JPH0639387B2 - 免疫毒素複合体 - Google Patents

免疫毒素複合体

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JPH0639387B2
JPH0639387B2 JP59127258A JP12725884A JPH0639387B2 JP H0639387 B2 JPH0639387 B2 JP H0639387B2 JP 59127258 A JP59127258 A JP 59127258A JP 12725884 A JP12725884 A JP 12725884A JP H0639387 B2 JPH0639387 B2 JP H0639387B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の目的 本発明は、免疫毒素複合体追（Immunotoxin Conjugat
e）およびその用途である標的細胞群の選択的排除に関
する。特に、細胞表面親和性結合物質（Cell surface a
ffinity binding agent）と結合した毒素Ｂ鎖部分は、
毒素Ａ鎖部分と結合した細胞表面親和性結合物質が与え
る細胞毒性を増強するのに有用である。
リシン（Ricin）は微少量で真核細胞に対してかなりの
毒性を示す多数の植物蛋白質のうちの一種であり、１つ
のジスルフイド結合により共有結合した２つの糖蛋白質
から成る。リシンのＡ鎖の見かけの分子量（ＡＭＷ）は
約30,000であり、リシンのＡ鎖は毒性発現に寄与し、６
０Ｓのリボゾーム・サブユニツトに酵素的に作用して蛋
白質合成を不可逆的に停止させてしまう［Olsnes,et,a
l.,FEBS Lett.,28,48〜50(1972)]．リシンＢ鎖（ＡＭＷ
32,000）はガラクトースに対して特異性を有するレクチ
ン(lectin)として作用し、細胞膜に毒素を結合させるよ
う働く［例えば、Baenziger,etal.,J.Biol.Chem.,254,9
795-9799(1979)を参照.］. 抗体と結合したリシンまたは精製リシンＡを用いること
は、腫瘍の治療に際し、潜在的に有用な薬剤として大き
な興味の対象となつてきた。抗体−リシンおよび抗体−
Ａ鎖複合体、即ち「免疫毒素」は、成功の程度は変わる
が多数の系に用いられてきた［例えば、Vitetta,et a
l.,Science,219,644-650(1983),Thorpe et al.,Immuno
l.Rev.,62,120-158(1982),Neville,et al.,Immunol.Re
v.,62,75-91(1982)およびJansen,et al.,Immunol.Rev.,
62,185-216(1982)を参照。］。
リシンＡ鎖−抗体複合体により選択的に細胞群を排除す
る方法はよく知られている。好ましい抗体は、腫瘍細胞
上または正常なリンパ球のサブセツト上の抗原と反応す
るものである。腫瘍細胞を排除することにより、例え
ば、体内の腫瘍による苦痛を減じたり［Krolick,et a
l.,J.Ekp.Med.,155,1799(1982)］、自己骨髄移植に際し
て骨髄から腫瘍細胞を排除したり［Thorpe,et.al.,Netu
re (London),271,752(1978)およびKrolick,et al.,Natu
re(London),295,604(1982)］することが可能である。
また、正常なリンパ球のサブセツトを排除することによ
り、免疫応答を高くも低くも調整できる。免疫毒素の利
点は、標的細胞に非常に特異的であることおよび少用量
で不要な細胞を排除できることである。リシンＡ鎖−抗
体複合体は、主に、生体内系および生体外系において正
常および新生物性Ｂ細胞を排除するのに用いられる。あ
る研究施設では、リシンＡ鎖とモノクロナール抗体の複
合体をＴ細胞由来の新生物性細胞およびその他の種々の
癌性細胞を排除するものにも用いている。
しかし、リシンＡ鎖−抗体複合体は、ある特定の型の腫
瘍細胞（例えば、ある種のＴ細胞腫瘍）に用いた場合、
活性ではない［Neville,et al.,Immunol.Rev.,62,75(19
