KR0151851B1 - 자기면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 면역독소 - Google Patents

자기면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 면역독소

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KR0151851B1 KR1019890015214A KR890015214A KR0151851B1 KR 0151851 B1 KR0151851 B1 KR 0151851B1 KR 1019890015214 A KR1019890015214 A KR 1019890015214A KR 890015214 A KR890015214 A KR 890015214A KR 0151851 B1 KR0151851 B1 KR 0151851B1
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에이.지.제이.베르미렌; 에프.지.엠.헤르만스
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Abstract

내용없음.

Description

자기 면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 면역독소
본 발명은 자기-면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 면역 독소와 이 면역 독소를 하나 이상 포함하는 약학적 체계 및 상기 면역독소의 제조 방법에 관한 것이다.
면역 시스템은 복잡하게 나타나며, 이것은 자가-인지의 요건을 포함한다. 면역 시스템의 조절은 이러한 자가 인지를 통해 발생하며, 세포, 항체, 증폭 시스템(예, 보체) 및 이러한 성분의 조합과 관련된다. 건강한 개체의 경우, 면역 시스템은 이물질에 노출시 세포 면역 반응이 활성화되고/되거나 이러한 물질에 대한 특이항체를 생성함으로써 반응할 것이다. 또한 면역 시스템은 일반적으로 그 자신의 신체 구성물에 대해서는 내성을 가지며, 이것을 일명 자기-내성을 벗어난 것으로 정의될 수 있다.
자기 면역 질환증에는 다음과 같은 것들이 있다.
공격 대상 조직이 미엘린인 다발성 경화증; 중요한 신경 전달 물질인 아세틸콜린에 대한 수용체 분자가 표적인 중증성 근무력증; 특히 말초 관절이 표적인 류마티드성 관절염; 인슐린을 생성하는 세포가 파괴되는 것을 특징으로 하는 제 1 유형의 당뇨병, 및 혈관, 피부 및 신장을 공격하는 전신적 홍반성 낭창.
자기-면역 질환은 특정한 외부 약물이 없이 개시될 수 있다. 자가-항원에 대한 내성의 손실은 자가-항원 자체에 의해, 자가-항원에 대한 비정상적인 면역 반응에 의해 또는 그 둘다에 의해 발생할 수 있다. 어떤 경우에는 외인성 약물이 면역 반응을 일으키는데, 이 면역 반응이 일부 자가-항원(에피토프 모방)에 대한 반응도 포함한다. 감염 약물의 특이적 결정 인자에 대해서 숙주가 일으키는 면역 반응은 모방된 숙주 서열과 교차-반응하며, 자기 면역 및 가능한 조직 손상 및 질환을 유도한다. 수 많은 바이러스 및 박테리아 단백질은, 교차 반응을 할 수 있을 정도로 유사하지만 면역 내성을 파괴할 정도로 상이한 에피토프를 숙주 세포 단백질과 공유한다.
자가-항원 및/또는 외인성 항원의 인지 및 그 이후 일어나는 면역 시스템에 의해 자가-항원을 함유하는 조직의 손상은, T-임파구와 B-임파구에 의해서 매개된다.
미합중국 특허 제 4,634,590호에는 실험 동물에 있어서, 자기 면역 질환을 일으키는 특정한 T-임파구가 장기간 세포주로서 기재되어 있다. 상기의 특정한 T-임파구를 감쇠시킨 이후, 그 세포나 막의 물질은 특정한 자기 면역 질환에 대해 유효한 백신용 약물로서 사용될 수 있다.
WO 85/05034호는 증상을 완하시키거나 관절염의 치료 또는 진단하기 위한 조성물 또는 백신에 있어서 미코박테리움 또는 그것의 단편물의 용도를 기술하고 있다. 정상의 관절연골에 있는 당단백질(proteoglycan)과 면역적 교차 반응을 나타내는 미코박테리움의 특정한 단편물을 확인하였다. 보조 관절염 (AA)에 대한 보호 및 자기 면역 질환의 억제가 미코박테리움의 특정한 하나의 단편물과 관련될 수 있는 반면, 다른 단편물은 유해한 자기 면역 반응을 유도한다.
또한 두 개의 T-임파구 클로운은 상기 두 개의 미코박테리움 단편물에 각기 반응하는 것을 확인하였으며, 따라서 관절염 발생 또는 관절염 억제와 관련될 수 있다.
보조 관절염 T-임파구 클로운은 상기의 T-세포 쿨로운에 의해 인지된 미코박테리움 상에 존재하는 항원을 확인하는데 사용할 수도 있다. 65KD 단백질이 실험실상(in virto)에서 T-세포 클로운의 증식 반응을 유도하는 미코박테리움 항원으로 확인되었다. T-세포 클로운에 의해 인지된 에피토프는 65KD 항원이 180-188 아미노산 서열내에 존재한다. 이 서열은 랫트의 당단백질 중 링크 단백질의 일부분과 유사하다(참고, 판 에덴 등, Nature 331, 171, 1988).
