JP2807506B2 - 自己免疫疾患の治療もしくは予防用免疫毒素 - Google Patents
自己免疫疾患の治療もしくは予防用免疫毒素Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は自己免疫疾患の治療もしくは予防用免疫毒
素、１つ以上の免疫毒素を含む薬剤及び免疫毒素の製造
方法に関する。
素、１つ以上の免疫毒素を含む薬剤及び免疫毒素の製造
方法に関する。
免疫系は複雑であり、その中には自己認識に対する要
性が含まれる。免疫系はこの自己認識により調節され、
細胞、抗体、増幅系（例えば補体）及びそれらの組合せ
が関与し得る。健康人の場合、免疫系は細胞免疫応答を
活性化するか及び／又は異種物質に対する抗体を産生す
ることにより異種物質に対する暴露に応答する。一方、
免疫系は通常自己の成分に対して寛容である（いわゆる
自己寛容）。自動免疫はこの自己寛容の回避として定義
付けられる。
性が含まれる。免疫系はこの自己認識により調節され、
細胞、抗体、増幅系（例えば補体）及びそれらの組合せ
が関与し得る。健康人の場合、免疫系は細胞免疫応答を
活性化するか及び／又は異種物質に対する抗体を産生す
ることにより異種物質に対する暴露に応答する。一方、
免疫系は通常自己の成分に対して寛容である（いわゆる
自己寛容）。自動免疫はこの自己寛容の回避として定義
付けられる。
自己免疫疾患としては、多発性硬化症（冒される組織
がミエリンである）、重症筋無力症（ターゲットは重要
な神経伝達物質であるアセチルコリンに対する受容体分
子である）、リウマチ性関節炎（ターゲットは特に未梢
関節である）、Ｉ型真性糖尿病（インシュリンを産生す
る細胞が破壊される特徴を有する）及び全身エリテマト
ーデス（血管、皮膚及び肝臓が冒される）が挙げられ
る。
がミエリンである）、重症筋無力症（ターゲットは重要
な神経伝達物質であるアセチルコリンに対する受容体分
子である）、リウマチ性関節炎（ターゲットは特に未梢
関節である）、Ｉ型真性糖尿病（インシュリンを産生す
る細胞が破壊される特徴を有する）及び全身エリテマト
ーデス（血管、皮膚及び肝臓が冒される）が挙げられ
る。
自己免疫疾患は特定の外部物質に関係なく生じる。自
己抗原に対する寛容は、自己抗原自体及び／又は自己抗
原に対する異常な免疫応答により損失し得る。場合によ
り、外因性物質は、ある種の自己抗原に対する応答性を
含めた免疫応答を生起する（エピトープ擬態）。感染剤
の特定の決定基に対する宿主による免疫応答は、擬態
（mimicked）宿主配列と交差反応し、自己免疫を生じ、
組織の損傷及び疾患を招く場合がある。多くのウィルス
性及び細菌性たんぱく質は、宿主たんぱく質と交差反応
するに十分類似しているが免疫寛容を破壊するほど異な
っているエピトープを有している。
己抗原に対する寛容は、自己抗原自体及び／又は自己抗
原に対する異常な免疫応答により損失し得る。場合によ
り、外因性物質は、ある種の自己抗原に対する応答性を
含めた免疫応答を生起する（エピトープ擬態）。感染剤
の特定の決定基に対する宿主による免疫応答は、擬態
（mimicked）宿主配列と交差反応し、自己免疫を生じ、
組織の損傷及び疾患を招く場合がある。多くのウィルス
性及び細菌性たんぱく質は、宿主たんぱく質と交差反応
するに十分類似しているが免疫寛容を破壊するほど異な
っているエピトープを有している。
自己抗原及び／又は異種抗原の認識並びにその後発生
する免疫系による自己抗原を含む組織の損傷は、Ｔ−リ
ンパ球及びＢ−リンパ球により媒介される。
する免疫系による自己抗原を含む組織の損傷は、Ｔ−リ
ンパ球及びＢ−リンパ球により媒介される。
U.S.特許第4,634,590号には、長期細胞系として実験
動物において自己免疫疾患の発症因子となり得る特定の
Ｔ−リンパ球を培養することが記載されている。これら
特定のＴ−リンパ球を弱毒化すると、細胞又はその膜材
料が特定の自己免疫疾患に対する予防接種用の有効な薬
剤として使用され得ることが判明した。
動物において自己免疫疾患の発症因子となり得る特定の
Ｔ−リンパ球を培養することが記載されている。これら
特定のＴ−リンパ球を弱毒化すると、細胞又はその膜材
料が特定の自己免疫疾患に対する予防接種用の有効な薬
剤として使用され得ることが判明した。
WO 85/05034には、マイコバグテリウムもしくはその
分画を症状の緩和用あるいは関節炎疾患の治療もしくは
診断用組成物又はワクチン中に使用する旨が記載されて
いる。正常な関節軟骨のプロテオグリカンと免疫交差反
応を示す特定のマイコバクテリウム分画が同定されてい
る。アジュバンド関節炎（AA）に対する予防及び自己免
疫疾患の抑制は１つの特定のマイコバグテリウム分画に
関連しており、他の分画は有害な自己免疫応答を引き起
す。
分画を症状の緩和用あるいは関節炎疾患の治療もしくは
診断用組成物又はワクチン中に使用する旨が記載されて
いる。正常な関節軟骨のプロテオグリカンと免疫交差反
応を示す特定のマイコバクテリウム分画が同定されてい
る。アジュバンド関節炎（AA）に対する予防及び自己免
疫疾患の抑制は１つの特定のマイコバグテリウム分画に
関連しており、他の分画は有害な自己免疫応答を引き起
す。
また、２つのＴ−リンパ球クローンが、それぞれ関節
炎の発症（arthritogenicity）又は関節炎の抑制に関与
し得る２つのマイコバグテリウム分画に応答すると同定
された。
炎の発症（arthritogenicity）又は関節炎の抑制に関与
し得る２つのマイコバグテリウム分画に応答すると同定
された。
アジュバンド関節炎Ｔ−リンパ球クローンは、これら
のＴ−細胞クローンにより認識されるマイコバクテリウ
ム上に存在する抗原を同定するためにも使用された。65
kDたんぱく質は、インビトロでＴ−細胞クローンの増殖
応答を引き出すマイコバクテリウム抗原として同定され
た。Ｔ−細胞クローンにより認識されるエピトープは65
kD抗原の180〜188アミノ酸配列中に存在している。この
配列はラットのプロテオグリカンのリンクたんぱく質の
一部を類似している（van Edenら、Nature 331,171,198
8参照）。
のＴ−細胞クローンにより認識されるマイコバクテリウ
ム上に存在する抗原を同定するためにも使用された。65
kDたんぱく質は、インビトロでＴ−細胞クローンの増殖
応答を引き出すマイコバクテリウム抗原として同定され
た。Ｔ−細胞クローンにより認識されるエピトープは65
kD抗原の180〜188アミノ酸配列中に存在している。この
配列はラットのプロテオグリカンのリンクたんぱく質の
一部を類似している（van Edenら、Nature 331,171,198
8参照）。
現在の自己免疫疾患の治療方法は、非特異性薬物を投
与する方法である。前記した薬物は自己免疫応答を抑制
するが、免疫系の全体的な低下を伴なう様々な望ましく
ない合併症を発現させたり、非リンパ様組織に対して他
の望ましくない中毒副作用を発現させる。現在使用され
ている自己免疫疾患の治療薬としては、ナプロキセン、
アウラノフィン、ペニシラミン、クロロキシ及びコルチ
コステロイドが例示される。自己免疫疾患の好ましい治
療もしくは予防方法においては、薬物を疾病症状を誘発
する免疫反応に特異的に作用するようにターゲットさせ
るべきである。
与する方法である。前記した薬物は自己免疫応答を抑制
するが、免疫系の全体的な低下を伴なう様々な望ましく
ない合併症を発現させたり、非リンパ様組織に対して他
の望ましくない中毒副作用を発現させる。現在使用され
ている自己免疫疾患の治療薬としては、ナプロキセン、
アウラノフィン、ペニシラミン、クロロキシ及びコルチ
コステロイドが例示される。自己免疫疾患の好ましい治
療もしくは予防方法においては、薬物を疾病症状を誘発
する免疫反応に特異的に作用するようにターゲットさせ
るべきである。
自己免疫疾患である重症筋無力症患者の自己抗原であ
るアセチルコリン受容体が抗原に対する特異的な免疫応
答を抑制すべく使用され得ることは、文献から公知であ
る。毒素のリシン又はゲロニンに結合したアセチルコリ
ン受容体は抗原反応性リンパ球の分画を除去し得る［Ki
llen,J.A.及びLindstrom,J.M.,Journal of Immunology
133（1984）,2549−2553;Olsberg,C.A.ら,Journal of I
mmunology 135（1985）,3062−3067:Brust,S.ら,Biol.C
hem.Hoppe−Seyler,368（1987）,991−999］。
