JPH11510164A

JPH11510164A - ポリヌクレオチドの粘膜送達

Info

Publication number: JPH11510164A
Application number: JP9507664A
Authority: JP
Inventors: キング，ダニー，エイチ
Original assignee: マキシムファーマシューティカルズ
Priority date: 1995-07-26
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 1999-09-07
Also published as: CA2227871A1; WO1997005267A3; WO1997005267A2; AU6505796A; EP0840796A2

Abstract

(57)【要約】ＧＭ１−結合蛋白及びこの結合蛋白に会合するポリヌクレオチドを含む、粘膜細胞、神経細胞、または他の細胞にポリヌクレオチドを送達するための組成物、及び、この組成物を動物に投与すること、及びポリヌクレオチドを発現させて、該動物にポリヌクレオチドの産物に対する免疫応答を起こさせることを含む、免疫性を調節する方法、及び、ＧＭ１結合蛋白及び機能性ポリヌクレオチドを動物に投与し、この動物においてポリヌクレオチドを発現させてポリヌクレオチドの機能が動物に治療効果を与えることを含む、遺伝子治療の方法。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチドの粘膜送達関連出願本出願は、３５ＵＳＣ（米国特許法）１１９（ｅ）によって、１９９６年７月２６日に出願された暫定出願番号第６０／００１５２７号を優先権主張するものである。発明の分野本発明は、脊椎動物の粘膜及び神経組織、及びＧＭ１受容体が表在する他の組織または細胞への、機能性ポリヌクレオチドの送達に関する。こうして送達される機能性ヌクレオチドは、治療効果のある遺伝子であるか、または動物の免疫応答を調節するために働く能力がある。この調節によって、動物において、続いて起こる免疫応答の大きさを増強または低下させることが可能である。発明の背景粘膜は、呼吸・消化器及び泌尿生殖器系、目の結膜、内耳、及び全ての外分泌腺の管路の、外部にさらされる表面を覆っている。粘膜はその分布のため、多数の異物粒子及び侵入する微生物と常に接触している。これらの膜は、接触する粒子及び微生物の大部分を取り込んで分解する能力がある。加えて、粘膜は特殊な免疫系を有する。粘膜の免疫系細胞は、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ；mucosa -associated lymphoid tissues）を構成する。ＭＡＬＴ細胞は普通、多数の異物質と接触する。そうして接触するあらゆる異物に対して完全に免疫応答すれば、例えば蛋白様の食物を摂取するような単純かつ生命維持に不可欠のプロセスが不可能になるであろう。従って、粘膜性免疫系は、異物のエピトープ（抗原決定基）のほとんどを選択的に無視する能力を持っていなければならず、一方では他のいくつかの異物に対して強力に応答する。ある異物のエピトープに対して獲得寛容性を発現する現象は、ある別の方法で免疫原性物質が充分大量に摂取されると、感受性が低下することによって初めて認められたことから、「経口寛容性」（oral tolerance）として知られている。現在は、この「経口寛容性」は、ＭＡＬＴ細胞をある異物に充分暴露することによって、少なくとも一時的及び局所的に獲得され得ることが知られている。多くの粘膜細胞では、原形質膜にガングリオシドＧＭ１が相対的に多いという特徴がある。ＧＭ１はシアロセラミドの一種であり、その親油性セラミド部分は原形質膜のリン脂質二重層中に拡散してこの脂質二重層と結合し、一方ＧＭ１のオリゴ糖−シアル酸部分は膜外に突き出て、細胞表面に表在する。ＧＭ１は粘膜細胞のみに限定されるものではない。実際にＧＭ１は、体の多くの異なる細胞型中にあるレベルで存在しているが、ニューロン膜及び粘膜細胞の膜に最も多く存在する。ＧＭ１は、原形質膜において、暴露されているそのオリゴ糖−シアル酸部分に結合する蛋白に対する受容体として作用する能力がある。最も知られているＧＭ１結合蛋白は、コレラ菌（Ｖibrio cholcrae）の毒素であるコレラ毒素（ＣＴ）である。ＣＴは二つのタイプのサブユニットで構成されている。サブユニットＡのフラグメントＡ１にはＡＤＰ−リボシル化活性があり、サブユニットＢにはＧＭ１結合活性がある。ホロトキシン(holotoxin)は、５個のサブユニットＢと１個のサブユニットＡからなるヘテロ６量体である。同族である大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシン（ＬＴ）は、構造及び機能がＣＴと非常に類似している。ＣＴのＡＤＰ−リボシル化活性及びＧＭ１結合活性は両者とも、ＣＴの全体の毒素活性に必須である。ホロトキシンのサブユニットはＡ、Ｂ共に、単独ではインビボでの毒素反応を起こさない。細胞では、サブユニットＡのＡＤＰ−リボシル化活性によって、ＮＤＡのＡＤＰ−リボシル部分が、膜に結合するアデニル酸シクラーゼの正のレギュレーターである、グアニン−ヌクレオチドの結合蛋白Ｇ_s のサブユニットαへ運ばれる。この本文では主としてＧＭ１結合蛋白の使用について論じるが、「ＡＤＰ−リボシル化部分」もまた、あたかもこの語句が「ＧＭ１結合蛋白」という語句に代用されているかのように、「ＧＭ１結合蛋白」という語句がここに掲載されているのと同じく、完全に本発明の一部と考えられることに注意するべきである。類似の機能を持つＡＤＰ−リボシル化酵素は他にも多数存在する。例えば、大腸菌の熱に不安定なエンテロトキシン（ＬＴ）は、そのサブユニットＡ及びＢもまた、それぞれＡＤＰ−リボシル化活性及びＧＭ１結合活性を示すことから、二重に類似している。ＧＭ１はオリゴ糖部分を含有しそれが表在することから、多数のレクチン類及びレクチン様分子とも結合する能力がある。また、セラミド部分の親油性の性質によって、外因性のＧＭ１は多くの細胞型の膜に容易に取り込まれる。ＣＴは粘膜性免疫系によって強力な反応を引き起こす。従って、ホロトキシンまたはサブユニットＡ単独で、選択された他のエピトープに対する粘膜性免疫反応を刺激するためのアジュバントとして使用されている。非常に驚くことは、ＣＴＢは、選択されたエピトープと結合した場合、送達されたエピトープに対する獲得（「経口」）寛容性をもたらす強力な能力を有するという対照的な事実である。サブユニットＢは単独で、結合したエピトープをＭＡＬＴの近くに効率的に送達するが、一般的にはそれ自身では免疫認識の増強を刺激しない。多くの場合、このような免疫刺激のない送達の結果が獲得寛容性である。粘膜性免疫系が全身性免疫に対する影響に加えて、粘膜性免疫が増強または低下するという二つの現象から、粘膜性免疫のアジュバントとしてＣＴまたはＣＴＡを、及び獲得寛容性のイニシエーター及びメディエーターとしてＣＴＢを含む、組成物及び治療方法の開発にかなりの関心が寄せられている。現在の方法及び組成物は、エピトープに対する獲得寛容性を得るために、エピトープをＭＡＬＴに送達するためのＣＴＢと所望のエピトープとの共有結合を利用している。この体系は、アレルギー、同種異系移植の拒絶反応、及び自己免疫疾患の問題に関心のある者に特に評価されている。同様に、獲得粘膜性免疫、ひいては全身性免疫の刺激を目的とする研究者らは、粘膜性免疫を増強するため、選択した抗原をＣＴまたはＣＴＡと結合させた。両方の場合で、送達された蛋白エピトープ及びＣＴＢとの結合が不安定であることで、エピトープにＭＡＬＴ細胞が適切に暴露された効果及び期間が制限されている。ここに記載した発明は、この問題を新規な方法で検討するものである。本発明は、当技術の現在の状態における欠点を解決するという新規性を有する以上に、遺伝子治療に適用する場合にも非常に有用である。ここに記載するのは、ポリヌクレオチドとＧＭ１または他の粘膜結合蛋白とで複合体を形成させるかまたは結合させることによって、ＭＡＬＴ細胞などの標的細胞に活性なポリヌクレオチドを送達する発明である。送達される分子は、蛋白質よりもむしろポリヌクレオチドであって、単一の蛋白質の送達よりも数百倍または数千倍大きい単一の送達イベント（a simple delivery event）において効果がある。これは、活性なポリヌクレオチドが、所望の蛋白の多数のコピーの最終発現を指示し、コードし、または最終発現に他の影響を及ぼすことが可能であるからである。さらに、活性なポリヌクレオチドは、発現が一時的であるならば数時間から数日間、または、ポリヌクレオチドが送達される細胞のゲノム内へ安定して組み込まれる場合は永久的に、そのように作用する能力がある。送達される分子が単なる蛋白質である場合には、同様の結果にはとうてい到達しない。