자기 면역 질환의 최근 치료는, 자기 면역 반응을 억제하지만 또한 면역 시스템의 전체적인 억제와 관련된 여러 가지 바람직하지 않은 합병증을 일으키거나 비-임파성 조직에 기타 유해한 부작용을 야기하는 비-특이적 약물을 투여하는 것이다. 현재 사용되는 자기 면역 질환 퇴치용 약물의 예로는 나프로센, 오라노핀, 페니실아민, 클로로퀸 및 코티코스테로이드가 있다. 따라서, 자기 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 바람직한 시도에 있어서, 상기 질환 증세를 일으키는 면역 반응에 특이적으로 작용할 수 있는 방식으로 약물을 표적화해야 한다.
자기 면역의 질환인 중증성 근무력증 경우의 자가-항원인 아세틸콜린 수용체는 이 항원에 대한 특이적 면역 반응을 억제하는데 사용할 수 있음이 문헌에 공지되었다. 독소인 리신 또는 겔로닌에 연결된 아세틸콜린 수용체는 항원-반응성 임파구의 단편물을 제거할 수 있다(Killen. J. A. and Lindstrom. J. M., Journal of Immunology 133(1984), 2549-2553; Olsberg. C.A. et al., Journal of Immunology 135(1985), 3062-3067; Brust, S. et al., Biol Chem. Hoppe-Seyler 368(1987), 991-999).
또한 대부분의 경우에 주요 조직상용성 복합체(MHC) 분자와 조합된 항원이 존재하는 세포(APC)에 의해 항원이 가공된 이후에 비로소 상기 항원이 T-임파구에 의해서 인지될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 결과적으로, 상기 언급한 종래 기술에서 항원-독소의 시도는, 항원-독소의 접합물이 APC 가공되는 동안, 독소 작용에 의해 APC가 불활성화되어, 중요한 세포의 면역 시스템을 파괴시키는 단점이 있다.
본 발명은, 전체의 자가 항원 또는 외인성 항원 대신에 특이적 자가 에피토프 또는 외인성 에피토프가 세포 독소 물질에 접합되어, APC에 의한 가공을 피할 수 있다는 사실에 근거를 둔다.
또한 본 발명에 있어서, 세포 독소 물질은 T-임파구에 의해 직접 인지되는 항원의 단편물(에피토프)에 연결된다. 이 결과, T-임파구에 대한 상기의 에피토프-세포 독소 물질 접합물의 독소 작용이 더 유효하게 되어 자기 면역성 T-임파구를 완전히 제거하기 위하여 저 농도의 에피토프-세포 독소 물질의 접합물을 사용하는 것이 가능해진다.
또한, 외인성 항원의 경우, 본 발명에서는, 자기 면역 반응에 관련된 T-임파구만을 제거하므로 외인성 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 면역 독소는 특이적 자기 면역 질환에 특징적인 T-임파구에 의해 인지되는 에피토프 또는 상기 에피토프의 교차 반응성 동족물(analogue)을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 상기 에피토프나 그 교차 반응성 동족물은 세포 독소 물질에 연결된다.
특이적 자기 면역 질환에 대해 특징적인 T-임파구에 의해 인지되는 많은 단백질 및/또는 에피토프가 공지되었으며 문헌에 기술되어 있다.
보조 관절염(AA)는 만성의 자기 면역 질환으로서 관절 연골의 변성을 일으킨다. 보조 관절염은 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mt)의 항원으로 랫트를 면역화시킴으로써 유도될 수 있다. AA에 나타나는 조직 손상은 T-임파구를 특징으로 한다. T-임파구는, 관절염에 걸린 랫트의 자가 항원을 모방한, Mt에 속하는 항원에 의해 항진된다.
특이적 T-임파구 클로운은 이종의 Mt 항원과 자가 항원 둘다를 인지할 수 있는 것이 밝혀졌다. 자가 항원은 연골 프로테오그리칸 분자(링크 단백질)의 일부분에 존재하는 것이 가능하다. 상기의 특이적 T-임파구 클로운은 Mt DNA으로 형질 감염된 E. coli에 의해 형질 발현된 Mt 단백질(65KD 단백질)과 특이적으로 반응한다. 상기의 65KD 단백질은 미코박테리움 균주에 대해 면역 반응하는데 있어서 중요한 역할을 한다.
상기 65KD 단백질의 180-188 아미노산 서열에 위치한 9개 아미노산(Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr)으로 구성된 펩타이드 뿐만 아니라, 65KD 단백질의 65-85 아미노산 서열에 존재하는 21개 아미노산으로 구성된 펩타이드는 T-임파구에 의해 인지되는 에피토프로 확인되었다. 상기 노나 팹타이드는, 분자의 당 골격에 코아 단백질을 연결시키며 Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln의 아미노산 서열을 갖는 프로테오글리칸 분자의 링크 단백질 일부분과 유사하다. Mt 65KD 단백질과 동일한 암호화 부위를 갖는 미코박테리움 보비스의 65KD 단백질은, 임파구에 의해 인지되는 에피토프를 여러개 포함한다.