るアセチルコリン受容体が抗原に対する特異的な免疫応
答を抑制すべく使用され得ることは、文献から公知であ
る。毒素のリシン又はゲロニンに結合したアセチルコリ
ン受容体は抗原反応性リンパ球の分画を除去し得る［Ki
llen,J.A.及びLindstrom,J.M.,Journal of Immunology
133（1984）,2549−2553;Olsberg,C.A.ら,Journal of I
mmunology 135（1985）,3062−3067:Brust,S.ら,Biol.C
hem.Hoppe−Seyler,368（1987）,991−999］。
更に、多くの場合、抗原は抗原提供細胞（APC）と主
要組織適合性複合体（MHC）の分子との組合せにより抗
原を提供した後抗原がＴ−リンパ球により認識され得る
ことも公知である。従って、従来の抗原−毒素は、抗原
−毒素複合体APC処理中APCが毒素の作用により不活性化
し、有用な細胞の免疫系が損われるという欠点を有して
いた。
要組織適合性複合体（MHC）の分子との組合せにより抗
原を提供した後抗原がＴ−リンパ球により認識され得る
ことも公知である。従って、従来の抗原−毒素は、抗原
−毒素複合体APC処理中APCが毒素の作用により不活性化
し、有用な細胞の免疫系が損われるという欠点を有して
いた。
本発明は、APCより処理する必要がなく、特定の自己
エピトープ又は異種エピトープが自己抗原又は異種抗原
ではなく細胞毒性物質に接合するという事実に基づく。
エピトープ又は異種エピトープが自己抗原又は異種抗原
ではなく細胞毒性物質に接合するという事実に基づく。
本発明においては、細胞毒性物質はＴ−リンパ球によ
り直接認識される抗原の断片：エピトープに結合する。
この結果、エピトープ−細胞毒性物質接合体がＴ−リン
パ球に対してより有効に毒作用するので、自己免疫性Ｔ
−リンパ球を完全に除去するために使用するエピトープ
−細胞毒性物質接合体の濃度を低下させることができ
る。
り直接認識される抗原の断片：エピトープに結合する。
この結果、エピトープ−細胞毒性物質接合体がＴ−リン
パ球に対してより有効に毒作用するので、自己免疫性Ｔ
−リンパ球を完全に除去するために使用するエピトープ
−細胞毒性物質接合体の濃度を低下させることができ
る。
本発明において、異種抗原の場合自己免疫応答に関与
するＴ−リンパ球のみが除去されるので、免疫系は異種
抗原に対する免疫応答を示す。
するＴ−リンパ球のみが除去されるので、免疫系は異種
抗原に対する免疫応答を示す。
本発明の免疫毒素は、特定の自己免疫疾患に特徴的な
Ｔ−リンパ球により認識されるエピトープ又はその交差
反応アナログを含み、前記エピトープ又はその交差反応
アナログが細胞毒性物質に結合していることを特徴とす
る。
Ｔ−リンパ球により認識されるエピトープ又はその交差
反応アナログを含み、前記エピトープ又はその交差反応
アナログが細胞毒性物質に結合していることを特徴とす
る。
特定の自己免疫疾患に特徴的なＴ−リンパ球により認
識される多くのたんぱく質及び／又は文献に認識されて
おり、公知である。
識される多くのたんぱく質及び／又は文献に認識されて
おり、公知である。
アジュバンド関節炎（AA）は、関節中の軟骨の変性を
引起す慢性自己免疫疾患である。アジュバンド関節炎は
結核菌（MT）の抗原を用いて免疫化することによりラッ
トにおいて誘発され得る。AAで認められる組織の破壊は
Ｔ−リンパ球に特徴的である。Ｔ−リンパ球は、関節炎
ラットにおける自己抗原に似ている結核菌に属する抗原
により刺激される。
引起す慢性自己免疫疾患である。アジュバンド関節炎は
結核菌（MT）の抗原を用いて免疫化することによりラッ
トにおいて誘発され得る。AAで認められる組織の破壊は
Ｔ−リンパ球に特徴的である。Ｔ−リンパ球は、関節炎
ラットにおける自己抗原に似ている結核菌に属する抗原
により刺激される。
特定のＴ−リンパ球クローンが、外来結核菌抗原及び
自己抗原の両方を認識し得ることが判明した。自己抗原
は多分、リンクたんぱく質と称される軟骨プロテオグリ
カン分子の一部に存在している。これら特定のＴ−リン
パ球クローンは、MtDNAを移入した大腸菌により発現ざ
せたMtたんぱく質である65kDたんぱく質と特異的に反応
する。この65kDたんぱく質はマイコバグテリウム菌株に
対する免疫応答において重要な役割を果す。
自己抗原の両方を認識し得ることが判明した。自己抗原
は多分、リンクたんぱく質と称される軟骨プロテオグリ
カン分子の一部に存在している。これら特定のＴ−リン
パ球クローンは、MtDNAを移入した大腸菌により発現ざ
せたMtたんぱく質である65kDたんぱく質と特異的に反応
する。この65kDたんぱく質はマイコバグテリウム菌株に
対する免疫応答において重要な役割を果す。
65kDたんぱく質の65〜85アミノ酸配列中に存在する21
個のアミノ酸からなるペプチド、並びに65kDたんぱく質
の180〜188アミノ酸配列中に存在する９個のアミノ酸Th
r−Phe−Gly−Leu−Gln−Leu−Glu−Leu−Thrからなる
ペプチドは、Ｔ−リンパ球により認識されるエピトープ
として同定される。前記したノナペプチドは、プロテオ
グリカン分子の糖骨格に対して核たんぱく質を結合し且
つThr−Ala−Val−Val−Ala−Leu−Glu−Leu−Glnのア
ミノ酸配列を有しているプロテオグリカン分子のリンク
たんぱく質の一部と類似している。Mt65kDたんぱく質と
同一のコード領域を有するウシ型結核菌の65kDたんぱく
質も、リンパ球により認識される数個のエピトープを含
む。
個のアミノ酸からなるペプチド、並びに65kDたんぱく質
の180〜188アミノ酸配列中に存在する９個のアミノ酸Th
r−Phe−Gly−Leu−Gln−Leu−Glu−Leu−Thrからなる
ペプチドは、Ｔ−リンパ球により認識されるエピトープ
として同定される。前記したノナペプチドは、プロテオ
グリカン分子の糖骨格に対して核たんぱく質を結合し且
つThr−Ala−Val−Val−Ala−Leu−Glu−Leu−Glnのア
ミノ酸配列を有しているプロテオグリカン分子のリンク
たんぱく質の一部と類似している。Mt65kDたんぱく質と
同一のコード領域を有するウシ型結核菌の65kDたんぱく
質も、リンパ球により認識される数個のエピトープを含
む。
これらのＴ−リンパ球エピトープはアミノ酸配列１〜
16、17〜61、85〜108、112〜132、235〜279及び437〜45
9中に共在又は存在している［マイコバクテリウム65kD
たんぱく質のアミノ酸配列については、Tholeら,Infec
t.Immun.55,1466−1475,1987;Hussonら,PNAS 84,1679−
1683,1987;Shinnickら,J.Bact.169,1080−1088,1987を
参照されたい］。
16、17〜61、85〜108、112〜132、235〜279及び437〜45
9中に共在又は存在している［マイコバクテリウム65kD
たんぱく質のアミノ酸配列については、Tholeら,Infec
t.Immun.55,1466−1475,1987;Hussonら,PNAS 84,1679−
1683,1987;Shinnickら,J.Bact.169,1080−1088,1987を
参照されたい］。
ミエリン塩基性たんぱく質（BP）は別の種における自
己抗原である。BPを用いて免疫化するか又はBPを用いて
免疫化した動物からのリンパ球を受動移入すると、幾つ
かの種において自己免疫疾患実験的自己免疫脳脊髄炎
（EAE）が発症した。EAEは多発性硬化症で見られる症状
の炎症麻痺及び髄鞘脱落を生起する。EAEは、特定の種
類のＴ−リンパ球により媒介される。BPもしくはその幾
つかの断片を用いて免疫化すると、感受性種においてEA
Eが生起するが、すべての断片が起脳炎（encephalogeni
c）ではない。Ｔ−リンパ球は特定のエピトープが含有
するたんぱく質又は断片によってのみ活性化される。BP
中の幾つかのエピトープは既に公知である。BPのアミノ
酸配列１〜16、１〜37、59〜74、68〜88、89〜169及び1
14〜122は既に、起脳炎Ｔ−リンパ球及び多発性硬化症
に特有のＴ−リンパ球に対して親和性を示すエピトープ
又はエピトープ含有配列として同定されている［ミエリ
ン塩基性たんぱく質のアミノ酸配列については、Eylar
ら,J.Biol.Chem.246,5770,1971;Gibsonら,J.Biol.Chem.
