ES2258796T3

ES2258796T3 - Proteinas de fusion que contienen proteinas de estres para inducir respuestas inmunitarias.

Info

Publication number: ES2258796T3
Application number: ES97945684T
Authority: ES
Inventors: Lee Mizzen; Lawrence S. D. Anthony
Original assignee: Stressgen Biotechnologies Corp
Current assignee: Stressgen Biotechnologies Corp
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-25
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: JP4484969B2; WO1998023735A1; DE69735376T2; CA2272536A1; EP0941315A1; HK1022715A1; EP0941315B1; ATE318899T1; JP2008214360A; PT941315E; AU5112098A; DK0941315T3; AU736318B2; JP2001504702A; DE69735376D1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA VACUNA, DESTINADA A INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE DIRIGIDA CONTRA UN ANTIGENO DE UN VERTEBRADO (POR EJEMPLO UN MAMIFERO), Y QUE COMPRENDE UN ANTIGENO ASI COMO TODO O PARTE DE UNA PROTEINA DEL ESTRES O TODO O PARTE DE UNA PROTEINA QUE TIENE UNA SECUENCIA DE ACIDOS AMINADOS LO SUFICIENTEMENTE HOMOLOGA A LA SECUENCIA DE ACIDOS AMINADOS DE LA PROTEINA DEL ESTRES, CON EL FIN DE INDUCIR LA RESPUESTA INMUNITARIA DIRIGIDA CONTRA EL ANTIGENO. EN UN MODO DE REALIZACION, ESTA INVENCION SE REFIERE A UNAS VACUNAS Y A UNAS COMPOSICIONES QUE INDUCEN UNA RESPUESTA DE LOS LINFOCITOS T CITOTOXICOS (CTL) EN UN MAMIFERO Y QUE COMPRENDEN UN ANTIGENO O TODO O PARTE DE UNA PROTEINA DEL ESTRES. EN OTRO MODO DE REALIZACION, ESTA INVENCION SE REFIERE A UNAS VACUNAS Y COMPOSICIONES QUE INDUCEN UNA RESPUESTA INMUNE DIRIGIDA CONTRA EL VIRUS DE LA GRIPE EN UN MAMIFERO Y QUE COMPRENDE UN ANTIGENO DEL VIRUS DE LA GRIPE ASI COMO TODO O PARTE DE UNA O VARIAS PROTEINAS DEL ESTRES. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNAS VACUNAS Y A UNAS COMPOSICIONES DESTINADAS A INDUCIR UNA RESPUESTA DE LOS CTL A UN ANTIGENO ASOCIADO A UN TUMOR, Y QUE COMPRENDE UN ANTIGENO ASOCIADO A ESTE TUMOR ASI COMO TODO O PARTE DE UNA PROTEINA DEL ESTRES, ASI COMO A VACUNAS Y A COMPOSICIONES DESTINADAS A SUPRIMIR RESPUESTAS INMUNES ALERGICAS A ALERGENOS Y QUE COMPRENDEN UN ALERGENO ASI COMO TODO O PARTE DE UNA PROTEINA DEL ESTRES.

Description

Proteínas de fusión que contienen proteínas de estrés para inducir respuestas inmunitarias.

Antecedentes de la invención

Los virus que producen la gripe se han denominado arbitrariamente como influenza tipo A, B y C. Estos tipos definen virus diferenciados antigénicamente. Cada tipo tiene varios subtipos diferenciados. Los virus dentro de un tipo son genéticamente compatibles en el sentido de que las células infectadas con dos subtipos diferentes pueden ensamblar virus mixtos que contienen componentes de ambos subtipos. Los virus influenza se clasifican como ortomixovirus. Los virus forman partículas de entre 80 y 120 nm de diámetro. Los virus influenza son virus con envoltura, es decir, su superficie externa se deriva de la membrana de la célula huésped. Insertadas en y sobresaliendo de la envoltura, hay dos proteínas principales codificadas por el virus, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Los virus influenza son virus de ARN de hebra negativa, que contienen un genoma compuesto por 8 segmentos de ARN de polaridad de ARN no mensajero. Los segmentos genómicos de ARN se ensamblan en complejos RNP con la proteína nuclear codificada por el virus (NP). Tras la infección de una célula huésped, los segmentos genómicos de ARN se transcriben en primer lugar en ARN con polaridad de ARN mensajero que se someten posteriormente a transcripción inversa para producir ARN genómico. Las actividades transcriptasa responsables de estas etapas carecen de capacidad de corrección de lectura. Por tanto, los errores que se cometen durante la transcripción y la transcripción inversa no se reparan, dando como resultado una alta frecuencia de mutación del genoma viral. Aunque todos estos genes virales están sometidos al mismo proceso mutacional, los genes para las proteínas externas HA y NA están sometidos particularmente a fuertes procesos de selección que dirigen su evolución hacia formas mutantes que escapan a la detección inmunitari6+ en sus huéspedes. Los huéspedes incluyen no sólo seres humanos sino también animales tales como pollos, pavos, cerdos y caballos.

La gripe ha sido tradicionalmente una de las causas principales de muerte humana. Los signos clínicos de la gripe son variables, oscilando desde la infección asintomática hasta la mortal. Normalmente, el inicio de la enfermedad es rápida y postrante, y acarrea casi invariablemente tos, malestar, cefalea y mialgia. Rinitis, dolor de garganta y menos comúnmente, dolor subesternal también indican que el sitio primario de infección es el sistema respiratorio. Normalmente, sin embargo, predominan la fiebre y los síntomas sistémicos. La recuperación normalmente es rápida. La gravedad de la enfermedad depende mucho del huésped y se relaciona con la edad, estado fisiológico e inmunización previa mediante infección o inmunización. Una grave complicación es la neumonía. Los individuos comprometidos son propensos a padecer infecciones secundarias con patógenos bacterianos que producen neumonía. La mayor parte de los pacientes que fallecen tras la gripe, fallecen con neumonía bacteriana. Cada año se producen variaciones antigénicas menores en los tipos A y B del virus influenza, produciendo epidemias regionales. La tasa de mortalidad anual debida a tales epidemias anuales puede aproximarse a 20.000 en los EE.UU. solamente. A intervalos variables entre 10 y 30 años, se producen pandemias globales con números de muertos que superan ampliamente los de las epidemias anuales. Estas pandemias se producen probablemente por reordenamiento genético de componentes procedentes de virus influenza A de seres humanos y animales, dando como resultado un nuevo virus con una estructura superficial totalmente extraña para la experiencia humana. El número de muertos de la pandemia de 1918-19 fue de aproximadamente 500.000 americanos. (Como referencia general: Joshua Lederberg, Encyclopedia of Microbiology, 2(D-L):505-520, Academic Press Inc., San Diego, CA 92101 (1992).

Las vacunas autorizadas actualmente incluyen virus purificados inactivados. Las vacunas son trivalentes e incluyen cepas representativas de los dos subtipos A prevalentes, H3N2 y H1Ni, y una única cepa de tipo B. Las vacunas de virus vivos atenuados también se han utilizado con algún éxito, particularmente en la antigua Unión Soviética. Se han desarrollado vacunas de subunidades que contienen HA y NA (vacuna de la gripe dividida; Connaught Lab.). Estas vacunas no son completamente eficaces para proporcionar una inmunidad protectora. Se acepta generalmente que las vacunas de la gripe generan inmunidad protectora principalmente por medio de la inducción de respuestas de anticuerpos contra las proteínas HA y NA de la superficie viral. Esto puede explicar por qué las vacunas son sólo eficaces de manera incompleta; son susceptibles a la variación antigénica continua en estas proteínas de la superficie.

La búsqueda de diferencias entre las células tumorales y las células normales ha conducido al aislamiento y la caracterización de varios de los denominados antígenos asociados a tumor (Henderson, R. A. y Finn, O. J., Advances in Immunology, 62:217-256 (1996)). Estos antígenos se expresan por las células tumorales pero no del todo o al menos no en grandes cantidades en células totalmente diferenciadas. Las secuencias que codifican para estos antígenos tumorales son derivadas de virus o están presentes normalmente en el genoma del huésped. Un ejemplo de un antígeno asociado a tumor derivado de un virus es la proteína E7 transformante del papilomavirus humano presente en la mayor parte de los tumores cervicouterinos humanos. Un antígeno asociado a tumor derivado del genoma del huésped típico es gp 100, también denominado pMel-17, que se expresa en muchos melanomas humanos. Aunque se sabe que los antígenos asociados a tumor inducen una respuesta inmunitaria del huésped, la respuesta es normalmente insuficiente para ser terapéuticamente eficaz. Existe una necesidad de enfoques para estimular esta respuesta.

Utilizando clones de linfocitos T citotóxicos (LCT) monoespecíficos, se ha identificado la expresión de al menos cinco antígenos asociados a tumor, denominados A, B, C, D y E, en células tumorales de mastocitoma P815 de ratón. Uno de estos antígenos, denominado P1A, expresa un único epítopo que lo reconocen los clones de LCT. Utilizando un enfoque molecular, el gen para P1A se clonó y se encontró que era un gen no mutado presente en células normales pero transcrito y traducido sólo en células transformadas (Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 173:1373 (1991)). Además, mediante el examen de variantes de células P815 que habían perdido la expresión del antígeno P1A, fue posible identificar la secuencia del epítopo de LCT mínimo restringido por L^{d} de MHC de clase I de P1A (Lethe, et al., Eur. J. Immunol., 22:2283 (1992)).

Barlos et al., EUR. J. Immunol. (22: 1365-1372, 1992) describe un conjugado de un péptido con una proteína de choque térmico, preparándose el conjugado según la práctica habitual, mezclando dos proteínas en presencia de glutaraldehído, un agente reticulante.

Srivastava y Udono, Current Opin. Immunol. (6: 728-232, 1994) describe complejos no covalentes de HSP ("heat shock proteins", proteínas de choque térmico) y antígenos aislados de tumores.

El documento WO94/29459 (Young) describe una proteína de fusión que contiene HSP70 y un antígeno de VIH.

El documento WO95/24923 (Srivastava et al) describe complejos de péptido de proteína de estrés.

El documento WO94/03208 (Cohen et al) describe diversas combinaciones de un fragmento que contiene un epítopo de células T de la proteína hsp60 humana y un antígeno escasamente inmunogénico, concretamente un polisacárido.

El documento WO97/06821 se refiere a métodos y composiciones para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, en el que se administra al sujeto al menos una proteína de choque térmico en combinación con uno o más antígenos diana definidos.

El documento WO97/26910 describe una composición que comprende células tumorales, en las que se ha insertado un gen que codifica para una proteína de choque térmico, o antígenos tumorales que se unieron a una proteína de choque térmico. Se apreciará que este documento no describe una proteína de fusión.

Por tanto, existe una necesidad de vacunas más eficaces contra antígenos asociados con virus y tumores.

Según la presente invención, se proporciona una proteína de fusión según se define en la reivindicación 1.

La proteína de estrés para su uso en la presente invención puede ser, por ejemplo, una proteína de estrés micobacteriana (por ejemplo, hsp65, hsp71) o una proteína de estrés que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés micobacteriana para inducir la respuesta inmunitaria al antígeno en el mamífero al que se administra. La vacuna para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un antígeno en un mamífero puede comprender también un polinucleótido que codifica y dirige la expresión de un antígeno y una secuencia de proteína de estrés en el mamífero. El polinucleótido puede expresar el antígeno y la proteína de estrés como una proteína de fusión.