상기의 T-임파구 에피토프는 미코박테리움 65KD 단백질의 아미노산 서열에 대해서 아미노산 서열 1-16, 17-61, 85-108, 112-132, 235-279및 437-459와 일치하거나 그 안에 위치한다.
미코박테리움 65KD 단백질의 아미노산 서열에 대해서는 하기 문헌을 참고하시오(Thole et al., Infect. Immun. 55. 1466-1475, 1987; Husson et al., PNAS 84 1679-1683, 1987; Shinnick et al., J. Bact. 169. 1080-1088, 1987).
미엘린 염기성 단백질(BP)는 상이한 종의 자가 항원이다. BP로 면역된 동물로부터 임파구가 수동적으로 전달되거나 BP로 면역되면 몇몇 종에 있어서, 자기 면역 질환인 실험적 자기 면역 뇌척수염(EAE)이 유도된다. EAE는 염증성 마비와 탈미엘린화를 일으키며, 증강도 다발성 경화증과 함께 나타난다. EAE는 특이적 유형의 T-임파구에 의해 매개된다. BP나 그것의 일부 단편물로 면역화시키면 감수성이 높은 종에 있어서 EAE를 유도하지만, 모든 단편물이 뇌척수염을 야기하는 것은 아니다. T-임파구는 특이적 에피토프를 포함한 단편물이나 완전한 단백질에 의해서만 활성화된다. BP 내의 몇가지 에피토프는 이미 당해 분야에 공지되었다. BP의 아미노산 서열 1-16, 1-37, 59-74, 68-88, 89-169 및 114-122는 이미 서열을 함유하는 에피토프로 확인되었으며, 이것은 뇌척수염 발생의 T-임파구에 대한 친화성을 나타내고 따라서 다발성 경화증에 대한 T-임파구에 대해 친화성을 나타낸다(미엘린 염기성 단백질의 아미노산 서열의 경우임. 참고, Eylar et al., J. Biol, Chem, 246. 5770. 1971; Gibson et al., J. Biol. Chem, 259. 5028. 1984; Stoner, G. L. J. Neurochem, 43, 433-447, 1984; Scoble et al., J. Neureochem. 47, 614-616, 1986).
또 다른 자기-면역질환인 중증성 근무력증(MG)는 아세틸콜린 수용체의 면역생성인자가 존재함으로써 개시되어 자기-면역 임파구를 자극하게 된다. MG는 아세틸콜린 수용체에 대한 T-임파구 및 자기-항체를 특징으로 하고 있으며, 그 결과 수용체의 분해가 증가되어 수의근의 약화 및 피로에 의해 임상적으로 나타난다. 아세틸콜린 수용체는 5 서브 유닛(α2βcd)으로 구성된다.
MG를 앓고 있는 환자의 세포 자기-면역 반응의 주요부는 수용체의 α-서브 유닛상의 한 영역 즉, 주요 면역원 영역을 가르킨다. 이 영역에서 아미노산 서열 1-30, 73-90, 110-116, 111-126, 146-162, 169-181, 182-198, 257-271, 351-368과 같은 아미노산 서열을 함유하는 다수의 에피토프(들)가 확인되었다(아세틸콜린 수용체의 아미노산 서열의 경우 다름과 같은 문헌들을 참조할 수 있다: Noda et al., Nature 299, 793-797, 1982 및 Nature 302, 528-532, 1983 및 Nature 305, 818-823, 1983; Sumikawa et al., Nucleic Acid Res, 10, 5809-5822, 1982; Devillers-Thiery et al., PNAS 80, 2067-2071, 1983; Hohlfeld et al., J. Clin. Invest. 81, 657-660, 1988).
본 발명에서 사용한 에피토프란 용어는 면역원 분자의 면역원 결정인자를 나타내며, 이 면역원 결정인자는 면역 시스템의 한 성분에 의해 인식된다.
전술한 에피토프는 세포독소물질에 결합되어 본 발명에 의한 에피토프-세포독 소물질 접합물을 생성한다.
에피토프의 일부만을 함유하는 펩타이드는, 에피토프와 함께 옆에 존재하는 아미노산 또는 다른 잔기를 함유하는 펩타이드와 마찬가지인 T-임파구에 대한 결합 친화도를 나타낸다는 것이 당업자에게 자명하다. 이러한 측면에 존재하는 잔기의 길이는, 펩타이드를 APC에 의해 반드시 가공할 필요는 없다는 요건에 의해 제한된다. 이러한 펩타이드를 포함하는 면역독소도 본 발명의 범위내에 포함된다는 것이 명백하다.
또한, 유사하기는 하나 동일하지는 않는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드는 대응하는 면역학적 특성을 나타낼 수 있다. 전술한 에피토프와 관련된 폴리펩타이드도 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 세포독소물질은 세포 증식을 정지시켜서 결국 세포를 사멸시키는 물질의 군에서 선택된다.
