０−スを使用した免疫親和精製 １２．１＋抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロースの調製凍結乾燥活性化Ｃ Ｈ−セファロース４Ｂ９ｇを１ｍＭＨｃ］に懸濁し、焼結ガラスフィルターに移 し、１ｍ１１ＨＣ］２１で１５分洗浄する。配位子（抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ ４　９５ｍｇ）を連結緩衝液５０ＩＩｌｌに溶解し、栓をした容器内で洗浄した ゲルと混合し、１時間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、 １時間ＩＭエタノールアミン５０ｍ１とインキュベーションし、残存活性基を遮 断する。次いで、親和性収着媒を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイ クルは、ｐＨ４（０，１Ｍ酢酸、領５Ｍ　ＮａＣ１）での洗浄、続＜　ｐＨ８（ ０，ＩＭ　Ｆリス、０．５Ｍ　ＮａＣ］）での洗浄から成る。

１２．２＋抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザル血清１ｇ（Ａ Ｂ３）の単離 クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム（ファルマシアカラムＨＲ５／２、ベ ッド容積５Ｘ２５順）を抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロース（容量０゜ ５ｍ１）で満たす。ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。出発材料は 抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルから、免疫開始９週間後に 得た血清２１１である。他の一連の実験のために、抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４ で免疫化したアカゲザルから、２回目の追加免疫４および９週間後に得た保存血 清２ｍｌを使用した。各々の血清を結合緩衝液中１＝２に希釈し、カラムにかけ る。エスチーパー分画の溶出の後、結合抗−１ｄＢＲ５５−２が溶出緩衝液と共 に脱着し、脱着後すぐにＩＭ　Ｆリス／ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，５で中和する。

実施例１３：抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウスＩｇＧ１で免疫 化したアカゲザル血清Ｉｇまたは免疫精製１ｇの抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４へ の結合（ＥＬＩＳＡ） 抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４（１０ｇｇ／ｍｌ；コーティング緩衝液中希釈）の １００μｍのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃で ６０分インキュベージジンする。プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ 欠乏１５％ＦＣ３２００μｍを加え、３０分、３７℃でインキュベーションする 。

プレートを上記のように洗浄する。サル血清または免疫精製サルＩｇをＰＢＳ欠 乏／２％ＦＣ３中希釈する。各々のサンプルの１００μｍのアリコートを加え、 プレートを６０分、３７℃でインキュベーションする。非結合抗体を上記のよう に洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体（ケミコン％コーポレイテッドの試薬 のようなりギー抗−人−１ｇ／ペルオキシダーゼ、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１ ０００）の１００μｍのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベージ ジンの後、プレートを４回洗浄用緩衝液、２回染色緩衝液で洗浄する。基質溶液 １００μｌのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を 加えることにより停止させる。光学密度（ＯＤ）を４９２ｎ＋１で測定する（参 考測定６２０止）。

実施例１４：人ＰＢＭＣを使用した免疫精製サルＩｇ（ＡＢ３）またはＢＲ５５ −２／マウスＩｇＧ３により媒介される５ＫＢＲ５細胞に対する抗体依存細胞毒 性（ＡＤＣＣ） 測定の前日、５ＫＢＲ５細胞を新鮮培地Ａに移し、培養フラスコ中で３７℃７５ ％ＣＯ２に保つ。

標的細胞の５Ｉ（ｒ標識： 細胞を培養フラスコから回収し、培地Ａ３００μｌ中５Ｘ１０’細胞の濃度で３ ７℃１５％ＣＯ２で１時間、１００　μｃｉ　Ｎ　ａ　２”　Ｃｒ　０４とイン キュベーションする。細胞を、次いで培地Ａで洗浄し、過剰の５１（ｒを除去し 、新鮮培地Ａに再！濁し、その１度を２．５Ｘ１０’細胞／ｍｌに調製する。

