JPS59134734A - 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 - Google Patents
殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な殺細胞性修飾免疫グロブリンとその製造
方法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合する免疫
グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
ト中のアミノ基にマイトマイシンＣ誘導体を結合せしめ
て成る新規な殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法に
関する。
方法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合する免疫
グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
ト中のアミノ基にマイトマイシンＣ誘導体を結合せしめ
て成る新規な殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法に
関する。
抗体蛋白質に、水溶性カルボジイミドの存在下、大量の
マイトマイシンＣを作用させて抗体のカルボキシル基に
マイトマイシンＣを直接結合せしめることは公知である
（特開昭５５−９２３２５ ）。
マイトマイシンＣを作用させて抗体のカルボキシル基に
マイトマイシンＣを直接結合せしめることは公知である
（特開昭５５−９２３２５ ）。
本公知方法のとと（、アミ７基とカルボキシル基の間に
アンド結合を形成せしめる縮合剤１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルポジイミドを用いる
方法においては、抗体蛋白質分子内の７ミノ基とカルボ
キシル基の間での分子内反応や、抗体分子間での同様な
反応が起こり、そのため、抗体の抗原認識活性を低下せ
しめたり、治療剤として不適当な高分子アグリゲートを
形成したりする。 ２、又、その様な不都合を＋
を力さけるためには、上記の方法で用いるアミノ成分で
あるマイトマイシン・Ｃ−＜、大過剰に反応させる必要
があり。
アンド結合を形成せしめる縮合剤１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルポジイミドを用いる
方法においては、抗体蛋白質分子内の７ミノ基とカルボ
キシル基の間での分子内反応や、抗体分子間での同様な
反応が起こり、そのため、抗体の抗原認識活性を低下せ
しめたり、治療剤として不適当な高分子アグリゲートを
形成したりする。 ２、又、その様な不都合を＋
を力さけるためには、上記の方法で用いるアミノ成分で
あるマイトマイシン・Ｃ−＜、大過剰に反応させる必要
があり。
工業的に適当な方法とは言い難い。
又、抗体蛋白質をシアノグンプロマイドで処理し、ひき
つづき大量のマイトマイシンＣを作しかし、本方法によ
って得られる結合体においては、抗体蛋白質分子に結合
したマイトマイシンＣは１分子であり、工業的に適した
方法とは言い難い。
つづき大量のマイトマイシンＣを作しかし、本方法によ
って得られる結合体においては、抗体蛋白質分子に結合
したマイトマイシンＣは１分子であり、工業的に適した
方法とは言い難い。
本発明者らは、鋭意研究の結果活性エステル基をその構
造中に含むマイトマイシンＣ誘導体を免疫グロブリンに
作用させ、免疫グロブリンがもつアミノ基に結合させて
得られる修飾免疫グロブリンは、すぐれた選択的殺細胞
能を有することおよび工業的に極めて有利Ｋｇ造し得る
修飾免疫グロブリンであることを知見し、≠９壬本発明
に到達した。
造中に含むマイトマイシンＣ誘導体を免疫グロブリンに
作用させ、免疫グロブリンがもつアミノ基に結合させて
得られる修飾免疫グロブリンは、すぐれた選択的殺細胞
能を有することおよび工業的に極めて有利Ｋｇ造し得る
修飾免疫グロブリンであることを知見し、≠９壬本発明
に到達した。
即ち、本発明は一般式〔■〕
で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン及び一般式（
ｎ） で表わされるマイトマイシソＣ誘導体を、免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴と
するその製造方法であ８゜一般式ＣＩ）および（ＩＩ）
において、Ｒは２価の有機基を表わすが、好ましくは炭
素数２〜７個のフルキレソ基であり、エチレン基、トリ
メチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基。
ｎ） で表わされるマイトマイシソＣ誘導体を、免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴と
するその製造方法であ８゜一般式ＣＩ）および（ＩＩ）
において、Ｒは２価の有機基を表わすが、好ましくは炭
素数２〜７個のフルキレソ基であり、エチレン基、トリ
メチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基。
２−メチルトリメチレン基等を挙げることができる。特
に好ましいのはトリメチレン基である。
に好ましいのはトリメチレン基である。
また一般式（ｎ）において、Ｘで表わされる活性エステ
ルのアルコール残基としては、＃３Ｌサクシンイミジル
基、 芥＝＃ｓ−ノルｄｉ ルネ７−２．３−ジカルポ
桜ミジル基Ｊミにフタルイミジル基、ｐ−ニトロフェニ
ル＆ 、 ２．４−ジニトロフェニル基、 ２，４．５
− ）リクロロフェニル基。
ルのアルコール残基としては、＃３Ｌサクシンイミジル
基、 芥＝＃ｓ−ノルｄｉ ルネ７−２．３−ジカルポ
