JP2001504702A - ストレスタンパク質を含む組成物を使用する免疫応答 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）において抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは、抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するのにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。特定の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてCTL応答を誘導するワクチンおよび組成物に関し、これは、抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部を含む。他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するワクチンおよび組成物に関し、これは、インフルエンザウイルスの抗原、および１つ以上のストレスタンパク質のすべてもしくは一部を含む。本発明はまた、腫瘍関連抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部を含む、腫瘍関連抗原に対するCTL応答を誘導するためのワクチンおよび組成物に関する。本発明はまた、アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部を含む、アレルゲンに対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンおよび組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレスタンパク質を含む組成物を使用する免疫応答 関連出願 本出願は、1996年11月26日に出願された米国特許出願第08/756,621号の一部継 続出願であり、その全体の教示は参考として本明細書に援用される。 発明の背景 インフルエンザを引き起こすウイルスは、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ型 として任意に命名されている。これらの型は、抗原的に異なるウイルスを定義す る。各型は、いくつかの異なるサブタイプを有する。１つの型内のウイルスは、 ２つの異なるサブタイプで感染した細胞が、両方のサブタイプからの成分を含む 混合されたウイルスを組み立て得る意味で、遺伝的に適合可能である。インフル エンザウイルスは、オルトミクソウイルスとして分類される。ウイルスは、80と 120nmの間の直径の粒子を形成する。インフルエンザウイルスは、エンベロープ を有するウイルスであり、すなわち、その外表面は宿主細胞膜に由来する。２つ の主要なウイルスがコードするタンパク質、ヘマグルチニン（HA）およびノイラ ミニダーゼ（NA）は、エンベロープに挿入されそして突出する。インフルエンザ ウイルスは、非メッセンジャーRNA極性の８RNAセグメントから構成されるゲノム を含む、マイナス鎖RNAウイルスである。ゲノムRNAセグメントは、ウイルスがコ ードする核タンパク質（NP）とともにRNP複合体に組み立てられる。宿主細胞の 感染後、ゲノムRNAセグメントは、第１に、ゲノムRNAを産生するために後に逆転 写されるメッセンジャーRNA極性を有するRNAに転写される。これらの工程に寄与 し得る転写酵素活性は、校正能力を欠く。したがって、転写および逆転写中に作 成される誤りは修復されず、ウイルスゲノムの高頻度の変異を生じる。すべての ウイルス遺伝子は同じ変異プロセスを受けるが、外部タンパク質HAおよびNAにつ いての遺伝子は、その宿主において免疫検出を逃れる変異形態へ進化させる強い 選択プロセスを特に受ける。宿主には、ヒトだけでなく、ニワトリ、七面鳥、ブ タ、およびウマのような動物も含まれる。 インフルエンザは、伝統的に、ヒトの死亡の主要な原因の１つである。インフ ルエンザの臨床的徴候は、無症候から致死的感染までの範囲で可変である。代表 的には、病気の開始は、急速および衰弱性であり、そしてほとんど変わらずに咳 、不快、頭痛、および筋痛を伴う。鼻感冒、咽喉炎、および普通ほとんどない胸 骨下痛もまた、感染の一次部位が呼吸器系であることを示す。しかし、代表的に は、発熱および全身症状が優勢である。代表的には、回復は急速である。病気の 重篤度は、非常に宿主依存的であり、そして年齢、生理学的状熊、および感染ま たは免疫接種による前免疫接種に関連する。重篤な合併症は肺炎である。易感染 性の個体は、肺炎を引き起こす細菌病原体での二次感染を受けることが証明され ている。インフルエンザ後に死亡するほとんどの患者は、細菌性肺炎で死亡する 。インフルエンザウイルスＡおよびＢ型でのマイナーな抗原変更は毎年起こり、 地域的流行を引き起こす。このような毎年の流行からの毎年の死亡率は、米国単 独において20,000に近づき得る。10年と30年との間の可変間隔で、全世界的流行 病は、毎年の流行をはるかに越える死亡者数を生じる。これらの流行病は、おそ らく、ヒトおよび動物インフルエンザＡウイルスからの成分の遺伝子再取り合わ せによって引き起こされ、ヒト実験とは全体的に全く別の表面構造を有する新し いウイルスを生じる。1918〜19年の流行病の死亡者数は、約500,000のアメリカ 人を殺した。（一般的参考文献として：Joshua Lederberg，Encyclopedia of Mi crobiology，2(D-L):505-520，Academic Press Inc.，San Diego，CA 92101(199 2)）。 現在認可されたワクチンは、不活性化した精製されたウイルスを含む。ワクチ ンは、三価であり、そして２つの普及したＡサブタイプ、H3N2およびHiNiの代表 的株、ならびに単一のＢ型株を含む。弱毒化生ウイルスワクチンはまた、特に旧 ソビエト連邦において、いくらかの成功をともなって使用されてきた。HAおよび NAを含むサブユニットワクチンが開発されている（split fluワクチン；Connaug ht Lab.）。これらのワクチンは、防御免疫を提供することに完全には効果的で はない。一般的に、インフルエンザワクチンが、主としてウイルス表面タンパク 質HAおよびNAに対する抗体応答を誘導することによって、防御免疫を生じると認 められている。これは、ワクチンが単に完全に効果的ではない理由を説明し得； これは、これらの表面タンパク質における連続的抗原変更を受けやすい。 腫瘍細胞と正常細胞との間の差についての検索は、多くのいわゆる腫瘍関連抗 原の単離および特徴づけを導いている（Henderson，R.A.およびFinn，O.J.，Adv ances in Immunology，62:217-256(1996)）。これらの抗原は、十分に分化した 細胞において、必ずしもすべてではなくまたは少なくとも大量でもなく、腫瘍細 胞によって発現される。これらの腫瘍抗原をコードする配列は、ウイルス由来で あるか、または宿主のゲノムに正常に存在するかのいずれかである。ウイルス由 来腫瘍関連抗原の例は、ほとんどのヒト頚部肺瘍に存在するヒトパピローマウイ ルストランスフォーミングタンパク質E7である。代表的な宿主ゲノム由来の腫瘍 関連抗原は、gp100であり、これはpMel-17ともいい、多くのヒト黒色腫で発現さ れる。肺瘍関連抗原は、宿主免疫応答を誘導することが公知であるが、応答は、 代表的には、治療に効果的であるには不十分である。この応答を刺激するために アプローチの必要がある。 単特異的細胞溶解性Ｔリンパ球（CTL）クローンを使用して、少なくとも５つ の腫瘍関連抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと命名される）の発現は、マウスP8 15肥満細胞腫腫瘍細胞において同定されている。P1Aと命名されたこれらの抗原 の１つは、CTLクローンによって認識される単一エピトープを発現する。分子ア プローチを使用して、P1Aの遺伝子をクローニングし、そして正常細胞に存在す る非変異遺伝子であるが形質転換された細胞でのみ転写されそして翻訳されるこ とを見いだした（Van den Eyndeら，J．Exp．Med.，173:1373(1991)）。さらに 、P1A抗原発現をなくしたP815細胞の改変体の実験によって、P1AのMHCクラスＩ( L^d)-制限した最小CTLエピトープの配列を同定することが可能であった（Letheら ，Eur．J．Immunol.，22:2283(1992)）。 したがって、ウイルスおよび腫瘍に関連する抗原に対する、より効果的なワク チンについての必要性が存在する。 発明の要旨 本発明は、哺乳動物において抗原に対する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答（ 細胞溶解性Ｔ細胞（CTL）応答）を誘導するためのワクチンに関し、これは、 抗原、および、ストレスタンパク質（または熱ショックタンパク質(hsp)）のす べてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタン パク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべて もしくは一部を含む。１つの実施態様では、抗原は、インフルエンザウイルスの 抗原である。他の実施態様では、抗原は、腫瘍関連抗原である。本発明における 使用のためのストレスタンパク質は、例えば、マイコバクテリアストレスタンパ ク質（例えば、hsp65、hsp71）または投与される哺乳動物において抗原に対する 免疫応答を誘導するためにマイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列 に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。本発明のワクチン の抗原およびストレスタンパク質は、化学結合によってまたは融合タンパク質と して連結され得る。哺乳動物において抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解性免疫 応答を誘導するためのワクチンはまた、哺乳動物において抗原およびストレスタ ンパク質配列をコードしその発現を指示するポリヌクレオチドを含み得る。ポリ ヌクレオチドは、融合タンパク質として抗原およびストレスタンパク質を発現し 得る。 本発明はまた、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する細胞媒介す る細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは、インフルエン ザウイルスの抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗 原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分 に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。１つの 実施態様では、本発明は、哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原に対 する細胞媒介する細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、これは 、哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原およびストレスタンパク質の 発現を指示するポリヌクレオチドを含む。本発明で使用され得るインフルエンザ ウイルスの抗原には、例えば、ヘマグルチニン、核タンパク質、ノイラミニダー ゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせが含まれる。 １つの実施態様では、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫 応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、 または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配 列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に結合 した、インフルエンザウイルスの抗原である。 他の実施態様では、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応 答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、ま たは抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列 に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部に融合し た、インフルエンザウイルスの抗原を含む組換え融合タンパク質である。 本発明はまた、ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルスの抗原を含 む組成物に関する。１つの実施態様では、組成物は、インフルエンザウイルスの 抗原に連結されたストレスタンパク質を含む結合体である。他の実施態様では、 組成物は、インフルエンザウイルスの抗原に融合されたストレスタンパク質を含 む融合タンパク質（pET65MP/NP-BおよびpET65M/NP-D）である。 本発明はまた、哺乳動物においてインフルエンザウイルスを予防または処置す るための組成物の使用に関する。 本発明はまた、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞溶解 性免疫応答を誘導するためのワクチンに関し、このワクチンは、ストレスタンパ ク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにスト レスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質 のすべてもしくは一部に連結した腫瘍関連抗原を含む。本発明で使用され得る抗 原は、当該技術分野で現在公知のものを含む任意の哺乳動物の腫瘍関連抗原を含 む。CTLエピトープを含むこれらの抗原のフラグメントをも含む。 １つの実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細 胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、ストレスタンパク質のすべても しくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク質 のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしく は一部に化学的に結合した腫瘍関連抗原である。 