KR0152272B1 - 암 진단 및 치료용 면역접합체 - Google Patents

암 진단 및 치료용 면역접합체

Info

Publication number
KR0152272B1
KR0152272B1 KR1019900700479A KR900700479A KR0152272B1 KR 0152272 B1 KR0152272 B1 KR 0152272B1 KR 1019900700479 A KR1019900700479 A KR 1019900700479A KR 900700479 A KR900700479 A KR 900700479A KR 0152272 B1 KR0152272 B1 KR 0152272B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
gelonin
antibody
tumor
antibodies
Prior art date
Application number
KR1019900700479A
Other languages
English (en)
Other versions
KR900701321A (ko
Inventor
지. 로젠블룸 마이클
둘벡코 레나토
로스 알렌 더블유.
Original Assignee
제임스 에프. 웨일러
리서치 디벨롭먼트 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제임스 에프. 웨일러, 리서치 디벨롭먼트 파운데이션 filed Critical 제임스 에프. 웨일러
Publication of KR900701321A publication Critical patent/KR900701321A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR0152272B1 publication Critical patent/KR0152272B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
암진단 및 치료용 면역 접합체
[배경]
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 면역접합체 분야에 관한 것이고, 더욱 특히. 암 진단 및 치료에 있어서의 면역접합체의 용도에 관한 것이다.
또한. 본 발명은 모노클로날 항체(MoAb)와 리보좀 억제 단백질인 겔로닌과의 세포독성 접합체를 사용하여 유방암 및 자궁암을 치료하는 것에 관한 것이다
[발명의 배경]
유방암 및 자궁암은 서방세계 여성들의 악성 종양으로 인한 사망원인중 가장 비중있는 두 종류의 암이다. 국소적(localized) 악성 종양의 외과적 제거는 단지 상기 질환이 1차병변외에는 더이상 확산되지 않는 경우에만 유효한 것으로 밝혀졌다. 일단 질환이 확산되면, 외과적 밤법은 발병 세포 또는 악성 종양 세포를 말살 시키기 위해 기타의 많은 일반적인 방법으로 보강되어야 한다. 조사 또는 화학요법과 같은 통상적으로 사용되는 보강법의 대부분은 중양 세포에만 국한되지 않고, 이들 방법이 정상세포에 비하여 악성 종양 세포에 대하여 더욱 큰 사멸효과를 나타낼지라도 종종 어느 정도는 정상 세포에 영향을 미친다.
많은 종양 세포는 정상 세포에 의해서는 극히 약하게 발현되거나 전혀 발현되지 않는 항원 또는 항원성 결정인자를 발현한다. 몇몇 종양 세포는 배아 세포유형에 의해서는 발현되지만 성숙한 동물의 정상 세포에 의해서는 발현되지 않는 항원을 발현한다. 이러한 비정상적 발현 항원은 종양-연관된 항원으로서 공지되어 있다. 특정 항원이 하나 이상의 종양에 의해 발현될지라도. 대개는 이를 발현하는 특정 종양의 모든 세포 또는 대다수의 세포에 의해 발현된다는 점에서 종양에 의해 발현된 항원은 특이적이다.
종양 세포는 하나 이상의 종양-연관된 항원을 발현할 수 있다. 이들 종양-연관된 항원은 세포 표면상에 발현되거나(세포 표면 항원), 종양 세포에 의해 분비될 수 있거나(분비된 항원), 세포내에 보유될 수 있다(세포내 항원) 이들 종양-연관된 항원의 존재 여부를 이용하여 종양을 검출, 진단 및 국소화할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서는, 종양 세포상의 종양-연관된 항원의 존재로 인해 증양 세포에 특정의 약물 및 치료 수단을 특이적으로 표적화할 수 있었다.
항체는 외래 항원 또는 항원 결정인자에 대하여 동물의 면역 시스템에 의해 정상적으로 생성된 단백질이다. 항체는 이들이 유도되는 특이 항원과 결합한다. 특이 항원 또는 항원 결정인자에 대해 유도되는 모노클로날 항체는 대량으로 제조 될수있다.
화학치료제를 종양 세포에 대해서는 표적화하면서 정상 세포에 대해서는 이들의 약제 효과를 감소시키는 한가지 방법은, 정상 세포상에서는 발생하지 않고 종양 세포상에서의 항원에 대해서만 유도되는 MoAb를 개발함으로써 가능하게 되었다.
악성 종양 질환을 국소화하고 치료하기 위하여 항체를 표지시킬 수 있다.
약물과 커플링된 항체를, 항체가 유도되는 특이 종양 세포 유형에 대해 약물이 표적화되는 운반 시스템으로서 사용할 수 있다. 항체를 또한 독소와 커플링시킬 수있는데, 이로써 특이 종양 세포에 직접 독소를 표적화하는 운반 시스템으로서 작용할수 있다.
겔로닌은 겔로늄 멀티포륨(Gelonium Multiforum)의 종자로부터 정제된 당단백질(분자량 29,000 내지 30,000)이다. 겔로닌은 강력한 리보좀 불활성화 식물 독소의 한 부류에 속한다. 이러한 부류의 리보좀 불활성화 식물 독소중 다른 구성원은 아브린(Abrin). 리신(Ricin) 및 모덱신(Modeccin)의 쇄이다. 아브린 및 리신과 같이 겔로닌은 포유동물 리보좀의 60S 서브-유니트를 손상시킴으로써 단백질 합성을 억제한다. 리보좀의 불활성화는 비가역적이고, 보조-인자와 관련되는 것으로 여겨지지 않으며 , 효율적으로 발생하므로 겔로닌이 효소적으로 작용함을 시사한다.
수많은 선행 연구자들은 세포독성제를 항체에 연결시켜 면역독소를 제조하는 것을 제시 또는 보고하여 왔다. 특히 중요한 것은 세균성 또는 식물 기원(origin)(예 : 리신 또는 아브린)의 독소의 효소적 활성 부분(A쇄)에 접합된 모노클로날 항체의 면역 독소였다[참조 : Nevelle and York, lnmunol. Rev. (1982) 62 :75-91: Ross et al., European Biochem. (1980) 104; Vitteta et al., lmmunol. Rev. (1982) 62 : 158-183 ; Ross et al., Cancer Res. (1983) 42 : 457-464 ; Trowbridge and Domingo Nature(Cond) (1981) 294 : 171-173]
겔로닌 및 리신은 단백질 중량을 기준으로 하여 단백질 합성을 억제하는데 가장 활성적인 독소중 일부이다. 겔로닌은 단백질 합성을 억제하는데 있어서 리신 A쇄보다 10 내지 1000배 더 큰 활성을 갖는다. 리신 및 아브린과 같은 펩타이드는 2개의 쇄, 즉 독성 단위인 ,A쇄 및 세포에 결합됨으로써 작용하는 B쇄로 구성된다.
리신 및 아브린과는 달리, 겔로닌은 세포에 결합되는 B쇄가 결핍된 단일 쇄로 구성되어 있고 그 자체로는 온전한 세포에 대해 무독성이다[참조 : Stirpe, et al., J. Biol. Chem. 255 : 6947-6953(1980) ] . 포유동물 세포는 천연 겔로닌 분자와 결합하고/하거나 이를 내화시키는(internalize) 능력이 현저하게 부족하다. 특정의 종양세포(예 : 유방암 세포)상에 존재하는 항원에 대해 유도되는 모노클로날 항체 15A8과 같은 종양-표적화 모노클로날 항체와 겔로닌의 접합체는 겔로닌을 상기 세포에 결합시키는 특이적 방법과 겔로닌-항체 복합체를 내화시키는 경로를 제공해준다.
