ES2266652T3 - Respuestas inmunologicas contra los antigenos de hpv provocadas por compuestos que contienen un antigeno de hpv y una proteina de stress o un vector de expresion capaz de expresar dichas proteinas. - Google Patents

Respuestas inmunologicas contra los antigenos de hpv provocadas por compuestos que contienen un antigeno de hpv y una proteina de stress o un vector de expresion capaz de expresar dichas proteinas. Download PDF

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Abstract

Proteína de fusión que comprende el antígeno proteico HPV 16 E7 y la proteína M. Bovis BCG Hsp65, siendo codificada por un plásmido que se puede obtener por el siguiente proceso: (a) amplificar el gen de M. Bovis BCG hsp65 contenido en el plásmido RIB 1300 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5¿-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG-3¿ y un cebador inverso que tiene la secuencia 5¿-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT GCC-3¿; (b) digerir el producto amplificado con Ncol y Nhel; (c) purificar el producto amplificado; (d) ligar el producto amplificado a un plásmido digerido con Ncol y Nhel; (e) amplificar el gen E7 del ADN genómico de HPV 16 contenido en el plásmido pSK/HPV16 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5¿- CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3¿ y un cebador inverso que tiene la secuencia 5¿-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3¿; (f) digerir el producto amplificado con Ndel y EcoRI; (g) purificar el producto amplificado; y (h) ligar el producto amplificado a dicho plásmido obtenido en la etapa (d) digerido con Ndel y EcoRI.