他の実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する細胞 溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍関連抗原、および、ストレス タンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するため にストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタン パク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質である。 さらなる実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介する 細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍関連抗原、およびストレ スタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するた めにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタ ンパク質のすべてもしくは一部をコードする配列を発現可能形態で含むポリヌク レオチドである。 さらに他の実施態様では、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞媒介す る細胞溶解性免疫応答を誘導するためのワクチンはまた、腫瘍関連抗原、および ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導 するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有 するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質をポリヌクレ オチドであり得る。 本発明はまた、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に対す るアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンに関し、このワクチンは、ア レルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー 応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ 酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。ペプチド性であるかど うかにかかわりなく、任意のアレルゲンが使用され得る。 １つの実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン） に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、ストレスタンパク 質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するためにストレスタン パク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべて もしくは一部に化学的に結合したアレルゲンである。 他の実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン）に 対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、アレルゲン、および ストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応答を抑制するた めにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するタ ンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク質である。 さらなる実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲン ）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンは、ペプチド性アレ ルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレルギー応 答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸 配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部をコードする配列を発現可能形態 で含むポリヌクレオチドである。 さらに他の実施態様では、哺乳動物において天然または人工的抗原（アレルゲ ン）に対するアレルギー性免疫応答を抑制するためのワクチンはまた、ペプチド 性アレルゲン、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、またはアレル ギー応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なア ミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む組換え融合タンパク 質をコードするポリヌクレオチドである。 本発明はまた、哺乳動物において抗原に対するTh2応答を抑制するための組成 物に関し、これは、抗原、およびストレスタンパク質のすべてもしくは一部、ま たは抗原に対するTh2応答を抑制するためにストレスタンパク質のアミノ酸配列 に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む。 この組成物は、ワクチン、結合体、または融合タンパク質であり得る。 図面の簡単な説明 図１は、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、核タンパ ク質（NP）ペプチドおよび熱ショックタンパク質70（hsp70）を含む混合物に対 するマウスにおける細胞溶解性Ｔ細胞（CTL）応答を示す。 図２は、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、NPペプチ ドおよびhsp70の化学結合体を含む組成物に対するマウスにおけるCTL応答を示す 。 図３は、ベクターpET65MPの模式図である。 図4Aは、ベクターpET65MP/NP-Bの模式図である。 図4Bは、ベクターpET65MP/NP-Dの模式図である。 図5A〜5Bは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、hsp- NP融合タンパク質のhsp65-NP.Bに対するマウスにおけるCTL応答を示し、ここで エフェクター細胞をIL-2の不在下（図5A）およびIL-2の存在下（図5B）において 再刺激した。 図6A〜6Bは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、hsp- NP融合タンパク質のhsp65-NP.Dに対するマウスにおけるCTL応答を示し、ここで エフェクター細胞をIL-2の不在下（図6A）およびIL-2の存在下（図6B）において 再刺激した。 図7A〜7Bは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、hsp- P1A融合タンパク質で免疫したBALB/cマウスにおけるCTL応答を示す。 図8A〜8Bは、エフェクター：標的比対％特異的細胞溶解のグラフであり、hsp- PIA融合タンパク質で免疫したDBA/2(H-2^d)マウスにおけるCTL応答を示す。 図９は、hsp-腫瘍関連抗原のhsp71-P1Aでの免疫が、関連のMHCクラス１拘束さ れたエピトープを提示する細胞に対するCTL活性の刺激を生じることを示す棒グ ラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、抗原（１つ以上）、およびストレスタンパク質または熱ショックタ ンパク質（１つ以上）のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘 導するためにストレスタンパク質に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク 質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗原に対す る免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。特定の実施態様では、 本発明は、抗原（１つ以上）、およびストレスタンパク質（１つ以上）のすべて もしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導するためにストレスタンパク 質に十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質のすべてもしくは一部を含む 、哺乳動物において細胞媒介性免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関 する。 特定の実施態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの抗原、およびスト レスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導する ためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有する タンパク質のすべてもしくは一部を含む、哺乳動物においてインフルエンザウイ ルスに対する免疫応答を誘導する、ワクチンおよび組成物に関する。本明細書中 で記載される場合、インフルエンザ抗原（例えば、CTLエピトープを含むNP配列 ）、および少なくとも１つのストレスタンパク質を、インフルエンザ抗原とスト レスタンパク質との混合物の形態で、インフルエンザ抗原とストレスタンパク質 との結合体として、もしくはインフルエンザ抗原およびストレスタンパク質配列 を含む融合タンパク質としてのいずれかで含む組成物は、哺乳動物において使用 されるインフルエンザ抗原に対する特異的免疫応答（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞 （CTL）応答、Ｔ細胞ヘルパー応答、Ｂ細胞応答）を刺激することに効果的であ る。例えば、実施例で証明されるように、本明細書に記載のワクチンでの宿主（ 脊椎動物（例えば、哺乳動物））の免疫は、インフルエンザ抗原（例えば、NP） を提示する細胞に対する特異的CTL活性の刺激を生じ得る。あるいは、個々のイ ンフルエンザ抗原およびストレスタンパク質は、連続的に投与され得る。 さらなる実施態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に対する細胞媒介性免疫応答 を誘導するワクチンに関し、特定のタイプの予め存在する腫瘍に対する免疫のた めまたはこのような腫瘍の発生を予防するために適切な腫瘍関連抗原、およびス トレスタンパク質のすべてもしくは一部、または抗原に対する免疫応答を誘導す るためにストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有す るタンパク質のすべてもしくは部分を含む。これまでの実施態様と類似して、少 なくとも１つの腫瘍関連抗原および１つのストレスタンパク質を、腫瘍関連抗原 とストレスタンパク質との混合物、腫瘍関連抗原とストレスタンパク質との結合 体、または腫瘍関連抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質の 形態のいずれかで含むワクチンは、哺乳動物において腫瘍関連抗原に対する細胞 媒介性細胞溶解性免疫応答を刺激し得る。あるいは、抗原およびストレスタンパ ク質は、継続的に投与され得る。実施例で示されるように、この型のワクチン、 最小PIA肥満細胞腫抗原およびストレスタンパク質を含む融合タンパク質は、P1A 抗原を提示する細胞に対して細胞媒介性細胞溶解性応答を誘導する。さらに、ワ クチンで免疫した哺乳動物は、P1A抗原を発現する腫瘍細胞でのその後のチャレ ンジに対して免疫性である。 本発明では、組成物は２つの部分から構成される：ストレスタンパク質、およ び免疫応答が所望されるものに対する抗原。２つの部分は、混合、結合、または 連結され、そして単一の単位を形成し得る。結合は、当業者に公知の化学的手段 によって（例えば、ストレスタンパク質と第２の部分との間の共有結合を介して ；還元的アミノ化）、または組換え技法によって、達成され得る。組換え技法が ２つの部分を連結または結合するために使用されるならば、その結果は、単一分 子におけるストレスタンパク質および抗原を含む組換え融合タンパク質である。 これは、ワクチン産生プロセスにおいて単一組換え分子を産生および精製するこ とを可能にする。ストレスタンパク質は、細胞媒介細胞溶解性免疫応答が所望さ れるものに対する任意の抗原に、あるいは投与される個体における免疫応答を誘 導するために十分な抗原の一部に、結合され得る。 本明細書中で定義されるように、用語「ワクチン」は、予防的または治療的ワ クチンとして使用され得る組成物を含む。１つの実施態様では、ワクチン組成物 は、抗原およびストレスタンパク質をコードする１つ以上の核酸である。本発明 はまた、哺乳動物において、抗原（例えば、腫瘍抗原）、または抗原を含む病原 体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫）の存在に関連するまたはこれによって引 き起こされる病気もしくは症状を予防または処置するための、ストレスタンパク 質および／または抗原をコードする核酸である組成物の使用に関する。例えば、 本明細書中に記載される組成物は、ウイルスに感染されていない哺乳動物におい てインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。さ らに、本明細書中に記載のワクチンまたは組成物は、インフルエンザウイルスに 感染した哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する ために使用され得、そして哺乳動物において感染しているインフルエンザウイル スによって引き起こされる病態の回復または除去を生じ得る。本明細書中で使用 される場合、「免疫応答の誘導」とは、増加した免疫応答（検出不能より大また は以前より大）；または比較可能な条件下で抗原単独での免疫によって達成可能 な応答よりも優れた応答を意味する。 本明細書中に記載のように、抗原（ストレスタンパク質当たり１つ以上）は、 好ましくは、ペプチドの種類（すなわち、タンパク質、ポリペプチド、またはペ プチドである）である。抗原およびストレスタンパク質が混合または化学結合さ れる適用では、抗原はまた、炭水化物、脂質、糖脂質、または有機分子もしくは 無機分子であり得る。本明細書中で使用される場合、「抗原」は、少なくとも１ つのCTLエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。CTLエピトープは 、Ｉ型制限Ｔ細胞エピトープ、またはII型制限Ｔ細胞エピトープのいずれかとし て定義される。本発明における使用のための抗原は、単離、精製（本質的に純粋 ）、化学合成、または組換え産生され得る。本発明の組成物に有用な他の適切な 抗原は、当業者によって決定され得る。 