JPH021129B2 - - Google Patents

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JPH021129B2
JPH021129B2 JP55180553A JP18055380A JPH021129B2 JP H021129 B2 JPH021129 B2 JP H021129B2 JP 55180553 A JP55180553 A JP 55180553A JP 18055380 A JP18055380 A JP 18055380A JP H021129 B2 JPH021129 B2 JP H021129B2
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JP
Japan
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protein
mom
fragment
immunoglobulin
cytotoxic
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Yasuhiko Masuyasu
Takeshi Hara
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Teijin Ltd
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Teijin Ltd
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    • A61K47/6817—Toxins
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    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は新規な細胞毒性蛋白複合体を活性成分
とする細胞毒剤およびその製造法に関する。更に
詳しくは、本発明は殺すべき細胞（以下標的細胞
という）のもつ特定の抗原と特異的に結合しうる
免疫グロブリン、あるいはその抗原結合部位を含
むフラグメントからなる構成部分と、ツルレイシ
（Momordica charantia）から抽出精製される蛋
白合成阻害活性をもつ、ラウリル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミド・ゲル電泳動で測定した
分子量が約23000の蛋白（以下MOMという）か
らなる構成部分を有する、新規な細胞毒性蛋白複
合体を活性成分とする細胞毒剤とその製造法に関
するものである。 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。免疫グロブリンに結合させる細
胞毒性物質としては、従来、制癌剤、酵素あるい
は毒素が用いられてきた（テイーゴースら（T.
Ghose）、ジヤーナル オブザ ナシヨナル キ
ヤンサー インステイテユート（J.Natl.Gancen
Inst）．第61巻、第657〜676頁、1978年参照）。し
かし、これらの物質は元来非特異的な細胞毒性が
あるために、特異的な免疫グロブリンと結合させ
ても、十分な選択毒性は得られなかつた。最近、
本発明者らはジフテリア毒素から蛋白合成阻害活
性をもつフラグントＡと種々の細胞と非特異的に
結合するフラグメントＢとを分離し、フラグメン
トＡと免疫グロブリンのフラグメントFab′とを
架橋することによつて、優れた選択毒性をもつ蛋
白複合体を得た（増保（Y.Masuho）ら、バイオ
ケミカル アンド バイオフイジカル リサーチ
コミユニケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.
Commun.）、第90巻、第320〜360頁、1979年及び
特開昭55―136235参照）。ジフテリア毒素の他に、
植物毒素リシン（ricin）、アブリン（abrin）、モ
デシン（modeccin）等からも蛋白合成阻害活性
をもつフラグメントが得られることが知られてい
る（例えば、特開昭55―49321参照）。こうした毒
素のフラグメントと免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメンントとの複合体は、毒素由来の蛋白を用
いるため、いくつかの難点がある。 その第１は、毒素から蛋白合成阻害活性をもつ
フラグメントを分離、精製することが難しいこと
である。そして第２は、第１の点とも関連する
が、そのフラグメント中にインタクト毒素が混入
し易すく、その場合には毒素の細胞毒性が極めて
強いが由に、毒素の混入が僅かであつても、標的
細胞以外の細胞をも非特異的に傷害してしまうと
いう問題である。 ところが、本発明において用いられるツルレイ
シのMOMは、それ自身だけでは細胞内へ侵入し
得ぬために、それ自体は極めて毒性が低い。また
MOMは特にフラグメメント化することなく、そ
のまゝ用いることができるので、その分離、精製
も非常に容易であるという特徴がある。 本発明者らは、MOMのかかる性質に着目し、
MOMを標的細胞に選択的に送り込み得る蛋白複
合体を活性成分とする細胞毒剤の創製につき鋭意
研究の結果、先行技術の欠点を解消した極めて選
択性の高い細胞毒性を有する蛋白複合体を活性成
分とする細胞毒剤を知見し本発明に到達した。 すなわち、本発明は、殺すべき細胞のもつてい
る特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと、ツルレイシから得
られる、ラウリル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動で測定した分子量が23000