本発明は、粘膜細胞を認識するだけではない結合蛋白を使用するので、遺伝子治療の分野においても有用である。標的細胞の結合蛋白及び膜の決定基は、治療効果のある遺伝子または他のポリヌクレオチドが標的細胞に正確かつ効率的に送達されるように、選択及び／または操作され得る。結果として、標的細胞の一時的なトランスフェクションまたは安定で永久的な形質転換が起こる。発明の概要本発明は、遺伝子治療及び免疫系の操作に新規なアプローチを導入するものである。本発明は、機能性ポリヌクレオチドを粘膜組織、神経組織、及びＧＭ１受容体が表在する他の組織または細胞に局在化させる能力を有する組成物に関する。そうして送達される機能性ヌクレオチドは、治療効果のある遺伝子であるか、または動物の免疫応答を調節するために働く能力がある。この調節によって、動物において、続いて起こる免疫応答の大きさを増強または低下させることが可能である。本発明を具体的に表すものは、ポリヌクレオチドを粘膜細胞、神経細胞、及び他の脊椎動物細胞または組織に送達する組成物である。この組成物は、活性なポリヌクレオチドに会合（association）して脊椎動物の粘膜組織の決定基に親和性を有する粘膜結合蛋白を含む。粘膜結合蛋白は、他の細胞型に対しても親和性があるので、本発明の組成物は、他の選択された細胞及び組織にも同様に、活性なポリヌクレオチドを送達するのに効果的である。本発明のさらに特別な態様では、蛋白成分として、粘膜結合蛋白である下記の群の要素を使用する：ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴ、細菌性線毛状蛋白（bacterial fimb riae proteins）、動物性レクチン、植物性レクチン、及びレクチン様蛋白。本発明の好ましい態様では、粘膜結合蛋白はコレラ菌（Ｖibrio cholerae）のコレラ毒素である。この態様は、サブユニットＡ及びＢ、またはそのモノマーまたはフラグメントから成るホロトキシンの使用を意図するものであり、また、（結合）サブユニットＢのみから成る、毒素の特別なフラグメントの使用も意図する。さらに、ＡＤＰ−リボシル化活性を示す他の分子は勿論、サブユニットＡ（Ａ１及びＡ２）の両フラグメントまたはそれらの一方のフラグメントを含む、（活性）サブユニットＡのみの使用も意図する。本発明の別の態様では、蛋白成分として、粘膜細胞を特異的に認識することができる免疫グロブリンを使用する。この局面について、さらに特別な本発明の態様では、免疫グロブリンはＧＭ１受容体を認識し、これに結合する。本発明のさらなる態様はポリヌクレオチド成分に関する。一つの態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、このＤＮＡはゲノム由来のものであってもよい。あるいは、ＤＮＡはｃＤＮＡであってもよい。加えて、本発明によれば、ＤＮＡは組換えＤＮＡであってもよい。本発明はヌクレオチド成分として、ＤＮＡの全ての形態を意図する。本発明のこの局面について、好ましい態様として、コード領域（coding regio n）に操作的に結合するプロモーター領域を含むＤＮＡが挙げられる。コード領域は、種々の蛋白ドメインを特定することが可能である。本発明の別の好ましい態様では、ＤＮＡはアンチセンスメッセージをコードするものである。本発明の別の態様では、ポリヌクレオチド成分はＲＮＡである。従って、好ましい態様では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。別の好ましい態様では、ＲＮＡはアンチセンスである。ほかの態様では、ＲＮＡはリボザイムである。本発明はポリヌクレオチド成分として、ＲＮＡの全ての形態を意図する。本発明の組成物はいくつかの有用な剤形であってもよい。本発明は、組成物の全ての有用な剤形を意図するものである。一つの態様では、組成物は、吸入による送達に使用されるような、霧状の分散剤の形態である。好ましい態様では、組成物は、直腸坐剤または膣坐剤の形態である。別の好ましい態様では、組成物は、クリーム、軟膏、または経皮貼付剤の形態である。また本発明は、粘膜結合蛋白及びポリヌクレオチドが組成物を形成し得る全ての方法をも意図するものである。好ましい態様では、組成物は粘膜結合蛋白とポリヌクレオチドとの混合物の形態である。この混合物は、静電気的または疎水性の相互作用を利用する他の成分または、ポリヌクレオチド送達の障害の一つである粘液の効果を減じる他の成分によって安定化してもよい。別の態様では、粘膜結合蛋白とポリヌクレオチドは互いに化学的に結合している。本発明のほかの態様では、粘膜結合蛋白及びポリヌクレオチドを一緒にカプセルに封入する。本発明の別の局面は、動物の免疫性を調節する方法である。この方法の第一段階では、粘膜結合蛋白と免疫原をコードするポリヌクレオチドとを組み合わせて動物に投与する。第二段階では、動物においてポリヌクレオチドを発現させ、これによって動物はポリヌクレオチドの産物に対して免疫応答を起こす。本発明のこの局面について、好ましい態様では、調節によって動物の免疫応答を増強する。本発明では、増強される免疫応答が、粘膜性または全身性であってもよく、または粘膜性と全身性の両方であってもよい。本発明のこの局面について、さらなる態様では、避妊に対する免疫応答を増強する。本発明の別の好ましい態様では、調節よって動物の免疫応答を低下させる。本発明では、低下させる免疫応答は、粘膜性または全身性であってもよく、または粘膜性と全身性の両方であってもよい。本発明の好ましい態様では、経口寛容性の場合と類似の方法で、アレルゲンに対して脱感作させるために免疫応答を低下させる。別の好ましい態様では、臓器及び組織移植を許容するために免疫応答を低下させる。本発明のさらに好ましい態様では、自己免疫疾患の治療に対する免疫応答を低下させる。本発明によれば、免疫応答の調節は、病原体またはアレルゲンに暴露する前に実施してもよい。また本発明は、病原体またはアレルゲンに暴露した後に調節を実施することも意図する。従って、本発明は、暴露の前でも後でも、及び処置される動物を免疫するにせよ脱感作するにせよ、本発明組成物の、免疫応答を調節するための全ての使用を包含する。本発明の組成物は、種々の経路で投与することが可能である。一つの態様では、投与形態は鼻及び／または肺経由のものである。好ましい態様では、投与形態は経口投与である。さらに好ましい態様では、本発明の組成物は直腸または膣内に投与される。もしくは、本発明の態様として、本発明の組成物を吸入によって、眼科的に投与することによって、また経皮的に投与することによって投与する形態も包含される。本発明の別の局面は、あらゆるＧＭ１細胞にポリヌクレオチドを送達するために機能する組成物である。この組成物の結合蛋白成分は、ＧＭ１受容体に親和性があり、この親和性によって、ＧＭ１受容体が表在するあらゆる細胞にポリヌクレオチドを送達する。本発明のこの局面について、一つの態様では、結合蛋白は、ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴ、ＬＴＢ、細菌性線毛状蛋白、動物性レクチン、植物性レクチン、及びレクチン様蛋白からなる群より選択される。好ましい態様では、結合蛋白は、コレラホロトキシン（サブユニットＡ及びＢを有する）であるか、または、この毒素のいくつかのフラグメントを単独でまたは他の蛋白フラグメントと組み合わせて含有する、この毒素の誘導体である。他の好ましい態様では、組成物の結合蛋白は免疫グロブリンである。本発明によれば、ポリヌクレオチドのＧＭ１送達は、遺伝子治療も目的としている。そのような態様として、本発明は、ＧＭ１結合蛋白と機能性ポリヌクレオチドとを組み合わせて動物に投与し、次にポリヌクレオチドを動物細胞において発現させる、動物における遺伝子治療のための方法を開示するものである。この方法によって、ポリヌクレオチドの機能が動物に治療効果を与える。本発明のこの局面について好ましい態様では、動物細胞は送達された機能性ポリヌクレオチドを一時的に発現する。他の好ましい態様では、動物細胞が機能性ポリヌクレオチドによって安定的に形質転換される。発明の詳細な説明粘膜組織は多くの感染性疾患が入り込む経路である。また粘膜組織は多くのアレルゲンの侵入及び刺激の主要部位でもある。本発明は、これらの医学的問題の両方に取り組むものである。さらに、本発明は、遺伝子治療のため、ある細胞にポリヌクレオチドを送達する新規な方法によって、他の重要な疾患及び症状へのアプローチを提供する。本発明は、粘膜性免疫にかかわる細胞を機能性ポリヌクレオチドの標的とすることによって、脊椎動物の粘膜性及び全身性免疫系の調節を可能にするものである。次にポリヌクレオチドはこれらの細胞の内部に取り込まれ、そこで発現する。ポリヌクレオチドの産物は、選択されたエピトープに対する体の正常な免疫応答の大きさを増強するか低下させることが可能であり、従って、あるアレルゲンに対する体の反応性を小さくし、または本発明で特に使用されるパラメーターによれば、ある病原体と闘うのにより有効である。