JP2003511061A

JP2003511061A - 変更された化学結合体化特性を有するａｂ５毒素ｂサブユニット変異体

Info

Publication number: JP2003511061A
Application number: JP2001530362A
Authority: JP
Inventors: ハロルドエイチ．ハンドリー，; タピオハーパランタ，; カーラエル．エウォルト，
Original assignee: アクティブバイオテックエイビー
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2003-03-25
Also published as: EP1222202A2; NZ518342A; CA2385172A1; WO2001027144A2; WO2001027144A3; AU7865900A; IL149009A0

Abstract

(57)【要約】少なくとも1つの変異を含む組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質であって、この変異は、野生型ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質と比較して、化学修飾に利用可能なアミノ酸残基の数を変え、そしてこの組換えタンパク質は、有効な標的リガンド結合親和性を保持する。例えば、特別に設計された変異は、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）内で産生され、その結果、この変異体は、依然としてそのレセプターＧｍ−１に高い親和性で結合し得るが、免疫原またはワクチンに対して、リジンまたはシステインで特異的に共有結合し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、変更された化学結合体化特性を有する、ＡＢ₅毒素Ｂサブユニット
タンパク質（例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ））における変異体を
作製する方法に関する。この変異体ＡＢ₅毒素Ｂサブユニットタンパク質を含む
組成物もまた議論される。さらに、ワクチンおよび生物活性分子送達薬剤として
のこれらの組成物の使用もまた議論される。

【０００２】（発明の背景）（粘膜免疫）多くの認可されたワクチンは、非経口的に送達され、これは、一般に、侵襲性
の疾患に対する全身保護の誘導において極めて効果的である１つの免疫経路であ
る。しかし、多くの病原体は、粘膜表面で複製または侵入するので、これらの生
物に対するワクチンの効力は、全身免疫および粘膜免疫の両方が誘導されるなら
ば、改善され得る。ワクチンは、粘膜免疫応答を誘導するために、例えば、経口
送達または鼻内送達によって、粘膜部位に投与されなければならないかもしれな
い。実際、これは、ワクチンが現在利用可能でない特定の病原体（例えば、ＲＳ
ウイルスおよびさらに可能性のあるＨＩＶ）に対するワクチンの製造に必須であ
り得る。粘膜ワクチンのさらなる潜在的利点は、これらが、容易に送達されるこ
とであり、これは、大量免疫プログラムにおいて非常に重要に考慮される。

【０００３】不運なことに、粘膜経路を介する多くの抗原の送達は、しばしば、抗原の不十
分な取り込みに起因する、低い免疫応答性によって特徴付けられる。結果として
、粘膜経路による抗原の効果的な送達のための種々のストラテジーが、研究され
てきた。粘膜管に並列している上皮細胞の障壁を横切って首尾よく送達される抗
原は、内在する、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の誘導性部位を刺激する。Ｍ
ＡＬＴにおいて感作される抗原特異的リンパ球は、循環系を介して移動し、離れ
た粘膜部位に集団形成し、従って、粘膜免疫は、局所保護および全身保護の両方
を提供する。

【０００４】多くの微生物は、粘膜表面を介してそれらの宿主に侵入するので、保護粘膜免
疫応答の発生は、種々の感染性疾患に対する防御の阻止ラインを提供し得る。首
尾よい経口ワクチン接種は、粘膜抗体の産生および／または細胞性免疫を誘導す
るはずである。しかし、多くの精製抗原の経口投与は、いかなる実質的な免疫応
答を生じない。

【０００５】（粘膜免疫におけるコレラ毒素の使用）コレラ毒素（ＣＴ）は、コレラ感染およびコレラ疾患後の効果的な長期継続性
の保護粘膜免疫応答の誘導を担うと、長い間考えられてきた。抗原をＣＴと混合
するかまたはコレラ毒素Ｂタンパク質（ＣＴＢ）と結合体化させた場合に、経口
投与したその抗原に対する増強された粘膜免疫応答が達成され得ることが、早期
に発見された。粘膜アジュバントとして作用するＣＴおよびＣＴＢの能力は、こ
れらのタンパク質の接着効果および上皮細胞膜透過効果から生じ得るが；しかし
、この免疫刺激活性の発揮において、活性な毒素が、このＢサブユニットよりも
効果的であるようである。従って、ＣＴＢ−膜相互作用に関連する事象を決定す
ること、およびＣＴＡ１の潜在的なトランスロケーション経路に関連する機構を
同定することが、重要である。

【０００６】（コレラ毒素）コレラの顕著な症状は周知であり、そしてＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ腸
毒素（ＣＴ）の毒性を担う細胞事象が、徹底的に記載されてきた。対照的に、Ｃ
Ｔの六量体ＡＢ₅複合体の異なるサブユニットが、共にどのように作用して、細
胞毒性を惹起するかの分子的詳細は、あまり理解されていない状態である。知ら
れていることは、ＣＴ（Ｍｒ＝８５６２０）が、そのホモ五量体Ｂサブユニット
（ＣＴＢ）を介して腸の上皮細胞の先端表面上のガングリオシドに結合すること
である。ガングリオシド（特に、ＧＭ−１）に対するＣＴＢの以上に強力なアビ
ディティは、その五量体形態中の各々のモノマーサブユニットの協同性の親和性
に、ほぼおそらく起因する。結合に際して、ＣＴＢは、膜表面上に平面環状構造
を形成し、この構造は、ＣＴのＡサブユニットと密接に相互作用する高い極性の
中心孔を有する。このＡサブユニットは、ＣＴＡ２サブユニットがジスルフィド
結合によって結合した毒性ＣＴＡ１サブユニットからなる。このジスルフィド結
合の還元によるＣＴＡ１の遊離は、細胞を通る、その側底膜へのトランスサイト
ーシスの間に生じる。これは、持続的なアデニル酸シクラーゼの活性化およびＧ
ＴＰ結合調節タンパク質Ｇ_Sαのリボシル化を導く。これらの事象は、ｃＡＭＰ
依存性プロテインキナーゼを介するナトリウムポンプの活性化およびその後の腸
管腔へのナトリウムおよび水の排出を生じる。ＣＴＢは、コレラ毒性の本質的工
程である、ガングリオシドＧＭ−１レセプターへの毒素結合を明らかに担うが、
標的細胞の細胞質区画へのＣＴＡ１の輸送の機構は、依然未知である。

【０００７】ＣＴ−膜相互作用の研究は、脂質二重層に組み込まれたＧＭ−１へのＣＴＢ結
合が、膜チャネルの形成を誘導することを示した。これらの知見は、ＣＴＡ１が
、膜を横切るタンパク質が並列する孔を通って通過することによって、標的細胞
の細胞質に転位されるということを、示唆する。しかし、膜包理化光活性化プロ
ーブを使用する研究および低解像度構造研究に基づくと、ＣＴＢは、ＧＭ−１レ
セプターとのその会合後に膜に侵入するようではない。これらの研究は、ＣＴが
、細胞表面に配向されたＣＴＡ１と結合し、これによって、ＣＴＢ−ＧＭ−１相
互作用に際して、ＣＴＡ１を膜内へそして膜を通過させることを示し得たが；し
かし、このような機構は、ＣＴ、ＣＴＢおよび密接に関連するＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉの易熱性腸毒素（ＬＴ）の結晶構造と一致しない。高解像度の
構造分析は、この毒素のＢ五量体が、膜に配向されたＡ１ポリペプチドと結合さ
れるならば、Ｂサブユニットの大部分もまた膜に侵入するはずであることを示す
。さらに、最近の証拠は、機能的ＣＴが、細胞表面から離れて面するＣＴＡ１と
、結合することを実証している。ＣＴがレセプター会合の際に有意な構造的変化
を受けるようではないというこれらの観察および事実は、ＣＴＡ１が細胞表面か
らいくらか離れた部位から標的細胞の細胞質内の位置まで移動する機構に関する
、多くの問題を提起した。

【０００８】エンドサイトーシスが、ＣＴによる細胞毒性の媒介において主要な役割を果た
すモデルを支持する証拠は、現在蓄積されている。ＣＴ中毒の媒介におけるエン
ドサイトーシスの役割は、全体的に明らかではないが；エンドソームのプロセシ
ングが、ゴルジおよび標的細胞の細胞質の可能性のある他の膜領域へのＣＴの移
動に関与するようである。現在、エンドサイトーシスが、ＣＴに、細胞毒性の経
路に影響する環境刺激に遭遇させるということが明らかである。これらのシグナ
ルの正確な性質は、明らかに確認されていないが、温度感受性およびｐＨが、ラ
ット肝細胞および肺上皮細胞株のＣＴ中毒に重要であることが示唆されており、
そしてＣＴＢの細胞質経路に影響しているかもしれない。さらに、低いｐＨが、
他のＡＢ₅毒素による細胞毒性における役割を有することが示唆されている。

【０００９】ＣＴＡ１輸送を担う機構は、重要である。なぜなら、周知の毒性効果に加えて
、ＣＴは、経口免疫ストラテジーおよび他の免疫ストラテジーに利用され得る、
強力な粘膜アジュバント特性を有するからである。

【００１０】（ＣＴを使用する粘膜ワクチンの産生：以前のストラテジー）粘膜ワクチンを開発するための１つのストラテジーは、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏ
ｌｅｒａ由来のコレラ毒素（ＣＴ）および関連するＥ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素（
ＬＴ）のような、細菌性腸毒素を使用してきた。これらの腸毒素は、粘膜送達さ
れた場合に高度に免疫原性であり、そして非関連抗原に対する応答を増強するた
めのキャリアとして作用し得る。両方の生物毒素は、Ｂサブユニットの環状五量
体と結合した、ＡＤＰリボシル化Ａサブユニットからなり、このＡサブユニット
が、毒性を媒介し、そしてＢサブユニットの五量体が、真核生物細胞上で発現さ
れるモノシアロガングリオシド（ＧＭ−１）糖と特異的に相互作用する。自然感
染の間、Ｂサブユニットの機能は、その結合したＡサブユニットの、ＧＭ−１−
発現細胞への結合および侵入を促進することである。このホロ毒素は、ある範囲
の抗原についての強力なアジュバントであり、そして抗原提示、サイトカイン産
生およびＢ細胞スイッチングを含む、異なる免疫機能を調節し得るが、これらの
実際の用途は、Ａサブユニットの毒性によって制限される。

【００１１】Ａサブユニットに対する変異を介して毒性を減少する試みは、このサブユニッ
トの毒性とアジュバント活性との間の直接的な関係についてかなりの議論を生じ
てきた。うまくいけば、これらのアジュバントは、処方が比較的簡単である。毒
性の問題を解決するための他の試みには、アジュバントとしての非毒性サブユニ
ットを開発する試みが含まれてきた。Ｂサブユニットを組み込むワクチンは、必
要とされる毒素投薬量を減少することによって、その毒素のアジュバント活性を
増強するようであるが、Ｂサブユニットは普及されなかった。しかし、多くの研
究は、抗原送達のためのビヒクルとしてもむしろ、アジュバントとして、Ｂサブ
ユニットを考慮するのみである。近年の証拠は、Ｂサブユニットが、抗原を物理
的に結合させた場合に、粘膜免疫系へその抗原を送達するのに効果的に作用する
ことを示す。この場合において、Ｂサブユニットは、その運ばれる抗原に対する
粘膜免疫応答を有意に増強することが知られている。

【００１２】ＬＴＢおよびＣＴＢのアジュバント特性のいくつかは、粘膜管に並列するＧＭ
−１発現上皮細胞を通るＢサブユニットの取り込みの増加、これによる、ＭＡＬ
Ｔ誘導性部位に受動的に送達される抗原の量およびその後の抗原特異的Ｂリンパ
球およびＴリンパ球の刺激を増強するによって説明され得る。ＬＴＢはまた、サ
イトカイン産生、リンパ球アポトーシス、およびＢ細胞活性化分子の発現のよう
な免疫活性を調節し得る。これらの特性はまた、アジュバントとしてのそれらの
有効性を付与し得る。明らかなことは、ＬＴＢおよびＣＴＢの高度に免疫原性の
性質およびリンパ球活性を調節するそれらの能力が、ＧＭ−１を結合するそれら
の能力に依存するということである。

【００１３】抗原は、遺伝子的手段および化学的手段のいずれかによって、Ｂ５サブユニッ
トに物理的に結合され得る。ＬＴＢへのエピトープの遺伝子融合は、いくつかの
場合で都合よいが、異種エピトープの遺伝子的連結は、そのＬＴＢ融合タンパク
質の構造、分泌、ＧＭ−１結合および免疫原性を干渉し得る。また、遺伝子融合
によってＬＴＢに結合され得る抗原のサイズおよび型に制限が存在する。代替的
でより柔軟性のあるアプローチは、化学的連結であり、これは、より大きくかつ
広範な範囲の抗原（ポリサッカリドを含む）を結合するために使用され得る。Ｃ
ＴＢはまた、センダイウイルス全体および精製したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓ由来ＡｇＩ／ＩＩのような抗原に化学的に連結され、そしてこれ
らの結合体は、粘膜部位（腸、気道、生殖管）および循環中で強力な免疫応答を
刺激することが示されている。

【００１４】Ｏ’Ｄｏｗｅｄら、１９９９、Ｖａｃｃｉｎｅ１７、１４４２−１４５３頁
は、エピトープタグ内の個々のアミノ酸をシステインで置換した、ＬＴＢ融合タ
ンパク質のパネルを生成した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、これ
らのシステイン残基に化学的に連結させた。ＨＲＰをＬＴＢに化学的に連結した
場合、鼻内投与後、ＨＲＰに対する高力価の粘膜抗体応答および全身抗体応答が
生成された。ＨＲＰをＬＴＢと同時投与した場合には、抗体応答は存在しなかっ
た。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、部位特異的な変異、欠失または付加による、組換えＣＴＢまたは他
のＡＢ₅型Ｂ５サブユニットタンパク質に対する、新規な配列改変体を提供する
。本発明はまた、ＣＴＢ産物または他のＡＢ₅型Ｂ５が、ガングリオシド特異性
を維持する様式で、免疫原アジュバント、マイクロカプセル、薬物または免疫応
答修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）と、化学的、疎水的または遺伝子的に架橋され
得るか、またはさもなければ会合され得る、上記タンパク質を生成する方法を意
図する。１つの実施形態において、組換えＢサブユニットタンパク質は、免疫原
、薬物または免疫応答修飾因子への化学結合体化が残基特異的様式で生じるよう
に特異的に変更され、そして得られた結合体のガングリオシド親和性を損なうこ
となく結合され得る。組換えＢサブユニットタンパク質は、大量に発現されそし
て単離され得る。このことは、組成においてより均質でありかつ受容可能な親和
性でガングリオシドに結合すると認識される結合体を可能にする。従って、この
結合体由来のワクチンは、粘膜組織を標的化し、そして全身性免疫応答および粘
膜免疫応答の両方を促進する。本発明の好ましい実施形態は、感染性疾患（これ
らの多くは、代表的に、粘膜組織表面に集落形成する）の優先的な感染部位に対
する免疫の動員に特に有利である。

【００１６】本発明の１つの実施形態は、Ｂ５タンパク質が高レベルで発現される、Ｂ５発
現系の新規なプラスミド構築物である。１つの実施形態において、ＣＴＢの１〜
１０３位の間の残基の少なくとも１つの変異、付加または欠失を含む、組換えコ
レラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）サブユニットタンパク質を開示する。有利には、この変
更は、ＣＴＢのガングリオシド結合を干渉することのない、この組換えタンパク
質の化学結合体化を可能にする。１つの実施形態において、この変異は、その部
位において、ｒＣＴＢが、任意の化合物、薬物、免疫原、免疫調節分子、アジュ
バントまたは他の生物活性分子と結合する能力を消失する。しかし、この化合物
は、別の部位でより特異的に結合し得、そして粘膜上皮にこれらの化合物を送達
し得る。好ましくは、これらの変異、欠失または付加は、野生型ＣＴＢの１〜１
０３位に対する。

【００１７】さらなる実施形態において、少なくとも１つの変異としては、Ｋ２３Ｕ、Ｋ３
４Ｕ、Ｋ４３Ｕ、Ｋ６２Ｕ、Ｋ６３Ｕ、Ｋ６９Ｕ、Ｋ８１Ｕ、Ｋ８４Ｕ、Ｃ８６
ＵまたはＫ９１Ｕが挙げられ；ここで、「Ｕ」は、これらの部位での化学修飾を
促進しないアミノ酸であるか、または「Ｕ」は、残基の欠失を表し、そして、こ
のアミノ酸の欠失が、これらの部位で共有結合的に修飾される能力が減少したｒ
ＣＴＢタンパク質を生じる。

【００１８】１つの実施形態において、有利には、これらの少なくとも１つの変異、欠失ま
たは付加は、ｒＣＴＢが、その変異、欠失または付加の部位で、任意の化合物、
薬物、免疫原、免疫調節分子、アジュバントまたは他の生物活性分子と結合する
こと、およびこの複合体を粘膜上皮へ送達することを容易にする。有利には、こ
れらの変異、欠失または付加は、野生型ＣＴＢの１〜１０３位に対する。

【００１９】本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの変異または欠失を含む組換え
コレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）サブユニットタンパク質であり、これらの変異または
欠失は、野生型ＣＴＢタンパク質と比較して、その組換えタンパク質における潜
在的な化学修飾部位の数を減少する。好ましくは、この変異または欠失は、ＣＴ
Ｂの１〜１０３位である。有利には、少なくとも１つの変異または付加が、野生
型ＣＴＢタンパク質と比較して、その変異部位で、この組換えタンパク質におけ
る潜在的な化学修飾部位の数を増加する。本発明の１つの局面において、この変
異または付加は、ＣＴＢの１〜１０３位である。

【００２０】本発明のさらなる実施形態は、野生型ＣＴＢタンパク質と比較して、修飾部位
の数が減少した組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）タンパク質をコードする、ｒＣ
ＴＢサブユニット遺伝子を作製する方法である。この方法は、コレラ毒素Ｂ（Ｃ
ＴＢ）タンパク質をコードするＣＴＢサブユニット遺伝子を提供する工程；この
ＣＴＢタンパク質の化学修飾を受け易いアミノ酸残基をコードするコドンを選択
する工程；およびこのコドンを変異または欠失させる工程であって、、その結果
、得られたアミノ酸残基は、化学修飾を受けにくい、工程を、包含する。

【００２１】本発明のさらなる実施形態は、野生型ＣＴＢタンパク質と比較して、化学修飾
部位の数が増加した組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）タンパク質をコードする、
ｒＣＴＢサブユニット遺伝子を作製する方法である。この方法は、コレラ毒素Ｂ
（ＣＴＢ）タンパク質をコードするＣＴＢサブユニット遺伝子を提供する工程；
このＣＴＢタンパク質の化学修飾を受けにくいアミノ酸残基をコードするコドン
を選択する工程；および、このコドンを変異させるかまたはこのコドンに付加さ
せる工程であって、その結果、この得られたｒＣＴＢタンパク質が、化学修飾を
受け易い能力を有する、工程；このＣＴＢタンパク質の化学修飾を受け易いアミ
ノ酸残基をコードするコドンを選択する工程；および、このコドンを変異または
欠失させる工程であって、その結果、この得られたアミノ酸は、化学修飾され得
ない、工程、を包含する。