82)およびThorpe,et al.,Immunol.Rev.,62,119(198
2)］。
これに対して、リシン毒素全体と結合した免疫毒素はさ
らに強力な細胞毒性物質である。ところが、完全なリシ
ンにはリシンＢにガラクトース結合部位が存在すること
から、上記免疫毒素はその標的細胞に対する特異性を失
い、それが生体内系での使用を妨げている。ガラクトー
ス結合部位を閉塞することにより、リシン含有免疫毒素
が非特異性となるのを克服しようとする試みが試されて
いるが、その生体内系での使用については未だ記載され
ていない。
一方、リシンＡ鎖−抗体複合体が細胞培養液に遊離Ｂ鎖
を添加することにより増強され得るとする記載もある
（Nevill,et al.,同上）。従って、リシンＢ鎖は、(1)
ガラストース結合性により細胞内へのリシンの侵入を促
進すること、および(2)Ａ鎖を細胞質に急速に接触させ
ること（おそらく、細胞内性小胞体膜に穴を形成させる
ことによる）２つの機能を有するものと想定されてい
る。
最近為された刊行物未記載の研究によれば、非毒性リシ
ンＡ鎖を注射し、その４〜８時間後に非毒性Ｂ鎖を注射
したマウスはリシンにより死亡した。これは、おそらく
血清中または循環細胞の表面で完全なリシン分子が最形
成されることによると思われる。従って、Ｂ鎖はリシン
Ａ鎖の毒性を増強する上で活発な役割を果たしていると
考えられる。
発明の構成 本発明により、標的細胞への特異性を保持しつつ、細胞
表面結合物質−毒素複合体の細胞毒性度を増強する組成
物および方法を提供する。本発明により提供する組成物
は毒素Ｂ鎖部分と結合した選択的結合物質を含有する。
更に、毒素Ｂ鎖部分と結合した選択的結合物質を含有す
る第１複合体を毒素Ａ鎖部分と結合した細胞表面結合物
質を含有する第２複合体と共に含有する組成物を提供す
る。第１複合体中の選択的結合物質は細胞表面結合物質
か第２複合体の細胞表面結合物質に特異性を有する結合
物質のどちらであつてもよい。
本発明の一側面は、リシンＢ鎖部分と結合する細胞表面
結合物質として抗体を含有する複合体を提供することで
ある。更にまた、リシンＢ鎖部分と結合した抗体を含有
する第１複合体とリシンＡ鎖部分と結合した抗体を含有
する第２複合体の混合物からなる組成物を提供する。
本発明の更に別の側面は、標的細胞を含有する細胞群
を、標的細胞の抗原性決定部位に特異性を有し毒素Ｂ部
分と結合する親和性結合物質からなる第１複合体および
前記標的細胞上の異なる抗原性決定部位に特異性を有し
毒素Ａ鎖部分と結合する細胞表面親和性結合物質からな
る第２複合体と接触させることにより、上記細胞群から
標的細胞を排除する方法を提供することである。前記の
複合体混合物は、毒素Ａ鎖部分と結合する細胞表面親和
性結合物質を含有する複合体だけによる選択的細胞毒性
度を増強する。
また、毒素Ｂ鎖部分を抗体と共有結合させることを特徴
とする毒素Ｂ鎖複合体の製造方法を提供する。
好ましい具体的内容として、本発明は毒素Ｂ鎖部分と結
合した抗体からなる複合体を提供する。更に、本発明は
リシンＢ鎖部分を含有する第１複合体とリシンＡ鎖部分
を含有する第２複合体を含有する組成物を協調的に用い
て標的細胞を排除する方法を提供する。
リシンは微少量で細胞に対してかなりの毒性を示す多く
の蛋白質毒素のうちの１つである。リシン毒素は１つの
ジスルフイド結合により共有結合した２種の糖蛋白質か
ら成る。リシンのＡ鎖（ＡＭＷ30,000）は蛋白質合成を
不可逆的に停止させることによい毒性を現わす。リシン
Ｂ鎖（ＡＭＷ32,000）は細胞表面上に露出したガラクト
ース含有糖蛋白質または糖脂質に結合するレクチンとし
て作用する。リシンにみられる一般的構造および作用機
作は、アブリン（abrin）、モデクシン（modeccin）、
ポークウイード・マイトジエン（Pokeweed mitogen）因
子およびビスカミン（viscumin）などの種々の植物蛋白
質毒素ならびにコレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳
菌毒素、破傷風毒素、ポツリヌス毒素、シユードモナス
毒素、赤痢菌毒素およびジフテリア毒素などの細菌性蛋
白質毒素中にも存在する。
本発明方法に用いるリシンＢ複合体およびリシンＡ複合
体はそれぞれ２つの活性部分を含有し、それは、細胞表
面結合物質または選択的結合物質と、（好ましくは縮合
剤によつて）共有結合した毒素ＡまたはＢ鎖サブユニツ
トである。それぞれの組成物において、活性部分の１つ
は、標的細胞表面構造に結合親和性（Binding affinit
y）を有するかまたは毒素Ａ鎖複合体中の細胞表面結合
物質(cell surface binding agent)に結合親和性を有す
る分子として示される。このような分子の代表的なもの
には、ホルモン、成長因子、レクチン、抗体などの物質
が挙げられる。好ましい分子は、細胞表面に結合親和性
を有する抗体またはそのフラグメント（特に、Fabフラ
グメント）である。
モノクロナール抗体は好ましいが必須ではない。標的へ
の特異性は多少低下するが、血清から得た免疫グロブリ
ン分画を用い得る。抗血清の免疫グロブリン分画は広範
囲の異なる抗原に関係する多数の抗体を保有するので、
本発明組成物および標的細胞を排除する本発明方法を実
際に用いるには特定の標的細胞上に存在する細胞表面抗
原性決定部位（Surface antigenic determinant）に結
合し得る各々の抗体を所望に応じて単離する必要が生じ
る。
上記の抗体を効果的に単離するには、充填剤に科学的に
結合させた各々の抗原を含有するカラムに免疫グロブリ
ン分画を通せばよい。抗原に特異性を有する抗体はカラ
ムに保持され、関係のない免疫グロブリンはカラムを通
過する。次に、ケイオトロピツク剤（Chaotropic agent
s）の酸性緩衝液などの適当な溶出剤を用いて保持され
た抗体をカラムから溶出させて採取し得る。単離された
免疫グロブリンは、単一の抗原に対応するが、均一では
ないことに注意を要し、抗原分子上に存在する種々の抗
原性決定部位に対応する抗体を含有する。従って、他の
関連した抗原と交差版応する可能性がある。
それ故に、本発明組成物を製造する際に、モノクロナー
ル抗体を用いることはモノクロナール抗体が抗原上に存
在し得る多くの抗原性決定部位のうち唯一つに対応する
ことから非常に好ましい。モノクロナール抗体は脾臓ま
たはその他の臓器中に存在するリンパ球から誘導したハ
イブリドーマから公知の方法で入手し得る。
また、本発明方法で用いる組成物中にモノクロナール抗
体を用いると選択性の向上という非常に望ましい特徴が
得られる。従って、リシンＢ鎖複合体およびリシンＡ鎖
複合体が共にモノクロナール抗体からなることは非常に
好ましく、これにより標的細胞への特異性は確実に高く
保てる。
前節では、本発明の一側面である、リシンＡ鎖複合体お
よびリシンＢ鎖複合体の両方を構成するのに同じ細胞表
面親和性結合物質を用いることについて述べた。しか
し、特異性をより高めることは可能である。正常細胞ま
たは腫瘍細胞は表面に数種の標識物質を有しているの
で、リシンＡ鎖とリシンＢ鎖の各々を同じ細胞上に異な
る抗原性決定部位に対応する抗体と結合させることによ
り、リシンＡ鎖およびリシンＢ鎖を上記細胞で誘導でき
る。例えば、表面Ia(sIa)および表面Ig(sIg)を共に有す
る新生物質Ｂ細胞の場合は、sIa およびsIg イデイオタ
イプに対する免疫毒素を、それぞれリシンＢ鎖およびリ
シンＡ鎖を用いて製造し得る。Ｔ細胞腫瘍の場合、ヒト
Ｔ細胞のサブセツトと反応する多数のモノクロナール抗
体が存在する。抗体の組合わせを選択して、リシンＡ鎖
およびリシンＢ鎖を上記細胞の特定のサブセツトに誘導
し得る。好ましくは、一方の抗体（リシンＡ鎖に結合）
は目的のサブセツトを特定し、他方の抗体（リシンＢ鎖
に結合）は多数のサブセツトに共通したもつと一般的な
標識物質であるのがよい。共通の標識物質と対応するＢ
鎖免疫毒素は正常細胞にも係合するが、これらの細胞は
排除されない。これに対して、Ａ鎖免疫毒素は腫瘍細胞
のみに集中し、Ｂ鎖含有免疫毒素によつて増強される。
本発明が意図する他の側面は、まず第１に、腫瘍細胞反
応性抗体−リシンＡ鎖複合体を生体内で腫瘍細胞に誘導
