PT91075B - Processo para a preparacao de imunoconjungados de gelonina com anticorpos especificos de tumor apropriados para o diagnostico e a terapeutica do cancro - Google Patents

Processo para a preparacao de imunoconjungados de gelonina com anticorpos especificos de tumor apropriados para o diagnostico e a terapeutica do cancro Download PDF

Info

Publication number
PT91075B
PT91075B PT91075A PT9107589A PT91075B PT 91075 B PT91075 B PT 91075B PT 91075 A PT91075 A PT 91075A PT 9107589 A PT9107589 A PT 9107589A PT 91075 B PT91075 B PT 91075B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
gelonin
antibody
cells
antigen
tumor
Prior art date
Application number
PT91075A
Other languages
English (en)
Other versions
PT91075A (pt
Inventor
Michael G Rosenblum
Renato Dulbecco
W Ross Allen
Original Assignee
Res Dev Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Res Dev Foundation filed Critical Res Dev Foundation
Publication of PT91075A publication Critical patent/PT91075A/pt
Publication of PT91075B publication Critical patent/PT91075B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • G01N33/57515—
    • G01N33/5755—
    • G01N33/5756—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Processo para a preparação de imunoconjugados de gelonina com anticorpos específicos de tumor apropriados para o diagnóstico e a terapêutica do cancro
Antecedentes
Campo da invenção
A presente invenção refere-se, dum modo geral, ao campo dos imunoconjugados e, mais particularmente à utilização de imunoconjugados para o diagnóstico e tratamento do cancro. A presente invenção também se relaciona com o tratamento do carcinoma da mama e carcinoma cervical com conjugados citotóxicos de anticorpos monoclonais (MoAbs) e gelonina, uma proteína que inibe o ribissoma.
Antecedentes da invenção cancro da mama e o cancro cervical são duas das causas principais de morte por malignidade nas mulheres no mundo ocidental. A remoção cirúrgica de malignidades localizadas demonstrou-se eficaz somente quando a doença não está disseminada para além da lesão primária. Quando a doença está disseminada os processos cirúrgicos devem ser acompanhados por outros processos mais gerais para irradicar a doença ou as células malignas. Os processos complementares mais correntemente utilizados, tais como as irradiações ou a quimioterapia não são localizados nas células do tumor e ainda que tenham um efeito destruidor proporcionalmente superior sobre as células malignas, frequente2
mente afectam as células normais nalguma extensão.
Muitos tumores exprimem antigénios ou determinantes antigénicos que são expressos muito fracamente pelas células normais ou que o não sao. Algumas células tumorais exprimem antigénios que são expressos pelos tipos de células embrionárias mas que não são expressos pelas células normais do animal adulto. Estes antigénios expressos anormalmente são conhecidos como antigénios associados a tumor. Os antigénios expressos pelo tumor são específicos, visto que, embora um dado antigénio possa ser expresso por mais de um tumor, ele é usualmente expresso por todas ou pela maior parte das células dos tumores particulares que o exprimem. Uma célula tumoral pode exprimir um ou mais do que um antigénio associado a tumor. Estes antigénios associados a tumor podem ser expressos na superfície das células (antigénio de superfície celular), podem ser segregados pela célula tumoral (antigénios segregados) ou podem permanecer no interior da célula (antigénio intercelular).
A presença destes antigénios associados a tumor tem sido utilizada para detectar, diagnosticar e localizar o tumor. Nalguns casos, a presença de antigénios associados com um tumor nas células tumorais tem permitido dirigir os fármacos específicos e os meios de tratamento especificamente para as células tumorais.
Os anticorpos são proteínas produzidas normalmente pelo sistema imunológico do animal como resposta a antigénios estranhos ou a determinantes antigénicos. Os anticorpos ligam-se
- 3 ao antigénio específico ao qual se dirigem. Os anticorpos ' monoclonais dirigidos a antigénios específicos ou a determinantes antigénicos podem preparar-se em grandes quantidades.
Um método para os agentes quimioterapêuticos atingirem as células tumorais e para diminuir os seus efeitos sobre as células normais tem sido possível com o desenvolvimento dos MoAbs dirigidos contra antigénios nas células tumorais que não ocorrem nas células normais.
Os anticorpos podem marcar-se a fim de permitir o seu uso para a localização e tratamento de doenças malignas. Podem ser utilizados anticorpos acoplados a fármacos como um sistema de libertação através do qual o fármaco é dirigido para o tipo de célula tumoral específico contra o qual o anticorpo se dirige. Os anticorpos podem também ligar-se a toxinas e, deste modo, actuarem como um sistema de libertação para atingir as toxinas dirigidas para as células tumorais específicas.
A gelonina é uma glicoproteína de peso molecular compreendido entre 29 000 e 30 000 purificada, proveniente das sementes de Gelonium multiforum. A gelonina pertence a uma classe de potentes toxinas vegetais que inactivam os ribossomas. Outros membros desta classe de toxinas vegetais inactivadoras de ribossomas são as das ramificações de abrina, ricina e modeccina. A gelonina, tal como a abrina e a ricina inibe a síntese proteica por destruição da sub-unidade 60S dos ribossomas de mamíferos. A inactivação de ribossomas é irreversível, não parece relacionar-se com co-factores e ocorre com uma eficiência que sugere que a gelonina actua por via enzimática.
Numerosos investigadores anteriores sugeriram ou referiram
agentes citotóxicos que se ligam a anticorpos para constituírem imunotoxinas. Têm particular interesse as imunotoxinas de anticorpos monoclonais conjugadas com fracções enzimáticas activas (cadeias A) de toxinas de origem bacteriana ou vegetal tais como a ricina ou a abrina. Nevelle e York, Immunol.
Rev. 62, 1982, 75-91; Ross et al., European J, Biochem., 1980, 104; Vitteta et al., Câncer Res. 42, 1982, 457-464; Trowbridge e Domingo Nature (Cond.) 294, 1981, 171-173·
Entre as toxinas mais activas inibidoras da síntese proteica estão a gelonina e ricina com base no peso da proteína. A gelonina é 10 a 1000 vezes mais activa para inibir a síntese proteica do que a cadeia A de ricina. Os péptidos semelhantes à ricina e abrina são compostos por duas cadeias, uma cadeia A que constitui a unidade tóxica e uma cadeia B que actua por ligação às células. Diferentemente da ricina e da abrina, a gelonina é composta por uma cadeia simples e, a ausência duma cadeia B para ligação às células é em si mesma não tóxica para as células intactas. (Stirpe, et al., J. Biol. Chem. 255, 1980, 6947-6953· As células de mamíferos, aparentemente, não possuem capacidade para ligar e/ou internalizar a molécula de gelonina natural. Os conjugados de gelonina para um anticorpo monoclonal que alveja um tumor tal como um anticorpo monoclonal 15AB dirigido para um antigenio presente em certas células tumorais, tais como as células do cancro da mama, proporciona um método específico para a ligação da gelonina às células e uma via para a internalização do complexo de gelonina-anticorpo. Entre as vantagens da utilização da toxina-gelonina sobre as toxinas tais como a cadeia A da ricina é a
- 7 sua reduzida toxicidade para os tecidos normais comparada com a cadeia A da ricina. A gelonina ligada com o antigénio antitumor monoclonal associado ao anticorpo monoclonal constitui um agente imunotóxico activo e selectivo para a terapêutica tumoral.
Uma vez que o anticorpo a que o fármaco, toxina ou marcador radioactivo está ligado se liga somente às células tumorais que expressa o antigénio específico, apenas são mortas as células tumorais. Contudo, a radiação proveniente de compostos radiomarcados não é limitada somente às células tumorais em que a radiação é absorvida. Os anticorpos radiomarcados apresentam problemas que limitam ou complicam o seu uso como agentes terapêuticos. Por exemplo, a degradação metabólica ou enzimática do anticorpo pode libertar o radiomarcador e permitir a sua distribuição por outros tecidos tais como rins ou medula óssea causando danos de radiação inaceitáveis nestes órgãos.