리신 A쇄와 같은 독소를 사용하는 것보다 독소 겔로닌을 사용할 경우에 얻을 수 있는 잇점중 하나는 정상 조직에 대한 독성이 리신 A쇄에 비하여 저하된다는 점이다.
겔로닌 커플링된 모노클로날 항-종양 연관된 항원 모노클로날 항체는 종양 치료에 대해 활성적이고 선택적인 면역독성제이다.
약물, 독소 또는 방사성 표지와 커플링된 항체는 특이 항원을 발현하는 종양 세포에만 결합하기 때문에, 종양 세포만이 사멸된다. 그러나, 방사선 표지된 화합물로부터의 방사선은 이러한 방사선이 흡수되는 종양 세포에만 제한되지는 않는다.
방사선 표지된 항체는 치료제로서의 이들의 용도를 제한하거나 복잡하게 한다는 문제점을 야기시킨다. 예를 들면, 항체의 대사적 또는 효소적 분해 결과 방사선 표지가 방출될 수도 있고, 이들 기관에 허용되지 않는 방사선 손상을 야기하면서, 다른 조직(예 : 신장 또는 골수)에 분배될 수 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 유방암 및 자궁암 세포상의 15A8 항원을 인지하는 항체의 면역접합체를 제공한다. 하나의 양태에 있어서, 항체는 겔로닌, 리신 A쇄 및 아브린 A쇄로 이루어진 그룹중에서 선택된 독소와 커플링된다. 또다른 양태에서는, 15A8 항체는 세포사멸 약물(예 아드리아마이센) 또는 생물학적 반응 변형제(예 림포킨 또는 사이토킨)와 커플링 될 수 있다 또 다른 양태에 있어서 항체는 검출가능한 표지(예 : 방사성 표지 . 화학발광체 , 형광성 물질 , 또는 효소 표지)로 표지시킬 수 있다 세포사멸성 면역접합체는 종양-연관된 15A8-보유 종양의 재발 치료를 필요로하는 개체에게 이들 세포사멸성 면역접합체를 투여함으로써 상기 질환의 재발을 예방하고 치료하는데 유용하다.
검출가능한 표지로 표지된 15A8 면역접합체는 당해분야에 공지된 기술을 사용하여 종양을 진단하고 국소화하는데 유용하다.
또한. 표지된 이들 면역접합체는 당해 분야의 전문가에게 공지된 방법으로 생물학적 표본 중의 15A8 항원의 존재여부를 검정하고 생체내 종양부위를 국소화하는 검정에 유용하다.
본 발명의 목적 중 하나는 종양 세포와 특이적으로 결합하여 이를 사멸시킬 수 있는 세포독성 조성물을 제공하는 것이다. 특히 . 본 발명의 한가지 목적은 15A8 항원(이 항원은 미합중국 특허원 제29,373호 (1987.3.23일자 출원됨)에 기술 및 청구된 모노클로날 항체에 의해 인지됨)을 발현하는 종양 세포와 특이적으로 결합하여 이 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 조성물을 제공하는 것이다 본 발명의 또다른 국면은 세포에 세포사멸 유효량의 면역독소를 접촉시켜 , 15A8 항원을 발현하는 사람 유방암 세포, 자궁암 세포. 또는 기타 종앙 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다
본 발명의 추가의 목적은 종양세포에 대해서는 독성적이지만 정상 조직세포에는 최소한의 손상만을 야기시키는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 22kD 15A8 종양-연관된 항원에 대해 유도되는 항체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 15A8 항원을 발현하는 종양을 검출, 진단 및 국소화하는데 유용한 표지된 항체를 제공하는 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 G-75 크로마토그래피에 의한 15A8-겔로닌 용출 프로파일을 나타내는 그래프이다.
제2도는 15A8-겔로닌 복합체의 전기영동 패턴이다.
제3도는 블루 세파로즈(Blue Sepharose)상의 G-75 용출물의 크로마토그래피적 용출 프로파일의 그래프이다.
제4도는 겔로닌-l5A8 항체 복합제의 단백질 합성 억제 활성을 나타낸다.
제5도는 Me-180 세포에 대한 유리 15A8 항체 복합체의 결함을 나타낸다.
제6도는 비-표적 HS 294T 세포에 대한 15A8-겔로닌 복합체의 항증식 활성을 나타낸다 .
제7도는 Me-180 세포에 대한 겔로닌 및 겔로닌-l5A8 항제 복합체의 항증식
활성을 나타낸다.
제8도는 A431 세포에 대한 겔로닌 및 겔로닌-l5A8 항체 복합체의 항증식 활성을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본 명세서에 사유된 용어 모노클로날 항체는 동종의 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 의미한다. 이는 항체의 공급원 또는 이의 제조방법으로서 제한하고자 함은 아니다.
유방암 세포는 그의 표면상에서 22kD 항원을 발현한다.
이 항원에 대한 항체가 생성된다. 특이적으로, 이러한 22kD 항원의 에피토프를 인지하는 lgG1, lgG2a및 lgG2b이소타입(Isotype)의 모노클로날 항체는 이러만 22kD를 인지하는 하이브리도마 (대부분 lgG1이소타입을 생성시킴), 15A8 G2a(대부분 lgG2a이소타입을 생성시킴) 및 15A8 G2b(대부분 lgG2b이소타입을 생성시킴)에 의해 생성된다.
모든 이소타입은 항원의 동일한 에피토프를 인지하며 , 본 발명의 목적을 위하여 이들은 15A8 에피토프로 명명한다. 따라서 이들 항체 모두는 작용적으로 동등하다.
동일한 유전형(Idiotype)의 항체를 분비하는 즉 모두가 15A8 에피토프를 인지하는 대표적인 이들 하이브리도마 배양물은 국제기탁기관[American Type culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852]에 기탁번호 HB-8655 (15A8의 경우), HB-9344 (15A8 G2a의 경우) 및 HB-9345 (15A8 G2b의 경우)으로 기탁되었다.
이들 모노클로날 항체는 당해 분야의 전문가에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
이들 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 배양물의 제조방법은 미합중국 특허원 제 678,264호(1984년 12월 5일자 출원됨)의 부분-연속 출원인 미합중국 특허원 제29,373호(1987년 3월 23일자 출원됨), 및 유럽 특허원 공개공보 제0 184 369호
(1986년 6월 11일에 공고됨)에 상세히 기술되어 있다.
간략하게는. 유방 종양 세포[참조 Soule et al, INCI, 51 : 1409-1413(1973) ATCC Accession NO. HTB-22]를 BALB/C마우스에게 매 3주간 총 3회 내지 4회 복강내 주사한다.
최종 주사한지 3일 후에 비장을 수거하고, 비장세포 현탁액을 제조한 다음 둘벡코 변형 이글즈 배지 (Dulbecco's Modified Eagles medium) 중에서 2회 원심분리(800xg)시켜 세척한다.