桜ミジル基Ｊミにフタルイミジル基、ｐ−ニトロフェニ
ル＆ 、 ２．４−ジニトロフェニル基、 ２，４．５
− ）リクロロフェニル基。
ペンタクロロフェニル基等を挙げることができる。
本発明において、免疫グロブリンとは、殺すべき細胞の
もっている特定の抗原と選択的に結合しうる免疫グロブ
リンをいう。かかる免疫グロブリンとしては、例えば、
次の様なものがある。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球
等の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫されたヒ
トｐサル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ。
もっている特定の抗原と選択的に結合しうる免疫グロブ
リンをいう。かかる免疫グロブリンとしては、例えば、
次の様なものがある。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球
等の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫されたヒ
トｐサル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ。
モルモット、ハムスター、ラット、マウス等ノ動物から
分離された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イ
オン交換あるいは分子篩カラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって調製されるグロブリン（抗体）、あ
るいは標的細胞で免疫した動物より採取された抗体産生
細胞を発癌性のある物質で癌化させて得られる細胞の培
養液、あるいは抗体産生細胞を骨髄腫細胞等と細胞融合
させて得られた融合細胞（バイプリドーマ）から選別さ
れた目的とする抗体産生性ツクミーンの培養液からまた
はこれを動物に接種してその血清または腹腔液からも本
発明の免疫グロブリンを得ることができる。免疫グロブ
リンには、ＩｇＧ 、 ＩｇＡ 、 ＩｇＭ 、 Ｉｇ
Ｄ、 ＩｇＥの５種類があることが知られているが、そ
のどれでも本°発明に用いることができる。
分離された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イ
オン交換あるいは分子篩カラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって調製されるグロブリン（抗体）、あ
るいは標的細胞で免疫した動物より採取された抗体産生
細胞を発癌性のある物質で癌化させて得られる細胞の培
養液、あるいは抗体産生細胞を骨髄腫細胞等と細胞融合
させて得られた融合細胞（バイプリドーマ）から選別さ
れた目的とする抗体産生性ツクミーンの培養液からまた
はこれを動物に接種してその血清または腹腔液からも本
発明の免疫グロブリンを得ることができる。免疫グロブ
リンには、ＩｇＧ 、 ＩｇＡ 、 ＩｇＭ 、 Ｉｇ
Ｄ、 ＩｇＥの５種類があることが知られているが、そ
のどれでも本°発明に用いることができる。
本発明に於いて免疫グロブリンはそのまＸでも、或いは
抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、そのフラ
グメント（例えば、Ｆ？ｌＬｂ。
抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、そのフラ
グメント（例えば、Ｆ？ｌＬｂ。
Ｉｌ′ａｂ’ 、 Ｆａｂ’の２量体Ｆ（ａｂ’）、
）でも用いることができる。
）でも用いることができる。
免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、分子中に末
端７ミノ基や構成アミノ酸のりジンに由来するアミノ基
を複数個有しているので、かかるアミ７基を利用して本
発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンが製造される。利用
される７ミノ基の個数は１〜２０個が好ましい。即ち、
本発明の一般式ＣＩ）で表わされる殺細胞性修飾免疫グ
ロブリンは、一般式（１０で表わされるマイトマイシン
Ｃ誘導体を免疫グロブリンまたはそのフラグメントと反
応せしめることにより製造される。本反応は、免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントのｐＨ５〜８の緩衝液の
溶液（蛋白濃度は好ましくは０．５〜１００〜／ゴに調
製する）Ｋ、０〜４０℃で攪拌しながら、少量の溶媒、
例えハ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド。
端７ミノ基や構成アミノ酸のりジンに由来するアミノ基
を複数個有しているので、かかるアミ７基を利用して本
発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンが製造される。利用
される７ミノ基の個数は１〜２０個が好ましい。即ち、
本発明の一般式ＣＩ）で表わされる殺細胞性修飾免疫グ
ロブリンは、一般式（１０で表わされるマイトマイシン
Ｃ誘導体を免疫グロブリンまたはそのフラグメントと反
応せしめることにより製造される。本反応は、免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントのｐＨ５〜８の緩衝液の
溶液（蛋白濃度は好ましくは０．５〜１００〜／ゴに調
製する）Ｋ、０〜４０℃で攪拌しながら、少量の溶媒、
例えハ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド。