することを含む。抗体は、キヤツプ（cap）あるいはモ
ジユレート(modulate)され得ないように１価（例えば、
F(ab′)-A）であることが好ましい。抗体−リシンＡ複
合体を癌患者に投与して過剰分が排泄または分解により
患者体内から消失したのち、リシンＡ複合体中の抗体に
対応するリシンＢ鎖含有免疫毒素を注射する。最初の免
疫毒素と結合した細胞だけが２番の免疫毒素を最初の免
疫毒素へと誘導させる。その結果、そのような細胞が選
択的に排除される。２番目の免疫毒素は、マクロフアー
ジ、単核細胞またはFc受容体を有する他の細胞に結合し
ない２価の抗抗体（例えば、F(ab′)2-B）であることが
好ましい。また、Ｂ鎖含有免疫毒素は、仮に最初に免疫
毒素に予め結合していない細胞に非特異的に結合して
も、無害であるので、２番目の免疫毒素を投与すること
による副作用は排除できる。これに対して、両方の免疫
毒素と結合する細胞は死滅する。
前述したように、本発明のリシンＢ含有組成物および本
発明方法で用いるリシンＡ含有組成物はそれぞれ少なく
とも２種の活性部分を有しており、その活性部分のうち
の一方は結合親和性（Binding affinity）（ＢＡ）であ
り、他方はリシン・サブユニツト（ＲＳ）（リシンＡ
（ＲＡ）にしろリシンＢ（ＲＢ）にしろ）である。各々
の組成物は縮合剤で係合するが、得られる組成物は、
（ａ）上記の活性部分が少なくとも１つずつ存在するこ
と、および（ｂ）上記の活性部分の少なくとも１つずつ
の本来の活性を保有していることを要する。
本発明においては、他の蛋白質毒素も同様に結合物質成
分（Binding agent component）に結合させて使用され
る。構造と作用機作が似ているため、アブリン、モデク
シン、ポークウイード・マイトジエン因子、ビスカミ
ン、およびコレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳菌毒
素、破傷風毒素、ポツリヌス毒素、シユードモナス毒
素、赤痢菌毒素、ジフテリア毒素などの植物性または細
菌性蛋白質毒素が利用され得る。また、例えばアブリン
などから得たＡ鎖をを細胞表面結合性物質（Cell surfa
ce binding moiety）に結合させて本発明の第１複合体
を形成し、例えばビスカミンなどから得たＢ鎖を選択的
結合性物質（Sslectivebindingagent moiety）に結合さ
せて第２複合体を形成するのが有利である。細胞表面結
合性物質に係合して第１複合体を形成するＡ鎖として、
Ａ鎖だけから成るゲロニン(gelonin)などの植物性蛋白
質毒素を用いるのが有利である。この第１複合体はリシ
ン、ビスカミン、モデクシンまたはアブリン毒素のうち
のいずれか１つから選んだＢ鎖と係合した選択的結合性
物質からなる複合体と共に用いる。
上記の制限に従えば、本発明組成物および本発明方法に
用いる組成物は二量体（ＢＡ−ＲＳ）、即ち、それぞれ
の部分を１つずつ含有する、三量体［（Ｂａ2-ＲＳ）ま
たは（ＢＡ−ＲＳ2）］、即ち、各部分の一方を２つ有
して他方を１つ含有する、四量体［（ＢＡ3-ＲＳ）、
（ＢＡ2-ＲＳ2）または（ＢＡ−ＲＳ3）］などであり得
る。
前述したように、本発明方法に用いる非常に好ましい組
成物は係合部分が抗体または抗体の抗原結合性フラグメ
ント、好ましくは、モノクロナール抗体または抗原結合
性フラグメントであるものである。代表的組成物はＡｂ
−ＲＢ，Ａｂ2-ＲＢ，Ａｂ−ＡＢ２，ＡＢ３−ＲＢ，Ａ
Ｂ２−ＲＢ２，Ａｂ−ＲＢ３，Ａｂ−ＲＡ，Ａｂ２−Ｒ
Ａ，Ａｂ−ＲＡ２，Ａｂ３−ＲＡ，Ａｂ２−ＲＡ２また
はＡｂ−ＲＡ３である。
本発明組成物を製造するには、ＢＡおよびＲＳ部分を適
当な縮合剤で結合する。多種の結合剤がGhose,T.and Bl
air,A.H.,J.Natl.Cancer Inst.,61,657-676(1980)に報
告されている。前記著者らは抗体を細胞毒性物質に結合
させるのにグルタルアルデヒド、ｐ−ベンゾキノン、p,
p′−ジフルオロ−m,m′−ジニトロジフエニルスルホン
またはジメチルアジピミデートなどの二官能性物質とカ