259,5028,1984;Stoner,G.L.,J.Neurochem.,43,433−44
7,1984;Scobleら,J.Neurochem.,47,614−616,1986を参
照されたい］。
己抗原である。BPを用いて免疫化するか又はBPを用いて
免疫化した動物からのリンパ球を受動移入すると、幾つ
かの種において自己免疫疾患実験的自己免疫脳脊髄炎
（EAE）が発症した。EAEは多発性硬化症で見られる症状
の炎症麻痺及び髄鞘脱落を生起する。EAEは、特定の種
類のＴ−リンパ球により媒介される。BPもしくはその幾
つかの断片を用いて免疫化すると、感受性種においてEA
Eが生起するが、すべての断片が起脳炎（encephalogeni
c）ではない。Ｔ−リンパ球は特定のエピトープが含有
するたんぱく質又は断片によってのみ活性化される。BP
中の幾つかのエピトープは既に公知である。BPのアミノ
酸配列１〜16、１〜37、59〜74、68〜88、89〜169及び1
14〜122は既に、起脳炎Ｔ−リンパ球及び多発性硬化症
に特有のＴ−リンパ球に対して親和性を示すエピトープ
又はエピトープ含有配列として同定されている［ミエリ
ン塩基性たんぱく質のアミノ酸配列については、Eylar
ら,J.Biol.Chem.246,5770,1971;Gibsonら,J.Biol.Chem.
259,5028,1984;Stoner,G.L.,J.Neurochem.,43,433−44
7,1984;Scobleら,J.Neurochem.,47,614−616,1986を参
照されたい］。
他の自己免疫疾患である重症筋無力症（MG）は、アセ
チルコリン受容体の免疫原性因子の提供により始まり、
自己免疫リンパ球の刺激を生ずる。MGは受容体の顕著な
変性を生起するアセチルコリン受容体に対するＴ−リン
パ球及び自己抗体により特徴付けられ、臨床的には随意
筋の虚弱及び疲労の症状を呈する。アセチルコリン受容
体は５個のサブユニット（α２βcd）からなる。
チルコリン受容体の免疫原性因子の提供により始まり、
自己免疫リンパ球の刺激を生ずる。MGは受容体の顕著な
変性を生起するアセチルコリン受容体に対するＴ−リン
パ球及び自己抗体により特徴付けられ、臨床的には随意
筋の虚弱及び疲労の症状を呈する。アセチルコリン受容
体は５個のサブユニット（α２βcd）からなる。
MGを罹患している患者の細胞自己免疫応答の大部分は
受容体のα−サブユニットの領域：主免疫原性領域に向
けられている。この領域では、アミノ酸配列を含有する
幾つかのエピトープがアミノ酸配列１〜30、73〜90、10
0〜116、111〜126、146〜162、169〜181、182〜198、25
7〜271、351〜368の如く同定された［アセチルコリン受
容体のアミノ酸配列については、Nodaら,Nature 299,79
3−797,1982;Nature 302,528−532,1983;Nature 305,81
8−823,1983;Sumikawaら,Nucleic Acid Res.10,5809−5
822,1982;Devillers−Thieryら,PNAS 80,2067−2071,19
83;Hohlfeldら,J.Clin.Invest.81,657−660,1988を参照
されたい］。
受容体のα−サブユニットの領域：主免疫原性領域に向
けられている。この領域では、アミノ酸配列を含有する
幾つかのエピトープがアミノ酸配列１〜30、73〜90、10
0〜116、111〜126、146〜162、169〜181、182〜198、25
7〜271、351〜368の如く同定された［アセチルコリン受
容体のアミノ酸配列については、Nodaら,Nature 299,79
3−797,1982;Nature 302,528−532,1983;Nature 305,81
8−823,1983;Sumikawaら,Nucleic Acid Res.10,5809−5
822,1982;Devillers−Thieryら,PNAS 80,2067−2071,19
83;Hohlfeldら,J.Clin.Invest.81,657−660,1988を参照
されたい］。
本明細書中、エピトープという用語は免疫系の成分に
より認識される免疫原性分子の抗原決定基を指す。
より認識される免疫原性分子の抗原決定基を指す。
上記エピトープは細胞毒性物質に結合して、本発明の
エピトープ−細胞毒性物質接合体を生ずる。
エピトープ−細胞毒性物質接合体を生ずる。
当業者に自明の如く、エピトープの一部を含むペプチ
ドも、エピトープに加えてフランキングアミノ酸又は他
の部分を含むペプチドと同様にＴ−リンパ球に対して結
合親和力を示す。これらのフランキング部分の長さは、
ペプチドが必ずしもAPCにより処理されないという要件
により限定される。前記したペプチドを含む免疫毒素も
本発明に包含され得る。
ドも、エピトープに加えてフランキングアミノ酸又は他
の部分を含むペプチドと同様にＴ−リンパ球に対して結
合親和力を示す。これらのフランキング部分の長さは、
ペプチドが必ずしもAPCにより処理されないという要件
により限定される。前記したペプチドを含む免疫毒素も
本発明に包含され得る。
類似している同一ではないアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドも対応の免疫原性特徴を示す。上記したように
エピトープに関連するポリペプチドも本発明に包含され
得る。
ペプチドも対応の免疫原性特徴を示す。上記したように
エピトープに関連するポリペプチドも本発明に包含され
得る。
本発明の構成に使用される細胞毒性物質は、細胞増殖
を停止させ、最後には細胞を死滅させ得る物質群の中か
ら選択される。
を停止させ、最後には細胞を死滅させ得る物質群の中か
ら選択される。
好ましくは、細胞毒性物質は、真核細胞においてタン
パク質合成を阻害する作用を有する植物，真菌又は細菌
由来のたんぱく質群から選択される。これらの毒素は、
リボソームを触媒的に不活性化させることにより翻訳過
程で特異的に作用する。植物毒素は２つのグループ、す
なわち２個もしくは、４個のたんぱく質を含有するサブ
ユニットから構成される毒素及び通常カルボハイドレー
ト部分が結合している単一鎖のたんぱく質分子から構成
される毒素に大別される。
パク質合成を阻害する作用を有する植物，真菌又は細菌
由来のたんぱく質群から選択される。これらの毒素は、
リボソームを触媒的に不活性化させることにより翻訳過
程で特異的に作用する。植物毒素は２つのグループ、す
なわち２個もしくは、４個のたんぱく質を含有するサブ
ユニットから構成される毒素及び通常カルボハイドレー
ト部分が結合している単一鎖のたんぱく質分子から構成
される毒素に大別される。
２つのサブユニット毒素は60〜65kDの分子質量を有
し、サブユニットＡはサブユニットＢに比べてやや小さ
い（30kD対32kD）。サブユニットは単一のジスルフィド
結合により共役的に結合するが、疎水性相互作用はＡ及
びＢを一緒に保持するために相対的である。サブユニッ
トＢはポリペプチド鎖とマンノース及びＮ−Ac−グルコ
サミンを含むカルボハイドレート鎖から成る。このサブ
ユニットは毒素とターゲット細胞膜のガラクトース−含
有糖たんぱく質及び−脂質との相互作用に関与している
と考えられる。このサブユニットにより、サブユニット
Ａは細胞に進入し得る。サブユニットＡは触媒的に真核
