JPS6041617A - 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な殺細胞性修飾免疫グロブリンとその製造
方法に関する。史に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつＩｌｌ定の抗原と選択的に結合する
免疫グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグ
メント中のＶミ／基に、アクチノマイシンＤ誘導体を結
合せしめて成る新規な殺細胞性免疫グルプリンとその製
造方法１（関する。 現在までに７クチノマイシンＤを抗体に共有結合させる
試みは、なされない。本発明；にらは、鋭意研究の結果
、活性エステル基をその構造中に含むアクチノマイシン
Ｄ誘導体を免疫ダルプリンに作用させると、免疫グロブ
リンに結合することを、−ヤたしかＬ７てイｎらハ、る
修飾免疫グロブリンはすぐれたホ択的殺訓胞能を治する
ことを知見し、ンド発明に到達した。 即ち、本発明は一般弐Ｂ４） で表わされる′１９．細胞性修飾免疫グロフリン、及び
一般式（ｎ） で表わされる７クチノマイシンＤＨ導体を、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴
とする製造法である。 一般式印および（ＪＪ’）　において、Ｒは２価の有様
基を表わすが、ｌｌｆｆしくは炭素数２〜７個の直鎖の
又は分枝なもったアルキレン基、又は置換基を有する又
は有しないフェニレン基である。 さら忙好ましくは、エチレン基、トリメチレン基、テト
ラメチレン基、ペンタメチレン基、２−メチルトリメチ
レン基、２−メチルエチレン基、２，２−ジメチルエチ
レン基、３−ノチルトリメチレン基、３−プロピルトリ
メチレン基。 ３．３−ジメチルトリメチレン基（ただし、置換基の位
置はカルボキシル基側より数えた炭素位置を表わす）＋
　Ｐ−フェニレン基７ｍ−フェニレン基等である。また
一般式〔］〕においてＸで表わされる活性エステルのア
ルフール残基としては、ザクシンイミジル、徒、５−ノ
ルボルネン−２，３−ジノフルボキシイミジル基、フク
ルイミジル基、ｐ−ニトロフェニル基、　２　、４−ン
ニトｐフェニル基＋　２１４１５−トリクρμフェニル
基！ペンタクｐロフェニル基等を４でけることができる
。 本発明において、免疫グロブリンとは、殺すべき細胞の
もっている特定の抗原と選択的に結合（一つる免疫クロ
ッリンをいう。かかる免疫グロノ′リンどし又は、例え
ば、次の様なものがある。腫瘍細胞あるいは特定のリン
パ球等の標的１１１）胞ちるい（丁それらを含む組織で
免疫さＪまたヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、
ウサギ。 モルモット、ハムスター、ラットマウス等の動物から）
分離された抗血済より、エタノール分画。 硫安分画、イオン交換あるい１す分子ふるいカラムクロ
マトクラフィー等の公知の手段によって調製されるグ「
プリン（抗体）。また枕的細胞で免疫した動物より採取
された抗体産生＃１１！胞を発馬性のある物質で癌化さ
せて得られる細胞の培養液、あるいは抗体産生細胞を骨
髄腫細胞等と細胞融合させて得られた融合細胞（ハイブ
リドーマ）から選別された目的とする抗体産生性のクロ
ーンの培養液から、またはこれを動物に接種してその血
清または腹腔液からも本発明の免疫グロブリンを得るこ
とができる。免疫グロブリンには、ＩｇＧ　、　ＩｇＡ
　＋　ＩｇＭ　＋　ＩｇＤ　＋　ＩｇＥの５種類がある