ＰＢＭＣの単離： ヘパリン処理した新鮮人血液５０１１１１を０．１％グルコース含有ＰＢＳ完全 ６〇−１で希釈する。本溶液の１５ｍ１のアリコートをフィコール−パーク溶液 １５■１の上に重層し、管を４００ｇで３０から６０分遠心する。血漿上清を廃 棄し、ＰＢＭＣ層を回収し、ＰＢＳ完全＋０．１％グルコース５０謹ｌで希釈す る。約８０ｇ（１０分）で遠心後、ベレットをＰＢＳ完全＋０．１％グルコース ２５−３０ｇ＋１に再懸濁し、再遠心（８０ｇ、１０分）し、ペレットを回収し 、培地Ａに懸濁し、細胞を計数し、懸濁液を約２Ｘ１０’から９Ｘ１０’細胞／ ｍｌとなるように培地Ａで希釈する。１００μｍのアリコートをマイクロタイタ ープレートの各々のウェルにピペットで移し、エフェクター細胞を一晩３７℃１ ５％ＣＯ３でインキュベーショＩＩＣ，−標識標的細胞１００μｌを予備インキ ュベーションしたエフェクター細胞に、エフェクター細胞対標的細胞の所望の比 で加える。所望の濃度にＰＢＳ欠乏で希釈した免疫精製サルＩｇ（ＡＢ３）また はＢＲ５５−２／マウスＩ　ｇＧ３５０μｌを加え、プレートを一晩（約１８時 間）３７℃１５にＣｏ、でインキュベーションする。上清をスカトロンーハーベ スティング・プレスで回収し、γ−カウンターで計数する。これは実験的遊離の 値を産生ずる。全５ＩＣｒ遊離は、ＰＢＭＣを２％５ＤＳｓ　５０ｍＭ　Ｎａ１ ＣＯ３および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ１００μｌと置き換え、抗体溶液をＰＢＳ欠乏 ５０μｍと置き換えることにより上記のように決定する。自然５ＩＣｒ遊離はＰ ＢＭＣを培地Ａ１００μｌと置き換え、抗体溶液をＰＢＳ欠乏５０μｌと置き換 えて得る。

計数後、結果を以下のように計算する：実施例１５　：ＨＩＶ＝感染／非感染Ｐ ＡＬＬ−細胞へのアカゲザル血清、免疫精製アカゲザルＩｇまたはＢＲ５５−２ ／マウスＩｇＧ３の結合（間接的免疫蛍光測定、ＩＦＡ−抗−ＨＩＶＩ−キット 、バルドハイム）商業的に入手可能な免疫蛍光測定キット（バルドハイム＆コー ポレイテッド：ＨＩＶ血清陽性性を決定するために購入）において、ＨＩＶ−感 染および非感染ＦＡＬＬ細胞（人Ｔ細胞系）をスライドに固定する。実験方法は 本質的に提供者のガイドラインに従う。１％ＢＳＡと共に３０分、３７℃でイン キュベーションした後、スライドをアカゲザル血清（濃縮およびＰＢＳ欠乏中１ ：１０希釈）または正常人血清中で希釈した免疫精製アカゲザルＩｇ（ＡＢ３） またはＢＲ５５−２／マウスＩ　ｇＧ３と共に１時間、３７℃でインキュベーシ ョンする。ＨＩＶ陽性人血清（試験キットの一部由来）を陽性対照として、正常 人血清を陰性対照として使用する。試験サンプルの非結合決定基を３回ＰＢＳ欠 乏で洗い出し、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ欠乏中の抗−人−１ｇＧ−ＦＩＴＣ（試験 キットの一部）または抗−マウス−１ｇＧ−Ｆ　Ｉ　ＴＣ（Ｍａ　ｂの検出のた め）の１；２０希釈を加える。３７℃で３０分インキュベーション、３回ＰＢＳ 欠乏で洗浄およびスライドのはめ込みの後、免疫蛍光が蛍光マイクロスコープ内 で観察され、得点する（０＝蛍光なし、５＝最大蛍光）。

実施例１６：人血清中の免疫活性ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５ −２／マウスＩｇＧ２ａを測定するための抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用し たＥＬ　Ｉ　ＳＡ 抗−１ｄ−ＢＲ５５−２＃Ｅ４（１０μｇ／ｍｌ；コーティング緩衝液中希釈） の１００μｌのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃ で６０分インキュベーションする。

プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏１５％ＦＣ３２００μｍを加 え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄す る。ＢＲ５５−２／７ウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／？ウスＩｇＧ２ａ含有 人血清をＰＢＳ欠乏／２％ＦＣ３中好適な希釈で試験する。これらのサンプルの １００μｍのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、６０分、 ３７℃でインキュベーションする。標準として、ＢＲ５５−２／マウスＩ　ｇＧ ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２を正常人血清で１０μｇ／ｍｌに予備希 釈する。ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣ３中の好適な希釈を上記のように処理する。非結 合抗体を上記のように洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体（ツイメツド試薬 のようなウサギ−抗−マウス１ｇＧ３／ペルオキシダーゼまたはウサギ−抗−マ ウスＩｇＧ２ａ／ペルオキシダーゼ、ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣ３中１：１０００） の１００μｌのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベージジンした 後、ウェルを４回洗浄用緩衝液、２回染色液で洗浄する。

基質溶液１００μｌのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ　Ｈｇ ＳＯ４を加えることにより停止させる。抗体の細胞への結合を４９２ｎ■の光学 的励起を測定することにより決定する（参考測定６２０　ｎｍ）。

血清サンプルのＯＤ値は、標準曲線から読み取り、μｇ／■１で表す。

実施例１７：抗−１ｄＢＲ５５２＃Ｅ４を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ５ ５−２／キメラ人１ｇＧ１を測定するためのＥＬＩＳＡＢＲ５５−２／キメラ人 １ｇＧ１を上記実施例１６に記載のように、ベルオキシダーゼ結合抗体（ケミコ ン＆カンパニーの試薬のようなりギー抗−人１ｇＧ／ペルオキシダーゼ、ＰＢＳ ／２％ＦＣＳ中１：１０００）を使用して試験する。

実施例１８：抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ ５５−２／キメラ人１　ｇＧ３を測定するためのＥＬＩ　５ＡＢＲ５５−２／キ メラ人ＩｇＧ３を上記実施例１７に記載のように試験する。

実施例１９　：　ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１およびＢＲ５５−２／人化Ｉ ｇＧ１と抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの間の実時間生特異的相互作用測定実験は ファルマシア・バイオセンサー・アクチェボラーク、ウプサラ、スウェーデンの Ｂ　Ｉ　Ａｃｏｒｅ（商標）系で行った。ＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１およ びＢＲ５５−２／人化１ｇＧ１の非動化ＲＡＭ−１ｇＧ１（ファルマシア・バイ オセンサー・アクチェポラーク、ウプサラ、スウェーデンの試薬のような）に捕 獲された種々のマウスＩｇＧ１抗−１ｄＢＲ５５２Ｍａｂへの結合を実時間生特 異的相互作用測定で測定した。

系の流速を５μｍ／分に調製した。センサーチップを蒸留水３５μｍ中のＮＨ３ ０，２０１ｍｇおよびＥＤＣｌ、３１３ｍｇで活性化した。１０１１Ｍ　酢酸ナ トリウム緩衝液ｐＨ５，０３５μｌｌ：３０μｇ／ｍｌの濃度で溶解されたＲＡ Ｍ−１ｇＧ１を、次いで活性化センサー表面と反応させた。残存遊離活性化部位 をＩＭ　エタノールアミンヒドロクロリド／ＮａＯＨ，ｐＨ８，５３５μｍで遮 断した。

測定は３段階で行った： １）各々の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ（Ｅ４、Ｃ１ｌ、Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ ９）を培地Ｈで希釈し、最終濃度１０から１７μｇ／ａ＋１にした。各々の測定 において、抗−イディオタイプ抗体をＲＡＭ−ＩｇＧ１に本溶液３５μｍをセン サー表面を通すことにより結合させた。結合−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの質量の 比である“反応単位２を記録し蓄積した。