Description

Respuestas inmunológicas contra los antígenos de HPV provocadas por compuestos que contienen un antígeno de HPV y una proteína de estrés o un vector de expresión capaz de expresar dichas proteínas.
Campo técnico
La presente invención se refiere de manera general a los métodos y composiciones que involucran proteínas de estrés ligadas y proteínas antigénicas de papilomavirus humanos para la inducción de respuesta inmune contra las proteínas antigénicas de papilomavirus humanos.
Antecedentes de la invención
La infección por papilomavirus humano (PVH) es común, y el virus puede ser transmitido sexualmente. Se estima que entre 20 y 80% de los adultos activos sexualmente se encuentran infectados. Aún cuando la mayor parte de las infecciones son asintomáticas, la infección puede llevar al desarrollo de verrugas genitales y cáncer del tracto anogenital. Las verrugas genitales tienen una frecuencia de 1-5% entre adultos. Alrededor de un uno por ciento de las mujeres en todo el mundo sufren cáncer cervical, el cual es la causa más común de muerte en mujeres de menos de 50 años. El cáncer cervical está íntimamente asociado con el PVH. Frazer, Genitourin Med 72:398-403 (1996).
En la actualidad, no se dispone de composiciones terapéuticas o profilácticas efectivas, es decir, vacunas contra el PVH, y hay, por tanto, una necesidad para el desarrollo de composiciones eficaces. Las expectativas de encontrar una vacuna muerta convencional o una vacuna viva atenuada son pocas. Según Frazer, el PVH no se ha podido propagar todavía en cultivos celulares, y los efectos de promotor de tumor de la infección por PVH así como la especificidad del PVH para especies completas representan dificultades adicionales que no son fácilmente superables (Frazer, Genitourin Med 72:398-403 (1996)). Se ha propuesto que la observación de que las proteínas de cápsida principales, al expresarse en células eucarióticas, forman partículas viroides que son inmunogénicas sin adyuvante, puede proporcionar una base para el desarrollo de una vacuna (Christensen y otros, J Gen Virol 75:2271-6 (1994); ver también PCT/EP95/03974 y PCT/US95/12914).
El PVH pertenece al género A de la familia papovaviridae, la cual también incluye al SV40 y a los poliomavirus. Se han caracterizado más de 68 tipos diferentes de PVH, los cuales están estructuralmente muy relacionados pero que comparten menos de un 50% de sus secuencias de ADN. Todos los tipos conocidos son virus epiteliotrópicos que infectan tipos específicos de epitelio y que frecuentemente producen proliferaciones epiteliales. Se identificaron varios tipos en verrugas comunes. Se conocen veintitrés tipos que infectan el tracto anogenital masculino y femenino. Las enfermedades anogenitales causadas por estos tipos de PVH van desde Condylomata acuminata a carcinoma celular escamoso invasivo. Se confirma la presencia de ADN de PVH en más de 80% de las mujeres con lesiones escamosas intraepiteliales o neoplasias intraepiteliales del cerviz confirmadas por biopsia. Algunos casos particulares, entre ellos el PVH 16, 18, y 31, están muy ligados con lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado y cáncer invasivo del cerviz, vulva, pene y ano (Lorincz y otros, Obstet Gynecol 79:328-37 (1992)). Según Frazer, el cáncer cervical está asociado en un 90-95% con PVH. Frazer, Genitourin Med 72:398-403 (1996). El PVH no está sólo asociado con cáncer del sistema anogenital, sino que también está presente en carcinomas faríngeos, laríngeos y de la vejiga (Brachman y otros, Cancer Res 52:4832-6 (1992); Rotola y otros, Int J Cancer 52:359-65 (1992)). Un estudio reciente informó que el ADN de PVH se encuentra también presente en el 30% de carcinomas de pulmón examinados. Los tipos identificados incluían PVH 6, 11, 16, 18, 31 y 33 (Soini y otros, Thorax 51:887-893 (1996)). Por tanto, los tipos de PVH que con mayor frecuencia se asocian con cáncer son el 6, 11, 16, 18, 31 y 33, de los cuales los PVH 16 y 18, detectados en más de un 90% de los carcinomas cervicales (van Driel y otros, Ann Med 28:471-477 (1996)), son los que se han investigado en mayor profundidad.
Los papilomavirus son virus ADN con un genoma de ADN circular de doble hebra de 7800 a 7900 pares de bases, un virión sin envoltura y una cápsida icosaédrica de 72 capsómeros. El genoma contiene tres regiones principales, una codifica para genes tardíos, otra codifica para genes tempranos y otra región no codifica (Park y otros, Cancer 76:1902-1913 (1995)). La región no codificante también se denomina región reguladora de la línea de entrada. Esta región tiene una longitud de unos 400 pares de bases y contiene una serie de sitios de unión para los diversos factores de transcripción que controlan la expresión de genes tempranos y tardíos. La región de genes tardíos presenta dos marcos separados de lectura abierta que codifican proteínas virales de la cápsida L1 y L2. La proteína L1 es la proteína de cápsida más importante de las que están altamente conservadas entre diferentes especies de PVH. La región de genes tempranos incluye seis marcos de lectura abierta, denominados E1, E2, E4, E5, E6 y E7. Las proteínas E6 y E7 son oncoproteínas críticas en la replicación viral, así como para la inmortalización y transformación de la célula-huésped. Las proteínas E1, E2 y E4 también desempeñan un importante papel en la replicación vírica. Además, la E4 actúa durante la maduración del virus. El papel de E5 es menos conocido.
Las células de los tumores malignos compartan dos características de crecimiento. Son inmortales, o sea, no envejecen, y son capaces de crecimiento sin dependencia de anclaje. La introducción de ADN de PVH 16 o PVH 18 en células inmortalizadas de roedor resulta en su transformación, es decir, adquieren la capacidad de crecer en ausencia de sustratos de anclaje y la capacidad para formar tumores al inyectarlas en ratones (Crook y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8820-24 (1988)). Se obtiene un resultado diferente cuando se introducen los ADNs de PVH en células jóvenes ("early pasagge") no inmortalizadas: las células se hacen inmortales pero no se transforman (Woodworth y otros, Cancer Res. 48:4620-28 (1988)). Así, un camino por el cual se desarrolla un tumor, involucra un cambio que resulta en la inmortalización de células seguida de la expresión de genes del PVH que resultan en su transformación. Los genes de PVH involucrados en la transformación de células in vitro son aquéllos que codifican para la E6 y/o E7 (Bedell y otros, J Virol 61:3635-40 (1987)). Ya se han propuesto mecanismos por los que las proteínas E6 y E7 pueden causar la transformación celular (Park y otros, Cancer 76:1902-1913 (1995) y referencias citadas en la misma publicación).