Resumo da invenção
A presente invenção proporciona imunoconjugados dum anticorpo que reconhece o antigénio 15A8 nas células do cancro da mama e do cancro cervical. Num aspecto, o anticorpo é ligado a uma toxina escolhida num grupo constituído por gelonina, cadeia A de ricina e cadeia A de adrina. Num outro aspecto o anticorpo 15A8 pode ligar-se com um fármaco citocídico tal como a adriamicina ou um modificador da resposta biológica tal como a linfocina ou a citosina. Num outro aspecto o anticorpo pode marcar-se com um marcador detectável tal como um radioο — ç
marcador, um agente quimiluminescente, um agente fluorescente í ’ ou uma enzima. Os imunoconjugados citocídicos são úteis para tratar ou prevenir o retorno de tumores que contêm 15A8 associado a tumor por administração destes imunoconjugados citocídicos a um indivíduo que necessite desse tratamento. Os imunoconjugados de 15A8 marcados de modo detectável são úteis para o diagnóstico e localização de tumores por meio de técnicas conhecidas. Estes imunoconjugados marcados também são úteis para a análise da presença do antigénio 15A8 em espécimes biológicos e para a localização do sítio do tumor in vivo por meios tecnicamente conhecidos.
Um dos objectivos da presente invenção é proporcionar uma composição citotóxica que se liga especificamente a células de tumor assassinas. Especificamente, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar uma composição citotóxica que se ligará especificamente e matará células de tumor que exprimem o antigénio 15A8 ( antigénio reconhecido pelos anticorpos monoclonais descritos e reivindicados no pedido de patente de invenção norte-americana Ser. NP. 29 373 depositado a 23 de Março de 1987)· Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de eliminação das células cancerígenas da mama humanas, células de carcinoma cervical e células de outros tumores que exprimem o antigénio 15A8 mediante o contacto das células com uma quantidade citocidicamente eficaz duma imunotoxina.
Ê ainda um objectivo da presente invenção que estas composições sejam tóxicas para células tumorais e que causem um mínimo de prejuízo no tecido normal.
δ ainda um objectivo desta invenção proporcionar uma composição que contém o anticorpo dirigido para um antigénio 15A8 associado com um tumor de 22 kD. $ ainda objectivo desta invenção proporcionar um anticorpo marcado utilizável para a detecção e diagnóstico e localização de tumores que exprimem o antigénio 15A8.
Descrição dos desenhos
A Figura 1 é um gráfico que representa o perfil de eluição de 15A8-gelonina por cromatografia G-75·
A Figura 2 representa o esquema de electroforese dum complexo 15A8-gelonina.
A Figura 3 é um gráfico do perfil de eluição cromatográfica de G-75 eluído em sefarose azul.
A Figura 4 representa a actividade inibidora da síntese proteica do complexo de gelonina-anticorpo 15A8.
A Figura 5 representa a ligação do complexo do anticorpo 15A8 livre a células Me-180.
A Figura 6 representa a actividade antiproliferativa do complexo 15A8-gelonina sobre células não-alvo HS 294%.
A Figura 7 representa a actividade antiproliferativa da gelonina e do complexo gelonina-anticorpo 15A8 sobre células Me-180.
A Figura 8 representa a actividade antiproliferativa da gelonina e do complexo gelonina-anticorpo 15A8 sobre células A431.
Descrição pormenorizada da invenção
Tal como aqui se utiliza a designação anticorpo monotí
cional significa uma composição de anticorpos com uma população de anticorpos homogénea. Não se considera estar limitado no que se refere à origem dos anticorpos ou à forma como são preparados.
As células de carcinoma da mama exprimem um antigénio de 22kD na sua superfície celular. Têm sido produzidos os anticorpos para este antigénio. Particularmente, têm sido produzidos os anticorpos dos isotipos IgG^, IgG2a θ IgG2b Que reconhece um epitope deste antigénio de 22 kD. Os hibridomas que reconhecem este 22 kL (produzindo predominantemente o isotipo IgG^), 15A8 G2a (produzindo predominantemente o isotipo IgG2a) el5A8 G^ (produzindo predominantemente o isotipo IgG^).
Todos os isotipos reconhecem o mesmo epitope do antigénio que para os fins da presente invenção será designado por epitope 15A8. Assim, todos estes anticorpos são funcionalmente equivalentes .
As culturas destes hibridomas representativos cujas células segregam o anticorpo do mesmo idiotipo, isto é, todas reconhecem o epitope 15A8, foram depositadas na American Type Culture Collection de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (ATCC) e foram-lhes atribuídos os números de aceitação
HB-8655 (para 15A8), HB-9344 (para 15A8 G2&) e HB-9345 para 15A8 G2b.
Podem preparar-se estes anticorpos monoclonais por métodos conhecidos pelos especialistas na matéria. Os processos para a preparação das culturas de células de hibridoma que produzem estes anticorpos está descrito pormenorizadamente no pedido de patente de invenção norte-americana séria N2 29 375
- 9 ί /
depositado a 23 de Março de 1987 que é uma continuação em parte do pedido de patente de invenção norte-americana
N2 678 274· depositado a 5 de Dezembro de 1984 e do pedido de patente de invenção europeia N2 0 184 369 publicado a 11 de Junho de 1986. Sumariamente, as células de tumor mamário (Soule, et al., JNCI, 51« 1973, 1409-14-13, número de aceitação na ATCC HTB-22) injectaram-se em murganhos BALB/c por via intraperitonial de 3 θ® 3 semanas num total de 3 ou 4 injecções. Retiraram-se os baços 3 dias após a última injecção e preparou-se uma suspensão de células de baço, lavou-se por meio de duas centrifugações (800 x g) em meio de Eagle modificado por Dulbecco.
Para a fusão re-suspenderam-se 108 células de baço de murganho imunizado e 107 células de mieloma PAI obtidas através do Dr. Theo Staehlin, Basileia, Suíça, J. Stocker, Research Disclosure, 21713, 1982, 155-157, numa solução a 45% (v/v) de polietilenoglicol I5OO. Seleccionaram-se as células híbridas em meio de hipoxantina-timidina amenopterina (HAT).
Desenvolveram-se os clones do hibridoma in vitro de acordo com as técnicas de cultura de tecidos habituais tais como as que estão descritas por Cotten et al., Eur. J. Immunol., 3, 1973, 136. Os anticorpos que produzem hibridomas que reagem com células MCF/7 e/ou MDA-157 mas não reagem com células de fibroplastos de prepúcio humano foram caracterizados posteriormente.
Os anticorpos produzidos pela linha de células 15A8 e anticorpos funcionalmente equivalentes produzidos por hibridomas reagiram com o antigénio 15A8 das células MOF-7· Também reagiram com 28/31 dos carcinomas mamários obtidos aleatoriamente e exibiram uma reacção menor com células epiteliais humanas normais fi provenientes da mama e dos túbulos proximais renais, do revestimento da bexiga, do esófago e das glândulas salivares mas não com células doutros tecidos substancialmente normais e apresentaram-se não reactivos em 14 de 18 outros tecidos malignos testados. 0 anticorpo 15A8 também reagiu com todas as doenças fibrocíticas, epitélio mamário normal, e diversos adecarcinomas. Não reagiu com mesoteliomas.
anticorpo 15A8 apresentou reacção cruzada com epitélio da mama normal, dos tubos proximais renais, da epiderme, do esófago e das glândulas salivares e com carcinomas cervicais do cólon e da próstata. No Quadro 1 do Exemplo 4 resume-se a ligação do anticorpo 15A8 a vários tumores e tecidos.
Como aqui se utiliza no que se refere aos anticorpos monoclonais murinos exemplificados anticancro da mama humano, a designação equivalente funcional” significa um anticorpo monoclonal que: (Ϊ) bloqueia . dum modo cruzado um anticorpo monoclonal exemplificado; (b) liga-se selectivamente às células que exprimem o antigénio 15A8 tais como as células de cancro da mama humano; (c) possuem um isotipo G ou M; (d) ligam-se ao antigénio 15A8 como determinado por imunoprecipitação ou por imunoensaio de sandwich; e (e) quando conjugado com gelonina exibe uma dose inibidora de cultura de tecido (TCID) de pelo menos 50# contra pelo menos uma das linhas de células MCF-7, ME-180, BT-20, ou A431 quando utilizado numa dose compreendida entre 5 θ 10 unidades por ml.
Conjugou-se o anticorpo 15A8 com gelonina utilizando-se N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) ou imunotiolano (IT) como agente de acoplamento. Testaram-se os conju11
