JPH04346935A - 抗癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新しい作用機序を有す
る抗癌剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
抗癌剤投与により生じる副作用軽減と、効果増強を図る
ために、腫瘍細胞を選択的に識別する抗体と毒素の接合
体を利用することが研究されている。

【０００３】この研究によれば、毒素と抗体の接合体は
、抗体が腫瘍細胞上に存在する抗原と複合体を形成し、
この複合体が細胞内に陥入することにより毒素を細胞内
に導入し、腫瘍細胞の蛋白質合成を阻害するという作用
機序を有する。このときの毒素はリシンＡ鎖に代表され
る毒素が用いられる。

【０００４】しかし、従来の方法では細胞内に陥入する
モノクローナル抗体が必要であるが、このような性質を
もった抗体は少なく固形癌に有効な抗癌剤が少ないこと
から新しい作用機序をもつ抗癌剤の開発が望まれている
。

【０００５】本発明は、前記した事情に鑑みてなされた
ものであり、その目的は毒素として細胞内に取込まれな
くても腫瘍細胞膜を特異的に破壊する新しい作用機序を
有する抗癌剤を提供するにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、前記した目的
を達成するため、ホスホリパーゼ活性を有する毒蛋白質
と腫瘍細胞を識別する抗体との接合体からなることを特
徴としている。

【０００７】

【作用】本発明は前記した構成になっているので、抗体
が腫瘍細胞上に存在する抗原と複合体を形成すると共に
、ホスホリパーゼ活性を有する蛋白質が細胞膜中のリン
脂質を加水分解して腫瘍細胞を破壊する。

【０００８】

【実施例】ウメボシイソギンチャク（Ａｃｔｉｎａ　ｅ
ｑｕｉｎａ　Ｌ．）よりホスホリパーゼ活性を有する毒
蛋白質を抽出し、これとヒト大腸癌細胞株ＳＫＣＯ−１
を識別する抗体（ＣＯ４１３）との接合体を次の方法で
調製した。

【０００９】ホスホリパーゼ活性を有する毒蛋白質の調
製：ウメボシイソギンチャクを細切にし、さらにヒスト
コロン（日音医理科器械製作所製）で均質に細分化する
。この細分化されたものを凍結（−８０℃），解凍して
細胞を破壊した後、遠心分離し、その上澄をアセトン中
に移し、沈殿物を生じさせる。次で、この沈殿物を１ミ
リモル酢酸で溶解し、セファデックスＧ−５０（ファル
マシア社製）カラムにかける。活性分画を１０ミリモル
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析し、同じ緩衝液で平
衡化したＣＭ−セルロース（ワットマン社製）に吸着さ
せた後、上記緩衝液に塩化ナトリウムを連続的に加え溶
出させる。各溶出分画の吸光度（波長２８０ｎｍ）を測
定したところ、吸光度曲線において主に２つのピークが
観察された。本発明に係るホスホリパーゼ活性を有する
毒素蛋白質は塩化ナトリウム濃度が０．２モルの時に溶
出される最も大きいピークを示す分画として得られた。 このように精製された毒蛋白質の純度は、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動により９５％以上であること
が確認された。なお、上記精製毒蛋白質の毒性活性は、
赤血球の溶血速度で評価し、充分な活性を有することを
確認した。

【００１０】腫瘍細胞を識別する抗体の調製：ヒト大腸
癌細胞株ＳＫＣＯ−１を識別する抗体（ＣＯ４１３）を
次のようにして調製した。大腸癌患者の腹水中に浮遊し
ている癌細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫し、その脾
細胞とマウス骨髄細胞を融合させた。この融合はポリエ
チレングリコール（分子量４０００，シグマ社製）中で
行い、スクリーニングはＥＬＩＳＡ法で行った。このと
きの抗原は大腸癌細胞の膜蛋白質であるＣＥＡ分子であ
る。得られたハイブリドーマを１５％牛血清を含んだＲ
ＰＭＩ１６４０培地で増殖し、Ｘ−線処理した後、ブリ
スタン投与したＢａｌｂ／ｃマウス腹腔内に細胞（１０
７　／匹）を投与し、約３週間後、腹水を取り遠心分離
を行い上澄をプロテインＡカラム（ファルマシア社製）
にかけて精製し、本抗体（ＣＯ４１３）を得た。

【００１１】毒蛋白質と腫瘍細胞を識別する抗体との接
合体の調製：本調製は弘田ら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　４９，７１０６頁，１９８９年）の方法に準
じて行った。本抗体にジチオール基を導入するため、抗
体の１０倍量のモル濃度のＮ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で
抗体を修飾する。 この際未反応のＳＰＤＰはセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア社製）を充填したカラムに通すことによって
除去される。また、前記調製により得られた毒蛋白質に
チオール基を導入するため、還元状態で、２−イミノチ
オレーンで毒蛋白質を修飾した。この際未反応の２−イ
ミノチオレーンはセファデックスＧ−２５を充填したカ
ラムに通して除去した。修飾された抗体と毒蛋白質は、
等モル濃度で混合され、４℃で２０時間反応後、ヨード
アセトアミドを添加して反応を停止させた。反応生成物
の精製は、ヨードアセトアミド液に３５ミリモル塩化ナ
トリウムを含んだ５ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ６．５
）で透析を行った後、同じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セ
ルロース（ＣＭ５２）（ワットマン社製）を充填したカ
ラムに吸着させ、その後連続的に塩化ナトリウム濃度を
増加することにより、抗体と毒蛋白質との接合体を溶出
させることによって行った。このようにして本接合体を
得た。