【００２２】本発明のさらなる実施形態は、野生型ＣＴＢタンパク質と比較して、化学修飾
部位が減少した組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）タンパク質をコードするｒＣＴ
Ｂサブユニット遺伝子を作製する方法である。この方法は、コレラ毒素Ｂ（ＣＴ
Ｂ）タンパク質をコードするＣＴＢサブユニット遺伝子を提供する工程；このＣ
ＴＢタンパク質の化学修飾を受けにくいアミノ酸残基をコードするコドンを選択
する工程；このコドンを変異させるかまたはこのコドンに付加させる工程であっ
て、その結果、この得られたｒＣＴＢタンパク質が、化学修飾を受け易い能力を
有する、工程；このＣＴＢタンパク質の化学修飾を受け易いアミノ酸残基をコー
ドするコドンを選択する工程；およびこのコドンを変異または欠失させる工程で
あって、その結果、この得られたアミノ酸残基は、化学修飾され得ない、工程、
を包含する。

【００２３】本発明のさらなる実施形態は、組換えコレラ毒素Ｂ（ｒＣＴＢ）サブユニット
タンパク質を産生するための方法であり、この方法は、本発明のｒＣＴＢタンパ
ク質または変異タンパク質をコードする遺伝子を得る工程；プロモーターを付加
して、これによって、発現カセットを生成する工程；この発現カセットを適切な
宿主細胞に導入する工程；およびこの発現カセットがタンパク質に翻訳される条
件下で宿主細胞を培養する工程を包含する。

【００２４】本発明のさらなる実施形態は、コレラ毒素の組換え結合サブユニットタンパク
質（ＣＴＢ）を産生するための遺伝子構築物であり、これは、プロモーター、お
よび適切な読み枠で作動可能に連結されたｒＣＴＢタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を有する。

【００２５】本発明のさらなる実施形態は、コレラ毒素の組換え結合サブユニットタンパク
質（ＣＴＢ）を産生するための方法である。この方法は、適切な宿主細胞におい
て遺伝子構築物を発現させる工程、およびＣＴＢまたはその変異体を回収する工
程を包含する。

【００２６】本発明のさらなる実施形態は、ｒＣＴＢまたはその改変体と、全体または部分
的な生存、死化または再構成化した細菌またはウイルス、ウイルス様粒子、タン
パク質、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、ポリサッカリド、リン脂質、ＤＮ
Ａ、薬物、生物学的応答修飾因子、微粒子またはアジュバントの化合物との、遺
伝子的、共有結合的、疎水的または会合的な機構による、複合体の作製である。

【００２７】本発明のさらなる実施形態は、プロモーター、本発明のコレラ毒素結合サブユ
ニットタンパク質または変異体ｒＣＴＢをコードするＤＮＡ配列、および免疫原
性ペプチドコード配列を含む、遺伝子融合ベクターであり、ここで、このコレラ
毒素結合タンパク質サブユニットおよび免疫原性ペプチドコード配列は、適切な
読み枠で作動可能に連結されており、これによって、遺伝子融合タンパク質が生
じ、そしてこの遺伝子融合タンパク質が、封入体内または培地内に発現および分
泌される。

【００２８】本発明のさらなる実施形態は、免疫原または免疫原性複合体に対する抗体また
は細胞性免疫応答を生成する方法である。有利には、この方法は、本発明の組換
えＣＴＢタンパク質を提供する工程、このタンパク質を、第１の官能基および第
２の官能基を有するヘテロ二官能性の架橋剤で共有結合的に修飾する工程であっ
て、ここで、この第１の官能基は、この組換えＣＴＢタンパク質と化学的に会合
する、工程、この第２の官能基を免疫原で共有結合的に修飾する工程、および動
物が免疫応答を生じるようにこの修飾したＣＴＢタンパク質を投与する工程を、
包含する。

【００２９】本発明のさらなる実施形態は、免疫原または免疫原性複合体に対する抗体また
は細胞性応答を生成する方法であり、これは、本発明の組換えＣＴＢタンパク質
を提供する工程、このタンパク質を、第１の官能基および第２の官能基を有する
二量体架橋剤で修飾する工程であって、ここで、この第１の官能基は、この組換
えＣＴＢタンパク質と化学的に会合する、工程、第２の官能基を、エピトープと
共有結合的に修飾する工程、および免疫応答が生じるまで宿主にこのタンパク質
を投与する工程を、包含する。

【００３０】本発明のさらなる実施形態は、免疫原または免疫原性複合体に対する抗体また
は細胞性応答を生成する方法であり、これは、本発明の組換えＣＴＢタンパク質
を提供する工程、このタンパク質を、プレニル化によって疎水的に修飾するか、
または両親媒性側鎖基に対するＣＴＢ部位特異的様式での共有結合によって修飾
する工程、任意の脂質またはリン脂質ミセル処方物を含む免疫原性複合体と混合
する工程、および免疫応答が生じるまで宿主にこのＣＴＢ−免疫原を投与する工
程を、包含する。

【００３１】本発明のさらなる実施形態は、ＭＳ−０ベクターおよび配列番号１を含む、ｒ
ＣＴＢ発現ベクターである。このベクターは、ｐＭＬ−ＣＴＢｔａｃ１である。

【００３２】本発明のさらなる実施形態は、免疫原に対する免疫応答を生成するための方法
であり、この方法は、組換えＡＢ₅毒素Ｂタンパク質を提供する工程、この毒素
Ｂタンパク質をプレニル化する工程、このプレニル化した毒素Ｂタンパク質を免
疫原と混合し、疎水的に結合したタンパク質を生成する工程、および抗体または
細胞性応答を生じるようにこのタンパク質を動物に投与する工程を、包含する。
１つの実施形態において、ＡＢ₅毒素Ｂタンパク質は、コレラ毒素Ｂタンパク質
（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型
Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質、志賀様毒
素Ｂタンパク質、または百日咳毒素Ｂタンパク質であり得る。好ましくは、ＡＢ ₅ 毒素Ｂタンパク質は、コレラ毒素Ｂタンパク質（ＣＴＢ）である。

【００３３】本発明のさらなる実施形態は、野生型ｒＢタンパク質と比較して、修飾部位の
数が増加した組換えＡＢ₅毒素Ｂ（ｒＢ）タンパク質をコードする、ｒＢサブユ
ニット遺伝子を作製する方法である。この方法は、Ｂタンパク質をコードするＢ
サブユニット遺伝子を提供する工程、このＢタンパク質の共有結合的修飾に関与
しないアミノ酸残基をコードするコドンを選択する工程、およびこのコドンを変
異させる工程であって、その結果、この得られたｒＢタンパク質が、増強された
修飾能力を有する、工程、を包含する。

【００３４】本発明のさらなる実施形態は、野生型Ｂタンパク質と比較して、変更された化
学修飾能力を有する組換えＡＢ₅毒素Ｂ（ｒＢ）タンパク質をコードする、ｒＢ
サブユニット遺伝子を作製する方法である。この方法は、Ｂタンパク質をコード
する毒素Ｂ（Ｂ）サブユニット遺伝子を提供する工程、このＢタンパク質の共有
結合修飾を受けやすいアミノ酸残基をコードするコドンを選択する工程、このコ
ドンを変異させる工程であって、その結果、この得られたｒＢタンパク質が、そ
の部位で増強された化学修飾能力を有する、工程；このＢタンパク質の共有結合
的修飾を受けやすいアミノ酸残基をコードするコドンを選択する工程；およびこ
のコドンを変異させる工程であって、その結果、この得られたアミノ酸は、その
部位で化学修飾を受けにくい、工程、を包含する。１つの実施形態において、ｒ
Ｂタンパク質は、コレラ毒素Ｂタンパク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素
Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタン
パク質、志賀毒素Ｂタンパク質、志賀様毒素Ｂタンパク質、または百日咳毒素Ｂ
タンパク質であり得る。好ましい実施形態において、ｒＢタンパク質は、コレラ
毒素Ｂタンパク質（ＣＴＢ）である。有利には、変異としては、リジン、ヒスチ
ジン、アルギニンまたはシステイン残基の、任意の他のアミノ酸残基への変化が
挙げられる。さらなる実施形態において、変異としては、任意のアミノ酸の、リ
ジン、ヒスチジン、アルギニンまたはシステインへの変化が挙げられる。

【００３５】本発明のさらなる実施形態は、プロモーター、ＡＢ₅毒素ガングリオシド結合
サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡ、および免疫原性ペプチドコード配
列を含む、遺伝子融合ベクターであり、ここで、このＡＢ₅毒素ガングリオシド
結合タンパク質サブユニットおよび免疫原性ペプチドコード配列は、適切な読み
枠で作動可能に連結されており、これによって、遺伝子融合タンパク質が生じ；
そしてこの遺伝子融合タンパク質は、封入体内または培地内に発現および分泌さ
れる。

【００３６】（好ましい実施形態の詳細な説明）本発明は、増強した結合特性を保有する変異体タンパク質を産生するように、
ＡＢ₅毒素のファミリー由来のＢサブユニット（本明細書中で以後、ＡＢ₅Ｂサブ
ユニットタンパク質）の核酸配列全体に、アミノ酸の付加もしくは欠失のような
、変異を挿入することを意図する。用語「増強した結合特性」とは、薬物、免疫
原、サイトカインもしくは他の生物活性化合物に化学的手段または他の手段によ
り、結合した化合物が増加した生物活性を有するように結合され得る、ＡＢ₅Ｂ
サブユニットをいう。詳細には、ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質における増強
した結合特性は、結合プロセスの結果として立体障害または不適切な四次構造の
形成を減少するように設計される、本明細書中に教示される変異から生じる。こ
のようにして、これらの変異は、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質および
それらから構成される結合体上のリガンド結合部位の利用可能性を最大にする。
このような変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質を使用する１つの利益は、結
合後の生物活性構造の収量を改善することである。

【００３７】本発明は、その配列全体に、互いに結合される分子の新規な推定可能な空間的
方向を生じる単一もしくは複数の、アミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む、
ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質の変異体を記載する。本発明はさらに、生じる
結合体の生物活性を増強する、増強した結合特性もしくは変化した結合特性を有
する、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットサブユニットをさらに意図する。免疫原もし
くは他の生物活性化合物に結合したこのような変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタン
パク質は、その変異体タンパク質結合体が投与される被験体におけるその化合物
の活性を増強するように作用する。

【００３８】ＡＢ₅毒素は、単一の触媒的に活性なＡサブユニットとＢサブユニットの五量
体とを含む、六量体センブリーからなる。これらの毒素のＢ五量体は、そのＡサ
ブユニットの非存在下でさえ、標的細胞の認識および結合をすることができる。
この毒素五量体は、サッカライドに（細胞膜におけるガングリオシドのオリゴサ
ッカライド部分かまたは細胞表面のグリコシル化タンパク質のいずれかに）結合
する。ＡＢ₅毒素のクラスは、配列相同性および触媒活性に基づいて、ファミリ
ーへの部分分割され得る。１つのファミリーであるコレラ毒素（ＣＴ）ファミリ
ーは、ＣＴ自体に加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンＬＴおよびＬＴ
−ＩＩ、ならびにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒＪｅｊｕｎｉ由来の十分には特
徴付けられていない毒素を含む。別のファミリーである志賀毒素ファミリーは、
Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来の多数の毒素およびＥ．ｃｏｌ
ｉ由来の志賀様毒素（ベロ毒素としても公知）を含む。他のＡＢ₅毒素としては
、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳毒素および真核生物毒素リシンが挙げら
れる。

【００３９】ＡＢ₅毒素ＬＴＢは、このファミリーのタンパク質間で１つの関係を示す。Ｌ
ＴＢは、ＣＴＢと広範な相同性を共有する。この２つの毒素は、８０％アミノ酸
同一性、類似のレセプター特異性、触媒活性、および免疫学的特性を共有する。
志賀毒素および百日咳毒素のような配列同一性がほとんどないＡＢ₅タンパク質
はなお、高い程度の構造類似性を共有する。これは、毒素レセプターからのペン
タサッカライドとの複合体中のその毒素の構造に基づいて、そして毒素−レセプ
ター結合相互作用の結晶学的に決定された詳細に基づいて、決定された（Ｍｅｒ
ｒｉｔｔｅら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ１９９５、５：１６５〜１７１を参照のこと）。従って、他
のＢ５サブユニットタンパク質はアミノ酸配列が異なり得るが、それらはなお、
匹敵する機能的特異性を有する。この型のいくつかのＢ５ホロ毒素は、ＬＴＩ
Ｉａ型およびＩＩｂ型である。さらに、志賀毒素、志賀様毒素および百日咳毒素
は、Ｂ５サブユニットの類似のレセプター特異性を共有する。さらに、ｒＣＴＢ
について本明細書中に示されるような、これらのサブユニットに対する変異は、
他の生物活性化合物に結合するがなおガングリオシド特異性を保持する能力が増
強した、送達分子を生成する。本願にて教示されるｒＣＴＢについての概念は、
Ｂ５サブユニットのすべての例に適用され得、そのいくつかが表１に示される。

【００４０】（表１：ＡＢ₅毒素配列）

【００４１】

【表１】多くの場合において、アミノ酸配列が異なるいくつかの毒素改変体が、特徴付
けられた。示される第１のＣＴＢ配列（配列番号３３）は、アミノ末端以外は、
本願において使用される配列（配列番号２）と同一である、Ｓａｎｃｈｅｚおよ
びＨｏｌｍｇｒｅｎにより公開されたオリジナルの配列である。第１のＬＴＢ配
列（配列番号１５）は、クローン化された遺伝子の配列に由来する。この表に列
挙される他の配列は、ＮＣＢＩ遺伝子バンクにて見出される、ＣＴＢまたはＬＴ
Ｎのいずれかの改変体である。この列挙は、すべての改変体を示すことを意図す
るのではなく、これらの毒素間の天然のバリエーションを示すことを意図する。

【００４２】（変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質をコードするポリヌクレオチド）本発明はまた、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質、そのフラグメントま
たは誘導体をコードする、ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。１つの
実施形態において、本発明を用いる使用のために意図されるＡＢ₅Ｂサブユニッ
トタンパク質、フラグメントまたは誘導体は、粘膜組織結合能力もしくは粘膜組
織会合能力を有する。これらの配列は、一般に、野生型ＡＢ₅Ｂサブユニットタ
ンパク質と比較して、単一もしくは複数の、アミノ酸の付加、欠失および置換を
生じる、少なくとも１つの塩基の挿入、欠失もしくは置換、またはそれらの組み
合わせを含む。

【００４３】ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、変異体サブユニットについての同
じアミノ酸配列をコードする他の任意のＤＮＡ配列が、本発明の実施において使
用され得る。これらとしては、その配列内の同じアミノ酸残基をコードする異な
るコドンの置換により変化しそれによりサイレントな変化を生じる、ＡＢ₅Ｂサ
ブユニットのコード領域のすべてもしくは部分を含むヌクレオチド配列が挙げら
れるが、これらに限定されない。（ＡＢ₅Ｂサブユニット遺伝子クローニング）ＡＢ₅Ｂサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、生物学的クローンの
「ライブラリー」によってか、化学合成によってか、ＤＮＡクローニングによっ
て、または所望の細胞型から精製されたゲノムＤＮＡのクローニングによって示
されるような、クローン化ＤＮＡの供給源からの標準的手順により得られ得る。
これらの手順を実施するために有用な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ
、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｌ（１９８９）によ
って；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．編、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉ
ｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＭＲＩＰｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ
．Ｋ．（１９８５）によって；そしてＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＪｏｈｎＷ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９８）によって、詳述されている。ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリ
ーにおいてＡＢ₅Ｂサブユニットをコードする配列を増幅するために使用され得
る。合成オリゴヌクレオチドが、標的配列の供給源として、ＲＮＡライブラリー
もしくはＤＮＡライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーを使用するＰＣＲプ
ロトコルにおいてプライマーとして使用され得る。増幅される核酸配列としては
、任意のＡＢ₅Ｂ毒素産生細菌由来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが挙げられ得
る。ＡＢ₅Ｂサブユニットのセグメントをコードするポリヌクレオチドの首尾良
い単離もしくは増幅の後、そのセグメントが、分子クローニングされそして配列
決定され得、そして完全ｃＤＮＡクローンまたはゲノムクローンを単離するため
のプローブとして使用され得る。次いで、これは、ＡＢ₅Ｂサブユニットコード
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の特徴づけ、ならびに機能分析および／ま
たは治療用途もしくは診断用途のためのＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質産物の
産生を可能にする。

【００４４】そのサブユニットのコード領域を単離することの代替策としては、公開された
配列から遺伝子配列自体を化学合成することが挙げられる。他の方法が可能であ
りそして本発明の範囲内にある。上記の方法は、Ｂ₅サブユニットの変異体が得
られ得る方法の性能を限定することは意味しない。

【００４５】同定および単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子配列の増幅のために適切な
クローニングベクターに挿入され得る。当該分野で公知の多数のベクター−宿主
系が、この目的のために使用され得る。可能なベクターとしては、プラスミドま
たは改変ウイルスが挙げられる。当然、そのベクター系は、これらの手順におい
て使用される宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターとして
は、λ誘導体のようなバクテリオファージ、あるいはｐＢＲ３２２またはｐＵＣ
プラスミド誘導体またはｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）のようなプラスミドが、挙げられる。クローニン
グベクターへの挿入は、例えば、相補性付着末端を有するクローニングベクター
へ目的のＤＮＡフラグメントを連結することによって、達成され得る。しかし、
そのＤＮＡを断片化するために使用される相補性制限部位がそのクローニングベ
クター中に存在しない場合、そのＤＮＡ分子の末端が、酵素修飾され得る。ある
いは、所望の任意の部位が、そのＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）
を連結することにより作製され得；これらの連結されるリンカーは、制限エンド
ヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の化学合成されたオリゴヌクレオチド
を含み得る。別の方法において、切断されたベクターおよび変異体サブユニット
遺伝子が、ホモポリマーテーリング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃｔａｉｌｉ
ｎｇ）によって改変され得る。組換え分子が、目的の遺伝子配列を含むベクター
のコピーが増加するように、形質転換、トランスフェクション、感染またはエレ
クトロポレーションを介して宿主細胞に導入され得る。

【００４６】別の方法において、所望の遺伝子が、「ショットガン」アプローチにおいて、
適切なクローニングベクター中への挿入後に、同定および単離され得る。所望の
遺伝子についての濃縮が、例えば、サイズ分画によって、クローニングベクター
中への挿入の前に行われ得る。