세포독소물질은 진핵 세포내에서의 단백질 합성을 억제하는 특성을 가진 식물, 진균류(fungal) 또는 박테리아 기원의 단백질균에서 선택하는 것이 바람직하다. 특히 이러한 독소들은 리보좀을 촉매적으로 불활성화시켜서 해독(translation)과정에 작용한다. 식물 독소는 2개의 군으로 분류되는데, 즉 2개 또는 4개의 단백질을 함유하는 서브 유닛으로 구성되는 독소와, 탄수화물 잔기가 통상적으로 결합되는 단일쇄 단백질분자로 구성되는 독소로 분류된다.
2-서브 유닛 독소는 60-65KD의 분자량을 가지며, 서브 유닛 A는 서브 유닛 B보다 약간 작다(30KD 대 32KD). 서브 유닛들은 단일 디설파이드 결합에 의해 공유 결합되나, A와 B를 함께 유지하기 위해서는 소수적 상호작용도 관련된다. 서브 유닛 B는 폴리펩티드 쇄와 만노즈 및 N-Ac-글루코자민을 함유하는 탄수화물쇄로 구성된다. 서브 유닛 B는, 표적 세포막의 갈락토즈-함유 당단백질 및 당지질과 독소의 상호 작용에 관련되는 것으로 나타났다. 서브 유닛 B는 서브 유닛 A로 하여금 세포내로 들어가도록 한다. 서브 유닛 A는 진헥 리보좀을 촉매적으로 불활성화시켜서 단백질 합성을 억제하고 세포를 사멸시킨다. 이러한 군의 독소로는 리신, 아브린, 모데신, 볼켄신 및 비스쿠민이 포함된다.
단일쇄 식물 독소는 전술한 서브 유닛 A와 유사한 특성들을 가진다. 단일쇄 식물 독소는 세포가 존재하지 않는 시스템에서는 매우 강한 억제제이지만 완전한 세포에 대해서는 불활성이다. 서브 유닛 B가 없으므로 이러한 독소들은 표적 세포내로의 주입이 어렵고, 따라서, 서브 유닛 B를 함유하는 독소보다 세포에 대한 독성이 훨씬 작다. 그러나 이들은 세포에 결합 또는 주입될 수 있는 담체(예, 렉틴 및 항체)에 결합되면 유독하게 될 수 있다. 하기의 단백질, 예를 들면 겔로닌 ,포크위드 항바이러스성 단백질, 도데칸드린, 디안틴, 루핀, 사포린, 모마르디카 캐란티아 억제제, 그레인 억제제가 이러한 부류의 독소에 속한다.
균류 단백질 독소, 예를 들면 α-사르신, 레스크릭토신 및 미토길린은 관련성이 높은 기본 단백질이다. 이러한 독소들은 단일 폴리펩티드쇄를 함유하며 대부분의 식물 독소와 달리, 탄수화물 잔기를 함유하지 않는다.
디프테리아독소 및 슈모도나스 외독소는 박테리아성 독소의 두예이며 전술한 2 서브 유닛 식물 독소와 작용성면에서도 유사하다.
다른 바람직한 세포 독성 물질은 방사선 동위원소군에서 선택된다. 이러한 방사선 동위원소는 특정 세포로 표적화될 수 있다. 표적 세포는 에너지성 α-입자 또는 β-입자를 방출하는 동위원소를 사용함으로써 손상되거나 사멸된다.
적합한 동위원소는99Y,153Sm,43Sc,67Cu,186Rh,188Rh,212Bi,211At,103Pd이다.
에피토프를 단백질 독소에 접합시키는데에는 여러 방법이 공지되어 있다.
에피토프와 단백질 독소간의 무작위 결합은 예를 들면, 단백질 독소의 카르복실기를 활성화시켜서 에피토프의 아미노기에 결합시킬 수 있는 카르보디이미드 화합물(예를 들면, EDC)을 사용하여 달성할 수 있다.
상기 직접 결합과는 달리, 링커를 사용하여 에피토프와 단백질 독소간의 가교를 형성시킬 수 있다. 널리 공지된 단일 이작용성 교차 결합제는 글루타르(디)알데히드이다. 이것은 아민과 우선적으로 반응한다.
다른 단일 이작용성 링커는 이미도-에스테르류(예를 들면, 디메틸 아디피미데이트, 디메틸 수베르이미데이트) 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르류(예를 들면, 디숙신이미딜 수베레이트, 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트))로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 이들은 둘다 아민기에 대해 특이성을 가진다.
이종 이작용성 시약은 2개의 다른 작용성기를 함유하여 접합 반응을 선택적으로 및 연속적으로 제어할 수 있으므로 바람직하다. 이종 이작용성 링커의 일례는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)이다. 먼저 일차이민과 SPDP를 반응시켜서 2-피리딜-디설파이드기를 에피토프로 도입한다. 유도된 에피토프를 티올기를 함유한 단백질 독소간에 디설파이드 결합을 형성시켜 상기 에피토프를 상기 단백질 독소에 접합시킬 수 있다. 만약 단백질 독소에 티올기가 존재하지 않는다면 2-이미노티오란, SPDP 또는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트와 같은 티올화제를 사용하여 티올기를 단백질 독소에 도입할 수 있다.