リボソームを不活性化し、その結果たんぱく質の合成を
阻害し、細胞を死滅させる。この群の毒素には、リシ
ン、アブリン、モデシン（modeccin）、ボルケンシン
（volkensin）及びビスクミン（viscumin）が包含され
る。
し、サブユニットＡはサブユニットＢに比べてやや小さ
い（30kD対32kD）。サブユニットは単一のジスルフィド
結合により共役的に結合するが、疎水性相互作用はＡ及
びＢを一緒に保持するために相対的である。サブユニッ
トＢはポリペプチド鎖とマンノース及びＮ−Ac−グルコ
サミンを含むカルボハイドレート鎖から成る。このサブ
ユニットは毒素とターゲット細胞膜のガラクトース−含
有糖たんぱく質及び−脂質との相互作用に関与している
と考えられる。このサブユニットにより、サブユニット
Ａは細胞に進入し得る。サブユニットＡは触媒的に真核
リボソームを不活性化し、その結果たんぱく質の合成を
阻害し、細胞を死滅させる。この群の毒素には、リシ
ン、アブリン、モデシン（modeccin）、ボルケンシン
（volkensin）及びビスクミン（viscumin）が包含され
る。
単一鎖植物毒素は、上記したＡサブユニットと類似の
性質を有する。これらの毒素は無細胞系では非常に強力
な抑制剤であるが、完全な細胞に対しては不活性であ
る。Ｂサブユニットが存在しないので、これらの毒素は
ターゲットの細胞に簡単に進入せず、従って毒素を含む
Ｂサブユニットに比べて細胞に対する毒性は非常に低
い。しかしながら、毒素が細胞を結合し得るか又は細胞
に進入し得るキャリア、例えばレクチンや抗体に結合し
ていると、毒性を呈するようになる。この毒素群に属す
るたんぱく質の例には、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ
抗菌性たんぱく質、ドデカンドリン（dodecandrin）、
ジアンチン（dianthins）、ルフィン（luffin）、サポ
リン（saporins）、Momardicacharatia阻害剤、グレイ
ン阻害剤（grain inhibitor）が包含される。
性質を有する。これらの毒素は無細胞系では非常に強力
な抑制剤であるが、完全な細胞に対しては不活性であ
る。Ｂサブユニットが存在しないので、これらの毒素は
ターゲットの細胞に簡単に進入せず、従って毒素を含む
Ｂサブユニットに比べて細胞に対する毒性は非常に低
い。しかしながら、毒素が細胞を結合し得るか又は細胞
に進入し得るキャリア、例えばレクチンや抗体に結合し
ていると、毒性を呈するようになる。この毒素群に属す
るたんぱく質の例には、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ
抗菌性たんぱく質、ドデカンドリン（dodecandrin）、
ジアンチン（dianthins）、ルフィン（luffin）、サポ
リン（saporins）、Momardicacharatia阻害剤、グレイ
ン阻害剤（grain inhibitor）が包含される。
真菌性たんぱく質毒素、例えばα−サクリン、レスト
リクトニン及びマイトジリンは、塩基性たんぱく質と密
接に関連している。これらの毒素は単一のポリペプチド
鎖を含み、多くの植物毒素とは異なってカルボハイドレ
ート部分を含まない。
リクトニン及びマイトジリンは、塩基性たんぱく質と密
接に関連している。これらの毒素は単一のポリペプチド
鎖を含み、多くの植物毒素とは異なってカルボハイドレ
ート部分を含まない。
ジフテリア毒素及びシュードモナス外毒素は、上記し
た２サブユニット植物毒素と機能類似性を示す細菌性毒
素の例である。
た２サブユニット植物毒素と機能類似性を示す細菌性毒
素の例である。
他の好ましい細胞毒性物質は、ラジオアイソトープの
群から選択される。これらのラジオアイソトープは特定
の細胞に対してターゲットされ得る。ターゲット細胞
は、強力なα−粒子又はβ−粒子を放出するアイソトー
プを使用すると破壊もしくは死滅する。適当なアイソト
ープは90Y、153Sm、43Sc、67Cu、186Rh、188Rh、212B
i、211At、103Pdである。
群から選択される。これらのラジオアイソトープは特定
の細胞に対してターゲットされ得る。ターゲット細胞
は、強力なα−粒子又はβ−粒子を放出するアイソトー
プを使用すると破壊もしくは死滅する。適当なアイソト
ープは90Y、153Sm、43Sc、67Cu、186Rh、188Rh、212B
i、211At、103Pdである。
エピトープをたんぱく質毒素に接合させる方法は幾つ
か公知である。
か公知である。
エピトープとたんぱく質毒素とのランダムカップリン
グは、例えばたんぱく質毒素のカルボキシル基を活性化
してエピトープのアミノ基にカップリングし得るカルボ
ジイミド化合物（例EDC）を用いて実施され得る。
グは、例えばたんぱく質毒素のカルボキシル基を活性化
してエピトープのアミノ基にカップリングし得るカルボ
ジイミド化合物（例EDC）を用いて実施され得る。
この直接カップリングとは別に、リンカーを使用して
エピトープとたんぱく質毒素とを架橋するこができる。
公知のホモ二官能性化架橋剤はグルタル（ジ）アルデヒ
ドである。これは優先的にアミンとする。
エピトープとたんぱく質毒素とを架橋するこができる。
公知のホモ二官能性化架橋剤はグルタル（ジ）アルデヒ
ドである。これは優先的にアミンとする。
他のホモ二官能性リンカーは、イミドエステル（例え
ばジメチルアジピイミデート，ジメチルスベライミデー
ト）、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例
えばジスクシンイミジルスベレート，ジチオビス（スク
シンイミジルプロピオネート））から選択され、これら
はアミノ基に対して特異性を有する。
ばジメチルアジピイミデート，ジメチルスベライミデー
ト）、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例
えばジスクシンイミジルスベレート，ジチオビス（スク
シンイミジルプロピオネート））から選択され、これら
はアミノ基に対して特異性を有する。
ヘテロ二官能性試薬が好ましい。なぜならば、これら
の試薬は選択的に且つ継続的に接合反応をコントロール
し得る２個の異種の官能基を含んでいるからである。ヘ
テロ二官能性リンカーの例がＮ−スクシンイミジル−３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）であ
る。まず、第一アミンとSPDPとを反応させて２−ピリジ
ルジスルフィド基をエピトープに導入する。次いで誘導
体合成（derivatised）したエピトープをチオール基を
含むたんぱく質毒素に接合して、エピトープとたんぱく
質毒素との間にジスルフィド結合を形成する。チオール
基が存在していないときには、２−イミノチオラン,SPD
P又はＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテ
ートのようなチオール化剤を用いてこのチオール基をた
んぱく質毒素に導入してもよい。
の試薬は選択的に且つ継続的に接合反応をコントロール
し得る２個の異種の官能基を含んでいるからである。ヘ
テロ二官能性リンカーの例がＮ−スクシンイミジル−３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）であ