Ζ
gados contra células Me-180 e Α4-31 através dum ensaio de cultura de tecido de 72 horas. Os conjugados do anticorpo exibiram uma actividade antiproliferativa aceitável (TCID 50% inferior a 5 unidades por ml) sobre estas duas linhas de células.
Mais pormenores da caracterização dos anticorpos apresentam-se nos exemplos seguintes.
Imunoquímicos
Os derivados imunoquímicos da presente invenção são de importância primordial, as imunotoxinas ( conjugados de anticorpo 15A8 e dum radical citotóxico ou dum modificador da resposta biológica) e marcados (por exemplo, radiomarcados, enzima-marcados ou fluorocromo-marcados) derivados de forma a que o marcador proporcione um meio de identificação dos complexos imunes que incluem o anticorpo marcado.
radical citotóxico da imunotoxina pode ser um fármaco citotóxico ou uma toxina enzimatiçamente activa proveniente de bactérias ou de vegetais (gelonina), ou um fragmento enzimaticamente activo (cadeia A) tal como uma toxina.
Pref er em-se as toxinas enzimatic amente activas e os seus fragmentos e são exemplificados pela gelonina, cadeia A de difteria, fragmentos activos não ligantes de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (proveniente de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de adrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytoiacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de saponaria, officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, e enomicina. A conjugação mais preferida é com a gelonina
Os modificadores da resposta biológica que se podem ligar com o anticorpo 15A8 e utilizados na presente invenção, incluem, mas não estão limitados a estes, linfocinas e citocinas tais como IL-2, interferons (o<S, ρ, Y), e IL-6. Estes modificadores da resposta biológica apresentam uma diversidade de efeitos sobre as células de tumor. Entre estes efeitos incluem-se o aumento da eliminação de células de tumor por acção directa assim como o aumento da eliminação das células de tumor por aumento dos processos de defesa do hospedeiro. A conjugação do anticorpo 15A8 com estes modificadores da resposta biológica permitirá a localização selectiva dentro dos tumores e consequentemente melhora os efeitos antiproliferativos suprimindo os efeitos não específicos que conduzem à toxicidade de células não alvejadas.
Os fármacos citotóxicos que são utilizáveis na presente invenção, incluem mas não estão limitados à adriamicina e seus derivados, o complexo de cis-platina e seus derivados, bleomicina e metotrexato e seus derivados.
Estes fármacos citotóxicos são algumas vezes utilizáveis para o manejo (manageraent) clínico de tumores recorrentes e em particular do cancro da mama, mas a sua utilização é complicada pelos efeitos secundários graves e pelo dano causado às células não alvejadas.
anticorpo 15A8 pode servir como um veículo útil destes fármacos proporcionando um meio eficiente tanto para a sua libertação no tumor como para uma penetração reforçada nas próprias células tumorais. Além disso, a libertação do anticorpo ±5 Ζ específico dos fármacos citotóxicos nos tumores, proporcionará protecção de sítios sensíveis tais como o fígado, rim e medula óssea de efeitos nocivos dos agentes quimioterápicos.
uso de fármacos conjugado com o do anticorpo 15A8 como um sistema de libertação permite uma dose menor do fármaco em si uma vez que todos os radicais do fármaco se conjugam com os anticorpos concentrados no interior do tumor.
Podem preparar-se conjugados de anticorpos monoclonais utilizando-se uma diversidade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais. Exemplos destes reagentes são SPDP,
IT, derivados bifuncionais de imidoésteres tais como o cloridrato de adipimidato de dimetilo, ésteres activos tais como suberato de di-succinimidilo, aldeídos tais como o glutaraldeído, compostos bis-azido tais como bis(]3-azidobenzoil)-hexanodiamina, derivados de bis-diazónio tais como bis(p-diazóriiobenzoil)-etilenodiamina, diisocianatos tais como o 2,6-diisocianato de tolileno e compostos de bis-fluoreto activo tais como 1,5-difluoro-2,4—dinitrobenzeno.
Quando utilizados para exterminar células de cancro da mama humana in vitro para fins de diagnóstico os conjugados serão habitualmente adicionados ao meio de cultura de células numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM. A composição e o modo de administração para utilização in vitro não são críticos. Serão utilizadas normalmente composições aquosas que são compatíveis cont o meio de cultura ou com o meio de perfusão. A citotoxicidade pode ser avaliada por técnicas convencionais para determinar a presença ou o grau do cancro da mama.
Os medicamentos radioactivos citotóxicos para o diagnós- 14 tico e tratamento de tumores que contêm oantigénio 15A8 tais ( como cancro da mama podem ser preparados por conjugação de isótopos que emitem energia de transferência linear alta (por exemplo, Y, Pr) com os anticorpos. A designação radical citotóxico aqui utilizada considera-se incluir estes isótopos.
Os marcadores que são utilizados para preparar versões marcadas dos anticorpos incluem grupos que podem ser detectados directamente tais como os fluorocromos e marcadores radioactivos assim como radicais, tais como enzimas, que podem regair ou formar derivados (derivatized) para serem detectados. Exemplos destes marcadores são 32P, ^C, fluoresceína e os seus derivados, rodamina e os seus derivados, dansil, umbeliferona, luciferia, 2,5-di-hidroftalzainedionas, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, lisozima e glucose-6-fosfato-desidrogenase.
Os anticorpos podem ser marcados com estes marcadores por métodos conhecidos. Por exemplo, os agentes de acoplamento tais como aldeídos, carbodiimidas, dimaleimida, imidatos, succinimidas, benzadina bis-diazotada e outros podem-se utilizar para acoplar os anticorpos aos marcadores fluorescentes, quimioluminescentes e enzimas anteriormente descritas.
Os anticorpos e os anticorpos marcados podem-se utilizar numa diversidade de procedimentos de imuno-imagem e de imuno-ensaio para detectar a presença de tumores que exprimem o antigénio 15A8 tais como o cancro da mama, num doente ou para controlar (monitor) o estado desse cancro num doente já diagnosticado. Quando utilizados para controlar a situação de um cancro pode utilizar-se um processo de imuno-ensaio quantitativo. Estes ensaios de controlo são realizados periodicamente e os resultados comparados para
determinar se o tumor aumentou ou diminuiu. As técnicas de ensaio correntes que podem utilizar-se incluem os ensaios directos e indirectos. Os ensaios directos envolvem a incubação ; duma amostra do tecido ou das células do doente com um anticorpo . marcado. Se a amostra de células que contêm o antigénio 15A8, inclui células do cancro da mama, o anticorpo marcado ligar-se-à a essas células. Após a lavagem do tecido ou das células para eliminar o anticorpo marcado não ligado a amostra do tecido é observada (read) para determinar a presença de complexos imunes marcado.
Para a utilização em diagnóstico os anticorpos são distribuídos habitualmente sob a forma de um kit1’. Estes kits contêm usualmente: o anticorpo sob uma forma marcada em contentores apropriados, reagentes para incubações e lavagens e substratos ou agentes deles derivados dependendo da natureza do marcador. Podem também estar incluídos controlos para o antigénio 15A8 e instruções.
A administração das imunotoxinas da presente invenção a um indivíduo a quem foi diagnosticado um tumor com um determinante antigénio 15A8, permitirá dirigir e concentrar o agente citotóxico no local em que este é necessário para eliminar as células tumorais. Orientando deste modo os agentes citotóxicos, diminuir-se-à ou eliminar-se-à a toxicidade não específica para outros órgãos, tecidos e células.
Quando utilizadas para terapêutica in vivo, as imunotoxinas são administradas ao doente em quantidades terapêuticas eficazes, isto é, quantidades que eliminem ou reduzam a dimensão do tumor. Serão administradas, normalmente, por via /