말레이미드기는 물론 브로모아세틸기 또는 요오드아세틸기는 온화한 조건하에서 상당히 빠르게 티올기와 반응하여 티오-에테르 형태의 결합을 형성한다. 말레이미드기는. 예를 들어 에피토프의 아미노기를 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트와 반응시킴으로써 에피토프에 도입될 수 있다. 제 2 단계로, 단백질 독소를 함유한 설프히드릴기를 상기 말레이미드 활성화된 에피토프에 연결시킨다.
또한, 단백질 독소의 탄수화물 잔기를 사용하여 에피토프에 연결할 수 있다. 퍼아이오데이트를 사용하여 탄수화물 잔기에 알데히드기를 형성한다. 뒤이어, 상기 알데히드기는 에피토프의 아미노기와 반응하여 쉬프(Schiff)염기를 형성하고, 이것은 환원에 의해 안정화되어 2차 야민을 형성할 수 있다.
킬레이터를 사용하여 에피토프에 방사성 동위원소를 결합한다. 킬레이터는 생체내에서 킬레이터-동위원소 복합체의 양호한 안정성이 유지되도록 제조한다.
본 발명에 따른 면역독소를 제조하는 또다른 방법은 제조합 DNA 기술을 통해 수행한다. 독소 폴리펩티드 또는 이것의 독소 분역을 암호화하고 있는 게놈성 DNA 또는 mRNA로부터 유도된 관련 핵산 서열을, 에피토프의 아미노산 서열에 대한 유전정보를 운반하는 누클레오타이드 서열과 연결시킨다. 임의로 독소와 에피토프 사이의 스페이서로 적합한 아미노산 서열을 암호화하는 연결 서열을 도입할 수 있다. 이러한 면역독소의 생성은 원핵 또는 진핵발현 시스템에 달성될 수 있다.
본 발명의 면역독소는 직장 또는 바람직하게는 비경구적으로 투여될 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 면역 독소를 하나 이상의 상용 약학 허용 비-독성 담체 및/또는 부형제와 혼합하여 약학 조성물을 제조한다.
상기 약학 조성물은 직장 투여용으로 정제, 환약 및 코팅된 정제, 경구 또는 비경구 투여용으로 용액, 현탄액, 및 에멀젼을 포함한다.
본 발명에 따라서 제조된 화합물의 복용량은 대체적으로 환자 개인의 요건에 따라 다르지만, 정맥주사시, 처음에는 체중 1㎏당 0.1μg내지 1㎎사이의 양으로 투여하는 것이 바람직하고 필요하다면 하루 한 번 또는 그 이상의 보충양이 추가될 수 있다. 주입시에는, 상술한 정맥내 투여를 기초로 한 복용량으로 오랜 시간 동안 화합물을 투여한다.
본 발명은 하기 실시예에서 더 상세히 예시한다.
[실시예1]
노나펩타이드 Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln-OH (I)의 합성.
일반식(I)의 상기 노나펩타이드를 메리필드(J. Amer, Chem. Soc. 85, 2149, 1963)에 의해 최초 설명된 바와 같이, 고체상 펩타이드 방법으로 합성하였다.
배가 연결기(Vega Coupler) 250 C 장치상에서, p-벤질옥시벤질 알콜수지(0.6-0.7㎜ol/g, Bachem A. G., TM위스)를 사용하여 합성 과정을 수행하였다.
아미노산을 Nα-Fmoc-(Fmoc=9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐-) 유도체로서 수지에 단계적으로 결합시키는데, Glu와 Thr의 측쇄 기능을 t-부틸에스테르와 t-부틸에테르로 각각 보호하였다.
반 니스펜 외 다수의 문헌(Real. Trav. Chim, Pays-Bas 104, 99-100, 1985)에 기재된 바와 같이, HOBt(N-히드록시벤조트리아졸) 존재하의 저온에서 DCC(디시클로헥실카르보디이미드)와 DMAP(N,N-디메틸아미노피리딘)을 사용하여 Fmoc-Glu-OH를 수지에 결합함으로써 합성을 시작한다. 생성된 Fmoc-Glu-수지(0.3-0.4㎜ol/g)상에 남아 있는 유리알콜기를 아세틸화시켜 차단시킨다.
DMF(디메틸포름아미드)중의 25% 피페리딘으로 수지를 10분간 처리하고 DMF와 CH2Cl2로 3 번 세척(각 1분씩)하여 Fmoc-보호기를 제거한다.