En una realización, la presente invención se refiere a una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un antígeno de un virus influenza en un mamífero que comprende un polinucleótido que dirige la expresión del antígeno del virus influenza y una proteína de estrés en el mamífero. El antígeno del virus influenza que puede utilizarse en la presente invención incluye, por ejemplo, hemaglutinina, nucleoproteína, neuraminidasa, M1, M2, PB1, PB2, PA y una combinación de los mismos.

La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una proteína de estrés y un antígeno de un virus influenza según se define en la reivindicación 15. En una realización, la composición es una proteína de fusión (pET65MP/NP-B y pET65M/NP-D) que comprende una proteína de estrés fusionada a un antígeno del virus influenza.

La presente invención también se refiere al uso de las composiciones para prevenir o tratar el virus influenza en un mamífero.

También se describe una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un antígeno asociado a tumor en un mamífero, comprendiendo la vacuna una antígeno asociado a tumor relacionado con toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno. El antígeno que puede utilizarse en la presente invención comprende cualquier antígeno asociado a tumor de mamífero incluyendo los conocidos actualmente en la técnica. También incluye los fragmentos de estos antígenos que contienen un epítopo de LCT.

Además se describe la vacuna para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un antígeno asociado a tumor en un mamífero en la que la vacuna es un polinucleótido que contiene, en forma expresable, secuencias que codifican para un antígeno asociado a tumor y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno.

También se describe la vacuna para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un antígeno asociado a tumor en un mamífero que también puede ser un polinucleótido que codifica para una proteína de fusión recombinante que incluye un antígeno asociado a tumor o toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno.

También se describen vacunas para suprimir las respuestas inmunitarias alérgicas frente a antígenos naturales o sintéticos (alérgenos) en un mamífero, incluyendo las vacunas un alérgeno y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para suprimir las respuestas alérgicas. Puede utilizarse cualquier alérgeno, independientemente de que sea peptídico o no.

También se describen la vacuna para suprimir las respuestas inmunitarias alérgicas frente a antígenos naturales o sintéticos (alérgenos) en un mamífero, que es un alérgeno conjugado químicamente a toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para suprimir las respuestas alérgicas.

En otra realización descrita, no reivindicada, la vacuna para suprimir las respuestas inmunitarias alérgicas frente a antígenos naturales o sintéticos (alérgenos) en un mamífero es una proteína de fusión recombinante que incluye un alérgeno y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para suprimir las respuestas alérgicas.

En una realización descrita, no reivindicada, adicional la vacuna para suprimir las respuestas inmunitarias alérgicas frente a antígenos naturales o sintéticos (alérgenos) en un mamífero es un polinucleótido que contiene, en forma expresable, secuencias que codifican para un alérgeno peptídico y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para suprimir las respuestas alérgicas.

Todavía en otra realización descrita, no reivindicada, la vacuna para suprimir las respuestas inmunitarias alérgicas frente a antígenos naturales o sintéticos (alérgenos) en un mamífero también puede ser un polinucleótido que codifica para una proteína de fusión recombinante que incluye un alérgeno peptídico y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para suprimir las respuestas alérgicas.

También se describe una composición para suprimir una respuesta Th2 frente a un antígeno en un mamífero, que comprende el antígeno y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para suprimir la respuesta Th2 al antígeno. La composición puede ser una vacuna, un conjugado o una proteína de fusión.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una gráfica de la razón de efectoras:diana frente al % de lisis celular específica que demuestra una respuesta de células T citolíticas (LCT) en ratones frente a una mezcla que comprende péptido de nucleoproteína (NP) y proteína de choque térmico 70 (hsp70).

La figura 2 es una gráfica de la razón de efectoras:diana frente al % de lisis celular específica que demuestra una respuesta de LCT en ratones frente a una composición que comprende un conjugado químico de un péptido de NP y hsp70.

La figura 3 es una representación esquemática del vector, pET65MP.

La figura 4A es una representación esquemática del vector, pET65MP/NP-B.

La figura 4B es una representación esquemática del vector pET65MP/NP-D.

Las figuras 5A-5B son gráficas de la razón de efectoras:diana frente al % de lisis celular específica que demuestra una respuesta de LCT en ratones frente a la proteína de fusión de hsp-NP, hsp65-NP.B, en las que las células efectoras se volvieron a estimular en ausencia de IL-2 (figura 5A) y en presencia de IL-2 (figura 5B).

Las figuras 6A-6B son gráficas de la razón de efectoras:diana frente al % de lisis celular específica que demuestra una respuesta de LCT en ratones frente a la proteína de fusión de hsp-NP, hsp65-NP.D, en las que las células efectoras se volvieron a estimular en ausencia de IL-2 (figura 6A) y en presencia de IL-2 (figura 6B).

Las figuras 7A-7B son gráficas de la razón de efectoras:diana frente al % de lisis celular específica que demuestra una respuesta de LCT en ratones BALB/c inmunizados con una proteína de fusión hsp-P1A.

Las figuras 8A-8B son gráficas de la razón de efectoras:diana frente al % de lisis celular específica que demuestra una respuesta de LCT en ratones DBA/2 (H-2^{d}) inmunizados con una proteína de fusión hsp-P1A.

La figura 9 es una gráfica de barras que demuestra que la inmunización con el antígeno asociado a tumor de hsp, hsp71-P1A, da como resultado la estimulación de la actividad de LCT dirigida contra las células que muestran epítopos restringidos por MFIC de clase I relevantes.

Descripción detallada de la invención

La presente solicitud describe vacunas y composiciones que inducen una respuesta inmunitaria frente a un antígeno en un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que comprenden un antígeno (uno o más) y toda o una parte de una proteína de estrés o una proteína de choque térmico (uno o más) o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno. Particularmente, se describen vacunas y composiciones que inducen una respuesta inmunitaria mediada por células en un mamífero que comprenden un antígeno (uno o más) y toda o una parte de una proteína de estrés (una o más) o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno.

La invención se refiere a composiciones que inducen una respuesta inmunitaria frente a un virus influenza en un mamífero que comprenden un antígeno del virus influenza y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno, según se define en la reivindicación 1. Tal como se describe en el presente documento, las composiciones que comprenden un antígeno de influenza (por ejemplo, secuencias de NP que incluyen epítopos de LCT) y al menos una proteína de estrés, en la forma de una proteína de fusión que contiene el antígeno de influenza y las secuencias de la proteína de estrés, son eficaces para estimular respuestas inmunitarias específicas (por ejemplo, respuesta de células T citolíticas (LCT), respuesta de células T cooperadoras, respuesta de células B) frente al antígeno de influenza utilizado en mamíferos. Por ejemplo, tal como se demuestra en los ejemplos, la inmunización de un huésped (vertebrado, tal como un mamífero) con las vacunas descritas en el presente documento puede dar como resultado la estimulación de la actividad de LCT específica dirigida contra las células que muestran el antígeno de influenza (por ejemplo, NP).

También se describen vacunas que inducen una respuesta inmunitaria mediada por células frente a antígenos asociados a tumor que comprenden un antígeno asociado a tumor adecuado para la inmunización frente a un tumor preexistente de un tipo particular o para la prevención del desarrollo de tal tumor y toda o una parte de una proteína de estrés o toda o parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés, para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno. De manera análoga a la realización anterior, las vacunas que comprenden al menos un antígeno asociado a tumor y una proteína de estrés, en la forma de proteínas de fusión que contienen secuencias de antígeno asociado a tumor y de proteína de estrés, pueden estimular respuestas inmunitarias citolíticas mediadas por células frente al antígeno asociado a tumor en mamíferos. Tal como se demuestra en los ejemplos, una vacuna de este tipo, una proteína de fusión que contiene un antígeno de mastocitoma P1A mínimo y una proteína de estrés, induce una respuesta citolítica mediada por células frente a células que muestran el antígeno P1A. Además, los animales mamíferos inmunizados con la vacuna son inmunes frente a una exposición posterior a células tumorales que expresan el antígeno P1A.

En la presente invención, la composición está compuesta por dos restos: una proteína de estrés y un antígeno frente al que se desea una respuesta inmunitaria. Los dos restos forman una única unidad. La conjugación puede conseguirse mediante técnicas recombinantes. Si las técnicas recombinantes se utilizan para unir o conectar los dos restos, el resultado es una proteína de fusión recombinante que incluye la proteína de estrés y el antígeno en una única molécula. Esto hace posible producir y purificar una única molécula recombinante en el procedimiento de producción de la vacuna. La proteína de estrés puede conjugarse con cualquier antígeno de influenza frente al que se desea la respuesta inmunitaria citolítica mediada por células o con una parte del antígeno suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo al que se administra.

Tal como se define en el presente documento, el término "vacuna" incluye composiciones que pueden utilizarse como vacuna profiláctica o terapéutica. En una realización, la composición de la vacuna es uno o más ácidos nucleicos que codifican para el antígeno y la proteína de estrés. La presente invención también se refiere al uso de las composiciones que son ácidos nucleicos que codifican para una proteína de estrés y/o el antígeno para prevenir o tratar una enfermedad o condición asociado con o producido por la presencia de un virus influenza. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria frente a un virus influenza en un mamífero no infectado por el virus. Además, las vacunas o composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria frente a un virus influenza en un mamífero infectado por un virus influenza, y puede dar como resultado la mejora o eliminación del estado de enfermedad producido por el virus de influenza infeccioso en el mamífero. Tal como se utiliza en el presente documento, "inducción de una respuesta inmunitaria" significa un aumento de la respuesta inmunitaria (más que indetectable o más que antes); o una respuesta que es superior a la que puede conseguirse mediante inmunización, en condiciones comparables, con el antígeno solo.

Tal como se describe en el presente documento, un antígeno (uno o más por proteína de estrés) preferiblemente es de naturaleza peptídica, es decir, es una proteína, polipéptido o péptido. En aplicaciones en las que el antígeno y la proteína de estrés se añaden o unen químicamente, el antígeno también puede ser un hidrato de carbono, lípido, glucolípido o molécula orgánica o inorgánica. Tal como se utiliza en el presente documento, un "antígeno" incluye péptidos o polipéptidos que comprenden al menos un epítopo de LCT. Un epítopo de LCT se define como, o bien un epítopo de células T restringido de clase I o bien un epítopo de células T restringido de clase II. El antígeno para su uso en la presente invención puede aislarse, purificarse (esencialmente puro), sintetizarse químicamente o producirse de manera recombinante. Los expertos en la técnica pueden determinar otros antígenos adecuados útiles en las composiciones de la presente invención.

En la realización en la que la vacuna o composición induce una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un virus influenza, los antígenos del virus influenza incluyen pero no se limitan a péptidos o polipéptidos que comprenden al menos un epítopo de células B y/o T (por ejemplo, células T cooperadoras, células T citolíticas). Por ejemplo, un antígeno del virus influenza incluye, pero no se limita a hemaglutinina (HA, por ejemplo, HA1, HA7), nucleoproteína (por ejemplo, NP tal como NP-b y NP-D descrito en los ejemplos), neuramidasa (NA), M1, M2, PB1, PB2 y PA. Otros antígenos de un virus influenza que pueden utilizarse en las composiciones de la presente invención pueden determinarse por los expertos en la técnica.

En el caso de que la vacuna o composición induzca una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células frente a un antígeno asociado a tumor, los antígenos incluyen, pero no se limitan a, MAGE1, MAGE3, BAGE y GAGE. Estas proteínas se expresan normalmente en los testículos.