parentérica, de preferência por via endovenosa. A dose e a posologia dependerão da natureza do cancro, primário e metastásico, e da sua população, características da imunotoxina particular, por exemplo do seu índice terapêutico, do doente e da história do doente. A quantidade de imunotoxina administrada usualmente variará entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal.
Para administração parentérica as imunotoxinas devem ser formuladas sob a forma de uma dose unitária injectáVel (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo farmacêutico aceitável para administração parentérica. Estes veículos serão inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. Exemplos destes veículos são a água, a solução de cloreto de sódio, a solução de Ringer, a solução de dextrose e sero-albumina humana a 5%· Também podem ser utilizados veículos não aquosos tais como óleos fixos e oleáto de etilo. Podem-se utilizar como veículos lipossomas. 0 veículo pode conter quantidades diminutas de aditivos tais como substâncias que promovem a isotonia e a estabilidade química, por exemplo, agentes tampão e conservantes. A imunotoxina deverá, habitualmente, ser incluída nestes veículos em concentrações compreendidas entre cerca de 0,1 mg/ml e 10 mg/ml.
Purificou-se toxina de gelonina a partir de sementes de gelonin multiflorinum pelo método de Stirpe et al., supra.
Em resumo, a gelonina foi extraída a partir das sementes por homogeneização em solução de cloreto de sódio tamponada (pH 7,4). A fase sobrenadante concentrou-se após a diálise contra fosfato de sódio 5 mM (pH 5,5) e agelonina foi purifi1/
Lf.
cada depois por cromatografia de permuta iónica tal como descrito no Exemplo 1. A pureza da toxina de gelonina foi avaliada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e electroforese de gel de dodecilsulfato-poliacilamida (SDS-page).
A toxina de gelonina migrou numa banda única com um peso molecular aproximado de 29-30000 daltons.
A actividade da toxina de gelonina foi avaliada como descrito no Exemplo 2 por inibição da síntese proteica, num sistema isento de células.
anticorpo 15A8G2 modificado com SPDP, como descrito no Exemplo foi conjugado com gelonina modificada por iminotionano, tal como descrito nos exemplos 3 θ 6. Purificou-se o anticorpo conjugado com a gelonina, como descrito no Exemplo 7, por cromatografia de coluna de Sephadex G-75· Determinou-se a toxicidade da gelonina conjugada com o anticorpo pela inibição da síntese proteica e pela sua actividade antiproliferativa por ensaios in vitro e in vivo.
Os exemplos que se seguem proporcionam uma descrição pormenorizada da preparação, caracterização e utilização dos anticorpos monoclonais de imunotoxina da presente invenção.
Estes exemplos não são considerados como limitativos da presente invenção em qualquer aspecto.
Exemplo 1
Purificação de gelonina
Pietirou-se o revestimento de sementes de Gelonin multiflorinum e fraccionaram-se as sementes num homogeneizador com oito volumes de cloreto de sódio 0,14 M contendo fosfato
Ití
de sódio 5 mM (pH 7,4). Deixou-se homogeneizar durante a noite à temperatura de 4°C sob agitação contínua, arrefeceu-se sobre gelo e centrifugou-se a 35000 x g durante 20 minutos à temperatura de 0?C. Retirou-se a fracção sobrenadante, dialisou-se contra fosfato de sódio 5 mM (pH 6,5) θ concentrou-se utilizando-se um filtro pmlO. Introduziu-se a amostra numa coluna de permuta iónica CM-52 de 20 x 1,5 cm, equilibrou-se com fosfato de sódio 5 mM (pH 6,5).
Eluiu-se a substância que se ligou à resina de permuta iónica, com 400 ml de gradiente de cloreto de sódio linear 0 a 0,3 M com um caudal de 25 ml/hora, à temperatura de 4°C. Recolheram-se fracções de 5 ml. Controlaram-se as fracções num espectrofotómetro a 280 nm. A gelonina elui nas fracções cerca de 55 & 70 e apresentou o último pico de eluição principal. As fracções 55-70 foram reunidas, dialisaram-se contra água destilada duas vezes e concentraram-se por liofílização. A pureza e o peso molecular de cada preparação foi verificada por cromatografia líquida de alta pressão utilizando-se uma coluna de impregnação de gel TSK 3000 com tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4 e electroforese em dodecilsulfato de sódio a 15% gel de poliacrilamida (SDS-Page). A gelonina migrou com uma banda única com um peso molecular aproximado de 29-30000 daltons.
Exemplo 2
Ensaio da actividade da gelonina
A actividade da gelonina foi controlada através dum ensaio de inibição de síntese proteica isento de células. 0 ensaio
de inibição de síntese proteica isento de células foi realizado por adição sequencial de 50 jil de lisado de reticulocitos de coelho, dissolvido imedi atam ente antes do uso, misturando-se após cada adição dos componentes seguintes: 0,5 ml de 0,2 M Tris HCI (pH 7,8), 8,9 ml de etilenoglicol e 0,25 ml de HCI 1 M; 20 microlitros de uma mistura energética dum sal de aminoácido (SAEM) constituído por: KOI 0,375 M, Mg (0^002^ 10 mM, glucose 15 mM, 0,25-10 mM de aminoácidos (com exclusão de leucina), ATP 5 mM, GTP 1 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), yil de creatinina fosfato-creatinina-fosfoquinase, 8 jil de 14 C-leucina (Amersham, 348 mCi/mmole) e adicionando-se 1,5 Jil de soluções contendo concentrações diversas da mistura de gelonina. Incubou-se a mistura durante 60 minutos à temperatura de 30°C. Controlou-se a incorporação de 14 C-leucina numa aliquota da mistura, por precipitação da proteína sintetizada em filtros de fibra de vidro, lavagem com TCA a 10# e acetona e controlo da radioactividade num contador Beta utilizando-se líquido de cintilação Aquasol. Utilizou-se a gelonina com uma actividade específica não inferior a 4 χ 10θ U/mg para a conjugação com os anticorpos. Uma unidade de actividade de gelonina consiste na quantidade de proteína de gelonina que provoca uma inibição de 50# na incorporação de 14 C-leucina no ensaio isento de células.
Exemplo 3
Modificação de gelonina com iminotiolano
Concentrou-se gelonina em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato até aproximadamente 2 mg/ml num micro- 20 -
/ concentrador Centricon 10. Adicionaram-se cloridrato de trietanolamina (TEA/HC1), pH 8 e EDTA para uma concentração final de 60 mM de TEA/HC1 e lmM de EDTA, pH 8,0. Adicionou-se uma solução de reserva de 2-iminotiolano 20 mM até uma concentração final de 1 mM e incubou-se a amostra durante 90 minutos à temperatura de 4-°C sob uma corrente de azoto gasoso.
Removeu-se o excesso de iminotiolano por filtração em gel numa coluna de Sephadex G-25 (1 x 24- cm) pré-equilibrada com bis-Tris 5 mM/tampão de acetato, pH 5,8, contendo NaCl 50 mM e EDTA 1 mM. Analisaram-se as fracções para o conteúdo de proteína em placas microtituladoras utilizando-se o ensaio de ligação de corante de Bradford. Resumidamente, adicionaram-se 4-0 jil de amostra, 100 jil de solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS) e 4-0 jil de concentrado de corante a cada cavidade. Leu-se a absorvãncia a 600mm num Dynatech Microelisa Autoreader. A gelonina eluiu no volume vazio (fracções cerca de 14- a 20). Estas fracções foram reunidas e concentradas com um microconcentrador Centricon-10.
Exemplo 4Preparação e caracterização de anticorpo monoclonal para o antigénio 15A8 do cancro da mama
Podem preparar-se os anticorpos monoclonais por métodos conhecidos pelos especialistas na matéria. 0 procedimento para a preparação de culturas celulares de hibridoma que produzem estes anticorpos está descrito em pormenor no pedido de patente de invenção norte-americana Série N2. 29 373, deposi21
tado a 23 de Março de 198? que constitui uma continuação em parte do pedido de patente de invenção norte-americana Série Νθ. 678 264- depositado a 5 de Dezembro de 1984- e na publicação do pedido de patente de invenção 0 184- 369 (publicado a 11 de Junho de 1986). Resumidamente, injectaram-se células de tumor mamário (Soule, et al., JNCI, 51. 1973, 14-09-14-13 - aceitação N2. HTB-22 da ATCC) em murganhos BALB/c por via intraperitoneal de três em três semanas num total de 3 â 4- injecções. Recolheram-se os baços 3 dias apés a última injecção e preparou-se uma suspensão de células de baço que se lavou mediante duas centrifugações (800 x g) em meio de Eagles modificado por Dulbecco. Re—suspenderam-se para fusão em solução a 4-5# (v/v) de polietilenoglicol 1500, 108 células de baço de murganho imunizado e 107 células de mieloma PAI obtidas junto do Dr. Theo Staehlin, Basileia, Suiça; J. Stocker, Research Disclosure, 21713, 1982, 155-157· Seleccionaram-se as células híbridas em meio de hipoxantina-timidina aminopterina (HAT).