メタノール、子タノール、アセトン等に溶かした一般式
［ｆｆ）で表わされるマイトマイシンＣ誘導体（好まし
くは前者１モルに対し１〜５０モル゛）を添加し、１５
分〜１２時間行われる。その後、反応混合物をゲル濾過
あるいは透析することによって未反応のマイトマイシン
Ｃ誘導体と低分子反応生成物を除き、殺細胞性修飾免疫
グロブリンを精製することができる。
［ｆｆ）で表わされるマイトマイシンＣ誘導体（好まし
くは前者１モルに対し１〜５０モル゛）を添加し、１５
分〜１２時間行われる。その後、反応混合物をゲル濾過
あるいは透析することによって未反応のマイトマイシン
Ｃ誘導体と低分子反応生成物を除き、殺細胞性修飾免疫
グロブリンを精製することができる。
本発明において用いる一般式（ＩＩ）で表わされるマイ
トマイシンＣ誘導体は、例えば、次に示す合成ルートに
よりマイトマイシンＣと二塩基性カルボン酸の酸無水物
を出発原料として合成することができる。好適に用い得
る酸無水物としては、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物。
トマイシンＣ誘導体は、例えば、次に示す合成ルートに
よりマイトマイシンＣと二塩基性カルボン酸の酸無水物
を出発原料として合成することができる。好適に用い得
る酸無水物としては、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物。
３−メチルグルタル酸無水物等を挙げることができる。
マイト、イシンＣテトラヒドロフラン
［ＩＩ）
活性エステルのアルコール部に由来する残基（３）本発
明において得られた殺細胞性修飾免疫グロブリンは、殺
すべき標的細胞に対し特異的増殖抑制活性を有する。
明において得られた殺細胞性修飾免疫グロブリンは、殺
すべき標的細胞に対し特異的増殖抑制活性を有する。
以下、実施例によｐ本発明を詳述する。
参考例１
ウサギ抗Ｌ１２１０免疫グロブリンの精製マウス白血病
Ｌ１２１０細胞Ｉ Ｘ １０６個をフロイント完全７ジ
ユバンドとの工２ルジョンとし、家兎に静脈注射した。
Ｌ１２１０細胞Ｉ Ｘ １０６個をフロイント完全７ジ
ユバンドとの工２ルジョンとし、家兎に静脈注射した。
その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約Ｉ Ｘ １
０”個のＬ１ｘｏｉｆｆＢ砲をアジュバントと共に皮下
注射し、最終投与口から８日後に採血した。得られた血
液をプールし、血清を分離し、その血清を５６℃、３０
分間加熱、非動化した。こづして得られた抗１［，１２
１０血清２００ゴに、硫安の飽和水溶液２００ｍ１を加
えて、生じた沈澱を遠心分離によって分取した。この沈
澱を０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，６） ５０
ｍに俗解し、更に同緩衝液に対して十分に透析した。
０”個のＬ１ｘｏｉｆｆＢ砲をアジュバントと共に皮下
注射し、最終投与口から８日後に採血した。得られた血
液をプールし、血清を分離し、その血清を５６℃、３０
分間加熱、非動化した。こづして得られた抗１［，１２
１０血清２００ゴに、硫安の飽和水溶液２００ｍ１を加
えて、生じた沈澱を遠心分離によって分取した。この沈
澱を０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，６） ５０
ｍに俗解し、更に同緩衝液に対して十分に透析した。
この透析内液を同じ緩衝？Ｉ［”Ｆ衡化したジエチルア
ミノエチルセルロースカラム（３Ｘ９４ｃｍ）にがけて
、未吸着分画として目的とするウサギ抗Ｌｔｚ１０Ｉｇ
Ｇ抗体を含む溶液を得た。
ミノエチルセルロースカラム（３Ｘ９４ｃｍ）にがけて
、未吸着分画として目的とするウサギ抗Ｌｔｚ１０Ｉｇ
Ｇ抗体を含む溶液を得た。
参考例２
マウスモノクロナル抗ＭＭ４６免疫グロブリンの精製
マウスの乳癌細胞ＭＭ４６に対するマウスのモノクロナ
ル抗体ＩｇＧ Ｚｂ ＩｓＥ生性のハイブリドーマ（瀬
戸ら、ジャーナルオプイムノロジ−２゛（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１２８巻、第２０
１項、１９８２年参照）をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに
移植し、１０日後その腹水液をえた。
ル抗体ＩｇＧ Ｚｂ ＩｓＥ生性のハイブリドーマ（瀬
戸ら、ジャーナルオプイムノロジ−２゛（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１２８巻、第２０
１項、１９８２年参照）をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに
移植し、１０日後その腹水液をえた。
こうして得られた腹水液４ｄを０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ８，ＯＩｃ透析した後、同緩衝液に平衡化したプ
ロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂカラム（ｉ、ｓｘｚ
ｚｃｍ）にかげた。同緩衝液でカラムを充分洗浄し、次
に、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４，５で非特異的免疫
グロブリンを溶出した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液、
ｐＨ３，５で目的とするマウスモノクロカル抗ＭＭ４６
抗体１ｇＧ２ｂ （１０〜）を溶出した。溶出した抗体
は、５０％飽和硫安により沈澱させ、少量の０．９％塩
化ナトリウム溶液に再溶解した後、Ｏ，１Ｍ塩化力）
ＩＪウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、 ｐＨ７，５（