の蛋白合成阻害活性を有する蛋白（MOM）とを
ジスルフイド結合またはスルフイド結合させてな
る細胞毒性蛋白複合体を活性成分とする細胞毒
剤、および免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トとMOMを架橋剤を用いて結合することを特徴
とする細胞毒性蛋白複合体を活性成分とする細胞
毒剤の製造方法である。 本発明において、殺すべき細胞のもつている特
定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン
（細胞毒性蛋白複合体の誘導部）とは次のような
ものである。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球等
の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウカ
ギ、モルモツト、ハムスター、ラツト、マウス等
の動物から分離された抗血清より、エタノール分
画、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラム
クロマトグラフイー等の公知の手段によつて調製
される免疫グロブリン、あるいは標的細胞で免疫
した動物より採取された抗体産生細胞を発癌性の
ある物質で癌化させたり、ミエローマ細胞と融合
させてハイブリドーマにしたりすることによつて
得られるモノクロナルな抗体をいう。また標的細
胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤等で分
離して得られる、標的細胞に時異的な免疫グロブ
リンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。 免疫グロブリンにはIgG，IgA，IgM，IgD，
IgEの５つのクラスが知られており、さらに各ク
ラスはいくつかのサブクラスから成つていること
が知られている。しかし、その基本構造は、２本
の重鎖と２本の軽鎖とから成る点、また抗原結合
活性をもつFab部分とエフエクタ活性をもつFc部
分から成る点において一致している。ただし、
IgMは５量体、IgAは一部２量体で存在するが、
細胞毒性蛋白複合体の組織浸透性という面から考
えると、これらをメルカプタンで還元し、１量体
としてから、複合体の誘導部分に用いる方が望ま
しい。 細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グ
ロブリン分子全体を用いてもよいが、それより
も、その抗原結合部位を含むが、Fc部分をもた
ないフラグメントを用いることが望ましい。それ
はFc部分を含む複合体にあつては、Fc部分によ
る標的細胞以外の細胞に対する非特異的吸着及び
細胞膜上のFcリセプターとの結合が起り、細胞
毒性蛋白複合体の殺すべき細胞に対する選択性が
減じるからである。さらに異種タンパクとしての
免疫グロブリンの抗原性はFc部分において特に
強いので、蛋白複合体の抗原性を低下させる点に
おいても、Fc部分のない免疫グロブリンのフラ
グメントが、細胞毒性蛋白複合体の誘導部として
望ましい。一般に、免疫グロブリンをパパイン
（papain）、トリプシン（trypsin）、キモトリプシ
ン（chymitrypsin）、プラスミン（plasmin）等
の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分を１
つもつ、いわゆるFabフラグメントが得られる。
またペプシン（pepsin）分解、条件によつてはト
リプシン分解によつても抗原結合部分を２つも
つ、いわゆるＦ（ab′）2フラグメントが得られる。
このフラグメントはさらにメルカプタンで処理す
ると、一価のFab′フラグメントになる。さらに
免疫グロブリンを変性させつつ分解させると抗原
結合部分（バリアブルリージヨン variable
region）のみが得られる。これらの免疫グロブリ
ン由来フラグメントは原料としての免疫グロブリ
ンがいかなるクラス、サブクラスであれ、いずれ
も本発明の蛋白複合体の誘導部として用いること
ができる。 本発明において、ツルレイシ（Momordica
charantia）の蛋白合成阻害活性を有する蛋白質
（MOM）とは、ツルレイシの種子より公知の方
法、例えばバルビエリら（L.Barbieri et al.、バ
イオケミカル ジヤーナル（Biochem.J.）、第
186巻、第443〜452頁、1980年参照）の方法によ
つて抽出精製することができるラウリル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で測
定した分子量が約23000の蛋白であり、ウサギ網
状赤血球のライゼート（lysate）による蛋白合成
に対して強力な阻害活性をもつている。 本発明の細胞毒性蛋白複合体は免疫グロブリン
またはそのフラグメントとツルレイシのMOMを
ジスルフイド結合またはスルフイド結合によつて
架橋することにより製造される。下記式（），
（），（）または（）で表わされる複合体が、
その製造、分離精製及び活性上特に好ましく、本
発明の蛋白複合体を構成する。 Ab〔―（X2）p―S1―（X3）q―S2―X4―MOM〕o …（） 〔Ab―（X2）p―S1―（X3）q―S2―X4〕―oMOM …（） ［Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トを、MOMはツルレイシから得られるラウリル
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動で測定した分子量が約23000の蛋白合成阻害