【００４７】特定の実施形態において、変異体サブユニットの遺伝子、ｃＤＮＡ、または合
成ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を用いた宿主細胞の形質転換は、その遺伝
子の複数のコピーの生成を可能にする。従って、ＡＢ₅Ｂサブユニットコードポ
リヌクレオチドが、形質転換された宿主生物を増殖させること、その形質転換体
から組換えＤＮＡ分子を単離すること、そして必要な場合、単離された組換えＤ
ＮＡから挿入された遺伝子を回収することによって、多量に得られ得る。その遺
伝子のコピーは、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質の構造および機能を研
究するために変異誘発実験において使用される。

【００４８】（変異誘発）本発明の変異体ＡＢ₅Ｂサブユニット、フラグメントおよび誘導体中に存在す
る変異は、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得る。それらの生成を
生じる操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで生じ得る。例えば、その
サブユニットのクローン化されたコード領域は、当該分野で公知の多数のストラ
テジーのいずれか（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版、、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと）によって改変され得る。そのポリ
ヌクレオチド配列は、インビトロで、制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な
部位で切断され得、その後所望ならばさらなる酵素修飾が行われ得、単離および
連結され得る。変異体サブユニットの生成において、改変された遺伝子が、その
サブユニットがコードされる遺伝子領域において翻訳終止シグナルにより中断さ
れず、同じ翻訳読取り枠内のままであることを確実にするように注意が払われる
べきである。

【００４９】さらに、そのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、コード領域
においてバリエーションを生成（例えば、アミノ酸置換）、および／あるいは翻
訳開始配列および／もしくは翻訳終止配列を生成および／または破壊、および／
あるいは新規な制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するかまたは既存の制限エン
ドヌクレアーゼ部位を破壊して、さらなるインビトロ改変を容易にするように、
インビトロもしくはインビボで変異され得る。当該分野で公知の変異誘発の任意
の技術が使用され得、そのような技術としては、化学的変異誘発、インビトロ部
位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ２５３：６５５１）、ＰＣＲベースの重複伸長（Ｈｏら、１９８９、
Ｇｅｎｅ７７：５１〜５９）、ＰＣＲベースのメガプライマー変異誘発（Ｓａ
ｒｋａｒら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８：４０４〜４０７）ま
たは同様の方法が挙げられるが、これらに限定されない。変異の存在は、二本鎖
ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認され得る。

【００５０】変異体サブユニット配列の操作はまた、タンパク質レベルで行われ得る。翻訳
の間もしくは翻訳の後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミ
ド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体
分子もしくは他の細胞リガンドへの連結によって、示差的に改変されている変異
体ＡＢ₅Ｂサブユニットが、本発明の範囲内に含まれる。多数の化学的改変のい
ずれかが、公知の技術により実行され得、そのような公知の技術としては、臭化
シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ ₄ による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；またはツニカ
マイシンの存在下での代謝合成が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５１】さらに、変異体ＡＢ₅Ｂペプチド配列または化学的アナログが、合成され得る
。例えば、所望の変異ドメインを含む変異体サブユニットの部分に対応するペプ
チドが、自動ペプチド合成機を使用して合成され得る。必要に応じて、非古典的
アミノ酸アナログもしくは古典的アミノ酸アナログが、その変異体サブユニット
配列に置換もしくは付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般
的アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−
アミノ酪酸、γーＡｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−ア
ミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリ
ン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチル
グリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、
β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸
（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸
）、および一般のアミノ酸アナログが挙げられる。さらに、このアミノ酸は、Ｄ
（右旋性）もしくはＬ（左旋性）であり得る。

【００５２】（変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットコードポリヌクレオチドの発現）ＣＴＢの変異体サブユニットまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは
他の誘導体をコードするポリヌクレオチド配列が、適切な発現ベクターに挿入さ
れ得る。本発明の状況において、適切な発現ベクターは、挿入されるタンパク質
コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む。その必要な転写シグナ
ルおよび翻訳シグナルはまた、天然のＡＢ₅ＢサブユニットのｃＤＮＡもしくは
遺伝子、および／またはそのサブユニット遺伝子に隣接するゲノム配列により供
給され得る。種々の宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するため
に利用され得る。これらとしては、確立された細菌発現系もしくは実験的細菌発
現系；組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルスもしくはアデノウイルス）
に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、組換えバキュロウイルス）に感
染した昆虫細胞系、および酵母において複製し得るベクターを含む酵母のような
微生物が、挙げられる。

【００５３】ベクターの発現エレメントは、その強さおよび特異性が変化する。利用される
宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメン
トのいずれか１つが、使用され得る。特定の実施形態において、変異体サブユニ
ットコード領域もしくは各変異体サブユニットの変異しそして機能的に活性な部
分をコードする配列が、発現される。

【００５４】ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のための以前に記載された方法のいず
れかが、適切な転写／翻訳コントロールシグナルとタンパク質コード配列とから
なるキメラ遺伝子を含む、発現ベクターを構築するために使用され得る。これら
の方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡ合成技術が挙げられる。変異体Ａ
Ｂ₅Ｂサブユニットもしくはそのペプチドフラグメントをコードするポリヌクレ
オチド配列の発現が、その変異体サブユニットもしくはペプチドが組換えＤＮＡ
分子で形質転換した宿主において発現されるように、第２のポリペプチド配列に
より調節され得る。例えば、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットもしくはそのペプチド
フラグメントの発現が、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエ
レメントにより制御され得る。使用され得るプロモーターとしては、ＳＶ４０初
期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａ
ｔｕｒｅ２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に
含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８
７〜７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９
８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜
１４４５）およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１
９８２、Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９〜４２）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。

【００５５】特定の実施形態において、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットのコード領域に作動可
能に連結したプロモーター、および１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質
耐性遺伝子）を含むベクターが、使用される。

【００５６】挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を
改変および保有する宿主細胞株が、選択され得る。特定のプロモーターからの発
現が、特定の誘導物質の存在下で上昇され得る。このように、遺伝子操作された
変異体サブユニットの発現が、制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳
および翻訳後のプロセシングおよび改変（例えば、タンパク質のグリコシル化、
リン酸化）について特徴的かつ特定の機構を有する。適切な細胞株もしくは宿主
系は、発現される外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にする
ように、選択され得る。哺乳動物細胞における発現が、異種タンパク質の「天然
の」グリコシル化を確実にするために使用され得る。さらに、異なるベクター／
宿主発現系が、異なる程度プロセシング反応をもたらし得る。

【００５７】一旦、変異体サブユニット遺伝子配列を発現する組換え宿主細胞が同定される
と、その遺伝子産物が精製および分析され得る。その分析は、その産物の物理的
特性もしくは機能的特性に基づくアッセイにより達成され、そのようなアッセイ
としては、その産物の放射性標識、その後のゲル電気泳動、イムノアッセイまた
はその変異体サブユニットの生物学的活性を検出するために有用な他の技術によ
る分析が挙げられる。

【００５８】（変異体サブユニットおよびそのアナログに対する抗体の産生）本発明によると、単独または免疫原性異分子またはいくつかの他の目的のタン
パク質に結合した変異体ＡＢ₅Ｂサブユニット、そのフラグメントまたは他の誘
導体は、このような免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原
として使用され得る。このような抗体として、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブ
ラリが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、変異体
ＡＢ₅Ｂサブユニット（例えば、ＣＴＢ）に対する抗体が産生される。別の実施
形態において、変異体サブユニットのドメインに対する抗体が産生される。別の
実施形態において、免疫原に対する抗体が産生される。

【００５９】当該分野で公知の様々な手順が、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニット、そのフラグメ
ントまたは他の誘導体に対して指向されるポリクローナル抗体の産生のために使
用され得る。抗体の産生のために、様々な宿主動物が、本明細書中に記載される
方法を用いて産生された変異体サブユニットを注射することによって免疫化され
得る。適切な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラット、他の動物、ならびに
ニワトリのようなトリが挙げられる。様々なアジュバントが、宿主種に依存して
、免疫学的応答を増加させるために使用され得、これには、フロイトアジュバン
ト（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面
活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、
カプリル酸グリセリド、ペプチド、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル
、油および水エマルジョン、リポソーム、ポリ−Ｌ−ラクチドｃｏ−グリコリド
（ＰＬＧ）マイクロスフェア、タンパク質キャリア（例えば、キーホールリンペ
ットヘモシアニン）、またはジフテリア毒素変異体、ジニトロフェノール、およ
び潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅＣａｌ
ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、およびコリネバクテリウムパルヴムが挙げられる
が、これらに限定されない。

【００６０】変異体ＡＢ₅Ｂサブユニット、そのフラグメントまたは他の誘導体に対して指
向されたモノクローナル抗体を調製するために、培養物中の連続した細胞株によ
り抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７）
によって本来開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢ
Ｖ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌ
ｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁）。本発明のさらなる実施形態において、モノ
クローナル抗体は、最近の技術（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）を使用して無
菌動物において産生され得る。ヒト抗体が使用され得、そしてヒトハイブリドー
マ（Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８０：２０２６〜２０３０）を使用することによって、またはヒトＢ細胞を
ＥＢＶウイルスでインビトロにおいて形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐ
ｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ、７７〜９６頁）することによって得られ得る。実
際に、エピトープに対して特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物
学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによ
る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９
８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１〜
６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４〜
６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２〜４５４）
が使用され得る。これらの技術の抗体産物は、本発明の範囲内である。

【００６１】本発明によると、単鎖抗体を産生するための記載される技術（米国特許第４，
９４６，７７８号）は、ＡＢ₅Ｂサブユニット、そのフラグメントまたは誘導体
に対する特異的単鎖抗体を産生するように適合され得る。本発明のさらなる実施
形態は、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容
易な同定を可能にするため、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のための記載される技
術（Ｈｕｓｅら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１）を
使用する。

【００６２】この分子のイデオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術によって生成
され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメ
ント（これは抗体分子のペプシン消化によって産生され得る）、Ｆａｂ’フラグ
メント（これはＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元すること
によって生成され得る）、Ｆａｂフラグメント（これは抗体分子をパパインおよ
び還元剤で処理することによって生成され得る）、およびＦｖフラグメントが挙
げられるが、これらに限定されない。

【００６３】抗体の産生において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野で公
知の標準的な技術を使用して達成され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫
吸着アッセイ）は、適切なスクリーニング技術である。例えば、変異体サブユニ
ットの特定のドメインを認識する抗体を選択するために、ハイブリドーマをこの
ようなドメインを含む変異体サブユニットのフラグメントに結合する産物につい
アッセイし得る。変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットに特異的に結合するが、野生型タ
ンパク質には特異的に結合しない抗体を選択するために、変異体へのポジティブ
な結合および野生型タンパク質への結合の欠如を基準に選択し得る。変異体ＡＢ ₅ Ｂサブユニットまたはそのフラグメントのドメインに対して特異的な抗体はま
た、本発明によって提供される。

【００６４】前記の抗体は、本発明の変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットの局在化および活性に関
連する分野で公知の方法で使用され得る。これらの方法は、タンパク質を標識す
る工程、適切な生理学的サンプル中のそれらのレベルを診断的方法で測定する工
程を包含し得る。

【００６５】（変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットの構造分析および機能分析）変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットの構造および機能を分析するため、および前記の
インビトロ活性およびインビボの生物学的機能を分析するための方法が、本明細
書中に記載される。

【００６６】一旦変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットが同定されると、これは標準的な方法（クロ
マトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差
的溶解度、またはタンパク質を精製するために有用な任意の他の標準的技術を含
む）で単離および精製され得る。タンパク質の機能特性は、任意の適切なアッセ
イ（免疫学的アッセイ、免疫化学的アッセイ、生化学的アッセイおよび生物学的
アッセイを含む）を使用して評価され得る。

【００６７】あるいは、一旦、組換え宿主細胞によって産生される変異体ＡＢ₅Ｂサブユニ
ットが同定されると、このサブユニットのアミノ酸配列は、タンパク質の配列決
定のための標準的な技術（自動アミノ酸配列決定装置の使用を含む）を使用して
決定され得る。

【００６８】変異体ＡＢ₅Ｂサブユニット、その誘導体およびフラグメントの機能的活性は
、当該分野で公知の様々な方法によってアッセイされ得る。例えば、変異体ＡＢ ₅ Ｂサブユニットまたはそのフラグメントが、対応する野生型ＡＢ₅Ｂサブユニッ
トに結合するかまたはこれと競合する能力についてアッセイされる。あるいは、
ＡＢ₅Ｂサブユニットが抗体結合についてアッセイされる場合、当該分野で公知
の様々な免疫アッセイが使用され得る。これらの免疫アッセイとしては、放射免
疫アッセイのような技術を使用する競合アッセイシステムおよび非競合アッセイ
システム、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、
ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コ
ロイド状の金、酵素または放射性同位体標識を使用する）、ウエスタンブロッド
、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、
補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気
泳動アッセイが挙げられる。抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによ
って検出され得る。あるいは、一次抗体は、特に二次抗体が標識されている場合
、二次抗体またはその試薬の一次抗体への結合を検出することによって検出され
得る。

【００６９】当業者は、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットの結合親和性をその標的リガンドにつ
いて測定するために上記の様々なアッセイを使用し得る。変異体ＡＢ₅Ｂサブユ
ニットに対する結合親和性は、１、２、３、４、または５のオーダーの大きさだ
け減少され得る。変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質は、変異体タンパク質
の結合親和性がインビボでの変異体タンパク質結合体の送達を排除しない限り、
受容可能なままである。野生型ＣＴＢのＧｍ−１に対する結合親和性は、ＢＩＡ
ｃｏｒ分析により決定したところ、約４．６×１０^-12と算出された（Ｄｕｚｉ
ｅｍｄｏら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６３７５〜６３８４）。変化し
た修飾特性を有するＣＴＢの変異体は、ＧＭ−１に対する減少した結合親和性を
示し得るが、野生型の親和性はあまりに強いため、変異後の親和性の有意な減少
は変異体タンパク質結合体のインビボ送達を減少し得ない。従って、約１０^-12
、１０^-11、１０^-10、１０^-9、１０^-8、１０^-7の結合親和性を有する変異体ＣＴ
Ｂタンパク質が、受容可能と考えられる。（ワクチンとしての変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質）変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質は、ワクチンとして使用され得る。こ
のように使用される場合、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットは、選択された免疫原に
結合され得る。本明細書中で記載される変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質
は、免疫化された被験体から最適な保護粘膜免疫応答および全身免疫応答を誘発
し得るワクチンを産生するような所望の重量比で組み合わせられる。一実施形態
において、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットおよび免疫原成分は、キャリア成分の割
合が免疫原の割合を超えるような割合、例えば、約５００，０００：１の分子量
比で混合される。本発明の別の実施形態において、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニット
および免疫原成分は、約１００，０００：１の分子量比で混合される。さらに別
の実施形態において、変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットおよび免疫原は、約１０００
：１、または１００：１、または１０：１の分子量比で混合される。そしてさら
に別の実施形態において、この分子量比は、１：１の比であり得る。あるいは、
ワクチンの成分はまた、キャリア成分の割合が免疫原の割合未満になるような比
で合わせられ得る。例えば、本明細書中で記載される変異体ｒＣｔＢに結合した
小分子またはペプチドは、５、１０またはそれ以上の免疫原性分子に対して１の
ｒＣｔＢホモ五量体の割合で結合され得る。

【００７０】（変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットと共に使用するための架橋試薬）様々な架橋手順および生体活性化合物（例えば、免疫原およびワクチン）を変
異体ＡＢ₅Ｂサブユニットに結合するために利用可能な試薬がある。架橋手順は
、一般的に、アミノ酸側鎖を修飾する二官能性試薬を用いる。典型的な修飾され
たアミノ酸としては、システイン、リジン、およびヒスタミンが挙げられるが、
本発明と共に使用するための任意の修飾可能なアミノ酸が企図される。二官能性
試薬は、しばしば、（ｉ）化学的特異性；（ｉｉ）形成された架橋の長さ；（ｉ
ｉｉ）化合物がホモ二官能性化合物であるかまたはヘテロ二官能性化合物である
か；（ｉｖ）基が化学的反応性であるかまたは光化学的反応性であるか；および
（ｖ）試薬が切断可能な結合を含むか否か、に基づいて分類される。

【００７１】しばしば、架橋試薬は、アミノ酸のアミノ基またはスルフヒドリル含有側鎖（
例えば、リジンまたはシステイン側鎖）と反応性である。架橋試薬の選択は、架
橋されるリガンドおよび標的ＡＢ₅Ｂサブユニットの両方における標的アミノ酸
に基づく。本発明と共に使用するための架橋試薬は、標的アミノ酸残基を修飾し
、選択した免疫原と免疫原性産物を産生する変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットとの間
に架橋を生成し、そして変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットのリガンド結合親和性を実
質的に減少しない。リジン残基およびシステイン残基についての架橋技術の一例
を実施例５に示す。

【００７２】多数の試薬が、タンパク質を架橋するために利用可能である。適切な架橋試薬
の例としては、切断可能な架橋試薬および切断不可能な架橋試薬が挙げられる。
リジン側鎖のような１級アミンと主に反応するいくつかの適切な切断可能架橋試
薬としては、以下が挙げられる：ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイ
ミデート（ＤＴＢＰ）、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）、Ｎ−スクリンイミジ
ル−（４−アジドフェニル）−１，３−ジチオプロピオネート（ＳＡＤＰ）、エ
チル−４−アジドフェニル−１，４−ジチオブチルイミジエート（ｄｉｔｈｉｏ
ｂｕｔｙｒｉｍｉｄｉａｔｅ）（ＥＡＤＢ）、１−［ｎ−２−ヒドロキシ−５−
アジドベンゾイル）−２−アミノエチル］−４−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル）−スクシネート（ＨＡＨＳ）、およびＮ−［４−ｐ−アジドフェニルアゾ
）ベンゾイル］−３−アミノプロピル−Ｎ’−オキシスルホスクシンイミドエス
テル。１級アミンに対して特異的な適切な切断不可能な架橋剤は、スクシンイミ
ジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）である。システイン側鎖に対して特異的な適切な切断可能架橋
試薬の例としては、以下が挙げられる：Ｎ−（４−アジドフェニル）フタルイミ
ド（ＡＰＴＰ）、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（
２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（４−
アジドベンゾイル）シスチン（ＡＢＣ）２、およびＮ−（４−アジドベンゾイル
グリシル）−Ｓ−（２−チオピリジル）システイン（ＡＧＴＣ）。