La expresión ectópica da lugar a una variedad de tumores incluyendo melanomas. También se incluyen en esta lista los antígenos de diferenciación de melanocitos, tirosinasa, MART-1/MELAN-1 y gp 100/pMe117 así como las proteínas relacionadas con tirosinasa pg75 y MUM-1, todos los cuales se asocian con melanomas. Otros antígenos asociados a tumor útiles son HER2/neu que se encuentra en los tumores de mama y ovario, MUC-1 que se encuentra en tumores de células epiteliales, y las proteínas del papilomavirus humano E6 y E7 que se asocian fuertemente con tumores cervicouterinos. Antígenos adicionales incluyen GnT-V, beta-catenina, CDK4 y p15. Todos estos antígenos asociados a tumor se reconocen por células T. (Wang, R. F. y Rosenberg, S. A., Journal of Leukocyte Biology, 60:296-309 (1996); Houghton; A. N., J. Exp. Med. 180:1-4 (1994); Henderson, R. A. y Finn, O. J., Advances of Immunology, 62:217-256).

Los que desempeñan un papel importante en la enfermedad alérgica (atópica) y asmática son IgE y las reacciones inflamatorias locales dominadas por la infiltración de eosinófilos.

Hiperreactividad pulmonar a estímulos no específicos debidos a inflamación crónica es la definición moderna de asma. Esta inflamación puede estar producida por respuestas alérgicas anómalas a antígenos naturales o sintéticos mediadas por IgE y conduce a una infiltración celular crónica de células granulares denominadas eosinófilos. Se piensa que la liberación de mediadores desde mastocitos residentes y basófilos y eosinófilos reclutados es la causa de la inflamación y posterior hiperreactividad. En el hombre, como en otras especies, cualquier reacción inflamatoria produce hiperreactividad local. Sin embargo, en el asma la inflamación es crónica, conduciendo a hiperreactividad potencialmente mortal a menos que se trate apropiadamente. El tratamiento actual incluye el uso de corticosteroides para reducir la inflamación y broncodilatadores como albuterol (beta-agonistas) para un rápido alivio sintomático.

En los seres humanos como en los ratones, se han definido dos patrones diferentes de secreción de citocinas entre los clones de células T cooperadoras CD4+ (del Prete, G., Allergy, 47:450-455 (1992)).

Las células cooperadoras humanas de tipo 1 (Th1) pero no las de tipo 2 (Th2) producen interleucina-2 (IL-2), gamma-interferón y factor de necrosis tumoral beta. Las células Th2 pero no las Th1 secretan IL-4 e IL-5, pero no IL-2 o gamma-interferón.

Otras citocinas tales como IL-3, IL-6, GM-CSF o el factor de necrosis tumoral alfa se producen tanto por células Th1 como por Th2. Los diferentes patrones de citocinas se asocian con diferentes funciones. En general, las células Th2 proporcionan una excelente función cooperadora para la producción de anticuerpos de células B, particularmente de la clase de IgE. Las células Th1 son responsables de las reacciones de hipersensibilidad retrasadas y son citolíticas para células presentadoras de antígeno autólogas incluyendo células B. La mayor parte de los clones de células T CD4+ humanas específicas de antígeno de helminto o alérgeno muestran un fenotipo Th2 mientras que la mayor parte de los clones específicos para antígenos bacterianos muestran un perfil Th1. Las células Th2 específicas de alérgeno parecen desempeñar un papel crucial en la atopia. Estas células inducen la producción de IgE a través de IL-4 y favorecen la proliferación, diferenciación y activación de eosinófilos a través de IL-5. Además, IL-3, IL-4 e IL-13 derivadas de Th2 son factores de crecimiento de mastocitos que actúan en sinergia, al menos in vitro. Existe la evidencia de que las células Th2 específicas de alérgeno se enriquecen selectivamente en tejidos afectados por inflamación alérgica tales como la mucosa bronquial de seres humanos con asma alérgico.

Con el uso creciente de antibióticos en la primera infancia en el mundo desarrollado, la incidencia de y los fallecimientos debidos a asma (alérgico) están aumentando. La siguiente discusión está utilizando esta información que relaciona el aumento de la incidencia y la gravedad de las reacciones alérgicas frente a una falta de exposición y memoria de células T para proteínas bacterianas incluyendo las proteínas de estrés, para apoyar la idea de que la exposición deliberada a antígenos bacterianos incluyendo las proteínas de estrés disminuirá las respuestas alérgicas.

Muchos científicos creen que el desarrollo de resistencia o sensibilidad a los antígenos ambientales depende de la naturaleza de la memoria inmunológica generada durante los encuentros tempranos del antígeno en la lactancia y la primera infancia (Holt P. G., Toxicol Lett., 86:205-210). Este proceso parece estar dirigido por antígeno. La selección es por células de memoria similares a Th1 frente a Th2 específicas dentro de las respuestas inmunitarias individuales a antígenos inhalados, un proceso que se produce en los ganglios linfáticos regionales que drenan las vías respiratorias conductoras. Esta selección parece estar regulada por una variedad de citocinas producidas por células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno. Este proceso de selección de células T puede estar influenciado en teoría por agentes infecciosos: las infecciones en la mucosa de las vías respiratorias puede movilizar y activar macrófagos del tejido local (alveolar) que migran hasta los ganglios linfáticos regionales y secretan citocinas inhibidoras de Th2 tales como IL-12 y alfa-interferón. Además, pueden aumentar los niveles de gamma-interferón en el medio a través de la activación de linfocitos citolíticos naturales. El resultado neto es la producción de LCT (que son predominantemente
células CD8+).

El gamma-interferón inhibe la generación de células Th2 y, por tanto, la producción de IL-4 e IL-5, citocinas cruciales para la generación de respuestas alérgicas humorales (IgE) y celulares (eosinófilos, basófilos y mastocitos) (Anderson G. P. y Coyle, A. J., Trends Pharmacol. Sci., 15:324-332 (1995); Stam, W. B., van Oosterhout, A. J. y Nijkamp, F. P., Life Sci., 53:1921-1934 (19939)).

En los mamíferos, las proteínas de estrés han demostrado inducir respuestas inmunitarias humorales así como celulares. Tal como se muestra en los ejemplos del presente documento, cuando se administra a un mamífero un antígeno soluble mezclado con, conjugado químicamente con o fusionado a una proteína de estrés, se potencian sustancialmente las respuestas inmunitarias citolíticas mediadas por células. Estas respuestas se deben en gran parte a las células T CD8+. Por tanto, una comparación de las respuestas de CD4+ a antígenos por sí mismos con respecto a las de mezclados con o acoplados a proteínas de estrés dan el perfil pronosticado: los antígenos solubles mezclados con o unidos a proteínas de estrés producen una alta proporción de LCT (principalmente células T CD8+) que son una medida de la estimulación de la ruta de Th1 descrita anteriormente porque estos LCT surgen como resultado de la inducción de células T específicas de antígeno del tipo Th1. Estas células Th1 producen gamma-interferón, citocina que inhibe las células Th2. Por tanto, las citocinas de Th2 IL-4 e IL-5 no están ya disponibles para apoyar la producción de IgE y eosinófilos. Con el título decreciente de IgE, disminuirá la estimulación antigénica directa de mastocitos y basófilos. Además, la disminución de la producción de IL-5 conducirá a una disminución de la producción, diferenciación y activación de eosinófilos. Este patrón producirá una disminución de la inflamación del tejido implicado y dará como resultado menos acontecimientos hiperreactivos (asmáticos).

Por tanto, la administración de mezclas de antígenos alergénicos (alérgenos) conocidos y proteínas de estrés o composiciones que contienen alérgenos unidos químicamente a o fusionados con proteínas de estrés debe influir en la razón de Th1 con respecto a Th2 en pacientes atópicos, restableciendo un equilibrio más normal y conduciendo a una disminución de la alergia o el asma. Las proteínas de estrés utilizadas en tales composiciones son preferiblemente de origen bacteriano o micoplásmico. Los alérgenos utilizados en las proteínas de fusión de alérgeno-proteína de estrés son necesariamente de naturaleza peptídica; pueden utilizarse alérgenos no peptídicos en conjugados que contienen un alérgeno y una proteína de estrés o mezclas de un alérgeno y una proteína de estrés. Los ejemplos no limitantes para los alérgenos incluyen Fel d 1 (gato); Amb a 1 (antígeno E), Amb a 2 (antígeno K) (ambrosía); Der f2, Der p 1, Der p 9, Der f 1 (ácaros); Bla g 1; Bla g 2 (cucaracha); Bet v 1 (abedul); Rat n 1 (rata); Cha o 1 (ciprés japonés); Hev b 5 (látex); gp40 (enebro de monte). Para una lista razonablemente exhaustiva de alérgenos hasta el momento de la publicación, véase King, T. P. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 105:224-233 (1994).

Cuando se administran composiciones que contienen alérgeno y proteína de estrés unidos covalentemente o añadidos por una vía adecuada tal como inyección subcutánea o intramuscular o incluso se administra mediante inhalación a un paciente que necesita tratamiento para reacciones de hipersensibilidad, deben producir una disminución en los síntomas alérgicos tal como se mide mediante la prueba de hiperreactividad clásica en asma, por ejemplo. Tras el tratamiento, el paciente mostrará menos reactividad no específica. En asmáticos, o en modelos animales de asma, se mide la hiperreactividad determinando las dosis de metacolina inhalada que inducen una respuesta broncoconstrictora. Los mamíferos con condiciones inflamatorias crónicas que conducen a hiperreactividad mostrarán una mayor sensibilidad a la exposición a metacolina. Será broncoconstrictor a dosis inferiores que en mamíferos "normales". Tras el tratamiento con la composición apropiada que contiene la proteína de estrés, la respuesta a la dosis de metacolina cambiaría a menos sensible.

Puede utilizarse cualquier proteína de estrés adecuada (proteína de choque térmico (hsp)) en las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos, pueden utilizarse hsp65 y/o hsp71. Volviendo a las proteínas de estrés en general, las células responden a un factor de estrés (normalmente un tratamiento de choque térmico) aumentando la expresión de un grupo de genes denominados comúnmente como genes de estrés, o de choque térmico. El tratamiento de choque térmico implica la exposición de células u organismos a temperaturas que son de uno o varios grados Celsius superiores a la temperatura a la que se adaptan las células. En coordinación con la inducción de tales genes, los niveles de proteínas de estrés correspondientes aumentan en las células sometidas a estrés. Tal como se utiliza en el presente documento, una "proteína de estrés" también conocida como "proteína de choque térmico" o "Hsp" es una proteína que está codificada por un gen de estrés y, por tanto, se produce normalmente en cantidades significativamente superiores con el contacto o la exposición del factor de estrés al organismo. Un "gen de estrés", también conocido como "gen de choque térmico" se utiliza en el presente documento como un gen que se activa debido al contacto o la exposición de un organismo (que contiene el gen) a un factor de estrés, tal como choque térmico o privación o adición de glucosa. "Gen de estrés" también incluye genes homólogos dentro de las familias de genes de estrés conocidas, tales como ciertos genes dentro de las familias de genes de estrés Hsp70 y Hsp90. Cada uno de los términos gen de estrés y proteína de estrés tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva puede incluir el otro, a menos que el contexto indique lo contrario.

Las proteínas de estrés pueden ser proteínas de estrés aisladas, lo que significa que las proteínas de estrés se han seleccionado y separado de la célula huésped en la que se produjeron. Tal aislamiento puede llevarse a cabo tal como se describe en el presente documento y utilizando métodos de rutina de aislamiento de proteínas conocidos en la técnica (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La proteína de estrés aislada también puede, adicionalmente, purificarse (esencialmente pura) según los métodos, particularmente los métodos de purificación con detergentes.