２）マウス７人キメラＩｇＧ１の希釈２０μｍおよび培地Ｈ中の１−１００μｇ ／ｉｌの濃度の入代１　ｇ　Ｇ　１を次いで注入し、捕獲抗−ｉｄに結合させる 。結合−１ｄＢＲ５５−２Ｍａｂの質量の比である“反応単位“を記録し蓄積し た。

３）次いで、センサー表面をＩＭ　ギ酸５μｍおよび８Ｍ　尿素５μｍの連続注 入の次の分析のために再生した。

結合率を第２抗体（ＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１またはＢＲ５５−２／人化 １　ｇＧｌ）で得られた最大反応単位および最初の抗体（各々の抗−イディオタ イプＭａｂ）で得られた最大反応単位で計算することにより決定した。

実施例２０．抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用した人血清中の免疫反応性Ｂ Ｒ５５−２／人化ＩｇＧ１の測定のためのＥＬＩ　５ＡＢＲ５５−２／人化Ｉｇ Ｇ１含有人血清を、実施例１７に記載のように試験する。

実施例２１　：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗−１ｄＢＲ５５２＃Ｅ４への ＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１またはＢＲ５５−２／キメラ人１　ｇＧ３によ る競合的結合 抗−４ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４（１０μｇ／ｍｌ；コーティング緩衝液中の希釈） の１００μｍのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、３７℃ で６０分インキュベーションする。

プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏１５％ＦＣ３２００μｍを加 え、３０分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記のように洗浄す る。キメラ人ＩｇＧ１またはキメラ人１ｇＧ３をＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳで希釈 する（０．５　μｇ／ｍｌから３ｎｇ／＋ａｌ）。これらの各々の希釈に、０． ０５　μｇ／ｍ１ＢＲ５５−２／マウスＩ　ｇＧ３を加える。これらのサンプル の１００μｍのアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに加え、６０分 、３７℃でインキュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペル オキシダーゼ−結合抗体（ツィメッド試薬のようなウサギ−抗−マウス１ｇＧ３ ／ペルオキシダーゼまたはウサギ−抗−マウスＩｇＧ２ａ／ペルオキシダーゼ、 ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣ８中１：１０００）の１００μｍのアリコートを加える。

３０分、３７℃でインキュベーションした後、ウェルを４回洗浄用緩衝液、２回 染色液で洗浄する。

基質溶液１００μｍのアリコートを加え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ　Ｈ。

ＳＯｌを加えることにより停止させる。光学密度（ＯＤ）を４９２止で測定する （参考測定６２０ｎｍ）。

実施例２２　：　ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介される５ＫＢＲ５細 胞系への補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）−抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による阻 害測定の前日、５ＫＢＲ５細胞を新鮮培地Ａに移し、培養フラスコ中で３７℃１ ５％ＣＯ２に保つ。

標的細胞の５ＩＣｒ標識： 細胞を培養フラスコから回収し、培地Ａ３００μｍ中５Ｘ１０’細胞の濃度で３ ７℃１５％ＣＯ２で１時間、１００μＣｉ　Ｎａ２”ＣｒＯ２とインキュベージ −Ｂンする。細胞を、次いで培地Ａで洗浄し、過剰の５ＩＣｒを除去し、新鮮培 地Ａに再Ｖ濁し、その濃度を２．５Ｘ１０５細胞／ｍｌに調製する。

ＣＤＣ： 本標的細胞の懸濁液の１００μｌのアリコートをマイクロタイタープレートのウ ェルにピペットで移す。ＰＢＳ欠乏欠乏型所望度に希釈した抗−１ｄＢＲ５５− ２＃Ｅ４の５０μｌのアリコートを加える。次いで２μｇ／ｗｌＢＲ５５−２／ ＩｇＧ３含有人血清の１００μｍのアリコートをウェル毎に加え、細胞を一晩、 ３７℃１５％ＣＯ２でインキュベーションする。上清をスカトロンーハーベステ イング・プレスで回収し、γ−カウンターで計数する。これは実験的遊離の値を 産生する。