ワクチンまたは組成物が、インフルエンザウイルスに対する細胞媒介細胞溶解 性免疫応答を誘導する実施態様では、インフルエンザウイルスの抗原は、赤血球 凝集素、ウイルス全体（例えば、不活性化または生の弱毒化ウイルス全体）、イ ンフルエンザウイルスの抗原性部分、および組換え産生したウイルスもしくはそ の一部を含むが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスの抗原は、少 なくとも１つのＢ細胞および／またはＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞、細胞溶 解性Ｔ細胞）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、イ ンフルエンザウイルスの抗原は、赤血球凝集素（HA（例えば、HA1、HA7））、核 タンパク質（例えば、NP（例えば、実施例に記載のNP-bおよびNP-D））、ノイラ ミニダーゼ（NA）、M1、M2、PB1、PB2、およびPAを含むが、これらに限定されな い。本発明の組成物に使用され得るインフルエンザウイルスの他の抗原は、当業 者によって決定され得る。 ワクチンまたは組成物が腫瘍関連抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を 誘導する実施態様では、抗原は、MAGE1、MAGE3、BAGE、およびGAGEを含むが、こ れらに限定されない。これらのタンパク質は、正常には精巣で発現される。エピ トープ発現は、黒色腫を含む種々の肺瘍を生じる。メラニン形成細胞分化抗原チ ロシナーゼ、MART-1/MELAN-1、およびgp 100/pMe117、ならびにチロシナーゼ関 連タンパク質pg75およびMUM-1はまた、このリストに含まれ、そのすべては黒色 腫に関連する。他の有用な腫瘍関連抗原は、乳ガンおよび卵巣ガンで見られるHE R2/neu、上皮細胞腫瘍で見られるMUC-1、ならびに頸ガンと強く関連するヒトパ ピローマウイルスタンパク質E6およびE7である。さらに、抗原は、GnT-V、β-カ テニン、CDK4、およびp15を含む。これらのすべての腫瘍関連抗原は、Ｔ細胞に よって認識される。（Wang，R.-F.およびRosenberg，S.A.，Journal of Leukocy te Biology，60:296-309(1996);Houghton，A.N.，J．Exp．Med.，180:1-4(1994 );Henderson，R.A.およびFinn，O.J.，Advances of Immunology，62:217-256） 。 アレルギー性（アトピー性）疾患および喘息疾患における重要な担い手は、好 酸球の浸潤に支配されるIgEおよび局所的炎症反応である。慢性炎症による非特 異的刺激に対する肺の過剰反応は、喘息の最近の定義である。この炎症は、IgE によって媒介される天然抗原または人工的抗原に対する異常なアレルギー性応答 によって引き起こされ、そして好酸球と呼ばれる顆粒細胞の慢性細胞性炎症を導 き得る。常駐の肥満細胞ならびに補充された好塩基球および好酸球からのメディ エーターの放出は、炎症およびその後の過剰反応性の原因であると考えられる。 ヒトでは、他の種におけるように、何らかの炎症性反応が局所的過剰反応性を生 じる。しかし、喘息では、炎症は慢性的であり、適切に処置されなければ、生命 を脅かす過剰反応性を導く。現在の処置は、炎症を減少させるためのコルチコス テロイドおよび迅速な症候の緩和のためのアルブテロール（βアゴニスト）のよ うな気管支拡張薬の使用を含む。 ヒトでは、マウスにおけるように、サイトカイン分泌の２つの異なるパターン が、CD4⁺ヘルパーＴ細胞クローンの中で定義されている（del Prete，G.，Aller gy，47:450-455(1992)）。ヒト１型ヘルパー（Th1）細胞（２型ヘルパー（Th2） 細胞ではない）は、インターロイキン-2（IL-2）、γインターフェロン、および 腫瘍壊死因子βを産生する。Th1ではなくTh2細胞は、IL-4およびIL-5を分泌する がIL-2またはγインターフェロンを分泌しない。IL-3、IL-6、GM-CSF、または腫 瘍壊死因子αのような他のサイトカインは、Th1およびTh2細胞の両方によって産 生される。異なるサイトカインパターンは、種々の機能に関連する。一般に、Th 2細胞は、特にIgEクラスの、Ｂ細胞抗体産生についての優れたヘルパー機能を提 供する。Th1細胞は、遅延した過敏性反応を担い、そしてＢ細胞を含む自己抗原 提示細胞に対して細胞溶解性である。ほとんどのアレルゲン特異的または蠕虫抗 原特異的ヒトCD4⁺Ｔ細胞クローンはTh2表現型を示すが、細菌抗原に特異的な ほとんどのクローンはTh1プロフィールを示す。アレルゲン特異的Th2細胞は、ア トピーで重要な役割を果たすようである。これらの細胞は、IL-4によってIgE産 生を誘導し、そしてIL-5によって好酸球の増殖、分化、および活性化を好んで行 う。さらに、Th2由来のIL-3、IL-4、およびIL-13は、少なくともインビトロで、 相乗的に作用する肥満細胞増殖因子である。アレルゲン特異的Th2細胞が、アレ ルギー性喘息を有するヒトの気管支粘膜のような、アレルギー性炎症によって提 供を受ける組織に、選択的に豊富であるという証拠がある。 発展途上国での幼児における抗体の使用の増加につれて、（アレルギー性）喘 息の徴候およびこれによる死亡が上昇している。以下の論議は、ストレスタンパ ク質を含む細菌抗原への慎重な曝露がアレルギー性応答を弱めるという概念を支 持するために、ストレスタンパク質を含む細菌タンパク質についての曝露および Ｔ細胞記憶の欠如に、アレルギー性反応の増加した徴候および重篤度を結び付け る、この情報を使用している。 多くの科学者らは、環境抗原に対する抵抗性または感受性の発生が、乳児およ び幼児において初期抗原遭遇中に生成した免疫学的記憶の性質に依存すると考え る（Holt P.G.，Toxicol Lett.，86:205-210）。このプロセスは、抗原由来であ るようである。選択は、吸入した抗原に対する個体の免疫応答（気道の流通を奪 う、局部リンパ節で生じるプロセス）における特異的Th1対Th2様記憶細胞につい てである。この選択は、抗原特異的CD4⁺およびCD8⁺細胞によって産生される種々 のサイトカインによって調節されるようである。このＴ細胞選択プロセスは、理 論的には、感染性薬剤によって影響を受け得る：気道粘膜における感染は、局部 リンパ節に遊走し、そしてIL-12およびα-インターフェロンのようなTh2阻害サ イトカインを分泌する局所組織（肺胞）マクロファージを移動および活性化し得 る。さらに、これらは、ナチュラルキラー細胞の活性化によって環境中のγ-イ ンターフェロンレベルに加えられ得る。正味の結果は、CTL（これは主としてCD8⁺ 細胞である）の産生である。γ-インターフェロンは、Th2細胞の生成、したが って、体液性（IgE）および細胞性（好酸球、好塩基球、および肥満細胞）アレ ルギー性応答の産生に重要なサイトカインであるIL-4およびIL-5の産生を阻害す る（Anderson，G.P.およびCoyle，A.J.，Trends Pharmacol．Sci.，15:324-33 2(1995)；Stam，W.B.，van Oosterhout，A.J．およびNijkamp，F.P.，Life Sci. ．53:1921-1934(19939)）。 哺乳動物において、ストレスタンパク質は、体液性および細胞性免疫応答を誘 導することが示されている。本明細書中の実施例で示すように、ストレスタンパ ク質と混合した、ストレスタンパク質に化学結合した、またはストレスタンパク 質に融合した可溶性抗原が、哺乳動物に投与される場合、細胞媒介細胞溶解性免 疫応答は実質的に増強される。これらの応答は、大部分は、CD8⁺Ｔ細胞による。 したがって、それ自体による抗原に対するCD4⁺応答の、ストレスタンパク質と混 合または結合した抗原に対する応答との比較は、予測されたプロフィールを与え る：ストレスタンパク質と混合または連結された火可溶性抗原は、前記のTh1経 路の刺激の尺度であるCTL（主としてCD8⁺Ｔ細胞）の高い割合を得る。なぜなら 、これらのCTLは、Th1型の抗原特異的Ｔ細胞の誘導の結果として生じたからであ る。これらのTh1細胞は、γ-インターフェロンを産生し、このサイトカインはTh 2細胞を阻害する。したがって、Th2サイトカインであるIL-4およびIL-5は、IgE および好酸球の産生を支持するためにもはや利用可能ではない。IgEの力価の減 少につれて、肥満細胞および好塩基性細胞の直接的抗原性刺激は衰える。さらに 、減少したIL-5産生は、好酸球の減少した産生、分化、および活性化を導く。こ のパターンは、関連した組織の減少した炎症を引き起こし、そして過剰反応性（ 喘息）事象をあまり生じない。 したがって、公知のアレルギー性抗原（アレルゲン）とストレスタンパク質と の混合物、またはストレスタンパク質に化学結合もしくは融合したアレルゲンを 含む組成物の投与は、アトピー性患者においてTh1対Th2比に影響を及ぼすばずで あり、より正常な平衡を回復させそして減少したアレルギーまたは喘息を導く。 このような組成物に使用されるストレスタンパク質は、好ましくは、細菌起源ま たはマイコプラズマ起源である。アレルゲン-ストレスタンパク質融合タンパク 質に使用されるアレルゲンは、必然的にペプチド性質であり；非ペプチド性アレ ルゲンは、アレルゲンとストレスタンパク質とを含む結合体、またはアレルゲン とストレスタンパク質との混合物で使用され得る。アレルゲンについての非限定 的な例には、Fel d1（ネコ）;Amb a1（抗原Ｅ）、Amb a2（抗原Ｋ）（ブタク サ）；Der f2、Der p1、Der p9、Der f1（ダニ）;Bla g1、Bla g2（ゴキブリ）; Bet v1（カバノキ）;Rat n1（ラット）;Cha o1（ヒノキ）;Hev b5（ラテックス ）;gp40(ヤマスギ(mountain cedar))が挙げられる。刊行時までのアレルゲンの 適切な包括的なリストについては、King，T.P.ら，Int．Arch．Allergy Immunol .，105:224-233(1994)を参照のこと。 共有結合したまたは混合されたアレルゲンおよびストレスタンパク質を含む組 成物が、過敏性反応の処置の必要な患者に、皮下または筋肉内注射のような適切 な経路によって投与されるか、あるいはさらに吸入によって与えられる場合、こ れらは、例えば、喘息における古典的過剰反応性試験によって測定されるような アレルギー性症候の減少を生じるべきである。処置後、患者は、非特異的反応性 をほとんど示さない。喘息では、または喘息の動物モデルでは、過剰反応性は、 気管支狭窄応答を誘導する吸入されたメタコリンの用量を決定することによって 測定される。過剰反応性を導く慢性炎症性状態を有する哺乳動物は、メタコリン チャレンジに対してより大きな感受性を示す。これらは、「正常」哺乳動物より も低い用量で気管支狭窄する。適切なストレスタンパク質含有組成物での処置後 、メタコリンに対する用量応答は、あまり感受性でなくなる。 任意の適切なストレスタンパク質（熱ショックタンパク質（hsp））は、本発 明の組成物において使用され得る。例えば、実施例に記載のように、hsp65およ び／またはhsp71が使用され得る。ストレスタンパク質に向かって、一般的に、 細胞は、普通ストレス遺伝子または熱ショック遺伝子といわれる遺伝子群の発現 を増加させることによって、ストレッサー（代表的には、熱ショック処置）に応 答する。熱ショック処置は、細胞が適応する温度より数℃上までの温度への、細 胞または生物の曝露を包含する。このような遺伝子の誘導と同調して、対応する ストレスタンパク質のレベルは、ストレスを受けた細胞で増加する。本明細書中 で使用される場合、「ストレスタンパク質」は、「熱ショックタンパク質」また は「Hsp」としても公知であり、これは、ストレス遺伝子によってコードされる タンパク質であり、したがって、代表的には生物に対するストレッサーの接触ま たは曝露の際に顕著により大量に産生されるタンパク質である。「熱ショック遺 伝子」としても公知である「ストレス遺伝子」は、本明細書中で、熱ショックま たはグルコースの誘導もしくは追加のような、ストレッサーに対する生物（遺伝 子を含む）の接触または曝露によって、活性化されるまたは他の検出可能に調節 されない遺伝子として、使用される。「ストレス遺伝子」はまた、このような相 同遺伝子が、それ自体ストレッサーによって誘導されなくても、Hsp70およびHsp 90ストレス遺伝子ファミリー内の特定の遺伝子のような、公知のストレス遺伝子 ファミリー内の相同遺伝子を含む。本明細書中で使用される場合、用語ストレス 遺伝子およびストレスタンパク質のそれぞれは、内容が他に指示されない限り、 他のものを含み得る。Hspの増加した発現の他に、細胞は、特定の他の遺伝子を ダウンレギュレートし、シグナル伝達に関与するいくつかのキナーゼを活性化し 、特定のタンパク質の細胞内位置を変化し、そしていくつかの状況では、細胞骨 格レベルの変化ならびに一過性増殖阻止を経験し得る。 特定の実施態様において、本発明における使用のためのストレスタンパク質は 、単離されたストレスタンパク質であり、これはストレスタンパク質が、それが 産生される宿主細胞から選択および分離されていることを意味する。このような 単離は、本明細書中に記載されるように、および当該分野において公知のタンパ ク質単離の日常的な方法を用いて、行われ得る。（Maniatisら、Molecular Clon ing、A Laboratory Manual,．Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Ha rbor、N.Y.、1982；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第 ２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989））。単離されたストレス タンパク質はまた、さらに、方法、特に界面活性剤精製法に従って、（本質的に 純粋に）精製され得る。 細菌において、優勢なストレスタンパク質は、それぞれ、約70kDaおよび約60k Daの分子量サイズを有するタンパク質であり、これはそれぞれ、Hsp70およびHsp 60として称される。これらのおよび他の特定のストレスタンパク質、およびそれ らをコードする遺伝子は、以下にさらに考察される。細菌において、Hsp70およ びHsp60は、典型的に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳 動および染料クマシーブルーを用いる染色パターンに基づいて、細胞タンパク質 の約１〜３%を示すが、ストレスの多い条件下で25%程の高レベルまで蓄積する。 ストレスタンパク質は、重要な細胞プロセス（例えば、タンパク質合成、細胞内 輸送、ならびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリ（disassembl y））に関与するようである。ストレスの間に合成される増加される量のストレ スタンパク質は、誘導されたタンパク質がほどける（unfolding）結果を最小に するために主として作用するようである。実際、ストレスタンパク質の合成を誘 導する中程度にストレスが多い条件への細胞の予めの曝露は、細胞に対して、そ の後のより極度のストレスの有害な影響からの防御を与える。 