면역화된 마우스의 108개 비장 세포 및 문헌[참조 Dr : Theo Staehlin Basel Switzerland, J. Stocker, Research Disclosure, 21713, 155-157(1982)]으로부터 수득된 107 PAI 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜 1500의 45% 용액(V/V)중에 융합용으로 재현탁 시킨다. 이러한 하이브리드 세포는 하이포크산틴-아메노프테린 티미딘(HAT) 배지상에서 선택된다.
하이브리도마의 클론은 문헌[참조 : Cotten. et al., Eur. J. Immunol. 3:136(1973)]에 기술된 공지된 조직 항온처리 기술에 따라서 시험관내에서 성장시킨다.
MCF-7 및/또는 MDA-157 세포와는 반응하지만 사람 포피 섬유아세포와는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마를 좀더 특성화한다. 15A8 세포주에 의해 생성 되는 항체 및 하이브리도마가 생성하는 작용적으로 동등한 항체는 MCF-7 세포상의 15A8 항원과 반응한다. 또한, 이들 항체는 시험된 무작위로 수득된 사람 유방암종 세포 31개중 28개와 반응하며 유방, 신장 근위 세뇨관, 방광표피, 식도 및 타액선의 정상적인 사람 상피 세포와는 약하게 반응하고 이것외에 다른 정상 조직의 세포와는 실질적으로 반응하지 않으며 , 시험된 18개의 다른 악성 종양 조직중 14개 와는 반응성이 없었다. 15A8 항체는 또한 모든 낭양변성 섬유종 질환 통상의 유방 상피, 수많은 선암 세포와 반응한다 그러나, 중피종 세포와는 반응하지 않는다.
15A8 항체는 정상의 유방, 신장 근위 세뇨관, 표피, 식도 및 타액선 상피, 및 자궁암. 결장암 및 전립선암 세포와 교차반응한다. 여러가지 종양 및 조직에 대한 15A8 항체의 결합은 실시예 4의 표 l에 요약되어 있다.
예시된 쥐의 모노클로날 항-사람 유방암 항체에 대하여 본 명세서내에 사용된 용어 작용적 동등물 (a) 예시된 모노클로날 항체를 교차 차단시키고; (b) 15A8 항원을 발현하는 세포(예 : 사람 유방암 세포)와 선택적으로 결합하며 ; (c) G 또는 M 이소타입을 갖고; (d) 면역침전법 또는 샌드위치 면역검정법에 의한 측정시 15A8 항원과 결합하며 (e) 겔로닌과 접합될 경우, 5 내지 10단위/ml의 용량으로 사용될 때 적어도 하나의 MCF-7 ME-180, BT-20 또는 A431 세포주에 대하여 50% 이상의 조직 함온처리 억제 용량(TClD)를 나타내는 모노클로날 항체를 의미한다.
항체 15A8은 커플링제로서 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 또는 이미노티올란(IT)을 사용하여 겔로닌에 접합된다 72시간 조직 합온 처리 검정법으로 Me-180 및 A431 세포에 대하여 상기 접합체를 시험한다. 항체 접합체는 이들 세포주 둘다에 대하여 허용되는 항증식 활성(5단위/ml 미만의 TClD 50%을 나타내었다.
항체 특성화가 더욱 상세히 하기 실시예에서 제공된다.
[면역화학물질]
가장 중요한 본 발명의 면역화학적 유도체는 면역독소(15A8 항체와 세포독성잔기 또는 생물학적 반응 변형제의 접합체) 및 표지된 항체를 포함한 면역 복합체를 확인하기 위한 수단을 제공해주는 표지된(예 : 방사성표지된, 효소-표지된, 또는 형광색소-표지된) 유도체이다.
면역독소의 세포독성 잔기는 세포독성 약물 또는 세균 또는 식물 기원의 효소적 활성 독소(겔로닌), 또는 이러한 독소의 효소적 활성 단편 (A쇄)일 수 있다.
효소적 활성 독소 및 이의 단편이 바람직하며, 이는 겔로닌, 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄(슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로 부터), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모덱신 A쇄, 알파-살신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질 디안틴 단백질, 피토이아카 아메리카나(Phytojacca americana) 단백질(PAPI PAPll, 있 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 큐신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신 페노마이신, 및 에노마이신으로 예시된다. 가장 바람직한 것은 겔로닌과의 접합이다.
15A8 항체와 커플링될 수 있고 본 발명에 사용될 수 있는 생물학적 반응 변형제는 IL-2, 인터페론(α,β또는γ), 및 lL-6과 같은 림포킨 및 사이토킨을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 반응 변형제는 종양 세포에 대하여 여러가지 효과를 나타낸다. 이러한 효과는 직접적으로 작용하여 종양 세포의 사멸을 증가시킬뿐만 아니라 숙주 방어-매개된 프로세스를 증가시켜 종양세포의 사멸을 증가시키는 것이다. 항체 15A8을 이들 생물학적 반응 변형제에 접합시키면 종양내에 선택적 국소화가 이루어져서, 비-표적 세포에 대한 독성을 초래하는 비-특이적 효과는 억제시키면서 항증식 효과를 향상시킨다.
본 발명에 유용한 세포독성 약물은 아드리아마이신(및 이의 유도체), 시스백금 복합체(및 이의 유도체) 블레오마이신 및 메토트렉세이트(및 이의 유도체)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 세포독성 약물은 때때로 재발된 종양 특히 유방암의 임상적 처리에 유용하지만, 이러한 용도는 심한 부작용과 비-표적 세포에 야기된 손상에 의해 악화된다. 항체 15A8은 종양으로의 운반과 종양 세포 자체내로의 향상된 삽입 둘다에 대해 유효한 수단을 제공하는 상기 약물의 유용한 담체로서 사용될 수 있다. 또한, 종양으로 세포독성 약물의 특이적 항체 운반은 간, 신장 및 골수와 같은 민감성 부위를 화학치료제의 해로운 작용으로부티 보호해 줄 것이다 운반 시스템으로서 항체 15A8에 접합된 약물의 사용으로 약물 자체의 복용량은 감소되는데, 이는 모든 약물 잔기가 종양내에 농축된 항체에 접합되기 때문이다
여러가지 이작용성 단백질 커플링제을 사용하여 모노클로날 항체의 접합체를 제조할 수 있다. 이러한 시약의 예로는 SPDP, lT, 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예 : 디메틸 아디피미데이트 ·HCl), 활성 에스테르(예 : 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예 : 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예 : 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예 : 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예 : l,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)이 있다.
진단 목적으로 시험관내에서 사람 유방암 세포를 사멸시키도록 사용될 경우, 접합체에는 일반적으로 약 10nM 이상의 농도로 세포 항온처리 배지에 가해질 것이다.
시험관내 용도용의 투여제형 및 투여방식은 중요하지 않다. 배양 배지 또는 환류(perfusion) 배지와 부합하는 수성 제형이 통상적으로 사용될 것이다. 세포독성은 통상의 기술로 판독하여 유방암의 존재 여부 또는 정도를 측정한다.
유방암과 같은 15A8 항원을 보유하는 종양 진단 및 치료용 세포독성 방사성 약제는 고 선형 에너지 전이(LET) 방출 동위원소(예 : Y Pr)를 항체에 접합시켜 제조할 수 있다. 본 명세서내에 사용된 용어 세포독성 잔기는 이러한 동위원소를 포함할 것이다.