En las bacterias, las proteínas de estrés predominantes son proteínas con tamaños moleculares de aproximadamente 70 y 60 kDa, respectivamente, que se denominan como Hsp70 y Hsp60, respectivamente. Éstas y otras proteínas de estrés específicas y los genes que codifican para ellas, se tratan adicionalmente a continuación. En las bacterias, Hsp70 y Hsp60 representan normalmente aproximadamente el 1-3% de proteína celular basado en el patrón de tinción utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio y la tinción con azul de Coomasie, pero se acumula hasta niveles de hasta el 25% en condiciones de estrés. Las proteínas de estrés parecen participar en importantes procesos celulares tales como la síntesis de proteínas, tráfico intracelular, y ensamblaje y desemsamblaje de complejos de proteínas. Parece que las cantidades aumentadas de proteínas de estrés sintetizadas durante el estrés sirven principalmente para minimizar las consecuencias del desplegamiento de proteínas inducido. De hecho, la exposición previa de células a condiciones de estrés leves que inducen la síntesis de proteínas de estrés proporciona protección a las células frente a los efectos perjudiciales de un estrés más extremo posterior.

Las principales proteínas de estrés parecen expresarse en cada organismo y tipo de tejido examinados hasta ahora. También, parece que las proteínas de estrés representan el grupo más altamente conservado de proteínas identificadas hasta la fecha. Por ejemplo, cuando se comparan proteínas de estrés en organismos muy diversos, Hsp90 y Hsp70 muestran una identidad del 50% o superior a nivel de los aminoácidos y comparten muchas similitudes en posiciones no idénticas.

Los genes que codifican para las proteínas de estrés pueden estar presentes en una única copia o en múltiples copias no idénticas en el genoma de una célula u organismo. Por ejemplo, el genoma humano ha demostrado contener al menos una copia de un gen Hsp100, al menos dos genes Hsp90 diferentes, hasta diez genes Hsp70 de los que al menos varios son copias no idénticas, varios genes de complejo T (genes Tcp) y al menos un gen que codifica para la proteína mitocondrial relacionada Hsp60, así como al menos tres copias de genes Hsp pequeños que codifican para proteínas en el intervalo de 20-30 kDa de tamaño molecular. En la mayor parte de los grupos de genes de estrés, existe al menos un gen cuyo nivel de expresión es relativamente elevado y es o bien completamente constitutivo o bien sólo ligeramente inducible por choque térmico. Además, varios grupos de genes de estrés incluyen miembros que no están regulados por incremento mediante calor sino mediante otros impulsos tales como un aumento en los niveles de calcio, etc.

Las proteínas de estrés, particularmente Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 y Hsp10, se encuentran entre los determinantes principales reconocidos por el sistema inmunitario del huésped en la respuesta inmunitaria a la infección por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. Young, R. A., y Elliot, T. J., Stress Proteins, Infection, And Immune Sureveillance, Cell 50:5-8, (1989). Además, algunas células T artritogénicas de ratas reconocen epítopos de Hsp60. Van Eden, W., Thole, J., van der Zee, R., Noordzij, A., van Embden, J., Hensen, E., y Cohen, I., Nature 331:171-173, (1988). Sin embargo, los individuos, incluyendo individuos sanos, sin historia de infección micobacteriana o enfermedad autoinmunitaria también portan células T que reconocen tanto epítopos de Hsp60 bacterianos como humanos; una fracción considerable de células T en individuos sanos que se caracterizan porque la expresión del receptor de células T gamma-delta reconoce tanto proteínas de estrés propias como foráneas. O'Brien, R., Happ, M., Dallas, A., Palmer, E. Kubo, R., y Born, W., Cell 57:664-674 (1989). Por tanto, los individuos, incluso los individuos sanos, tienen poblaciones de células T que reconocen epítopos tanto de proteínas de estrés foráneas como propias.

El sistema de reconocimiento de los epítopos de las proteínas de estrés constituye un "sistema de defensa temprana" frente a organismos invasores. El sistema puede mantenerse mediante la estimulación frecuente por las bacterias y virus que hacen que las células huésped regulen por incremento sus propios genes de estrés. Sin embargo, la presencia de células T autorreactivas es compatible con la salud normal y no produce enfermedad autoinmunitaria; esto también demuestra la seguridad de las proteínas de estrés en un individuo. La seguridad de las proteínas de estrés se demuestra adicionalmente mediante el éxito y la seguridad relativa de las vacunaciones con BCG (bacilo Calmette-Guerin, una cepa de Mycobacterium bovis), que induce una respuesta inmunitaria frente a las proteínas de estrés que es también protectora frente a Mycobacterium tuberculosis.

Los genes y las proteínas de estrés para su uso en la presente invención son aquellas bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBP, ciclofilinas, Hsp20-30, C1pP, GrpE, Hsp10, ubiquitina, calnexina y proteína disulfuro isomerasas. Macario, A. J. L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70, 1995; Parsell, D. A. y Lindquist, S., Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); patente de los EE.UU. número 5.232.833 (Sanders et al.). Un grupo particular de proteínas de estrés incluye Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 y ubiquitina, más preferiblemente Hsp70 y Hsp60.

Una proteína de estrés en los métodos y composiciones de la presente invención se selecciona preferiblemente de proteínas de estrés presentadoras de antígeno de manera extracelular o de proteínas de estrés que están procesadas y los fragmentos peptídicos resultantes se presentan en la superficie de la célula, de tal manera que es una proteína presentadora de antígeno de manera extracelular. Adicionalmente, un gen o proteína de estrés seleccionado para su uso en la presente invención se selecciona preferiblemente de tal manera que el gen o proteína de estrés no está regulada con arreglo a una o más formas de estrés en al menos una expresión, preferiblemente una bacteria o un ser humano. Más preferiblemente, los genes o proteínas de estrés seleccionados no están regulados en seres humanos, incluyendo mediante factores de estrés tales como los descritos anteriormente o transformación.

Los ejemplos de Hsp100-200 incluyen Grp170 (para proteína regulada por glucosa), residuos de Grp170 en la luz del RE, en el compartimento pre-Golgi y pueden desempeñar un papel en el plegamiento y ensamblaje de inmunoglobulinas.

Los ejemplos de Hsp100 incluyen Hsp110 de mamífero, Hsp 104 de levaduras, c1pA, c1pB, c1pC, c1pX y c1pY. El Hsp 104 de levaduras y el clpA de E. coli forman partículas hexaméricas y tetraméricas de c1pB de E. coli cuyo ensamblaje parece requerir la unión del nucleótido adenina. La proteasa Clp proporciona un heterooligómero de 750 kDa compuesto por ClpP (una subunidad proteolítica) y por C1pA. C1pB-Y están relacionados estructuralmente con C1pA, a pesar de que a diferencia de C1pA no parecen complejarse con C1pP.

Los ejemplos de Hsp90 incluyen HtpG en E. coli, Hsp83 y Hsc83 en levaduras y Hsp90\alpha, Hsp90\beta y Grp94 en seres humanos. Hsp90 se une a grupos de proteínas, proteínas que son normalmente moléculas reguladoras celulares tales como receptores de hormonas esteroideas (por ejemplo, glucocorticoides, estrógeno, progesterona y testosterona), factores de transcripción y proteína cinasas que desempeñan un papel en los mecanismos de transducción de señales. Las proteínas Hsp90 también participan en la formación de complejos de proteínas grandes y abundantes que incluyen otras proteínas de estrés.

Lon es una proteína tetramérica que funciona como una proteasa dependiente de ATP que degrada proteínas no nativas en E. coli.

Los ejemplos de Hsp70 incluyen Hsp72 y Hsp73 de células de mamífero, DnaK de bacterias, particularmente micobacterias tales como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis (tales como el bacilo Calmette-Guerin), DnaK de Escherichia coli, levaduras y otras procariotas, y BiP y Grp78.

Hsp70 puede unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos y péptidos desplegados, participando así en el plegamiento y desplegamiento de proteínas así como en el ensamblaje y desensamblaje de complejos de proteínas.

Los ejemplos de Hsp60 incluyen Hsp65 de micobacterias, Hsp60 bacteriano también conocido comúnmente como GroEL, tal como GroEL de E. coli. Hsp60 forma grandes complejos homooligoméricos y parece desempeñar un papel clave en el plegamiento de proteínas. Los homólogos de Hsp60 están presentes en mitocondrias y cloroplastos eucariotas.

Los ejemplos de TF55 incluyen Tcpl, TRiC y termosoma. Las proteínas se producen normalmente en el citoplasma de eucariotas y algunas arqueobacterias, y forman anillos de múltiples miembros, que promueven el plegamiento de las proteínas. También son débilmente homólogos a Hsp60.

Los ejemplos de Hsp40 incluyen DnaJ de procariotas tales como E. coli y micobacterias, y HSJ1, HDJ1 y Hsp40. Hsp40 desempeña un papel como chaperona molecular en la síntesis de proteínas, termotolerancia y replicación de ADN, entre otras actividades celulares.

Los ejemplos de FKBP incluyen FKBP12, FKBP13, FKBP25 y FKBP59, Fpr1 y Nep1. Las proteínas normalmente tienen actividad peptidil-prolil isomerasa e interaccionan con inmunosupresores tales como FK506 y rapamicina. Las proteínas se encuentran normalmente en el citoplasma y el retículo endoplásmico.

Los ejemplos de ciclofilina incluyen ciclofilinas A, B y C. Las proteínas tienen actividad peptidil-prolil isomerasa e interaccionan con el inmunosupresor ciclosporina A. la proteína ciclosporina A se une a calcineurina (una proteína fosfatasa). Los ejemplos de Hsp20-30 incluyen \alpha-cristalina y a Hsp20-30 se denomina también como Hsp pequeña. Hsp20-30 se encuentra normalmente en grandes complejos homooligoméricos o, posiblemente, también complejos heterooligoméricos en los que un tipo de célula u organismo expresa varios tipos diferentes de Hsp pequeñas. Hsp20-30 interacciona con estructuras citoesqueléticas y pueden desempeñar un papel regulador en la polimerización/despolimerización de actina. Hsp20-30 se fosforila rápidamente con el estrés o la exposición de células en reposo a factores de crecimiento.

ClpP es una proteasa de E. coli implicada en la degradación de proteínas anómalas. Se encuentran homólogos de ClpP en los cloroplastos. C1pP forma un complejo heterooligomérico con ClpA.

GrpE es una proteína de E. coli de aproximadamente 20 kDa que está implicada tanto en el rescate de proteínas dañadas por el estrés como en la degradación de proteínas dañadas. GrpE desempeña un papel en la regulación de la expresión de genes de estrés en E. coli. Los ejemplos de HsplO incluyen GroES y CpnlO. HsplO se encuentra normalmente en E. coli y en mitocondrias y cloroplastos de células eucariotas. HsplO forma un anillo de siete miembros que se asocia con oligómeros de Hsp60. HsplO también está implicado en el plegamiento de las proteínas.

Se ha encontrado que la ubiquitina se une a proteínas en coordinación con la eliminación proteolítica de las proteínas mediante proteasas citosólicas dependientes de ATP.

En realizaciones particulares, las proteínas de estrés de la presente invención se obtienen a partir de enterobacterias, micobacterias (particularmente M. leprae, M. tuberculosis y M. bovis, E. coli, levaduras, Drosophila, vertebrados, aves, pollos, mamíferos, ratas, ratones, primates y seres humanos.