以下、緩衝液Ａと省略する）に充分透析した。
ｐＨ８，ＯＩｃ透析した後、同緩衝液に平衡化したプ
ロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂカラム（ｉ、ｓｘｚ
ｚｃｍ）にかげた。同緩衝液でカラムを充分洗浄し、次
に、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４，５で非特異的免疫
グロブリンを溶出した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液、
ｐＨ３，５で目的とするマウスモノクロカル抗ＭＭ４６
抗体１ｇＧ２ｂ （１０〜）を溶出した。溶出した抗体
は、５０％飽和硫安により沈澱させ、少量の０．９％塩
化ナトリウム溶液に再溶解した後、Ｏ，１Ｍ塩化力）
ＩＪウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、 ｐＨ７，５（
以下、緩衝液Ａと省略する）に充分透析した。
実施例１
１
１ ａ −（３−サクシンイミジルオキシプロビオニル
）−７−アミノ−９ａ− メトキシマイトサン （イ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの裏造上記参考例２
において精製したマウス七ノクロナル抗ＭＭ４６抗体Ｉ
ｇＧ２ｂ ９．７４ダを溶解した５、 １ ｍｌの緩衝
液Ａに、１ａ−（ｓ−ｔクシンイミジルオキシプロピオ
ニル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサン０．７
１■を溶解したジメチルホルムアミドｏ 、 ］ ７！
ｋ 、’）’るやかな撹拌下に少量ずつ添加し、以後４
℃で５時間放置し反応させた（抗体１分子にマイトマイ
シンＣ誘導体２０分子を加え、旋、応させたことになる
）。反応液は、０．９％塩化ナトリウム溶液に平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラム（１，ｏ Ｘ ｄ ｓ
釧）にかけ、未反応のマイトマイシンＣ誘導体及び低分
子反応体成物を除いて、目的とする殺細胞性修飾免疫グ
ロブリン溶液４，３−をえたつ ３６０ｎｒｎにおける吸光度ｔ、ら、結合したマイトマ
イシンＣ残基の濃度は２０．９μ７／ゴでアリ、一方バ
イオ・ラド プロティンアッセイによる蛋白量の定量（
エム ブラッドフォード（Ｍ、 Ｂｒａｄｆｏｒｄ ）
、 アナリテイカル バイオケ ミ ス ト リ −
（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）第 ７ ２巻、 ｇ ２４８頁、！９７６年疹照〕か
らＩｇＧ２ｂの濃度は１．３０ ｍｇ’／ ｙｎｌとな
った。これから、ＩｇＧ ２ｂ 抗体１分子当りのマ
イトマイシンＣ残基の結合数は７．７個と推定された。
）−７−アミノ−９ａ− メトキシマイトサン （イ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの裏造上記参考例２
において精製したマウス七ノクロナル抗ＭＭ４６抗体Ｉ
ｇＧ２ｂ ９．７４ダを溶解した５、 １ ｍｌの緩衝
液Ａに、１ａ−（ｓ−ｔクシンイミジルオキシプロピオ
ニル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサン０．７
１■を溶解したジメチルホルムアミドｏ 、 ］ ７！
ｋ 、’）’るやかな撹拌下に少量ずつ添加し、以後４
℃で５時間放置し反応させた（抗体１分子にマイトマイ
シンＣ誘導体２０分子を加え、旋、応させたことになる
）。反応液は、０．９％塩化ナトリウム溶液に平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラム（１，ｏ Ｘ ｄ ｓ
釧）にかけ、未反応のマイトマイシンＣ誘導体及び低分
子反応体成物を除いて、目的とする殺細胞性修飾免疫グ
ロブリン溶液４，３−をえたつ ３６０ｎｒｎにおける吸光度ｔ、ら、結合したマイトマ
イシンＣ残基の濃度は２０．９μ７／ゴでアリ、一方バ
イオ・ラド プロティンアッセイによる蛋白量の定量（
エム ブラッドフォード（Ｍ、 Ｂｒａｄｆｏｒｄ ）
、 アナリテイカル バイオケ ミ ス ト リ −
（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｒｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）第 ７ ２巻、 ｇ ２４８頁、！９７６年疹照〕か
らＩｇＧ２ｂの濃度は１．３０ ｍｇ’／ ｙｎｌとな
った。これから、ＩｇＧ ２ｂ 抗体１分子当りのマ
イトマイシンＣ残基の結合数は７．７個と推定された。
（ロ） 殺細胞性修飾免疫グロブリンのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ癌細胞増殖抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞に対し
、上記（イ）で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリンを
、マイトマイ７ンＣ相当の濃度でθ〜１５００ｎｆ／７
になるように添加して４８時間培養後、トリパンブルー
染色法により生細胞数を顕徹鋭下に測定した。この時、
比較として、ＭＭ４６Ｉ！）ｌ胞に対し伺ら喘異的な親
和性をもたない無［４１，］係の蛋白質でを・るウシ血
清アルブミンを、上記（イ）と類似の方法によって、１
ａ−（３−サクシンイミジルオキシグロビオニル）−７
−アミノ−９ａ−メトキシマイトサンによって修飾した
、降飾ウシ血清アルブミンをもちいた。結果を第１図に
示した。