Desenvolveram-se clones do hibridoma in vitro de acordo com técnicas de cultura de tecido conhecidas tais como as descritas por Cotten et al., Eur, J. Immunol., 3, 1973, 136. Posteriormente caracterizaram-se hibridomas produtores de anticorpos que reagiram com células MCP/7 e/ou células MDA-157 mas que não reagiram com células de fibroblastos de prepúcio humano. Os anticorpos produzidos pela linha de células 15A8 e os anticorpos funcionalmente equivalentes produzidos por hibridomas reagiram com o antigénio 15A8 nas células MCP-7. Também reagiram com 28 de 31 carcinomas mamários humanos obtidos aleatoriamente e ensaiados, e exibiram uma reacção menor com células epiteliais humanas normais da mama, dos túbulos proximais renais, do revestimento da bexiga, do esófago e das glândulas salivares mas não com as células de outros tecidos substancialmente normais e não reagiram com 14 de 18 outros tecidos malignos testados. 0 anticorpo 15A8 também reagiu com todas as doenças fibrocísticas, epitélio mamário normal e com numerosos adenocarcinomas. Nâo reagiu com mesoteliomas. 0 anticorpo 15A8 tem reacção cruzada com epitélio da mama normal, do túbulo proximal renal, da epiderme, do esófago e das glândulas salivares e com carcinomas cervicais do cólon e da próstata. A ligação do anticorpo 15A8 a diversos tumores e tecidos está resumida no Quadro 1 a seguir:
- Quadro 1
Ligação do anticorpo 15A8 com tecidos e tumores
15A8
LINHA DE CÉLULAS (viva) Carcinoma mamário
MCE—7 +
MDA-157 +
DU4475
Não mamário
HFP
PAI
TECIDOS (liofilizados)
Carcinoma mamário humano (total)
Carcinoma tubular de infiltração primária
Cancro de infiltração com metástases no fígado, pulmão, omento e cérebro + (28/31) + (16/19) + (5/5)
Carcinomas mamários coloidais, papilares intraductais + (6/6)
Carcinoma de comedão + (1/1)
Cistossarcoma filóide - (1)
Adenose esclerose hiperplasia ductal papilar + (2/2) doença fibrocística + (2/2) cíM- -
Fibroadenona
Epitélio mamário normal + (2/2) + (4A)
TECIDOS NORMAIS
Epiderme
Glândulas salivares
Tiróide
Supra-renais
Pulmão
Brônquios
Coração
Aorta
Esófago
Estômago
Intestino delgado Intestino grosso Fígado
Pâncreas
Vesícula biliar
Baço
Nódulos linfáticos Rim (2)
Bexiga
Ovários
Testículos
Cerviz
Útero
Medula óssea Cérebro prox tubule +
MALIGNIDADES NAO MAMÁRIAS Pulmão
Cancro de células escamosas
Adenocarcinoma
Cancro de pequenas células Gastrientestinal
Cancro do estômago Colangioc arcinoma Cancro do pâncreas Cancro do cólon
Génito-urinário
Cancro da cerviz
Cancro do ovário Cancro da bexiga
Cancro renal
Cancro da próstata (2)
Linfoma de células T
Mesotelioma
Melanoma
-A
-A + = reacção de imunoperoxidase positiva (habitualmente forte) - = sem reacção + = reacção fraca
- 26 λ
Exemplo 5
Modificação do anticorpo monoclonal 15A8 com SPDP
Preparou-se uma solução de reserva de 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo em dimetilformamida a 3 mg/ml de dimetilformamida anidra. Uma vez que a SPDP cristalina pode sofrer hidrólise, a concentração real do reagente químico reticulante foi determinada por espectrofotometria analisando a absorvância a 260 nm num espectrofotómetro de feixe duplo. Calculou-se a concentração de FPDP de reserva a partir da equação seguinte:
Alteração da absorvância a 260 nm x (5,01) = mmoles/ml/SPDP 0,02 x 10^ ml/mmole 0,01
A um tubo de vidro adicionou-se 1 mg de anticorpo monoclonal 15A8 em 0,5 ml de PBS. Adicionou-se ao tubo, lentamente, solução de reserva de SPDP com um excesso molar de 5 vezes e agitou-se continuamente. Incubou-se a mistura durante 30 minutos à temperatura ambiente, agitou-se de 5 ®m 5 minutos durante 0 período de incubação. Removeu-se o excesso de SPDP que nao reagiu, por cromatografia de filtração por gel numa coluna Sephadex G-25 (1 x 24 cm) pré-equilibrada com PBS. Recolheram-se fracções de 0,5 ml durante a eluição com PBS e analisaram-se relativamente ao teor de proteína pelo método de coloração de Bradford. 0 anticorpo eluiu no volume vazio (fracções aproximadamente entre 14 e 20). Estas fracções reuniram-se e concentrou-se a proteína num microconcentrador Centricon-30, e lavou-se o material retido no Centricon com tampão de fosfato
- 4'/ -
de sódio 100nM, pH 7,0, contendo EDTA (0,5 mM). Concentrou-se o anticorpo para um volume final de aproximadamente 0,5 a 0,75 ml.
Exemplo 6
Conjugação do anticorpo monoclonal 15A8 modificado por SPDP com gelonina modificada com iminotiolano
Misturou-se o anticorpo monoclonal 15A8 modificado como descrito no Exemplo 4 com um peso igual de gelonina modificada como descrito no Exemplo 3. Esta proporção correspondeu a um excesso molar de 5 vezes de gelonina relativamente ao anticorpo. Ajustou-se o pH da mistura para 7 por adição de tampão TEA/HC1 0,05 M, pH 8,0, e incubou-se a mistura durante 20 horas à temperatura de 4°C sob atmosfera de azoto. Adicionou-se iodoacetamida 0,1 M até uma concentração final de 2 mM para bloquear quaisquer grupos sulfidrilo livres remanescentes e continuou-se a incubação durante mais 1 hora a uma temperatura de cerca de 25°C. Conservou-se a mistura reaccional à temperatura de 4°C até purificação por filtração por gel.
Exemplo 7
Purificação de complexo gelonina-anticorpo monoclonal 15A8
Retirou-se a gelonina não conjugada das misturas reaccinais do Exemplo 6 por filtração em gel numa coluna de Sephadex G-75 (1,6 x 31 cm) pré-equilibrada com PBS.
Concentraram-se as misturas reaccionais provenientes do Exemplo 6 até aproximadamente 1 ml num microconcentrador Centricon 30 antes de introduzir na coluna de Sephadex. Recolhe28 -
ram-se fracçoes de 1 ml e analisaram-se aliquotas de 50 jjI relativamente ã proteína pelo ensaio de ligação de corante de Bradford. M. Bradford, Anal. Biochem, 72, 1976, 248.
anticorpo livre e conjugado com gelonina eluiu no volume vazio (fracções cerca de 17 a 23), enquanto a gelonina não conjugada eluiu: nas fracções de cerca de 35 a 41. A Figura 1 representa o perfil de eluição da coluna de G-75.
A figura'1 que representa o perfil de eluição demonstra que a gelonina pode ser separada do conjugado gelonina-anticorpo e do anticorpo não conjugado que co-eluem no primeiro pico (fracções cerca de 38 a 52). Este comportamento de eluição foi confirmado pela electroforese de aliquotas de 50 sobre gradiente de 5 a 20% de géis de SDS poliacrilamida não redutores como se mostra na Figura 2. A mistura de acoplamento carregou-se na pista 3· Estão representadas as bandas de gelonina livre, anticorpo livre e de uma molécula de gelonina acoplada por cada molécula de anticorpo e de duas moléculas de gelonina acoplada por molécula de anticorpo. 0 pico do volume vazio da coluna G-75 que oontém o anticorpo livre e o conjugado de anticorpo-gelonina observa-se na pista 4.
Retirou-se o anticorpo não conjugado do anticorpo conjugado com gelonina por cromatografia de afinidade com uma coluna de 1 x 24 cm de Blue Sepharose CL-6B pré-equilibrada com tampão de fosfato de 10 mM, pH 7,2 contendo cloreto de sódio 0,1 M. Após carregar a amostra do eluato G-75 lavou-se a coluna com 30 ml do mesmo tampão para eluir compietamente o anticorpo não conjugado. 0 anticorpo conjugado com gelonina ligou-se à coluna e eluiu com um gradiente linear de cloreto
de sódio 0,1 a 2 M em tampão de fosfato 10 mM, pH 7,2. 0 complexo anticorpo-gelonina eluiu aproximadamente a cloreto de sódio 0,7 M como se mostra na Figura 5 que representa o perfil de eluição da coluna de Blue Sepharose. 0 fluxo até ao pico (flow-through peak) contém apenas o anticorpo livre (Figura 2, pista 5) enquanto as fracções 50 a 80, eluídas com concentração salina elevada, continham um conjugado de 15A8-gelonina isento de gelonina ou de anticorpo não conjugados (Fig. 2, pista 6).
teor de proteína das fracções eluídas foi determinado pelo ensaio de ligação ao corante de Bradford. As fracções que continham proteína foram reunidas e confirmado o esquema de eluição por electroforese num gradiente de 5 a 20% de gel de poliacrilamida não redutor. Na Figura 2 representa-se o esquema electroforético do complexo 15A8-gelonina.