このように免疫系の応答を調節する能力も、本発明と自己免疫疾患の治療及び予防とを関連づけるものである。粘膜結合蛋白とあるポリペプチドから成る組成物にはあることだが、特定のポリペプチドアレルゲンまたは免疫原を一回だけ送達するよりもむしろ、単一のポリヌクレオチドがその産物てある多数のコピーを発現することができるという事実から、本発明は、標的細胞をあるアレルゲンまたは免疫原により多く暴露することを可能にするものである。細胞内でのポリヌクレオチドの発現期間によって、及び活性なポリヌクレオチドであるポリペプチド産物が細胞内起源であることによって、粘膜細胞をペプチド産物に暴露する効果も改善される可能性がある。本発明の粘膜結合蛋白はＧＭ１が充分な濃度で表在するあらゆる細胞と実際に結合することから、本発明はさらに、遺伝子治療に適用するためのポリヌクレオチドの標的設定及び送達の新規な形態を形成する。治療効果のある遺伝子を送達する現在の形態は、ウイルスのカプシド、陽イオン性脂質、作製された生きているウイルス、及び生体外トランスフェクションにおおむね限定されている。ほとんどは疑わしい物質を注入する必要がある。しかし、本発明は、吸入、経口投与、点眼液または眼軟膏、点鼻液または点鼻軟膏、坐剤、浣腸剤、潅注剤、または経皮貼付剤、クリーム剤または軟膏による、治療効果のある遺伝子または他の機能性ポリヌクレオチドの投与を可能にする。従って、遺伝子治療に本発明を使用することは、粘膜組織及び神経組織の疾患に対して、及びＧＭ１受容体が表在する組織及び細胞へポリヌクレオチドを送達することによって治療できる他の疾患に対して、特に効果的である。本発明は特に、脊椎動物の種々の細胞に機能性ポリヌクレオチドを送達するための組成物を開示するものである。本発明は、結合蛋白と機能性ポリヌクレオチドを含む。組成物の蛋白成分には、多数の脊椎動物細胞の決定基を認識し、これに結合する性質がある。さらにこの蛋白成分には、動物の体内での迅速な分解から、自身及び関連する他の分子を保護する性質もある。また、結合蛋白には、機能性ポリヌクレオチドと関連して、ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するという重要な性質がある。本発明は、樹状組織、及び、胃腸管、生殖管、肺及び鼻洞を含む肺気道、及び目の結膜の組織を含む、いくつかの神経組織または粘膜組織のいずれかと特異的に結合するかまたは会合する能力のある、あらゆる蛋白の使用を意図するものである。限定されない例として、下記の蛋白は全て、粘膜細胞に結合することが知られている：少なくともコレラ毒素のサブユニットＢ、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンのサブユニットＢ、百日咳菌（Ｂordetella pertussis）毒素のサブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４及び／またはＳ５、ジフテリア毒素のフラグメントＢ及び志賀菌毒素または志賀菌様毒素の膜結合サブユニットを含む、細菌性毒素膜結合サブユニット。本発明の範囲内と考えられる他の粘膜結合サブユニットには、細菌性線毛状蛋白の大腸菌線毛（Ｅ．coli fimbria）Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／II（ＣＳ１、ＣＳ２及び／またはＣＳ３）、ＣＦＡ／IV（ＣＳ４、ＣＳ５及び／またはＣＳ６）、線毛Ｐなどが含まれる。本発明の範囲内と考えられる他の線毛には、百日咳菌線維状赤血球凝集素、コレラ菌毒素補調節（co regulate）ピリ線毛（ＴＣＰ）、マンノース感受性赤血球凝集素（ＭＳＨＡ）、フコース感受性赤血球凝集素（ＦＳＨＡ）などが含まれる。本発明の範囲内と考えられる、さらに他の粘膜結合分子には、インフルエンザ及びセンダイウイルス赤血球凝集素、及び免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、カルシウム依存性（Ｃ型）レクチン、セレクチン（selectin）、コレクチン（collectin）またはエスカルゴ（Ｈelix pomatia）赤血球凝集素を含む動物性レクチンまたはレクチン様分子を含む、ウイルス性接着蛋白が含まれる。粘膜結合サブユニットを有する植物レクチンには、コンカナバリンＡ、小麦胚芽凝集素、植物凝集素（フィトヘマグルチニン）、アブリン及びリシン（ricin）が含まれる。本発明では、神経細胞、粘膜細胞または他の脊椎動物細胞を特異的に認識し、結合する能力のある他の蛋白質が意図される。特に、ＧＭ１受容体などの特有の粘膜エピトープに対して親和性がある全ての免疫グロブリンは、本発明で意図される粘膜結合蛋白成分の一部である。加えて、粘膜細胞に結合する性質を有する、組換え蛋白、キメラ蛋白、または他の作製された蛋白質も、本発明の一部と意図する。本発明の好ましい態様では、粘膜結合蛋白は、コレラ菌（Ｖibrio cholerae ）のコレラ毒素である。この態様は、サブユニットＡ及びＢから成るホロトキシンの使用を意図し、また、単体または重合体の（結合）サブユニットＢモノマーのみから成る毒素のフラグメントの使用も意図するものである。本発明の態様では、さらに、組成物の蛋白成分として、ＣＴまたはその類似体の（活性）サブユニットＡが使用される。本発明のこの局面は、本発明の蛋白成分として、フラグメントＡ１のみ、またはフラグメントＡ２のみの使用を意図するものである。加えて、Ａ１のようにＡＤＰ−リボシル化活性があるかまたはその補助となるような、他の酵素、ホルモン、コファクター（補助因子）、または触媒も、本発明のこの局面についての態様である。本発明はさらに、天然であれ合成であれ、いずれかのサブユニットの全部または一部を含むコレラ毒素の誘導体の使用を意図する。本発明の別の態様では、その蛋白成分として、粘膜細胞を特異的に認識することができる免疫グロブリンを使用する。この局面について、さらに特別な本発明の態様では、免疫グロブリンはＧＭ１受容体を認識し、これに結合する。本発明は、粘膜細胞の他の決定基に対して誘導される（raised）免疫グロブリンも意図するものである。コレラ毒素の結合性及び毒性は当業者にはよく知られている。類似の結合性を有する他の蛋白質も多数知られている。さらに他の蛋白は作製することが可能である。同様に、ＧＭ１または粘膜細胞の他の特異的なエピトープに対する免疫グロブリンも誘導され得る。本発明のさらなる態様はポリヌクレオチド成分に関するものである。一つの態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、ＤＮＡはゲノム由来のものであってもよい。ゲノムＤＮＡは、イントロンを有するか有しないＤＮＡ、及びプロモーター配列、エンハンサー配列、及び他のシス作用構成分子を有するか有しないＤＮＡであってもよい。またゲノムＤＮＡは、実質的に組換えＤＮＡ技術によって操作されたゲノム由来のＤＮＡも包含する。ゲノムＤＮＡは、動物、植物、菌類、原生生物、またはバクテリア由来のものであってもよい。もしくは、ＤＮＡはｃＤＮＡであってもよい。本発明では、ｃＤＮＡは逆転写酵素によってｍＲＮＡから直接調製されてもよく、または、ＤＮＡが逆転写酵素を用いてｍＲＮＡから調製されず、むしろ、イントロンを除去し、操作の産物がｃＤＮＡの一般的特徴を有するような他の配列を加えるか除去するように操作する場合は、ｃＤＮＡ様分子であってもよい。加えて、本発明によれば、ＤＮＡは組換えＤＮＡであってもよい。本発明では、組換えＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術による操作を行ったいずれのＤＮＡであってもよい。そのような技術としては、ランダム突然変異誘発、特定部位の突然変異誘発、３’または５’エキソヌクレアーゼのトリミング（trimming）、リンカー連結、他のＤＮＡ配列との連結（ligation）、メチル化、脱メチル化、ポリアデニル化、外来フラグメントの挿入、及び内在性フラグメントの除去を挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明のＤＮＡは、ＤＮＡの任意のフラグメントであってもよい。任意のフラグメント形成のための最初のＤＮＡは、ＤＮＡの増幅サンプルから選択されてもよく、またはゲノムＤＮＡの任意のサンプルであってもよい。従って、本発明のポリヌクレオチド成分は、蛋白産物をコードする配列のみに限定されない。分子の塩基対の長さ及び分子の物理的構造に関係なく、あらゆる機能性ＤＮＡ配列が意図される。従って、ＤＮＡがプラスミドの形態であっても、スーパーコイルまたは開環状、コンカテマー、線形、一本鎖、または二本鎖であっても、本発明は、ポリヌクレオチド成分としてあらゆる機能性ＤＮＡ配列を意図するものである。