活性を有する蛋白質を、ｎは１〜３の整数を表
す。 上記式（）―（）においてｐ＝０の場合に
は、S1は免疫グロブリンまたはそのフラグメント
に由来する硫黄原子であり、ｐ＝１の場合には架
橋剤により導入された硫黄原子である。S2は架橋
剤によつて導入された硫黄原子である。式（）
および（）においてｑ＝０の場合には、硫黄原
子S1とS2は直接結合しジスルフイド基を形成す
る。一方ｑ＝１の場合には、硫黄原子S1とS2は２
価の有機基X3を介して結合するが、X3はチオー
ル基と反応する２個の官能基を有する架橋剤、例
えば式（）、 〔X6は２価の有機基である。〕 で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンに由来
する２価の有機基である。 式（）―（）におけるX2および式（），
（）におけるX4は同一または異なつて下記式
（）、 〔Ｙは結合している硫黄原子Ｓと共に活性ジル
フイド基を形成し得る１価の有機基を、X7は２
価の有機基を、Ｚは活性エステルのアルコール残
基を表わす。〕 で表わされる架橋剤、下記式（）、 〔ＹおよびX7の定義は式（）の場合に同じ
である。Ｑはイミドエステルのアルコール残基
を、Ｒはハロゲン原子を表わす。〕 で表わされる架橋剤、 下記式（）、 〔X7およびＺの定義は式（）の場合に、Ｒ
の定義は式（）の場合に同じである。〕 で表わされる架橋剤、下記式（XI）、 で表わされる架橋剤（２―イミノチオラクトン）
下記式（XII）、 で表わされる架橋剤（Ｎ―アセチルホモシステイ
ン）、下記式（）、 で表わされる架橋剤（Ｓ―アセチルメルカプトコ
ハク酸無水物）、下記式（）、 〔X7およびＺの定義は式（）の場に同じ
である。〕 で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基であ
る。 Ｙで表わされる、結合している硫黄原子と共に
活性ジスルフイド基を形成し得る１価の有機基の
具体例としては、２―ピリジル基
【式】４―ピリジル基
【式】３―カルボキシ―４―ニトロ フエニル基
【式】等を挙げること ができる。X6またはX7で表わされる２価の有機
基は、化学的に不活性であれば特に限定されない
が、一般的には分岐を有するか有しないアルキレ
ン基、フエニレン基等から適宜選ばれる。Ｚで表
わされる活性エステルのアルコール残基の具体例
としては２，４―ジニトロフエノキシ基
【式】サクシンイミドキシ 基
【式】等を挙げることができる。 Ｑで表わされるイミドエステルのアルコール残基
の具体例としてはメトキシ、エトキシ基等を挙げ
ることができる。Ｒで表わされるハロゲン原子の
具体例としては塩素、臭素等を挙げることができ
る。 架橋剤の具体例としては、式（）で表わされ
る架橋剤として、Ｎ，N′―（１，２―フエニレ
ン）ジマレイミド、Ｎ，N′―（１，４―フエニ
レン）ジマレイミド、４，4′―ビス（マレオイル
アミノ）アゾベンゼン、ビス（Ｎ―マレイミドメ
チル）エーテルを、式（）で表わされる架橋剤
として、Ｎ―サクシンイミジル３―（２―ピリジ
ルジチオ）プロピオネート、２，４―ジニトロフ
エニル４―（４―ピリジルジチオ）ブチレート
を、式（）で表わされる架橋剤として、メチル
３―（２―ピリジルジチオ）プロピオンイミデー
ト塩酸塩を、式（）で表わされる架橋剤とし
て、Ｎ―サクシンイミジル３―プロモプロピオネ
ートを挙げることができる。 本発明の細胞毒性蛋白複合体の内、式（）ま
たは（）で表わされる複合体を製造するには、
例えば蛋白複合体を構成する免疫グロブリンある
いはそのフラグメントとMOMのどちらか（任意
の一方の蛋白をPro1で他方の蛋白をPro2で表わ
す）に活性ジスルフイドを導入しておき、他方に
チオール基を導入あるいは生成させておき、両者
をジスルフイド結合であるいは架橋剤を用いて架
橋する方法をとることができる。すなわち、
Pro1に例えば式（）、あるいは式（）で表わ
される架橋剤を反応せしめ〔反応(1)，(2)〕るか、 式（）で表わされる架橋剤を反応させた後、
生成物（）をチオ亜硫酸イオンで処理〔反応
(3)〕するか、 あるいは、Pro1を式（XI）または（）で
表わされる架橋剤と反応せしめて生成した式（
）または式（）で表わされる蛋白、または
Pro1を式（）で表わされる架橋剤と反応せ
しめ、次いで脱アセチル化して生成した式（
）で表わされる蛋白を、チオール基を活性ジス
ルフイド基に変換する試薬〔例えば、２，2′―ジ
ピリジルジスルフイド
【式】４，4′―ジピリ ジルジスルフイド
【式】５，5′―ジチオ ビス（２―ニトロ安息香酸） 〕 で処理して〔反応(4)，(5)または(6)〕、活性ジスル
フイド基 〔Ｙの定義は式（）の場合と同じである。〕 が導入されたPro1〔式（），（），（―
１），（―１），（―２）または（―
３）で表わされる蛋白〕を得る。他方もう一方の
蛋白pro2より上記式(1)，(2)または(3)の如くして
作つた、下記式（），（XII）または（―
１）で表わされるジスルフイド基が導入された蛋
白のジスルフイド基を、例えば２―メルカプトエ
タノールまたはジチオスレイトール等のチオール
試薬で還元する〔反応(7)，(8)または(9)〕か、また
は は反応式(4)または(5)の第一段階の反応と同様にし
てチオール基が導入されたPro2〔式（XII），（
），（―１），（XII―１）または（XII
―２）で表わされる蛋白〕を得る〔式（），
（） または（―１）中のX7およびＲと式（
XII）または（XI）中のX7およびＲは同一で
もまたは互に異なつていてもよい〕。上記の如く
して製造したチオール基が導入されたPro2を、
同じく上記の如くして製造した活性ジスルフイド
基が導入されたPro1と反応させしめて式（）
または（）（共にｑ＝０）で表わされる本発明