全”Ｃｒ１Ｍは、血清溶液を２％ＳＤＳ、５０ｓ＋Ｍ　Ｎａ２ＣＯｓおよび１０ ａＭＥＤＴＡと置！換、ｊ、抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４溶液をＰＢＳ欠乏５０ μｌと置き換えることにより上記のように決定する。自然＆＋（ｒ遊離は人血清 を培地Ａと置き換え、抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４溶液をＰＢＳ欠乏５０μｌ と置き換えて得る。

計数後、結果を以下のように計算する：実施例２３：抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃ Ｅ４セフアロースを使用したＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１の免疫親和精製 ２３．１・抗−ｉ　ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロースの調製凍結乾燥活性化 ＣＨ−セファロース４Ｂ９ｇを１ｄＨＣ１に懸濁し、焼結ガラスフィルターに移 し、１ｍＭ　ＨＣｌ２１で１５分洗浄する。配位子（抗−１ｄＢＲ５５−２＃Ｅ ４　９５ｍｇ）を連結緩衝液５０ａ＋１に溶解し、栓をシタ容器内で洗浄したゲ ルと混合し、１時間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１ 時間ＩＭエタノールアミン５０ｍ１とインキュベーションし、残存活性基を遮断 する。次いで、親和性収着線を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイク ルは、ｐＨ４（０，１Ｍ酢酸、０．５Ｍ　ＮａＣＩ）での洗浄、続＜ｐＨ８（０ ，１Ｍ　Ｉ−リス、０．５Ｍ　ＮａＣＩ）での洗浄から成る。

２３．２　：　ＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１の単離クロマトグラフィーを４ ℃で行う。カラム（ＢＩＯＲＥＸ　ＭＰカラム直径１．５Ｃｍ）を抗−１ｄＢＲ ５５−２＃Ｅ４−セファロース（容量３５１１）で満たす。

ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。出発物質はＢＲ５５−２／キメ ラ人１ｇＧ１条件培地１００１である。中空ファイバーカートリッジＰＩＯを装 着したアミコンＤＣ２濃縮系を使用した５：１濃縮後、濃縮物をカラムにかける 。

エスチーバー分画の溶出の後、結合ＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１が溶出緩衝 液と共に脱着し、脱着後すぐにＬＭ　）リス／ＭＣＩ緩衝液、ｐＨ７，５で中和 する。

２３、３　：　ＢＲ５５−２／キメラ人１ｇＧ１の濃縮溶出抗体溶液の濃縮を、 ＰＭＩＯシアフロ膜を使用した攪拌アミコン超濾過セル中で行う。ＩｇＧに対す る溶質拒否は９８％以上であり、ＩｇＧの最終濃縮は３、３６ｍｇ／ａｌである 。

２３．４：精製ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１の特徴付け２３．４．１　：Ｍ ｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィーカラム：　Ｍｏｎｏ−ＱＨＲ５１５（ ファルマシア）緩衝液Ａ　＋　２０＋Ｍ　ＴＥＡ、ｐＨ７，７緩衝液Ｂ：　２０ ｍＭ　ＴＥＡ、ＩＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，７流速：　１　ｍｌ／分 検出：　ＵＶ２８０ｎｍ 勾配：　直線２％／分 結果：　〉９５％ ２３．４．２：高速サイズ排除クロマトグラフィーカラム：　ゾルパックスＧＦ ２５０．９．４Ｘ２５０ｍｍ緩衝液：　０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２Ｍ　 ＮａＣｌ、ｐＨ７，０流速：１１１１／分 検出：　ＵＶ２８Ｏｒ＋ａ 結果：　〉９５％純度 ２３、４．３・５ＤＳ−ＰＡＧＥ 実験は、１０％アクリルアミドゲルを使用して、レミリーの方法に従って行う（ 結果は図１０に示す）。

出発物質 マウスモノクローナル抗体ＢＲ５５−２は、例えばそれぞれハイブリドーマＢＲ ５５，２（ＢＲ５５−２／ＩｇＧ３）およびＢＲ５５，２ｓ　２　ａ（ＢＲ−５ ５−２／ＩｇＧ２ａ）から入手可能である。