ｏ癌細胞増殖抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞に対し
、上記（イ）で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリンを
、マイトマイ７ンＣ相当の濃度でθ〜１５００ｎｆ／７
になるように添加して４８時間培養後、トリパンブルー
染色法により生細胞数を顕徹鋭下に測定した。この時、
比較として、ＭＭ４６Ｉ！）ｌ胞に対し伺ら喘異的な親
和性をもたない無［４１，］係の蛋白質でを・るウシ血
清アルブミンを、上記（イ）と類似の方法によって、１
ａ−（３−サクシンイミジルオキシグロビオニル）−７
−アミノ−９ａ−メトキシマイトサンによって修飾した
、降飾ウシ血清アルブミンをもちいた。結果を第１図に
示した。
第１図より修飾アルブミンは、非常に弱い活性しか示さ
ないのに対し、本発明の修飾免疫グロブリンでは、濃度
依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この修飾免疫グ
ロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６細胞に特異的に
反応し作用したことが分る。
ないのに対し、本発明の修飾免疫グロブリンでは、濃度
依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この修飾免疫グ
ロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６細胞に特異的に
反応し作用したことが分る。
なお、培養条件は以下の通りであった。
培養条件：
実施例２
０）−考例１で得られたウサギＩｇＧ ５．３■を含有
するｉ、ｏｍ６の０．１ Ｍリン酸緩衡液（ｐＨ７，０
）に、水冷下１１１−（ａ−サクシンイミジルオキシグ
ロピオニル）−７−アミノ−９ｍ −、％トキシマイト
サンの７０ ｍＭＤＭＦ 溶液１２μｔ を加え、４
°で一夜放置して反応せしめた。
するｉ、ｏｍ６の０．１ Ｍリン酸緩衡液（ｐＨ７，０
）に、水冷下１１１−（ａ−サクシンイミジルオキシグ
ロピオニル）−７−アミノ−９ｍ −、％トキシマイト
サンの７０ ｍＭＤＭＦ 溶液１２μｔ を加え、４
°で一夜放置して反応せしめた。
沈殿を遠心分離した後、上澄をセファデックスＧ−２５
（Ｉ Ｘ ４０ｃｍ、 １０ ｍＭ リン酸緩衡液
−０，１４Ｍ塩化ナトリウム（ｐｎ７．ｏ）にかけて、
高分子域の画分を集めると、目的物であるＭＭＣ誘導体
で修飾されたウサギ゛ＩｇＧが得られた。
（Ｉ Ｘ ４０ｃｍ、 １０ ｍＭ リン酸緩衡液
−０，１４Ｍ塩化ナトリウム（ｐｎ７．ｏ）にかけて、
高分子域の画分を集めると、目的物であるＭＭＣ誘導体
で修飾されたウサギ゛ＩｇＧが得られた。
（ロ） 上記（イ）で得られた修飾ウサギＩｇＧに結合
したマイトマイシンＣ残基量を紫外線吸により下記のご
とく決定した。即ち、修飾２ウサギＩｇＧは２８０ｎｍ
と、３６０ｎｍに吸収極大を示したが、２８０ｎｍの吸
光度よｊ７ ＩｇＧの蛋白質濃度を、３６０ｎｍの吸光
度より、マイトマイシンＣ残基の濃度を求めた。２つの
濃度の比、 は、ＩＨＧｔ分子に含有されるマイトマイ
シンＣ残基数を表わすが、（イ）で得られた修飾グロフ
ＩＪンでは、ＩｇＧ１分子に、マイトマイシンＣ残基が
、７．６個含有されることが判明した。
したマイトマイシンＣ残基量を紫外線吸により下記のご
とく決定した。即ち、修飾２ウサギＩｇＧは２８０ｎｍ
と、３６０ｎｍに吸収極大を示したが、２８０ｎｍの吸
光度よｊ７ ＩｇＧの蛋白質濃度を、３６０ｎｍの吸光
度より、マイトマイシンＣ残基の濃度を求めた。２つの
濃度の比、 は、ＩＨＧｔ分子に含有されるマイトマイ
シンＣ残基数を表わすが、（イ）で得られた修飾グロフ
ＩＪンでは、ＩｇＧ１分子に、マイトマイシンＣ残基が
、７．６個含有されることが判明した。
本実施例で得られた修飾免疫グロブリンは、マウス白血
病Ｌ１２１０細胞に対し、殺細胞性を示した。
病Ｌ１２１０細胞に対し、殺細胞性を示した。
第１図は、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンの、マ
ウス乳癌ＭＭ４６Ｍ胞に対する増殖抑制効果を示す。 第１図 マイトマイシンＣ相当１曳 （〉〆一）手続補正書 昭届５８年り月く日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭 ５１−５８０７ 号２、発明の名称 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区南本町ｊ丁目１１番地 （３００）帝人株式会社 代表者 徳 末 知 夫 帝 人 株 式 会 社内 明細書の「発明の詳細な説明」と「図面の簡単な説明」
の欄並びに図面 ６、補正の内容 （１） 明細書の３頁の１９９行目「アシド」とある
を、「アミド」と訂正する。 （２） 同１０頁の下から７行目Ｋｒ残基（３）」と
あるを、「残基Ｘ」と訂正する。 （３） 同１３頁の５〜７行目、１３頁の末行〜１４
頁の２行目、１５頁の１４〜１６行目、１６貞の下から
６〜４行目にいずれも「１ａ−（３−サクゾンイミジル
オキングロビオニル〕−１７−アミノ＝９ａ−メトキシ
マイトサン」とらるを、いずれも「１ ａ −（４−サ
クゾンイミジルオキシカルボニルプチリル）−７−アミ
ノ−９ａ−メトキシマイトサン」と訂正する。 （４） 同１７頁の１８８行目実施例２の末尾）の次
に、下記の実施例３を追加する。 「実施例３ （イ） 殺細胞性１し飾免疫グロブリンのｉｎ ｖｉｔ
ｒ。 癌細胞増殖抑制活性の測定 マウス乳癌Ｍ４６ のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養細胞に
対し、上記実施例１の（イ）で製造した殺細胞性修飾免
疫グロブリンを、マイトマイシンＣ相当の濃度で０〜１