の細胞毒性蛋白複合体を製造することができる。 式（）または（）で表わされる本発明の蛋
白複合体を製造するにはMOMを例えば式（
）で表わされる架橋剤と反応せしめ、式（
）で表わされるマレイミド基が導入された蛋白
を得、 これに反応式(7)，(8)，(9)または反応式(4)，(5)の
第一段階の反応または反応式(6)の第二段階の反応
の如くして製造したチオール基が導入された免疫
グロブリンまたはそのフラグメントを反応させて
製造することができる。 式（），（），（）または（）で表わされ
る本発明の蛋白複合体の一つの前駆物質はチオー
ル基を有する蛋白質であるが、かかるチオール基
は化学式で具体的に記した如く、外部から導入さ
れたチオール基の他、蛋白質自体がもともとチオ
ール基を有している場合にはそのチオール基、あ
るいはシスチンに基づくジスルフイド結合をもつ
ている場合には、そのジスルフイド基を還元して
生成させることができるチオール基でもよい。 上記の免疫グロブリンまたはそのフラグメント
とMOMの架橋反応において、免疫グロブリンま
たはそのフラグメント、或いはMOMに架橋剤を
反応させる場合は、架橋剤を反応せしめる蛋白１
モルに対し、架橋剤を１〜100モル用いるのが好
ましい。反応は免疫グロブリンまたはそのフラグ
メント、或いはMOMの、PH４〜９の緩衝液中蛋
白濃度が0.5〜100mg／ml（より好ましくは１〜20
mg／ml）になるように調製された溶液に、０〜50
℃で撹拌しながら架橋剤の水溶液または架橋剤が
水に溶けない場合には、架橋剤を少量の有機溶
媒、例えば、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、１，２―ジメトキシエタ
ン、メタノール、エタノール、アセトン等に溶か
した溶液を添加して行なわれる。反応時間は反応
スケール、反応条件によるが、一般に２日間以内
である。反応終了後、透析または分子ふるいのカ
ラムクロマトグラフイにより、未反応の架橋剤を
除いた後、得られた架橋剤が導入された蛋白溶液
に複合体のもう一方の構成々成である蛋白（また
は架橋剤により架橋用官能基が導入された蛋白）
のPH４〜９の緩衝液の溶液（好ましい蛋白濃度の
範囲は上に記載したのと同じである）を添加し
て、０〜50℃で反応せしめる。複合体の反応混合
物からの分離、精製は通常用いられる操作、例え
ば分子ふるいのカラムクロマトグラフイーによつ
て行なうことができる。なお、複合体の一方の成
分の蛋白の溶液に、架橋剤が導入された他方の部
分の蛋白の溶液を添加して複合体を製造すること
もできる。さらに、架橋剤が導入された蛋白を、
低分子の試薬で処理して特定の架橋用官能基を有
する蛋白に変換する場合（例えば架橋剤によつて
導入された活性ジスルフイド基をチオール基に変
換する場合）、或いは免疫グロブリンまたはその
フラグメント、或いは低分子試薬を用いMOMを
直接活性化誘導体に変換する場合（例えば免疫グ
ロブリンのフラグメントFab′のチオール基を活
性ジスルフイドに変換する場合）の反応条件も上
記の蛋白に架橋剤を反応せしめる場合の反応条件
と同様である。 本発明における蛋白複合体を活性成分とする細
胞毒剤は患者に対し、静注、動注等の投与方法に
より投薬される。 製剤は、無菌の水性液剤として与えられる。 このような製剤は、必要に応じ、例えば、血清
アルブミン、グリシン、グルコース等の安定剤を
含むことができる。これらの溶液剤は、例えば除
菌濾過、γ線照射等の処理を適宜行うことによつ
て無菌化される。また無菌の凍結乾燥製剤を製造
し、使用直前に注射用蒸留水に溶解して使用する
ことができる。 本発明の蛋白複合体の有効投与量は年令、性
別、患者の状態により異なるが、一般には１日10
〜104μg／人の範囲から適宜選択される。投与は
必要により反復して行われる。 本発明の細胞毒性蛋白複合体より成る細胞毒剤
のマウスに対する毒性は、LD50値で約１mg／Kg
である。 以下実施例により本発明を詳述する。 実施例 １ (イ) ツルレイシの種子より蛋白合成阻害活性を有
する蛋白質（MOM）の抽出・精製 ツルレイシの種子9.2ｇを、乳バチですりつぶ
し、エーテルで脂質を除去した。こうして得た脱
脂粉体に、５ｍＭリン酸緩衝液―0.2M塩化ナト
リウム溶液（PH7.2）50mlを加えて、４℃で一晩
撹拌を続けた。その後、遠心分離によつて不溶物
を除去し、硫安を30％飽和になるように加えた。
０℃で１時間撹拌後、遠心分離によつてその上清
を取り、この上清にさらに硫安を加えて70％飽和
として、０℃で２時間撹拌後、遠心分離によつて
その沈澱を分離した。沈澱物に５mlの５ｍＭリン
酸緩衝液（PH6.5）を加えて溶解し、同じリン酸
緩衝液に対して十分に透析した。その透析内液
を、同じリン酸緩衝液で平衡化したセフアデツク
スG150スーパーフアイン・カラムクロマトグラ
フイー（カラム・サイズ84cm×2.5cm）にかけて、
分子量約３万の位置に流出する蛋白をプールし
た。これをCMセフアデツクスＣ―50カラムクロ
マトグラフイ（カラム・サイズ1.6cm×34cm）に
かけた。レジンは５ｍＭリン酸緩衝液（PH6.5）
に平衡化されているが、0.05Mリン酸緩衝液（PH
6.5）、0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）さらに0.2Mリ
ン酸緩衝液（PH6.5）という具合に塩濃度を上げ
ていくと、0.10MのところでMOMが流出してき
た。この分画の蛋白は、分子量約23000であり、
他の蛋白を含まぬことはラウリル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下SDS―
PAGEと略す）によつて確認された。SDS―
PAGEの方法はウエーバーとオズホーン（K.