これらのハイブリドーマは、本来それぞれ１９８７年２月１７日および１９８図 ２ 等電点電気泳動 」 ム 」 ν　□□ 特表千７−５０７２０７　（１６） ど 卦 ≠ ≠ ｌｌ′１５６ ′１）　− Δ帝　１．二 ″　〜ダタ 下斑　さくヴ　−ｇＪ！ ６雪　と＜　〜８（ →９廻 本式　！訂３ご　塾。ヨ ■　ｃｃ　■　“　塾血巨 ６　’Ｊ　Ａ　″２′ Ｇｖ、≧　０　ぐ■ 旧く　ト〜■ ト　＋＋÷φ ６．　配　〔ハ 特表千７−５０７２０７　（１９） の ト 刊 θ に ト ＼勾 、、、　ｒ−コ ｉＩｌ＜ １．１′）Ｈ ヱ」 （ＩＱ＜ ト 個 ：コ 肥 ω 怠 図３９ Ｓ　Ｉ）Ｓ　−Ｐ　Ａに　Ｅ 還元状態 １１．１１１６１１．１．、Ｎ自ＰＣＴ／ＥＰ９３１０１２１５フロントページ の続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　２１１０ ８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （３１）優先権主張番号　９２１０９４４．６（３２）優先臼　１９９２年５月 ２２日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）ＦＩ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＮＥ 、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、 ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　ロイブナ−、ハンス オーストリア国アーー１２３８ウィーン、ハイムガッセ２別片 （７２）発明者　ショルッ、ディーターオーストリア国アーー１０４０ウィーン 、バイリンガーシュトラーセ３１１５番

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．モノクローナル抗体ＢＲ５５−２（Ａｂ１）に対するモノクローナルマウス 内部像抗−イディオタイプ抗体（Ａｂ２）。
2. ２．マウスをＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３−Ｆ（ａｂ′）２−ＫＬＨ−接合体 で免疫化し、マウスミエローマ細胞系ＳＰ２／０と脾臓細胞を融合し、阻害能９ ５％以上（ＢＲ５５−２マウスＩｇＧ２ａのＳＫＢＲ５細胞系への結合を阻害） のＩｇＧ産生する培養ハイブリドーマ細胞を選択し、抗−イディオタイプ抗体を 精製し、単離することを含む、請求項１記載の抗−イディオタイプ抗体の製造法 。
3. ３．ＨＩＶ−感染に対する予防的および／または治療的免疫化のための、請求項 １記載の抗−イディオタイプ抗体の使用。
4. ４．処置を必要とする患者に治療的有効量の請求項１記載の抗−イディオタイプ 抗体を投与することを含む、ＨＩＶ−感染に対する免疫化法。
5. ５．活性成分として請求項１記載の抗−イディオタイプ抗体を、薬理学的に許容 可能なアジュバント、担体または希釈剤と共に含有する、ＨＩＶ−感染に対する 予防的および／または治療的免疫化に使用する、医薬組成物。
6. ６．上皮起源の癌に対するまたは小細胞肺癌に対する免疫化のための、請求項１ で定義のモノクローナル抗一イディオタイプ抗体の使用。
7. ７．請求項１で定義の抗−イディオタイプモノクローナル抗体を、薬理学的に許 容可能なアジュバント、担体または希釈剤と共に含む、上皮起源の癌に対するお よび小細胞肺癌に対する免疫化に使用する、医薬組成物。
8. ８．処置を必要とする患者に、有効量の請求項１で定義の抗−イディオタイプモ ノクローナル抗体を投与することを含む、上皮起源の癌に対するおよび小細胞肺 癌に対する免疫化性。
9. ９．ＢＲ５５−２に対する結合特性を有するモノクローナル抗体、その誘導体ま たは断片の定量的測定のための、請求項１記載の抗−イディオタイプ抗体の使用 。
10. １０．ＢＲ５５−２のモノクローナルマウス／人キメラおよびＢＲ５５−２の充 分人化した変異体の定量的測定のための、請求項１記載の抗−イディオタイプ抗 体の使用。
11. １１．ＢＲ５５−２の変異体の１工程免疫精製のための、請求項１記載の抗−イ ディオタイプ抗体の使用。