Las proteínas de estrés pueden estar en la forma de sales ácidas o básicas, o en forma neutra. Además, los residuos de aminoácidos individuales pueden modificarse mediante oxidación o reducción. Debido a la degeneración del código genético, por ejemplo, puede haber una variación considerable en las secuencias de nucleótidos que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden contener también fragmentos de proteínas de estrés obtenidos de proteínas de estrés, siempre que tales fragmentos incluyan los epítopos conformacionales implicados en aumentar la respuesta inmunitaria al antígeno elegido. Los fragmentos de proteínas de estrés pueden obtenerse mediante fragmentación utilizando proteinasas, o mediante métodos recombinantes, tales como la expresión de una parte de una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de estrés (o bien sola bien o como fusiones con otra proteína). También pueden producirse péptidos mediante tales métodos, o mediante síntesis química. La proteína de estrés se fusiona a una segunda proteína, que puede o puede no ser una proteína de estrés. Las proteínas de estrés pueden incluir mutaciones introducidas en loci particulares mediante una variedad de técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: 4 Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Drinkwater y Klinedinst, PNAS 83:3402-3406, 1986; Liao y Wise Gene 88:107-111, 1990'); Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989.

El término "suficientemente homólogo a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés" significa que la secuencia de aminoácidos de la proteína o polipéptido mostrará generalmente una identidad de al menos el 40% con la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés; en algunos casos, la secuencia de aminoácidos de un equivalente funcional muestra una identidad de aproximadamente el 50% con la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés.

Los métodos de identificación de un gen o una proteína en consideración como gen o proteína de estrés se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la conservación de los genes y proteínas de un grupo particular de proteínas de estrés permite la comparación de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos del gen/proteína en consideración con los genes de estrés bien conocidos tales como DnaK, GroEL o DnaJ, por ejemplo, mediante hibridación de ácido nucleico o secuenciación de ácido nucleico o aminoácidos, seguido por análisis de comparación informático. Voellmy, R., et al., PNAS 82:4949-4953 (1985). Alternativamente, puede utilizarse un ensayo para identificar y/o discriminar entre características estructurales esenciales y/o propiedades funcionales de una proteína de estrés seleccionada. Por ejemplo, puede examinarse una biblioteca de expresión utilizando anticuerpos anti-Hsp y otros ensayos bien conocidos en la técnica. Antibodies: A Laboratory Manual Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Además, puede aprovecharse la actividad biológica de un grupo de proteínas de estrés dado. Guidon, P. T., y Hightower, L. E., Biochem., 25:3231-3239 (1986). Por ejemplo, Hsp70 puede unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos y péptidos desplegados en el ensamblaje de complejos de proteínas. Por tanto, el mezclado de una proteína en consideración con una muestra que comprende polipéptidos, péptidos o ATP apropiados, seguido por la determinación de la presencia o ausencia de producción de complejos proteína-proteína o proteína-ácido nucleico indica la presencia o ausencia aparente de un gen o proteína Hsp70, presencia o ausencia que puede confirmarse utilizando otros ensayos tales como ensayos basados en anticuerpos.

Una dosis eficaz de las proteínas de estrés para provocar una inmunidad celular y humoral específica a las proteínas de estrés, o a sustancias conjugadas a las proteínas de estrés, tales como proteínas u oligosacáridos, está en el intervalo de 0,1 a 1000 \mug de hsp por inyección, dependiendo del individuo al que se está administrando la proteína de estrés (Lussow, A. R., et al., Eur. J. Immun., 21:2297-2302 (1991); Barrios, C. et al., Eur. J. Immun., 22:1365-1372 (1992)). La dosificación apropiada de la proteína de estrés para cada individuo se determinará teniendo en cuenta, por ejemplo, la proteína de estrés particular que se esté administrando, el tipo de individuo al que se esté administrando la proteína de estrés, la edad y el tamaño del individuo, la condición que se esté tratando o previniendo y la gravedad de la condición. Los expertos en la técnica también podrán determinar sin utilizar más que la experimentación de rutina, la dosificación apropiada para administrar a un individuo.

La proteína de estrés, parte de la proteína de estrés, el equivalente funcional de la proteína de estrés y el antígeno al que se añade, fusiona o conjuga la proteína de estrés, presente en la vacuna puede producirse u obtenerse utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, la proteína de estrés y/o el antígeno del virus influenza puede obtenerse (aislarse) de una fuente en la que se produce en la naturaleza, puede producirse mediante clonación y expresión de un gen que codifica para la proteína de estrés o el antígeno deseado o puede sintetizarse químicamente o mecánicamente.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria frente a una variedad de patógenos (por ejemplo, bacterias, virus, parásitos). La composición que comprende un antígeno del virus influenza y toda o una parte de una o más proteínas de estrés o toda o una parte de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína de estrés para inducir la respuesta inmunitaria frente al antígeno puede utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria frente a un virus influenza en cualquier vertebrado (por ejemplo, mamíferos, aves de corral) sensibles a un virus influenza. Por ejemplo, pueden utilizarse las composiciones para inducir una respuesta inmunitaria frente a un virus influenza en primates (por ejemplo, seres humanos), caballos, cerdos, pavos y pollos.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un huésped en una variedad de maneras. Las vías de administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por ejemplo, polímeros de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural e intranasal. Puede utilizarse cualquier otra vía conveniente de administración, por ejemplo, infusión o inyección en bolo, o absorción a través de los revestimientos epitelial y mucocutáneo. Además, las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse junto con otros componentes o agentes biológicamente activos (por ejemplo, alumbre), tensioactivos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, glicéridos), excipientes (por ejemplo, lactosa), soportes, diluyentes o vehículos.

Además, la proteína de estrés y/o antígeno peptídico pueden administrarse mediante expresión in vivo de polinucleótidos que codifican para tales en un sujeto mamífero.

Es decir, puede utilizarse un vector para suministrar ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) para un antígeno y una proteína de estrés o un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que contiene secuencias de antígeno y proteína de estrés. Por ejemplo, la proteína de estrés y/o el antígeno pueden administrarse a un huésped (mamífero) utilizando vectores vivos en los que se administran los vectores vivos que contienen las secuencias de ácido nucleico de proteína de estrés y antígeno en condiciones en las que el antígeno y/o la proteína de estrés se expresan in vivo. Por ejemplo, puede inyectarse a un mamífero un vector que codifica para y expresa un antígeno in vivo en combinación con una proteína de estrés en forma proteica o peptídica, o en combinación con un vector que codifica para y expresa una proteína de estrés in vivo.

Alternativamente, puede inyectarse a un huésped un vector que codifica para y expresa la proteína de estrés in vivo en combinación con un antígeno en forma de péptido o proteína, o en combinación con un vector que codifica para y expresa un antígeno in vivo. También puede utilizarse un único vector que contiene las secuencias que codifican para un antígeno de proteína (péptido) para las composiciones de la presente invención.

Varios sistemas de vector de expresión están disponibles comercialmente o pueden reproducirse según técnicas de ADN recombinante y cultivo celular. Por ejemplo, pueden utilizarse sistemas de vector tales como los sistemas de expresión del virus vaccinia o levaduras, o vectores virales (Kaufman, R. J., A J. of Meth. In Cell and Molec. Biol., 2:221-236 (1990)). Pueden utilizarse otras técnicas que utilizan plásmidos desnudos o ADN, y genes clonados encapsidados en liposomas de selección de objetivo o en eritrocitos fantasma para introducir los polinucleótidos de la proteína de estrés y/o antígeno en el huésped (Freidman, T., Science, 244:1275-1281 (199); Rabinovich, N. R., et al., Science, 265:1401-1404 (1994)). La construcción de los vectores de expresión y la transferencia de los vectores y ácidos nucleicos en diversas células huésped puede conseguirse utilizando técnicas de ingeniería genética, tal como se describe en manuales como Molecular Cloning y Current Protocols in Molecular Biology, que se incorporan como referencia al presente documento, o utilizando kits disponibles comercialmente (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 1989; Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1989)).

La cantidad de proteína de estrés y/o antígeno en las composiciones de la presente invención es una cantidad que produce una respuesta inmunoestimuladora eficaz en el huésped (vertebrado tal como un mamífero). Una cantidad eficaz es una cantidad tal que cuando se administra, da como resultado un aumento de la respuesta inmunitaria con respecto a la respuesta inmunitaria cuando no se administra. Es decir, una cantidad eficaz es una cantidad que proporciona una respuesta inmunitaria más pronunciada que cantidades similares del antígeno o la proteína de estrés solos. Además, la cantidad de proteína de estrés y/o antígeno administrada al huésped variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo el antígeno empleado, el tamaño, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del huésped, y el momento de la administración, duración o cualidades particulares del virus influenza. El ajuste y la manipulación de los intervalos de dosis establecidos están muy dentro de las habilidades de los expertos en la técnica. Por ejemplo, la cantidad de proteína de estrés y antígeno puede ser de desde aproximadamente 100 \mug hasta aproximadamente 1 g, preferiblemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g, y desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 100 mg.

La presente invención enseña que la presencia de una proteína de estrés estimula enormemente la respuesta citolítica mediada por células frente a un antígeno. Aunque se han identificado antígenos asociados a tumor, las respuestas inmunitarias frente a estos antígenos solos no son terapéuticamente eficaces. El aumento de la respuesta celular frente a estos antígenos por medio de la coadministración de una proteína de estrés, o bien en una mezcla o bien unida al antígeno, es beneficioso en el tratamiento del cáncer. Esta expectativa se apoya por la observación detallada en los ejemplos de que una composición de la presente invención inmuniza un animal mamífero frente a una exposición tumoral posterior. Se prevé que el aumento de la respuesta citolítica, mediada por células, frente a un antígeno dé como resultado la regulación por disminución de una respuesta humoral preexistente (mediada por Th2) frente al mismo antígeno. Finalmente, también se considera que la inmunidad mediada por células T es un elemento importante en la defensa del huésped mamífero frente a infecciones producidas por virus, protozoos y ciertas bacterias intracelulares tales como micobacterias. Tal como se muestra en los ejemplos, las composiciones (mezclas, conjugados y proteínas de fusión) que incluyen una proteína de estrés y un antígeno de virus influenza son eficaces para provocar una respuesta citolítica sustancial mediada por células frente a células de mamífero que expresan el antígeno viral.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no se pretende que sean limitantes en modo alguno y de los que los ejemplos 1-3 y 5-6 caen fuera del alcance de la invención reivindicada.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de proteínas de estrés recombinantes A. Hsp70 micobacteriana recombinante

El plásmido Y3111 contiene un gen Hsp70 de M. tuberculosis insertado funcionalmente entre secuencias de control de la expresión (Mehlert, A. y Young, D. B., Mol. Microbiol., 3:125-130 (1989). La cepa de E. coli CG2027 (obtenida de C. Georgopoulos, Universidad de Ginebra, Suiza) que contiene un gen Hsp70 truncado se transformó con el plásmido Y3111 mediante procedimientos convencionales. (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).

Se hicieron crecer bacterias que contenían el plásmido Y3111 durante la noche en medio 2xYT (20 g de triptona, 10 g de extracto de levaduras, 10 g de NaCl por litro) que contenía 100 microgramo/ml de ampicilina a 37ºC, con agitación (250 rpm). Se preparó una reserva de glicerol al 10% a partir de este cultivo y se almacenó a -70ºC. Se utilizaron varias raspaduras de la reserva de glicerol congelada para inocular un gran cultivo que se incubó como anteriormente durante 48 h. Cuando la densidad óptica a 590 nm alcanzó de 2,5 a 3,5, se recogieron las células por centrifugación.

Se realizaron las siguientes etapas a 4ºC. Se resuspendieron los sedimentos celulares en 3 ml por gramo de tampón de lisis. La composición del tampón de lisis fue Tris-HCl 10 mM, etilendiaminotetraacetato (EDTA) 2 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, 10 microgramo/ml de aprotinina, 10 microgramo/ml de leupeptina y 1 microgramo/ml de pepstatina. Se añadió lisozima a la suspensión celular hasta una concentración final de 0,14 mg/ml. Entonces se congeló la suspensión a -70ºC.