수지 1g당 6-7㎖의 DMF중의 각 3당량씩의 보호된 아미노산, DCC 및 HOBt를 사용하여 Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH(2번), Fmoc-Ala-OH 및 Fmoc-Thr(tBu)-OH를 2시간동안 연속적으로 결합시킨다. 그후 에탄올, DMF 및 CH2Cl2로 3번 (각 1분씩)세정한다. 아실화시킨 후 카이저 외 다수에 의한 닌히드린 테스트(Anal Biochem. 34, 595-598, 1970)로 아실화가 완료되었는지 확인한다. 양성 반응의 경우, 각 1당량씩의 Fmoc-아미노산, DCC 및 HOBt를 사용하여 1시간동안 적절한 결합 단계를 반복한다. 그래도 카이저 레스트가 양성을 나타내면, 아세트 무수물 피리딘(2:1; 부피/부피; 6-7㎖/g)으로 10분간 수지를 처리한 다음, DMF와 CH2Cl2로 각 1분간씩 3회 세척하여 전류하는 유리 아미노산을 아세틸화시킨다. 상기와 같이 DMF 중의 25% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc-보호기를 제거시킨 후 다음 번 아미노산을 결합시킨다.
최종 Fmoc-보호기를 제거하면 노나페타이드-수지(II)가 합성된다.
Figure kpo00001
노나페타이드-수지(II)를 트리플루오로아세트산-디클로로메탄(1:1; 부피/부피)로 3시간 처리하여 유리 펩타이드(I)를 수득한다.
이러한 산 처리는 t-부틸 보호기를 제거하고 동시에 수지로부터 펩타이드를 분리하는 효과를 낸다. 여과하여 수지를 제거한다. 그후 여액을 진공 증발시킨다. 잔류물을 t-부탄올-물(1:1; 부피/부피)에 용해시킨다. 다음 잔류하는 TFA를 Dowex 2×8(OAC) 이온 교환 수지를 첨가하여 아세트산으로 바꾸었다.
생성된 용액을 동결 건조시켜 노나펩타이드 I (아세테이트염 상태)를 수득했다.
[실시예2]
노나펩타이드 유도체의 합성
A. S-아세틸티오아세틸 유도체
노나펩타이드 I을 DMF-H2O(2:1; 부피/부피)중에 용해시켰다. 이 용액의 pH는 N-에틸, N,N-디이소프로필 아민을 가해 7.5-8.0까지 상승시켰다. 그후 여기에 DMF중의 N-숙신 이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA) 1.2 당량 용액을 첨가했다. 반응 혼합물의 pH는 상기 3차 염기를 가해 7.5-8.0으로 유지했다. 실온에서 30분후 아세트산을 첨가해 용액의 pH는 5.0이 되도록 했다. 진공 증발로 용매를 제거한 후, 그 잔류물은 에틸아세테이트-에테르로 마쇄했다. 이 펩타이드 유도체 III을 t-부탄올-물(1:1; 부피/부피)에 용해시킨 후 동결 건조시켜 분리했다.
Figure kpo00002
B. 말레이미드-유도체
실시예 2A에 기술된 방법을 사용하여, N-숙신이미딜-4-(N-사이클로헥산-1 카르복실레이트(SMCC, Pierce)로 노나펩타이드 I 중의 Na-아미노기를 아실화시켜 말레이미드-유도체 IV를 얻었다.
C. 브로모아세틸-유도체
실시예 2A에 기술된 방법을 사용하여, N-숙신이미딜 브로모아세테이트로 노나펩타이드 I 중의 Nα-아미노기를 아실화시켜 브로모아세틸-유도체 V를 얻었다.
D. 피리딜디설파이드-유도체
실시예 2A에 기술된 방법을 사용하여, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP. Pierce)로 노나펩타이드 I 중의 Nα-아미노기를 아실화시켜 피리딜디설파이드-유도체 VI를 얻었다.
[실시예3]
겔로닌 유도체의 합성
A. 이미노티오란 유도체
2-이미노티오란(트라우트 시약)으로 독소를 유도체화시켜 겔로닌 내에 유리 SH-기를 도입했다. 50배 몰의 과량의 2-이미노티오란(1mM EDTA를 함유하고 있는 0.1M 인산염 완충용액(pH 8.0) 중의 0.4M 2-이미노티오란; 2-이미노티오란 최종 농도는 5㎜ol/ℓ)를 상기 완충액중의 4㎖ 겔로닌 용액(3㎎/㎖; 100μmol/ℓ)에 가했다. 반응 혼합물을 30℃에서 30분간 항온 배양했다. 그 후 이 혼합물을 0.1M 인산염 완충액(pH 7.5), 0.1M NaCl, 1mM EDTA로 평형화시킨 세파덱스 G25 칼럼에 적용하여 과량의 시약과 저분자량의 반응 생성물을 제거하였다. 이 유도체화 단계의 수율운 92%이고, 독소는 겔로닌 1분자당 평균 1-2개의 SH-기를 포함한다
B. 피리딜디설파이드-유도체
0.1M 인산염 완충용액(pH 7.5), 0.1M NaCl, 1mM EDTA(3g 겔로닌/ℓ)중에 겔로닌을 용해시킴으로써 피리딜디설파이드(PDP) 기를 겔로닌 내에 도입한다. 5배 몰 정도의 과량의 숙신 이미딜-피리딜디티오 프로피오네이트(에탄올중의 40mM SPDP; SPDP의 최종농도는 500μmol/ℓ이다)를 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.5), 0.1M NaCl, 1mM EDTA 중의 겔로닌 용액(3g 겔로닌/ℓ) 4㎖에 첨가하고, 실온에서 30분간 항온 배양했다. 이 혼합물을 상기 완충액중에 평형화된 세파덱스 G25 칼럼에 적용하여 과량의 시약 및 저분자량의 반응 생성물을 제거하였다. 독소 회수율은 95%이고 독소 분자는 겔로닌 1분자당 평균 1-2개의 피리딜디설파이드기를 포함한다.