항체의 표지된 부분을 제조하는데 사용되는 표지는 직접 검출될 수 있는 잔기(예 : 형광색소 및 방사성표지), 및 검출되기 위해서는 반응되거나 유도되어야만 하는 잔기(예 : 효소)를 포함한다. 이러한 표지의 예로는.32P,125I,3H,14C 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페리아,2,3-디하이드로프탈자이네디온, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 리소자임 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제가 있다 공지된 방법으로 항체에 이러한 표지를 붙일 수 있다. 예를 들면 알데히드 카보디이미드, 디말레이미드, 이미데이트, 석신이미드, 비스-디아조화 벤자딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 항체를 상기-기술된 형광성 물질, 화학발광체, 및 효소 표지와 커플링시킬 수 있다.
이러한 항체 및 표지된 항체를 여러가지 면역영상(immunoimaging) 또는 면역 검정법에 사용하여 환자중의 15A8 항원을 발현하는 종양(예 : 유방암)의 존재 여부를 검출하거나 이러한 종양을 가진 것으로 이미 진단된 환자의 암 진행 상태를 모니터링할 수 있다. 암 진행 상태를 모니터링하기 위해 사용될 경우 정량적 면역 검정법이 사용될 수 있다. 이러한 모니터링 검정을 주기적으로 수행하고, 수득된 결과를 비교하여 환자의 종양 크기가 증가 또는 감소하였는지를 결정한다. 사용될 수 있는 통상의 검정 기술은 직접 검정법 및 간접 검정법을 포함한다. 직접 검정법은 환자로부터의 조직 샘플 또는 세포를 표지된 항체와 함께 항온처리시켜 수행 한다. 이와 같은 샘플 15A8 항원 보유 세포가 유방암 세포를 포함할 경우, 표지된 항체는 이들 세포에 결합될 것이다. 조직 또는 세포를 세척하여 비결합된 표지된 항체를 제거한 후. 표지된 면역 복합체의 존재 여부를 알아보기 위하여 조직 샘플을 판독한다.
진단용 항체는 일반적으로 키트 형태로 분배될 것이다. 이들 키트는 일반적으로 하기 성분, 즉 적합한 용기중의 표지된 형태의 항체 항온처리 및 세척용 시약, 및 표지의 성질에 따른 기질 또는 유도화제를 포함할 것이다 또한, 항원 15A8 대조 및 지침서가 포함될 수도 있다.
본 발명에 따른 면역독소를, 15A8 항원 결정인자를 갖는 종양이 존재하는 것으로 진단된 개체에게 투여하면, 종양 세포를 사멸시켜야만 하는 부위에서 세포 독성제를 표적화하고 집중시킬 수 있다. 이와같이 세포독성제를 표적화함으로써, 다른 기관, 조직 및 세포에 대한 비-특이적 독성은 제거되거나 감소될 것이다.
생체내에서 치료용으로 사용할 경우 이러한 면역 독소는 치료적 유효량(즉 환자의 종양 부담을 제거하거나 감소시키는 양)으로 환자에게 투여한다. 이들은 통상적으로 비경구 바람직하게는 정맥내 투여될 것이다 용량 및 복용량 섭생은 암(1차 또는 전이성)의 성질 및 이의 집단, 특정한 면역독소의 특성(예 : 이의 치료지수) 환자 및 환자의 병력에 따라서 결정될 것이다. 면역독소 투여량은 일반적으로 환자 체중 Kg당 약 0.l 내지 약 10mg이 될 것이다.
비경구 투여용 면역독소는 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클과 혼합하여 단위 용량 주사가능한 형태(액제 현탁제, 유제)로 제형화될 것이다. 이러한 비히클은 본래가 무독성이고 비치료성이다. 이러한 비히클의 예로는 물, 식염수 링거용액(Ringer's solution), 덱스트로즈 용액 및 5% 사람 혈청 알부민이 있다. 비휘발성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 비수성 비히클도 또한 사용될 수 있다.
리포좀을 담체로서 사용할 수 있다. 비히클은 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질과 같은 소량의 부가제[예 : 완충제 및 방부제)를 함유할 수 있다. 이 면역독소는 일반적으로 이러한 비히클중에서 약 0.lmlg/ml 내지 10mg/ml의 농도로 제형화될 것이다.
겔로닌 독소를 문헌[참조 Stirpe, et al, 상기 참조]에 기술된 방법으로 겔로닌 멀티플로리늄의 종자로부터 정제한다. 간략하게는, 겔로닌은 완충 식염수 용액(PH 7.4)중에서 균질화시킴으로써 상기 종자로부터 추출한다. 5mM 인산 나트륨(pH 6.5)에 대하여 투석시킨 후 상등액을 농축시키고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 의해 겔로닌을 추가로 정제시킨다. 겔로닌 독소의 순도를 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-Page)으로 평가한다. 겔로닌 독소는 분자량 약 29,000 내지 30,000 달톤을 갖는 단일 밴드로서 이동하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 세포-비함유 시스템내에서의 단백질 합성 억제에 의해 겔로닌 독소 활성을 측정한다.
실시예 5에 기술된 바와 같이 SPDP로 변형시킨 항체 15A8G2를 실시예 3 및 6에 기술된 바와 같이 이미노티올란 변형된 겔로닌과 접합시킨다. 겔로닌 접합된 항체는 실시예 7에 기술된 바와 같이 세파덱스 G-75 컬럼상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시킨다.
겔로닌-접합된 항체의 독성은 단백질 합성 억제법으로 측정하고, 이의 항증식 활성은 시험관내 및 생체내 시험으로 측정한다.
하기 실시예는 본 발명에 따른 면역독소 모노클로날 항체의 제조 방법, 특성화, 및 용도를 상세히 기술하고 있다. 이들 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하고자 함은 아니다.
[실시예 1]
겔로닌의 정제
겔로닌 멀티플로리늄 종자의 껍질을 벗기고, 이 너트를 5mM 인산나트륨(pH7.4)을 함유하는 8배 용적의 0.14M NaCl과 함께 균질기내에서 분쇄시킨다. 균질물을 지속적으로 교반시키면서 4℃하에서 밤새 놓아두고, 얼음으로 냉각시킨 다음 0℃에서 20분간 35.000xg으로 원심분리시킨다. 상등액을 제거하고, 5mM 인산나트륨(pH 6.5)에 대하여 투석한 다음 pm10 필터를 사용하여 농축시킨다. 샘플을 5mM 인산나트룸(pH 6.5)으로 평형시킨 CM-52 이온-교환 컬럼(20 x l.5cm상에 층을 이루게 한다. 이온 교환 수지에 결합된 물질을 4℃에서 25ml/시간의 속도로 0 내지 0.3M 선형 NaCl 구배 400ml을 사용하여 용출시킨다. 5ml 분획을 수집한다. 분획을 분광 광도계로 280nm에서 모니터링한다. 겔로닌은 분획 약 55 내지 70중에서 용출되고 이는 최종 주요 용출 피크이다. 분획 55 내지 70을 모으고, 이중 증류수 에 대하여 투석한 다음 동결건조시켜 농축시킨다. 각 제제의 순도 및 분자량을, 50mM 인산나트륨 완충제(pH 7.4)로 TSK 3000 겔 투과 컬럼을 사용하는 고압 액체 크로마토그래피, 및 15% 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-page)상에서 체크한다. 겔로닌은 분자량 약 29,000 내지 300,000 달톤을 갖는 단일 밴드로서 이동하였다.