ルボジイミド類を使用することを報告している。
単一部分多重合体、例えば、（ＢＡ）ｎまたは（ＲＳ）
ｎの形成を防ぐことは非常に望ましいことなので、ヘテ
ロ二官能性物質を用いて各活性部分を少なくとも１つず
つ有する組成物が必ず得られるようにするのが好まし
い。このようなヘテロ二官能性物質の例としては、Ｎ−
スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシ−スクシニミジルエステル、ブロモアセチル
−ｐ−アミノベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミ
ジルエステルまたはヨードアセチル−Ｎ−ヒドロキシ−
スクシニミジルエステルが挙げられる。
例えば、縮合剤としてＳＰＤＰを用いて、本発明の組成
物を製造する方法は、（ａ）ＳＰＤＰと反応させること
によりＡｂおよびＲＳを別々に修飾し、（ｂ）Ａｂ含有
生成物を還元し、（ｃ）ＡＢ含有生成物とＲＳ含有生成
物を混合することにより組成物を形成させ、および
（ｄ）ゲル濾過により非反応性の単量体を除去すること
を特徴とする。
リシンＢを含有する本発明の複合体は、リシンＡ複合体
と共に用いた場合、特定の抗原標識物質により規定され
たタイプの細胞を特異的かつ選択的に死滅させるのに一
般的に適応させることができる。抗原標識物質を適当に
選択することにより、細胞表面結合物質を対応する認識
決定部位を有する一群の正常細胞または新生物性細胞の
サブセツトに誘導し得る。このようにして、上記複合体
は、例えば癌の免疫治療などの際に、また寄生感染症の
治療および広範囲の自己免疫疾患の治療に有用である。
更に、本組成物には、例えば、自己骨髄移植に先立つ骨
髄中の白血球細胞の除去、遺伝的に異質な骨髄移植に先
立つ骨髄中のＴ細胞の除去および変異株選別の際の野生
株の殺菌などのような幾つもの生体外での適用の仕方が
ある。
本発明組成物は種々の製剤に用いることができ、筋肉
内、静脈内、皮下、腹腔内投与などの汎用される種々の
経路で投与し得る。「製薬上許容される」という用語
は、温血動物の化学療法に利用できることを意味する。
本複合体組成物を非経口投与または腹腔内投与する場
合、注射用の製薬上許容される形には、滅菌水溶液また
は分散液および注射可能な滅菌溶液または分散液に再構
成し得る滅菌粉末などが挙げられる。単体は、例えば、
水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリ
ン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール液
など）およびその適当な混合物ならびに植物油などの溶
媒または分散媒であればよい。適当な流動度は、例え
ば、レシチンなどのコーテイング剤を用いたり、分散液
の場合は所望の粒径を維持したり、界面活性剤を用いた
りすることにより維持できる。種々の抗生物質および抗
真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フエ
ノール、ソルビン酸なども用いるとよい。多くの場合、
等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを含有する
ことが望ましい。注射可能な剤型の吸収を長期化するに
は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど
の吸収遅延剤を用いればよい。
注射可能な滅菌溶液は、所望量の適当な溶媒に溶解した
前記の複合体組成物を所望の他の成分と組み合わせるこ
とにより製造できる。
要すれば、より有効に分布されるために、本組成物は多
重保持体(polymer matrix)、リポゾーム、微粒体(micro
sphere)などの緩徐放出系内に取り込ませることができ
る。また、本組成物は単独でまたは多数の活性成分の混
合物として投与し得る。
本組成物は治療への反応が所望どおりとなる間隔で対象
に投与する。対象の体重および投与形式により所望の反
応を誘起するのに必要な用量が決まる。
投与を簡単にして用量を均一化するために、本複合体組