Utilizou-se o sistema de traduçao in vitro de reticulocitos de coelho descrito no Exemplo 3 para avaliar a actividade de gelonina do complexo gelonina-anticorpo 15A8 essencialmente puro. Como se mostra na Figura 4 a gelonina-anticorpo 15A8 essencialmente puro apresenta actividade no ensaio do lisado de reticulocitos. Uma diluição a 1:1000 da amostra original provocou uma inibição de aproximadamente 50% da síntese proteica, isto é, uma redução de 50% na incorporação de 140-leucina na proteína. Assim, a actividade da preparação origi-, nal 'pra de 1000 U/ml.
- ου (
Exemplo 8
Comparação da ligação a células-alvo de anti-corpo 15A8 conjugado e não conjugado com gelonina
Avaliou-se a capacidade do anticorpo 15A8 conjugado com gelonina e nao conjugado para se ligar a células alvo.
Em cada cavidade da placa microtituladora adicionaram-se 50000 células alvo Me-180 ou células de melanoma humano não alvo células AAB-527. Secaram-se as células nas placas durante a noite à temperatura de 37°C. Em seguida lavaram-se as células com 3 substituições de PBS frio e secaram-se ao ar durante a noite. Após este tratamento os determinantes antigénicos de superfície da célula permaneceram antigenicamente activos.
Após a ligação das células, lavaram-se as placas com tampão de lavagem (Tris 9,68 mM, cloreto de sódio 64,8 mM,', 16 ml de Tween 20, 800 mg de timerasol em 8 litros de água destilada duas vezes. As amostras de anticorpo foram diluídas com tampão de lavagem que continha 1% de albumina de soro de bovino (p/v) (tampão de diluição). Adicionaram-se às cavidades 50/il de concentrações várias, compreendidas entre 0,05 θ 50 jig/1 tanto de anticorpo 15A8 conjugado como de anticorpo 15A8 não conjugado. Após incubação durante 1 hora à temperatura de 4°C, retiraram-se os sobrenadantes e lavaram-se as cavidades duas vezes com tampão de lavagem.
A cada cavidade adicionaram-se 50 ^il de IgG anti-murganho desenvolvido na cabra e conjugado com peroxidase de rábano obtido na Bio-rad e diluída a 1:1000 (v/v) (HPGAM) em tampão de diluição. Incubaram-se as placas durante 1 hora à tempera- 2J- tura de 4°C e lavaram-se as cavidades duas vezes com tampão de lavagem. Após incubação das placas com 50 jil de solução de substrato (citrato de fosfato 80 mM pH 5,0, o-fenilenodiano 1 mM (ABTS) e 4 jil de peróxido de hidrogénio a 30%), na ausência de luz, durante 30 minutos à temperatura ambiente, adicionaram-se a cada cavidade 25 £il de ácido sulfúrico 4 N. Determinou-se a absorvância num scanner de Elisa a 492 nm.
Os resultados apresentam-se na Figura 5· complexo gelonina-15A8 ligou-se às células-alvo Me-180 na mesma extensão que o anticorpo 15A8 natural. Dado que não houve diferença entre a ligação de 15A8-gelonina e a de anticorpo não conjugado ao antigénio de Me-180 contido nas células-alvo. 0 processo de conjugação química não altera a actividade do anticorpo para o seu antigénio alvo. Não há ligação detectável entre 15A8 ou o complexo 15A8-gelonina para células de melanoma AAB527 não alvo.
Exemplo 9
Efeitos anti-proliferativos de gelonina e do complexo gelonina-anticorpo 15A8
Avaliaram-se os efeitos anti-proliferativos da gelonina e do complexo gelonina-15A8 por plaqueação de aproximadamente 5000 células/cavidade em placa microtituladora, em 200 jj.1 de meio de cultura de tecido apropriado. Deixaram-se as células a aderir durante 24 horas à temperatura de 37°C, numa atmosfera de ar com 5% de dióxido de carbono. Trataram-se as células não alvejadas, células de melanoma HS294 negativas para o antigénio, células de carcinoma escamoso A431 e Me-180 positivas para o antigénio na fase logarítmica, com diversas concentrações tanto de meio isolado (controlo) como de gelonina ou conjugado 15A8-gelonina e incubaram-se à temperatura de 37°C sob atmosfera de ar contendo 5% de dióxido de carbono, durante 72 horas. Lavaram-se as placas 3 vezes com PBS frio. Adicionaram-se 50 jil de metanol a cada cavidade e lisaram-se as células por ciclos repetidos de congelação e descongelação. Em seguida, determinaram-se as concentrações de proteína pelo teste de coloração de Bradford. Avaliou-se a inibição do crescimento celular por redução nas concentrações de proteína de células tratadas comparadas com controlos tratados com solução de cloreto de sódio. Como se mostra na Figura 6, não houve inibição no crescimento das células pelo conjugado 15A8-gelonina nas células de melanoma HS294t não alvejadas. As células Mè-180 alvo eram 7 e 5 unidades logarítmicas (logs), respectivamente, mais sensíveis para a imunotoxina de 15A8-gelonina do que para a gelonina isolada (Fig. 7 θ 8, respectivamente).
A Figura 7 demonstra que aproximadamente a 5 U/ml o conjugado de gelonina-anticorpo 15A8 inibiu 50% das células Me-180 enquanto era necessária concentração de 10' U/ml de gelonina não conjugada para a obtenção do mesmo efeito.
Obtiveram-se resultados similares com células A431, uma linha de células de carcinoma epidermóide positiva para o antigénio 15A8. Como se mostra na Figura 8, o complexo gelonina-anticorpo 15A8 eliminou as células para uma concentração de aproximadamente 5 unidades logarítmicas (5 log) menor do que a da toxina livre.
Uma vez que as células que contêm o antigénio 15A8 na sua superfície foram eliminadas pela imunotoxina gelonina-15A8, esta imunotoxina é um método eficaz para alvejar e eliminar células que contêm o antigénio 15A8 associado com tumores, dado que minimizam ou impedem o dano ou prejuízo de células normais que contenham antigénio não associado com tumor.
Exemplo 10
Efeito do conjugado gelonina-anticorpo 15A8 in vivo
Testou-se a actividade do conjugado do anticorpo 15A8 com gelonina ou de gelonina isolada (como controlo) contra uma variante altamente tumorogénica das linhas de células MW de cancro da mama humano (Chu, et al., Câncer Research, 4-5, 1357-1566). Injectaram-se murganhos fêmeas atímicos BAB/c nu/nu com 20-24 g na região axilar direita com 1,25 x 10 células em 0,5 ml para cada animal. Após 3 dias injectaram-se 200 jil de complexo 15A8-gelonina ou gelonina livre em meio de
Eagle modificado por Duibecco contendo 50 ng/ml de hidrocorti-7 -7 sona e de insulina em concentrações de 10 M, 3 x 10 M, χ 10”' e 10 M, na veia da cauda para se obterem concentra— —8 _8 -8 ções plasmáticas aproximadas de 10 M, 3 x 10 M, 6 x 10 _7 e 10 ' M. Decorridas 4 semanas mediram-se os tumores por meio de compassos de calibre e 5 semanas após a injecção retiraram-se e pesaram-se os tumores. Os resultados representam-se no Quadro 2.
- 2-t- Quadro 2
Efeitos in vivo do conjugado gelonina-anticorpo 15A8
Cone, in vivo (M) Volume (cm) Peso (g)
10 8 2,5 2,55
IO8 4,00 3,87
3 x 108 0,86 0,54
3 x 108 1,66 1,66
6 χ IO8 1,46 1,48
6 χ 108 5,42 5,05
107 4-,75 3,51
10“ 7 2,39 .,..1.1¾
23,11 20,19
Conjugado
10“ 8 0,15 0,21
6 x 10“8 1,88 2,54
3 x IO8 0,14 0,14
10“8 3,02 1,86
6 x 10“8 3,15 1,50
10 7 1,69 1,69
107 5,24 4,27
3 x 10~8 1,87 2,18
17,24 14,39
A concentração de gelonina ou de conjugado gelonina-15A8 calculou-se aproximadamente admitindo uma diluição de 10 vezes da dose injectada no volume de sangue do animal. Baseado
- 55 no tamanho médio do tumor e no peso médio do tumor o conjugado gelonina-15A8 reduziu o crescimento do tumor de aproximadamente a 74-% como se mostra em seguida:
Tamanho do tumor às 5 semanas:
Conjugado gelonina-15A8 = 17*24 = 75% gelonina 23.11
Peso do tumor às 5 semanas:
Conjugado 15A8-gelonina = 14,59 = 71% gelonina 20.19
Assim, pode verificar-se que com apenas uma administração do complexo gelonina-15A8 o tamanho do tumor foi reduzido de 70^-75%. Injecções mais frequentes da imunotoxina devem ser ainda mais eficazes para reduzirem a dimensão do tumor.
Um especialista na matéria facilmente compreenderá que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objectivos e obter os fins e vantagens mencionadas assim como as que lhe são inerentes. Os compostos, métodos, processos e técnicas descritos aqui são, presentemente, representativos de aspectos preferidos, e pretende-se que sejam considerados como exemplos e não como limitações do âmbito da presente invenção.
Alterações e outros usos poderão ocorrer aos especialistas na matéria os quais estarão abrangidos no espírito desta invenção e que são definidos pelo âmbito das reivindicações apensas.