【００７３】変異体ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質との架橋は、アルデヒドを用いて誘導
され得る。例えば、適切なアルデヒドとしては、グルタルアルデヒド、ホルムア
ルデヒド、グリセルアルデヒド、アセトアルデヒド、フェニルアルデヒド、バレ
ルアルデヒド、または３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドが挙げら
れる。本発明の別の局面において、ワクチン成分を改変および架橋するためにケ
トンが使用され得る。適切なケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン、
３−ペンタノン、または当業者に公知の任意の他のケトンが挙げられる。他の架
橋剤または結合剤の使用もまた企図され、これにはＮ−スクシンイミジル３−［
２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）、紫外線架橋および他の当該
分野で公知のタンパク質架橋方法が挙げられる。

【００７４】（ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質の変異体）（三次元構造分析）ガングリオシドレセプターまたはＡＢ₅毒素の毒素活性のいずれかに関与する
成分残基を理解するために、多数の変異分析研究が行われている。ＬＴのＡサブ
ユニットに対する変異は、アジュバントの活性を維持しつつ、毒性を排除するこ
とが試みている。ＣＴおよびＬＴの毒性は、Ｂサブユニットを介する細胞への毒
素の結合、およびＡ２サブユニットからの切断による毒性Ａ１サブユニットの活
性化を必要とする。Ａサブユニットの変異は、Ａ２サブユニットからの毒性Ａ１
の切断を防止するか、またはＡ１酵素的部位の活性残基を変化させる。残基Ａ７
、Ｓ６１、Ｑ１１２、Ｇ１１８、Ａ１４６、またはＡ１９２で変化された多数の
ＬＴＡの変異は、毒素活性の損失と一致するアジュバント活性を保持することが
主張されている（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ１６：２４８〜
２５４）。しかし、これらの変異体の多くのアジュバント活性は、ｒＬＴＢの添
加によって増大される（Ｖｅｒｗｅｉｊら、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ１６：
２０６９〜２０７６）。

【００７５】ＡＢ₅毒素のＢサブユニットのガングリオシド結合部位に対する変異は、タン
パク質のガングリオシド親和性特性に悪影響を与え得る。実際、ＣＴＢサブユニ
ット残基に対するいくつかの変異は、レセプター結合に影響する。例えば、変異
Ｇ３３Ｄは、ガングリオシド親和性を排除し、さらにポリグリコシルセラミド親
和性を保持するようである（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、１９９７ＭｏｌＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ２４：４８９〜４９７）、驚くべきことに、Ｇ３３Ｒ変異は、ガ
ングリオシド親和性を保持する（Ｍｅｒｒｉｔｔら、１９９５、Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ３：５６１〜５７０）。

【００７６】交互置換は、ＣＴＢの４級構造に対して驚くべき効果を有し得る。例えば、Ｇ
３５Ｄ置換は、ホモ五量体形成を軽減する（Ｍｅｒｒｉｔｔら、１９９５、Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ３：５６１〜５７０）。さらに、１０〜１４の間のＣＴＢ残基
、特にＨ１３のＣＴＢのガングリオシドレセプターに対する親和性は、五量体−
五量体形成を導くことが示唆されている（Ｍｅｒｒｉｔｔら、１９９５、Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ３：５６１〜５７０）。Ｈｉｓ１３はまた、ｒＣＴＢのＺｎ⁺² に対する親和性に密接にしている（Ｄｅｒｔｚｂａｕｔｈら、１９９８Ｐｒｏ
ｔＥｎｇ１１：５７７〜５８１）。対照的に、５５〜６４位についてのいく
つかの新規なペプチド配列の置換は、ガングリオシド親和性に影響を与えない（
Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、１９９５、Ｇｅｎｅ１６５：１６３〜１７１）。

【００７７】別の例において、Ｔ１３およびＴ１４位におけるＬＴ−ＩＩａエンテロトキシ
ンのＢサブユニットの部位特異的突然変異は、ＧＤ１ａガングリオシド親和性を
有意に減少させた。同様に、Ｔ１３、Ｔ１４、さらにＴ３４におけるＬＴ−ＩＩ
ｂの変異誘発は、リガンド親和性を減少させた。興味深いことに、これらの部位
におけるセリン置換のみが、リガンド親和性の保持を可能にした（Ｃｏｎｎｅｌ
ｌおよびＨｏｌｍｅｓ、１９９５．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１６：２１〜
３１）。従って、リガンド親和性に関与することが知られている残基の変異は、
活性が損失することなくなお達成され得る。逆に、リガンド親和性に関与するこ
とが知られていない残基の変異（挿入、欠失、置換）は、レセプター活性に影響
し得る。従って、部位指向性変異分析は、部位毎の基準で行われる。

【００７８】ガングリオシドレセプターまたはＡＢ₅毒素の毒素活性のいずれかに関与する
成分残基を理解するために、多数の変異分析研究が行われている。ＬＴのＡサブ
ユニットに対する変異は、アジュバント活性を維持しつつ、毒性を排除するよう
試みる。ＣＴおよびＬＴの毒性は、Ｂサブユニットを介する細胞への毒素の結合
、およびＡ２サブユニットからの切断による毒性Ａ１サブユニットの活性化を必
要とする。Ａサブユニットに対する変異は、Ａ２サブユニットからの毒性Ａ１の
切断を防止するか、またはＡ１酵素的部位の活性残基を変化させる。残基Ａ７、
Ｓ６１、Ｑ１１２、Ｇ１１８、Ａ１４６、またはＡ１９２において変化された多
数のＬＴＡの変異は、毒素活性の損失と一致するアジュバント活性を保持するこ
とが主張されている（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ１６：２４
８〜２５４）。これらの変異体の多くのアジュバント活性は、ｒＬＴＢの添加に
よって増大される（Ｖｅｒｗｅｉｊら、１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ１６：２０
６９〜２０７６）。

【００７９】ＡＢ₅毒素のＢサブユニットのガングリオシド結合部位に対する変異は、ガン
グリオシド親和性特特有のＣＴＢに悪影響を与え得る。ＣＴＢサブユニット残基
に対するいくつかの変異は、レセプター結合に影響する。例えば、変異Ｇ３３Ｄ
は、ガングリオシド親和性を排除して、さらにポリグリコシルセラミド親和性を
保持するようである（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、１９９７ＭｏｌＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ２４：４８９〜４９７）。驚くべきことに、Ｇ３３Ｒ変異は、ガングリ
オシド親和性を保持する（Ｍｅｒｒｉｔｔら、１９９５、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
３：５６１〜５７０）。交互置換は、ＣＴＢの４級構造に対して驚くべき効果を
有し得る。例えば、Ｇ３５Ｄ置換は、ホモ五量体形成を軽減する（Ｍｅｒｒｉｔ
ｔら、１９９５、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３：５６１〜５７０）。さらに、１０〜
１４の間のＣＴＢ残基、特にＨ１３のＣＴＢのガングリオシド結合部位に対する
親和性は、五量体−五量体形成を導くことが示唆されている（Ｍｅｒｒｉｔｔら
、１９９５、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３：５６１〜５７０）。Ｈｉｓ１３はまた
、ｒＣＴＢのＺｎ⁺²に対する親和性に密接にしている（Ｄｅｒｔｚｂａｕｔｈら
、１９９８ＰｒｏｔＥｎｇ１１：５７７〜５８１）。対照的に、５５〜６
４位についてのいくつかの新規なペプチド配列の置換は、ガングリオシド親和性
に影響を与えない（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、１９９５、Ｇｅｎｅ１６５：１６
３〜１７１）。

【００８０】（ＣＴＢの構造特徴）アミノ酸２〜７は、ｒＣＴＢの外表面上にループを形成する。残基Ｇｌｎ３
、Ａｓｎ４、Ｔｈｒ６、およびＡｓｎ７は全て、その分子から外に直面する
極性側鎖を保有する。これらの側鎖は、別のアミノ酸で置換されて、化学的に修
飾可能なアミノ酸側鎖をこの領域に導入し得る。残基１０〜１４は、ガングリオ
シドレセプター親和性を有するアミノ酸配列を形成することが報告されている。
この部位への変異（特に、Ｈ１３）は、より疎水性のｒＣＴＢを作製し得る（Ｍ
ｅｒｒｉｔｔら、１９９５、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３：５６１−５７０）。アミ
ノ酸１４〜２０は、外側へ面する多数の側鎖と共にｒＣＴＢの外部表面上にβシ
ートを形成すると考えられている。これらの間のアミノ酸は、リジン付加を受け
やすくあり得る多くの極性側鎖基（特にＨｉｓ１８）である。

【００８１】ＣＴＢの残基２１〜２５は、ｒＣＴＢの表面上に表面ループを形成する。この
ループは、Ａｓｎ２１（荷電していない極性アミン）、Ａｓｐ２２（酸性側
鎖）、およびＬｙｓ２３（塩基性アミン）を含む。各側部の基は、タンパク質
の表面から外側へ面すると考えられている。この残基の方向は、これがモノマー
の構造安定性にいくらかの役割を果たし得ることを示差する。アミノ酸残基Ｐｈ
ｅ２５もまた、その荷電していない非極性ベンジル環と共に分子表面から外側
へ面し、そしてそのタンパク質配列に修飾可能なアミノ酸を導入するために変異
され得る。残基２５〜３０は、分子表面に接近可能でないＣＴＢモノマー内のβ
プリーツシートを形成する。この部位への変異は、ｒＣＴＢの４次構造を破壊す
ることが予想され得る。残基３１〜３５は、Ｇｍ−１レセプターに関して本明細
書中に参照される。ＣＴＢの残基３６〜４０は、２５〜３０のような内部βプリ
ーツシートを形成すると考えられる。

【００８２】残基４１〜４４は、Ａｓｎ４４の隣にＬｙｓ４３を含む表面曝露されたル
ープを形成する。Ａｓｎ４４は、その位置、電荷、およびＬｙｓ４３に対す
る側鎖の類似性に起因して、リジンの良好な候補物であり得る。

【００８３】残基４５〜５５は、モノマー内にβプリーツシートを形成すると考えられてい
る。残基５５〜６４は、挿入許容部位を形成すると考えられている。この領域内
の６２位および６３位におけるリジンは、ｒＣＴＢ変異体のガングリオシド結合
親和性に対する明らかな有害な効果を伴わずに、欠失または変異され得る（Ｂａ
ｃｋｓｔｒｏｍら、１９９５、Ｇｅｎｅ１６５：１６３−１７１）。残基６０
〜７８は、ホモ五量体において内部疎水性αへリックスを形成する。この配列に
対する有意な変更（特に、残基６５〜７８に対して）は、ホモ五量体形成を妨害
することが予想され得る。

【００８４】ＣＴＢの残基７９〜８５は、ＣＴＢモノマーの表面上にループを形成する。ル
ープ内において、Ｌｙｓ８１およびＬｙｓ８４は、モノマー構造から外側に
面する。Ｌｙｓ８１および８４は、レセプターに対して反対側のその位置およ
びモノマー内の表面配置に起因して、結合体化のための最適な標的残基であるよ
うである。

【００８５】ＣＴＢの残基８６〜９５は、内在化された側鎖およびＧｍ−１との下方ループ
接触点を形成し、首尾よく産生されるＬｙｓ９１を含み、そして本明細書中で
主張される。ＣＴＢの残基９６〜１０３は、最適に位置付けられたＡｓｎ１０
３で終わる内部シートを形成する。このＡｓｎ１０３は、その類似した電荷、
構造、および分子上であることに起因して、Ｌｙｓ挿入の重要な標的である。

【００８６】上記に議論された構造分析を考慮して、多数の変異が、変更された結合体化特
性を有する変異体ＣＴＢタンパク質を生じ得ることは明らかである。いくつかの
変異体は、保存されるか、増強されるか、または少なくとも劇的には本明細書中
に記載される変異体ＣＴＢタンパク質のＧｍ−１結合親和性を減少しない。他方
で、Ｇｍ−１親和性のいくらかの損失は、Ｇｍ−１レセプターに対するコレラ毒
素Ｂの並外れて高い最初の親和性（４．６×１０^-12）の場合、許容できる。変
異体タンパク質の結合親和性は、当該分野で周知の多数のアッセイを用いて決定
され得る。

【００８７】（組換えコレラ毒素サブユニットＢ（ｒＣＴＢ）の変異体）本発明は、コレラ毒素サブユニットＢのアミノ酸配列中の１、２、３、４また
はこれより多くののアミノ酸残基の変異、置換、欠失、または挿入を考慮する。
野生型ｒＣＴＢの全長アミノ酸配列は、図１に示される（配列番号２）。

【００８８】本発明において考慮されるアミノ酸置換は、組換え産生された分子のガングリ
オシド（Ｇｍ−１）結合親和性に対する有害な効果を伴わずに、ｒＣＴＢの結合
体化特性を選択的に変更する、任意のそのような置換、欠失、または挿入を含む
。このような変異としては、以下

【００８９】

【化１】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置に現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置換され
るアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入された場合に
、共有結合的な修飾または結合体化に関する変更された特徴を有する変異体ｒＣ
ＴＢまたは改変体ｒＣＴＢを引き起こし、そしてこの部位において生物活性な化
合物へ結合された場合に、そのＧｍ−１結合活性を保持する、任意のアミノ酸残
基の欠失または置換を表す。

【００９０】（ｒＣＴＢ中のリジン置換）ｒＣＴＢの感染性疾患から誘導された免疫原への結合体化は、粘膜送達の後に
保護を誘導するワクチンを作製し得る。古典的な結合体化の化学標的は、反応性
アミノ酸側鎖基、例えば、一級アミン、カルボン酸、アルデヒドまたはスルフヒ
ドリルである。ｒＣＴＢ中の一級反応性アミノ酸は、リジンである（図３を参照
のこと）。コレラ毒素のＢサブユニットは、９個のリジンアミノ酸残基を含む。
多数のこれらの残基は、生物活性化合物のｒＣＴＢタンパク質への結合体化を容
易にする際に役割を果たすことが考えられる。これらのリジン残基は、ＣＴＢ配
列を通じて種々の位置に分布される。Ｇｍ−１結合部位の付近であるこれらのリ
ジン残基（例えば、Ｋ９１）は、ガングリオシド結合を妨げるコンフォメーショ
ンで、目的の生物活性化合物に結合し得る。さらに、生物活性化合物が結合され
る任意のリジン残基は、結合体化の際にコンフォメーション変化を誘導し得、こ
れは、ガングリオシド結合に必要とされる４次構造の形成を妨げるかまたは崩壊
する。従って、野生型形態のタンパク質と比較して増加した結合体化部位数また
は減少した結合体化部位数を有する多数の変異体ｒＣＴＢタンパク質が、本明細
書中に開示される。

【００９１】本手断は、生物活性分子がＣＴＢのガングリオシド部位を妨げないように、Ａ
Ｂ₅Ｂサブユニットキャリアと生物活性分子との共有結合的な連結を指向するこ
とを含む。部位指向型変異誘発が、ｒＣＴＢコード配列のＬｙｓ９１における変
異のパネルを作製するために使用された。この変異は、インビトロにおいて野生
型のレベルと比較可能なタンパク質レベルを産生して、粘膜免疫系に生物活性Ｃ
ＴＢ免疫原複合体を効果的に送達し得る、いくつかの変異体を生じる。

【００９２】従って、本明細書中に議論される１つの実施形態は、野生型ｒＣｔＢタンパク
質中に見出されるリジン残基を置換するアミノ酸置換を有する多数の変異体ｒＣ
ＴＢタンパク質を表現する。野生型ＣＴＢ中に存在する９個のリジン残基のうち
、本発明は、１つ以上の以下のアミノ酸置換を有する組換えＣＴＢタンパク質を
考慮し：Ｋ２３Ｘ、Ｋ３４Ｘ、Ｋ４３Ｘ、Ｋ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｋ６９Ｘ、Ｋ８
１Ｘ、Ｋ８４Ｘ、およびＫ９１Ｘ；ここで、「Ｘ」は、変異部位において結合体
化するための減少された能力を有するｒＣＴＢタンパク質をもたらす任意のアミ
ノ酸である。これらの変異はまた、野生型タンパク質または変異されていない形
態のタンパク質と比較して、実質的な程度のＧｍ−１結合親和性を保持すること
が考慮される。さらに、前述のように、Ｇｍ−１レセプターに対する野生型ＣＴ
Ｂの並外れて高い最初の親和性（４．６×１０^-12）に起因して、親和性におけ
るいくらかの損失は許容できる。

【００９３】Ｇｍ−１結合部位に対するその残基の近接が与えられると特に有害な結合体化
事象を引き起こすと考えられる多数のリジン残基が存在する。これらの残基とし
ては、Ｋ３４、Ｋ６２、Ｋ６３、およびＫ９１が挙げられる。これらの残基の変
異は、Ｇｍ−１結合親和性を妨害しない結合体化事象を好む。

【００９４】本発明はさらに、Ｋ６９における結合体化を排除するためにこの位置のリジン
残基を変異することが考慮される。リジン６９は、Ｇｍ−１結合部位から遠位で
あると考えられているが；この残基への結合体化は、ｒＣｔＢホモ五量体の自己
集合を減少し得る。不完全な４次構造フォーメーションは、Ｇｍ−１親和性を減
少し、ｒＣＴＢ結合体化分子の生物活性もまたおそらく減少することが公知であ
る。

【００９５】ＣＴＢ中の残存するリジン残基は、Ｋ２３、Ｋ４３、Ｋ８１、およびＫ８４で
ある。これらの残基の各々は、結合体化に受容可能な部位として考慮される。こ
れらの残基のうちの１つ以上が、変異されて、結合体化のための部位の総数を減
少し得る。

【００９６】ＭｃＣａｎｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９７、３６：９１６９）は、Ｌｙｓ９
１が、「小さい」（蛍光）分子プローブと反応された場合に、ＣＴＢ中の全ての
リジン残基のうち最も反応性であったことを証明した。ＣＴＢがＧｍ−ｌへ結合
される場合、Ｌｙｓ９１は、Ｇｍ−１の末端ガラクトース残基の近位に配置され
る。従って、大きな分子量の生物活性分子の結合体化は、おそらく、ｒＣＴＢの
Ｇｍ−１結合部位の立体障害を引き起こす。同様に、大きな分子量の化合物とＬ
ｙｓ６９（これは、五量体疎水性コア内に位置する）との反応は、生物活性ＣＴ
Ｂホモ五量体の再フォーメーションを疎んじる。

【００９７】Ｌｙｓ９１は、Ｇｍ−１のヒドロキシル化ガラクトースが相互作用し、Ｇｍ−
１に対するｒＣＴＢの親和性を促進し得る塩基性アミノ側鎖を保有する。従って
、Ｌｙｓ９１のノックアウトは、Ｇｍ−１に対する変異体ｒＣＴＢの親和性を有
意に減少し、組換え産生レベルに減少をもたらすことが、予想され得る。