本発明のこの局面について、好ましい態様では、ＤＮＡはプロモーター領域とコード領域を有するものである。プロモーターを有する場合、あらゆる起源のプロモーターが意図される。コード領域は特有のポリペプチドを特定することが可能である。そのようなコード領域はイントロンを含有していてもよく、またはイントロンのないものであってもよい。加えて、他の種類のコード領域を使用してもよい。他の種類のコード領域の限定されない例としては、アンチセンスメッセージをコードする配列または、ＤＮＡ結合蛋白または分子間相互作用を有する他の薬剤の、競争的標的を形成する配列が挙げられる。コード領域がポリペプチドを特定化する場合、本発明は、自然発生的及び組換え型の両方の、全ての形態のコード領域を意図する。配列は、ランダムなまたは特定部位の突然変異誘発に由来するものであってもよく、または非突然変異体の配列であってもよい。またこの配列は、らせん、シート、シグナルペプチド、変異ペプチド、標的ドメイン、保持（retention）ドメイン、疎水性ドメイン、親水性ドメイン、フィンガー、ジッパー、ループ、コイル、活性部位、結合部位、プロセシング部位、切断部位、オリゴマー化部分などの、種々の蛋白構造及びドメインを特定するものであってもよい。またこの配列は、公知または予想される蛋白配列の任意のフラグメントを特定するものであってもよい。本発明のこの局面をさらに具体的に表すものは、ウイルス由来のＤＮＡである。そのようなＤＮＡは、ＤＮＡウイルスから直接精製したものでもよく、またはウイルスの宿主から精製したものでもよく、宿主は真核生物であっても原核生物であってもよい。加えて、ウイルスのＤＮＡはインビトロで合成してもよい。本発明では、ウイルスのＤＮＡとして、配列が完全なものであっても配列の一部または一フラグメントのみが発現されていても、ウイルスのあらゆるＤＮＡ分子または、ウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡ配列由来のあらゆるＤＮＡ分子が包含される。本発明の別の好ましい態様では、ＤＮＡはアンチセンスメッセージをコードするものである。本発明では、アンチセンスメッセージは、別の状況では翻訳されるか翻訳を助ける他のポリヌクレオチド配列と相補的に結合する能力のある、あらゆるポリヌクレオチド配列である。この定義は、例えば、ＭＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、または他のＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子の領域、または他の活性ポリヌクレオチドと、アンチセンスハイブリッドを形成し得るポリヌクレオチドを包括するものである。このようなアンチセンスメッセージに必須の性質は、アンチセンスメッセージが、他のポリヌクレオチドと結合して、そのポリヌクレオチドの翻訳もしくは他の発現または活性を消失するか減衰する能力を有する配列であることである。アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡもまた本発明の範囲内である。本発明の実施に必要なＤＮＡの選択及び増幅技術はよく知られているので、当業者は、過度の実験作業を行うことなく、ここで論じる種類のＤＮＡポリヌクレオチドを調製及び使用するであろう。本発明の別の態様では、ポリヌクレオチド成分はＲＮＡである。本発明は、由来、構造、修飾、または精製方法にかかわらず、ＲＮＡの全ての機能的形態を意図するものである。好ましい態様では、このＲＮＡはＭＲＮＡである。本発明では、ＭＲＮＡは、翻訳されるかまたはポリペプチド産物を生成するために翻訳され得る、あらゆるＲＮＡである。従って、ＭＲＮＡは、真核生物または原核生物の細胞から精製されるか、インビトロで合成され得る。本発明は、例えば３’末端または５’ｍ⁷ Ｇキャップでのポリアデニル化などの、翻訳の効率に影響する修飾を受けている、または受けていない、ＭＲＮＡ分子を意図するものである。別の好ましい態様では、ＲＮＡはアンチセンスＲＮＡである。本発明では、アンチセンスＲＮＡは、別の状況では翻訳されるか翻訳を助ける他のポリヌクレオチド配列と相補的に結合する能力のある、あらゆるＲＮＡ配列である。この定義は、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、または他のＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子の領域、または他の活性ポリヌクレオチドと、アンチセンスハイブリッドを形成し得るポリヌクレオチドを包括するものである。ポリヌクレオチド活性によるアンチセンスの干渉またはポリヌクレオチド活性の減衰の理論は、当業者間ではよく知られており、通常の技術者は所望の効果を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドを設計、単離、または作製することができるであろう。本発明のこの局面をさらに具体的に表すものは、ウイルス由来のＲＮＡである。そのようなＲＮＡは、ＲＮＡウイルスから直接精製したものでもよく、またはウイルスの宿主から精製したものでもよく、宿主は真核生物であっても原核生物であってもよい。加えて、ウイルスのＲＮＡはインビトロで合成してもよい。本発明では、ウイルスのＲＮＡとして、配列が完全なものであっても配列の一部または一フラグメントのみが発現されていても、ウイルスのあらゆるＲＮＡ分子または、ウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡ配列由来のあらゆるＲＮＡ分子が包含される。別の態様では、ＲＮＡはリボザイムである。本発明では、リボザイムは、自触的であっても他触的であっても、触媒活性を有するあらゆるＲＮＡ分子である。ここでは、本発明組成物のポリヌクレオチド成分として、あらゆるリボザイムの使用が意図される。またＲＮＡの他の形態及び立体配座も本発明の一部である。限定されない例として、ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、自己アニーリング型、ループ型、またはコンカテマーであってもよい。加えて、本発明のポリヌクレオチド成分の態様にとして、自然界に存在するものであっても合成されたものであっても、上記していないあらゆる機能性ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明が意図するそのようなポリヌクレオチドの限定されない例として、リンカー、遺伝子、プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、サイレンサー（silencer）配列、転置因子、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ、ヌクレオチド類似体を含むＤＮＡ配列、ヌクレオチド類似体を含むＲＮＡ、種々のＤＮＡ配列の異種混合物、種々のＲＮＡ配列の異種混合物、及びＤＮＡ及びＲＮＡ両配列の異種混合物が挙げられる。本発明の組成物はいくつかの有用な剤形であってもよい。本発明は、組成物の全ての有用な剤形を意図するものである。一つの態様では、組成物は、吸入による送達に使用されるような、霧状の分散剤の形態である。霧状の分散剤は、本発明の組成物の液剤であってもよく、この組成物を含有する懸濁液であってもよい。霧状またはエアゾール状分散剤の代表的な担体としては、ミグリオール（Ｍig lyol；登録商標）、フリゲン（Ｆrigen；登録商標）（１１／１２／１１３／１１４）、及び緩衝生理食塩水が挙げられる。本発明組成物が体の他のＧＭ１細胞に循環血液によって吸収される場合と同様に、本発明組成物を吸入によって送達する場合には、粘膜組織の広い範囲に迅速に分散する効果がある。好ましい態様では、組成物は、直腸坐剤または膣坐剤の形態である。坐剤の不活性部分の処方について、代表的な担体としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、ココアバター、イムハウセン（Imhausen）Ｈ、及びウィテップゾル（Ｗitepsol；登録商標）Ｈが挙げられる。また、本発明組成物の送達に好適な他の坐剤処方も本発明の一部と考えられる。坐剤によって本発明組成物を送達する場合には、組成物を粘膜表面に接触させて近位の粘膜組織に放出する効果がある。また、本発明の組成物は、遠位の粘膜組織にも拡散によって到達する。加えて本発明は、液剤の形態の組成物も意図する。この液剤は、経口投与用、または点眼剤または点鼻剤の眼内または鼻内投与用であってもよく、または浣腸剤または潅注剤として使用してもよい。本発明の組成物が液剤の形態である場合、この液剤は組成物の溶液であっても懸濁液であってもよい。使用の目的に応じて、この溶液または懸濁液について、種々の好適な剤形がある。液剤の形態の本発明組成物を経口投与によって送達する場合は、胃腸管粘膜を組成物に暴露することが目的である。