Weber and M.Osborn）、ジヤーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー（J.Biol.Chem）、第
244巻、第4406―4412頁、1969年の方法に基いた。 (ロ) Ｎ―〔３―（２―ピリジルジチオ）プロピオ
ニル〕―MOMの調製 上記(イ)の如く抽出精製されたMOM3.8mgを含
む0.02Mリン酸緩衝液―0.14M塩化ナトリウム―
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下、EDTA
と略す）溶液（PH7.5）1.4mlに、９ｍＭのＮ―サ
クシンイミジル３―（２―ピリジルジチオ）プロ
ピオネート（SPDP）を含むエタノール溶液を
0.05mlを加え、室温で30分間反応させた。過剰の
試薬を除去するために、上記リン酸緩衝液（PH
7.5）中でセフアデツクスG25カラムクロマトグ
ラフイにかけた。こうしてＮ―〔３―（２―ピリ
ジルジチオ）プロピオニル〕基が平均として約２
個導入されたMOMを得た。 (ハ) マウス白血病L1210に特異的な免疫グロプリ
ンの調製 DBA／2Crマウスで継代されたマウス白血病細
胞L1210を、DBA／2Crマウスの腹水より取り出
し、その約108個をフロイント完全アジユバンド
とのエマルジヨンとし、家兎に静脈注射した。そ
の後更に、１週間間隔で３回、それぞれ106個の
L1210細胞をアジユバントと共に皮下注射し、最
終投与日から７日後および10日後に採血した。得
られた血液をプールし、血清を分離し、その血清
を56℃、30分間加熱、非働化した。こうして得ら
れた抗L1210血清200mlに、硫安の飽和水溶液200
mlを加えて、生じた没澱を遠心分離によつて分取
した。この沈澱を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.6）
50mlに溶解し、更に同緩衝液に対して十分に透析
した。この透析内液を同じ緩衝液で平衡化した
DEAEセルロースカラムクロマトグラフイー（カ
ラムサイズ３cm×94cm）にかけて、未吸着分画と
して抗L1210IgGを含む溶液を得た。 (ニ) 免疫グロブリンよりＦ（ab′）2フラグメントの
分離 上記(ハ)の如くして得られた抗L1210IgGの1.2ｇ
を0.1M酢酸緩衝液（PH4.5）40mlに溶解し、24mg
のペプシンを添加して、37℃で約18時間分解した
後、分解生成物を生理食塩水中でセフアデツクス
G200カラムクロマトグラフイー（カラムサイズ
3.5cm×140cm）にかけて、分子量10万のところに
流出する蛋白を取り出した。これはSDS―PAGE
にかけると、第４図の如く純粋なＦ（ab′）2フラグ
メントであることが確認された。 (ホ) Fab′フラグメントの調製 上記(ニ)の如くして得られたＦ（ab′）2フラグメン
ト13.0mgを含む0.01Mトリス・塩酸―0.14M塩化
ナトリウム―２ｍMEDTA溶液（PH8.3）1.0mlに
150ｍＭの２―メルカプトエタノール水溶液を
0.01ml加えて、37℃で１時間還元した。反応後、
その溶液を５ｍＭ酢酸緩衝液―0.14M塩化ナトリ
ウム―１ｍMEDTA溶液（PH5.5）（以下、ANE
緩衝液と略す）で平衡化したセフアデツクスG25
カラムクロマトグラフイー（1.0cm×20cm）にか
けて２―メルカプトエタノールを除去し、チオー
ル基１個を有するFab′フラグメントを得た。（第
２図のデイスク１参照）。 (ヘ) Fab′フラグメントとMOMとのジスルフイド
結合を含む共有結合による複合体の調製 Ｎ―〔３―（２―ピリジルジチオ）プロピニ
ル〕―MOM約３mgを含む0.02Mリン酸緩衝液―
0.14M塩化ナトリウム―１ｍＭ EDTA溶液（PH
7.5）3.0mlと１個のチオール基をもつたFab′フラ
グメント4.1mgを含む上記リン酸緩衝液1.0mlとを
混合し、室温で20時間反応させた。反応液を、生
理食塩水中で、セフアデツクスG150スーパーフ
アイン・カラムクロマトグラフイー（1.3cm×95
cm）にかけた。その結果、第１図に示す如く、
280mmの吸光度を測ると、５つのピークが現れた。
これらを解析するためにSDS―PAGEにかけたと
ころ、第２図に示した如き結果が得られた。第２
図においてデイスク１はFab′の、デイスク２は
MOMのバンドのパターンである。 第１図のピークの主成分はデイスク３の如
く、分子量が約12万であり、２―メルカプトエタ
ノールによる還元によりデイスク７の如く
Fab′フラグメント（デイスク１に対応）とMOM
（デイスク２に対応）とに分れた、両者の比は約
２対１である。従つてピークの蛋白はFab′フ
ラグメント２分子とMOM1分子とが結合した複
合体である。ピークの蛋白はデイスク４の如
く、分子量が約７万であり、２―メルカプトエタ
ノールによる還元によりデイスク８の如く
Fab′フラグメントとMOMが１対１の割合で分離
された。従つてピークの蛋白はFab′フラグメ
ント１分子とMOM1分子とが結合した複合体で
ある。ピーク，の蛋白はデイスク５，６の如