La suspensión celular se descongeló y las células se rompieron por sonicación. Los materiales sonicados se sometieron a centrifugación a 17.000 rpm durante 30 min. (rotor JA-17, Beckmann). Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la disolución del sobrenadante hasta que la disolución estaba saturada al 65% con (NH_{4})_{2}SO_{4}. Tras una incubación de 30 min., la mezcla se centrifugó como anteriormente. El sedimento se disolvió en tampón A de Q-SEPHAROSE. A esta disolución, se añadieron 10 microgramo/ml de aprotinina, 10 microgramo/ml de leupeptina y 1 microgramo/ml de pepstatina, y la disolución se dializó durante la noche frente a 65 volúmenes de tampón A de Q-SEPHAROSE. El tampón A de Q-SEPHAROSE contenía Tris-HCl 30 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM. La disolución dializada se clarificó mediante centrifugación tal como se describió anteriormente.

La disolución dializada se aplicó a una columna de Q-SEPHAROSE (Pharmacia) equilibrada con tampón A de Q-SEPHAROSE. La columna se lavó con dos volúmenes del mismo tampón. La elución fue con un gradiente de NaCl 0 a 600 mM. Se probaron las fracciones mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie para determinar la presencia de un polipéptido principal de 71 kDa (es decir, la proteína Hsp70 de M. tuberculosis recombinante). Se reunieron las fracciones que contenían el polipéptido y la combinación se llevó a una saturación del 65% mediante la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido. La mezcla se centrifugó tal como se describió anteriormente, se disolvió el sedimento en un tampón ATP Start (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 20 mM, MgCl_{2} 5 mM, beta-mercaptoetanol 15 mM y EDTA 0,1 mM) y la disolución de proteína resultante se dializó frente a 65 volúmenes del mismo tampón y se clarificó mediante centrifugación.

Entonces, se aplicó la disolución de proteína dializada a una columna de ATP-agarosa (Fluka) equilibrada con tampón ATP Start. La columna se lavó con 1 volumen de columna de tampón ATP Start con NaCl 1 M. La elución se consiguió con tampón ATP Start complementado con ATP 10 mM. El eluato se llevó a una saturación del 65% con (NH_{4})_{2}SO_{4} y se recogió la proteína precipitada tal como se describió anteriormente. El sedimento de centrifugación se disolvió ahí y se dializó frente a 200 volúmenes de tampón de Blue SEPHAROSE (Tris-HCl 30 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM).

La disolución de proteína dializada de la última etapa se aplicó a una columna de Blue SEPHAROSE (Pharmacia) equilibrada con tampón de Blue SEPHAROSE. La columna se lavó con 1,5 volúmenes de columna del mismo tampón. Se recogieron las fracciones no retenidas ("flow-through") y de lavado como una única combinación.

Se evaluó la pureza de la preparación final mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, mediante análisis de inmunotransferencia ("western blot") (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)) utilizando anticuerpos monoclonales de ratón específicos para Hsp70 micobacteriana y Hsp70 de E. coli, respectivamente, y mediante ensayos de la actividad ATPasa. Las preparaciones son normalmente puras en más del 90% basado en el patrón de tinción de la preparación en geles teñidos con azul de Coomassie y preferiblemente puras en más del 95% y contienen menos del 1% de Hsp60 de E. coli y sin Hsp70 de E. coli detectable.

B. Hsp60 micobacteriana

El plásmido RIB1300 contiene un gen Hsp60 de BCG de M. bovis insertado funcionalmente entre secuencias de control de la expresión. (Thole, J. E. R., et al., J. Exp. Med., 178:343-348 (1993). La cepa de E. coli M1546 se transformó con el plásmido RIB1300 (Thole, J. E. R., anteriormente) utilizando procedimientos convencionales. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Se hizo crecer un inóculo de bacterias que contenía el plásmido RIB1300 hasta saturación en medio NCZYM (10 g de N-Z amina A, 5 g de extracto de levaduras Bacto, 1 g de casaminoácidos, 5 g de NaCl, 2 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}-7H_{2}O) por litro) que contenía 200 microgramo/ml de ampicilina a 28ºC y con agitación. Este cultivo se utilizó para inocular un cultivo mayor que se hizo crecer en las mismas condiciones que el cultivo de inóculo hasta que la densidad óptica del cultivo estuvo entre 0,3 y 0,6 a una densidad óptica de 590 nm. Se inició la producción de la proteína recombinante mediante el rápido aumento de la temperatura del cultivo hasta 42ºC mediante incubación en un baño de agua caliente. El cultivo se mantuvo a esta temperatura durante 3 h. Entonces se recogieron las bacterias mediante centrifugación y se resuspendieron en 6 volúmenes por peso de sedimento bacteriano de tampón de lisis. El tampón de lisis contenía Tris-JCL 10 mM, etilendiaminotetraacetato (EDTA) 10 mM, PMSF 0,1 mM y 0,1% de RIVM BA (0,104 g de 4-amino-benzamidina-2HCl, 0,066 g de ácido épsilon-aminocaproico por 50 ml). Se añadió lisozima hasta una concentración de 0,1 mg/ml, y la suspensión se congeló a -70ºC.

Se descongeló la suspensión bacteriana y se puso a 4ºC. Las siguientes operaciones fueron a esta temperatura. Se consiguió la lisis completa de las bacterias mediante sonicación. El material sonicado se centrifugó a 17.000 rpm durante 30 min. en un rotor JA-17 (Beckman). Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado a la disolución del sobrenadante hasta que se consiguió una saturación del 20%. Se eliminaron los precipitados por centrifugación (véase anteriormente) y se desecharon. La disolución del sobrenadante se llevó hasta una saturación del 55% mediante la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado. El sedimento resultante de la posterior centrifugación se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), beta-mercaptoetanol 15 mM, EDTA 1 mM). La disolución de proteína en TE se dializó entonces frente a 50 volúmenes de tampón TE.

Tras centrifugación (como anteriormente) para eliminar el material precipitado, la disolución de proteína dializada se aplicó a una columna de DEAE-SEPHAROSE (Pharmacia). Tras lavado con tampón TE, se eluyeron las proteínas con un gradiente de NaCl 0-300 mM en tampón TE. Se identificaron las fracciones que contenían Hsp60 de BCG de M. bovis (peso molecular aparente real igual a 65 kDa) mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie y se reunieron. Se añadieron 10 microgramo/ml de aprotinina, 10 microgramo/ml de leupeptina y 1 microgramo/ml de pepstatina a la combinación y se concentró en una celda Amicon utilizando una membrana YM30.

La combinación concentrada se aplicó a una columna S-200 SEPHACRYL (Pharmacia) equilibrada con tampón S200 (Na_{2}HPO_{4} 10 mM (pH 6,8), NaCl 150 mM y beta-mercaptoetanol 15 mM). La elución fue con el mismo tampón. Se probaron las fracciones para determinar la presencia de Hsp60 micobacteriana como antes y las fracciones positivas que contienen la proteína sumamente purificada se reunieron y dializaron durante la noche frente a tampón HAP (Na_{2}HPO_{4} 10 mM (pH 6,8), beta-mercaptoetanol 15 mM).

La combinación dializada se aplicó a una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad; gel HTP de Bio-Gel) equilibrada con tampón HAP. La columna se lavó con 3 volúmenes de columna de MgCl_{2} 1 mN y beta-mercaptoetanol 15 mM y luego con Na_{2}HPO_{4} 1 mM, (pH 6,8) y beta-mercaptoetanol 15 mM. La proteína se eluyó con un gradiente de fosfato 10-60 mM. Se probaron las fracciones como anteriormente, y se reunieron las fracciones positivas, se concentraron y se intercambiaron en NaCl al 0,85% por medio de filtración en gel a través de PD10. Se evaluó la pureza de Hsp60 micobacteriana mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie así como análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos para Hsp70 y Hsp60 de E. coli. Las preparaciones fueron normalmente puras en más del 90% y contenían no más del 0,5% de Hsp60 de E. coli y 0,1-0,2% de Hsp70 de E. coli, respectivamente.

Las preparaciones de Hsp pueden despirogenarse o bien mediante cromatografía de afinidad sobre resina DetoxiGel, adición de poliximina B o bien (lo menos preferiblemente) mediante extracción con detergentes tales como Triton® X-114.

Ejemplo 2 Respuesta de LCT a una composición que comprende una mezcla de un péptido NP y hsp70 a. Preparación de hsp70 y péptido NP

Hsp70, aquí hsp71 de M. tuberculosis, se preparó tal como se describe en el ejemplo 1. El péptido NP (al que se hace referencia en el presente documento como NP.B; Motal, U. M. A., et al., Eur. J. Immunol., 25:1121-1124 (1995) y referencias en ese documento) con la secuencia de aminoácidos VQLASNENMETM (SEQ ID NO: 1) correspondiente a los residuos 363-374 en el NP completo y que contiene un epítopo de LCT conocido (restringido por H-2b) se produjo de manera sintética (a escala de 0,25 mM) en un sintetizador de péptidos modelo 431A de Applied Biosystems utilizando Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) como el grupo protector de alfa-amino y resina HMP (Wang) como el soporte sólido. Todos los aminoácidos y productos químicos de síntesis se adquirieron a Applied Biosystems.

NP.B se escindió del soporte y se eliminaron los grupos protectores de cadenas laterales mediante incubación con agitación continua de NP-B-resina durante 3 h en 2 ml de una mezcla preparada combinando 10 ml de ácido trifluoroacético, 0,5 ml de agua, 0,75 g de fenol cristalino, 0,25 ml de etanoditiol y 0,5 ml de tioanisol. La mezcla de escisión se filtró en 40 ml de dietil éter enfriado con hielo. Se recogió el material insoluble mediante centrifugación a 5000 x g durante 8 min. Se decantó el éter y se lavó el sedimento tres veces mediante resuspensión en dietil éter frío seguido por centrifugación. Tras el último lavado, se secó al aire el sedimento, se llevó a agua destilada y se liofilizó.

b. Inmunización de ratones y preparación de células efectoras

Se disolvió el péptido NP.B en un pequeño volumen de PBS de Dulbecco (DPBS; KH_{2}PO_{4} 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 0,137 M). Se mezclaron alícuotas de 1,89, 18,9 o 189 microgramos, respectivamente, de péptido NP.B con alícuotas de 100 microgramos de hsp71 en DPBS para obtener composiciones con razones molares de péptido:hsp de 1, 10 o 100, respectivamente. Grupos de cuatro ratones hembra de la cepa C57BL/6 o bien se dejaron sin inmunizar (control) o bien se les inyectó por vía subcutánea en la nuca con tres mezclas diferentes de NP.B-hsp71. Tras siete días, se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical y se extirparon los bazos. Se prepararon suspensiones celulares individuales de los bazos reunidos y se lavaron una vez con "medio completo", que era medio RPMI-1640 complementado con un 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM y sulfato de gentamicina 50 \mug/ml. Se volvieron a estimular células linfoides cultivando 25 x 10^{6} células viables con péptido NP.B a una concentración 0,1 \mumolar durante cinco días. Se incubaron los cultivos en matraces verticales de 25 cm^{2} con 10 ml de medio completo a 37ºC y un 5% de CO_{2}. Los cultivos (células efectoras) se utilizaron entonces en el ensayo de actividad de LCT descrito a continuación.

c. Ensayo de actividad de LCT

Se utilizaron células EL4 (H-2b) como células diana. Se incubaron las células durante 90 min. con 150 \muCi de Na_{2}CrO_{4} y 10 \mug de péptido NP.B por 10^{6} células. Tras el lavado extenso para eliminar el radiomarcador en exceso, se cultivaron 10^{4} células diana marcadas conjuntamente con células efectoras vueltas a estimular en diversas razones de células efectoras:diana. Tras 4-5 horas de incubación, las placas de cultivo se centrifugaron durante 5 min. a 200 x g, y se recogieron alícuotas de 100 \mul de las disoluciones de sobrenadante que contienen el radiomarcador liberado de las células en recipientes Ready Caps de Beckman. Se midió la radiactividad mediante recuento por centelleo líquido. Para determinar la radiactividad liberada espontáneamente y la que puede liberarse total, se recogieron las disoluciones de sobrenadantes procedentes de los cultivos que contienen sólo células diana o procedentes de células diana lisadas mediante la adición de Triton® X-100, y se determinó la radiactividad como anteriormente. Los resultados se expresaron como % de lisis específica, calculada basada en la siguiente fórmula:

% \ de \ lisis \ especifica = 100 \ x \ (cpmprueba-cpmespont) / (cpmtotal-cpmespont),

en la que cpmprueba es la radiactividad liberada a partir de un cocultivo particular, cpmespont es la radiactividad liberada espontáneamente de un cultivo de células diana y cpmtotal es la radiactividad liberada por la lisis con Triton X-100 de las células diana. Se realizaron ensayos de LCT por triplicado, y se facilitó el valor promediado.