胃の極端なｐＨを阻止して安定化される好適な量を投与することによって、組成物は胃腸管の全ての部分、特に上部胃腸管に送達されるであろう。本発明は、液剤を経口投与する場合、組成物が胃腸管に沿って一様に、効果的に送達されるように組成物を安定化する、全ての手段を意図するものである。例えば、組成物が胃を通過した直後にのみ放出されるように、被覆または放出制御物質を使用することができる。液剤の形態で経口投与するために、組成物を微細な粒子で被覆するか、または懸濁液として投与してもよい。液体の形態の本発明組成物を点眼液によって送達する場合は、目の粘膜及び関連組織を組成物に暴露することが目的となるであろう。点眼液の代表的な液剤担体は、メトセル（Ｍethocel；登録商標）６５ＨＧ４０００を含む緩衝生理食塩水である。液剤の形態の本発明組成物を点鼻液によって送達する場合は、鼻洞の粘膜及び関連組織を組成物に暴露することが目的となるであろう。代表的な点鼻液の液剤担体は、種々の形態の緩衝生理食塩水である。さらに本発明の態様として、眼、鼻、膣、または直腸投与用のクリームの形態の組成物が挙げられる。本発明の組成物をクリームの形態で所定の粘膜組織に適用する場合は、組成物を組織に有効に送達するのに充分な時間、組成物を粘膜組織に接触させることが目的である。また、クリーム剤には、組成物送達の障害である粘液を可溶化するか、もしくは粘液の効果を減じる性質もある。また、デオキシリボヌクレアーゼ溶液などの粘液溶解剤をさらに加えてもよい。代表的なクリーム剤及び軟膏に使用される担体は、パラフィン油、ワセリン、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール及びメトセル（登録商標）である。また、本発明の態様として、樹状細胞及び他の細胞への局所適用または経皮送達（transdermal delivery）に適した組成物が挙げられる。考えられる剤形には、経皮貼付剤、クリーム剤、及び軟膏が含まれる。経皮送達は、組成物を迅速にまたは経時的に徐々に、組織に近位の細胞から遠位の細胞まで放出することを目的とする。そのような細胞としては、樹枝状突起及び他の神経組織、血液細胞、及び平滑筋及び横紋筋細胞が挙げられる。本発明の別の態様では、組成物は、経口投与用の固形の錠剤またはカプセル剤の形態である。組成物をこの形態で使用する場合には、小腸粘膜を組成物に暴露するために組成物を胃腸管に送達する効果がある。従って、組成物を小腸粘膜へ最適に送達するために、この錠剤またはカプセル剤は、胃の極端なｐＨから組成物を保護するのに効果的な物質、または組成物を経時的に放出するのに効果的な物質から成るものであってもよい。酸抵抗性の錠剤及びカプセル剤に使用される代表的な腸溶コーティングには、酢酸フタル酸セルロース、プロピレングリコール、及びソルビタンモノリエート（monoleate）が含まれる。また、本発明は、粘膜結合蛋白とポリヌクレオチドとが組成物を形成し得る全ての方法を意図するものである。好ましい態様では、ポリヌクレオチドと蛋白とを意図的に共有結合させることなく、ポリヌクレオチドと蛋白を混合する。この態様では、蛋白とポリヌクレオチドとの会合を強め、かつ安定化するために、混合物中に他の成分が含まれていてもよい。蛋白成分とポリヌクレオチド成分との適当な混合割合は、混合物の所望の効果に合わせて、経験的に容易に決定することができる。結合蛋白とポリヌクレオチドを安定であるが非共有結合的につなぐ現在の方法には、ポリカチオン性ポリリジン法（polycationic polylysine method）及びカチオン性リポソーム法が含まれる。ポリリジン法では、初めに結合蛋白をポリリジン（polylysine）に化学的に結合させる。結合蛋白と結合したポリカチオン性ポリリジンを、次にポリヌクレオチドと混合する。ポリリジンと核酸との間の静電気的相互作用によって、容易に解離せず、従って標的細胞への送達に好適な、安定な組成物が形成される。下記の２件の文献は引用することによって本発明に取り入れられる：Ｗu,Ｇ.Ｙ.,Ｗilson,Ｊ.Ｍ.,Ｓhalaby,Ｆ.,Ｇrossman,Ｍ.,Ｓh afritz,Ｄ.Ａ.,and Ｗu,Ｃ.Ｈ.(1991)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.266:14338-14342;Ｃhen, Ｊ.,Ｇamou,Ｓ.,Ｔakayanagi,Ａ.,Ｓhimizu,Ｎ.(1994)ＦＥＢＳＬett.338:167- 169。この技術の限定されない別の例として、陽性に荷電した脂質を使用してポリヌクレオチドと静電気的に相互作用する能力のあるリポソームの形成が挙げられる。ポリヌクレオチドを脂質と混合すると、リポソームが形成される。次にリポソームの二元機能性成分（bifunctional component）が本発明の結合蛋白の誘導体と化学的に結合する。組成物は、このようにポリヌクレオチドと蛋白との間に共有結合を全く形成せずに、標的細胞にポリヌクレオチドを送達することができる。下記の文献は引用することによって本発明に取り入れられる：Ｍizuno,Ｍ., Ｙoshida,Ｊ.,Ｓugita,Ｋ.,Ｉnoue,Ｉ.,Ｓeo,Ｈ.,Ｈayashi,Ｙ.,Ｋoshizaka,Ｔ. ,and Ｙagi,Ｋ.（1990）Ｃancer Ｒes.50:7826-7829。別の態様では、粘膜結合蛋白とポリヌクレオチドは互いに化学的に結合する。様々な結合が考えられる。限定されない例として、蛋白のカルボキシ末端またはアミノ末端で、または蛋白内のアミノ酸残基のＲ基で結合する。ポリヌクレオチドは５’末端または３’末端で結合してもよく、またはいくつかのポリヌクレオチドの立体配座によって、ポリヌクレオチド配列と内部で結合してもよい。本発明の別の好ましい態様では、粘膜結合蛋白とポリヌクレオチドとを一緒にカプセルに封入する。カプセル封入手段によって、組成物の成分間の会合を維持し、また一方で、胃酸、消化酵素、過剰の粘液、またはこの他の、好ましい粘膜組織へ最適に送達する際の障害から、組成物を保護するという、二つの役割を果たすことができる。当業者間では、多種多様のカプセル封入手段がよく知られている。本発明は、特別な適用に好適なあらゆるカプセル封入手段の使用を意図する。本発明の別の局面は、動物の免疫性を調節する方法である。本発明では、免疫性の調節には、免疫応答を増強または低下させることが含まれ、または後述の通り、同時に増強及び低下させることも含まれる。この方法の第一段階では、粘膜結合蛋白と免疫原をコードするポリヌクレオチドとを組み合わせて動物に投与する。第二段階は、動物においてポリヌクレオチドを発現させ、これによって動物はポリヌクレオチドの産物に対して免疫応答を起こす。本発明のこの局面について、好ましい態様では、調節によって動物の免疫応答を増強する。増強のための調節は、その免疫応答が、別の様式で起こる免疫応答より迅速であることが特徴となり得る。また、抗原に暴露した後、免疫グロブリンの力価が上昇することも特徴となり得る。他の特徴としては、病原体に対する抵抗性が上がること、病原体による感染期間が別な様式で起こる感染よりも短くなること、関連の病原体及び抗原に対する反応性が上昇すること、または抗原に対する炎症応答が増すことが挙げられる。本発明では、増強される免疫応答は、粘膜性または全身性であってもよく、または粘膜性と全身性の両方であってもよい。ＣＴなどの粘膜結合蛋白は、免疫応答を起こすポリヌクレオチドの送達に効果的であることが知られている。これらの蛋白は、抗原をコードするポリヌクレオチドの送達にも同様に効果的に使用される。上記した免疫応答増強のインディケーターに加えて、粘膜性の免疫応答の増強では、ｓｌｇＡを含む中和抗体の産生が増加することが特徴となり得る。さらに、免疫ブロブリンＩｇＥ、ＩｇＧ産生の増加、及び細胞媒介性免疫の増強が特徴となり得る。上記した免疫応答増強のインディケーターに加えて、全身性の免疫応答の増強では、免疫グロブリンＩｇＧを含む中和抗体の産生が増加することが特徴となり得る。さらに、免疫ブロブリンＩｇＡ産生の増加、及び細胞媒介性免疫の増強が特徴となり得る。本発明のこの局面について、ほかの態様では、避妊に対する免疫応答を増強する。これは、精子細胞に独特の決定基に対する特異的な獲得粘膜性免疫を意図するものである。そのような免疫が起こった場合、そうして免疫された動物は精子細胞の粘膜組織を除くように反応し、動物の卵子に受精可能な活動的な精子の数が減少するであろう。本発明の別の好ましい態様では、調節によって動物の免疫応答を低下させる。免疫応答を低下させるための調節は、その免疫応答が、別の様式で起こる免疫応答より小さいことが特徴となり得る。また、抗原に暴露した後、免疫グロブリンの力価が低下することも特徴となり得る。他の特徴としては、アレルゲンまたは関連する病原体または抗原の寛容性が上がること、アレルギー症状が減じられるかまたは消失すること、炎症性サイトカインのダウンレギュレーションが起こることが挙げられる。