く、それぞれ未反応のFab′フラグメントとMOM
である。 (ト) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性 上記(ヘ)の如くして得られた蛋白複合体の標的細
胞L1210に対する細胞毒性を検討した。 96穴のマイクロプレートに、３×104個／mlの
L1210細胞を含む培地RPMI1640（牛胎児血清10
％、２―メルカプトエタノール0.02ｍＭとカナマ
イシン0.1mg／mlを含むもの）0.10mlを分注し、
種々の濃度に希釈した被検サンプル0.01mlを加
え、37℃で５％CO2雰囲気下で42時間培養後、ト
リパンブルー染色法により、生細胞数を測定し
た。その結果、第３図に示す如く、Fab′，MOM
あるいは両者の１対１混合液にはその蛋白濃度
10-6モル／リツトルでさえもほとんど細胞毒性が
認められなかつた。しかし、上記(ヘ)で精製された
蛋白複合体（第１図のピークに含まれる蛋白）
は著しい細胞毒性が認められた。なお、別の実験
において、第１図のピークに含まれる蛋白複合
体にもピークの場合と同じか若干弱い細胞毒性
が認められた。 実施例 ２ (イ) チオール基を導入したMOMの調製 前記実施例１(ロ)に記載した方法で調製されたＮ
―〔３―（２―ピリジルジチオ）プロピオニル〕
―MOM6mgを含む0.1Mトリス塩酸―２ｍＭ
EDTA（PH8.3）緩衝液3.3mlに、２―メルカプト
エタノールを最終濃度５ｍＭになるように加え
て、37℃で１時間還元した後、ANE緩衝液で平
衡化されたセフアデツクスG25カラムクロマトグ
ラフイーにかけて、低分子生成物を除去し、チオ
ール基を平均として約２個をもつたMOMを得
た。 (ロ) マレイミド基を導入したFab′の調整 実施例１の(ホ)で調製されたFab′フラグメント
8.2mgを含むANE緩衝液2.0mlと、０―フエニレン
ジマレイミドを飽和溶解させたANE緩衝液2.0ml
とを混合し、室温で30分間反応させた後、ANE
緩衝液で平衡化されたセフアデツクスG25カラム
クロマトグラフイにかけて、未反応の試薬を除去
し、マレイミド基１個をもつFab′フラグメント
を得た。 (ハ) チオール基をもつMOMとマレイミド基をも
つFab′フラグメントの架橋による複合体の調
製 チオール基をもつMOM2.5mgを含むANE緩衝
液1.1mlと、マレイミド基をもつFab′フラグメン
ト４mgを含むANE緩衝液2.3mlと、0.3Mリン酸緩
衝液―10ｍＭ EDTA（PH6.5）0.24mlを混合し、
４℃で22時間反応させた。この反応液を実施例１
の(ヘ)で用いられたセフアデツクスG150スーパー
フアインカラムクロマトグラフイーにかけて
Fab′とMOMが２対１で結合した複合体、１対１
で結合した複合体を分離した。それらの分子量は
SDS―PAGEで実施例１の(ヘ)の如く確認され、さ
らに実施例１の(ト)の方法でL1210細胞に対する細
胞毒性を確認した。 実施例 ３ (イ) マレイミド基を導入したMOMの調製 実施例１の(イ)の如くして調製されたMOM4.4
mgを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）1.0mlに、メ
タマレイミド安息香酸Ｎ―ヒドロキシサクシニイ
ミドエステル7.0mg／mlを溶解したＮ，Ｎ―ジメ
チルホルムアミド溶液0.03mlを加えて、室温で30
分間反応した後、ANE緩衝液で平衡化したセフ
アデツクスG25カラムクロマトグラフイにかけ
て、未反応試薬を除去し、マレイミド基を導入し
たMOMを得た。 (ロ) マレイミド基をもつMOMとチオール基をも
つFab′フラグメントの架橋による複合体の調
製 上記(イ)によつて得られたマレイミド基をもつ
MOM2.6mgを含むANE緩衝液1.0mlと、実施例１
の(ホ)で得られた、チオール基１個をもつFab′フ
ラグメント4.1mgを含むANE緩衝液1.0mlとを混合
し、室温で一晩反応させた。この反応液を実施例
１の(ヘ)で用いられたセフアデツクスG150スーパ
ーフアイン・カラムクロマトグラフイーにかけ
て、Fab′2分子とMOM1分子とが結合した複合体
およびFab′1分子とMOM1分子が結合した複合体
を分離した。なお、この２つ以外にもいくつかの
未同定の複合体が認められた。 実施例 ４ (イ) Ｎ―〔３―（２―ピリジルジチオ）プロピオ
ニル〕―Ｆ（ab′）2フラグメントの調製 実施例１の(ニ)の如く調製されたＦ（ab′）2フラグ
メント11.2mgを含む0.02Mリン酸緩衝液―0.14M
塩化ナトリウム―１ｍＭ EDTA（PH7.5）1.2ml
に、10ｍＭのSPDPを含むエタノール溶液0.04ml
を加えて、室温で30分間反応し、過剰の試薬を除
去すべく上記リン酸緩衝液で平衡化したセフアデ
ツクスG25カラムクロマトグラフイーにかけた。
こうして、Ｎ―〔３―（２―ピリジルジチオ）プ
ロピオニル〕Ｆ（ab′）2フラグメントを得た。 (ロ) Ｎ―〔３―（２―ピリジルジチオ）プロピオ
ニル〕―Ｆ（ab′）2フラグメントとチオール基を