[실시예4]
겔로닌 유도체에 노나펩타이드 유도체를 연결
A. 겔로닌-이미노티오란 유도체에 노나펩타이드 IV의 연결
겔로닌 유도체 용액(1.4㎎/㎖) 8㎖를 2.5몰배 과량의 노나펩타이드 IV(최종농도 115μmol/ℓ)와 함께 2시간동안 실온에서 항온 배양했다. 배양완충용액은 pH 7.5 인산염 완충액, 0.1M NaCl, 1mM EDTA이다. 그 후 배양 완충용액으로 평형화시킨 세파덱스 G50 칼럼에 이 반응 혼합물을 적용하여 과량의 시약과 저분자량의 반응 생성물을 제거하였다. SDS-PAGE로 시험해 본 결과 72%의 겔로닌 유도체가 접합물로 전환되었고, 주성분은 1개 펩타이드당 1개의 겔로닌 분자를 함유했다.
유리 겔로닌은 모노 Q(0.05M 트리스-완충용액, pH 8.0) 상에서 이온-교환 크로마토 그래피로 제거했다. 접합물은 0.5M NaCl로 용출되었다.
B. 겔로닌-이미노티오란 유도체에 노나펩타이드 IV의 연결
상술된 접합물의 제조는 A에 기술된 방법을 사용하여 실시한다.
C. 겔로닌-피리딜디설파이드 유도체에 노나펩타이드 IV의 연결
상술된 접합물의 제조는 A에 기술된 방법을 사용하여 실시한다.
[실시예5]
겔로닌-피리딜디설파이드 유도체에 노나펩타이드 III의 연결
겔로닌 유도체 (1.4㎎/㎖) 0.5㎖를 히드록실 아민(10mM)이 가해진 상기 인산염 완충용액중의 2.5몰배 과량의 노나펩타이드 III(최종농도 115μmol/ℓ)와 함께 밤새 실온에서 항온 배양했다.
반응이 완결된 후, 이 혼합물을 배양 완충용액으로 평형화시킨 세파덱스 G50 칼럼에 적용하여 과량의 시약 및 저분자량의 반응 생성물을 제거하였다. SDS-PAGE에 의해 시험한 결과 67%의 겔로닌 유도체가 접합물로 전환되었다. 유리 겔로닌은 모노 Q상에서 이온교환 크로마토 그래피(0.05M 트리스-완충용액, pH 8.0)로 제거했다. 접합물은 0.5M NaCl로 용출되었다.
[실시예6]
미코박테리움 투버쿨로시스(MT)의 65KD 단백질의 65-85 아미노산 서열을 갖는 21개의 아미노산으로 구성된 에피토프(RdV1)를 리신-A에 연결하는 방법
Lys-Thr-Ile-Ala-Tyr-Asp-Glu-Glu-Ala-Arg-Arg-Gly-Leu-Glu-Arg-Gly-Ala-Val-Arg-Asn-Ala-Lys의 서열을 갖는 펩타이드를 DMF/H2O(1:2)로 희석시킨다. DMF중의 0.4M SPDP를 첨가하고(몰 비 1:1), 그 혼합물은 주위 온도에서 30분간 항온 배양한다.
배양 후, 에틸아세테이드 2부피를 첨가하고, 그 혼합물을 에펜도르프 원심분리기 중에서 최대속도로 5분간 원심분리한다. 침전물을 에테르로 세척하고, 다시 최대속도로 5분간 원심 분리한다. 이어서, 침전물을 질소 기체하에 건조시킨다.
건조된 침전물을 가능한 한 소량의 부피로 0.1M NaP(PH=7.3)중에 용해시킨다.
리신-A(0.1M NaP중에 있음, pH=7.3)에 1M DTT를 첨가하여 10mM의 농도로 감소시킨 뒤, 주위온도에서 30분간 혼합물을 항온 배양하였다. 이어서 용액을 0.1M NaP(PH=7.3) 중에서 PD10 이상으로 탈염시켰다.
감소된 리신-A를 SPDP-처리한 펩타이드에 1:5의 몰 비로 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 1시간동안 항온 배양하였다.
생성된 접합물 용액을 4℃로 저장할 수 있다. 필요하다면, 고분자량의 불순물을 크로마토그래피(PBS 중의 Fractogel HW 55(S))로 정제 제거할 수 있다.