主要なストレスタンパク質は、今までのところ、試験されたあらゆる生物およ び組織タイプにおいて発現されるようである。また、ストレスタンパク質は、今 日までに同定されたタンパク質の最も高度に保存された群を表すようである。例 えば、広範に多様な生物におけるストレスタンパク質が比較される場合、Hsp90 およびHsp70は、アミノ酸レベルで50%以上の同一性を示し、そして非同一性の位 置で多くの類似性を共有する。 ストレスタンパク質をコードする遺伝子は、細胞または生物のゲノムにおいて 、単一のコピー、または複数の、非同一性のコピーで存在し得る。例えば、ヒト ゲノムは、少なくとも１つのコピーのHsp100遺伝子、少なくとも２つの異なるHs p90遺伝子、少なくともいくつかが非同一性のコピーである、最大10までのHsp70 遺伝子、いくつかのＴ複合体遺伝子（Tcp遺伝子）、および関連のミトコンドリ アタンパク質Hsp60をコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびに20〜30kDaの 範囲の分子量サイズのタンパク質をコードする、少なくとも３コピーの小Hsp遺 伝子を含むことが示されている。ストレス遺伝子のほとんどの群において、その 発現レベルが比較的高く、および完全に構成的であるか、またはわずかに中程度 に熱ショック誘導性であるかのいずれかである少なくとも１つの遺伝子が存在す る。さらに、ストレス遺伝子のいくつかの群は、熱によってアップレギュレート されないが、他のきっかけ（例えば、増加されるカルシウムレベルなど）によっ てアップレギュレートされるメンバーを含む。 ストレスタンパク質、特に、Hsp70、Hsp60、Hsp20〜30、およびHsp10は、Myco bacterium tuberculosisおよびMycobacterium lepraeによる感染に対する免疫応 答において、宿主免疫系によって認識される主要な決定因子の中の１つである。 Young，R.A.およびElliott，T.J.、ストレスタンパク質、感染、および免疫監視 、 Cell 50:5-8（1989）。さらに、いくつかのラットのarthritogenicＴ細胞は、Hs p60エピトープを認識する。Van Eden、W.、Thole，J.、van der Zee，R.、Noord zij，A.、van Embden，J.、Hensen，E.、およびCohen，I.、Nature 331:171-173 ，（1988）。しかし、マイコバクテリア感染または自己免疫疾患の病歴を有しな い、個体（健常な個体を含む）はまた、細菌およびヒトのHsp60エピトープの両 方を認識するＴ細胞を保有し；γ−ΔＴ細胞レセプターの発現によって特徴付け られる健常な個体におけるＴ細胞のかなりの画分は、自己のおよび外来性のスト レスタンパク質の両方を認識する。O'Brien，R.、Happ，M.、Dallas，A.、Palme r，E．Kubo，R.、およびBorn，W.、Cell 57:644-674（1989）。従って、個体は 、健常な個体であっても、外来のおよび自己のストレスタンパク質エピトープの 両方を認識するＴ細胞集団を保有する。 ストレスタンパク質エピトープを認識するこの系は、侵入する生物に対する「 初期防衛系」を構成する。この系は、宿主細胞にそれら自身のストレス遺伝子を アップレギュレートさせる、細菌およびウイルスによる頻繁な刺激によって維持 され得る。しかし、自己応答性Ｔ細胞の存在は、正常な健常性と適合性であり、 自己免疫疾患を引き起こさない；これはまた、個体内のストレスタンパク質の安 全性を実証する。ストレスタンパク質の安全性は、BCG（Bacille Calmette Guer in,.Mycrobacterium bovisの株）ワクチン接種（これは、Mycobacteriurn tuber culoslsに対してもまた防御的であるストレスタンパク質に対する、免疫応答を 誘導する）の成功および比較的な安全性によって、さらに実証されている。 本発明における使用のためのストレス遺伝子およびタンパク質は、当該分野に おいて周知であり、そして例えば、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、Hsp70、H sp60、TF55、Hsp40、FKBP、シクロフィリン、Hsp20-30、ClpP、GrpE、Hsp10、ユ ビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。 Macario，A.J.L.、Cold Spring Harbor Laboratory Res．25:59-70 1995；Parse ll，D.A.，& Lindquist，S.，Ann．Rev．Genet．27:437-496（1993）；米国特許 第5,232,833号（Sandersら）。ストレスタンパク質の特定の群は、Hsp90、Hsp70 、Hsp60、Hsp20-30、およびユビキチン、さらに好ましくはHsp70およびHsp60を 含む。 本発明の方法および組成物におけるストレスタンパク質は、好ましくは、細胞 外的な抗原提示ストレスタンパク質から、またはプロセシングされたストレスタ ンパク質から、好ましくは選択され、そして得られたペプチドフラグメントは、 それが細胞外抗原提示タンパク質であるように細胞の表面上に提示される。さら に、本発明における使用のための選択されるストレス遺伝子またはタンパク質は 、好ましくは、ストレス遺伝子またはタンパク質が、少なくとも１つの発現（好 ましくは、細菌またはヒト）において、１つ以上の形態のストレスに応じて調節 されないように選択される。さらに好ましくは、選択されるストレス遺伝子また はタンパク質は、ヒトにおいて調節されない（上記されるようなストレッサー、 または形質転換によって調節されないことを含む）。 Hsp100-200の例は、Grp170（グルコース調節性のタンパク質について）、プレ ゴルジ区画における小胞体のルーメンにおけるGrp170残基を含み、そして免疫グ ロブリンの折り畳みおよびアセンブリにおいて役割を果たし得る。 Hsp100の例は、哺乳動物Hsp110、酵母Hsp104、clpA、clpB、clpC、clpX、およ びclpYを含む。酵母Hsp104およびE．coli clpAは、ヘキサマーの粒子、およびそ のアセンブリがアデニンヌクレオチド結合を必要とするようであるテトラマーの 粒子であるE．coli clpBを形成する。Clpプロテアーゼは、ClpP（タンパク質分 解性のサブユニット）およびClpAからなる750kDaのヘテロオリゴマーを提供する 。ClpB-Yは、ClpAに構造的に関連するが、ClpAとは異なり、ClpPと複合体化しな いようである。 Hsp90の例は、E．coliにおけるHtpG、酵母におけるHsp83およびHsc83、ならび にヒトにおけるHsp90α、Hsp90β、およびGrp94を含む。Hsp90は、タンパク質の 群に結合し、このタンパク質は、ステロイドホルモンレセプター（例えば、糖質 コルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロン）、転写 因子、ならびにシグナル伝達機構において役割を果たすプロテインキナーゼのよ うな代表的には細胞調節分子である。Hsp90タンパク質はまた、他のストレスタ ンパク質を含む大きな豊富なタンパク質複合体の形成に関与する。 Lonは、E．coliにおいてネイティブでないタンパク質を分解する、ATP-依存性 プロテアーゼとして機能する、テトラマーのタンパク質である。 Hsp70の例は、哺乳動物細胞からのHsp72およびHsp73、細菌、特にマイコバク テリア（例えば、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、および Mycobacterium bovis（例えば、Bacille-Calmette Guerin））からのDnaK、Esch erichiacoli、酵母、および他の原核生物からのDnaK、ならびにBipおよびGrp78 を含む。 Hsp70は、ATP、ならびにほどけたポリペプチドおよびペプチドに特異的に結合 し得、それによってタンパク質の折り畳みおよび脱折り畳み（unfolding）、な らびにタンパク質複合体のアセンブリおよび脱アセンブリに関与する。 Hsp60の例は、マイコバクテリアからのHsp65を含む。細菌Hsp60はまた、一般 に、GroEL（例えば、E．coliからのGroEL）としても知られる。Hsp60は、大きな 、ホモオリゴマーの複合体を形成し、およびタンパク質折り畳みにおいて重要な 役割を果たすようである。Hsp60相同体は、真核生物のミトコンドリアおよび葉 緑体に存在する。 TF55の例には、Tcp1、TRiC、およびサーモソーム（thermosome）が含まれる。 このタンパク質は、代表的には、真核生物の細胞質およびいくつかの始原細菌に おいて生じ、そして多員環を形成して、タンパク質折り畳みを促進する。これら はまた、Hsp60に低度に相同性である。 Hsp40の例は、E．coliおよびマイコバクテリアのような原核生物からのDnaJ、 およびHSJ1、HDJ1、ならびにHsp40を含む。Hsp40は、細胞活性の中でとりわけ、 タンパク質合成、熱耐性、およびDNA複製における分子シャペロンとしての役割 を果たす。 FKBPの例は、FKBP12、FKBP13、FKBP25、ならびにFKBP59、Fpr1およびNep1を含 む。これらのタンパク質は、代表的には、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活 性を有し、および免疫抑制薬（例えば、FK506およびラパマイシン）と相互作用 する。これらのタンパク質は、代表的には、細胞質および小胞体において、見出 される。 シクロフィリンの例には、シクロフィリンＡ、Ｂ、およびＣが含まれる。タン パク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を有し、そして免疫抑制薬の シクロスポリンＡと相互作用する。タンパク質シクロスポリンＡは、カルシニュ ーリン（タンパク質ホスファターゼ）に結合する。Hsp20-30の例には、α-クリ スタリンが含まれ、そしてHsp20-30はまた、小Hspと称される。Hsp20-30は、代 表的には、大きなホモオリゴマーの複合体において見出され、またはヘテロオリ ゴマーの複合体（ここでは、生物または細胞タイプは、いくつかの異なるタイプ の小Hspを発現する）において見出されることもあり得る。Hsp20-30は、細胞骨 格構造と相互作用し、そしてアクチンの重合／解重合において調節的な役割を果 たし得る。Hsp20-30は、ストレスにより、または静止細胞の増殖因子への曝露の 際に、迅速にリン酸化される。 ClpPは、異常なタンパク質の分解に関与するE．coliプロテアーゼである。Clp Pの相同体は、葉緑体において見出される。ClpPは、ClpAとヘテロオリゴマーの 複合体を形成する。 GrpEは、ストレスで障害されたタンパク質の救済、および障害されたタンパク 質の分解の両方に関与する約20kDaのE．coliタンパク質である。GrpEは、E.coli においてストレス遺伝子の発現の調節において役割を果たす。Hsp10の例は、Gro ESおよびCpn10を含む。Hsp10は、代表的には、E.coliにおいて、ならびに真核生 物細胞のミトコンドリアおよび葉緑体において見出される。Hsp10は、Hsp60オリ ゴマーと会合する七員環を形成する。Hsp10はまた、タンパク質折り畳みに関与 する。 ユビキチンは、ATP-依存性の細胞質ゾルのプロテアーゼのタンパク質分解除去 と協調して、タンパク質を結合することが見出されている。 特定の実施態様において、本発明のストレスタンパク質は、腸内細菌、マイコ バクテリア（特に、M．leprae、M．tuberculosis、およびM．bovis、E.coli、酵 母、ショウジョウバエ、脊椎動物、鳥類、ニワトリ、哺乳動物、ラット、マウス 、霊長類、またはヒトから得られる。 ストレスタンパク質は、酸性もしくは塩基性の塩の形態、または中性の形態で あり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾され得 る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸配列に対し てなされ得、その正味の効果は、変異体の増加された生物学的活性を保持するこ と、またはさらに増強することである。コード縮退に起因して、例えば、同じア ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変化が存在し得る。 本発明はまた、ストレスタンパク質から得られる、ストレスタンパク質のフラグ メントまたはぺプチドを用いる使用に適切である（但し、このようなフラグメン トまたはペプチドは、選択される抗原に対する免疫応答を増強することに関与す る立体配座エピトープを含む）。ストレスタンパク質フラグメントは、プロテイ ナーゼを用いるフラグメント化により、または組換え法（例えば、ストレスタン パク質をコードするヌクレオチド配列の一部の発現（単独でまたは別のタンパク 質との融合としてのいずれか））によって得ることができる。ペプチドはまた、 このような方法、または化学合成によって生成され得る。本発明はまた、第２の タンパク質に融合または結合されるストレスタンパク質を用いる使用に適切であ り、第２のタンパク質は、ストレスタンパク質であってもなくてもよい。ストレ スタンパク質は、多様な公知の技術によって、特定の遺伝子座で導入された変異 を含み得る。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、 第２版.，Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989;DrinkwaterおよびKline dinst、PNAS 83:3402-3406、1986；LiaoおよびWise Gene 88:107-111、1990'） ；Horwitzら、Genome 3:112-117、1989を参照のこと。 用語「ストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分に相同性である」とは、タン パク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、一般に、ストレスタンパク質アミ ノ酸配列と少なくとも40%の同一性を示すことを意味する；いくつかの場合にお いて、機能的に等価なアミノ酸配列は、ストレスタンパク質のアミノ酸配列と約 50%の同一性を示す。 ストレス遺伝子またはタンパク質としての考慮のもとに、遺伝子またはタンパ ク質を同定する方法は、当該分野において周知である。例えば、特定のストレス タンパク質群の遺伝子およびタンパク質の保存は、周知のストレス遺伝子（例え ば、DnaK、GroEL、またはDnaJ）を考慮して、例えば、核酸ハイブリダイゼーシ ョン、または核酸もしくはアミノ酸配列決定、その後のコンピューター比較解析 によって、遺伝子／タンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の比較を 可能にする。