[실시예 2]
겔로닌 활성의 검정
세포-비함유 단백질 합성 억제 검정으로 겔로닌 활성을 모니터링한다. 세포 비함유 단액질 합성 억제 검정은, 사용직전에 해동된 50㎕ 래빗트 망상적혈구 용해질에 가하고 이어서 0.2M 트리스 HCl(pH 7,8) 0,5ml, 에틸렌 글리콜 8.9ml, 및 1M HCl 0.25ml을 각각 가한후 혼합시킴으로써 수행된다.
0,375M KCI , 10mM Mg(CH3Co2)2. 15mM 글루코즈, 0.25-10mM 아미노산(로이신은 제외), 5mM ATP, 1mM GTP, 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10㎕ 크레아티닌 포스페이트-크레아티닌 포스포키나제, 8㎕14C 로이신(Amersham, 348mCi/mmol)으로 구성된 염-아미노산-에너지 혼합물(SAEM) 20㎕에 여러가지 농도의 겔로닌 혼합물을 함유한 용액 l.5㎕를 가한다. 이 혼합물을 30℃에서 60분간 항온처리한다. 합성된 단백질을 유리 섬유 필터상에 침전시키고, 10% TCA 및 아세톤중에서 세척하며, 아쿠아졸 신틸레이션 유체를 사용하는 베타-계수기로 방사능을 모니터링함으로써 , 일정 분취량의 혼합물중에서14C-로이신 통합을 모니터링한다. 4x109U/mg 이상의 특이 활성을 갖는 겔로닌을 항체와의 접합에 사용한다. 겔로닌 활성의 단위는 세포-비함유 검정에 있어서 [14c] 로이신의 단백질로의 통합을 50% 억제시키는 겔로닌 단백질의 양이다.
[실시예 3]
이미노티올란을 사용한 겔로닌의 변형
인산염 완충 식염수중의 겔로닌을 센트리콘(Centricon) 10 미세농축기내에서 약 2mg/ml로 농축시킨다. 트리에탄올아민 염산염(TEA/HCl)(pH 8.0) 및 EDTA를 60mM TEA/HCl 및 1mM EDTA(pH 8.0)의 최종 농도로 가한다. 2-이미노티올란 스톡용액(20mM)을 1mM의 최종 농도로 가하고, 샘플을 질소 기체 스트림하 4℃에서 90분간 항온처리 한다.
50mM NaCl 및 1mM EDTA를 함유하는 5mM 비스-트리스/아세테이트 완충제(pH5.8)로 예비-평형시킨 세파덱스 G-25의 컬럼(lx24cm)상에서 겔 여과시켜 과량의 이미노티올란을 제거한다. 브랫포드 염료 결합 검정을 사용하여 미세역가 플레이트중의 단백질 함량에 대해 분획을 분석한다. 간략하게는, 샘플 40㎕, 인산염 완충 식염수(PBS) 100㎕ 및 염료 농축물 40㎕을 각각의 웰에 가한다. 자동판독기 (Dynatech Microelisa .Autoreader)상에서 600㎚하의 흡광도를 판독한다. 겔로닌은 공극 용적에서 용출된다.(분획 약 14-20). 이들 분획을 모으고, 센트리콘-10 미세 농축기를 사용하여 농축시킨다.
[실시예 4]
15A8 유방암 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조 및 특성화
당해 분야의 전문가에게 공지된 방법으로 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 이들 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 배양물의 제조방법은 미합중국 특허원 제678,264호(1984년 12윌 5일자 출원됨)의 부분-연속. 출원인 미합중국 특허원 제29,373호(1987년 3윌 23일자로 출원됨) 및 유럽 특허원 공개공보 제0 184 369호 (1986년 6윌 11일자 공고됨)에 상세히 기술되어 있다. 간략하게는, 유방 종양세포 [참조 : soule, et al, JNCI, 51 1409-I413(1973) ATCC 기탁번호 제HTB-22호]로 BALB/c 마우스에게 매 3주간 총 3회 내지 4회 복강내 주사한다. 최종 주사한지 3일후에 비장을 수거하고, 비장세포 현탁액을 제조한 다음 둘벡코 변헝 이글즈 배지 중에서 2회 원심분리(800xg)시켜 세척한다. 면역시킨 마우스의 108개 비장 세포 및 문헌[참조 : Dr. Theo Staehlin, Basel, Switzerland, 42140 J. Stocker, Research Disclosure, 21713, 155-l57(1982)]으로부터 수득된 107 PAI 골수종 세포를 폴리에틸렌 글리콜 1500의 45% 용액(V/V)중에 융합용으로 재현탁시킨다. 이러한 하이브리드 세포는 하이포크산틴-아메노프테린 티미딘(HAT) 배지상에서 선택된다.
하이브리도마의 클론은 문헌[참조 : Cotten, et al., Eur. L. Immunol 3:136(1973)]에 기술된 공지된 조직 배양 기술에 따라서 시험관내에서 성장시킨다.
MCF-7 및/또는 MDA-157 세포와는 반응하지만 사람 포피 섬유아세포와는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마를 좀더 특성화한다. 15A8 세포주에 의해 생성되는 항체 및 작용적으로 동등한 하이브리도마-생산 항체는 MCF-7 세포상의 15A8 항원과 반응한다. 또한, 이들 항체는 시험된 무작위로 수득된 사람 유방암 세포 3l개중 28개와 반응하며, 유방, 신장 근위 세뇨관, 방광표피, 식도 및 타액선의 정상 사람 상피세포와는 약하게 반응하고 이것외에 다른 정상 조직세포와는 실질적으로 반웅하지 않으며 시험된 18개의 다른 악성 종양 조직중 14개와는 반응성이 없었다.
15A8 항체는 또한 모든 낭양변성 섬유종 질환. 통상의 유방 상피 및 수많은 선암 세포와 반응한다. 그러나, 중피종 세포와는 반응하지 않는다. 15A8 항체는 정상의유방,신장 근위세뇨관,표피,식도 및 타액선 상피,및자궁암,결장암 및 전립선암 세포와 교차반응한다. 여러가지 종양 및 조직에 대한 15A8 항체의 결합은 하기 표 1에 요약된다.
+=양성 면역 퍼옥시다제 반응(통상적으로 강함)
-=반응이 없음
±=약한반응
[실시예 5]
SPDP를 사용한 모노클로날 항체 15A8의 변형
디메틸포름아미드중의 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)[프로피오네이트)를 무수 디메틸포름아미드중의 3mg/ml의 스톡 용액으로서 제조한다. 결정성 SPDP는가수분해를 진행시킬 수 있기 때문에, 화학적으로 반응성인 가교결합제의 실제 농도는 분광광도계 측정법을 사용하여 이중-빔(beam) 분광광도계내에서 260nm하의 흡광도를 분석함으로써 측정 한다. SPDP 스톡의 농도는 하기 식으로부티 산정된다.
PBS 0.5ml중의 모노클로날 항체 15A8 1mg을 유리 튜브에 가한다. SPDP 스톡용액을 일정하게 혼합시키면서, 5배 몰 과량으로 튜브에 서서히 가한다. 이 혼합물을 항온처리 기간 동안 매 5분간 혼합시키면서 실온에서 30분간 항온처리한다.