本発明では、低下させる免疫応答は、粘膜性または全身性であってもよく、または粘膜性と全身性の両方であってもよい。本発明の好ましい態様では、アレルゲンに対して脱感作させるために免疫応答を低下させる。本発明は様々な程度の脱感作を意図する。アレルゲンに対する脱感作の一例として、経口寛容性の現象がよく知られている。典型的な経口寛容性では、比較的大量の特別な物質、例えばアレルゲンに暴露した動物は、一定期間を越えるとにアレルゲンに対する免疫学的感受性が低下する。このように発現する経口寛容性は、粘膜性免疫系及び全身性免疫系の両方に現れる。経口寛容性を発現するのに必要な投与量は、アレルゲンと結合した粘膜結合蛋白を使用することによって、かなり減らすことができる。ヒトガンマグロブリン（ＨＧＧ）を単純経口投与（給餌）によってまたは抗原に結合した粘膜結合蛋白（ＣＴＢ）を使用してマウスに送達する実験において、遅延型過敏症（ＤＴＨ）（後期（late phase））に対して同レベルの寛容性を得るのに必要な抗原の量は、ＣＴＢに結合した抗原より単純給餌の方が約２００〜６２５倍大きかった。さらに、単純給餌による送達は、ＤＴＨ応答の前期を短縮する効果はなく、一方、粘膜結合蛋白に結合させ、比較的少量の投与量を送達した場合は、完全に効果があった。下記の文献は引用することによって本発明に取り入れられる：Ｓun，Ｊ.- Ｂ.,Ｈolmgren,Ｊ.,and Ｃzerkinsky,Ｃ.(1994)Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 91:10795-10799。さらに本発明は、蛋白アレルゲンまたは免疫原自身を送達せずに、粘膜性免疫系がいくつかのアレルゲンまたは他の免疫原に対する身体の免疫応答を減じる能力を利用する。むしろ本発明では、ポリヌクレオチドの産物または活性が身体の免疫応答を低下させることができるように、活性なポリヌクレオチドを粘膜に送達する。重要なことは、ポリヌクレオチドはそれ自身は免疫原、抗原、アレルゲン、またはハプテンではないが、代わりに、所望の免疫応答の低下に最終的に影響するのは、ポリペプチド産物であるか、ポリヌクレオチドの他の活性体であるということである。組成物の特別の蛋白成分は、免疫応答を増強または低下させる調節に大きな効果があることから、本発明は、粘膜性または全身性のいずれかのタイプの免疫性の調節は勿論、免疫応答を増強または低下させる、いずれかの種類の調節ができる組成物を意図するものである。別の好ましい態様では、臓器及び組織移植に対する寛容性を形成するために免疫応答を低下させる。ＭＨＣクラスＩの蛋白の外因性非自己シグナルには、免疫応答を刺激する能力があるので、移植された臓器及び組織について、認識された非自己のエピトープに関連する免疫応答を消失させるか、または少なくとも減じるために、それらの遺伝子は本発明の組成物に使用する候補となる。限定されない例として、ＭＨＣのＩ蛋白をコードする遺伝子を粘膜結合蛋白と組み合わせて粘膜に送達すると、粘膜細胞において遺伝子は局所的に発現する。非自己エピトープを含む遺伝子産物は、通常、重要な免疫応答を刺激する。代わりに、その発現は粘膜細胞において生じる性質があることから、遺伝子はエピトープに対する感受性を低下させ、感受性の低下が全身性及び粘膜性の両方の免疫系でみられる。その直後に、動物に同一のエピトープが表在する移植物を移植すると、移植された組織に対する免疫応答は、別な方法で移植された場合よりもかなり弱い。従って、被移植患者に免疫抑制剤を投与する必要性は勿論、拒絶反応も減少する。本発明のさらに好ましい態様では、自己免疫疾患の治療に対する免疫応答を低下させる。外因性非自己エピトープは、免疫系によって認識され攻撃を受ける唯一の決定基ではない。免疫系のある異常によって、動物自身の細胞及び組織に対する誤った免疫反応が起こり、自己を非自己として誤って認識する。この現象が、例えば全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosis）、Ｉ型糖尿病、リウマチ性関節炎、及び多発性硬化症などの、自己免疫疾患の原因である。このような疾患では、自己細胞の誤認された決定基に対して免疫系を脱感作させることによって、疾患が消失または改善する。従って、本発明は、本発明の組成物を自己免疫疾患を処置または治療するために使用することを意図するものである。また、本発明は、疾患の病原体のあるエピトープに対する免疫化を、病原体の他のエピトープの脱感作と同時に行うことを意図する。免疫系において、このように同時にアップレギュレーションとダウンレギュレーションを行う効果によって、一方で非生産性側副炎症が原因の「バイスタンダー組織（bystander tissue ）」のダメージを軽減しながら、結局は病原体を制御または消失するために、効果的な免疫防御が病原体に集中するであろう。異なるエピトープが一方で細胞媒介性免疫応答を刺激し、他方で有害な炎症反応を刺激する場合、その疾患は、一方のエピトープに対して上昇した感受性に対する免疫応答と、他方のエピトープに対する非常に小さい応答性に対する免疫応答とを同時に調節することによって、最善の治療がなされる。本発明によれば、免疫応答の調節は、病原体またはアレルゲンに暴露する前に実施することができる。暴露前に調節する本発明の適用について、限定されない例としては、予防接種、移植前脱感作、及び予防的自己免疫抑止（preemtive au toimmune deterrence）が挙げられる。病原体が判っていて、この病原体に対する予防接種をしようとする場合、本発明の組成物の一部として、病原体のエピトープをコードする遺伝子を送達する。この遺伝子は粘膜細胞内部に取り込まれ、そこで発現し、その結果粘膜性及び全身性免疫系の両方で免疫が増強される。続いて、全身性免疫と同様に強力で特異的な粘膜性免疫に、接触点で病原体が暴露される。このようにして疾患誘起剤としての病原体の効果が低下・減少する。また本発明は、病原体またはアレルゲンに暴露した後に実施される調節も意図するものである。暴露後に調節する本発明の適用について、限定されない例としては、慢性感染に対する暴露後免疫化、ガン細胞に対する自己免疫反応を形成するための免疫化、アレルギーに対する脱感作治療、及び自己免疫疾患において攻撃を受けるエピトープに対する治療的脱感作が挙げられる。自己免疫疾患と診断され、その原因が判明している場合、免疫系によって非自己と誤認されているエピトープをコードするポリヌクレオチドを、ＣＴＢと複合体を形成させるか、または結合させる。組成物を好適な投与量、動物に与え、その結果、自己免疫疾患のエピトープに対する粘膜性及び全身性免疫を低下または消失させる。従って、本発明では、暴露の前でも後でも、及び処置される動物を免疫するにせよ脱感作するにせよ、免疫応答を調節するための本発明組成物の全ての使用が具体化される。本発明の組成物は、種々の経路で投与することができる。一つの態様では、投与形態は鼻経由のものである。本発明組成物が鼻に投与される場合は、鼻及び鼻洞の粘膜及び関連組織を組成物に暴露することを目的とする。あるいは、本発明の態様として、吸入によって本発明組成物を投与する形態が挙げられる。本発明組成物が動物の他のＧＭ１細胞に循環血液によって吸収される場合と同様に、吸入によって本発明組成物が投与される場合には、組成物が粘膜組織の広い範囲に迅速に分散する効果がある。さらに本発明の態様として、組成物の眼科的投与が挙げられる。本発明組成物を眼科的に投与する場合には、目の粘膜及び関連組織を組成物に暴露することを目的とする。好ましい態様では、投与形態は経口投与である。本発明組成物を経口的に投与する場合には、胃腸管の粘膜を組成物に暴露する効果がある。好適な量を投与することによって、組成物が胃腸管の全ての部分に送達される。本発明は、液剤の経口投与の形態、固形の錠剤、またはカプセルの形態のいずれであっても、経口送達のあらゆる手段を意図するものである。さらに好ましい態様では、本発明の組成物は直腸または膣内に投与される。本発明組成物を直腸または膣内に投与する場合には、粘膜表面を組成物に接触させて、近位の粘膜組織に組成物を放出する効果がある。また、遠位の粘膜組織にも、拡散によって本発明の組成物が到達する。本発明の別の局面は、あらゆるＧＭ１動物細胞にポリヌクレオチドを送達するために機能する組成物である。組成物の結合蛋白成分がＧＭ１受容体に対する親和性を有する場合、この組成物はＧＭ１受容体が表在するあらゆる細胞に送達されるであろう。ＧＭ１ガングリオシドは、体中の細胞の原形質膜中に存在する。しかし、異なる細胞型の原形質膜中のＧＭ１濃度には非常に差がある。ある臨界的なレベルのＧＭ１濃度を有する細胞型においてのみ、ＧＭ１は実際にＣＴＢに結合する受容体として働く。異なる結合蛋白は、異なる方法でＧＭ１またはＧＭ１の集合体と相互に作用する。