もつたMOMとの架橋による複合体の調製 上記(イ)の方法で調製されたＮ―〔３―（２―ピ
リジルジチオ）プロピオニル〕―Ｆ（ab′）2フラグ
メント9.3mgを含む0.02Mリン酸緩衝液―0.14M塩
化ナトリウム―１ｍＭ EDTA溶液（PH7.5）2.4
mlと、実施例２の(イ)の如くして調製された、チオ
ール基をもつMOM3.2mgを含むANE緩衝液1.7ml
を混合し、室温で20時間反応させた。この反応混
合液を実施例１の(ヘ)の如く、セフアデツクス
G150スーパーフアイン・カラムクロマトグラフ
イーにかけて、第30，31および32分画をプールし
た。これをSDS―PAGEにかけて第４図にした如
き結果が得られた。こ分画に含まれる蛋白はデイ
スク３のバンドのパターンを示し、原料のＦ
（ab′）2フラグメント（デイスク１に対応）の他に
分子量約12万の生成物と、分子量のより大きな生
成物が少量認められた。この蛋白を２ｍＭの２―
メルカプトエタノールで37℃１時間還元すると、
Fab′フラグメントとMOM（デイスク２に対応）
とに解離した。これらの結果から、主な生成物
（分子量12万）はＦ（ab′）2フラグメントとMOM
とがジスルフイド結合を介して結合した複合体で
あることがわかる。 この複合体は実施例１で得られたFab′との複
合体よりもL1210細胞に対し、若干強い細胞毒性
を有していた。 実施例 ５ (イ) マレイミド基を導入したＦ（ab′）2フラグメン
ト 実施例１の(ニ)の如く調製されたＦ（ab′）2フラグ
メント1.5mgを含む0.1Mリン酸緩衝液1.0mlに、メ
タマレイミド安息香酸Ｎ―ヒドロキシサクシニイ
ミドエステル7.0mg／mlを溶解したＮ，Ｎ―ジメ
チルホルムアミド溶液0.05mlを加えて、室温で30
分間反応した。反応液をANE緩衝液で平衡化し
たセフアデツクスG25カラムクロマトにかけて、
未反応の試薬を除去し、マレイミド基をもつＦ
（ab′）2フラグメントを得た。 (ロ) マレイミド基をもつＦ（ab′）2とチオール基を
もつPAPとの架橋による複合体の調製 上記(イ)によつて得られた、マレイミド基をもつ
Ｆ（ab′）2フラグメント7.6mgを含むANE緩衝液2.0
mlと、実施例２の(イ)の如くして調製された、チオ
ール基をもつMOM2.7mgを含むANE緩衝液1.5ml
とを混合し、室温で24時間反応させた。その反応
混合液を実施例１の如く、セフアデツクスG150
スーパーフアインカラムクロマトグラフイーにか
けた。各分画の280mmを測定すると、実施例４の
(ロ)の場合と同じように２つのピークが認められ
た。分子量の大きな蛋白を含む最初のピークを
SDS―PAGEにかけた結果、分子量約12万の主生
成物、すなわちＦ（ab′）2のマレイミド基とMOM
のチオール基とが結合することによつて生成した
複合体を確認した。この複合体を含む分画も、実
施例１の(ト)の如く細胞毒性を検討すると、標的細
胞L1210に毒性をもつことが判明した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１(ハ)で得た反応生成物の、セ
フアデツクスG150スーパーフアイン・カラムク
ロマトグラフイーにおける蛋白流出パターンであ
る。第２図は、６％ゲル内でのSDS―PAGEのパ
ターンであり、デイスク１はFab′、デイスク２
はMOM、デイスク３は第１図のピーク、デイ
スク４は第１図のピーク、デイスク５は第１図
のピーク、デイスク６は第１図のピーク、デ
イスク７は第１図のピークの還元生成物、デイ
スク８は第１図のピークの還元生成物をSDS―
PAGEにかけた場合の得られるバンドのパターン
である。斜線は濃度の低いバンドを示している。
第３図は、実施例１(ト)で行なつたL1210細胞に対
する蛋白複合体の細胞毒性を調べた結果であり、
42時間後の生細胞数を、添加した蛋白複合体また
はその構成蛋白の濃度に対して示したグラフであ
る。第４図は、６％ゲル内でのSDS―PAGEのパ
ターンであり、デイスク１はＦ（ab′）2デイスク２
はMOM、デイスク３は実施例４(ロ)で得られたＦ
（ab′）2とMOMの複合体、デイスク４はその複合
体の２―メルカプトエタノールによる還元生成物
をSDS―PAGEにかけた場合の得られるバンドの
パターンである。斜線は濃度の低いバンドを示し
ている。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 殺すべき細胞のもつている特定の抗原と特異
    的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグ
    メントと、ツルレイシ（Momordica charantia）
    から得られる、ラウリル硫酸ナトリウム・ポリア
    クリルアミド・ゲル電気泳動で測定した分子量が
    約23000の蛋白合成阻害活性を有する蛋白質をジ
    スルフイド結合、またはスルフイド結合させてな
    る、細胞毒性蛋白複合体を活性成分とする細胞毒
    剤。 ２ 下記式（）または（）で表される、特許