【００９８】（ｒＣＴＢ中のリジン付加）本発明はさらに、ｒＣＴＢのアミノ酸配列を通じたアミノ酸残基の付加を考慮
し、ｒＣＴＢ内の特定の部位に対して、免疫原、免疫調節因子、薬物、または他
の生物活性分子の結合体化を指向する。ｒＣＴＢの任意の残基が変異されて、受
容可能な結合体化事象を促進するアミノ酸残基を導入し得る。これらの変異の例
としては、Ｑ３Ｘ、Ｎ４Ｘ、Ｔ６Ｘ、Ｎ７Ｘ、Ｈ１８Ｘ、Ｎ２１Ｘ、Ｆ２５Ｘ、
Ｎ４４Ｘ、Ｍ１０１Ｘ、およびＮ１０３Ｘが挙げられ、ここで、「Ｘ」は、受容
可能な結合体化部位の付加を引き起こす任意のアミノ酸である。これらの部位に
おける使用に最適なアミノ酸の特定の例としては、リジンおよびシステインが挙
げられる。従って、１つ以上の以下の変異：Ｑ３Ｋ、Ｎ４Ｋ、Ｔ６Ｋ、Ｎ７Ｋ、
Ｈ１８Ｋ、Ｎ２１Ｋ、Ｆ２５Ｋ、Ｎ４４Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｎ１０３Ｋ、Ｑ３Ｃ、
Ｎ４Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｎ７Ｃ、Ｈｌ８Ｃ、Ｎ２１Ｃ、Ｆ２５Ｃ、Ｎ４４Ｃ、Ｍ１０１
Ｃ、およびＮ１０３Ｃが、考慮される。

【００９９】（選択的化学架橋部分）特定の化学カップリングまたは部位指向型化学カップリングに対するさらなる
手段は、リジン残基よりもシステイン残基を用いる化学カップリングのための部
位を作製することである。従って、以下のシステイン挿入が作製される：Ｈ１８
ＣおよびＭ１０１Ｃ。部位指向型変異誘発は、実施例１〜２のように実行される
。実施例５は、これらの残基を目的の免疫原へ化学的にカップリングするための
技術を提供する。

【０１００】（ｒＣＴＢのＮ末端における変異）ｒＣＴＢの野生型アミノ酸配列は、図１に示される。本発明は、ｒＣＴＢアミ
ノ酸配列を通じた種々の変異を考慮する。１つの実施形態において、１つ以上の
変異が、タンパク質配列のＮ末端に導入される。例えば、１つの実施形態におい
て、アラニン残基がｒＣＴＢアミノ酸配列の１位に導入される。この特定のアミ
ノ酸の導入は、野生型形態のｒＣＴＢのアミノ末端におけるトレオニン残基と対
照的に、規定されたシグナル配列切断部位を作製する。この切断部位は、翻訳後
修飾に重要であり得る。

【０１０１】（ＮＣＢＩ登録番号によって同定されたＣＴＢファミリーの他のメンバーの変
異体）本発明において考慮されるアミノ酸置換は、組換え産生された分子のガングリ
オシド（Ｇｍ−１）結合親和性に対する有害な効果を伴わずに、ｒＣＴＢ（ＧＩ
：７５８３５１）の結合体化特性を選択的に変更する、任意のそのような置換、
欠失、または挿入を含む。このような変異としては、以下：

【０１０２】

【化２】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置に現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置換され
るアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入された場合に
、共有結合的な修飾または結合体化に関する変更された特徴を有する変異体ｒＣ
ＴＢまたは改変体ｒＣＴＢ（ＧＩ：７５８３５１）を引き起こし、そしてこの部
位において生物活性な化合物へ結合された場合に、そのＧｍ−１結合活性を保持
する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表す。

【０１０３】本発明において考慮されるアミノ酸置換は、組換え産生された分子のガングリ
オシド（Ｇｍ−１）結合親和性に対する有害な効果を伴わずに、ｒＣＴＢ（ＧＩ
：１８２７８５０）の結合体化特性を選択的に変更する、任意のそのような置換
、欠失、または挿入を含む。このような変異としては、以下：

【０１０４】

【化３】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置に現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置換され
るアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入された場合に
、共有結合的な修飾または結合体化に関する変更された特徴を有する変異体ｒＣ
ＴＢまたは改変体ｒＣＴＢ（ＧＩ：１８２７８５０）を引き起こし、そしてこの
部位において生物活性な化合物へ結合された場合に、そのＧｍ−１結合活性を保
持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表す。

【０１０５】本発明において考慮されるアミノ酸置換は、組換え産生された分子のガングリ
オシド（Ｇｍ−１）結合親和性に対する有害な効果を伴わずに、ｒＣＴＢ（ＧＩ
：８０８９００）の結合体化特性を選択的に変更する、任意のそのような置換、
欠失、または挿入を含む。このような変異としては、以下：

【０１０６】

【化４】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置に現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置換され
るアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入された場合に
、共有結合的な修飾または結合体化に関する変更された特徴を有する変異体ｒＣ
ＴＢまたは改変体ｒＣＴＢ（ＧＩ：８０８９００）を引き起こし、そしてこの部
位において生物活性な化合物へ結合された場合に、そのＧｍ−１結合活性を保持
する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表す。

【０１０７】本発明において考慮されるアミノ酸置換は、組換え産生された分子のガングリ
オシド（Ｇｍ−１）結合親和性に対する有害な効果を伴わずに、ｒＣＴＢ（ＧＩ
：２２９６１６）の結合体化特性を選択的に変更する、任意のそのような置換、
欠失、または挿入を含む。このような変異としては、以下：

【０１０８】

【化５】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置に現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置換され
るアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入された場合に
、共有結合的な修飾または結合体化に関する変更された特徴を有する変異体ｒＣ
ＴＢまたは改変体ｒＣＴＢ（ＧＩ：２２９６１６）を引き起こし、そしてこの部
位において生物活性な化合物へ結合された場合に、そのＧｍ−１結合活性を保持
する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表す。

【０１０９】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（Ｇｍ−１）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＣＴＢＧＩ：９９８
４０９の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または挿
入を包含する。このような変異として；

【０１１０】

【化６】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって変更された特徴を有する変異体または改
変体ｒＣＴＢＧＩ：９９８４０９を生じ、そしてその部位で生物活性化合物に
結合する場合、そのＧｍ−１結合活性を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失ま
たは置換を表わす。

【０１１１】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（Ｇｍ−１）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＣＴＢＧＩ：２１４
４６８５の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または
挿入を包含する。このような変異として；

【０１１２】

【化７】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＣＴＢＧＩ：２１４４６８５を生じ、そしてその部位で生物活性化合物
に結合する場合、そのＧｍ−１結合活性を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失
または置換を表わす。

【０１１３】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（Ｇｍ−１）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＣＴＢＧＩ：１４２
１５１１の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または
挿入を包含する。このような変異として；

【０１１４】

【化８】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＣＴＢＧＩ：１４２１５１１を生じ、そしてその部位で生物活性化合物
に結合する場合、そのＧｍ−１結合活性を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失
または置換を表わす。

【０１１５】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（Ｇｍ−１）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＣＴＢＧＩ：４８８
９０（クラシック（ｃｌａｓｓｉｃ）５６９Ｂ）の結合体化特性を選択的に変え
る任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として
；

【０１１６】

【化９】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＣＴＢＧＩ：４８８９０（クラシック（ｃｌａｓｓｉｃ）５６９Ｂ）を
生じ、そしてその部位で生物活性化合物に結合する場合、そのＧｍ−１結合活性
を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１１７】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（Ｇｍ−１）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＣＴＢＧＩ：２７８
１１２１（Ｏｇａｗａ４１）の結合体化特性を選択的に変える任意のこのよう
な置換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１１８】

【化１０】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＣＴＢＧＩ：２７８１１２１（Ｏｇａｗａ４１）を生じ、そしてその
部位で生物活性化合物に結合する場合、そのＧｍ−１結合活性を維持する、任意
のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１１９】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（Ｇｍ−１）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＣＴＢＧＩ：１４２
１５２５（Ｏｇａｗａ４１Ｒ３５Ｄ）の結合体化特性を選択的に変える任意
のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１２０】

【化１１】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＣＴＢＧＩ：１４２１５２５（Ｏｇａｗａ４１Ｒ３５Ｄ）を生じ、
そしてその部位で生物活性化合物に結合する場合、そのＧｍ−１結合活性を維持
する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１２１】（ＮＣＢＩ登録番号で同定されたＬＴＢおよびＬＴＢファミリーメンバーの変
異体）本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シドおよびグリコスフィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴ
ＢＧＩ：３０６２９００の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置
換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１２２】

【化１２】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：３０６２９００を生じ、そしてその部位で生物活性化合物
に結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を
維持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１２３】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シドおよびグリコスフィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴ
ＢＧＩ：１１６９５０５の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置
換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１２４】

【化１３】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：１１６９５０５を生じ、そしてその部位で生物活性化合物
に結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を
維持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１２５】アミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオシドおよびグリコス
フィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴＢＧＩ：１３９５
１２２の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または挿
入を包含する。このような変異として；

【０１２６】

【化１４】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：１３９５１２２を生じ、そしてその部位で生物活性化合物
に結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を
維持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１２７】アミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオシドおよびグリコス
フィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴＢＧＩ：１４５８
３３の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または挿入
を包含する。このような変異として；

【０１２８】

【化１５】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：１４５８３３を生じ、そしてその部位で生物活性化合物に
結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を維
持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１２９】アミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオシドおよびグリコス
フィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴＢＧＩ：１６４８
８６５（ＬＴ８７）の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠
失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１３０】

【化１６】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：１６４８８６５（ＬＴ８７）を生じ、そしてその部位で生
物活性化合物に結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピ
ド結合活性を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１３１】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シドおよびグリコスフィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴ
ＢＧＩ：２２３２５４の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換
、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１３２】

【化１７】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：２２３２５４を生じ、そしてその部位で生物活性化合物に
結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を維
持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１３３】アミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオシドおよびグリコス
フィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴＢＧＩ：４０８９
９６の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または挿入
を包含する。このような変異として；

【０１３４】

【化１８】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：４０８９９６を生じ、そしてその部位で生物活性化合物に
結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を維
持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１３５】本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シドおよびグリコスフィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴ
ＢＧＩ：４９４２６５の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換
、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１３６】

【化１９】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：４９４２６５を生じ、そしてその部位で生物活性化合物に
結合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を維
持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１３７】アミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオシドおよびグリコス
フィンゴリピド結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴＢＧＩ：６９６３
０の結合体化特性を選択的に変える任意のこのような置換、欠失、または挿入を
包含する。このような変異として；

【０１３８】

【化２０】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴＢＧＩ：６９６３０を生じ、そしてその部位で生物活性化合物に結
合する場合、そのガングリオシドおよびグリコスフィンゴリピド結合活性を維持
する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わす。

【０１３９】（ＬＴ−ＩＩａの変異体）本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（なかでも、ＧＤ１ｂ）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴ−ＩＩ
ａＮＣＢＩ登録番号ＧＩ：１４６６７１の結合体化特性を選択的に変える
任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１４０】

【化２１】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴ−ＩＩａを生じ、そしてその部位で生物活性化合物に結合する場合、
そのＧＤ１ｂ結合活性を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失または置換を表わ
す。

【０１４１】（ＬＴ−ＩＩｂの変異体）本発明で意図されるアミノ酸置換は、組換え的に生成された分子のガングリオ
シド（なかでも、ＧＤ１ａ）結合親和性に対して有害な効果なしにｒＬＴ−ＩＩ
ｂＮＣＢＩ登録番号ＧＩ：５７６５８４の結合体化特性を選択的に変える
任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このような変異として；

【０１４２】

【化２２】が挙げられ、ここで、最初の文字は、示された数の位置で現れるネイティブなア
ミノ酸であり、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸の代わりに置きかえ
られたアミノ酸である。「Ｘ」は、野生型アミノ酸残基の代わりに導入される場
合、共有結合修飾もしくは結合によって改変された特徴を有する変異体または改
変体ｒＬＴ−ＩＩｂを生じ、そしてその部位で生物活性化合物に結合する場合、
そのガングリオシドＧＤ１ａ結合活性を維持する、任意のアミノ酸残基の欠失ま
たは置換を表わす。

【０１４３】（志賀毒素βサブユニットの変異）本発明に意図されるアミノ酸置換は、Ｇａｌα１−−−−４Ｇａｌβ１−−−
−４Ｇｌｃおよびグロボトリオシド（ｇｌｏｂｏｔｒｉｏｓｉｄｅ）三糖類に対
する組換え的に産生された分子の炭化水素結合親和性に有害な効果なしで、志賀
毒素βサブユニットＮＣＢＩ受託番号ＧＩ：１５２７８４の特性を有する結合を
選択的に変化させる任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。この
ような変異には、以下が挙げられる：

【０１４４】

【化２３】ここで、最初の文字は、示される数の位置に現れるネイティブなアミノ酸であり
、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸を置換するアミノ酸である。「Ｘ
」は、野生型のアミノ酸残基の代わりに導入される場合、共有結合的修飾または
結合について変化した特性を有する変異（ｍｕｔａｎｔ、ｖａｒｉａｎｔ）志賀
毒素βサブユニットを生じ、そしてその部位において生物活性な化合物に結合し
た場合、その炭化水素結合活性を保持する欠失または任意のアミノ酸残基の置換
を表す。

【０１４５】（Ｅ．ｃｏｌｉ由来のベロ毒素（志賀様毒素）βサブユニットの変異）本発明に意図されるアミノ酸置換は、組換え的に産生された分子の、グロボト
リアオシルセラミド、Ｇｂ３または血液グループＰ１抗原性三糖類に対する炭水
化物結合親和性に対して有害な効果なしに、Ｅ．ｃｏｌｉＮＣＢＩ受託番号Ｇ
Ｉ：４８７７３４９からの志賀様毒素βサブユニットの特性を有する結合を選択
的に変化させる任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このよう
な変異には、以下が挙げられる：

【０１４６】

【化２４】ここで、最初の文字は、示される数の位置に現れるネイティブなアミノ酸であり
、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸を置換するアミノ酸である。「Ｘ
」は、野生型のアミノ酸残基の代わりに導入される場合、共有結合的修飾または
結合について変化した特性を有するＥ．ｃｏｌｉからの変異（ｍｕｔａｎｔ、ｖ
ａｒｉａｎｔ）志賀様毒素βサブユニットを生じ、そしてその部位において生物
活性な化合物に結合した場合、その炭化水素結合活性を保持する欠失または任意
のアミノ酸残基の置換を表す。

【０１４７】（百日咳毒素Ｂサブユニットの変異）本発明に意図されるアミノ酸置換は、組換え的に産生された分子の、ガングリ
オシド（シアログリコタンパク質）結合親和性に対して有害な効果なしに、百日
咳毒素Ｓ２サブユニットＮＣＢＩ受託番号ＧＩ：１４４０７０の特性を有する結
合を選択的に変化させる任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。
このような変異には、以下が挙げられる：

【０１４８】

【化２５】ここで、最初の文字は、示される数の位置に現れるネイティブなアミノ酸であり
、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸を置換するアミノ酸である。「Ｘ
」は、野生型のアミノ酸残基の代わりに導入される場合、共有結合的修飾または
結合について変化した特性を有する変異百日咳毒素Ｓ２サブユニットを生じ、そ
してその部位において生物活性な化合物に結合した場合、そのガングリオシド（
シアログリコタンパク質）結合活性を保持する欠失または任意のアミノ酸残基の
置換を表す。

【０１４９】アミノ酸置換は、組換え的に産生された分子の、ガングリオシド（シアログリ
コタンパク質）結合親和性に対して有害な効果なしに、百日咳毒素Ｓ３サブユニ
ットＮＣＢＩ受託番号ＧＩ：１４４０７０の特性を有する結合を選択的に変化さ
せる任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このような変異には
、以下が挙げられる：

【０１５０】

【化２６】ここで、最初の文字は、示される数の位置に現れるネイティブなアミノ酸であり
、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸を置換するアミノ酸である。「Ｘ
」は、野生型のアミノ酸残基の代わりに導入される場合、共有結合的修飾または
結合について変化した特性を有する変異百日咳毒素Ｓ３サブユニットを生じ、そ
してその部位において生物活性な化合物に結合した場合、そのガングリオシド（
シアログリコタンパク質）結合活性を保持する欠失または任意のアミノ酸残基の
置換を表す。

【０１５１】アミノ酸置換はさらに、組換え的に産生された分子の、ガングリオシド（シア
ログリコタンパク質）結合親和性に対して有害な効果なしに、百日咳毒素Ｓ４サ
ブユニットＮＣＢＩ受託番号ＧＩ：１４４０７０の特性を有する結合を選択的に
変化させる任意のこのような置換、欠失、または挿入を包含する。このような変
異には、以下が挙げられる：

【０１５２】

【化２７】ここで、最初の文字は、示される数の位置に現れるネイティブなアミノ酸であり
、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸を置換するアミノ酸である。「Ｘ
」は、野生型のアミノ酸残基の代わりに導入される場合、共有結合的修飾または
結合について変化した特性を有する変異百日咳毒素Ｓ４サブユニットを生じ、そ
してその部位において生物活性な化合物に結合した場合、そのガングリオシド（
シアログリコタンパク質）結合活性を保持する欠失または任意のアミノ酸残基の
置換を表す。

【０１５３】本発明に意図されるアミノ酸置換は、同様に、組換え的に産生された分子の、
ガングリオシド（シアログリコタンパク質）結合親和性に対して有害な効果なし
に、百日咳毒素Ｓ５サブユニットＮＣＢＩ受託番号ＧＩ：１４４０７０の特性を
有する結合を選択的に変化させる任意のこのような置換、欠失、または挿入を包
含する。このような変異には、以下が挙げられる：

【０１５４】

【化２８】ここで、最初の文字は、示される数の位置に現れるネイティブなアミノ酸であり
、そして最後の文字は、ネイティブなアミノ酸を置換するアミノ酸である。「Ｘ
」は、野生型のアミノ酸残基の代わりに導入される場合、共有結合的修飾または
結合について変化した特性を有する変異百日咳毒素Ｓ５サブユニットを生じ、そ
してその部位において生物活性な化合物に結合した場合、そのガングリオシド（
シアログリコタンパク質）結合活性を保持する欠失または任意のアミノ酸残基の
置換を表す。

【０１５５】（ｒＣＴＢ、ｒＬＴＢ、志賀、志賀様、および百日咳ファミリーにおけるリジ
ン置換）感染性疾患から誘導される免疫原に対するｒＣＴＢ、ｒＬＴＢ、志賀、志賀様
、および百日咳ファミリーのメンバーの結合は、粘膜送達に続く保護を誘導する
ワクチンを作製し得る。古典的な結合化学標的は、第１級アミン、カルボン酸、
アルデヒド、またはスルフヒドリルのような反応性アミノ酸側鎖基である。リジ
ン残基は、配列を通じて種々の場所に分布している。Ｇｍ−１結合部位の近くに
あるリジン残基は、ガングリオシド結合を妨害するコンフォメーションでリガン
ドに結合し得る。従って、本発明は、主に、ｒＣＴＢタンパク質ファミリーにお
いて見出されるリジン残基における、多くの変異結合特性を明確に表明する。