Voellmy，R.,ら、PNAS 82:4949-4953（1985）。あるいは、アッセ イは、選択されたストレスタンパク質の本質的な構造特徴および／または機能的 特性とを、同定および／または区別するために使用され得る。例えば、発現ライ ブラリーは、抗Hsp抗体および当該分野において周知の他のアッセイを使用して 、スクリーニングされ得る。Antibodies：A Laboratory Manual、HarlowおよびL ane（編）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、（1988）。さらに、所定の ストレスタンパク質群の生物学的活性が開発され得る。Guidon，P.T.、およびHi ghtower，L.E.、Biochem.、25:3231-3239（1986）。例えば、Hsp70は、タンパク 質複合体のアセンブリにおいて、ATP、ならびに折り畳まれていないポリペプチ ドおよびペプチドに特異的に結合し得る。従って、適切なポリペプチド、ペプチ ド、またはATPを含むサンプルを考慮してタンパク質を混合した後の、タンパク 質−タンパク質またはタンパク質−核酸複合体の生成の存在または不在の決定は 、Hsp70遺伝子またはタンパク質の明白な存在または不在を示し、この存在また は不在は、抗体ベースのアッセイのような他のアッセイを利用して確認され得る 。 ストレスタンパク質、またはストレスタンパク質に結合した物質（例えば、タ ンパク質もしくはオリゴ糖）に対する特異的な細胞性または体液性の免疫を誘発 するための、ワクチンとしての、本発明のストレスタンパク質の有効な投薬量は 、１回の注入あたり0.1〜1000μg hspの範囲であり、ストレスタンパク質が投与 される個体に依存する（Lussow，A.R.ら、Eur．J．Immun.，21:2297−2302（199 1）；Barrios，C.ら、Eur．J．Immun.，22:1365−1372（1992））。各個体につ いてのストレスタンパク質の適切な投薬量は、例えば、投与される特定のストレ スタンパク質、ストレスタンパク質が投与される個体のタイプ、個体の年齢およ び大きさ、処置または予防される状熊、ならびに状態の重篤度を考慮して決定さ れる。当業者は、日常的な実験だけを使用して、個体に投与するための適切な投 薬量を決定し得る。 ワクチンに存在する、ストレスタンパク質、ストレスタンパク質の部分、スト レスタンパク質の機能的等価物、およびストレスタンパク質が混合、融合、また は結合される抗原は、公知の技術を用いて生成され得るか、または得ることがで きる。例えば、インフルエンザウイルスのストレスタンパク質および／または抗 原は、それらが天然に生じる供給源から得られ（単離され）得るか、所望のスト レスタンパク質もしくは抗原をコードする遺伝子をクローニングおよび発現する ことによって生成され得るか、または化学的もしくは機械的に合成され得る。 本明細書中に記載される組成物は、多様な病原体（例えば、細菌、ウイルス、 寄生虫）に対する免疫応答を誘導するために使用され得る。インフルエンザウイ ルスの抗原、および１つ以上のストレスタンパク質の全体もしくは部分、または 抗原に対する免疫応答を誘導ためのストレスタンパク質のアミノ酸配列に十分相 同であるアミノ酸配列を有するタンパク質の全体もしくは部分は、インフルエン ザウイルスに感受性の任意の脊椎動物（例えば、哺乳動物、家禽）において、イ ンフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用され得る。例えば 、組成物は、霊長類（例えば、ヒト）、ウマ、ブタ、シチメンチョウ、およびニ ワトリにおいて、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使 用され得る。 本明細書中に記載される組成物は、種々の様式で宿主に投与され得る。投与の 経路としては、皮内、経皮（例えば、遅延放出ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静 脈内、皮下、経口、硬膜外、および鼻腔内の経路が挙げられる。任意の他の投与 の都合の良い経路（例えば、注入もしくはボーラス注射）、または上皮のもしく は粘膜皮膚の内層を介する吸収が使用され得る。さらに、本明細書中で記載され る組成物は、他の成分または生物学的に活性な薬剤（例えば、ミョウバン）、薬 学的に受容可能な界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクト ース）、キャリア、希釈剤、およびビヒクルとともに投与され得る。 さらに、ストレスタンパク質および／またはペプチド（peptidic）抗原は、こ れらをコードするポリヌクレオチドのインビボ発現によって、哺乳動物被験体に 投与され得る。すなわち、ベクターが、抗原およびストレスタンパク質をコード する核酸、または抗原およびストレスタンパク質配列を含む融合タンパク質をコ ードする核酸を送達するために使用され得る。例えば、ストレスタンパク質およ び／または抗原は、生きたベクターを用いて宿主（哺乳動物）に投与され得、こ こでストレスタンパク質および抗原の核酸配列を含む生きたベクターは、抗原お よび／またはストレスタンパク質がインビボで発現される条件下で投与される。 例えば、哺乳動物は、タンパク質もしくはペプチドの形態でのストレスタンパク 質と組合わせて、またはストレスタンパク質をコードし、そしてこれをインビボ で発現するベクターと組合わせて、抗原をコードし、そしてインビボでこれを発 現するベクターを用いて、注入され得る。あるいは、宿主は、ペプチドもしくは タンパク質の形態での抗原と組合わせて、または抗原をコードし、そしてこれを インビボで発現するベクターと組合わせて、ストレスタンパク質をコードし、そ してこれをインビボで発現するベクターを用いて、注入され得る。タンパク質（ ペプチド）抗原をコードする配列を含む単一のベクターはまた、本発明の組成物 のために使用され得る。 いくつかの発現ベクター系が、市販されているか、または組換えDNAおよび細 胞培養技術に従って再生され得る。例えば、酵母もしくはワクシニアウイルスの 発現系のようなベクター系、またはウイルスベクターは、本発明の方法および組 成物において使用され得る（Kauflnan，R.J.、A J．of Meth．Cell and Molec． Biol.，2:221−236（1990））。裸のプラスミドまたはDNA、および標的化リポソ ームにおいてもしくは赤血球ゴーストにおいてカプセル化されているクローン化 遺伝子を使用する他の技術は、ストレスタンパク質および／または抗原ポリヌク レオチドを宿主に導入するために使用され得る（Freidman，T.、Science、244:1 275-1281(199)；Rabinovich，N.R.ら、science、265:1401−1404(1994)）。発現 ベクターの構築、ならびにベクターおよび核酸の種々の宿主細胞への移入は、Mo lecular BiologyにおけるMolecular CloningおよびCurrent Protocols（これら は、本明細書によって参考として援用される）のような手引書に記載されるよう に、または、市販のキットを使用することによって、遺伝子操作技術を用いて達 成され得る（Sambrook，J.ら、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Press ，1989；Ausubel，F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、1989））。 本発明の組成物におけるストレスタンパク質および／または抗原の量は、宿主 （哺乳動物のような脊椎動物）において有効な免疫刺激応答を生成する量である 。有効量は、投与される場合、投与されない場合の免疫応答に比べて増強された 免疫応答を生じるような量である。すなわち、有効量は、抗原またはストレスタ ンパク質単独の類似の量よりも明白な免疫応答を提供する量である。さらに、宿 主に投与されるストレスタンパク質および／または抗原の量は、多様な因子に依 存 して変化し、これは用いられる抗原、宿主の大きさ、年齢、体重、全体の健常度 、性別、および食餌、ならびに投与の時間、持続時間、またはインフルエンザウ イルスの特定の特質を含む。確立された用量範囲の調整および操作は、当業者の 能力の十分な範囲内である。例えば、ストレスタンパク質および抗原の量は、約 100μg〜約１g、好ましくは約１mg〜約１g、および約1mg〜約100mgであり得る。 本発明は、ストレスタンパク質の存在が、抗原に対する細胞媒介性の細胞溶解 応答を非常に刺激することを教示する。腫瘍関連抗原は同定されているが、これ らの抗原に対する免疫応答単独は、治療学的に有効ではない。混合物中での、ま たは抗原に連結されるかのいずれかでの、ストレスタンパク質の同時投与による 、これらの抗原に対する細胞応答の増強は、ガン治療において有益である。この 予測は、本発明の組成物が、その後の腫瘍チャレンジに対して哺乳動物を免疫す るという実施例に詳述される観察によって、支持される。抗原に対する、細胞媒 介性の、細胞溶解応答の増強は、同じ抗原に対する、先存の（Th2媒介性の）体 液性応答のダウンレギュレーションを生じることが予測される。それゆえ、本発 明はまた、アレルギー性応答を抑制するために有用である。最後に、Ｔ細胞媒介 性免疫はまた、ウイルス、原生動物、および特定の細胞内細菌（例えば、マイコ バクテリア）によって引き起こされる感染に対する哺乳動物宿主防御において、 重要なエレメントであることが考慮される。実施例において示されるように、ス トレスタンパク質およびインフルエンザウイルス抗原を含む本発明の組成物（混 合物、結合体、および融合タンパク質）は、ウイルス抗原を発現する哺乳動物細 胞に対して、実質的な細胞媒介性の細胞溶解応答を誘発するにおいて有効である 。 本発明は、以下の実施例によって説明され、これはいかようにも限定されるこ とを意図されない。 実施例 実施例１：組換えストレスタンパク質の単離 Ａ．組換えマイコバクテリアHsp70。プラスミドY3111は、発現制御配列の間に 機能的に挿入されたM．tuberculosis Hsp70遺伝子を含む。（Mehlert，A.および Young，D.B.、Mol．Microbiol.、3:125-130(1989)）。短縮型Hsp70遺伝子を含む E.coli株CG2027（C．Georgopoulos、University of Geneva，Switzerlandから得 た）を、標準的な手順によって、プラスミドY3111で形質転換した。（Maniatis ら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator y，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)）。 プラスミドY3111を含有する細菌を、100μg/mlアンピシリンを含有する２×YT 培地（１リットル当たり、20gトリプトン、10g酵母抽出物、10g NaCl）中で、37 ℃で、撹拌しながら（250rpm）、一晩、増殖させた。10％グリセロールストック を、この培養液から調製し、そして-70℃で保存した。凍結したグリセロールス トックからのいくつかの削片を、大量培養物を接種するために使用し、これを約 48時間になる前まで、インキュベートした。590nmでの光学密度が、2.5〜3.5に 達した場合、細胞を遠心分離によって回収した。 以下の工程を、４℃で行った。細胞ペレットを、１g当たり３mlの溶解緩衝液 中に再懸濁した。溶解緩衝液の組成は、10mM Tris-HCl、２mMエチレンジアミン 四酢酸（EDTA）、５mM β-メルカプトエタノール、10μg/mlアプロチニン、10μ g/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチンであった。リゾチームを、0.14 mg/mlの最終濃度になるまで、細胞懸濁液に添加した。次いで、懸濁液を、-70℃ で凍結した。 細胞懸濁液を解凍し、そして細胞を、超音波処理によって破壊した。超音波処 理物を、17,000rpmで、30分間の遠心分離に供した。（JA-17ローター、Beckmann ）。固体の(NH₄)₂SO₄を、上清溶液が(NH₄)₂SO₄で65%飽和されるまで、上清溶液 に添加した。インキュベーションの30分後、混合液を以前のように遠心分離した 。ペレットを、Q SEPHAROSE緩衝液Ａに溶解した。この溶液に、10μｇ/mlアプロ チン、10μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチンを添加し、そして溶 液を65容量のQ SEPHAROSE緩衝液Aに対して、一晩、透析した。Q SEPHAROSE緩衝 液Ａは、30mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、５mM β-メルカプトエタノールを含 んだ。透析した溶液を、以前に記載のように、遠心分離によって澄明化した。 透析した溶液を、Q SEPHAROSE緩衝液Ａ中で平衡化したQ SEPHAROSEカラム（Ph armacia）にアプライした。カラムを、２容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出は 、0〜600mM NaCl勾配を伴った。画分を、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色に よ って、主要な71kDaポリペプチド（すなわち、組換えM．tuberculosis Hsp70タン パク質）の存在について試験した。ポリペプチドを含む画分をプールし、そして このプールを、固体の(NH₄)₂SO₄の添加によって65％飽和にさせた。混合液を、 以前に記載のように遠心分離し、ペレットをATP開始緩衝液（50mM Tris-HCl(pH8 .0)、20mM NaCl、５mM MgCl₂、15mM β-メルカプトエタノール、および0.1mM ED TA）に溶解し、そして得られたタンパク質溶液を、一晩、65容量の同じ緩衝液に 対して透析し、そして遠心分離によって澄明化した。 次いで、透析したタンパク質溶液を、ATP開始緩衝液中で平衡化したATP-アガ ロースカラム（Fluka）にアプライした。カラムを1M NaClを含有する１カラム容 量のATP開始緩衝液で洗浄した。溶出を、10mM ATPを補充したATP開始緩衝液を用 いて達成した。溶出物を、(NH₄)₂SO₄で65%飽和にさせ、そして沈殿したタンパク 質を、以前に記載のように回収した。遠心分離ペレットを、溶解し、そして200 容量のBlue SEPHAROSE緩衝液（30mM Tris-HCl（pH7.5）、５mM MgCl₂、５mM β- メルカプトエタノール）に対して透析した。 最後の工程からの透析したタンパク質溶液を、Blue SEPHAROSE緩衝液中で平衡 化したBlue SEPHAROSEカラム（Pharmacia）にアプライした。カラムを、1.5カラ ム容量の同じ緩衝液で洗浄した。溶出し、そして画分を、単一のプールとして回 収した。 最終調製物の純度を、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって、マイコバ クテリアのHsp70およびE．