る。まず、第一アミンとSPDPとを反応させて２−ピリジ
ルジスルフィド基をエピトープに導入する。次いで誘導
体合成（derivatised）したエピトープをチオール基を
含むたんぱく質毒素に接合して、エピトープとたんぱく
質毒素との間にジスルフィド結合を形成する。チオール
基が存在していないときには、２−イミノチオラン,SPD
P又はＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテ
ートのようなチオール化剤を用いてこのチオール基をた
んぱく質毒素に導入してもよい。
マレイミド基及びブロモ−又はヨードアセチル基を温
和な条件下で非常に迅速にチオール基と反応させると、
チオ−エーテル型の結合が得られる。マレイミド基は例
えば、エピトープのアミノ基とスクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレートとを反応させてエピトープ中に導入すること
もできる。第２工程で、スルフヒドリル基含有たんぱく
質マレイミド活性化エピトープに結合させる。
和な条件下で非常に迅速にチオール基と反応させると、
チオ−エーテル型の結合が得られる。マレイミド基は例
えば、エピトープのアミノ基とスクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレートとを反応させてエピトープ中に導入すること
もできる。第２工程で、スルフヒドリル基含有たんぱく
質マレイミド活性化エピトープに結合させる。
たんぱく質毒素のカルボハイドレート部分は、エピト
ープへの結合ために使用され得る。過ヨウ素酸塩は、ア
ルデヒド基をカルボハイドレート部分に発生させるべく
使用される。次いで、アルデヒド基をエピトープのアミ
ノ基と反応させてシップ塩基を形成することができる。
前記シップ塩基は還元により安定化して第２アミンを形
成する。
ープへの結合ために使用され得る。過ヨウ素酸塩は、ア
ルデヒド基をカルボハイドレート部分に発生させるべく
使用される。次いで、アルデヒド基をエピトープのアミ
ノ基と反応させてシップ塩基を形成することができる。
前記シップ塩基は還元により安定化して第２アミンを形
成する。
ラジオアイソトープのエピトープへのカップリング
は、キレート化剤を用いて実施される。キレート化剤
は、インビボで良好なキレート化剤−アイソトープ複合
体の安定性が確保できるように構成される。
は、キレート化剤を用いて実施される。キレート化剤
は、インビボで良好なキレート化剤−アイソトープ複合
体の安定性が確保できるように構成される。
本発明の免疫毒素を製造するための別の方法は、組換
えDNA法による。毒素ポリペプチド又はその毒性ドメイ
ンをコードするゲノムDNA又はmRNA由来の適当な核酸配
列を、エピトープのアミノ酸配列に関する遺伝情報を運
ぶ核酸配列を用いて連結させた。所要により、毒素とエ
ピトープとの間のスペーサーとして適当なアミノ酸配列
をコードする結合配列を導入してもよい。これらの免疫
毒素の産生は、原核又は真核発現係のいずれにおいても
実施され得る。
えDNA法による。毒素ポリペプチド又はその毒性ドメイ
ンをコードするゲノムDNA又はmRNA由来の適当な核酸配
列を、エピトープのアミノ酸配列に関する遺伝情報を運
ぶ核酸配列を用いて連結させた。所要により、毒素とエ
ピトープとの間のスペーサーとして適当なアミノ酸配列
をコードする結合配列を導入してもよい。これらの免疫
毒素の産生は、原核又は真核発現係のいずれにおいても
実施され得る。
本発明の免疫毒素は、腸管内又は好ましくは腸管外に
投与され得る。この目的で、通常の薬学的に許容され得
る非毒性の担体及び／又は通常の賦形剤と混合して、薬
剤組成物を調製し得る。
投与され得る。この目的で、通常の薬学的に許容され得
る非毒性の担体及び／又は通常の賦形剤と混合して、薬
剤組成物を調製し得る。
前記薬剤組成物としては、腸管内投与用錠剤、丸剤及
びコーティング錠、経口又は非経口投与用溶液、懸濁液
又は乳濁液が包含される。
びコーティング錠、経口又は非経口投与用溶液、懸濁液
又は乳濁液が包含される。
本発明の製剤中の化合物の投与量は、大きく患者の個
々の条件に依存する。しかしながら、静脈内投与の場合
には、化合物は好ましくは最初0.1〜１μg/Kg体重の量
投与され、その後所要により１日１回もしくはそれ以上
追加投与される。注入する場合には、化合物を、上記し
た静注容量に基づいた用量を長期間に亘り投与する。
々の条件に依存する。しかしながら、静脈内投与の場合
には、化合物は好ましくは最初0.1〜１μg/Kg体重の量
投与され、その後所要により１日１回もしくはそれ以上
追加投与される。注入する場合には、化合物を、上記し
た静注容量に基づいた用量を長期間に亘り投与する。
以下、本発明の実施例を示す。
実施例１ ノナペプチドThr−Ala−Val−Val−Ala−Leu−Glu−Leu
−Gln−OH（Ｉ）の合成 式Ｉを有するノナペプチドを、Merrifield（J.Amer.C
hem.Soc.85,49,1963）の方法に準じて合成した。
−Gln−OH（Ｉ）の合成 式Ｉを有するノナペプチドを、Merrifield（J.Amer.C
hem.Soc.85,49,1963）の方法に準じて合成した。
合成は、Vega Coupler 250 C装置を用い、ｐ−ベンジ
ルオキシベンジルアルコール樹脂（0.6−0.7mmol/g,Bac
hem A.G.,スイス）を使用して実施した。
ルオキシベンジルアルコール樹脂（0.6−0.7mmol/g,Bac
hem A.G.,スイス）を使用して実施した。
アミノ酸をそのＮα−Fmoc−（Fmoc＝９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル−）誘導体として樹脂に段階
的に結合させ、Glu及びThrの側鎖官能基はそれぞれｔ−
ブチルエステル及びｔ−ブチルエーテルとして保護し
た。
ルメチルオキシカルボニル−）誘導体として樹脂に段階
的に結合させ、Glu及びThrの側鎖官能基はそれぞれｔ−
ブチルエステル及びｔ−ブチルエーテルとして保護し
た。
合成は、Van Nispenら（Recl.Trav.Chim.Pays−Bas 1
04,99−100,1085）の方法に準じてDCC（ジシクロヘキシ
カルボジイミド）及びDMAP（N,N−ジメチルアミノピリ
ジン）を用いて低温、HOBt（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール）の存在下でまず樹脂にFmoc−Gln−OHをカッ
プリングさせた。得られたFmoc−Gln−樹脂上に残存す
る遊離アルコール基（0.3−0.4mmol/g）をアセチル化に
よりブロックした。
04,99−100,1085）の方法に準じてDCC（ジシクロヘキシ
カルボジイミド）及びDMAP（N,N−ジメチルアミノピリ
ジン）を用いて低温、HOBt（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール）の存在下でまず樹脂にFmoc−Gln−OHをカッ
プリングさせた。得られたFmoc−Gln−樹脂上に残存す
る遊離アルコール基（0.3−0.4mmol/g）をアセチル化に
よりブロックした。
Fmoc−保護基を、樹脂をDMF（ジメチルホルムアミ
ド）中25％ピペリジンで10分間処理した後、DMF及びCH2