成物は単位投与剤型に製剤化するのが特に有利である。
単位投与剤型とは、治療対象の単位投与量として適した
物理的に区分される単位である。各単位は所望の治療効
果を生じるように計算された既定量の本組成物を製薬上
許容される担体と共に含有する。個々の単位投与剤型
は、(a)個々の組成物の特性および（ｂ）達成すべき個
々の治療効果に依存する。
以下に限定を意図しない実施例を提示して本発明を更に
例示する。
実施例 免疫毒素の製造 Ａ．リシンＡ鎖およびリシンＢ鎖 リシンのＡおよびＢ鎖サブユニットを Xoma Corporatio
n(San Francisco,California)から購入し、使用する前
にＡおよびＢ鎖をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ，pH７．
２）にて４℃で完全に透析した。ＡおよびＢ鎖の回収率
はそれぞれ５０％および８０％であつた。
Ｂ．抗体 具体的な選択的に細胞表面に係合する物質として、文献
（例えば、Muirhead,et al.,Blood,42,327(1983),Vitet
ta,et al.,Science,219,644(1983)参照）記載の方法に
従つてアフイニテイー法で精製したウサギ抗ヒト免疫グ
ロブリン（RαHIg）を用いた。
Ｃ．複合 ６０mMのジチオスレイトール（ＤＴＴ）のＰＢＳ混液１
０μｌを透析したＡまたはＢ鎖１mgに加えて２５℃で６
０分間インキユベートし、還元された鎖を２５℃でSeph
adex G-25のカラム（１８×１．５ｃｍ）中にてpH７．
２でＰＢＳによりゲル濾過してＤＴＴから分離した。抗
体を文献(Vitetta et al.,Immunol.Rev.,62：159-183(1
982)およびCarlsson,et al.,Biochem.J.,173,723(1978)
参照）に記載されたように結合した。詳しくは、前記抗
体のＰＢＳ混液をおよそpH7.0〜7.5で約２０℃〜約２５
℃の温度下でＳＰＤＰ、即ちＮ−スクシニミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと処理する。こ
の抗体誘導体を緩衝溶液中でジチオスレイトールと処理
する。所望ならば、このチオール化抗体をゲル濾過によ
り精製してもよい。得られる活性化された結合抗体と還
元したてのＡまたはＢ鎖とを、抗体：Ａ鎖または抗体：
Ｂ鎖のモル比５：１の比率で混合した。混液を穏やかに
振盪しながら４℃で１５分間インキユベートしたのち、
４℃でＰＢＳにて一晩透析した。得られた免疫毒素を蒸
発(pervaporation)により１mg／mlまで濃縮し、４℃で
ＰＢＳにて２〜１６時間透析し、遠心分離して不溶物質
を取出した。免疫毒素と大部分の遊離Ａ鎖、Ｂ鎖および
抗体との分離はＰＢＳで平衡化した Sephacryl S-200
のカラム中で２５℃、pH７．２でゲル濾過して実施し
た。みかけの分子量が200,000 以上の物質を保存した。
還元されアルキル化された牛αグロブリン、分画４(Sig
ma)を最終濃度１mg／mlで上記保存試料に加えた。この
試料はアフイニテイー法で精製する前に４℃で１６〜２
０時間放置した。
このRαHIg−Ａ鎖（RαHIg-A）およびRαHIg−Ｂ鎖（R
αHIg-B）免疫毒素はSepharose-Hig のアフイニテイー
・クロマトグラフイーで精製した。Ａ鎖含有免疫毒素を
精製するために、カラムをpH７．２のＰＢＳ中で平衡化
して洗浄し、Ｂ鎖含有免疫毒素を精製するために、カラ
ムを０．１Ｍガラクトースを含有するpH７．６のＰＢＳ
で平衡化して洗浄した。上記試料をこのカラムに通し溶
出分は廃棄した。カラムをＰＢＳ（またはＰＢＳ−０．
１Ｍ gal）、次に０．８５％NaClで完全に洗浄した。免
疫毒素をカラム容量の２〜３倍量の３．５Ｍ MgCl2で３
７℃にてバツチ式により溶出した。MgCl2 を透析により
除去し、試料を蒸発（pervaporation）によりおよそ２
００〜３００μｇ／mlまで濃縮した。還元されアルキル
化された牛αグロブリンを最終濃度１mg／mlで加えた。
試料を濾過滅菌［ＰＢＳ２％牛胎児血清（ＦＣＳ）で前