coli Hsp70にそれぞれ特異的なマウスモノクローナル 抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって（Maniatisら、Molecular Clon ing，A Laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Har bor、NY（1982）；（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第 ２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY（1989）を参照のこと））、 ならびにATPアーゼ活性のアッセイによって、評価した。調製物は、クマシーブ ルー染色されたゲル中の調製物の染色パターンに基づいて、代表的に、90%を超 えて純粋であり、そして好ましくは95%を超えて純粋であり、ならびに1%未満のE ．coli Hsp60を含み、そして検出可能なE．coli Hsp70を含まなかった。 Ｂ．マイコバクテリアのHsp60 プラスミドRIB1300は、発現制御配列の間に機能的に挿入されたM．bovis BCG Hsp60遺伝子を含む。（Thole，J.E.R.ら、J．Exp．Med.，178:343-348（1993） ）。E．coli株M1546を、標準的な手順を用いて、プラスミドRIB1300（Tholeら、 J.E.R.、上述）で形質転換した。Maniatisら、Molecular Cloning、A Laborator y Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1982） ）。 プラスミドRIB1300を含有する細菌の接種物を、200μg/mlのアンピシリンを含 有するNCZYM培地（１リットル当たり10g N-ZアミンＡ、５g Bacto酵母抽出物、1 gカサミノ酸（Casamino acid）、５g NaCl、２g(NH₄)₂SO₄-7H₂O））において、2 8℃で、および撹拌下、飽和に増殖させた。この培養物を、大量培養を接種する ために使用し、これを接種培養と同じ条件下で、590nmの光学密度での培養物の 光学密度が0.3〜0.6の間になるまで増殖した。組換えタンパク質の生成を、熱水 浴におけるインキュベーションによって、培養物の温度を42℃に急速上昇するこ とによって、開始した。培養を、この温度で、３時間、維持した。次いで、細菌 を遠心分離によって回収し、そして細菌ペレットの１重量あたり６容量の溶解緩 衝液に再懸濁した。溶解緩衝液は、10mM Tris-JCL（pH8.0）、10mMエチレンジア ミン四酢酸（EDTA）、0.1mM PMSF、および0.1％ RIVM BA（50mlあたり、0.104g 4-アミノ-ベンズアミジン-2HCl、0.066g ε-アミノカプロン酸）を含んだ。リゾ チームを、0.1mg/mlの濃度に添加し、そして懸濁液を-70℃で凍結した。 細菌懸濁液を解凍し、そして４℃に置いた。以下の操作をこの温度で行った。 細菌の完全な溶解を、超音波処理によって達成した。超音波処理物を、17,000rp mで、30分間、JA-70ローター（Beckman）において遠心分離した。飽和化(NH₄)₂S O₄を、20％飽和が達成されるまで、上清溶液に添加した。沈殿物を、遠心分離（ 上述を参照のこと）によって回収し、そして破棄した。上清溶液を、飽和化(NH₄ )₂SO₄の添加によって、55％飽和にさせた。上清の遠心分離によって得られるペ レットを、TE緩衝液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、15mM β-メルカプトエタノール 、１mM EDTA）中に溶解した。次いで、TE中のタンパク質溶液を、50容量のTE緩 衝液に対して透析した。 沈殿された物質を除去するための遠心分離後（上述のように）、透析したタン パク質溶液を、DEAE SEPHAROSE（Pharmacia）カラムにアプライした。TE緩衝液 での洗浄後、タンパク質をTE緩衝液中の０〜300mM NaCl勾配で溶出した。M．bov is BCG Hsp60（実際の見かけの分子量は、65kDaに等しい）を含む画分を、SDS-P AGEおよびクマシーブルー染色によって同定し、そしてプールした。10μg/mlア プロチニン、10μg/mlロイペプチン、および１μg/mlペプスタチンを、このプー ルに添加し、次いでこれを、YM30メンブレンを用いてAmiconセルに濃縮した。 濃縮したプールを、S200緩衝液（10mM NaHPO₄（pH6.8）、150mM NaCl、および 15mMβ-メルカプトエタノール）で平衡化したS-200 SEPHACRYL（Pharmacia）カ ラムにアプライした。溶出は、同じ緩衝液を用いてであった。画分を、以前のよ うにマイコバクテリアのHsp60の存在について試験し、そして高度に精製された タンパク質を含有するポジティブな画分をプールし、そしてHAP緩衝液（10mM Na₂ HPO₄（pH6.8）、15mMβ-メルカプトエタノール）に対して、一晩、透析した。 透析したプールを、HAP緩衝液中で平衡化したヒドロキシアパタイト（Bio-Rad ；Bio-Gel HTP Gel）カラムにアプライした。カラムを、３カラム容量の１mN Mg Cl₂および15mMβ-メルカプトエタノール、次いで１mM NaHPO₄（pH6.8）および15 mMβ-メルカプトエタノールで洗浄した。タンパク質を、10〜60mMリン酸勾配で 溶出した。画分を、以前のように試験し、そしてポジティブな画分をプールし、 濃縮し、そしてPD10を介するゲル濾過によって0.85％ NaClに交換した。マイコ バクテリアのHsp60の純度を、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって、な らびにE．coli Hsp70およびHsp60に特異的な抗体を使用するウエスタンブロット 分析によって、評価した。調製物は、代表的に、90%を超える純度であり、なら びにそれぞれ、0.5%を超えないE．coli HSP60および0.1〜0.2％のE．coli Hsp70 を含んだ。 HSP調製物は、DetoxiGel樹脂に対するアフィニティークロマトグラフィーによ って、ポリミキシンＢを添加して、または（あまり好ましくないが）Triton X-1 14のような界面活性剤を用いる溶出によってのいずれかで、脱発熱化し得る（de pyrogenate）。 実施例２：NPペプチドおよびhsp70の混合物を含有する組成物に対するCTL応答ａ．hsp70タンパク質およびNPペプチドの調製 Hsp70（ここでは、M．tuberculo sis hsp71）を、実施例１に記載のように調製した。完全なNPにおける363-374残 基に対応するアミノ酸配列VQLASNENMETM（配列番号１）を有し、そして公知のCT Lエピトープ（H-2b制限される）を含む、NPペプチド（本明細書中でNP．Bとして 称される；Motal，U.M.A.ら、Eur．J．Immunol.、25:1121-1124（1995）および そこにおける参考文献）を、αアミノ保護基としてFmoc（9-フルオレニルメチル オキシカルボニル）を用い、および固相支持体としてHMP（Wang）樹脂を用いて 、Applied Biosystems model 431Aペプチド合成機において、合成的に生成した （0.25mMスケール）。全てのアミノ酸および合成化学薬品は、Applied biosyste msから購入した。 NP.Bを、支持体から切断し、そして連続的な撹拌下で、３時間、10mlトリフル オロ酢酸、0.5m1水、0.75g結晶性フェノール、0.25mlエタンジチオール、および 0.5mlトリアニソールを混合することによって調製した２mlの混合物中で、NP.B- 樹脂をインキュベートすることによって、側鎖の保護基を除去した。切断混合物 を、40mlの氷冷ジエチルエーテルに濾過した。不溶性の物質を、5000×gで、８ 分間の遠心分離によって回収した。エーテルをデカントし、そしてペレットを、 冷却ジエチルエーテルにおける再懸濁、次いで遠心分離によって、３回洗浄した 。最後の洗浄後、ペレットを風乾し、蒸留水中にとり、そして凍結乾燥した。 ｂ．マウスの免疫およびエフェクター細胞の調製 NP.Bペプチドを、小容量のダルベッコPBS（DPBS；2.7mM KH₂PO₄、4.3mM Na₂HP O₄、2.7mM KCl、0.137M NaCl）に溶解した。ペプチドNP.Bの、それぞれ、1.89、 18.9または189μgのアリコートを、DPBS中のhsp71の100μgのアリコートと混合 し、それぞれ、１、10、または100のペプチド：hspのモル比を有する組成物を得 た。株C57BL/6の４匹の雌性マウスの群は、免疫されないままであるか（コント ロール）または３つの異なるNP.B-hsp71混合物で、頸部の首筋に皮下注射された かのいずれかであった。７日後、マウスを頸部脱臼によって安楽死させ、それら の脾臓を取り出した。プールした脾臓の単一の細胞懸濁液を調製し、そして「完 全培 地」（これは、10%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン酸、１mMピルビン酸ナトリ ウム、50μM 2-メルカプトエタノール、および50μg/mlゲンタマイシン硫酸を補 充したRPMI-1640培地であった）中で、１回洗浄した。0.1μmol濃度でのNP.B.ペ プチドとともに、５日間、25×10⁶個の生存細胞を培養することによって、リン パ様細胞を再剌激した。培養物を、直立の25cm²フラスコ中で、10ml完全培地と ともに、37℃および５% CO₂で、インキュベートした。次いで、培養物（エフェ クター細胞）を、下記のCTL活性アッセイにおいて使用した。 ｃ．CTL活性アッセイ EL4細胞（H-2b）を、標的細胞として使用した。細胞を、10⁶細胞当たり150μC i Na₂CrO₄および10μg NP.Bペプチドとともに、90分間インキュベートした。大 量に洗浄して過剰な放射標識を除去した後、10⁴標識化標的細胞を、再刺激した エフェクター細胞とともに、種々のエフェクター：標的細胞比で、同時培養した 。インキュベーションの４〜５時間後、培養プレートを、５分間、200×gで遠心 分離し、そして細胞から放出された放射標識を含む上清液の100μlアリコートを 、Beckman Ready Capsに回収した。放射能を、液体シンチレーションカウンティ ングによって測定した。自発的に放出された放射能、および放出可能な全放射能 を測定するために、標的細胞のみを含む培養物からの上清液、またはTriton X-1 00の添加によって溶解された標的細胞からの上清液を回収し、そして放射能を以 前のように測定した。結果は、特異的溶解％として表され、以下の式に基づいて 算定された： 特異的溶解パーセント＝100×（cpm試験−cpm自発）／（cpm全体−cpm自発）、 ここでcpm試験は、特定の同時培養から放出された放射能であり、cpm自発は、標 的細胞培養物の自発的に放出された放射能であり、およびcpm全体は、標的細胞 のTriton X-100溶解によって放出される放射能である。CTLアッセイを、３連で 行い、そして平均値を提供した。 実験の結果を図１に示す。コントロール反応（すなわち、標的細胞と、免疫さ れていないマウスから調製されたエフェクター細胞との同時培養のクロミウム放 出のアッセイ）は、100のエフェクター：標的細胞比で、約10%の溶解についての バックグラウンド値を提供する。１：１または10：１のNP.B−hsp71混合物で免 疫したマウスからのエフェクター細胞を用いて、バックグラウンドを超える、CT L活性の増強は、何も観察されなかった。非常に増強された溶解は、NP.Bペプチ ドおよびhsp71の100：１の混合物で免疫したマウスからのエフェクター細胞を用 いて見出され、これはNP.Bのようなペプチドと、hsp71のようなhspとの同時免疫 は、ペプチドを提示する細胞に対してCTL活性を、強烈に刺激し得ることを実証 する。当該分野において周知であるように、DPBS中のNP.Bペプチド単独での免疫 は、CTL活性を刺激しないことに注目のこと。 実施例３：NPペプチドとhsp70との化学結合体を含む組成物に対するCTL応答 ａ．hsp70およびNPペプチドの調製 M．tuberculosis hsp71を、実施例１に記載のように調製した。NP.Bペプチド を、ペプチドが過剰のアミノ末端システイン残基を含み、従ってアミノ酸配列CV QIASNENMETM（配列番号２）を有した以外は、実施例２で議論したように合成し た。 ｂ．hsp70およびジフテリアトキソイドへのNp.Bペプチドの化学結合 結合を、hsp70、およびCTL活性特異的刺激の効力の比較のための標準を提供す る、一般的に使用されるキャリアタンパク質ジフテリアトキソイド（DTと省略す る；DTを商業的供給源から得た）の両方を用いて行った。 b.1．M.tuberculosis hsp71およびDTキャリアタンパク質の活性化 ９mgのhsp71を、4.5mlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に溶解した。 スルホ-MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステ ル)（100μlジメチルスルホキサミン中2.3mg）をタンパク質に添加し、そして反 応混合物を、室温で１時間インキュベートした。次いで、pHを6.0に調整し、そ して反応混合物を、４℃で一晩、１リットルの20mMリン酸ナトリウムおよび150m M NaCl（pH5.6）に対して透析した。DTを同様に処理した。 b.2.結合のためのNP.Bペプチドの調製 各結合反応のために、３mgのペプチドを、100μlの0.1Mβ-メルカプトエタノ ールに溶解した。ペプチドの還元を可能にする１時間のインキュベーション後、 還元剤を、反応混合物をSpecdVac遠心分離器において乾燥することにより除去し た。ペプチドを0.5ml蒸留水に再溶解し、これに１N NaOHの５μlアリコートを、 ペプチドが完全に溶解するまで添加した。DTとの結合実験のために、６mgのペプ チドを還元し、次いで１mlの水に再溶解した。 b.3.結合体形成 活性化キャリアタンパク質溶液のpHを、0.1N NaOHを用いて6.8に調整した。３ mgの活性化キャリアタンパク質を含む溶液を、連続的に混合しながら室温で３時 間、0.5mlの還元されたペプチド溶液（または、DTとの結合体の調製については １mlの還元されたペプチド溶液）と反応させた。未反応ペプチドを除去するため に、得られた結合体含有溶液を、４℃で一晩、１リットルの20mMリン酸ナトリウ ムおよび150mM NaCl（pH７）に対して透析した。タンパク質濃度をBCAアッセイ により決定した。この手順により達成された結合効率は、放射性標識されたNP.B ペプチドを用いる前予備実験（prior pilot experiment）において決定した。ペ プチド：タンパク質比は、NP.B-hsp71結合体（71.NP）については17.5、そしてN P.B-DT(DT.NP)については10.1であると見出された。 ｃ．マウスの免疫化およびエフェクター細胞の調製 １〜100μgの71.NPおよびDT.NP結合体での免疫化ならびにエフェクター細胞の 調製を、実施例２に記載のように行った。 ｄ．CTL活性アッセイ アッセイを実施例２に記載のように行った。 