【０１５６】従って、本発明のアプローチは、キャリアおよび免疫原の共有結合を、ＣＴＢ
ファミリーのガングリオシドレセプターから離れるように方向付ける考えを包含
する。部位特異的変異原性を使用して、ｒＣＴＢファミリーのコード配列の種々
のリジンにおけるパネルの変異を作製する。これらの変異は、野生型の可変レベ
ルに匹敵するタンパク質の可変レベルをインビトロで作製し、そして生物活性な
ＣＴＢ免疫原複合体を粘膜免疫系に効果的に送達し得る変異を生じる。

【０１５７】従って、本発明は、野生型ｒＣＴＢファミリータンパク質に見出されるリジン
残基を置換するアミノ酸置換を有する多くの変異ｒＣＴＢファミリータンパク質
を明確に表明する。好ましくは、以下のアミノ酸置換は、ｒＣＴＢファミリータ
ンパク質ＧＩ：７５８３５１、８０８９００、２１４４６８５、および４８８９
０（ここで、「Ｘ」は、変異部位に結合する能力が減少したｒＣＴＢタンパク質
を生じる任意のアミノ酸である）について意図される：Ｋ４４Ｘ、Ｋ５５Ｘ、Ｋ
６４Ｘ、Ｋ８３Ｘ、Ｋ８４Ｘ、Ｋ９０Ｘ、Ｋ１０２Ｘ、Ｋ１０５Ｘ、およびＫ１
１２Ｘ。ｒＣＴＢファミリータンパク質、ＧＩ：１８２７８５０、９９８４０９
、および１４２１５１１について、好ましくはＫ３４Ｘ、Ｋ４３Ｘ、Ｋ６２Ｘ、
Ｋ６３Ｘ、Ｋ６９Ｘ、Ｋ８１Ｘ、Ｋ８４Ｘ、およびＫ９１Ｘである。ｒＣＴＢフ
ァミリータンパク質、ＧＩ：２２９６１６について、好ましくは、Ｋ４３Ｘ、Ｋ
６３Ｘ、Ｋ６９Ｘ、Ｋ８１Ｘ、Ｋ８４Ｘ、およびＫ９１Ｘである。ｒＣＴＢファ
ミリータンパク質、ＧＩ：２７８１１２１について、好ましくは、Ｋ３５Ｘ、Ｋ
４４Ｘ、Ｋ６２Ｘ、Ｋ６９Ｘ、Ｋ８１Ｘ、Ｋ８４Ｘ、およびＫ９１Ｘである。ｒ
ＣＴＢファミリータンパク質、ＧＩ：１４２１５２５について、好ましくは、Ｋ
４３Ｘ、Ｋ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｋ６９Ｘ、Ｋ８１Ｘ、Ｋ９１Ｘである。全てのｒ
ＣＴＢファミリーＢサブユニットタンパク質について、これらが９１位にリジン
を有する場合、より好ましくは、Ｋ９１Ｘである。

【０１５８】ＬＴＢおよびＬＴＢファミリータンパク質ＧＩ：３０６２９００、１１６９５
０５、１３９５１２２、１４５８３３、１６４８８６５、２２３２５４、４０８
９９６、および６９６３０について、「Ｘ」は、変異部位に結合する能力が減少
したタンパク質を生じる任意のアミノ酸であり、Ｋ４４Ｘ、Ｋ５５Ｘ、Ｋ６４Ｘ
、Ｋ８３Ｘ、Ｋ８４Ｘ、Ｋ９０Ｘ、Ｋ１０２Ｘ、およびＫｌ０５Ｘである。ＬＴ
Ｂファミリータンパク質４９４２６５について、好ましくは、Ｋ３４Ｘ、Ｋ４３
Ｘ、Ｋ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｋ６９Ｘ、Ｋ８１Ｘ、Ｋ８４Ｘ、およびＫ９１Ｘであ
る。ＬＴＢファミリータンパク質について、これらが９１位にリジンを有する場
合、より好ましくは、Ｋ９１Ｘである。

【０１５９】ＬＴ−ＩＩａタンパク質ＧＩ：１４６６７１について、「Ｘ」は、変異部位に
結合する能力が減少したタンパク質を生じる任意のアミノ酸であり、Ｋ４７Ｘ、
Ｋ４８Ｘ、Ｋ８９Ｘ、Ｋ１００Ｘ、およびＫ１０７Ｘである。

【０１６０】ＬＴ−ＩＩｂタンパク質ＧＩ：５７６５８４について、「Ｘ」は、変異部位に
結合する能力が減少したタンパク質を生じる任意のアミノ酸であり、Ｋ４８Ｘ、
Ｋ７６Ｘ、およびＫ８９Ｘである。

【０１６１】志賀毒素βサブユニットタンパク質ＧＩ：１５２７８４について、「Ｘ」は、
変異部位に結合する能力が減少したタンパク質を生じる任意のアミノ酸であり、
Ｋ４３Ｘ、Ｋ４７Ｘ、およびＫ７３Ｘである。

【０１６２】Ｅ．ｃｏｌｉ由来の志賀様毒素サブユニットＢタンパク質ＧＩ：４８７７３４
９について、「Ｘ」は、変異部位に結合する能力が減少したタンパク質を生じる
任意のアミノ酸であり、Ｋ４１Ｘ、Ｋ４５Ｘ、およびＫ７１Ｘである。

【０１６３】百日咳毒素タンパク質ＧＩ：１４４０７０について、「Ｘ」は、変異サブユニ
ットに結合する能力が減少したタンパク質を生じる任意のアミノ酸である：Ｓ２
（Ｋ９８Ｘ、Ｋ１６７Ｘ、Ｋ１７７Ｘ、Ｋ１９５Ｘ）、Ｓ３（Ｋ３８Ｘ、Ｋ１０
０Ｘ、Ｋ１２１Ｘ、Ｋ１３３Ｘ、およびＫ１９６Ｘ）、Ｓ４（Ｋ５０Ｘ、Ｋ６１
Ｘ、Ｋ７８Ｘ、Ｋ９６Ｘ、Ｋ９９Ｘ、Ｋ１２７Ｘ、Ｋ１３４ＸおよびＫ１４８Ｘ
）、Ｓ５（Ｋ４２Ｘ、Ｋ５２Ｘ、Ｋ５４Ｘ、Ｋ５６Ｘ、およびＫ１０１Ｘ）。

【０１６４】（ｒＣＴＢファミリーサブユニットにおけるリジン付加）本発明は、さらに、免疫原、免疫調節因子、または薬物のような種々の生物活
性な化合物の結合を特定の部位に方向付けるために、ｒＣＴＢファミリー、ＬＴ
Ｂファミリー、志賀毒素、志賀様毒素、および百日咳毒素のアミノ酸配列にわた
るアミノ酸残基の付加を意図する。任意の残基が、受容可能な結合事象を促進す
るアミノ酸残基を誘導するために変異され得る。

【０１６５】（ｒＣＴＢの疎水性結合）化学結合がＧｍ−１標的免疫原を産生するのに優れた方法であるが、もはや化
学結合を必要としないが、その代り、他のタンパク質または免疫原に非共有結合
的に強く結合するような様式で、ｒＣＴＢを変化させるのに非常に有利である。
例として、ｒＣＴＢがプレニル化され得る場合、五量体につき５までの疎水性イ
ソプレンテール（ｔａｉｌ）を表示する（ｄｉｓｐｌａｙ）。適切に折り畳まれ
そして集合したタンパク質において、これらのテールは、Ｇｍ−１結合表面に対
して反対方向でタンパク質の表面に存在する。通常存在するイソプレン基には、
ファルネシル、ゲラニル、ゲラニル−ゲラニルが挙げられ、他の全てのプレニル
化または疎水性改変は、同じ結果を達成すると考えられる。このように改変され
たコレラ毒素は、疎水性構造および表面についての親和性を有すると予期される
。プレニル化ｒＣＴＢは、細菌細胞壁、細胞膜、ウイルス膜コート、および他の
疎水性構造（例えば、疎水性タンパク質および疎水性リン脂質またはアジュバン
ト）に結合する。ｒＣＴＢ上のイソプレン基は、ｒＣＴＢのリガンド結合部位を
ミセルの外側表面に提示するような様式で、ｒＣＴＢを疎水性構造と非共有結合
的に会合するために、自発的に任意の脂質膜、または疎水性ミセルに挿入する。
この概念は、ｒＣＴＢとワクチン抗原との間に結合体を作製するために、または
マイクロソームまたはリポソーム送達システムにおけるガングリオシド特異性を
促進するために適用され得る。

【０１６６】プレニル化は、真核生物細胞において選択されたタンパク質（例えば、ＧＴＰ
結合タンパク質）に天然に存在する。タンパク質の翻訳後修飾は、Ｃ末端で生じ
、ＣＡＡＸ（配列番号３４）のコンセンサス配列を有し、ここで、Ｃ＝システイ
ン、Ａ＝脂肪族アミノ酸、およびＸ＝任意のアミノ酸である。イソプレニル基は
、チオエーテル連結を介してシステインに結合し、そして修飾後、システインは
、その配列の最後のアミノ酸になる。他の翻訳後修飾（例えば、脂質、脂肪酸、
およびグリコシルリン脂質を伴なうタンパク質の修飾）もまた生じ、プレニル化
と同じ目的に潜在的に役立ち得る。

【０１６７】一つの実施形態において、コレラ毒素Ｂについての遺伝子が修飾されてインビ
トロプレニル化を可能にするプレニル化シグナルを含む。これは、Ｃ末端システ
イン、Ｃ末端ＣＡＡＸボックス配列（配列番号３４）、またはインビトロまたは
インビボプレニル化を達成するのに必要かまたは十分な任意の他の配列を含み得
る。コレラ毒素Ｂ遺伝子を含むプラスミドを、発現のために適切な宿主にトラン
スフェクトする。例えば、高度な発現ｒＣＴＢベクターを使用して、変異ｒＣＴ
Ｂを細菌において発現させる。一旦、変異ｒＣＴＢが発現され、そして精製され
ると、これは、インビトロプレニル化のために基質として使用される。インビト
ロプレニル化は、適切なプレニル化酵素および基質を用いて実施される。プレニ
ル化ｒＣＴＢ産物は、必要な場合に精製され、そして所望の結合体化生成物を産
生するために使用される。あるいは、プレニル化反応が許容される場合、ｒＣＴ
Ｂのプレニル化は、結合パートナーの存在下で実施され、従って、免疫原または
ワクチンへの改変ｒＣＴＢの迅速な結合を可能にする。これは、プレニル化ｒＣ
ＴＢを安定化するかまたは産生および精製を促進するために役立ち得る。

【０１６８】代替の実施形態は、細菌細胞または真核生物細胞を同時トランスフェクトして
ｒＣＴＢおよびプレニル化に必要なタンパク質を産生する工程を包含する。この
実施形態において、それぞれの系の特別な要件についてタンパク質を構築するこ
とが必要であり得る。例えば、任意の発現系において、ｒＣＴＢとプレニル化タ
ンパク質の両方が、効率的なプレニル化のために同じ区画に標的化される必要が
あり得る。これは、細菌の細胞質、ペリプラズム、または細胞外環境、あるいは
真核生物発現系における細胞質、任意の分泌性区画または他の細胞小器官であり
得る。

【０１６９】疎水性結合、精製、およびＧｍ−１結合アッセイの確認は、緩衝液およびｐＨ
のバリエーションとともに、化学的に結合したｒＣＴＢと基本的に同じように実
施される。ワクチン接種はまた、基本的に同じ方法で実施される。

【０１７０】（ワクチン）これらの概念は、ワクチンに基づくコレラ毒素Ｂを産生するための方法として
意図されている。特に、これらのプレニル−ｒＣＴＢ構築物は、細胞全体、ウイ
ルス全体または疎水性粒子ワクチン結合体に助力する。意図されるワクチンには
、インフルエンザウイルスワクチン、全体と成分（ｓｐｌｉｔ）の両方が挙げら
れる。なぜなら、インフルエンザウイルスは、膜コートを得、従って、プレニル
−ｒＣＴＢを膜コートに結合し得るからである。ウイルス成分ワクチンは、通常
、膜コートタンパク質血球凝集素を含む。このタンパク質は、その表面上で疎水
性パッチを介してプレニル−ｒＣＴＢに結合する。別の適切なワクチンは、細胞
全体の百日咳であり、プレニル−ＣＴＢが疎水性基をＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの
外膜に挿入し得る。また、油中水乳濁液に基づくワクチンおよびリポソームに基
づくワクチンのような疎水性粒子は、この技術についての魅力的な候補である。

【０１７１】（免疫原を用いたｒＣＴＢの遺伝的融合）ｒＣＴＢ結合免疫原の産生のための別の選択は、遺伝的融合である。遺伝的融
合は、融合タンパク質を発現するためのプロモーター、コレラ毒素結合サブユニ
ットｒＣＴＢのＤＮＡ配列、および免疫原性ペプチドコード配列を含むベクター
を使用して生じる。ｒＣＴＢおよび免疫原性ペプチドコード配列は、これらが、
融合タンパク質を産生する適切な読み取り枠にあるように連結される。融合タン
パク質は、ワクチンとしての使用のために発現され、分泌され、そして精製され
る。ｒＣＴＢ融合タンパク質は、表２に示される通りである。

【０１７２】

【表２】 ^*他の抗原性配列が、Ａ８ＶＤ４を置換し得る。リンカーは、ＧＡＰＡＳ（配列
番号３４）である。^** 他の抗原性配列が、Ａ８ＶＤ４を置換し得る。リンカーは、ＰＧＳＴＲＡＡＤ
ＲＤＧＡＰＡＳ（配列番号３５）である。^*** ＨＩＶエピトープが、Ｋｐｎ１およびＭｓｃ１制限酵素部位に隣接し、他の
コード配列の、ＣＴＢへの容易な挿入を可能にする。

【０１７３】（ｒＣＴＢワクチン）粘膜表面を介して侵入する微生物は、ｒＣＴＢワクチンについての最高の標的
である。しかし、大部分の任意の型のワクチンについて使用され得る。ワクチン
の産生のためのｒＣＴＢに結合され得る疾患および抗原の例は、以下の表３に列
挙される。上で述べるように、より大きな死滅した細胞ワクチン全体またはウイ
ルスワクチン全体は、特に、疎水性結合を使用して産生され得る。選択された免
疫原にいくつかの方法でｒＣＴＢタンパク質を結合するワクチンは、粘膜表面に
標的化される任意の型の疾患に特に有用である。

【０１７４】特定のワクチンの産生は、１）抗原または免疫原を同定する工程；２）抗原ま
たは免疫原をｒＣＴＢに（化学的、疎水的、または遺伝的に）同じ方法で結合す
る工程；３）結合されたｒＣＴＢ／免疫原を単離し、そしてそれがなおＧｍ−１
に結合することを確認する工程；４）それをマウスまたは他のモデル動物に注射
することによってそれがインビボで作用することを同定する工程；および５）ヒ
トまたは他の霊長類動物において効力についてそれを試験する工程を包含する。
ワクチン標的の例は、潜在的な抗原とともに表３に示される。

【０１７５】

【表３】（自己免疫の処置および耐性の誘導におけるｒＣＴＢの使用）自己抗原特異的末梢Ｔ細胞耐性は、ＣＴＢ自己抗原結合体によって誘導される
。末梢耐性は、Ｔｈ１を下方制御することによって自己免疫疾患を抑制する。Ｃ
ＴＢ自己抗原は、動物における既存の炎症性細胞増殖を逆転しさえし得る。ＣＴ
Ｂを使用する処置について考えれられる自己免疫疾患としては、以下を含むがこ
れらに限定されない：慢性関節リウマチ、脳脊髄炎（または他のニューロン脱髄
性の疾患）、糖尿病、および女性の父性的な免疫不妊。

【０１７６】炎症性細胞増殖（ｔｈ１耐性）の逆転をＮＯＤマウスにおける糖尿病について
の自己免疫モデルにおいて示す（インスリン−ＣＴＢ結合体；Ｂｅｒｇｅｒｏｔ
ら、ＰＮＡＳ１９９７９４：４６１０−１４）。さらに、逆転は、慢性関節
リウマチ（ＨＳＰ６０，Ｈａｑｕｅら、１９９６ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２
６：２６５０−２６５６；ＩＩ型コラーゲン結合体）およびＬｅｗｉｓラットに
おける実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（Ｓｕｎら、Ｍｙｅｌｉｎｂａｓ
ｉｃｐｒｏｔｅｉｎＭＢＰ−ｐｅｐｔｉｄｅＣＴＢｃｏｎｊｕｇａｔｅ
，１９９６ＰＮＡＳ９３：７１９６−７２０１）について示されている。こ
れらの結合体は、疾患の誘導前および後に、動物に対する単回用量として供給さ
れる。

【０１７７】本発明のｒＣＴＢは、化学的に、疎水性的に、または、遺伝子的に、上記抗原
に連結され、そして、効率を試験するために動物モデルに供給される。このよう
な処置は、上記の例において効率的であるため、この処置は、本発明の有利なｒ
ＣＴＢを使用して、より効果的またはそれ以上であると考えられている。さらに
、本発明のｒＣＴＢ結合体は、作製するのが容易であり、結合体化の部位が調節
され得るので研究しやすく、そして、高率の結合体化産物をもたらし、従って、
全身的および粘膜の応答の両方を誘導する。

【０１７８】本発明のｒＣＴＢまたは他のＢサブユニットもまた、感染に対する耐性を誘導
するために使用され得る。例えば、耐性は免疫優性の抗原ＬＡＣＫを産生するＬ
ｅｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒを投与することによって誘導され得る。ＬＡＣＫ
はＣＤ４⁺Ｔ細胞優性応答を産生し、そして、会合抗原に対するｔｈ２応答を駆
動する。Ｔｈ２は、外傷の発達を容易にし、そして未解決の感染を生じる。ＬＡ
ＣＫ＋トランスジェニックマウスは、ＬＡＣＫに耐性であり、そして、感染を消
散する。ＬＡＣＫを供給された動物は耐性であり、そして感染を消散する。（Ｍ
ｃＳｏｒｌｅｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，２８：４２４−３
２）は、ＣＴＢ−ＬＡＣＫ（経鼻的に供給されるかまたは与えられる）は、ＬＡ
ＣＫに対するＴ細胞増殖性応答を下方制御し、そして、動物が疾患をより高率的
に消散する（撃退する）ことを可能にする。さらに、ライター症候群またはライ
ム疾患などの急性自己免疫の発症に関連する疾患に対する応答は、耐性化結合体
で処置され得る。