과량의 비반응된 SPDP를 PBS로 예비-평형시킨 세파덱스 G-25 컬럼(lx24cm)상에서 겔 여과 크로마토그래피하여 제거한다 PBS 용출중에 분획(0.5ml)을 수집하고, 브랫포드 염료법으로 단백질 함량에 대해 분석한다. 항체는 공극 용적(분획 약 14-20)중에 용출되었다. 이들 분획을 모으고, 단백질을 센트리콘-30 미세농축기중에서 농축시킨다.
센트리콘 보유물을 EDTA(0.5mM)를 함유하는 100mM 인산나트륨 완충제(pH 7.0)로 세척한다. 항체를 약 0.5 내지 0,75ml의 최종 용적으로 농축시킨다.
[실시예 6]
SPDP - 변형된 모노클로날 항체 15A8과 이미노티올란-변형된 겔로닌과의 접합
실시예 4에 기술된 바와 같이 변형된 모노클로날 항체 15A8을 실시예 3에서와 같이 변형된 동일 중량의 겔로닌과 혼합한다. 이러한 비율은 항체와 비교해서 5배 몰 과량의 겔로닌에 상응한다. 0.05M TEA/HCl 완충제(pH 8.0)를 가하여 혼합물의 pH를 7.0으로 조절하고 혼합물을 질소하 4℃에서 20시간 동안 항온처리한다. 요오도아세트아미드(0.lM)를 2mM의 최종 농도로 가하여 잔류하는 모든 유리설프하이드릴 그룹을 차단시키고 항온처리를 약 25℃에서 몇시간 더 지속시킨다.
반응 혼합물을 겔 여과시켜 정제할 때까지 4℃에서 저장한다
[실시예 7]
겔로닌 - 모노클로날 항체 15A8복합체의 정제
비-접합된 겔로닌을 PBS로 예비-펑형시킨 세파덱스 G-75 컬럼(l.6x31cm)상에서 겔 여과시켜 실시예 6의 반응 혼합물로부터 제거한다.
실시예 6으로부터의 반응 혼합물을, 세파덱스 컬럼상에 로오딩하기 전에 센트리콘 90 미세농축기를 사용하여 약 1ml로 농축시킨다. 컬럼을 PBS로 세척한다.
분획 1ml을 수집하고 50㎕ 분취량을 브랫포드 염료 결합 분석법[참조: M.Bradford. Anal. Biochem 72:248 (1976)]으로 단백질에 대해 분석한다.
유리- 및 겔로닌-접합된 항체는 공극 용적(분획 약 17-23)으로 용출되는 반면 비접합된 겔로닌은 분획 약 35-41에서 용출된다. 제l도는 G-75 컬럼의 용출프로파일올 나타낸다. 제l도는 용출 프로파일을 나타내고, 겔로닌이 겔로닌-항체 접합체 및 비접합된 항체(이 둘다는 제l피크(분획 약 38-52)로 공용출된다)로부터 분리될 수 있음을 보여준다. 이러한 용출 패턴은 제2도에 나타낸 바와 같이 5 내지 20%, 구배 비-환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 50㎕ 분취량을 전기영동시킴으로써 확인된다. 커플링 혼합물을 레인 3상에 로오딩한다. 유리 겔로닌 유리항체, 빛 항체 분자당 커플링된 겔로닌 l분자 및 항체 분자당 커플링된 겔로닌 2분자에 대한 밴드가 도시되어 있다. 유리 항체 및 항체-겔로닌 접합체를 함유하는 G-75 컬럼의 공극 용적 피크를 레인 4상에 로오딩한다.
비-접합된 항체를, 0.lM NaCl올 함유하는 10mM 인산염 완충제(pH 7.2)로 예비-평형시킨 블루 세파로즈 CL-6B 컬럼(1x24cm)상에 친화성 크로마토그래피하여 겔로닌 접합된 항체로부터 제거한다. G-75 용출물 샘플을 로오딩한 후 컬럼을 동일한 완충제 30ml로 세척하여 비-접합된 항체를 완전하게 용출시킨다. 겔로닌-접합된 항체는 컬럼에 결합되며, 이를 10mM 인산염 완충제(pH 7.2)중의 0.l 내지 2M NaCl의 선형 염 구배로 웅출시킨다. 블루 세파로즈 컬럼의 용출 프로파일을 도시하는 제3도에 나타낸 바와 같이 항체-겔로닌 복합체는 약 0.7M NaCl에서 용출된다.
플로우-쓰루(flow-through) 피크는 단지 유리 항체만을 함유(제2도, 레인 5)하는 반면, 고염으로 용출시킨 분획 50 내지 80은 비접합된 겔로닌 또는 항체를 함유하지 않는 15A8-겔로닌 접합체를 함유한다(제2도, 레인 6)
용출된 분획의 단백질 함량을 브랫포드 염료 결합 검정법으로 측정한다. 단백질-함유 분획올 모으고 5 내지 20% 구배의 비-환원 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켜 용출 패턴을 확인한다. 15A8-겔로닌 복합체의 전기영동 패턴은 제2도에 도시된다.
실시예 3에 기술된 시험관내 래빗트 망상적혈구 해독 시스템을 사용하여 본질적으로 순수한 겔로닌-15A8 항체 복합체의 겔로닌 활성을 평가한다. 제4도에 나타낸 바와 같이, 본질적으로 순수한 겔로닌-15A8 항체는 망상적혈구 용해물 검정에서 활성적이다. 본래의 샘플을 1:1000 희석시키면 단백질 합성이 약 50% 억제되는데, 즉14C-로이신의 단백질내로의 통합이 50% 감소된다. 따라서, 본래 제제의 활성도는 1000U/ml이다.
[실시예 8]
표적세포에 대한 겔로닌-접합된 및 비접합된 15A8항체의 결합 비교
표적 세포와 결합하는 겔로닌-접합된 및 비접합된 15A8 항체의 능력을 평가한다. 5만개의 표적 세포(Me-180) 또는 비-표적 사람 흑색종 세포(AAB-527 세포)를 미세역가 플레이트의 각 웰에 가한다. 세포를 이 플레이트 상에서 37℃로 밤새 건조시킨다. 그 다음 세포를 찬 PBS로 3회 변화시키면서 세척하고 밤새 공기로 건조시킨다. 이렇게 처리한 후 세포 표면 항원 결정인자는 항원적으로 활성을 유지 한다.
세포를 부착시킨 후 플레이트를 세척 완충액(9.68 트리스, 64.8 염화나트륨, 16ml 트윈 20, 이중 증류수 8ℓ 중의 티머라졸 800mg)으로 세척한다. 항체 샘플을 l% 소 혈청 알부민(W/V)을 함유하는 세척 완충액중에서 희석시킨다.(희석 완충액). 0,05 내지 50㎍/ml의 여러가지 농도의 접합되거나 비접합된 15A8 항체 50㎕를 웰에 가한다. 4℃에서 l시간 항온처리한 후, 상등액을 제거하고 웰을 세척 완충액으로 2회 세척한다.