以て湿らせたフイルター上で］して、適量を滅菌バイア
ル中に入れて−２０℃で保存した。この方法で保存した
試料は４〜６ケ月間は安定であつた。
アフイニテイー法での精製による免疫毒素の回収率は２
６〜４５％であり、各々の免疫毒素は抗体１分子当り１
また２個のＡ（またはＢ）鎖サブユニツトを含有してい
た。免疫毒素を感受性のよいシルバー・ステイニングを
用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥslabゲルで分析すると、いずれ
の免疫毒素にも遊離のＡまたはＢ鎖は検出されなかっ
た。
発明の効果 リシンＢ鎖含有複合体およびリシンＡ鎖含有複合体の新
生物性ヒトＢ細胞死滅作用 Ａ．新生物性細胞培養 Houston,L.L.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,92：319-3
26(1980)に記載されたヒトのバーキツト(Burkitt)のリ
ンパ種細胞系、ダウジ(Daudi)を１０％(v/v)牛胎児血清
（ＦＣＳ）、新たに調製した２０mMグルタミンおよび抗
生物質を補なつたＲＰＭＩ−１６４０の懸濁培養液中に
保持した。培養液を湿潤な培養器中、３７℃で９５％Ｏ
２／５％ＣＯ２雰囲気下に維持した。全ての培養液は２
日間の予備培養ののち用いた。
Ｂ．ダウジ細胞の処理 ２日間の予備培養ののちダウジ細胞を採取し、緩衝化し
た食塩水（ＢＳＳ）中で洗浄した。ＢＳＳ中の１０5個
の細胞を微量滴定容器(microtiterwell)に分配した。２
つの免疫毒素、RαHIg−ＡおよびRαHIg−Ｂまたはその
両方の組合わさつたものの各々を希釈して、３組の上記
容器に１５分間４℃で加え、遠心分離してＢＳＳで３回
洗浄した。ロイシンを欠き１０％ＦＣＳを含有するＲＰ
Ｍ１２００μｌを各容器に加え、細胞を穏やかに撹拌し
て再懸濁した。プレートを５％ＣＯ２培養器中で３７
℃、２２時間培養し、細胞を１容器当り５μCiの3Ｈ−
ロイシン(New England Nuclear)で５％ＣＯ２中にて３
７℃、６時間パルスさせた。細胞をグラスフアイバー製
デイスク上に採取し、液体シンチレーション螢光測定器
で計測した。細胞を各々の免疫毒素で独立に、または以
下のように組合せたもので処理した。
１．非毒性量のRαHIg−Ａ（０．３μｇ／ml）と種々の
量のRαHIg−Ｂ、または ２．非毒性量のRαHIg−Ｂ（０．５μｇ／ml）と種々の
量のRαHIg−Ａ。
結果は第１表に示す。
上記の表に示したように、ダウジ細胞を１０５個の細胞
当り０．３μｇのRαHIg−Ａ鎖で処理した場合、殆ど毒
性はみられず、RαHIg−Ｂは存在しなくても毒性を示し
た。しかし、０．３μｇの RαHIg−Ａを種々の濃度の
RαHIg−Ｂと混合した場合、著しい細胞毒性を示した。
このようなダウジ細胞と免疫毒性混合物との処理はガラ
クトースを欠くＢＳＳ中で実施したことを特記してお
く。第１表に示したように、ダウジ細胞を０．５μｇの
RαHIg−Ｂで処理した場合、毒性は認められなかつたの
に対して、RαHIg−Ａはダウジ細胞を用量に依存して死
滅させた。しかし、RαHIg−Ａと混合した０．５μｇの
RαHIg−Ｂで処理で細胞を処理すると、RαHIg−Ａその
ものは毒性の認められなかつた濃度でさえ、細胞に対し
て毒性であつた。
複合体組成物およびその使用法を好ましい具体的内容と
して記載したが、当業者には、本発明の意図する範囲か
ら逸脱することなく種々の変化を加えることは理解され
るところである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−74614（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−64617（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−81621（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−136235（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−49321（ＪＰ，Ａ) 米国特許4359457（ＵＳ，Ａ) 欧州特許出願公開44167（ＥＰ，Ａ)