５００ｎ！ｉｌ／Ｔｎ７！に々るように添加して４８時
間培養後、トリバンブルー染色法によｐ生細胞数を顕微
鏡下に測定した。この時、比較の為に１ａ−（４−サク
シンイミジルオキシカルボニルプチリル）−７−アミノ
−９３−メトキンマイトサンによるイ多飾を施していな
い抗ＭＭ４６免疫グロブリンを対照としてもちいた。結
果を第２図に示した。 第２図よシ、未修飾の免疫グロブリンが全く活性を示さ
ないのに対し、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンに
は濃度依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この殺細
胞性修飾免疫グロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６
細胞に特異的に反応し作用したことが分る。 なお、培養条件は以下の通シであった。 培養条件： ［培養開始時の細胞ｉｊ・２．３ Ｘ ｉ ｏ４／ ＋
Ｊ 、 ０．２ ｍｌ嘩 ［雰 囲 気・・・５％Ｚ酸化炭素 、 ン一 （ロ） 殺細胞性修飾免疫グロブリンのｉｎ ｖＬｔ
ｒ。 癌細胞増殖抑！ｆｉｌｊ活件の一１１定マウス乳４ Ｍ
Ｍ４６のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培！細胞に対し、上記災施
例１の（イ）で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリンを
、マイヒマイシンＣ相尚の濃度で０〜ｂ うに添加して４８時間培養後、トリバンプルー染色法に
よシ生細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、比較の為
に、ＭＭ４６細胞に対し何ら特異的なＲ９性をもたない
正常マウスの非特異的免疫グロブリンを、上記冥施例１
の（イ）と類似の方法によって、Ｊａ−（４−サクンン
イミジルオキシカルボニルブチリル）−７−アミノ−９
ａ−メトキシマイトサンによって修飾し、対照とじても
ちいた、結果を第３図に示した。 第３図より、修飾した非特異的免疫グロブリンが非常に
弱い活性しか示さないのに対し、本発明の殺細胞性修飾
免疫グロブリンには濃度依存性の強い増殖抑制活性が認
められ、この殺細胞性修飾免疫グロテリンがその標的細
胞であるＭＭ４６細胞に特異的に反応し作用したことが
分る。 なお、培養条件は以下の通りであった。 培養条件： （５） 同１７頁の末行に「第１図は」とあるを、「第
１〜３図は」と訂正する。 （６） 図面として別紙第２図と第３図を追加する。 以 上 ｈ仕 手 ２ 図 兜反り゛°ロブリン 相当−ｊｌ屋（タオイ）第 ３
図
ウス乳癌ＭＭ４６Ｍ胞に対する増殖抑制効果を示す。 第１図 マイトマイシンＣ相当１曳 （〉〆一）手続補正書 昭届５８年り月く日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭 ５１−５８０７ 号２、発明の名称 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区南本町ｊ丁目１１番地 （３００）帝人株式会社 代表者 徳 末 知 夫 帝 人 株 式 会 社内 明細書の「発明の詳細な説明」と「図面の簡単な説明」
の欄並びに図面 ６、補正の内容 （１） 明細書の３頁の１９９行目「アシド」とある
を、「アミド」と訂正する。 （２） 同１０頁の下から７行目Ｋｒ残基（３）」と
あるを、「残基Ｘ」と訂正する。 （３） 同１３頁の５〜７行目、１３頁の末行〜１４
頁の２行目、１５頁の１４〜１６行目、１６貞の下から
６〜４行目にいずれも「１ａ−（３−サクゾンイミジル
オキングロビオニル〕−１７−アミノ＝９ａ−メトキシ
マイトサン」とらるを、いずれも「１ ａ −（４−サ
クゾンイミジルオキシカルボニルプチリル）−７−アミ
ノ−９ａ−メトキシマイトサン」と訂正する。 （４） 同１７頁の１８８行目実施例２の末尾）の次
に、下記の実施例３を追加する。 「実施例３ （イ） 殺細胞性１し飾免疫グロブリンのｉｎ ｖｉｔ
ｒ。 癌細胞増殖抑制活性の測定 マウス乳癌Ｍ４６ のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養細胞に
対し、上記実施例１の（イ）で製造した殺細胞性修飾免
疫グロブリンを、マイトマイシンＣ相当の濃度で０〜１
５００ｎ！ｉｌ／Ｔｎ７！に々るように添加して４８時
間培養後、トリバンブルー染色法によｐ生細胞数を顕微
鏡下に測定した。この時、比較の為に１ａ−（４−サク
シンイミジルオキシカルボニルプチリル）−７−アミノ
−９３−メトキンマイトサンによるイ多飾を施していな
い抗ＭＭ４６免疫グロブリンを対照としてもちいた。結
果を第２図に示した。 第２図よシ、未修飾の免疫グロブリンが全く活性を示さ
ないのに対し、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンに
は濃度依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この殺細
胞性修飾免疫グロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６
細胞に特異的に反応し作用したことが分る。 なお、培養条件は以下の通シであった。 培養条件： ［培養開始時の細胞ｉｊ・２．３ Ｘ ｉ ｏ４／ ＋
Ｊ 、 ０．２ ｍｌ嘩 ［雰 囲 気・・・５％Ｚ酸化炭素 、 ン一 （ロ） 殺細胞性修飾免疫グロブリンのｉｎ ｖＬｔ
ｒ。 癌細胞増殖抑！ｆｉｌｊ活件の一１１定マウス乳４ Ｍ
Ｍ４６のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培！細胞に対し、上記災施