Cl2を用いて３回洗浄して（各１分）、除去した。
ド）中25％ピペリジンで10分間処理した後、DMF及びCH2
Cl2を用いて３回洗浄して（各１分）、除去した。
Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Glu（OtBu）−OH、Fmoc−Leu
−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Val−OH（２回）、Fmoc−
Ala−OH及びFmoc−Thr（tBu）−OHを順次、樹脂1g当り
６〜7mlのDMF中それぞれ３当量の保護アミノ酸、DCC及
びHOBtを用いて２時間カップリングさせた。次いで、エ
タノール、DMF及びCH2Cl2を用いて３回洗浄した（各１
分）。各アシル化の終結をKaiserら（Anal.Bio−chem.3
4,595−598,1970）のニンヒドリンテストを用いてモニ
ターした。テストが陽性のときには、関連のカップリン
グ工程をそれぞれ１当量のFmoc−アミノ酸、DCC及びHOB
tを用いて１時間繰返した。Kaiserテストがなお陽性の
ときには、樹脂を無水酢酸−ピリジン（容量比2:1、６
〜7ml/g）を用いて10分間処理した後DMF及びCH2Cl2を用
いてそれぞれ１分間３回洗浄し残存の遊離アミノ基をア
セチル化した。上記したようにDMF中25％ピペリジンを
用いる処理によりFmoc−保護基を除去した後、次のアミ
ノ酸をカップリングさせた。
−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Val−OH（２回）、Fmoc−
Ala−OH及びFmoc−Thr（tBu）−OHを順次、樹脂1g当り
６〜7mlのDMF中それぞれ３当量の保護アミノ酸、DCC及
びHOBtを用いて２時間カップリングさせた。次いで、エ
タノール、DMF及びCH2Cl2を用いて３回洗浄した（各１
分）。各アシル化の終結をKaiserら（Anal.Bio−chem.3
4,595−598,1970）のニンヒドリンテストを用いてモニ
ターした。テストが陽性のときには、関連のカップリン
グ工程をそれぞれ１当量のFmoc−アミノ酸、DCC及びHOB
tを用いて１時間繰返した。Kaiserテストがなお陽性の
ときには、樹脂を無水酢酸−ピリジン（容量比2:1、６
〜7ml/g）を用いて10分間処理した後DMF及びCH2Cl2を用
いてそれぞれ１分間３回洗浄し残存の遊離アミノ基をア
セチル化した。上記したようにDMF中25％ピペリジンを
用いる処理によりFmoc−保護基を除去した後、次のアミ
ノ酸をカップリングさせた。
最後のFmoc−保護基を除去すると、以下のノナペプチ
ド−樹脂IIが得られた。
ド−樹脂IIが得られた。
遊離ペプチドＩが、ノナペプチド−樹脂IIをトリフル
オロ酢酸−ジクロロメタン（容量比1:1）中で３時間処
理すると得られた。
オロ酢酸−ジクロロメタン（容量比1:1）中で３時間処
理すると得られた。
この酸処理により、同時にｔ−ブチルをベースとする
保護基が除去され、ペプチドが樹脂から分離した。樹脂
を過により除去した。次いで液を真空下で蒸発させ
た。残渣をｔ−ブタノール−水（容量比1:1）に溶解さ
せた。残余のTFAを、Dowex2×８（OAc）イオン交換樹脂
を添加して酢酸に交換した。
保護基が除去され、ペプチドが樹脂から分離した。樹脂
を過により除去した。次いで液を真空下で蒸発させ
た。残渣をｔ−ブタノール−水（容量比1:1）に溶解さ
せた。残余のTFAを、Dowex2×８（OAc）イオン交換樹脂
を添加して酢酸に交換した。
生じた溶液を凍結乾燥すると、（酢酸塩として）ノナ
ペプチドＩが得られた。
ペプチドＩが得られた。
実施例２ ノナペプチド誘導体の合成 A.S−アセチルチオアセチル誘導体 ペプチドＩをDMF−H2O（容量比2:1）に溶解した。溶
液のpHを、Ｎ−エチル−N,N−ジイソプロピルアミンを
添加して7.5〜8.0に上昇させた。次いで、DMF中に1.2当
量のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテー
ト（SATA）を含む溶液を添加した。反応混合物のpHを、
前記した第三塩基を添加して7.5〜8.0に維持した。室温
で30分間、酢酸を添加して溶液のpHを5.0とした。真空
下で蒸発させて溶媒を除去した後、残渣を酢酸エチル−
エーテルを用いて粉砕した。次いで、ペプチド誘導体II
Iをｔ−ブタノール−水（容量比1:1）に溶解し、凍結乾
燥により単離した。
液のpHを、Ｎ−エチル−N,N−ジイソプロピルアミンを
添加して7.5〜8.0に上昇させた。次いで、DMF中に1.2当
量のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテー
ト（SATA）を含む溶液を添加した。反応混合物のpHを、
前記した第三塩基を添加して7.5〜8.0に維持した。室温
で30分間、酢酸を添加して溶液のpHを5.0とした。真空
下で蒸発させて溶媒を除去した後、残渣を酢酸エチル−
エーテルを用いて粉砕した。次いで、ペプチド誘導体II
Iをｔ−ブタノール−水（容量比1:1）に溶解し、凍結乾
燥により単離した。
B.マレイミド誘導体 実施例2Aに記載した方法に従って、Ｎ−スクシンイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC,“Pierce"）を用いてＩ
中のＮα−アミノ基をアシル化すると、マレイミド誘導
体IVが得られた。
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（SMCC,“Pierce"）を用いてＩ
中のＮα−アミノ基をアシル化すると、マレイミド誘導
体IVが得られた。
C.ブロモアセチル誘導体 実施例2Aに記載した方法に従って、Ｎ−スクシンイミ
ジル−ブロモアセテートを用いてＩ中のＮα−アミノ基
をアシル化すると、ブロモアセチル誘導体Ｖが得られ
た。
ジル−ブロモアセテートを用いてＩ中のＮα−アミノ基
をアシル化すると、ブロモアセチル誘導体Ｖが得られ
た。
D.ピリジルジスルフィド誘導体 実施例2Aに記載した方法に従って、Ｎ−スクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SP
DP,“Pierce"）を用いてＩ中のＮα−アミノ基をアシル
化すると、ピリジルジスルフィド誘導体VIが得られた。
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SP
DP,“Pierce"）を用いてＩ中のＮα−アミノ基をアシル
化すると、ピリジルジスルフィド誘導体VIが得られた。
実施例３ ゲロニン誘導体の合成 A.イミノチオラン誘導体 毒素を２−イミノチオラン（トラウト試薬）を用いて
誘導体合成することにより、遊離SH基をゲロニンに導入
した。
誘導体合成することにより、遊離SH基をゲロニンに導入
した。
50倍モル過剰の２−イミノチオラン（1mMのEDTAを含
有する0.1Mリン酸バッファ（pH8.0）中に0.4Mの２−イ
ミノチオラン；最終２−イミノチオラン濃度5mmol/g）
を上記したバッファ中のゲロニン溶液（3mg/ml;100μmo
l/）4mlに添加した。反応混合物を30℃でインキュベ
ートした。次いで、混合物を0.1Mリン酸バッファ（pH7.