【００１２】実験例： 本接合体をヒト大腸癌細胞株ＳＫＣＯ−１に投与して細
胞株に対する殺細胞効果を判定した。この判定はトリパ
ンブルー（ｔｒｉｐａｎ　ｂｌｕｅ）　を用いて経時的
に生存細胞を計測することによって行った。

【００１３】同時に比較例として前記毒蛋白質単独（比
較例１），前記抗体（ＣＯ４１３）単独（比較例２）あ
るいは、前記毒蛋白質とマウスＩｇＧ（抗体）との接合
体（比較例３）をそれぞれヒト大腸癌細胞株ＳＫＣＯ−
１に投与し、前記したと同様にして細胞株に対する殺細
胞効果を判定した。なお、毒蛋白質とマウスＩｇＧとの
接合体は、前記したＣＯ４１３−毒蛋白質接合体と同様
な方法で調製した。

【００１４】その結果を図１乃至図４に示す。図１は本
接合体の結果を示し、図２乃至図４はそれぞれ比較例１
，２及び３の結果を示す。図１において各線図ａ〜ｅは
本接合体の投与濃度の相違による結果を示し、各線図の
毒蛋白質置換濃度は、ａ：２．５μｇ／ｍｌ，ｂ：５μ
ｇ／ｍｌ，ｃ：１０μｇ／ｍｌ，ｄ：５０μｇ／ｍｌ，
およびｅ：１００μｇ／ｍｌをそれぞれ示す。図２にお
いて、各線図ａ〜ｅは比較例１の毒蛋白質濃度の相違に
よる結果を示し、各線図の毒蛋白質濃度はａ：１０μｇ
／ｍｌ，ｂ：２０μｇ／ｍｌ，ｃ：４０μｇ／ｍｌ，ｄ
：８０μｇ／ｍｌ，およびｅ：不投与（コントロール）
をそれぞれ示す。図３において、各線図ａ〜ｃは比較例
２の抗体（ＣＯ４１３）濃度の相違による結果を示し、
各線図の抗体濃度は、ａ：５００μｇ／ｍｌ，ｂ：１０
００μｇ／ｍｌ，およびｃ：不投与（コントロール）を
それぞれ示す。また、図４において、各線図ａ〜ｃは比
較例３の接合体の投与濃度の相違による結果を示し、各
線図における毒蛋白質置換濃度はａ：４０μｇ／ｍｌ，
ｂ：８０μｇ／ｍｌ，およびｃ：不投与（コントロール
）をそれぞれ示す。

【００１５】これらより、本接合体（本発明）は、毒蛋
白質濃度が増加するにつれて殺細胞効果が増大すること
が理解できる。そしてこの本接合体の殺細胞効果は、比
較例１（毒蛋白質単独）および，比較例３（毒蛋白質−
マウスＩｇＧ接合体）よりも毒蛋白質濃度が少ない量で
、かつ投与から短時間で奏することができる。即ち、本
接合体はその毒蛋白質濃度が比較例１，および比較例３
の毒蛋白質濃度の数分の１から数十分の１で殺細胞効果
を示すので副作用も少なく、かつ投与から３０分以内で
ヒト大腸癌細胞株ＳＫＣＯ−１を壊滅させることができ
る（図１，ｅ参照）。

【００１６】これに比べて、比較例２および３は、図３
および図４に示すように濃度を増加させても殺細胞効果
を示さず、抗体（ＣＯ４１３）単独および毒蛋白質とマ
ウスＩｇＧの接合体はヒト大腸癌細胞株ＳＫＣＯ−１に
対して殺細胞効果がないことが理解できる。殊に、毒蛋
白質とマウスＩｇＧとの接合体はマウスＩｇＧがヒト大
腸癌細胞株ＳＫＣＯ−１を識別する抗体でないことによ
る。

【００１７】本発明は前記した実施例に限定されるもの
ではなく、同じ作用機序を有する次のような技術的等価
物を含むものである。まず、抗体に関しては、マウスモ
ノクローナル抗体のみでなくヒト型モノクローナル抗体
を用い得る。次に毒蛋白質に関しては、ウメボシイソギ
ンチャク以外のものから得られるホスホリパーゼ活性を
有する毒蛋白質，および、ホスホリパーゼ活性を有する
遺伝子工学的手法により得られた毒蛋白質をも用い得る
。さらに、腫瘍細胞に関しては、大腸癌のみでなく胃癌
，乳癌，肝癌など各種腫瘍細胞に対しても充分適応可能
である。

【００１８】

【発明の効果】以上述べたように、本発明は、毒素とし
て細胞内に取込まれなくても腫瘍細胞膜を特異的に破壊
する新しい作用機序を有し、かつ、少量の毒蛋白質濃度
で短時間に充分な殺細胞効果を奏するので副作用も少な
い有用な抗癌剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の殺細胞効果を示すグラフである。

【図２】毒蛋白質単独の殺細胞効果を示すグラフである
。

【図３】抗体（ＣＯ４１３）単独の殺細胞効果を示すグ
ラフである。

【図４】毒蛋白質とマウスＩｇＧの接合体の殺細胞効果
を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ホスホリパーゼ活性を有する毒蛋白質
   と腫瘍細胞を識別する抗体との接合体からなることを特
   徴とする抗癌剤。