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】毒素Ｂ鎖部分と共有結合した抗体からなる
    第１複合体と、毒素Ａ鎖部分と共有結合した抗体からな
    る第２複合体とを含むことを特徴とする細胞毒性組成
    物。
  2. 【請求項２】第１複合体中の抗体が細胞表面の抗原に対
    して特異性を有する特許請求の範囲(１)記載の組成物。
  3. 【請求項３】第１複合体中の抗体が腫瘍細胞表面の抗原
    に対応する特許請求の範囲(１)または(２)記載の組成
    物。
  4. 【請求項４】第１複合体中の抗体が第２複合体中の抗体
    に対応する特許請求の範囲(１)記載の組成物。
  5. 【請求項５】毒素Ｂ鎖がリシンＢ鎖、モデクシンＢ鎖、
    アブリンＢ鎖、ポークウイード・マイトジェン因子Ｂ
    鎖、ビスカミンＢ鎖、コレラ毒素Ｂ鎖、大腸菌易熱性毒
    素Ｂ鎖、百日咳菌毒素Ｂ鎖、ボツリヌス毒素Ｂ鎖、シュ
    ードモナス毒素Ｂ鎖、赤痢菌毒素Ｂ鎖またはジフテリア
    毒素Ｂ鎖から選択される特許請求の範囲(１)から(４)の
    いずれか一項に記載の組成物。
  6. 【請求項６】毒素Ｂ鎖がリシンＢ鎖である特許請求の範
    囲(５)記載の組成物。
  7. 【請求項７】第２複合体中の抗体が細胞表面の抗原性決
    定部位に対応する特許請求の範囲(１)記載の組成物。
  8. 【請求項８】第１および第２複合体の各々が細胞表面の
    抗原性決定部位に対して同等の特異性を有する抗体を含
    有する特許請求の範囲(１)または(７)記載の組成物。
  9. 【請求項９】第１複合体中の抗体が、第２複合体中の抗
    体に対応する細胞表面の抗原性決定部位とは異なる細胞
    表面の抗原性決定部位に対応する特許請求の範囲(１)ま
    たは(７)記載の組成物。
  10. 【請求項１０】各々の抗体が腫瘍細胞の抗原性決定部位
    に対して特異性を有する請求の範囲(１)および(７)から
    (９)までのいずれか一項に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】第２複合体が細胞表面の抗原性決定部位
    に特異性を有する抗体を含有し、第１複合体が第２複合
    体中の抗体に特異性を有する抗体を含有する特許請求の
    範囲(１)記載の組成物。
  12. 【請求項１２】毒素Ａ鎖がリシン、アブリン、モデクシ
    ン、ゲロニン、ポークウイード・マイトジェン因子、ビ
    スカミン、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳菌毒
    素、ボツリヌス毒素、シュードモナス毒素、赤痢菌毒素
    およびジフテリア毒素のＡ鎖部分から選択される特許請
    求の範囲(１)および(７)から(１１)までのいずれか一項
    に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】毒素Ａ鎖部分がリシンＡ鎖であり、毒素
    Ｂ鎖部分がリシンＢ鎖である特許請求の範囲(１２)記載
    の組成物。
  14. 【請求項１４】毒素Ｂ鎖部分と共有結合した抗体からな
    る第１複合体と、毒素Ａ鎖部分と共有結合した抗体から
    なる第２複合体とを含む細胞毒性組成物を１種またはそ
    れ以上の製薬上許容される担体または賦形剤と共に含有
    する抗新生物細胞薬。
  15. 【請求項１５】人体内以外にある細胞群を、毒素Ｂ鎖部
    分と共有結合した抗体からなる第１複合体および毒素Ａ
    鎖部分と共有結合した抗体からなる第２複合体と接触さ
    せることを特徴とする、人体内以外にある細胞群から標
    的細胞を選択的に排除する方法。
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