5、0.1M NaCl、1mM EDTA）で平衡化したSephadex G25カ
ラムに導入して、過剰の試薬及び低分子量の反応生成物
を除去した。この誘導体合成（derivatization）工程の
収率は92％であり、毒素はゲロニン分子当り平均１〜２
個のSH基を含んでいた。
有する0.1Mリン酸バッファ（pH8.0）中に0.4Mの２−イ
ミノチオラン；最終２−イミノチオラン濃度5mmol/g）
を上記したバッファ中のゲロニン溶液（3mg/ml;100μmo
l/）4mlに添加した。反応混合物を30℃でインキュベ
ートした。次いで、混合物を0.1Mリン酸バッファ（pH7.
5、0.1M NaCl、1mM EDTA）で平衡化したSephadex G25カ
ラムに導入して、過剰の試薬及び低分子量の反応生成物
を除去した。この誘導体合成（derivatization）工程の
収率は92％であり、毒素はゲロニン分子当り平均１〜２
個のSH基を含んでいた。
B.ピリジルジスルフィド誘導体 0.1Mリン酸バッファ（pH7.5、0.1M NaCl、1mM EDT
A））中にゲロニンを溶解させて（3gゲロニン／）、
ピリジルジスルフィド（PDP）基をゲロニンに導入し
た。50倍モル過剰のスクシンイミジル−ピリジルジチオ
プロピオネート（エタノール中40mM SPDP;最終SPDP濃度
500μmol/）を、0.1Mリン酸バッファ（pH7.5.0.1M Na
Cl、1mM EDTA）中のゲロニン溶液（3gゲロニン／）4m
lに添加し、室温で30分間インキュベートした。次い
で、混合物を上記したバッファで平衡化したSephadex G
25カラムに導入して、過剰の試薬及び低分子量の反応生
成物を除去した。毒素の回収率は95％であり、毒素分子
はゲロニン分子当り平均１〜２個のピリジルジスルフィ
ド基を含んでいた。
A））中にゲロニンを溶解させて（3gゲロニン／）、
ピリジルジスルフィド（PDP）基をゲロニンに導入し
た。50倍モル過剰のスクシンイミジル−ピリジルジチオ
プロピオネート（エタノール中40mM SPDP;最終SPDP濃度
500μmol/）を、0.1Mリン酸バッファ（pH7.5.0.1M Na
Cl、1mM EDTA）中のゲロニン溶液（3gゲロニン／）4m
lに添加し、室温で30分間インキュベートした。次い
で、混合物を上記したバッファで平衡化したSephadex G
25カラムに導入して、過剰の試薬及び低分子量の反応生
成物を除去した。毒素の回収率は95％であり、毒素分子
はゲロニン分子当り平均１〜２個のピリジルジスルフィ
ド基を含んでいた。
実施例４ ノナペプチド誘導体のゲロニン誘導体への結合 A.ノナペプチドIVのゲロニン−イミノチオラン誘導体へ
の結合 ゲロニン誘導体溶液（1.4mg/ml）8mlを2.5倍モル過剰
のノナペプチドIV（最終濃度115μmmol/）と一緒に室
温で２時間インキュベートした。インキュベートバッフ
ァはリン酸バッファ（pH7.5、0.1M NaCl、1mM EDTA）で
あった。次いで、反応混合物をインキュベートバッファ
で平衡化したSephadex G50カラムに導入して、過剰の試
薬及び低分子量の反応生成物を除去した。SDS−PAGEに
よるテストの結果、72％のゲロニン誘導体が接合体に変
換されていた。主成分はペプチド当り１個のゲロニン分
子を含んでいた。
の結合 ゲロニン誘導体溶液（1.4mg/ml）8mlを2.5倍モル過剰
のノナペプチドIV（最終濃度115μmmol/）と一緒に室
温で２時間インキュベートした。インキュベートバッフ
ァはリン酸バッファ（pH7.5、0.1M NaCl、1mM EDTA）で
あった。次いで、反応混合物をインキュベートバッファ
で平衡化したSephadex G50カラムに導入して、過剰の試
薬及び低分子量の反応生成物を除去した。SDS−PAGEに
よるテストの結果、72％のゲロニン誘導体が接合体に変
換されていた。主成分はペプチド当り１個のゲロニン分
子を含んでいた。
遊離ゲロニンを、Mono Qのイオン交換クロマトグラフ
ィー（0.05M Trisバッファ、pH8.0）により除去した。
接合体を0.5M NaClで溶出した。
ィー（0.05M Trisバッファ、pH8.0）により除去した。
接合体を0.5M NaClで溶出した。
b.ノナペプチドVIのゲロニン−イミノチオラン誘導体へ
の結合 上記した接合体を、Ａに記載した方法に従って製造し
た。
の結合 上記した接合体を、Ａに記載した方法に従って製造し
た。
C.ノナペプチドＶのゲロニン−ピリジルジスルフィド誘
導体への結合 上記した接合体を、Ａに記載した方法に従って製造し
た。
導体への結合 上記した接合体を、Ａに記載した方法に従って製造し
た。
実施例５ ノナペプチドIIIのゲロニン−ピリジルジスルフィド誘
導体への結合 ゲロニン誘導体（1.4mg/ml）0.5mlを、ヒドロキシル
アミン（10mM）を添加した上記リン酸バッファ中で2.5
倍モル過剰のノナペプチドIII（最終濃度15μmol/）
と一緒に室温で一晩インキュベートした。
導体への結合 ゲロニン誘導体（1.4mg/ml）0.5mlを、ヒドロキシル
アミン（10mM）を添加した上記リン酸バッファ中で2.5
倍モル過剰のノナペプチドIII（最終濃度15μmol/）
と一緒に室温で一晩インキュベートした。
反応完了後、混合物をインキュベーションバッファで
平衡化したSephadex G50カラムに導入して、過剰の試薬
及び低分子量の反応生成物を除去した。SDS−PAGEによ
るテストの結果、67％のゲロニン接合体に変換されてい
た。遊離ゲロニンを、Mono Qのイオン交換クロマトグラ
フィー（0.05M Trisバッファ、pH8.0）による除去し
た。接合体を0.5M NaClで溶出した。
平衡化したSephadex G50カラムに導入して、過剰の試薬
及び低分子量の反応生成物を除去した。SDS−PAGEによ
るテストの結果、67％のゲロニン接合体に変換されてい
た。遊離ゲロニンを、Mono Qのイオン交換クロマトグラ
フィー（0.05M Trisバッファ、pH8.0）による除去し
た。接合体を0.5M NaClで溶出した。
実施例６ 結核菌（MT）の65kDたんぱく質の65〜85アミノ酸配列の
20個のアミノ酸からなるエピトープ（RdV1）のリシン−
Ａへの結合 配列Lys−Thr−Ile−Ala−Thy−Asp−Glu−Glu−Ala
−Arg−Arg−Gly−Leu−Glu−Arg−Gly−Ala−Val−Arg
−Asn−Ala−Lysを有するペプチドをDMF/H2O（1:2）中
で希釈した。DMF中の0.4MSPDP（モル比1:1）を添加し、
混合物を室温で30分間インキュベートした。
20個のアミノ酸からなるエピトープ（RdV1）のリシン−
Ａへの結合 配列Lys−Thr−Ile−Ala−Thy−Asp−Glu−Glu−Ala
−Arg−Arg−Gly−Leu−Glu−Arg−Gly−Ala−Val−Arg
−Asn−Ala−Lysを有するペプチドをDMF/H2O（1:2）中
で希釈した。DMF中の0.4MSPDP（モル比1:1）を添加し、
混合物を室温で30分間インキュベートした。
インキュベート後、２容量の酢酸エチルを添加し、混
合物をeppendorf遠心機により最大速度で遠心した。沈
澱をエーテルで洗浄し、再び最大速度で５分間遠心し
た。沈澱を窒素ガス下で乾燥した。
合物をeppendorf遠心機により最大速度で遠心した。沈
澱をエーテルで洗浄し、再び最大速度で５分間遠心し
た。沈澱を窒素ガス下で乾燥した。
乾燥した沈澱をできるだけ少量の0.1M NAP（pH7.3）
に溶解した。
に溶解した。
（pH7.3の0.1M NaP中の）リシン−Ａを、濃度10mMま
で1M DTTを添加し、混合物を室温で30分間インキュベー
トして還元した。次いで溶液を0.1M NaP（pH7.3）中PD
10で脱塩した。
で1M DTTを添加し、混合物を室温で30分間インキュベー