ことが知られているが、そのどれでも本発明に用いるこ
とができる。 本発明に於いて免疫グロブリンはそのまへでも、或いは
抗原と結合し得る部分を含む限りにおい℃は、そのフラ
グメント（例えば、Ｆａｂ　。 Ｆａｂ’　、　Ｆａｂ″の′２景体Ｆ（ａｂ’）ｔ　）
でも用いることができる。 本発明において用いる一般式（ｎ）で表わされるアクチ
ノマイシンＤ誘導体は、例えば、次に示す合成ルートに
よりアクチノマイシンＤを出発原料として合成すること
ができる。用いられるα−ケト酸としては、オキザロ酢
酸（ＨＯＣＯＣＯＣｔｒ＝ｃｏ曹Ｈ）、２−ケトゲルタ
ール酸、　（ＨＯＣＯＣＯＣＨｅＣ＆Ｃ０ｔＨ）　Ｐ−
カルボキシベンゾイル蟻酸（ＨＯＣＯＣＯＱＣＯｌＨ）
　、　２−ケト−３−メチルゲルタール酸（ＨＯＣＯＣ
ＯＣＨ（ＣＨｍ）ＣＨｔＣへＨ〕等が挙げられる。 れらに限られるものではない。 免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、分子中に末
端アミン基や構成アミノ酸のリジンに由来するアミ７基
を複数個有しているので、かかるアミノ基を利用して本
発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンが製造される。利用
されるアミ７基の個数は１〜２０個が好ましい。即ち、
本発明の一般式〔（〕で表わさハる殺細胞性修飾免疫グ
ロブリンは、一般式０で表わされるアクチノマイシンＤ
誘導体を免疫グロブリンまたはそのフラグメントと反応
せしめることにより製造される。本反応は、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントのｐＨ５〜８の緩徴液の溶
液（蛋白濃度は好ましくは０．５〜１００　ｒＲ９／ｍ
／　ＶＣ調製する）Ｋ、０〜４０℃で攪拌しながら、部
分の溶媒、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、メ
タノール、エタノール、アセトン等に溶かした一般式印
〕で表わされるアクチノマイシンＤ誘導体（好ましくは
前者１モルに対し１〜５０モル）を添加し、】５分〜１
２時間行われる。その後、反応混合物をグル濾過あるい
は透析することによって未反応のアクチノマイシンＤ誘
導体と低分子反応生成物を除き、殺細胞性修飾免疫グロ
ブリンを精製することができる。 本発明において得られた殺緬胞性修飾免疫グロブリンは
、殺すべき標的細胞に対して特異的増殖抑制活性を有し
、従って碧の治療剤として有用である。 参考例１ マウスモノクローナル抗ＭＭ　４６免疫グｑプリンの調
製。 マウス乳癌細胞Ｍ４６に対するマウスのモノクロナル抗
体１ｇＧ２ｍ産生性のノ１イプリドーマを、ＢＡＣＢ　
／　Ｃヌードマウスに移殖し、１０日後その腹水液をえ
た。得られた腹水液４０ｄを、０．１　Ｍ　リン酸後衝
液ｐＨ８、０に透析（−た後、同緩衝液に平衝化したプ
ロティンＡ七）７ｐ−スＣＬ−４Ｂカラム（１，５Ｘ２
２α）にかけた。 同緩衝液でカラムを充分洗浄後、０．１Ｍクエン障緩衝
液ｐＨ４，５で、目的とするマウスモノクローナル抗体
抗ＭＭ　４６　ＩｇＧ２ａ　（３００１ｎ９）を溶州し
た。溶出し、た抗体は、ｓｏ％飽和硫安により沈澱させ
、少夕の０．９％均化ナトリウム溶液に再ｍ　ｙｓした
後、４０　ｍ＋ｉＴ　リン（Ｉｓ、　ｅ　＜Ｊｉｉ　ｅ
、　ｑｌｉ７　、　ｏに４６分に透り１１．た。 参考例２ （イ）　抗マウス自ｎｕ病ＬＩ２１０１ｇＧの精製マウ
ス白ｉｎ病Ｌ１２］０細胞１ｘｌＯ″イＩＮＩをフ１３