【０１７９】（実施例）（実施例１）（変異体ｒＣＴＢの発現および精製）（細菌における組換えＣＴＢの産生）発現プラスミドＭＳ−０（図２を参照のこと）を使用して、ｒＣＴＢおよび修
飾体を発現する。ｒＣＴＢ遺伝子を含むＭＳ−０を、ｐＭＬ−ＣＴＢｔａｃ１と
命名する。プラスミドｐＭＬ−ＣＴＢｔａｃ１は、比較可能なプラスミド（ＳＢ
Ｌ’ｓｐＪＳ１６２）によって産生された産物を驚いたことに５倍まで産生す
る。ＣＴＢゲノム領域の一部および全長ＣＴＢコード領域をプラスミドＭＳ−０
にクローニングすることによって、ＰＭＬ−ＣＴＢｔａｃ１を構築し、３．６６
Ｋｂ発現プラスミドを作製した。ポリリンカーにおけるＰｖｕＩＩ部位をクロー
ニング間に破壊した。プラスミドは、ｐＫＫ２２３（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩポ
リリンカーフラグメント）由来のｔａｃプロモーターを含み、そしてｇｅｎｂａ
ｎｋ登録番号Ｍ７７７４９で見出され得る。コードされたタンパク質は、Ｖ．ｃ
ｈｏｌｅｒａ株５６９Ｂ（配列番号２）由来の配列と同一である。シグナル配列
（配列番号３）はまた、ＣＴＢＶ．ｃｈｏｌｅｒａの古典的な株５６９ＢＣＴ
Ｂ遺伝子由来である。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ株５６９ＢＣＴＢ遺伝子の全長ヌク
レオチド配列を図１に示す（配列番号１）。ＬＴＢ（配列番号１５）についての
シグナル配列は、ＭＮＫＶＫＣＹＶＬＦＴＡＬＬＳＳＬＣＡＹＧであり、そして
ＬＴＢの変異体または修飾体の産生において使用され得る。

【０１８０】（ｒＣＴＢ変異体または修飾体の発現レベルの測定）目的の大量の免疫原を迅速に、容易に、そして、安価に精製することは、有利
である。従って、ワクチンの産生における使用のためのｒＣＴＢおよびｒＣＴＢ
修飾体のミリグラム量を単離する能力が、以下で議論される。

【０１８１】浸透フラスコからのｒＣＴＢおよびｒＣＴＢ修飾体の単離のプロトコールを提
示する。驚くべきことに、培養物上清の１ｍｌ当りの８００μｇのｒＣＴＢまで
が獲得可能である。１０μｇ／ｍｌを超える収率を有する多数の組換え発現系が
、非常に生産的であると考えられる。従って、極端に産生されたｒＣＴＢ変異体
の発現レベルは、野生型よりも中程度に低い。

【０１８２】試験された全タンパク質の濃度を、Ｇｍ−１ＥＬＩＳＡにおける規定の濃度
におけるｒＣＴＢの標準曲線と比較して測定する。次いで、未知のサンプルの連
続希釈について記録された値を使用してサンプル濃度を決定し、次いで、未知の
サンプルの正確な濃度を獲得するための希釈因子によって操作する。

【０１８３】Ｇｍ−１ＥＬＩＳＡの１つの制限は、野生型ｒＣＴＢ対変異体ｒＣＴＢ
の相対的な結合濃度を同定することのみである。従って、正確な濃度を、Å２８
０またはＬｏｗｒｙ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＢＣＡまたは当業者に公知の類似した
比色定量タンパク質アッセイによって確認されなければならない。

【０１８４】ｒＣＴＢ配列に対する任意の変異は、Ｇｍ−１および他のリガンドについての
レセプター結合親和性における増加または減少を生じ得る（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ
ら、１９９７ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２４：４８９−４９７；Ｍｅｒｒ
ｉｔｔら、１９９５Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３：５６１−５７０）。Ｇｍ−１に
ついての新規に作製された変異体ｒＣＴＢのレセプター親和性における有意な変
化は、Ｇｍ−１ＥＬＩＳＡにおける結合の喪失の原因となり得、そして、濃度に
おける「みかけ上の」減少を生じる。このような場合において、以下に議論され
る方法を使用して、各試験タンパク質を、同質性のために最初に精製する。これ
らのことから、クマシー染色または銀染色ポリアクリルアミドゲル電気泳動（当
該分野で周知の技術）によって、純度を実証する。各タンパク質の相対的な濃度
を、Å２８０によって決定し、そして、タンパク質濃度アッセイによって確認す
る。各タンパク質の当量濃度（ガングリオシド部分（例えば、約５０μｇ／ｍｌ
）を飽和するのに十分である）を、Ｇｍ−１ＥＬＩＳＡプレート中でインキュ
ベートする。次いで、各変異体または未標識野生型タンパク質の２倍の連続希釈
液を、野生型ＣＴＢで標識した定常濃度（単独で最大のシグナルを生成する濃度
、通常＞約１０μｇ／ｍｌ）の結合特性ペルオキシダーゼを有する溶液中でイン
キュベートする。このアッセイから、各変異体についての標準曲線を作成し得、
そして未標識の野生型（ポジティブ標準曲線コントロール）についての類似曲線
と比較し得る。ポジティブ標準曲線コントロールからの矛盾は、ｇｍ−１につい
ての変異体ｒＣＴＢの親和性における有意な変化を反映する。曲線間の差異を定
量化して親和性における定量的差異を決定し、４．６×１０^-12Ｍの野生型親和
性を仮定する。

【０１８５】（ｒＣＴＢおよびｒＣＴＢ修飾体の精製）多数のＣＴＢ精製プロトコールが入手可能であり、そして当該分野で公知であ
る。３つの精製方法を以下で議論する。

【０１８６】（ｒＣＴＢの硫酸アンモニウム沈殿）この手順は、上清における１００〜５００μｇ／ｍｌｒＣＴＢを含むバッフ
ル化（ｂａｆｆｌｅｄ）振盪フラスコ中で増殖させた培養物について十分に機能
する。５０〜２５０の間の培養物容量を、このプロトコールを使用して首尾よく
処理した。上清を、培養物の増殖および清澄後すぐに処理した。

【０１８７】手短には、ｒＣＴＢまたはｒＣＴＢの変異体を発現する細菌を、振盪フラスコ
中で増殖した。上清を１５分間、４℃で、７０００×ｇ（平均）で細胞を遠心分
離し、清澄化した。斬増濃度の硫酸アンモニウムを使用するタンパク質の賢明な
沈殿工程は、高度に精製されたｒＣＴＢ産物を生じた。従って、硫酸アンモニウ
ムを、徐々に培養物上清に添加し、室温で撹拌する間に３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ
）までの硫酸アンモニウム濃度とした。撹拌せずに１時間の沈殿させた後、サン
プルを、１５分間、４℃で、１４，０００×ｇ（平均）で遠心分離した。上清を
除去し、そして濃縮された硫酸アンモニウム溶液を添加し、攪拌中に５０％（ｖ
ｏｌ／ｖｏｌ）の濃度とした。この混合物を室温で１時間静置させた。サンプル
を再び１５分間、４℃で、１４，０００×ｇ（平均）で遠心分離した。第３の沈
殿工程を行ない、６５％（１０１ｇ／Ｌ総容量）までの濃度とした。この混合物
を再び撹拌し、そして、前のように、遠心分離前に１時間静置させた。次いで、
高度に精製されたｒＣＴＢのペレットを適切な緩衝液中で再懸濁し、例えば、イ
オン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製が所望の場合、サンプルを１０
ｍＭＮａＰＯ₄緩衝液中に提示した。次いで、このサンプルを透析チューブ（
７０００ＭＷＣＯ）に配置した。サンプルをすぐに使用しない場合、使用するま
で、４℃で１か月までの間、未透析で貯蔵し得る。透析が行なわれる場合、１リ
ットル容量の緩衝液を少なくとも１時間ごとに使用し、この緩衝液を３回交換す
る。

【０１８８】（ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによるｒＣＴＢの精製）プロトコールのこの部分が、硫酸アンモニウム沈殿したｒＣＴＢに特異的に適
用する。選り抜きのＤＥＡＥセファロースＦａｓｔＦｌｏｗゲルを製造者の指
示に従って、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｃｏｌ
ｕｍｎに充填した。１５ｍｌの十分に混合したゲルスラリーは、約１０ｍｌの総
容量を生成した。充填の流速は、少なくとも４ｍｌ／分であった。１０ｍｌのベ
ット容量を有する１．５ｃｍ（内径）および２０ｃｍ（長さ）のカラムサイズは
、硫酸アンモニウム沈殿によって処理された培養物から約３０ｍｇのｒＣＴＢを
結合した。流速アダプターをカラムと共に使用した。このカラムを１ＭＮａＣ
ｌで洗浄してカラムベッドを活性化するか、または、２ＭＮａＣｌで、使用さ
れたカラムベッドを再生する。全ての洗浄についての流速は、充填速度の７５％
（すなわち、３ｍｌ／分）を超えなかった。カラムを緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を使用して過剰に平衡化して、全ての塩を除去
した。ｒＣＴＢを含むサンプルを、１〜１．５ｍｌ／分の速度で適用した。各画
分をｒＣＴＢの存在について試験した。サンプル適用後、Å２８０の吸光度が、
０．０２未満に低下するまで、３ｍｌ／分の流速で、カラムを緩衝液Ａを用いて
洗浄し、全ての非特異的および陽イオン種の除去を確かめる。カラムを、Å２８
０の吸光度が、０．０２未満に低下するまで、５０ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液
Ａを使用して洗浄した。ＲＣＴＢを１００ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａを使用
してカラムから溶出した。全ての画分を回収し、そしてプールした。総カラムの
結合したｒＣＴＢの約８０％をこれらの画分で回収した。カラムを、Å２８０の
吸光度が、０．０２未満に低下するまで、１ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａを使用
して洗浄した。カラムの再生前に、ＤＥＡＥベッドを、全ての塩を除去するため
に、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を使用して洗浄した。あるいは、Ｄ
ＥＡＥカラムに結合したＣＴＢを、緩衝液Ａ中の０．０２ＭＮａＣｌから１ＭＮａＣｌまでの塩勾配を使用して溶出し得る。ｒＣＴＢを含む画分を選り抜き
の緩衝液中でプールし、透析するか、または、濃縮した。

【０１８９】（ガングリオシドＡｆｆｉｇｅｌカラム上のアフィニティクロマトグラフィー
を使用するｒＣＴＢの精製のための詳細なプロトコール）この技術において、清澄化した細菌培養物の上清をカラムに直接注いだ。ｒＣ
ＴＢまたはｒＣＴＢ変異体は、固定されたガングリオシドに特異的に結合され、
そして、カラムを洗浄した。次いで、ｒＣＴＢを５Ｍグアニジンチオシアネート
を用いて溶出し、そして、リン酸緩衝液に対して透析した。この技術は、非常に
簡単であり、そして高い純度が達成された。しかし、１回当り約７ｍｇのｒＣＴ
Ｂの能力の制限が存在し、そして折り畳み特性が可能である変性タンパク質を必
要とし、この特性は、いくつかの変異体と問題となり得る。

【０１９０】ガングリオシドＡｆｆｉｇｅｌカラムを、Ａｆｆｉｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して生成した。小さいガングリオシド−Ａｆｆｉ
ｇｅｌカラム（０．５ｍｌベッド容量）は、１〜２ｍｇのｒＣＴＢと結合する能
力を有したが、大きい（５ｍｌベッド容量）カラムは、少なくとも７ｍｇと結合
する。５０ｍｌ円錐形チューブ中で新規に作製された、以下の緩衝液を使用した
：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５；０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ；蒸留水中の５Ｍグアニジンチオシ
アネート。

【０１９１】培養物上清を１０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した（ＳＳ−３４）。カ
ラムを詰まらせるので、粒子性物質を除去した。カラムを０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ（２〜５カラム容量）を使用して平衡化した。ｒＣＴＢを含む
サンプルを添加し、そして貫流液を回収し、そして、カラムに対する定量的結合
を可能にするために再度適用させた。カラムを、Å２８０が０に近くなるまで、
０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を使用して洗浄し、カラムを再び、０．
１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌを使用して、Å２８０
が０に近くなるまで洗浄した。カラムを０．１Ｍリン酸化ナトリウム、ｐＨ７．
５（２倍容量）を使用して平衡化した。グアニジンチオシアネート溶液を、１ｍ
ｌ工程で調製し、１ｍｌの画分を回収した。溶出緩衝液のカラムへの最初の２回
の１ｍｌの添加後、カラムを１０分間静置しておいた。このことは、ガングリオ
シド樹脂からのｒＣＴＢの完全な溶出を保証した。Å２８０の画分をプールし、
そして５００ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４に対して透析
し、撹拌しなかった。全４回の緩衝液交換をタンパク質を貯蔵する所望の緩衝液
中で最後の２回行なった。

【０１９２】必要に応じて、ｒＣｔＢは、ＣＭセファロースＦａｓｔＦｌｏｗイオン交換カ
ラム上の陽イオン交換によって精製し得る。手短には、ＮＨ₄ＳＯ₄塩が沈殿した
かまたはＤＥＡＥが溶出したｒＣＴＢが、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍ
ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．４に対して透析し得、そして、透析液をカラムに提供し
得る。

【０１９３】洗浄後、高度に精製されたｒＣｔＢ産物を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．４中の１０ｍＭ〜３００ｍＭＮａＣｌの連続的な塩勾配を使用して溶出
し得る。

【０１９４】この方法は、当業者が以下のＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーを参照
する残りの少量の混入産物を溶解する。

【０１９５】（実施例２）（ｒＣＴＢの変異誘発）Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．，およびＺａｋｏｕｒ，Ｒ．「Ｒ
ａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓｗｉｔｈｏｕｔＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ」、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７−３８２，１９８７
に従って、オリゴヌクレオチド指向インビトロ変異誘発によって、変異誘発を最
初に行なった。Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１６，２７９−３０３，１９９２に基本的に従っ
て、引き続き、変異誘発を行なった。変異誘発の結果をＤＮＡ配列決定によって
確かめた。

【０１９６】（実施例３）（ｒＣＴＢのリジン変異）以下の変異体ｒＣＴＢタンパク質を実施例２に記載された方法を使用して作製
する。リジン残基を配列番号２のｒＣＴＢ配列に挿入し、アミノ酸Ａｓｎ１０３
と置換した。アスパラギンの極性は、中性ｐＨで非電荷のアミノ側鎖に由来する
。Ａｓｎ１０３とリジンとの置換は、効果的および新規の結合体化部位であるこ
とが証明され得る。リジン残基を配列番号２のｒＣＴＢ配列に挿入し、アミノ末
端アミノ酸Ａｌａ１０２を置換する。リジン残基を位置Ａｌａ１に挿入する。リ
ジン残基を位置Ｐｒｏ２に挿入する。この変異体は、アミノ末端の構造を変化さ
せるが、得られた組成物のＧｍ−１結合親和性および抗原性は、変異によって損
なわれない。

【０１９７】外側に向いている多数の側鎖を有するｒＣＴＢの外表面上に、アミノ酸１４−
２０はβシートを形成する。この構造を形成するアミノ酸中のＨｉｓ１８が、変
異誘発に特に適している。従って、変異体Ｈ１８Ｋを有する変異体ｒＣＴＢタン
パク質が産生される。Ｈｉｓ１３と任意の他のタンパク質との置換は、ｒＣＴＢ
のＺｎ⁺²結合特性ならびに五量体−五量体自己会合に影響し得る。これらの特徴
のいずれかの除去は、変異体タンパク質の化学的単離の目的に所望であり得る。

【０１９８】（実施例４）（免疫原に結合されたｒＣＴＢ変異体の免疫原性を決定する）免疫原性をｒＣＴＢ：免疫原のｂａｌｂ／ｃマウスへの注射によって決定する
。１：１、１：６、および１：３の割合のｒＣＴＢ：免疫原結合体を注射した。
さらに、免疫原単独を使用するコントロールを注射した。１０日後、血液を免疫
化マウスから汲み出し、そして、ｒＣＴＢ：免疫原結合体を同定し、ＥＬＩＳＡ
などの抗体アッセイプロトコールまたは当業者に広範に公知の任意の他の適切な
アッセイを介して測定した。

【０１９９】（実施例５）（変異体ｒＣＴＢタンパク質の免疫原への化学的結合）（リジン残基）変異体ＣＴＢタンパク質ＣＴＢＫ９１ＧおよびＣＴＢ−Ｋ６２Ｇ、６３Ｇ，
９１Ｇを実施例１〜２に記載される方法を使用して修飾し、発現し、そして、精
製した。ＣＴＢのＧｍ−１結合部位に近接していること、およびＧｍ−１の末端
グルコースと相互作用することが公知であることから、Ｋ９１の変異体を、置換
のための部位として選択した。さらに、上記のように、Ｋ９１は、低分子結合体
（例えば、ＦＩＴＣまたはＳＰＤＰ）と高度に反応性である。従って、異種二機
能性試薬を用いた結合体は、減少したＧｍ−１結合親和性を有する分子複合体、
より簡単な、より高率的なＳＰＤＰとの結合反応を創出するプロトコルに対する
いくつかの重要な修飾、を作製するようである。手短に言えば、結合体のｐＨは
、８．０＞でなければならず、そして、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミドイル３
−［２−ピリジルチオ］プロピオネート）修飾ｒＣＴＢおよびその関連分子は、
高度に濃縮されなければならない。

【０２００】これらの修飾を使用して、ｒＣＴＢ野生型を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
およびＤｉｐｈｔｈｅｒｉａトキソイド（Ｄｔ）に首尾よく結合する。

【０２０１】確立されたプロトコールと対照的に、ＢＳＡまたはＤｔのいずれも結合体化の
前に、ＳＰＤＰ修飾されていなかった。これらのタンパク質は、容易にＳＰＤＰ
修飾ｒＣＴＢと反応する遊離スルフヒドリル基を有することを決定した。

【０２０２】（ＳＰＤＰ化学を使用するｒＣＴＢの修飾）ｒＣＴＢまたは修飾体ｒＣＴＢを、リン酸ホウ酸緩衝液に透析した。リン酸ホ
ウ酸緩衝液：１０×ストック溶液（２Ｌ）を、１２．４ｇホウ酸、１７５．３ｇ
ＮａＣｌ、および１３６．０９ｇリン酸カリウム（一塩基）を１．５リットルの
水に添加することによって作製した。この溶液を５ＭＫＯＨを用いてｐＨ６．
６に調製し、次いで、水を用いて２リットルの最終容量とした。この溶液を０．
２ミクロンフィルターを通してろ過した。１×溶液のｐＨは、７．０であった。
リン酸ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５は、５ＭＫＯＨを用いて調製された１×緩衝
液であった。ｒＣＴＢに対して、１０倍過剰のモル濃度のＳＰＤＰを使用して、
ｒＣＴＢを修飾した。ＳＰＤＰを秤量し、そして、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）を使用して、５ｍｇ／ｍｌに希釈し、分子ふるい（グレード５
６２、３ａ型、４〜８メッシュビーズ、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ）を含む。このようにして、５ｍｇ／ｍｌＳＰＤＰの２５
μｌをｒＣＴＢの２ｍｇｒＣＴＢ／ｍｌ溶液に添加する。ＳＰＤＰおよびｒＣ
ＴＢをインキュベートし、そして室温で少なくとも１時間反応させた。