Los resultados del experimento se muestran en la figura 1. La reacción de control, es decir, el ensayo de la liberación de cromo de un cocultivo de células diana y células efectoras preparado a partir de ratones sin inmunizar, proporciona un valor de fondo para la lisis de aproximadamente el 10% a una razón de células efectoras:diana de 100. No se observó un aumento de la actividad de LCT con respecto al fondo con las células efectoras procedentes de ratones inmunizados con mezclas de NP-B-hsp71 1:1 o 10:1. Se encontró un gran aumento de la lisis con células efectoras procedentes de ratones inmunizados con una mezcla 100:1 de péptido NP.B y hsp71, que demuestra que la inmunización conjunta con un péptido tal como NP.B y una hsp tal como hsp71 puede estimular espectacularmente la actividad de LCT frente a células que muestran el péptido. Obsérvese que, tal como se conoce bien en la técnica, la inmunización con el péptido NP.B en DPBS solo no estimula la actividad de LCT.

Ejemplo 3 Respuesta de LCT a una composición que comprende un conjugado químico de un péptido NP y hsp70 a. Preparación de hsp70 y péptido NP

Se preparó hsp71 de M. tuberculosis tal como se describe en el ejemplo 1. Se sintetizó el péptido NP.B tal como se trató en el ejemplo 2, excepto porque el péptido contenía un residuo de cisteína amino-terminal extra y, por tanto,, tenía la secuencia de aminoácidos CVQIASNENMETM (SEQ ID NO: 2).

b. Conjugación química del péptido Np.B a hsp70 y toxoide diftérico

Las conjugaciones se llevaron a cabo tanto con hsp70 como, para proporcionar un patrón para comparaciones de eficacias de la estimulación específica de la actividad de LCT, la proteína transportadora utilizada comúnmente toxoide diftérico (abreviado TD, TD se obtuvo de una fuente comercial).

b.1. Activación de hsp71 de M. tuberculosis y proteínas transportadoras TD

Se disolvieron nueve mg de hsp71 en 4,5 ml de tampón borato de sodio 0,1 M, pH 8,0. Se añadió sulfo-MBS (éster de m-maleimido-benzoíl-N-hidroxisulfosuccinimida) (2,3 mg en 100 \mul de dimetilsulfoxamina) a la proteína y se incubó la mezcla de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se ajustó el pH a 6,0 y la mezcla de reacción se dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 litro de fosfato de sodio 20 mM y NaCl 150 mM, pH 5,6. TD se trató de manera similar.

b.2. Preparación de péptido NP.B para conjugación

Para cada reacción de conjugación, se disolvieron 3 mg de péptido en 100 \mul de beta-mercaptoetanol 0,1 M. Tras 1 hora de incubación para permitir la reducción del péptido, se retiró el agente reductor secando la mezcla de reacción en una centrífuga SpeedVac. Se redisolvió el péptido en 0,5 ml de agua destilada a los que se añadieron alícuotas de 5 \mul de NaOH 1 N hasta que el péptido se disolvió por completo. Para experimentos de conjugación con TD, se redujeron 6 mg de péptido y luego se redisolvieron en 1 ml de agua.

b.3. Formación del conjugado

Se ajustó el pH de las disoluciones de proteína transportadora activada a 6,8 utilizando NaOH 0,1 N. Se hizo reaccionar una disolución que contenía 3 mg de proteína transportadora activada con 0,5 ml de disolución de péptido reducido (o 1 ml de disolución de péptido reducido para la preparación de los conjugados con TD) durante 3 horas a temperatura ambiente con mezclado continuo. Para eliminar el péptido sin reaccionar, la disolución que contiene el conjugado resultante se dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 litro de fosfato de sodio 20 mM y NaCl 150 mM, pH 7. Se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA. La eficacia de conjugación conseguida mediante este procedimiento se había determinado en experimentos piloto previos utilizando péptido NP.B radiomarcado. La razón de péptido:proteína se encontró que era de 17,5 para el conjugado de NP.B-hsp71 (71.NP) y 10,1 para NP.B-TD (TD.NP).

c. Inmunización de ratones y preparación de células efectoras

Se realizaron las inmunizaciones con 1-100 \mug de conjugados 71.NP y TD.NP y la preparación de células efectoras tal como se describe en el ejemplo 2.

d. Ensayo de actividad de LCT

Se realizaron los ensayos tal como se describe en el ejemplo 2.

Resultados

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2. Los ensayos de actividad de LCT con células efectoras procedentes de ratones a los que se les inyectó DPBS o 1 o 10 \mug de conjugado TD.NP dieron resultados negativos (línea inferior de la figura 2). Sólo las células efectoras a las que se les inyectó 100 \mug de TD.NP produjeron actividad de LCT medible (una lisis de entre el 5 y el 10% a una razón de células efectoras:diana de 100) que era comparable a la de las células efectoras procedentes de ratones inmunizados con 1 \mug de 71.NP. Los ensayos con células efectoras procedentes de ratones inmunizados con 10 o 100 \mug de conjugado 71.NP mostraron una actividad de LCT sustancialmente superior, es decir, una lisis de células diana de entre el 15 y el 25% a una razón de células efectoras:diana de 100. Este experimento demuestra en el ejemplo del péptido NP.B y hsp71 que la inmunización con un conjugado de péptido-hsp estimula la actividad de LCT específica dirigida contra las células que muestran el pépti-
do.

Ejemplo 4 Respuesta de LCT a una composición que comprende una proteína de fusión hsp-NP a. Preparación de proteínas de fusión hsp-NP a.1. Preparación de plásmidos de expresión que codifican para proteínas de fusión que contienen epítopos de LCT de NP en el extremo carboxi-terminal de hsp65 micobacteriana

Se construyeron los plásmidos que se expresan como parte de secuencias de NP de virus influenza de proteínas de fusión hsp65 que incluyen el epítopo de LCT de H-2b NP.B (véase anteriormente) o el epítopo de LCT de H-2^{d} NP.D (residuos 147-155 de NP; Levi, R. y Arnon, R., Vaccines, 14:85-92 (1996) y las referencias en ese documento).

Se construyó previamente un vector de expresión, pET65mp, derivado de un plásmido de sistema pET (Novagen) y que contiene un gen hsp65 de BCG de M. bovis completo y sitios de restricción útiles para la inserción de secuencias codificantes adicionales en el extremo carboxi-terminal del gen hsp65. En la figura 3, se facilita una representación esquemática de este vector.

Se obtuvo el constructo pNP/cA que contiene el marco de lectura abierto de NP de la cepa de virus influenza A/PR/8/34 bajo el control del promotor de citomegalovirus proporcionado por el plásmido pcDNA1 (Invitrogen) del Dr. Peter Palese (Dept. de Microbiología, Escuela de Medicina Monte Sinaí, Nueva York, NY).

Se sintetizaron dos pares de cebadores para la amplificación de fragmentos que contienen los epítopos NP.B y NP.D en un sintetizador automático de oligonucleótidos y se purificaron utilizando procedimientos de rutina. Los cebadores directos contenían, además de las secuencias apropiadas complementarias a las secuencias de NP, un sitio de restricción EcoRI y los cebadores inversos un sitio de restricción SpeI. El cebador directo para el fragmento NP.D tenía la secuencia 5' AAAGAAGAATTCAGGCGAATC (SEQ ID NO: 3) y el cebador inverso la secuencia 5' GTTCCGAT
CACTAGTCCCACG (SEQ ID NO: 4). Este par se diseñó para amplificar un fragmento que contiene los residuos 117-200 de NP. El cebador directo para el fragmento NP.B tenía la secuencia 5' CTGCTTGAATTCAGCCAAGTG (SEQ ID NO: 5), y el cebador inverso la secuencia 5'CTGTTGACTAGTGTTTCCTCC (SEQ ID NO: 6). Este último par se diseñó para producir un fragmento que contiene los residuos 310-395 de NP.

Se llevaron a cabo reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los anteriores pares de cebadores y pNP/cA como el molde de ADN. Los fragmentos de PCR se digirieron de manera doble con endonucleasas de restricción EcoRI y SpeI y se ligaron a pET65mp cortado con EcoRI/SpeI utilizando procedimientos de subclonación de rutina (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989)). Las células competentes para la transformación de la cepa de E. coli DH5alpha se transformaron con las mezclas de ligamiento y se sembraron en placa sobre agar que contenía ampicilina 100 \mug/ml. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se preparó ADN de plásmido y se analizó para determinar la presencia de la secuencia correcta del gen de fusión hsp65-NP.B o D mediante mapeo de restricción y secuenciación de nucleótidos. Se identificaron los constructos correctos que codifican para las proteínas de fusión hsp65-NP.B (pET65mp/B) y hsp65-NP.D (pET65mp/D) y se utilizaron en manipulaciones posteriores dirigidas a la expresión de proteínas de fusión en bacterias y su purificación. Véanse las figuras 4A-4B para representaciones esquemáticas de los constructos génicos de proteína de fusión, pET65MP/NP-B y pET65MP/NP-D, respectivamente.