바이오-래드(Bio-rad)로부터 수득되고 희석 완충액중에서 1:1000(V/V) 회석된 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 IgG(HPGAM) 50㎕를 각 웰에 가한다. 플레이트를 4℃ 에서 1시간 동안 항온처리하고, 웰을 세척 완충액으로 2회 세척한다. 플레이트를 실온하 어둠속에서 30분간 기질 용액(80mM 시트레이트 인산염(pH 5.0), 1mM o-페닐렌디아민(ABTS) 및 30% 과산화수소 4㎕) 50㎕와 함께 항온처리한 후. 4N 황산 25㎕을 각 웰에 가한다. 엘리사(Elisa) 스캐너상에서 492nm하의 흡광도를 측정한다.
그 결과는 제5도에 나타내었다. 15A8 겔로닌 복합체는 천연 15A8 항체와 동일한 정도로 Me-l80 표적 세포에 결합된다. 표적 세포를 함유하는 Me-180 항원에 대한 15A8-겔로닌 또는 비접합된 15A8 항체의 결합에는 어떠한 차이점도 없었기 때문에, 화학적 접합 방법은 이의 표적 항원에 대한 항체의 친화성을 변경시키지 않았다. 비-표적 , AAB527 흑색종 세포에 대한 15A8 또는 15A8 겔로닌 복합체의 검출 가능한 결합은 없었다.
[실시예 9]
겔로닌 및 겔로닌 - 15A8항체 복합체의 항증식 효과
겔로닌 및 15A8-겔로닌 복합체의 항증식 효과는 약 5,000 세포/웰을 적당한 조직 항온처리배지 200㎕중의 미세역가 플레이트내에 플레이팅 시켜 평가한다.
세포를 공기중 5% CO2대기압하 37℃에서 24시간 동안 부착시킨다. 비-표적된, 대수기의 항원 음성 HS294 흑색종 세포, 항원 양성 Me-180 및 A-431 인설 암 세포를 여러가지 농도의 배지 단독(대조군), 겔로닌 또는 15A8-겔로닌 접합체로 처리하고, 공기중 5% CO2대기압하 37℃에서 72시간 동안 항온처리한다. 플레이트를 찬 PBS로 3회 세척한다. 메탄을 50㎕을 각 웰에 가하고, 동결 및 해동의 사이클을 반복 하여 세포를 용해시킨다. 그 다음, 브랫포드 염료 시험으로 단백질 농도를 측정한다. 식염수-처리된 대조군과 비교하여 처리된 세포의 단백질 농도 감소로써 세포성장 억제를 평가한다. 제6도에 나타낸 바와 같이 비-표적화된 HS294t 흑색종 세포상에서의 15A8-겔로닌 접합체에 의한 세포 성장 억제는 전혀 없었다. Me-180 표적 세포는 겔로닌 단독에 대해서보다는 15A8-겔로닌 면역독소에 대해서 각각 7 log 및 5 log 값으로 더욱 민감하였다(각각 제7도 및 제8도)
제7도는, 겔로닌 접합된 15A8 항체가 약 5U/ml에서 Me-180 세포를 50% 억제 하는 반면, 동일한 효과를 성취하기 위해 비접합된 겔로닌은 107U/ml의 농도가 필요함을 보여주고 있다.
유표피 암 15A8 항원 양성 세포주인 A43l 세포를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. 제8도에 나타낸 바와 같이 , 겔로닌 15A8 항체 복합체는 유리 독소보다 약 5 log의 낮은 농도에서 세포를 사멸시켰다.
그들의 표면상에 15A8 항원을 함유하는 세포만이 겔로닌 15A8 면역독소에 의해 사멸되기 때문에 , 이러한 면역독소는, 정상의 비-종양 연관된 항원-보유 세포에 대한 손상 또는 상해를 최소화하거나 예방하면서, 15A8 종양 연관된 항원-함유 세포를 표적화하여 사멸시키는 유효한 방법이다.
[실시예 10]
생체내 겔로닌 15A8항체 접합체의 효과
사람 유방암 세포주 MW의 고 종양형성 변이체에 대한 활성을 알아보기 위하여 겔로닌과 접합된 항체 15A8또는 겔로닌 단독(대조군으로서)을 시험한다[참조:Chu, et al., Cancer Research 45:1357-1366]. 암컷 치매 BALB/C nu/nu 마우스(20내지 24g)에게 동물당 0.5ml중 1.25×107개 세포를 우측 겨드랑이 부위내에 주사한다. 3일후 50ng/ml 하이드로코르티손 및 인슐린을 함유하는 둘벡코 변형 이글 배지중의 10-7M, 3×10-7M, 6×10-7및 10-6M 농도의 15A8-겔로닌 복합체 또는 유리 겔로닌 200㎕을 꼬리 정맥내로 주사하여 약 10-8M, 3×10-8M, 6×10-8M 및 10-7M의 혈장 농도를 수득한다. 4주 후에 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 종양 크기를 측정하고, 주사 후 5주째에는 종양을 제거한 다음 무게를 단다. 그 결과는 표2에 제시된다.
겔로닌 또는 겔로닌 15A8접합체의 농도는 동물의 혈액용적중의 주사된 용량의 10배희석을 고려하여 대략 정해진다. 평균 종양 크기 및 평균 종양 중량을 기준으로 하여, 접합체 15A8-겔로닌은 하기에 나타낸 바와 같이 종양 성장을 약 70내지 75%정도 감소시켰다.
4주째 종양 크기 :
5주째 종양 중량:
따라서 , 겔로닌-15A8 복합체를 단지 한번만 투여할 경우, 종양 크기가 70 내지 75% 감소되었음을 알 수 있다. 면역독소를 더욱 자주 주사할수록 종양을 감소 시키는데 더욱 효과적일 수 있을 것이다.
당해 분야의 전문가는 본 발명이 본 목적을 수행하고 언급된 최종 목적 및 장점 , 및 본 발명내에 본래부터 포함되는 것들을 수득하는데 잘 적용된다는 사실을 용이하게 인식할 것이다. 본 명세서내에 기술된 화합물, 방법, 과정 및 기술은 바람직한 양태의 대표적인 것들이고, 이들은 단지 예시하고자 함이며 본 발명의 범위를 제한하고자 함은 아니다. 본 발명의 요지내에 포함되고 첨부된 특허청구 범위에 의해 한정되는 본 명세서내의 변화 및 기타 용도가 당해 분야의 전문가에게 발생될 것 이다.

Claims (2)

15A8 모노클로날 항체와 겔로닌 잔기의 내재성 아미노그룹과의 접합체.
15A8 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체와 커플링된 겔로닌 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유방암 치료에 유용한 약제학적 조성물.