例１の（イ）で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリンを
、マイヒマイシンＣ相尚の濃度で０〜ｂ うに添加して４８時間培養後、トリバンプルー染色法に
よシ生細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、比較の為
に、ＭＭ４６細胞に対し何ら特異的なＲ９性をもたない
正常マウスの非特異的免疫グロブリンを、上記冥施例１
の（イ）と類似の方法によって、Ｊａ−（４−サクンン
イミジルオキシカルボニルブチリル）−７−アミノ−９
ａ−メトキシマイトサンによって修飾し、対照とじても
ちいた、結果を第３図に示した。 第３図より、修飾した非特異的免疫グロブリンが非常に
弱い活性しか示さないのに対し、本発明の殺細胞性修飾
免疫グロブリンには濃度依存性の強い増殖抑制活性が認
められ、この殺細胞性修飾免疫グロテリンがその標的細
胞であるＭＭ４６細胞に特異的に反応し作用したことが
分る。 なお、培養条件は以下の通りであった。 培養条件： （５） 同１７頁の末行に「第１図は」とあるを、「第
１〜３図は」と訂正する。 （６） 図面として別紙第２図と第３図を追加する。 以 上 ｈ仕 手 ２ 図 兜反り゛°ロブリン 相当−ｊｌ屋（タオイ）第 ３
図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 Ｌ 一般式ＣＩ） で表わされる殺細胞性修飾免疫グロ７゛リン。 λ 式ＣＩ）において、Ｒが炭素数２〜７のフルキレン
基を表わす特許請求の範囲第１項記載の殺細胞性修飾免
疫グロブリン。 λ 式〔Ｉ〕において、Ｒがトリメチレン基を表わす、
特許請求の範囲第１項または第２項記載の殺細胞性修飾
免疫グロブリン。 本 一般式（■〕 で表わされるマイトマイシンＣ誘導体を、免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴と
する、一般式ＣＩ）で表わされる殺細胞性修飾免疫グロ
ブリンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58005807A JPH0651643B2 (ja) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| DE8484300170T DE3479806D1 (en) | 1983-01-19 | 1984-01-11 | Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof |
| EP84300170A EP0114730B1 (en) | 1983-01-19 | 1984-01-11 | Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof |
| US06/571,898 US4487714A (en) | 1983-01-19 | 1984-01-18 | Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58005807A JPH0651643B2 (ja) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59134734A true JPS59134734A (ja) | 1984-08-02 |
| JPH0651643B2 JPH0651643B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=11621349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58005807A Expired - Lifetime JPH0651643B2 (ja) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4487714A (ja) |
| EP (1) | EP0114730B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0651643B2 (ja) |
| DE (1) | DE3479806D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61204133A (ja) * | 1985-03-05 | 1986-09-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 抗マウス膀胱癌抗体と抗腫瘍性物質との結合物 |
| US9604896B2 (en) | 2014-09-03 | 2017-03-28 | Eastman Chemical Company | Halogen-free catalyst system and method for producing benzoic acid |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| US4843147A (en) * | 1986-11-06 | 1989-06-27 | University Of British Columbia | Anhydrous enhanced coupling of proteins |
| US4952394A (en) * | 1987-11-23 | 1990-08-28 | Bristol-Myers Company | Drug-monoclonal antibody conjugates |