インド完全アジュバントとのユマ・しジ・ヨンとし、家
兎に静脈注射した。イーの移りＥ　（／Ｃ１１週間間隔
テ：ｌ　ｌＩｌ”Ｊ、ソｆ１ぞれ約］　Ｘ　］、　０’
イ：ｔ＋＋　４７）Ｌ　Ｉ　２１−０硅ｊ胞をｒンユバ
ンドと共に皮下注ｒ１１シ、第６．終投与ト］から８日
ソ・シこ採血した。得ら」ｌだ血液をグー刀・Ｌ７．１
１′ｌｌ晴・ｋ分１’；Ｔ　Ｉ−１その皿ピｊ〒を５６
℃、３０分間加熱、非動化した。こうしてイ４１られた
抗Ｌ１．２１０血ｒｆｒ　２００　ｍｌに、硫安の抱和
水溶液２００　ｍｌを加えて、生じた沈殿を遠心分ｐＪ
ｔＫ　ｊって分取した。この沈澱を０．０　１　Ｍ　！
Ｊ　７１１’？９　衝ＩＴＩ　（ＰＩ（７，６）　ｓ　
ｏ　ｒｎ１ｗｉ容解し、更て同統胡液に対して十分（（
透析した。 この透析内＋’ｌＥを同じ緩衝教で平イ曲化したジエチ
ル７ミノＪ−十ルセル［ノースカラム〃ロー７トグラフ
イー（カラムザイズ３　（ＨＸ　９４　ｔｖ　）にかげ
て、禾吸着分画どして抗１−１２１．０１　ｇＧｆ　；
’；む硲１１ｋを得／こ。 （ロ）　ＩｇＭ　の　ｆｉｉ　實廖 （１’）の如くして、イ：１ら牙また抗■、１２１０抗
血清１００ゴに飽和ｊＪ　Ｔ；溶液１００　ｍｌを添加
し、生じた沈澱を遠心分離した。沈、・被を、少沿の０
．９％塩化カリウム溶液に？に解Ｃ−１遠心分離し−Ｃ
生じた不浴物を除いたのｓ、Ｕ、９％塩化ナトリウム溶
液に’Ｔ−Ｍｉ化したセフｌデックＧ・２００カラムク
１コ−７トグンフイー（２，２函×１０２　Ｇ７ｎ　）
にかけ、第１ピークＫ　ＩｇＭ　１ｌＵｉ分をえた。 こうして得たＩｇＭ両分は、回答（ａのｌｆｓ相硫安溶
液を加えて生じた沈ｆ夕を５ｈ心分Ｐ、Ｉｒ　Ｌ−た付
、少脣の０．９φ塩化ナトリウム溶液に浴かし、０．９
係塩化ナトリウムに１液に充分に透析した。 （ハ）　Ｉｇ：Ａｓの訣１製 ０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解したウサギＩｇＭ　
（９，５ｍ９　／　ｒｎｌ　）　１．８　ｙｉｌに、Ｉ
Ｍトリス塩酸緩衡液（ＰＨ８，６）に溶卵ｒした０、２
Ｍシスティンｏ、２ｍｌを混合し、室温】６時間還元し
た後、セファデックスｃ　−２ｓ　（ｏ、ｓ　Ｘ　４３
爪）を用いるゲルろ過（５ｍＭ酢酸酢酸緩衝液−０，１
４Ｍ　ＮａＣｌ−１ｍ　Ｍ　Ｅｌ）ＴＡ　（ｐ＋−１５
，５）により、過剰のシスティンを除いた。 イ）殺細胞性修飾免疫クロ７リンの１！！造上記参考例
ＩＫ、おいて精製したマウスモノクロナル抗ＭＬ（４６
抗体ＩｇＧ＋　８　１０．９　ｍ９に、上記式１で六わ
さ第１る没元）′クチノマインンーＤオキサンノンｒｉ
ｓ導体５．５＃＋９をｏ、＋ｍｌのジメチルホルムアミ
ドに溶かした溶液３Ｂ、８ｐｌ！を、ゆるやかな攪拌下
に少１．：ずつ添加し、？Ｘ協［９０分放ＩＱ：　Ｌ　
、反応マーせだ（抗体１モルにアクナ／マ・ｒンンＩ）
　ａ’３　ｍ１体２０４−ルな加女反応させたことにな
る）。反応液を５　ｍＭ　ｌ’？ｌ−酸緩衡液ｐＨ５、
５にイ衡化したセフ７テツクスＧ−５０カラＡ　（＋、
６’ｘ　４８　ｃｍ　）　Ｋ　、ｌｌＴｌして未反応の
フリチノマイシンＤ誘導体及び低分子反応生成物を除き
、目的とする緩細胞修飾ダ１疫グープリン溶液４．３　
ｍｌを得た。 ５０５　ｎｍ　における吸光度力）ら、結合したアクチ
／　マイシンＤの１１ま、９８．３　μｇ／ｍｌであり
、−カバイオ・ラツドーフ゛ロテインアンセイによる蛋
白量の定壊（エノ・、フラッドフォード（Ｍ　、　Ｂｒ
ａｄｆｏｒｄ　）　、アナ１ノテイカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ−□ｍ１