    請求の範囲第１項記載の細胞毒性蛋白複合体を活
    性成分とする細胞毒剤。 Ab〔―(X2)p―S1―(X3)q―S2―X4―MOM〕o …（） 〔Ab―(X2)p―S1―(X3)q―S2―X4〕―oMOM …（） ［Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメン
    トを、MOMはツルレイシから得られる、ラウリ
    ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電
    気泳動で測定した分子量が約23000の蛋白合成阻
    害活性を有する蛋白質を、X2，X3およびX4は２
    価の有機基を、S1およびS2は硫黄原子を、ｐおよ
    びｑは同一または異なつて０または１を、ｎは１
    〜３の整数を表す。］ ３ 下記式（）または（）で表される、特許
    請求の範囲第１項記載の細胞毒性蛋白複合体を活
    性成分とする細胞毒剤。 ［Ab，MOM，X2，S1，ｎおよびｐの定義は
    式（）および式（）の場合と同じ。X5は２
    価の有機基を表す。］ ４ 免疫グロブリンまたはそのフラグメントとツ
    ルレイシから得られる、ラウリル硫酸ナトリウ
    ム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で測定し
    た分子量が約23000の蛋白合成阻害活性を有する
    蛋白質のいずれか一方の蛋白に導入したジスルフ
    イド基に、他方の蛋白に発生または導入したチオ
    ール基を反応せしめることを特徴とする、下記式
    （―１）または（―１）で表される細胞毒性
    蛋白複合体を活性成分とする細胞毒剤の製造法。 Ab〔―(X2)p―S1―S2―X4―MOM〕o …（―１） 〔Ab―(X2)p―S1―S2―X4〕―oMOM …（―１） ［Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメン
    トを、MOMはツルレイシから得られるラウリル
    硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気
    泳動で測定した分子量が分子量が約23000の蛋白
    合成阻害活性を有する蛋白質を、X2およびX4は
    ２価の有機基を、S1、およびS2は硫黄原子を、ｎ
    は１〜３の整数を、ｐは０または１を表す。］ ５ 発生または導入されたチオール基を有する免
    疫グロブリンまたはそのフラグメントと、導入さ
    れたチオール基を有するツルレイシから得られ
    る、ラウリル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
    ド・ゲル電気泳動で測定した分子量が約23000の
    蛋白合成阻害活性を有する蛋白質とを、チオール
    基と反応し得る官能基を２個有する架橋剤を用い
    て結合することを特徴とする、下記式（―２）
    または（―２）で表される細胞毒性蛋白複合体
    を活性成分とする細胞毒剤の製造法。 Ab〔―(X2)p―S1―X3―S2―X4―MOM〕o …（―２） Ab〔―(X2)p―S1―X3―S2―X4〕―oMOM …（―２） ［Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメン
    トを、MOMはツルレイシから得られるラウリル
    硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気
    泳動で測定した分子量が約23000の蛋白合成阻害
    活性を有する蛋白質を、X2，X3およびX4は２価
    の有機基を、S1、およびS2は硫黄原子を、ｎは１
    〜３の整数を、ｐは０または１を表す。］ ６ 発生または導入されたチオール基を有する免
    疫グロブリンまたはそのフラグメントと、導入さ
    れたマレイミド基を有するツルレイシから得られ
    る、ラウリル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
    ド．ゲル電気泳動で測定した分子量が約23000の
    蛋白合成阻害活性を有する蛋白質とを反応させる
    ことを特徴とする、下記式（）または（）で
    表される細胞毒性蛋白複合体を活性成分とする細
    胞毒剤の製造法。 ［Abは免疫グロブリンまたはそのフラグメン
    トを、MOMはツルレイシから得られる、ラウリ
    ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電
    気泳動で測定した分子量が約23000の蛋白合成阻
    害活性を有する蛋白質を、X2およびX5は２価の
    有機基を、S1は硫黄原子を、ｐは０または１を表
    し、ｎは１〜３の整数を表す。］
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