結果 得られた結果を図２に示す。DPBSまたは１もしくは10μgのDT.NP結合体を注射 したマウスに由来するエフェクター細胞を用いたCTL活性アッセイは、ネガティ ブな結果を与えた（図２の最も下の線）。100μgのDT.NPを注射したエフェクタ ー細胞のみが、１μgの71.NPで免疫化したマウスに由来するエフェクター細胞の CTL活性に匹敵する、測定可能な（エフエクター：標的細胞比100で５〜10％溶解 ）CTL活性を生じた。10または100μgの71.NP結合体で免疫化したマウスに由来す るエフェクター細胞を用いたアッセイは、実質的に、より大きなCTL活性（すな わち、エフェクター：標的細胞比100で15〜25％の標的細胞溶解）を示した。こ の実験は、NP.Bペプチドおよびhsp71の例について、ペプチド-hsp結合体での免 疫化が、このペプチドを提示する細胞に対して指向される特異的CTL活性を刺激 することを証明する。 実施例４：hsp-NP融合タンパク質を含む組成物に対するCTL応答 ａ．hsp-NP融合タンパク質の調製 a.1.マイコバクテリアhsp65カルボキシ末端にNP CTLエピトープを含む融合タン パク質をコードする発現プラスミドの調製 hsp65融合タンパク質の一部として、H-2b CTLエピトープNP.B（上記を参照の こと）またはH-2^dCTLエピトープNP.D（NPの残基147〜155；Levi,R.およびArnon ，R.,Vaccines,14:85-92(1996)ならびに本明細書中の参考文献）を含むインフル エンザウイルスNP配列を発現するプラスミドを構築した。 pET系プラスミド（Novagen）に由来し、そして完全M.bovis BCG hsp65遺伝子 およびhsp65遺伝子のカルボキシ末端でのさらなるコード配列の挿入に有用な制 限部位を含む、発現ベクターpET65mpを、予め構築した。このベクターの模式図 を図３に提供する。 プラスミドpcDNA1（Invitrogen）により提供されるサイトメガロウイルスプロ モーターの制御下でインフルエンザウイルスA/PR/8/34株のNPのオープンリーデ ィングフレームを含む構築物pNP/cAを、Peter Palese博士(Dept.Of Microbiolog y,Mount Sinal School of Medicine,New York,NY)から得た。 NP.BおよびNP.Dエピトープを含むフラグメントの増幅のための２つのプライマ ー対を、自動化オリゴヌクレオチド合成機において合成し、そして日常的な手順 を用いて精製した。正方向プライマーは、NP配列に相補的な適切な配列に加えて EcoRI制限部位を含み、そして逆方向プライマーはSpeI制限部位を含んでいた。N P.Dフラグメントについての正方向プライマーは、配列5'AAAGAAGAATTCAGGCGAATC （配列番号３）を有し、そして逆方向プライマーは、配列5'GTTCCGATCACTAGTCCC ACG（配列番号４）を有した。この対は、NP残基117〜200を含むフラグメントを 増幅するように設計された。NP.Bフラグメントについての正方向プライマーは、 配列5'CTGCTTGAATTCAGCCAAGTG（配列番号５）を有し、そして逆方向プライマー は、配列5'CTGTTGACTAGTGTTTCCTCC（配列番号６）を有した。後者の対は、NP残 基310〜395を含むフラグメントを生成するように設計された。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、上記のプライマー対およびDNAテンプレート としてpNP/cAを用いて行った。PCRフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼEco RIおよびSpeIで２重消化し、そして日常的なサブクローニング手順（Maniatisら 、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spr ing Harbor,NY(1989)）を用いてEcoRI/SpeI切断pET65mpに連結した。E.coli DH5 α株の形質転換コンピテント細胞を連結混合物で形質転換し、そして100μg/ml アンピシリンを含む寒天にプレートした。形質転換された細胞のコロニーを単離 し、そしてプラスミドDNAを調製し、そして制限地図作成およびヌクレオチド配 列決定により適切なhsp65-NP.BまたはD融合遺伝子配列の存在について分析した 。hsp65-NP.B（pET65mp/B）およびhsp65-NP.D（pET65mp/D）融合タンパク質をコ ードする適切な構築物を同定し、そして細菌における融合タンパク質の発現およ びそれらの精製がねらいの後の操作において使用した。融合タンパク質遺伝子構 築物（それぞれ、pET65MP/NP-BおよびpET65MP/NP-D）の模式図については図4A〜 4Bを参照のこと。 a.2．hsp65-NP融合タンパク質の発現および精製 融合タンパク質構築物をE.coli BL21株（DE3；Novagen）に形質転換し、そし て融合タンパク質を、供給者の示唆したプロトコルに密接に類似したプロトコル を用いて、後者の株の６リットル培養物において発現させた。細胞を遠心分離に より採集し、10mM Tris-HCl₂、２mM EDTA、および５mM β-メルカプトエタノー ル （pH7.5）に懸濁し、そして超音波処理により溶解した。不溶性物質を遠心分離 により除去した後、硫酸アンモニウムを20％飽和まで添加し、そして沈殿タンパ ク質を遠心分離により収集した。硫酸アンモニウムペレット中の融合タンパク質 の存在を、SDS-PAGE、続いてクマシーブルー染色により確認した。同じアッセイ を使用して、後の全ての精製工程をモニターした。タンパク質を、30mM Tris-HC l、２mM EDTA、および５mM β-メルカプトエタノール（pH7.5）に再溶解し、そ して溶液を、同じ緩衝液中で平衡化されたDEAE Sepharose（ファーストフロー（ fast flow）、Pharmacia Biotech）カラムに適用する前に、同じ緩衝液に対して 徹底的に透析した。フロースルー画分（非結合タンパク質）を収集し、これは代 表的に約90mgのタンパク質を含んでいた。hsp65-NP.B融合タンパク質をさらに精 製するために、60mgの後者の画分を、10mMリン酸ナトリウム（pH6.8）に対して 透析し、次いで、同じ緩衝液中で平衡化されたヒドロキシアパタイト(BIORAD)カ ラムに適用した。溶出を、０〜600mMリン酸カリウム勾配を用いて行った。この 手順は、約５mgのタンパク質の回収しかもたらさなかった。次いで、カラムを４ M塩酸グアニジンでさらに溶出し、これによりさらに15mgのタンパク質が取り出 された。この画分をDPBSに対して透析し、そしてフロースルー発熱物質除去(dep yrogenation)のためにDetoxielカラムに適用する前に、Amicon限外濾過デバイス を用いて濃縮した。hsp65-NP.D融合タンパク質をさらに精製するために、DEAE S epharoseフロースルー画分を、30mM酢酸ナトリウム、２mM EDTA、および５mM β -メルカプトエタノール（pH5.8〜7.5）に対して透析し、次いで、同じ緩衝液中 で平衡化されたSP Sepharose（ファーストフロー、Pharmacia Biotech）カラム に適用した。溶出は、０〜600mM NaCl勾配を用いた。溶出されたhsp65-NP.D融合 タンパク質を、hsp65-NP.B融合タンパク質について記載されたように処理した。 これらの手順により精製された融合タンパク質は、染色されたSDS-PAGEゲルから 評価されたように90％を超えて純粋であり、そして実質的に発熱物質を含まなか った。 ｂ．マウスの免疫化およびエフェクター細胞の調製 C57BL/6マウスをhsp65-NP.Bを用いた実験において使用し、そしてBALB/cマウ スをhsp65-NP.Dを用いた実験において使用したことを除いて、DPBS（図５および ６において０μg 65-NPと呼ぶ）または１〜100μgのhsp65-NP.Bもしくはhsp65-N P.D融合タンパク質を用いた免疫化、ならびにエフェクター細胞の調製を、本質 的に実施例２に記載のように行った。インビトロ再刺激を、（一般的に、Ｔ細胞 増殖を刺激するために）３U/mlの組換えヒトIL-2の非存在下または存在下のいず れかで７日間の期間にわたって行った。 ｃ．CTLアッセイ EL4(H-2b)標的細胞をhsp65-NP.B融合タンパク質を用いた実験において使用し 、そしてP815(H-2^d)標的細胞をhsp65-NP.D融合タンパク質を用いた実験に使用し たことを除いて、アッセイを本質的に実施例２に記載のように行った。CTL応答 の特異性についてのさらなるコントロールを提供するために、標的細胞を、適切 なNPペプチドでパルスしたか（図5A〜5Bおよび図6A〜6Bの黒記号）、HPV16E7タ ンパク質の配列に由来する無関係な残基49〜57ペプチドでパルスしたか（図5A〜 5Bの白記号）、またはパルスしなかった（図6A〜6Bの白記号）。 hsp65-NP.B融合タンパク質（65-P.bと標識された）を用いた実験の結果を、図 5A〜5Bに示す。図5Aは、エフェクター細胞をIL2の非存在下で再刺激した実験を 指し、そして図5Bは、エフェクター細胞をIL2の存在下で再刺激した実験を指す 。図5Aから明らかなように、hsp65-NP.B融合タンパク質を用いた免疫化は、エフ ェクター：標的細胞比100で標的細胞の約20〜40％溶解の範囲にわたる、NP.Bペ プチドを提示する標的細胞に対して指向される特異的CTL活性の劇的な刺激をも たらす。本質的に、特異的な溶解は、DPBS「免疫化」動物に由来するエフェクタ ー細胞で観察されなかった。また、E7ペプチドでパルスされた細胞の有意な溶解 は明らかでなかった。IL2の存在下で再刺激されたエフェクター細胞を用いる実 験において、さらにより高いレベルの標的細胞溶解が、hsp65-NP.B融合タンパク 質免疫化マウスに由来するエフェクター細胞で観察された。レベルは、融合タン パク質用量に依存して、エフェクター：標的細胞比100で約25〜60％の範囲にわ たった。これらの値は、DPBS注射マウスに由来するエフェクター細胞で観察され た10〜15％溶解を大いに越えた。さらに、E7ペプチドでパルスされた標的細胞の 有 意な（DPBS「免疫化」マウスに由来するエフェクター細胞で観察された特異的溶 解より大きな）特異的溶解は観察されなかった。 hsp65-NP.D融合タンパク質（65-NP.Dと標識された）を用いた実験の結果を、 図6A〜6Bに示す。一般的に、これらの結果は、hsp65-NP.B融合タンパク質を用い た実験において得られた結果に類似する。hsp65-NP.Bを用いた以前の実験とは異 なり、免疫化に使用されたhsp65-NP.Dペプチドの用量への明らかな依存がこの実 験において観察されたことに留意のこと。全体として、例としてhsp65-NP融合タ ンパク質を使用するこれらの実験は、hsp外来ペプチド／ポリペプチド融合タン パク質を用いる免疫化が、外来ペプチド／ポリペプチド融合パートナーに含まれ るエピトープを提示する適切な標的細胞に対して指向されるCTL活性の激烈な刺 激をもたらすことを証明する。 実施例５．hsp-P1A融合タンパク質に対するCTL応答 上記の実施例において使用された手順に類似した手順を用いて、M.tuberculos isストレスタンパク質hsp71の完全コード配列、およびhsp71配列のカルボキシ末 端に付加された、腫瘍関連抗原P1Aの最小CTLエピトープ（LPYLGWLVP（配列番号 ７）；この配列を本実施例においてP1Aと呼ぶ）をコードする合成配列の４つの タンデムに配置されたコピーを含む融合遺伝子のE.coliにおける発現を可能にす る、プラスミドを構築した。Hsp71-P1A融合タンパク質（図7A、7B、8A、8B、お よび９において71-P1A(4)と呼ぶ）を発現させ、そして上記の実施例において使 用された方法に類似した標準的な生化学的方法を用いて精製した。 BALB/cまたはDBA/2(H-2^d)マウスを、塩酸ケタミンの腹腔内注射により麻酔し た。次いで、マウスを、０、５、50、または500μgのhsp71-P1A融合タンパク質 を用いて首の項部に皮下免疫化した。免疫原を、アジュバントを伴わずにDPBS中 で投与した。１週間後、１群あたり４つのプールされた脾臓に由来する単細胞懸 濁物を調製し、そして合成ペプチドCKKKLPYLGWLVP（配列番号８）（１μM）を用 いて７日間インビトロで再刺激した。CKKK残基はP1A ９量体の水性溶解度（aque ous solubility）を増強するために添加されたことに留意のこと。次いで、再刺 激されたエフェクター細胞を、⁵¹Cr標識標的細胞と共に４〜５時間培養した。標 的は、エフェクター：標的比100、33、または11：１で、P815肥満細胞腫のP1A抗 原発現クローンP1(H-2^d)細胞、または(CKKK)P1AでパルスされたL1210細胞(H-2^d) 、あるいはコントロール標的としてのパルスされていないL1210細胞であった。 標的細胞の特異的溶解を、実施例２に記載のように決定した。これらの実験の結 果を、図7A〜7B（BALB/cマウス）および図8A〜8B（DBA/2マウス）に示す。これ らの実験におけるバックグラウンド溶解は、無関係な標的細胞（パルスされてい ないL1210細胞）に対して観察された溶解活性により示されるように、５％未満 であった。非免疫化マウス（０μg）に由来する再刺激細胞は、P1標的細胞（図7 A、8A）に対してもCKKK（P1A）パルスL1210細胞（図7B、8B）に対しても溶解活 性を示さなかった。５μgほどの少ないhsp71-P1A融合タンパク質で免疫化したマ ウスに由来する細胞は、測定可能な溶解活性を示し、最大応答は、50〜500μgで 免疫化したマウスに由来する細胞において見られた。 実施例６：hsp71-P1A融合タンパク質で免疫化したマウスの腫瘍抗原投与 ３回の注射を２週間間隔で与えた以外は、マウスを上記の実施例のように免疫 化した。最後の注射の２週間後、1000個の生存可能なP1腫瘍細胞の腹腔内注射に より、マウスに抗原投与した。26日後、マウスを安楽死させ、秤量し、そして腹 部内容物の全ての塊を解剖し、そして秤量した。この実験の結果を図９に示す。 hsp71-P1A融合タンパク質を用いた３回の50μg免疫化を与えたマウスでは、総体 重のパーセントとして表される腹部内容物の質量は、非免疫化マウス（０μg、P 〈0.03）において見出された質量より有意に少なく、そして腫瘍細胞を注射しな かったマウス（コントロール）において観察された質量と同様であったことが観 察された。 全体として、実施例５および６における実験は、例としてhsp71-P1Aを用いた 、hsp-腫瘍関連抗原を用いた免疫化が、無関係なMHCクラスＩ拘束エピトープを 提示する細胞に対して指向されるCTL活性の実質的な剌激をもたらすことを証明 する。さらに、このような免疫化は、関連したエフェクター機能の発現、すなわ ち免疫化された抗原を発現する腫瘍を用いた抗原投与に対する免疫を導く。 等価物 当業者は、本明細書中に記載された本発明の特定の実施態様に対する多くの等 価物がわかるか、または単に日常的実験を用いてこれらを確かめ得る。これらお よび他の全ての等価物は、以下の請求の範囲に含まれることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/35 Ｃ０７Ｋ 14/35 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アンソニー，ローレンス エス．ディー. カナダ国 ブイ８ティー ４イー１ ブリ ティッシュ コロンビア，ビクトリア，ク アドラ ストリート 2527 307