ｓｔｒｙ　）第７２巻、第２４８頁、１９７６年参照）
から、Ｉ　ｇＧｍａ　の濃度は１．２８　ｍ９　／　ｍ
ｌであった。これらから、ＩｇＧｔａ　抗体１分子に哨
合し六−γり千ノマインンＤ残基の結合数

【ま９．２個
であることがわかった。 口）殺細胞性修飾免役グロブリンのＩｎ　ｖｉｔｒｏ癌
細胞増殖抑制活性の測定 マウス乳癌Ｍｈｉ　４６のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養細胞に
対して、上記で製造した殺細胞性イ四ｊ？；ｌｉ　Ｓｉ
疫り゛ロブリンを、アクチノマイシンＤ　ａ当σ）′６
１度で６２．７　ＰＫ　／　ｍｌ　Ｋなるよう１（添加
して、０℃で１０分暗培養後鮮な培地で２回洗（・、４
８ｈｒ３７　°ｃ　で培　養後　、ト　リ　〕（ン　）
°　ル　−　染　色　法により生細胞数を顕像鼻下に数
えた。このとき比較として、Ｎ憎４６　＃Ｉｌ＋胞に対
し何ら特異的な親」Ｕ性をもだ１工い無関係の蛋白質で
あるウシ血７胃γルプミンを、上、：Ｃ（イ）と同様の
方法ｔでよって修飾した修飾ウシ血清アルブミンも用い
た。 結果は第１表に示した。第１表より修飾アルブミン＋′
＃１三常に弱い活１りしか示さず、他のコン１ρ−ル（
７クチノマイシンＤ、アクチノマイシンＤと抗ＭＭ　４
６１ｇＧ＋ａの混合物、抗ＭＭ４６１ＫＧ＋ｉ１　＋ウ
シ血清アルブミン）も弱い活性しか示さないのに対し、
本発明の修飾免疫グロブリンでは、濃度依存性の強い増
殖抑制活性が認められ、この修飾免疫グロブリンがその
標的細胞であるＭ＋ｉ１４６細胞に％具的に反応し作用
したことが分る。 培養開始のＩｌｌ胞数　・・・・・−２，５Ｘ　Ｉ　ｏ
４／　ｍｌ培養液　・・・・・・　ＲＰＭ１１６４０　
＋１０％牛脂児血清＋２０μＭ２−メルカプトエ タノール＋１００μｇ　／　ｍ　ｌカナ第　１　表 実施例２ イ）殺細胞性修飾免役グロブリンの１１！！造上記参考
例２によって調製さねたウサギＩｇｌＶｉｓ　５ｍ９に
、上記３で表わきｆｌる還元アクチノマイシンーＤオキ
ザンノン誘４　体５π？をｊｏｏｐｌのジメ千ルホル人
アミ１′に溶かした溶液２０μｌを、ゆるやかな４”と
′押下（（添加し、室Ｆ１に１　、５１１９ｒ間か・Ｉ
ｆ”　Ｌ、ル”応させた。反応召τを実施例：］と同村
に処狸して精製した。実がり例１と同村に５５０ｎｍｆ
’こおける吸光度及びバイオ・ラソ１−・ブ１ティンア
ッセイによる蛋　白　ｐ　７：　’ｉｅ、＠　Ｋ、Ｊ’
、リ　、　Ｉｇ［４ｓ　＋　分　−７’　ｔｆ　Ｃ１，
ｏ　（［、ｑのアク千ノマイシン残基がｌ１合（２てい
ることが１１ｊ号！１しプこ。 このものも、実施例】のものと同様な蝉細胞増殖抑制活
性を示した。 以　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式〔１〕 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン。 ２　式〔１〕において、ｌ（が炭素数２〜７の直鎖の又
   は分枝をもったアルキレン基、置換基を有する、又は有
   しないフェニレン基を表わす、特許請求の範囲第１項記
   載の殺細胞性修飾免疫グ１ゴブリン。 ３一般式〔口〕 で表わされるアクチノマイシンＤ誘導体を、免疫グロブ
   リンまたはそのフラクメントと反応せしめることを特徴
   とする、一般式 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン製造法。