| US5008183A (en) * | 1988-05-10 | 1991-04-16 | Bio-Research Laboratories, Inc. | Assay system for detecting antibody and a method of producing non-human immune antibody |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5592325A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-12 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Antitumor agent and its preparation |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4045420A (en) * | 1973-05-29 | 1977-08-30 | Syva Company | Non-oxo-carbonyl containing benzoyl ecgonine and cocaine compounds polypeptide and derivatives thereof |
| GB1541435A (en) * | 1975-02-04 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| IL47372A (en) * | 1975-05-27 | 1979-10-31 | Yeda Res & Dev | Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same |
| US4263279A (en) * | 1975-08-19 | 1981-04-21 | Yeda Research & Development Co. Ltd | Pharmaceutically active compositions containing adriamycin and daunomycin |
| US4026879A (en) * | 1976-03-23 | 1977-05-31 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antigen-containing propranolol derivatives |
| US4069105A (en) * | 1977-03-03 | 1978-01-17 | Syva Company | Lidocaine antigens and antibodies |
| US4243654A (en) * | 1978-09-11 | 1981-01-06 | Syva Company | Oxazepam derivatives for immunoassay reagents |
| US4315851A (en) * | 1978-12-29 | 1982-02-16 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition having antitumor activity |
| US4223013A (en) * | 1978-12-29 | 1980-09-16 | Syva Company | Amitriptyline conjugates to antigenic proteins and enzymes |
-
1983
- 1983-01-19 JP JP58005807A patent/JPH0651643B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-01-11 DE DE8484300170T patent/DE3479806D1/de not_active Expired
- 1984-01-11 EP EP84300170A patent/EP0114730B1/en not_active Expired
- 1984-01-18 US US06/571,898 patent/US4487714A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5592325A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-12 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Antitumor agent and its preparation |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61204133A (ja) * | 1985-03-05 | 1986-09-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 抗マウス膀胱癌抗体と抗腫瘍性物質との結合物 |
| US9604896B2 (en) | 2014-09-03 | 2017-03-28 | Eastman Chemical Company | Halogen-free catalyst system and method for producing benzoic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0114730A3 (en) | 1986-11-12 |
| US4487714A (en) | 1984-12-11 |
| EP0114730B1 (en) | 1989-09-20 |
| DE3479806D1 (en) | 1989-10-26 |
| JPH0651643B2 (ja) | 1994-07-06 |
| EP0114730A2 (en) | 1984-08-01 |
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