KR1019900700479A 1988-07-07 1989-06-29 암 진단 및 치료용 면역접합체 KR0152272B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21659588A 1988-07-07 1988-07-07
US216,595 1988-07-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR900701321A KR900701321A (ko) 1990-12-01
KR0152272B1 true KR0152272B1 (ko) 1998-10-15

Family

ID=22807704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019900700479A KR0152272B1 (ko) 1988-07-07 1989-06-29 암 진단 및 치료용 면역접합체

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6669938B1 (ko)
EP (2) EP0423228B1 (ko)
JP (1) JP2756329B2 (ko)
KR (1) KR0152272B1 (ko)
AU (1) AU636113B2 (ko)
CA (1) CA1336497C (ko)
DE (1) DE68912334T2 (ko)
DK (1) DK175835B1 (ko)
ES (1) ES2059759T3 (ko)
FI (1) FI102517B (ko)
HK (1) HK1006676A1 (ko)
IE (1) IE62463B1 (ko)
IL (1) IL90688A (ko)
NO (1) NO303122B1 (ko)
NZ (1) NZ229652A (ko)
PT (1) PT91075B (ko)
WO (1) WO1990000405A1 (ko)
ZA (1) ZA894665B (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
IL97776A (en) * 1990-04-19 2000-10-31 Res Dev Foundation Composition comprising a conjugate of a ZME antibody and a biological response modifier
IE912716A1 (en) * 1990-08-14 1992-02-26 Res Dev Foundation Protein Structure of the Plant Toxin Gelonin
US5194594A (en) * 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
ZA932523B (en) * 1992-04-10 1994-10-08 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against cd33 related surface antigens
US6599505B1 (en) 1992-04-10 2003-07-29 Research Development Foundation Immunotoxins directed against CD33 related surface antigens
SE9601158D0 (sv) * 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
IT1286663B1 (it) * 1996-06-27 1998-07-15 Ministero Uni Ricerca Scient E Proteina capace di inibire l'attivita' ribosomiale,sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cdna
CA2693296C (en) 1997-12-08 2013-09-10 Merck Patent Gmbh Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
ATE316982T1 (de) 1999-08-09 2006-02-15 Lexigen Pharm Corp Mehrere zytokin-antikörper komplexen
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
ZA200305980B (en) 2001-02-12 2007-01-31 Res Dev Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
AU2002248571B2 (en) 2001-03-07 2007-01-18 Merck Patent Gmbh Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
JP4309662B2 (ja) 2001-05-03 2009-08-05 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 腫瘍特異的組換え抗体およびその使用
JP2004535202A (ja) 2001-07-17 2004-11-25 リサーチ　ディベロップメント　ファンデーション アポトーシス促進性蛋白質を含む治療剤
EP2354791A1 (en) 2001-12-04 2011-08-10 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
US20040048319A1 (en) * 2002-05-03 2004-03-11 Mather Jennie P. ALCAM and ALCAM modulators
EP1572170A4 (en) * 2002-06-12 2007-02-28 Res Dev Foundation IMMUNOTOXIN AS THERAPEUTIC AGENT AND USES THEREOF
WO2004055056A1 (en) 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
BRPI0418286A (pt) 2003-12-30 2007-05-02 Merck Patent Gmbh proteìnas de fusão de il-7
EA011859B9 (ru) 2004-01-05 2013-07-30 Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
EP1855724A2 (en) * 2005-02-01 2007-11-21 Research Development Foundation Blys fusion proteins for targeting blys receptor and methods for treatment of b-cell proliferative disorders
EP2066787A1 (en) * 2006-09-12 2009-06-10 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des Öffentlichen Rechts Cell culture of keratinocytes under non-differentiating conditions
GB0718045D0 (en) * 2007-09-14 2007-10-24 Peptcell Ltd Pharmaceutical compound
CN102405230A (zh) 2009-04-22 2012-04-04 默克专利有限公司 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4263279A (en) * 1975-08-19 1981-04-21 Yeda Research & Development Co. Ltd Pharmaceutically active compositions containing adriamycin and daunomycin
US4440747A (en) 1980-09-30 1984-04-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibody-ricin hybrids as a treatment of murine graft-versus-host disease
US4520226A (en) 1982-07-19 1985-05-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Treatment of graft versus host disease using a mixture of T-lymphocyte specific monoclonal antibody: ricin conjugates
GB2131830A (en) 1982-12-10 1984-06-27 Ludwig Inst Cancer Res Monoclonal antibody for use against breast cancer
FR2546756B1 (fr) * 1983-06-03 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives immunostimulants, leur preparation et leur application comme medicament
GB2148299B (en) * 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
DK423483A (da) 1983-09-16 1985-03-17 Nordisk Laederforskningsraad Fremgangsmaade til maerkning af huder, skind og lignende arkformige materialer
US4753894A (en) * 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
DE3408463C2 (de) * 1984-03-08 1987-02-26 Giulini Chemie Gmbh, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur Herstellung einer aluminium- und magnesiumhaltigen Verbindung der Formel Al↓5↓Mg↓1↓↓0↓ (OH)↓3↓↓1↓ (SO↓4↓)↓2↓ . x H↓2↓O
CA1306428C (en) * 1984-12-05 1992-08-18 Christine A. White Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cell surface antigen
EP0214995B1 (en) * 1985-03-04 1990-12-27 Dana Farber Cancer Institute Immunotoxin and method of making
JP2524586B2 (ja) * 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
JPS6220909A (ja) 1985-07-17 1987-01-29 株式会社井上ジャパックス研究所 パイプ等の接合方法
FR2587332B1 (fr) 1985-09-19 1989-02-17 Rhone Poulenc Spec Chim Procede de chloration selective de composes phenoliques
ATE76583T1 (de) 1985-12-06 1992-06-15 Cetus Corp Anti-immuntoxine gegen menschlichen eierstockkrebs und verfahren zu deren verwendung.
US4831122A (en) * 1986-01-09 1989-05-16 Regents Of The University Of Minnesota Radioimmunotoxins
EP0256471A3 (en) 1986-08-15 1989-10-25 Xoma Corporation Cytotoxic conjugates for cancer therapy
US4771128A (en) * 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography

Also Published As

Publication number Publication date
JP2756329B2 (ja) 1998-05-25
ZA894665B (en) 1990-04-25
US6669938B1 (en) 2003-12-30
EP0423228B1 (en) 1994-01-12
NZ229652A (en) 1991-08-27
IE62463B1 (en) 1995-02-08
EP0350230A2 (en) 1990-01-10
DK175835B1 (da) 2005-03-21
NO910031D0 (no) 1991-01-04
DK1091A (da) 1991-01-04
DE68912334D1 (de) 1994-02-24
KR900701321A (ko) 1990-12-01
EP0423228A4 (en) 1991-07-17
HK1006676A1 (en) 1999-03-12
FI102517B1 (fi) 1998-12-31
FI102517B (fi) 1998-12-31
CA1336497C (en) 1995-08-01
DK1091D0 (da) 1991-01-04
AU636113B2 (en) 1993-04-22
IL90688A0 (en) 1990-01-18
EP0350230A3 (en) 1990-12-12
DE68912334T2 (de) 1994-05-05
NO303122B1 (no) 1998-06-02
PT91075B (pt) 1995-01-31
FI910049A0 (fi) 1991-01-04
PT91075A (pt) 1990-02-08
ES2059759T3 (es) 1994-11-16
EP0350230B1 (en) 1993-09-15
IE891970L (en) 1990-01-07
WO1990000405A1 (en) 1990-01-25
NO910031L (no) 1991-01-04
AU3976189A (en) 1990-02-05
EP0423228A1 (en) 1991-04-24
JPH04500510A (ja) 1992-01-30
IL90688A (en) 1995-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0152272B1 (ko) 암 진단 및 치료용 면역접합체
EP0396387B1 (en) A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) Antibody delivery system for biological response modifiers
EP0226419B1 (en) Anti-human ovarian cancer immunotoxins and methods of use thereof
JP3340127B2 (ja) 異常増殖性疾患措置のための抗体接合体
EP0226418B1 (en) Anti-human ovarian cancer immunotoxins and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20080624

Year of fee payment: 11

LAPS Lapse due to unpaid annual fee