この事実から、本発明を実施する者は、粘膜細胞を治療用遺伝子の限定的な標的とすることのできる遺伝子治療組成物、または膜内である濃度のＧＭ１をプロセシングする他の細胞をより一般的に標的とすることのできる遺伝子治療組成物を設計することが可能になる。従って、治療用遺伝子を送達するこの形態によって、これまで利用できなかった標的細胞を選択する際の、精度の範囲が拡大する。本発明は、ＧＭ１細胞と特異的に結合するか会合する能力のあるあらゆる蛋白質の使用を意図するものである。本発明では、ＧＭ１細胞は、その原形質膜中にガングリオシドＧＭ１を有する脊椎動物の細胞である。既に粘膜結合蛋白として記載した多数の蛋白質は、ＧＭ１受容体を介して粘膜と結合することが知られているかそう信じられており、従って、本発明のこの局面においても好適に使用される。同様に、上述した全ての種類のポリヌクレオチドもまた、本発明のこの局面に好適であり、本発明のこの局面はそれらを意図するものである。本発明の組成物が送達される細胞は、粘膜細胞のみに限定されない。他の多くの細胞に様々な濃度でＧＭ１受容体が表在する。例えば、神経細胞はＧＭ１を高濃度含むことが知られている。表面のＧＭ１の濃度が低い他の細胞は、本発明の組成物を送達するために、ＧＭ１とプレインキュベーションし、ある時間安定化し、最後に本発明組成物の投薬するという処理を施してもよい。異なる膜成分を有する細胞では、ＧＭ１に対する親和性及びＧＭ１の取り込み速度の程度が異なる。従って、外因性ＧＭ１の濃度及び安定化時間と共に、インキュベーションの時間及び他の条件を調整し、標的細胞によるＧＭ１の取り込みの効果を調節し、それによって送達される組成物の最終的な投与量を調節するような方法で、本発明を実施することができる。このように、本発明組成物の効果的送達を増強するために、あらゆる細胞型に潜在的に、選択的な前処理を施すことができる。同様に、ＧＭ１受容体を遮断し、本発明の組成物に対するＧＭ１濃度が高い膜の親和性を減じるために、抗ＧＭ１抗体を使用することができる。本発明は、所望の結果を得るために、ＧＭ１に対する抗体またはＧＭ１そのものを、単独または組み合わせた前処理を行うことを考慮するものである。両形態の前処理を行う限定されない例として、本発明の組成物を送達する最も好ましい標的細胞であるＧＭ１濃度が低い細胞を処理するために、細胞の二つの主要な亜集団から成る組織を選択する。初めに、組織全体を好適な濃度の抗ＧＭ１ＩｇＧを含む溶液で処理する。ＩｇＧはＧＭ１濃度が高い細胞の膜において、大部分またはほとんど大部分の到達可能なＧＭ１を占有する。過剰の抗体を洗浄して除去した後、ＧＭ１を組織に加える。拡散勾配に従って、ＧＭ１は、ＧＭ１が高濃度の膜内よりも、ＧＭ１が低濃度の膜内に浸入し、このように拡散したＧＭ１はほとんど抗体による遮断を受けない。浸入しなかったＧＭ１を除去するために二回目の洗浄を行い、組織に本発明の組成物を投与する準備が整い、活性なポリヌクレオチドが本来最もＧＭ１濃度が低い細胞に特異的に送達される。本発明の遺伝子治療の局面は、ＧＭ１−結合蛋白と機能性ポリヌクレオチドとを組み合わせて動物に投与し、次にポリヌクレオチドを動物細胞において発現させる、動物における遺伝子治療のための方法を開示するものである。この方法によって、ポリヌクレオチドの機能が動物に治療効果を与える。本発明のこの局面について好ましい態様では、動物細胞は送達された機能性ポリヌクレオチドを一時的に発現する。一時的な発現の特徴は、発現が開始しても結局停止することである。ある期間発現することが、細胞内での活性なポリヌクレオチドの安定性の機能である。ポリヌクレオチドの安定性に影響する因子としては、ポリヌクレオチドの性質及び構造、ポリヌクレオチドの細胞の一部の位置、ポリヌクレオチドの局所領域における安定化蛋白または溶解酵素の利用性、及び、温度、ｐＨ、及びいくつかのイオンの濃度などの他の物理的パラメーターが挙げられる。送達された遺伝子産物またはポリヌクレオチドの活性は長期間にわたると悪影響を及ぼすこともあるので、適用される多くの場合で一時的な発現が好ましい。従って、このような場合、安定ではなく、一時的に発現すると思われるポリヌクレオチドが適当である。宿主細胞でより安定または不安定になるポリヌクレオチドが当業者には知られており、通常の技術を有する者は、本発明を特別に実施するために適当なポリヌクレオチドを選択することができるであろう。他の好ましい態様では、動物細胞が機能性ポリヌクレオチドによって安定的に形質転換される。安定な形質転換の特徴は、宿主細胞のゲノムにポリヌクレオチドが実際に組み込まれ、続いて細胞の寿命の期間を通して、ポリヌクレオチドの遺伝子または他の活性が発現することである。本発明のいくつかの使用では、ポリヌクレオチドによる細胞の安定な形質転換が必要となるかまたは、安定な形質転換の利益を得るであろう。例えば、欠如しているか非機能性の遺伝子を置換する、本発明に包含される治療の場合、細胞の安定な形質転換が潜在的に欠点を治療し、ポリヌクレオチドの一時的な発現には継続した治療が必要であろう。ポリヌクレオチドを単独または組み合わせて宿主細胞のゲノム中により安定的に組み込むと思われるポリヌクレオチドの特徴は、当業者には知られている。当業者は、宿主細胞の安定的な取り込み及び形質転換の可能性を最大にするために、送達されるポリヌクレオチドの所望の特徴を選択することができる。実施例１．組成物の形成コレラ毒素のサブユニットＢの蛋白質（ＣＴＢ）を、上述の通り、ポリ−Ｌ− リジンと結合させる。下記の文献は引用することによってここに取り入れられる：Ｊung，Ｇ.，Ｋohnlein，Ｗ.，and Ｆiders，Ｇ.（1981）Ｂiochem．Ｂiophys ．Ｒes．Ｃommun.101:599-606。このＣＴＢ蛋白を、ポリ−Ｌ−リジンの１５４倍過剰の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを使用し、ｐＨ７．４で、７倍モル過剰のポリ−Ｌ−リジンと反応させる。２４時間後、共役した生成物（conjugate product）をクロマトグラフィーで精製し、引用によってここに取り入れられる下記の文献に記載の通り、ゲル遅延アッセイ（gel retardation assay）によってプラスミドＤＮＡで滴定する：Ｗu．Ｇ.Ｙ.，and Ｗu，Ｃ.Ｈ. （1987）Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．262:4429-4432。次に、ＤＮＡと蛋白の複合体を使用して、好ましい送達形態の組成物を調製する。実施例２．免疫性の調節：増強上述したポリリジン法によって、強力なプロモーター及び、トラコーマクラミジア（Ｃhlamydia trachomatis）のＡ８及びＶＤＩＶ蛋白のエピトープをコードするコード領域を含むＤＮＡ配列と、ＣＴＢとの複合体を形成させる。アジュバントとして、組成物中に少量のコレラ毒素Ａ（ＣＴＡ）を加える。引用によってここに取り入れられる下記の二件の文献を参照のこと：Ｃzerkinsky，Ｃ. ， and Ｈolmgren，Ｊ.（1995）Ｔhe Ｉmmunologist 3/3:97-103; and Ａll en，Ｊ.，Ｌocksley，Ｒ.Ｍ.，and Ｓtephens，Ｒ.Ｓ．(1991)Ｊ.Ｉmmunol．147 :674-679。クラミジアに感染していないボランティアに、膣坐剤によってこの組成物を一度投与する。クラミジアに感染していない対照群には、プラセボの坐剤を投与する。一週間間隔で６回、両群の被験者から血清及び膣粘膜のサンプルを採取する。血清サンプルのＥＬＩＳＡアッセイによって、Ａ８／ＶＤＩＶに対して特異的なＩｇＧが処置群で存在し、対照群では存在しないことが示される。粘膜サンプルについての同様のアッセイでは、処置群ではＡ８／ＶＤＩＶに特異的なｓｌｇＡの力価が高く、一方対照群ではそのような反応が見られないことが示される。両群について、その後の追跡研究によって、対照群に比べて治療群ではクラミジア感染症の発症率が低いことが示される。実施例３．免疫性の調節：炎症反応の低下上述したポリリジン法によって、強力なプロモーター及び、ＣＴＢとトラコーマクラミジアの熱ショック蛋白質（ＨＰＳ５７）の融合物をコードするキメラコード領域を含むＤＮＡ配列と、ＣＴＢ蛋白との複合体を形成させる。クラミジア感染症及び骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ）を罹患する患者に、膣坐剤によってこの組成物を一度投与する。同様に感染症を罹患している対照群には、プラセボの坐剤を投与する。一週間間隔で６回、クラミジアの全溶解産物を使用して、両群の被験者の前腕で、スクラッチテスト及びタイン試験を実施する。また両群の被験者でＰＩＤ症状の重さを調査する。処置群では、スクラッチテスト及び尖叉試験（ tine test）において感受性が著しく低下し、ＰＩＤ症状も同様に減少することが示される。