[실시예6B]
RA 환자의 사람 T-세포 클로운을 항원 존재 세포(Antigen Presenting Cells, APC)존재하에서 항원 특이적인 65KD 단백질로 자극한다. 여러 농도를 갖는 리신-A, 65KD 리신-A, 또는 RdV1-리신-A를 첨가한다. 3일경과후, 세포의 증식을 3H-티미딘을 첨가하여 측정한다. 그 결과를, 독소(접합물)을 첨가하지 않은 자극된 배양물중의 첨가율로서 하기 표에 내타내었다.
a 및 b는 각각 1차 및 2차 실험을 나타내었다.
Figure kpo00003
상기 표에서 나타낸 실험에 대한 LD은 다음과 같다.
Figure kpo00004
그러므로, 우리는 에피토프-리신-A 접합물이 독소 단독만의 경우 또는 독소-65KD 접합물보다 이들 세포에 대해 독성이 크다고 결론 지울수 있다.
[실시예6C]
항원존재 세포가 존재하지 않고, T-세포가 IL-2(항원 특이성 없음)으로 자극된다는 가정하에 실시예 6B와 동일한 실험을 반복 실시하였다. 그 결과는 하기 표에 나타내었다.
Figure kpo00005
평균 LD값은 다음과 같다.
Figure kpo00006
여기서, RdV1-리신-A 접합물이 T-세포 클로운의 증식을 억제시키는데 가장 효과적이라는 것을 알 수 있다.
[실시예7]
수컷 루이스-렛트에서 미콤박테리아 부티리쿰(파라핀 오일중 100㎎/㎖)으로 보조 관절염을 야기시킨다.
5마리의 랫트로 구성된 6개 그룹 각각에 대하 다음의 주사액으로 0-5일 및 8-12일간 처리한다;
그룹 1 위약
그룹 2 65KD-리신-A(실시예 6 참조)(1㎎/㎏)
그룹 3 펩타이드 I-리신-A 접합물(실시예 5 참조) (0.25㎎/㎏)
그룹 4 리신-A (0.25㎎/㎏)
그룹 5 65KD 단백질 (0.5㎎/㎏)
그룹 6 펩타이드 I (0.01㎎/㎏)
22일째 되는 날 10μg 65KD를 귀에 주사한다.
24일째 되는 날 귀가 팽윤한 것을 측정한다. 그 결과는 그룹당 평균치이고, 팽윤율(%)로서 나타내었다.
그룹 팽윤율(%)
(1) 5.0±2.6
(2) 8.1±2.8
(3) -0.2±2.5
(4) 8.1±3.0
(5) 5.8±2.9
(6) 2.8±3.4
여기서, 노나펩타이드-리신 접합물이 랫트에서의 65KD 단백질에 대한 DTH를 억제한다는 것을 결론지을 수 있다.

Claims (9)

  1. 류마티스성 질환에 대해 특징적인 T-임파구에 의해 인지되는 에피토프(epitope) 또는 그것의 교차-반응성 동족물을 포함하여, 상기의 에피토프 또는 그것의 교차-반응성 동족물이 식물, 진균류 또는 박태리아로부터 기원하는 진핵 리보좀의 불활성화 단백질 및 에너지성 α 또는 β입자를 방출하는 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 세포독소물질에 연결되어 있는 면역독소를 특징으로 하는 류마티스성 질환의 예방 도는 치료용 면역 독소.
  2. 제 1 항에 있어서, 에피토프가 관절 연골의 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 류마토이드성 관절염의 예방 또는 치료용 면역 독소.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 에피토프가 아미노산 서열Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 독소.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 미코박테리움의 65KD 단백질에 존재하는 것을 특징으로 하는 류마토이드성 관절염의 예방 또는 치료용 면역 독소.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 에피토프가 아미노산 서열 Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr을 갖는 것을 특징으로 하는 면역 독소.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소물질이 리신, 아브린, 모데신, 볼켄신, 비스쿠민, 겔로닌, 포크위드 항바이러스성 단백질, 도데칸드린, 디안틴, 루핀, 사포린, 모마르디카 캐란티아 억제제, 그레인 억제제, α-사르신, 레스트릭토신, 미토길린, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소로 이루어진 군에서 선택되는 리보좀-불활성화 단백질인 것을 특징으로 하는 면역 독소.
  7. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소물질이99Y,153Sm,43Sc,67Cu,186Rh,188Rh,212Bi,211At 및103Pd로 이루어진 군에서 선택되는 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 면역 독소.
  8. 제1항 내지 제5항, 제6항, 제7항 중 어느 한 항에 의한 하나 이상의 면역 독소를 생물학적 활성성분으로 포함하는 류마티스성 질환 치료용 약학적 제제.
  9. 에피토프 또는 그것의 교차-반응성 동족물을 직접적으로, 또는 글루타르(디)알데히드, 이미도에스테르류, N-히드록시숙신이미드 에스테르류. N-숙신이미딜-3(2-피리딜디티오)-프로피오네이트, 말레이미드기, 브로모아세틸기, 요오드아세틸기 및 킬레이터로 이루어진 군에서 선택되는 링커를 통해 세포독소물질에 연결시키는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 의한 면역 독소의 제조 방법.
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