Claims (4)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. - Processo para a preparação de composições citotõxicas, caracterizado pelo facto de se conjugar o anticorpo 15A8 com um radical escolhido no grupo constituído por radicais citotõxicos e marcadores detectãveis.
  2. 2. - Processo de acordo com á reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o referido radical no grupo constituído por uma toxina, um fármaco citocídico modificador da resposta biológica e um marcador detectãvel.
  3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido radical ser a gelonina.
  4. 4.- Método de tratamento de doenças celulares proliferati . . - * - . - ----- , - ---.vas tais como cancro da mama, carcinoma cervical, carcinoma da mama humano e cancro cervical humano e ainda para impedir a repetição de tumores, caracterizado pelo facto de se administrar uma dose citocida eficaz compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de
    10 mg/Kg de massa corporal de uma composição citotóxica preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 1 a um indivíduo neces sitado desse tratamento,
    Lisboa, 14 de Novembro de 1989 O Ageide L.....w· aa Propriedade inclusfriaf
    RESUMO
    Processo para a preparação de imunoconjugados de gelonina com anticorpos específicos de tumor apropriados para o diagnóstico e a terapêutica do cancro
    Descreve-se um processo para a preparação, de composições para diagnóstico e tratamento de doenças celulares proliferativas, tais como o carcinoma da mama e o carcinoma cervical, assim como outros tumores associados com o antigénio 15A8, que utiliza imunoconjugados citotõxico, tal como um conjugado de gelonina-anticorpo monoclonal 15A8.
    Lisboa, 14 de Novembro de 1989
PT91075A 1988-07-07 1989-07-06 Processo para a preparacao de imunoconjungados de gelonina com anticorpos especificos de tumor apropriados para o diagnostico e a terapeutica do cancro PT91075B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21659588A 1988-07-07 1988-07-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT91075A PT91075A (pt) 1990-02-08
PT91075B true PT91075B (pt) 1995-01-31