トして還元した。次いで溶液を0.1M NaP（pH7.3）中PD
10で脱塩した。
還元したリシン−ＡをSPDP処理ペプチドに1:5モル比
で添加した。混合物を室温で１時間インキュベートし
た。
で添加した。混合物を室温で１時間インキュベートし
た。
得られた接合体溶液を４℃で貯蔵した。所要により、
高分子量の不純物はクロマトグラフィー（PBS中Fractog
el HW 55（ｓ））により除去され得る。
高分子量の不純物はクロマトグラフィー（PBS中Fractog
el HW 55（ｓ））により除去され得る。
実施例6B RA患者のヒトＴ−細胞クローンを、抗原提供細胞（AP
C）の存在下で抗原特異性の65kDたんぱく質で刺激し
た。各種濃度でリシン−Ａ、65kD−リシン−Ａ又はRdV1
−リシン−Ａを添加した。３日後、細胞の増殖を3H−チ
ミジンの取込み量から調べた。結果を、毒素の添加（接
合体）なしに刺激培養物中に取込まれた量（％）として
示した。ａ及びｂは夫々第１回、第２回の実験結果であ
る。
C）の存在下で抗原特異性の65kDたんぱく質で刺激し
た。各種濃度でリシン−Ａ、65kD−リシン−Ａ又はRdV1
−リシン−Ａを添加した。３日後、細胞の増殖を3H−チ
ミジンの取込み量から調べた。結果を、毒素の添加（接
合体）なしに刺激培養物中に取込まれた量（％）として
示した。ａ及びｂは夫々第１回、第２回の実験結果であ
る。
上記した実験におけるLD50値は次の通りである。
LD50 リシン−Ａ 1.1 65kD−リシン−Ａ 33 RdV1−リシン−Ａ ＜ 0.1 以上の結果から、エピトープ−リシン−Ａ接合体は毒
素単独又は毒素−65kD接合体に比べてこれらの細胞に対
する毒性が強いとの結論が下され得る。
素単独又は毒素−65kD接合体に比べてこれらの細胞に対
する毒性が強いとの結論が下され得る。
実施例6C 実施例6Bの実験を繰返した。ただし、抗原提供細胞は
存在させず、Ｔ−細胞をIL−２（抗原非特異性）により
刺激した。結果は次の通りである。
存在させず、Ｔ−細胞をIL−２（抗原非特異性）により
刺激した。結果は次の通りである。
LD50の平均値は次の通りである。
平均LD50 毒素 6.8 毒素−65kD 3.9 毒素−RdV1 1.7 以上の結果から、RdV1−リシン−Ａ接合体がＴ−細胞
クローンの増殖を最も有効に抑制するとの結論が下され
得る。
クローンの増殖を最も有効に抑制するとの結論が下され
得る。
実施例７ 雄Lewisラットの、マイコバクテリウム・ブチリウム
（パラフィン油中100mg/ml）によりアジュバンド関節炎
を誘発させた。
（パラフィン油中100mg/ml）によりアジュバンド関節炎
を誘発させた。
６群のラット（各群当り５匹のラット）に、０〜５日
及び８〜12日に以下の物質を注射した。
及び８〜12日に以下の物質を注射した。
第１群：プラセボ 第２群:65kD−リシン−Ａ接合体（実施例６）（1mg/K
g） 第３群：ペプチドＩ−リシン−Ａ接合体（実施例５）
（0.25mg/Kg） 第４群：リシン−Ａ（0.25mg/Kg） 第５群:65kDたんぱく質（0.5mg/Kg） 第６群：ペプチドＩ（0.01mg/Kg） 22日目に65kDたんぱく質10μｇを耳に注射した。24日
目に耳の腫脹を調べた。結果を１群当りの平均値として
腫脹％で示した。
g） 第３群：ペプチドＩ−リシン−Ａ接合体（実施例５）
（0.25mg/Kg） 第４群：リシン−Ａ（0.25mg/Kg） 第５群:65kDたんぱく質（0.5mg/Kg） 第６群：ペプチドＩ（0.01mg/Kg） 22日目に65kDたんぱく質10μｇを耳に注射した。24日
目に耳の腫脹を調べた。結果を１群当りの平均値として
腫脹％で示した。
腫脹％ 第１群： 5.0±2.6 第２群： 8.1±2.8 第３群：−0.2±2.5 第４群： 8.1±3.0 第５群： 5.8±2.9 第６群： 2.8±3.4 以上の結果から、ノナペプチド−リシン−Ａ整合体は
ラットにおいて65kDたんぱく質に対するDTHを抑制する
との結論が下され得る。
ラットにおいて65kDたんぱく質に対するDTHを抑制する
との結論が下され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/39 A61K 39/00 A61K 43/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】特定の自己免疫疾患に特徴的なＴ−リンパ
球により認識されるエピトープ又はその交差反応アナロ
グを含む自己免疫疾患の治療もしくは予防用免疫毒素で
あって、前記エピトープ又はその交差反応アナログが細
胞毒性物質に結合していることを特徴とする免疫毒素。 - 【請求項２】エピトープが関節軟骨たんぱく質中に存在
していることを特徴とする請求項１に記載のリウマチ性
関節炎の治療もしくは予防用免疫毒素。 - 【請求項３】エピトープがThr−Ala−Val−Val−Ala−L
eu−Glu−Leu−Glnのアミノ酸配列を有していることを
特徴とする請求項２に記載の免疫毒素。 - 【請求項４】エピトープがマイコバクテリウムの65kDた
んぱく質中に存在していることを特徴とする請求項１に
記載のリウマチ性関節炎の治療もしくは予防用免疫毒
素。 - 【請求項５】エピトープがThr−Phe−Gly−Leu−Gln−L
eu−Glu−Leu−Thrのアミノ酸配列を有していることを
特徴とする請求項４に記載の免疫毒素。 - 【請求項６】エピトープがミエリン塩基性たんぱく質中
に存在していることを特徴とする請求項１に記載の多発
性硬化症の治療もしくは予防用免疫毒素。 - 【請求項７】エピトープがアセチルコリン受容体中に存
在していることを特徴とする請求項１に記載の重症筋無
力症の治療もしくは予防用免疫毒素。 - 【請求項８】細胞毒性物質がリボソーム不活性化たんぱ
く質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに
記載の免疫毒素。 - 【請求項９】細胞毒性物質がラジオアイソトープである
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の免疫
毒素。 - 【請求項１０】生物学的活性成分として請求項１〜９の
いずれかに記載の免疫毒素を１つ以上含む、自己免疫疾
患用薬剤。 - 【請求項１１】エピトープ又はその交差反応アナログを
直接又はリンカーを介して細胞毒素物質に結合させるこ
とを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の免疫毒
素の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP88202349 | 1988-10-21 | ||
| EP88202349.2 | 1988-10-21 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| NL8701163A (nl) * | 1986-09-09 | 1988-04-05 | Nederlanden Staat | Gebruik van een peptide voor de bereiding van preparaten voor het verlichten, het behandelen en de diagnose van autoimmuunziekten, in het bijzonder arthritische toestanden, verbindingen die met dit peptide verwant zijn, alsmede farmaceutische en diagnostische preparaten en testkits. |
-
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-
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