【０２０３】過剰のＳＰＤＰをＧ−２５ゲルろ過カラム（１．５ｃｍ×９ｃｍ、ベッド容量
は、過剰のＳＰＤＰを分離するに必要な最小量である）を通過させることによっ
て除去した。５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７．５をカラムランニング緩衝液として使用した。ＳＰＤＰ修飾ｒＣＴＢをＡｍ
ｉｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｏｎｃ−３０（３０ｋＤカットオフ）を使用して１
〜２ｍｌの間の容量に濃縮した。

【０２０４】（ＳＰＤＰ修飾ｒＣＴＢに対するタンパク質の結合体化）未修飾タンパク質（免疫原−すなわちＢＳＡまたはＤｔ）を３×１０００容量
のリン酸ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０に対して透析させた。ＳＰＤＰ修飾ｒＣＴＢ
および未修飾タンパク質（免疫原）を、選択されたモル比で組み合わせ、そして
一晩インキュベートした。次にサンプルをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（３０，０
００ＭＷＣＯＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して濃縮
した。

【０２０５】（化学的結合の確認）濃縮されたサンプルを４〜２０％トリス−グリシンゲル上でのゲル電気泳動に
よってその成分部分に分泌することによって、結合体の形成を確かめた。以下を
含む多数の技術を使用して、２つのタンパク質の化学的結合を確かめ得る：ｒＣ
ＴＢに結合される場合、免疫原のみを認識する免疫原特異的抗体を使用するＧｍ
−１ＥＬＩＳＡ、および分子ふるいゲルろ過。

【０２０６】（システイン残基）実施例１〜２に記載される方法を使用して、変異体ＣＴＢタンパク質ＣＴＢ−
Ｈ１８ＣおよびＣＴＢ−Ｍ１０１Ｃを修飾し、発現し、そして、精製した。ｒＣ
ＴＢタンパク質を１００ｍＭＤＴＴを用いて室温で２時間処理した。Ｂｉｏｇ
ｅｌＰ６ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ
）で充填した１ｍｌスピンカラムを通して、２０００ｇで２分間遠心分離によっ
て、ＤＴＴを除去し、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０／１０ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して平衡化した。回収された画分をマ
レイミド活性化免疫原（すなわち、架橋剤ＳＭＣＣ，Ｓｉｇｍａを用いて機能化
した免疫原）を使用して、室温で２時間インキュベートした。β−メルカプトエ
タノール（β−ｍｅ）を１．５ｍＭの最終濃度になるように添加し、そして、Ｎ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で懸濁されたＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を
３ｍＭの最終濃度になるように添加することによって、反応を停止させた。

【０２０７】（化学的連結の確認）免疫原のｒＣＴＢへの結合体化をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティング
によって評価した。（Ｉ）ＥＬＩＳＡ：免疫原およびｒＣＴＢの結合体をＧＬＭ
−１でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いてインキュベートし、
そして、固定した免疫原を色素生産性基質３，３’，５，５’テトラメチルベン
ジジン（ＴＭＢ，ＫＰＬ）を用いて検出した。ＧＭ−１のコーティングに依存し
たプレート結合免疫原の検出を、ｒＣＴＢが物理的に免疫原に結合している証拠
として理解する。（ＩＩ）ウエスタンブロット：結合体を７．５％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロースに転
写した。ｒＣＴＢをポリクローナル抗ｒＣＴＢ血清で検出し、ヤギ抗マウスＩｇ
アルカリホスファターゼ（Ａ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｓｋｉｎｇｈａｍｓｈ
ｉｒｅ，ＵＫ）およびＡＰ特異的基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ，ＢｉｏＲａｄ，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）が続いた。免疫原を免疫原に特異的な抗体（ヤギ抗マウ
スＩｇ−ＡＰおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いて検出した。（免疫原−ｒＣＴＢ結合体の精製）結合体を結合体の予測されるサイズに基づいて、サイズ除去クロマトグラフィ
ーによって精製した。さらなる精製を、ＧＭ−１またはガングリオシドアフィニ
ティカラム中で行ない、非結合体化免疫原を除去し、そして、抗原または免疫原
特異的カラム中で、残渣のないｒＣＴＢおよびｒＣＴＢ−ｒＣＴＢ結合体をそれ
ぞれ除去した。これは、実施例６に記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳ
Ａによって評価される生理活性結合体のみを残す。

【０２０８】（実施例６）（野生型ｒＣＴＢと関連する、Ｇｍ−１結合に関する変異体ｒＣＴＢ結合体化
複合体のアッセイ）変異体ＣＴＢ、野生型ＣＴＢ、またはこれらから誘導された結合体におけるＧ
Ｍ−１結合部位によるガングリオシド親和性の保持を、ＥＬＩＳＡ分析によって
アッセイし得る。第１の例においては、モノシアロガングリオシド（ＧＭ−１）
を、０．３ｎｍｏｌ／ｍｌＰＢＳの濃度で使用した。１００マイクロリットル
のガングリオシド溶液を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加
え、そして２２℃で一晩インキュベートした。翌日、このプレートをＢｉｏｐｌ
ａｔｅＡｕｔｏｗａｓｈｅｒＥＬ−４０４（Ｂｉｏ−ＴｅｃｈＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を利用して、ＰＢＳで二回洗浄した。
次いで、プレートの全てのウェルを、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液２００μｌで
、３７℃で３０分間コーティングした。このプレートを、０．０５％のｔｗｅｅ
ｎ−２０を含むＰＢＳ中で３回洗浄し、そして残った溶液を除いた。全てのウェ
ル（最初の試験ウェル以外）に、ＰＢＳ中の０．１％のＢＳＡ、０．０５％のｔ
ｗｅｅｎ−２０の溶液１００μｌを与えた。次いで、試験ウェルに、１ｍｌ当た
り１５μｇのＣＴＢの試験変異体、野生型または結合体を１５０μｌ与えた。次
いで、３倍の連続希釈をプレートにわたって行い、第２の試験ウェルから５０μ
ｌを第３のウェル中の１００μｌの緩衝液内へ連続的に移動しそして希釈し、以
降１２回希釈まで同様に行った。このプレートを、２２℃で９０分間インキュベ
ートした。次いで、プレートを上記のように３回洗浄した。次いで、全てのウェ
ルにマウス抗ｒＣＴＢ抗血清の１／２０，０００の希釈物か、または結合した化
合物に対するマウス抗血清の所定の希釈物のいずれかの１００μｌを与えた。ウ
ェルを２２℃で１時間インキュベートし、そして引き続き上記のように３回洗浄
した。次いで、試験ウェルにセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マ
ウスＩｇＧの１／３０００の希釈物１００μｌを与え、２２℃で１時間インキュ
ベートさせた。次いで、プレートを再び洗浄し、そして０．１Ｍのクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４．５）中のオソフェニレンジアミンジヒドロクロライド（
ＯＰＤ）１ｍｇ／ｍｌ溶液および０．０１％のＨ₂Ｏ₂ １００μｌと共に、２０
分間インキュベートした。次いで、３ＮのＨＣｌ溶液５０μｌを加えて、酵素反
応を停止させた。次いで、プレートをＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ２５０マイクロプレ
ートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖ
ａｌｅ、ＣＡ）で、４９２ｎｍおよび６５０ｎｍで読み取った。変異体またはそ
れらの結合体に対する結果を、それぞれ、野生株またはこれらの結合体と関連す
る終点希釈（見かけの濃度）の関数として報告した。この結果は、変異されたｒ
ＣＴＢが結合した複合体は、ＧＭ−１結合部位に結合するその能力を保持するこ
とを示した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＭＳ−０（ＭａｘｉｍＳｅｃｒｅｔｏｒｙ−０）遺伝子発現ベクタ
ーにより産生されるｒＣＴＢタンパク質の翻訳されたコード配列（配列番号１お
よび２）である。コードされたタンパク質は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ５６９Ｂ株
由来の野生型配列と同一である。

【図２】図２は、ＭＳ−０プラスミドを示すプラスミドマップである。

【図３】図３は、ｒＣＴＢのアミノ酸配列（配列番号２）であり、これはさらに、推定
二次構造、リジン残基の位置、およびＧＭ−１への結合に関与する領域を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/28 Ｃ０７Ｋ 14/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エウォルト，カーラエル．アメリカ合衆国カリフォルニア 92122，サンディエゴ，トスカーナウェイ 5275，ナンバー 144 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 CA04 DA06 EA04 FA02 FA18 GA11 HA01 4B064 AG30 CA02 CA19 CC24 DA01 4C085 AA03 BA10 BA14 BA16 BA17 BA18 BA20 BA21 BA24 BA45 BA46 BA55 BA56 BA57 BA69 BA78 CC07 CC08 CC21 CC24 CC31 GG01 GG08 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA83 EA29 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１つの変異を含む組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタ
ンパク質であって、該変異は、野生型ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質と比較し
て、化学修飾に利用可能なアミノ酸残基の数を変化させ、そして該組換えタンパ
ク質は、有効な標的リガンド結合親和性を保持する、組換えＡＢ₅Ｂサブユニッ
トタンパク質。
【請求項２】前記変異が、化学修飾に利用可能なアミノ酸残基の数を増加
させる、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項３】前記変異が、化学修飾に利用可能なアミノ酸残基の数を減少
させる、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニット。
【請求項４】前記化学修飾に利用可能なアミノ酸残基が、リジン、システ
インおよびヒスチジンからなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＡＢ ₅ Ｂサブユニット。
【請求項５】前記変異が、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失およびアミノ酸置
換からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニット。
【請求項６】前記組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、薬物、免疫
原、免疫調節分子、アジュバントおよび他の生物活性分子からなる群から選択さ
れる化合物と化学結合する、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタン
パク質。
【請求項７】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタン
パク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴ
ＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質、
志賀様毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択され
る、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項８】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂ（Ｃ
ＴＢ）サブユニットタンパク質である、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユ
ニットタンパク質。
【請求項９】前記組換えタンパク質が、有効なＧｍ−１結合親和性を保持
する、請求項８に記載の組換えコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユニットタンパク質
。
【請求項１０】請求項８に記載の組換えコレラ毒素Ｂサブユニットタンパ
ク質であって、ここで、前記変異が、【化２９】からなる群から選択され、ここで、「Ｘ」は、該組換えＣＴＢタンパク質内の共
有結合的な修飾部位の数を変化させる任意のアミノ酸残基を表す、組換えコレラ
毒素Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項１１】前記化学修飾に利用可能なアミノ酸残基が、リジン、シス
テインおよびヒスチジンからなる群から選択される、請求項１０に記載の組換え
コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユニット。
【請求項１２】前記変異が、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失およびアミノ酸
置換からなる群から選択される、請求項１０に記載の組換えコレラ毒素Ｂ（ＣＴ
Ｂ）サブユニット。
【請求項１３】請求項１０に記載の組換えコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユ
ニットであって、ここで、「Ｘ」は、化学修飾に利用可能なアミノ酸残基の数を
減少させるアミノ酸を表す、組換えコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユニット。
【請求項１４】少なくとも１つの前記変異が、Ｋ９１Ｇ、Ｋ９１Ｑ、Ｋ９
１Ｓ、Ｋ９１ＰおよびＫ９１Ｙからなる群から選択される、請求項１１に記載の
組換えコレラ毒素Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項１５】少なくとも１つの前記変異が、Ｋ３４Ｇ、Ｋ３５Ｇ、Ｋ６
２Ｇ、Ｋ６３ＧおよびＫ９１Ｇからなる群から選択される、請求項１１に組換え
記載のコレラ毒素Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項１６】前記変異Ｋ３４ＧおよびＫ９１Ｇを含む、請求項１１に記
載の組換えコレラ毒素Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項１７】前記変異Ｋ６２Ｇ、Ｋ６３ＧおよびＫ９１Ｇを含む、請求
項１１に記載の組換えコレラ毒素Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項１８】請求項１０に記載の組換えコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユ
ニットタンパク質であって、ここで、「Ｘ」は、化学修飾に利用可能なアミノ酸
残基の数を増加させるアミノ酸を表す、組換えコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユニ
ットタンパク質。
【請求項１９】前記タンパク質が、Ａ１Ｋ，Ｐ２Ｋ，Ｑ３Ｋ、Ｎ４Ｋ、Ｔ
６Ｋ、Ｎ７Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｎ２１Ｋ、Ｆ２５Ｋ、Ｎ４４Ｋ、Ｍ１０１Ｋ、Ｎ１０
３Ｋ、Ｑ３Ｃ、Ｎ４Ｃ、Ｔ６Ｃ、Ｎ７Ｃ、Ｈ１８Ｃ、Ｎ２１Ｃ、Ｆ２５Ｃ、Ｎ４
４Ｃ、Ｍ１０１ＣおよびＮ１０３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つの
変異を含む、請求項１８に記載の組換えコレラ毒素Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項２０】請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質
であって、前記変異が、以下：変異を減少させる少なくとも１つの修飾であって、該修飾は、野生型ＡＢ₅Ｂサ
ブユニットタンパク質と比較して、修飾に利用可能な減少した数のアミノ酸残基
を有する該組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質を生じる、少なくとも１つの
修飾；および変異を増加させる少なくとも１つの修飾であって、該変異を増加させる修飾が
、以前化学修飾が不可能であった該組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質内の
部位に、化学修飾が可能なアミノ酸を導入する、修飾、を含む、組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項２１】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタ
ンパク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質
、志賀様毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択さ
れる、請求項２０に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項２２】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタ
ンパク質（ＣＴＢ）である、請求項２０に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタ
ンパク質。
【請求項２３】前記化学修飾に利用可能なアミノ酸残基が、リジン、シス
テインおよびヒスチジンからなる群から選択される、請求項２０に記載の組換え
ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質。
【請求項２４】請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質
をコードする組換えＡＢ₅Ｂサブユニット遺伝子を作製する方法であって、以下
：ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質をコードするＡＢ₅Ｂサブユニット遺伝子を提
供する工程；該ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質の共有結合的修飾に関与するアミノ酸残基
をコードするコドンを選択する工程；および生じたアミノ酸が、共有結合的修飾が不可能であるか、または増強された修飾
能力を有するかのいずれかであるように、該コドンを変異させる工程、を包含する、方法。
【請求項２５】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタ
ンパク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク
質、志賀様毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択
される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記化学修飾に利用可能なアミノ酸残基が、リジン、シス
テインおよびヒスチジンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】以下：組換えＡＢ₅Ｂサブユニットをコードする遺伝子を得る工程；該遺伝子にプロモーターを付加する工程であって、それによって、発現カセッ
トを産生する、工程；該発現カセットを、適切な宿主細胞へ導入する工程、および該発現カセットがタンパク質に翻訳される条件下で、該宿主細胞を培養する工
程、を包含する、請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質を産生す
るための方法。
【請求項２８】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタ
ンパク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク
質、志賀様毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択
される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質がコレラ毒素Ｂタン
パク質（ＣＴＢ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットを産生する
ための遺伝子構築物であって、適切なリーディングフレームに作動可能に結合された、プロモーターおよび該
組換えＡＢ₅ＢサブユニットをコードするＤＮＡ配列を含む、遺伝子構築物。
【請求項３１】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタ
ンパク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質
、志賀様毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択さ
れる、請求項３０に記載の遺伝子構築物。
【請求項３２】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質がコレラ毒素Ｂタン
パク質（ＣＴＢ）である、請求項３０に記載の遺伝子構築物。
【請求項３３】請求項１に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットを産生する
ための方法であって、以下：請求項３０に記載の遺伝子構築物を、適切な宿主細胞に発現させる工程：およ
び組換えＡＢ₅Ｂサブユニットを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項３４】組換えＡＢ₅Ｂサブユニットに対して免疫応答を引き起こ
す方法であって、以下：請求項１または２０に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質を提供す
る工程；第１の官能基および第２の官能基を有する二量体の架橋剤を用いて、該タンパ
ク質を共有結合的に修飾する工程であって、該第１の官能基は、請求項１または
２０に記載の組換えＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質と化学的に結合している、工程；該第２の官能基を、化合物を用いて共有結合的に修飾する工程；および該免疫応答が引き起こされるまで、該修飾されたタンパク質を宿主に投与する
工程、を包含する、方法。
【請求項３５】前記免疫応答が抗体応答である、請求項３４に記載の方法
。
【請求項３６】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質が、コレラ毒素Ｂタ
ンパク質（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質
、志賀様毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択さ
れる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】前記ＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質がコレラ毒素Ｂタン
パク質（ＣＴＢ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】前記免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項３４に記載
の方法。
【請求項３９】前記共有結合的に修飾されたタンパク質を前記宿主に投与
して前記免疫反応を引き起こす工程の前に、該タンパク質を免疫原と混合し、疎
水的に結合されたタンパク質を産生する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】前記ＡＢ₅毒素Ｂタンパク質が、コレラ毒素Ｂタンパク質
（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ
型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質、志賀
様毒素Ｂタンパク質、百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択される、請求
項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記ＡＢ₅毒素Ｂサブユニットタンパク質がコレラ毒素Ｂ
タンパク質（ＣＴＢ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】発現ベクターであって、以下：プロモーターおよび請求項１に記載のＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質をコー
ドする遺伝子であって、該ＡＢ₅毒素Ｂタンパク質が、コレラ毒素Ｂタンパク質
（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性腸毒素Ｂタンパク質（ＬＴＢ）、ＬＴＩＩａ
型Ｂタンパク質、ＬＴＩＩｂ型Ｂタンパク質、志賀毒素Ｂタンパク質、志賀様
毒素Ｂタンパク質および百日咳毒素Ｂタンパク質からなる群から選択される、プ
ロモータおよびＡＢ₅Ｂサブユニットタンパク質をコードする遺伝子、を含む、発現ベクター。
【請求項４３】請求項４２に記載の発現ベクターであって、該発現ベクタ
ーが、免疫原性ペプチドコード配列をさらに含む遺伝子融合ベクターであって、
ここで、前記ＡＢ₅毒素Ｂサブユニットタンパク質および該免疫性ペプチドコー
ド配列が、適切なリーディングフレームに作動可能に連結され、これによって、
遺伝子融合タンパク質が生じ；そして該遺伝子融合タンパク質が発現され、そして分泌される、発現ベクター。
【請求項４４】前記ＡＢ₅毒素Ｂサブユニットタンパク質がコレラ毒素Ｂ
タンパク質（ＣＴＢ）である、請求項４３に記載の遺伝子融合ベクター。