a.2. Expresión y purificación de proteínas de fusión hsp65-NP

Se transformaron los constructos de proteína de fusión en la cepa de E. coli BL21 (DE3; Novagen) y las proteínas de fusión se expresaron en cultivos de 6 litros de esta última cepa, utilizando un protocolo estrechamente similar al protocolo sugerido por el proveedor. Las células se recogieron mediante centrifugación, se suspendieron en Tris-HCl 10 mM, EDTA 2 mM y beta-mercaptoetanol 5 mM, pH 7,5 y se lisaron mediante sonicación. Tras la eliminación del material insoluble mediante centrifugación, se añadió sulfato de amonio hasta la saturación del 20% y las proteínas que precipitan se recogen mediante centrifugación. La presencia de la proteína de fusión en el sedimento de sulfato de amonio se verificó mediante SDS-PAGE seguido por tinción con azul de Coomassie. Se utilizó el mismo ensayo para monitorizar todas las etapas de purificación posteriores. La proteína se redisolvió en Tris-HCl 30 mM, EDTA 2 mM y beta-mercaptoetanol 5 mM, pH 7,5 y la disolución se dializó extensamente frente al mismo tampón antes de aplicarse a una columna de DEAE-Sepharose (flujo rápido, Pharmacia Biotech) equilibrada con el mismo tampón. Se recogió la fracción no retenida (proteína no unida) que normalmente contenía aproximadamente 90 mg de proteína. Para purificar adicionalmente la proteína de fusión hsp65-NP.B, se dializaron 60 mg de esta última fracción frente a fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8 y luego se aplicó a una columna de hidroxiapatita (BIORAD) equilibrada con el mismo tampón. Se realizó la elución utilizando un gradiente de fosfato de potasio 0-600 mM. El procedimiento dio como resultado la recuperación sólo de aproximadamente 5 mg de proteína. La columna se eluyó adicionalmente con clorhidrato de guanidinio 4 M que retiró otros 15 mg de proteína. Las fracciones se dializaron frente a DPBS y se concentraron utilizando un dispositivo de ultrafiltración de Amicon, antes de aplicarse a una columna Detoxiel para la despirogenación no retenida. Para purificar adicionalmente la proteína de fusión hsp65-NP.D, se dializó la fracción no retenida en DEAE-Sepharose frente a acetato de sodio 30 mM, EDTA 2 mM y beta-mercaptoetanol 5 mM, pH 5,8-7,5 y luego se aplicó a una columna SP-Sepharose (flujo rápido, Pharmacia Biotech) equilibrada con el mismo tampón. La elución fue con un gradiente de NaCl 0-600 mM. Se procesó la proteína de fusión hsp65-NP.D eluida tal como se describió para la proteína de fusión hsp65-NP.B. Las proteínas de fusión purificadas mediante estos procedimientos fueron puras en más del 90% según se estimó a partir de geles de SDS-PAGE teñidos y estuvieron sustancialmente libres de pirógenos.

b. Inmunización de ratones y preparación de células efectoras

Las inmunizaciones con DPBS (a las que se hace referencia en las figura 5 y 6 como 0 \mug de 65-NP) o 1-100 \mug de las proteínas de fusión hsp65-NP.B o hsp65-NP.D y la preparación de las células efectoras se realizaron esencialmente tal como se describe en el ejemplo 2, excepto porque se utilizaron ratones C57BL/6 en experimentos con hsp65-NP.B y ratones BALB/c en experimentos con hsp65-NP.D. La nueva estimulación in vitro puede llevarse a cabo durante un periodo de siete días, ya sea en ausencia o en presencia de 3 U/ml de IL2 recombinante humana (para estimular de manera general la proliferación de células T).

c. Ensayos de LCT

Los ensayos se realizaron esencialmente tal como se describe en el ejemplo 2, excepto porque se utilizaron células diana EL4 (H-2b) en experimentos con la proteína de fusión hsp65-NP.B y células diana P815 (H-2^{d}) en experimentos con la proteína de fusión hsp65-NP.D. Para proporcionar un control adicional para determinar la especificidad de la respuesta de LCT, las células diana o bien se pulsaron con el péptido NP apropiado (símbolos rellenos en las figuras 5A-5B y 6A-6B), se pulsaron con el péptido de residuos 49 a 57 irrelevantes a partir de la secuencia de la proteína HPV16E7 (símbolos en blanco en las figuras 5A-5B) o bien no se pulsaron (símbolos en blanco en las figuras 6A-6B).

Los resultados de los experimentos con la proteína de fusión hsp65-NP.B (65-P.b marcado) se muestran en las figuras 5A-5B. En la figura 5A se hace referencia a un experimento en el que se vuelven a estimular células efectoras en ausencia, y la figura 5B se hace referencia a un experimento en el que se vuelven a estimular células efectoras en presencia de IL2. Tal como es evidente a partir de la figura 5A, la inmunización con la proteína de fusión hsp65-NP.B da como resultado una estimulación espectacular de la actividad de LCT específica dirigida contra células diana que muestran el péptido NP.B, oscilando desde una lisis de aproximadamente el 20 al 40% de las células diana en una razón de células efectoras:diana de 100. Esencialmente, no se observó lisis específica con células efectoras procedentes de animales "inmunizados" con DPBS. Además, no fue evidente una lisis significativa de las células pulsadas con el péptido E7. En el experimento con células efectoras vueltas a estimular en presencia de IL2, se observaron niveles incluso superiores de lisis de células diana con las células efectoras procedentes de ratones inmunizados con la proteína de fusión hsp65-NP.B. Los niveles oscilaron desde aproximadamente el 25 hasta el 60% a una razón de células efectoras:diana de 100, dependiendo de la dosis de la proteína de fusión. Estos niveles superan enormemente la lisis del 10-15% observada con las células efectoras procedentes de los ratones a los que se les inyectó DPBS. De nuevo, no se observó un lisis específica significativa (superior a la observada con células efectoras procedentes de ratones "inmunizados" con DPBS) de células diana pulsadas con el péptido E7.

Los resultados de los experimentos con la proteína de fusión hsp65-NP.D (65-NP.D marcado) se muestran en las figuras 6A-6B. Generalmente, estos resultados son similares a los obtenidos en los experimentos con la proteína de fusión hsp65-NP.B. Obsérvese que, a diferencia del experimento previo con hsp65-NP.B, se observó una clara dependencia de la dosis de péptido hsp65-NP.D utilizada en la inmunización, en este experimento. Juntos, estos experimentos que utilizan proteínas de fusión hsp65-NP como ejemplos, demuestran que la inmunización con una proteína de fusión hsp-péptido/polipéptido foráneo da como resultado una estimulación espectacular de la actividad de LCT dirigida contra células diana apropiadas que muestran epítopos contenidos en el componente de fusión de péptido/polipéptido foráneo.

Ejemplo 5 Respuestas de LCT a una proteína de fusión hsp-P1A

Utilizando procedimientos similares a los utilizados en el ejemplo anterior, se construyó un plásmido que permitió la expresión en E. coli de un gen de fusión que contiene la secuencia codificante completa de la proteína de estrés hsp 71 de M. tuberculosis y, añadidos en el extremo carboxilo de la secuencia de hsp71, cuatro copias dispuestas en tándem de una secuencia sintética que codifica para el epítopo de LCT mínimo del antígeno asociado a tumor P1A (LPYLGWLVP (SEQ ID NO: 7); esta secuencia se denomina como P1A en este ejemplo). La proteína de fusión hsp71-P1A (denominada 71-P1A(4) en las figuras 7A, 7B, 8A, 8B y 9) se expresó y purificó utilizando métodos bioquímicos convencionales similares a los utilizados en el ejemplo anterior.

Se anestesiaron ratones BALB/c o DBA/2 (H-2^{d}) mediante inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina. Los ratones se inmunizaron entonces por vía subcutánea en la nuca con 0, 5, 50 o 500 \mug de la proteína de fusión hsp71-P1A. Se administró el inmunógeno en DPBS sin adyuvante. Una semana después, se prepararon suspensiones de células individuales a partir de cuatro bazos reunidos por grupo y se volvieron a estimular in vitro durante 7 días con el péptido sintético CKKKLPYLGWLVP (SEQ ID NO: 8) (1 \muM). Obsérvese que los residuos CKKK se añadieron para mejorar la solubilidad acuosa del nonámero P1A. Las células efectoras vueltas a estimular se cultivaron entonces durante 4-5 horas con células diana marcadas con ^{51}Cr. Las dianas fueron células del clon que expresa el antígeno P1A, P1 (H-2^{d}) del mastocitoma de P815 o, alternativamente, células L1210 (H-2^{d}) pulsadas con (CKKK)P1A o como dianas control, células L1210 no pulsadas a razones de efectoras:diana de 100, 33, o 11:1. La lisis específica de las células diana se determinó tal como se describe en el ejemplo 2. Los resultados de estos experimentos se representan en las figuras 7A-7B (ratones BALB/c) y 8A-8B (ratones DBA/2). La lisis de fondo en estos experimentos fue inferior al 5%, tal como se indica por la actividad lítica observada frente a células diana irrelevantes (células L1210 no pulsadas). Las células vueltas a estimular procedentes de ratones no inmunizados (0 \mug) no mostraron actividad lítica ni frente a células diana P1 (figuras 7A, 8A), ni a células L1210 pulsadas con CKKK(P1A) (figuras 7B, 8B). Las células procedentes de ratones inmunizados con tan sólo 5 \mug de la proteína de fusión hsp71-P1A mostraron actividad lítica medible, observándose la respuesta máxima en células procedentes de ratones inmunizados con 50-500 \mug.

Ejemplo 6 Exposición tumoral de ratones inmunizados con la proteína de fusión hsp71-P1A

Los ratones se inmunizaron como en el ejemplo anterior, excepto porque se administraron tres inyecciones a intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la inyección final, los ratones se expusieron mediante inyección intraperitoneal de 1000 células de tumor P1 viables. Tras 26 días, se sacrificaron los ratones, se pesaron y se diseccionó la masa completa de contenido abdominal y se pesó. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 9. Se observó que en los ratones a los que se les administró tres inmunizaciones de 50 \mug con la proteína de fusión hsp71-P1A, la masa del contenido abdominal, expresado como porcentaje del peso corporal total, era significativamente inferior a la hallada en los ratones sin inmunizar (0 \mug, P < 0,03) y similar a la observada en los ratones a los que no se les inyectaron células tumorales (control).

Juntos, los experimentos de los ejemplos 5 y 6 demuestran que la inmunización con antígeno asociado a tumor hsp, utilizando hsp71-P1A como ejemplo, da como resultado una estimulación sustancial de la actividad de LCT dirigida contra células que muestran epítopos restringidos por CMH de clase I irrelevantes. Además, tal inmunización conduce a la expresión de una función efectora relevante, concretamente la inmunidad frente a la exposición a un tumor que expresa el antígeno contra el que se inmuniza.

Claims

1. Proteína de fusión que comprende un antígeno de un virus influenza y una proteína de estrés, o un fragmento de la misma siempre que tal fragmento incluya los epítopos conformacionales involucrados en el aumento de la respuesta inmunitaria frente a dicho antígeno de la misma, en la que la proteína de fusión induce una respuesta inmunitaria frente al antígeno en un mamífero al que se administra la proteína de fusión.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el antígeno del virus influenza es hemaglutinina, nucleoproteína, neuraminidasa, M1, M2, PB1, PB2 o PA.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión está codificada por el plásmido pET65MP/NP-B tal como se define en la figura 4A o el plásmido pET65MP/NP-D tal como se define en la figura 4B.

4. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la proteína de estrés es una Hsp100-200, una Hsp100, una Hsp90, Lon, una Hsp70, una Hsp60, TF55, una Hsp40, una FKBP, una ciclofilina, una Hsp20-30, C1pP, GrpE, Hsp10, ubiquitina, calnexina o una proteína disulfuro isomerasa.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la proteína de estrés bacteriana es una proteína de estrés micobacteriana.

6. Proteína de fusión según la reivindicación 5, en la que la proteína de estrés micobacteriana es hsp65.

7. Proteína de fusión según la reivindicación 5, en la que la proteína de estrés micobacteriana es hsp71.

8. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la proteína de estrés es una proteína de choque térmico.

9. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el antígeno comprende al menos un epítopo de células B.

10. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el antígeno comprende al menos un epítopo de células T.

11. Proteína de fusión según la reivindicación 10, en la que el antígeno comprende al menos un epítopo de células LCT.

12. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria mediada por células.

13. Proteína de fusión según la reivindicación 12, en la que la respuesta inmunitaria mediada por células es una respuesta inmunitaria citolítica mediada por células.

14. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la respuesta inmunitaria es una respuesta cooperadora de células T o inmunitaria de células B.

15. Composición que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente, soporte, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Polinucleótido que codifica para la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

17. Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero.

18. Polinucleótido según la reivindicación 16, para su uso en inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero.

19. Uso in vitro de un polinucleótido según la reivindicación 16, para producir una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.