Family

ID=22807704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT91075A PT91075B (pt) 1988-07-07 1989-07-06 Processo para a preparacao de imunoconjungados de gelonina com anticorpos especificos de tumor apropriados para o diagnostico e a terapeutica do cancro

Country Status (17)

Country Link
US (1) US6669938B1 (pt)
EP (2) EP0423228B1 (pt)
JP (1) JP2756329B2 (pt)
KR (1) KR0152272B1 (pt)
AU (1) AU636113B2 (pt)
CA (1) CA1336497C (pt)
DE (1) DE68912334T2 (pt)
DK (1) DK175835B1 (pt)
ES (1) ES2059759T3 (pt)
FI (1) FI102517B1 (pt)
IE (1) IE62463B1 (pt)
IL (1) IL90688A (pt)
NO (1) NO303122B1 (pt)
NZ (1) NZ229652A (pt)
PT (1) PT91075B (pt)
WO (1) WO1990000405A1 (pt)
ZA (1) ZA894665B (pt)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
NZ237688A (en) * 1990-04-19 1993-01-27 Res Dev Foundation Antibody-cytotoxic immunoconjugate-containing compositions and cancer treatment
IE912716A1 (en) * 1990-08-14 1992-02-26 Res Dev Foundation Protein Structure of the Plant Toxin Gelonin
US5194594A (en) * 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
ZA932523B (en) * 1992-04-10 1994-10-08 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against cd33 related surface antigens
US6599505B1 (en) 1992-04-10 2003-07-29 Research Development Foundation Immunotoxins directed against CD33 related surface antigens
ZA932522B (en) * 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
IL112372A (en) * 1994-02-07 2001-08-26 Res Dev Foundation Non-viral vector for the delivery of genetic information to cells
ES2167391T3 (es) * 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
SE9601158D0 (sv) * 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
IT1286663B1 (it) * 1996-06-27 1998-07-15 Ministero Uni Ricerca Scient E Proteina capace di inibire l'attivita' ribosomiale,sua preparazione ed uso come immunoconiugato chimico o ricombinante e sequenza di cdna
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
JP4793971B2 (ja) 1999-08-09 2011-10-12 メルク パテント ゲーエムベーハー 複合サイトカイン−抗体複合体
EP1228214A2 (en) 1999-11-12 2002-08-07 MERCK PATENT GmbH Erythropoietin forms with improved properties
ATE336514T1 (de) 2000-02-11 2006-09-15 Merck Patent Gmbh Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen
RU2272644C2 (ru) 2000-06-29 2006-03-27 Мерк Патент Гмбх Усиление иммунной реакции, медиатором которой является слитый протеин антитело-цитокин, при помощи комбинированного лечения агентами, увеличивающими поглощение иммуноцитокина
ZA200305980B (en) 2001-02-12 2007-01-31 Res Dev Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US6969517B2 (en) 2001-05-03 2005-11-29 Emd Lexigen Research Center Corp. Recombinant tumor specific antibody and use thereof
IL159894A0 (en) 2001-07-17 2004-06-20 Res Dev Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins
BR0214650A (pt) 2001-12-04 2005-05-03 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
WO2003093443A2 (en) * 2002-05-03 2003-11-13 Raven Biotechnologies, Inc. Alcam and alcam modulators
CA2488858A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-24 Research Development Foundation Immunotoxin as a therapeutic agent and uses thereof
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
RU2369616C2 (ru) 2003-12-30 2009-10-10 Мерк Патент Гмбх Слитые белки il-7
EP1699821B1 (en) 2003-12-31 2012-06-20 Merck Patent GmbH Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
JP2007517506A (ja) 2004-01-05 2007-07-05 イーエムディー・レキシゲン・リサーチ・センター・コーポレーション 標的化用化合物
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
RU2437893C2 (ru) 2004-12-09 2011-12-27 Мерк Патент Гмбх Варианты il-7 со сниженной иммуногенностью
US20060171919A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-03 Research Development Foundation Targeted polypeptides
US7998737B2 (en) * 2006-09-12 2011-08-16 Deutsches Krebsforschungszentrum Cell culture of keratinocytes under non-differentiating conditions
GB0718045D0 (en) * 2007-09-14 2007-10-24 Peptcell Ltd Pharmaceutical compound
JP5781501B2 (ja) 2009-04-22 2015-09-24 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 改変されたＦｃＲｎ結合部位を有する抗体融合タンパク質

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4263279A (en) * 1975-08-19 1981-04-21 Yeda Research & Development Co. Ltd Pharmaceutically active compositions containing adriamycin and daunomycin
US4440747A (en) 1980-09-30 1984-04-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibody-ricin hybrids as a treatment of murine graft-versus-host disease
US4520226A (en) 1982-07-19 1985-05-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Treatment of graft versus host disease using a mixture of T-lymphocyte specific monoclonal antibody: ricin conjugates
GB2131830A (en) 1982-12-10 1984-06-27 Ludwig Inst Cancer Res Monoclonal antibody for use against breast cancer
FR2546756B1 (fr) * 1983-06-03 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives immunostimulants, leur preparation et leur application comme medicament
GB2148299B (en) * 1983-09-01 1988-01-06 Hybritech Inc Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
DK423483A (da) 1983-09-16 1985-03-17 Nordisk Laederforskningsraad Fremgangsmaade til maerkning af huder, skind og lignende arkformige materialer
US4753894A (en) * 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
DE3408463C2 (de) * 1984-03-08 1987-02-26 Giulini Chemie Gmbh, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur Herstellung einer aluminium- und magnesiumhaltigen Verbindung der Formel Al&darr;5&darr;Mg&darr;1&darr;&darr;0&darr; (OH)&darr;3&darr;&darr;1&darr; (SO&darr;4&darr;)&darr;2&darr; . x H&darr;2&darr;O
ATE74382T1 (de) * 1984-12-05 1992-04-15 Salk Inst For Biological Studi Monoklonaler antikoerper, spezifisch fuer brustkrebszelloberflaechenantigen.
EP0214995B1 (en) * 1985-03-04 1990-12-27 Dana Farber Cancer Institute Immunotoxin and method of making
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
JPS6220909A (ja) 1985-07-17 1987-01-29 株式会社井上ジャパックス研究所 パイプ等の接合方法
FR2587332B1 (fr) 1985-09-19 1989-02-17 Rhone Poulenc Spec Chim Procede de chloration selective de composes phenoliques
CA1287578C (en) 1985-12-06 1991-08-13 Michael J. Bjorn Anti-human ovarian cancer immunotoxins and methods of use thereof
US4831122A (en) * 1986-01-09 1989-05-16 Regents Of The University Of Minnesota Radioimmunotoxins
EP0256471A3 (en) 1986-08-15 1989-10-25 Xoma Corporation Cytotoxic conjugates for cancer therapy
US4771128A (en) * 1986-10-10 1988-09-13 Cetus Corporation Method of purifying toxin conjugates using hydrophobic interaction chromatography

Also Published As

Publication number Publication date
FI910049A0 (fi) 1991-01-04
NO910031D0 (no) 1991-01-04
EP0350230B1 (en) 1993-09-15
DE68912334T2 (de) 1994-05-05
AU3976189A (en) 1990-02-05
US6669938B1 (en) 2003-12-30
NZ229652A (en) 1991-08-27
EP0423228A1 (en) 1991-04-24
NO910031L (no) 1991-01-04
KR900701321A (ko) 1990-12-01
EP0423228A4 (en) 1991-07-17
AU636113B2 (en) 1993-04-22
EP0423228B1 (en) 1994-01-12
ZA894665B (en) 1990-04-25
IE891970L (en) 1990-01-07
FI102517B (fi) 1998-12-31
FI102517B1 (fi) 1998-12-31
DK1091A (da) 1991-01-04
NO303122B1 (no) 1998-06-02
HK1006676A1 (en) 1999-03-12
JP2756329B2 (ja) 1998-05-25
DK1091D0 (da) 1991-01-04
IL90688A0 (en) 1990-01-18
DK175835B1 (da) 2005-03-21
PT91075A (pt) 1990-02-08
CA1336497C (en) 1995-08-01
IL90688A (en) 1995-03-30
DE68912334D1 (de) 1994-02-24
ES2059759T3 (es) 1994-11-16
EP0350230A2 (en) 1990-01-10
IE62463B1 (en) 1995-02-08
JPH04500510A (ja) 1992-01-30
EP0350230A3 (en) 1990-12-12
WO1990000405A1 (en) 1990-01-25
KR0152272B1 (ko) 1998-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT91075B (pt) Processo para a preparacao de imunoconjungados de gelonina com anticorpos especificos de tumor apropriados para o diagnostico e a terapeutica do cancro
EP0396387B1 (en) A novel antibody delivery system for biological response modifiers
JP3340127B2 (ja) 異常増殖性疾患措置のための抗体接合体
HK1006678B (en) A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) Antibody delivery system for biological response modifiers
HK1008418B (en) Antibody conjugates for treatment of neoplastic disease
JP3949158B2 (ja) Ｃｄ３３関連表面抗原に対する免疫毒素
HK1006676B (en) Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy

Legal Events

Date Code Title Description
FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19940712

MM4A Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent

Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED

Effective date: 20090712