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するため のワクチンであって、該抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、 または該抗原に対する免疫応答を誘導するのに該ストレスタンパク質のアミノ酸 配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部 を含む、ワクチン。 ２．請求項１に記載のワクチンであって、ストレスタンパク質が、マイコバクテ リアストレスタンパク質、または該ワクチンが投与される前記哺乳動物において 前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレスタンパク 質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である 、ワクチン。 ３．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される、 請求項１に記載のワクチン。 ４．前記抗原および前記ストレスタンパク質が化学結合により連結される、請求 項１に記載のワクチン。 ５．前記抗原および前記ストレスタンパク質が融合タンパク質として連結される 、請求項１に記載のワクチン。 ６．哺乳動物において抗原に対する細胞媒介細胞溶解性免疫応答を誘導するため のワクチンであって、該哺乳動物において抗原およびストレスタンパク質配列を コードし、そして該抗原および該ストレスタンパク質配列の発現を指向するポリ ヌクレオチドを含む、ワクチン。 ７．前記抗原および前記ストレスタンパク質が融合タンパク質として発現される 、 請求項６に記載のワクチン。 ８．請求項６に記載のワクチンであって、前記ストレスタンパク質配列が、マイ コバクテリアストレスタンパク質、または該ワクチンが投与される前記哺乳動物 において前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレス タンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク 質に由来する、ワクチン。 ９．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される、 請求項６に記載のワクチン。 １０．哺乳動物においてインフルエンザウイルスの抗原に対する細胞媒介細胞溶 解性免疫応答を誘導するためのワクチンであって、該インフルエンザウイルスの 抗原およびストレスタンパク質の該哺乳動物における発現を指向するポリヌクレ オチドを含む、ワクチン。 １１．請求項１０に記載のワクチンであって、前記ストレスタンパク質が、マイ コバクテリアストレスタンパタ質、または該ワクチンが投与される前記哺乳動物 において前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレス タンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク 質である、ワクチン。 １２．前記ストレスタンパク質配列が、hsp65およびhsp71からなる群より選択さ れる、請求項１０に記載のワクチン。 １３．哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するた めのワクチンであって、該インフルエンザウイルスの抗原、およびストレスタン パク質の全てもしくは一部、または該抗原に対する免疫応答を誘導するのに該ス トレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタ ンパク質の全てもしくは一部を含む、ワクチン。 １４．請求項１３に記載のワクチンであって、前記ストレスタンパク質配列が、 マイコバクテリアストレスタンパク質、または該ワクチンが投与される前記哺乳 動物において前記抗原に対する免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアスト レスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタン パク質である、ワクチン。 １５．前記インフルエンザの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノイラミニ ダーゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせからなる群より選択され る、請求項１３に記載のワクチン。 １６．前記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、請求項１３に記載のワクチ ン。 １７．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される 、請求項１３に記載のワクチン。 １８．哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するワ クチンであって、ストレスタンパク質の全てもしくは一部、または該抗原に対す る免疫応答を誘導するのに該ストレスタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に 相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部に結合された該イン フルエンザウイルスの抗原を含む、ワクチン。 １９．請求項１８に記載のワクチンであって、前記ストレスタンパク質が、マイ コバクテリアストレスタンパク質、または該ワクチンが投与される個体において 免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレスタ冫パク質のアミノ酸配列 に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。 ２０．前記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノ イラミニダーゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせからなる群より 選択される、請求項１８に記載のワクチン。 ２１．前記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、請求項１８に記載のワクチ ン。 ２２．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される 、請求項１８に記載のワクチン。 ２３．哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するこ とにおける使用のためのワクチンであって、ストレスタンパク質の全てもしくは 一部、または該抗原に対する免疫応答を誘導するのに該ストレスタンパク質のア ミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしく は一部に融合された該インフルエンザウイルスの抗原を含む、組換え融合タンパ ク質を含む、ワクチン。 ２４．請求項２３に記載のワクチンであって、前記ストレスタンパク質が、マイ コバクテリアストレスタンパク質、または該ワクチンが投与される個体において 免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列 に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、ワクチン。 ２５．前記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノ イラミニダーゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせからなる群より 選択される、請求項２３に記載のワクチン。 ２６．前記免疫応答が細胞溶解性Ｔ細胞応答である、請求項２３に記載のワクチ ン。 ２７．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される 、請求項２３に記載のワクチン。 ２８．ストレスタンパク質およびインフルエンザウイルスの抗原を含む組成物。 ２９．請求項２８に記載の組成物であって、前記ストレスタンパク質が、マイコ バクテリアストレスタンパク質、または該組成物が投与される個体において免疫 応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対 して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、組成物。 ３０．前記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノ イラミニダーゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせからなる群より 選択される、請求項２８に記載の組成物。 ３１．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される 、請求項２８に記載の組成物。 ３２．インフルエンザウイルスの抗原と結合されたストレスタンパク質を含む結 合体。 ３３．請求項３２に記載の結合体であって、前記ストレスタンパク質が、マイコ バクテリアストレスタンパク質、または該結合体が投与される個体において免疫 応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレスタンパク質のアミノ酸配列に対 して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、結合体。 ３４．前記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノ イラミニダーゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせからなる群より 選択される、請求項３２に記載の結合体。 ３５．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される 、請求項３２に記載の結合体。 ３６．インフルエンザウイルスの抗原に融合されたストレスタンパク質を含む融 合タンパク質。 ３７．請求項３６に記載の融合タンパク質であって、前記ストレスタンパク質が 、マイコバクテリアストレスタンパク質、または該融合タンパク質が投与される 個体において免疫応答を誘導するのに該マイコバクテリアストレスタンパク質の アミノ酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である、融 合タンパク質。 ３８．前記インフルエンザウイルスの抗原が、赤血球凝集素、核タンパク質、ノ イラミニダーゼ、M1、M2、PB1、PB2、PA、およびその組み合わせからなる群より 選択される、請求項３６に記載の融合タンパク質。 ３９．前記ストレスタンパク質が、hsp65およびhsp71からなる群より選択される 、請求項３６に記載の融合タンパク質。 ４０．pET65MP/NP-BおよびpET65M/NP-Dからなる群より選択される融合タンパク 質。 ４１．前記抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１に記載のワクチ ン。 ４２．前記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む 、請求項１０に記載のワクチン。 ４３．前記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む 、 請求項１５に記載のワクチン。 ４４．前記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む 、請求項２８に記載の組成物。 ４５．前記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む 、請求項３２に記載の結合体。 ４６．前記インフルエンザウイルスの抗原が細胞溶解性Ｔ細胞エピトープを含む 、請求項３６に記載の融合タンパク質。 ４７．前記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群 より選択される、請求項１に記載のワクチン。 ４８．前記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群 より選択される、請求項３２に記載の結合体。 ４９．前記抗原が、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、およびアレルゲンからなる群 より選択される、請求項３６に記載の融合タンパク質。 ５０．哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するTh2応答を抑制するためのワ クチンであって、該抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、また は該抗原に対するTh2応答を抑制するのに該ストレスタンパク質のアミノ酸配列 に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含 む、ワクチン。 ５１．哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するTh2応答を抑制するための組 成物であって、該抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または 該抗原に対するTh2応答を抑制するのに該ストレスタンパク質のアミノ酸配列に 対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む 、組成物。 ５２．哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するTh2応答を抑制するための結 合体であって、該抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部、または 該抗原に対するTh2応答を抑制するのに該ストレスタンパク質のアミノ酸配列に 対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一部を含む 、結合体。 ５３．哺乳動物においてアレルゲン性抗原に対するTh2応答を抑制するための融 合タンパク質であって、該抗原、およびストレスタンパク質の全てもしくは一部 、または該抗原に対するTh2応答を抑制するのに該ストレスタンパク質のアミノ 酸配列に対して十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の全てもしくは一 部を含む、融合タンパク質。