対照群ではこのような結果は見られない。実施例４．免疫性の調節：炎症性反応の同時の低下と増強実施例２で得られたＤＮＡ構造物及び実施例３で得られたＤＮＡ構造物を両方含有する膣坐剤を、クラミジアに感染しているボランティアに投与する。同様に感染している対照群には、プラセボの坐剤を投与する。処置群の被験者では、ＰＩＤの症状が減少し、クラミジアに対する細胞媒介性免疫が増強する。粘液サンプルではＡ８／ＶＤＩＶに対するｓｌｇＡ及びＩｇＧの力価が高いが、クラミジアの全溶解産物を使用したスクラッチテスト及び尖叉試験にはほとんど反応しない。従って、ＰＩＤの特徴である、側副の「バイスタンダー組織」のダメージが低減する。対照群では、これに匹敵する結果は得られない。実施例５．臓器移植寛容性哺乳類のプロモーターの制御下で、種々のＭＨＣ−１蛋白の一つをコードするＤＮＡをそれぞれ含む、一組の組換えＤＮＡプラスミドを作製する。得られるプラスミドの蓄えは、特徴を調べて目録を作成し、数バッチの各プラスミドは、上述のポリリジン法を使用してＣＴＢと複合体を形成させ、臓器寛容性治療用の蓄えを作る。臓器提供者をスクリーニングし、提供者のＭＨＣ−１の遺伝子型を調べる。スクリーニングの結果を、上述の蓄えから選択した適当な寛容化組成物と照合する。提供された臓器を移植しようとする患者には、投与量の寛容化組成物を、吸入による霧状分散剤として、直腸坐剤として、及び腸溶錠として経口的に投与する。患者は外生のＭＨＣ−１蛋白に対する「経口寛容性」を迅速に獲得し、提供された臓器に対する非自己認識が大きく低下する。粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）での非自己ＭＨＣ−１遺伝子がある期間、充分に発現することから、遺伝子ではなくＭＨＣ−１蛋白自身を使用した経口寛容化のためのあらゆる慣用的なアプローチによる場合よりも、後天的な寛容性が長く継続する。実施例６．自己免疫疾患の治療糖尿病の自己免疫形態の患者に、強力なウイルス性プロモーターの制御下で、ＣＴＢ及びヒトインシュリンを両方コードするキメラ遺伝子から成る組成物を経口投与するが、ここでは上述のポリリジンによって、キメラ遺伝子のＤＮＡはＣＴＢ蛋白と複合体を形成させた。キメラ遺伝子は小腸粘膜に送達され、そこで遺伝子がＭＡＬＴの細胞によって取り込まれる。この細胞は、ＣＴＢ及びインシュリンから成るキメラ融合蛋白を発現し、インシュリンエピトープに対する粘膜性及び全身性免疫系が組み合わされて寛容化される。インシュリンに対する患者の自己免疫は低下し、糖尿病の進行は遅延する。長期試験に参加した他の非糖尿病患者にもこの組成物を投与する。このボランティアではその後の糖尿病の発症率が、他の同様の対照群よりも低い。実施例７．遺伝子治療ＬＴＢと、すい嚢胞性線維症（ＣＦ）を引き起こす突然変異遺伝子に対応する非突然変異のｍＲＮＡとから成る組成物を調製する。この組成物をＣＦ患者に１日２回、経口投与及び吸入によって投与する。ＣＦ患者に不足している酵素が効率的かつ一時的に作られる肺及び胃腸管の粘膜に組成物が局在化する。こうして治療される患者は、ＣＦの症状がかなり低減する。

Claims

【特許請求の範囲】１．脊椎動物の粘膜組織の決定基に対して親和性を有する粘膜結合蛋白、及び前記結合蛋白と会合するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの粘膜送達のための組成物。２．粘膜結合蛋白が、ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴ、細菌性線毛状蛋白、動物性レクチン、植物性レクチン、及びレクチン様蛋白からなる群より選択される、請求の範囲第１項に記載の組成物。３．粘膜結合蛋白が、コレラ毒素及びその誘導体からなる群より選択される、請求の範囲第１項に記載の組成物。４．粘膜結合蛋白が抗体である、請求の範囲第１項に記載の組成物。５．抗体がＧＭ１受容体に対するものである、請求の範囲第４項に記載の組成物。６．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求の範囲第１項に記載の組成物。７．ＤＮＡがゲノム由来のものである、請求の範囲第６項に記載の組成物。８．ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求の範囲第６項に記載の組成物。９．ＤＮＡが組換え型である、請求の範囲第６項に記載の組成物。１０．ＤＮＡがプロモーター領域及びコード領域を含有する、請求の範囲第６項に記載の組成物。１１．ＤＮＡがアンチセンスメッセージをコードする、請求の範囲第６項に記載の組成物。１２．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求の範囲第１項に記載の組成物。１３．ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求の範囲第１２項に記載の組成物。１４．ＲＮＡがアンチセンスである、請求の範囲第１２項に記載の組成物。１５．ＲＮＡがリボザイムである、請求の範囲第１２項に記載の組成物。１６．霧状分散剤の形態である、請求の範囲第１項に記載の組成物。１７．坐剤の形態である、請求の範囲第１項に記載の組成物。１８．粘膜結合蛋白及びポリヌクレオチドが混合物の形態で存在する、請求の範囲第１項に記載の組成物。１９．粘膜結合蛋白とポリヌクレオチドとが化学的に結合している、請求の範囲第１項に記載の組成物。２０．粘膜結合蛋白及びポリヌクレオチドが一緒にカプセルに封入されている、請求の範囲第１項に記載の組成物。２１．粘膜結合蛋白と免疫原をコードするポリヌクレオチドとを組み合わせて動物に投与すること、及び前記動物中で前記ポリヌクレオチドを発現させてそれによって前記動物が前記ポリヌクレオチドの産物に対する免疫応答を起こすことを含む、動物の免疫性を調節する方法。２２．前記調節が免疫応答を増強することである、請求の範囲第２１項に記載の方法。２３．前記増強する免疫応答が粘膜性である、請求の範囲第２２項に記載の方法。２４．前記増強する免疫応答が全身性である、請求の範囲第２２項に記載の方法。２５．前記免疫応答の増強が避妊のためである、請求の範囲第２２項に記載の方法。２６．前記調節が免疫応答を低下させることである、請求の範囲第２１項に記載の方法。２７．低下させる免疫応答が粘膜性である、請求の範囲第２６項に記載の方法。２８．低下させる免疫応答が全身性である、請求の範囲第２６項に記載の方法。２９．免疫応答の低下がアレルゲンに対する脱感作のためである、請求の範囲第２６項に記載の方法。３０．免疫応答の低下が臓器及び組織移植の寛容化のためである、請求の範囲第２６項に記載の方法。３１．免疫応答の低下が自己免疫疾患の治療のためである、請求の範囲第２６項に記載の方法。３２．選択されるエピトープに対する暴露前の予防接種のための、請求の範囲第２１項に記載の方法。３３．選択されるエピトープに対する暴露前の脱感作のための、請求の範囲第２１項に記載の方法。３４．選択されるエピトープの免疫認識を暴露後に増強するための、請求の範囲第２１項に記載の方法。３５．選択されるエピトープに対する暴露後の脱感作のための、請求の範囲第２１項に記載の方法。３６．投与形態が鼻からのものである、請求の範囲第２１項に記載の方法。３７．投与形態が経口的である、請求の範囲第２１項に記載の方法。３８．投与形態が直腸からのものである、請求の範囲第２１項に記載の方法。３９．投与形態が膣からのものである、請求の範囲第２１項に記載の方法。４０．投与形態が吸入である、請求の範囲第２１項に記載の方法。４１．投与形態が眼科的なものである、請求の範囲第２１項に記載の方法。４２．ＧＭ１受容体に対して親和性を有する結合蛋白、及び前記結合蛋白と会合するポリヌクレオチドを含む、ＧＭ１動物細胞にポリヌクレオチドを送達するための組成物。４３．結合蛋白が、ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴ、ＬＴＢ、細菌性線毛状蛋白、動物性レクチン、植物性レクチン、及びレクチン様蛋白からなる群より選択される、請求の範囲第４２項に記載の組成物。４４．結合蛋白が、コレラ毒素及びその誘導体からなる群より選択される、請求の範囲第４２項に記載の組成物。４５．結合蛋白が免疫グロブリンである、請求の範囲第４２項に記載の組成物。４６．ＧＭ１結合蛋白と機能性ポリヌクレオチドとを組み合わせて動物に投与すること、及び前記動物の細胞中で前記ポリヌクレオチドを発現させてそれによって前記ポリヌクレオチドの機能が前記動物に治療効果を与えることを含む、動物の遺伝子治療の方法。４７．前記動物の前記細胞が前記機能性ポリヌクレオチドを一時的に発現することによる、請求の範囲第４６項に記載の方法。４８．前記動物の前記細胞を前記機能性ポリヌクレオチドによって安定的に形質転換する、請求の範囲第４６項に記載の方法。