E6 es un polipéptido pequeño (aproximadamente 15.000 de PM) que contiene dominios para la unión de Zn. Una pista a su función transformadora la proporcionó la observación de que la proteína se une a p53. La proteína p53 es una proteína supresora de tumores bien conocida que regula negativamente la progresión del ciclo celular y, en consecuencia, el crecimiento y división celulares. La unión de E6 a p53 resulta en la ubiquinación y posterior degradación de la última proteína, proceso que involucra otra proteína celular denominada "proteína E6-asociada". En consecuencia, las células que expresan la E6 tendrán un nivel basal reducido de p53. Los niveles de p53 se elevan en respuesta al daño al ADN. Tales niveles elevados resultan en un aumento en la expresión de p21, el cual es un inhibidor de quinasas ciclina-dependientes, cuya proteína interviene en la detención del ciclo celular. Este mecanismo proporciona a las células una ventana de tiempo durante la cual pueden reparar ADN dañado antes de que empiece a replicarse, lo que resultaría en la producción de un daño/mutación. El incremento de producción de p53 mediado por E6 puede evitar que opere este mecanismo. Recientemente, también se ha encontrado que E6 afecta no sólo a la regulación del ciclo celular por aceleración de la degradación de la p53, sino también, más directamente, por bloqueo de la interacción de la p53 con el ADN (Thomas y otros, Oncogene 10:261-8 (1995)).
La proteína E7 es una fosfoproteína pequeña (aproximadamente 10.000 de PM) que se une a Zn, y es capaz de unirse al producto Rb del gen del retinoblastoma. El Rb es un supresor de tumor que se une al factor de transcripción E2F e inactiva al mismo. El último factor controla la transcripción de un número de genes relacionados con el crecimiento celular, entre ellos los que codifican la timidina quinasa, c-myc, dihidrofolato reductasa y ADN polimerasa alfa. La formación del complejo Rb-E2F previene la expresión de los genes mencionados en las fases G0 y G1, restringiendo su expresión a la fase S, en la que los complejos Rb-E2F están programados para disociarse, liberando el factor de transcripción E2F activo. La formación de complejos Rb-E7 previene la formación de complejos Rb-E2F con el resultado de un acortamiento de las fases pre-S, es decir, se acelera la progresión a través del ciclo celular. Son evidencia correlativa de la importancia de estos mecanismos, las observaciones de que las proteínas E6 de tipos PVH altamente oncogénicos (por ejemplo, los PVHs 16 y 18) tienen afinidades más elevadas con p53 que las proteínas correspondientes de tipos no oncogénicos, y que las proteínas E7 de tipos altamente oncogénicos tienen afinidades más elevadas con el Rb que las proteínas correspondientes de tipos no oncogénicos.
En la mayoría de los cánceres cervicales y lesiones precursoras, el ADN del PVH está integrado en el genoma de la célula-huésped (Cullen y otros, J Virol. 65:606-12 (1991)). Parece que en muchos casos, la integración involucra la rotura del ADN genómico del PVH en la región E1/E2, dejando a la región E6/E7 intacta. Una consecuencia de la rotura en la región E1/E2 es una interrupción del marco de lectura abierta que codifica para dos proteínas E2 diferentes, la más pequeña de las cuales funciona como represor transcripcional de expresión génica temprana. Esto conduce a una regulación positiva de la expresión de E6 y E7.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para la inducción de una respuesta inmunológica contra un antígeno proteico del PVH en un sujeto al que se le administran. La respuesta inmunológica puede ser una respuesta humoral o celular, en particular, una respuesta citolítica mediada por células a un antígeno proteico del PVH. Las composiciones pueden utilizarse profiláctica o terapéuticamente. En una aplicación profiláctica, la inducción de una respuesta inmunológica se refiere a la producción de respuestas inmunes sobre un fondo muy reducido de inmunidad inherente. En una aplicación terapéutica, la inducción de una respuesta inmunológica en un sujeto se refiere a la generación de respuestas que exceden, o en magnitud o en calidad, a las respuestas previamente provocadas por el contacto con antígenos proteicos del PVH mostrados o por el virus o por células infectadas o transformadas del sujeto. En realizaciones particulares, las composiciones se utilizan para generar respuestas inmunológicas a células tumorales que expresan y muestran antígenos proteicos del PVH. En estas realizaciones, los antígenos proteicos del PVH preferentes que son dianas de las composiciones, son las proteínas virales tempranas E6 y E7, las cuales se sabe que son consistentemente expresadas en tumores asociados al PVH. En una realización, las composiciones comprenden un antígeno proteico del PVH unido a una proteína de shock (o proteína de shock térmico (Hsp)). El antígeno proteico del PVH puede unirse a la proteína de estrés por conjugación química, o pueden unirse el antígeno y proteína de estrés a nivel de nucleótido, permitiendo la expresión y aislamiento de una proteína de fusión que contenga tanto las secuencias del antígeno como de la proteína de estrés. Las composiciones pueden administrarse a un sujeto o utilizarse ex vivo para estimular y/o causar la expansión del número de células inmunitarias de un sujeto que atacan o intermedian en el ataque contra el PVH o contra células, incluyendo células tumorales, que muestran un antígeno proteico del PVH. Las composiciones son eficaces en la estimulación de una respuesta inmunológica cuando se administran como soluciones proteicas no particuladas (por ejemplo, no como parte de un virus o partícula viroide) en ausencia de adyuvante.
En otra realización, las composiciones comprenden un vector de expresión que incluye secuencias nucleotídicas que codifican para un antígeno proteico de PVH y una proteína de estrés. El vector de expresión comprende además elementos de secuencia que dirigen la transcripción y traducción de las secuencias codificantes y puede también incluir elementos que facilitan la entrega y persistencia o amplificación de ácidos nucleicos en células de un sujeto. El vector de expresión puede introducirse en células de un sujeto, o puede utilizarse para transducir células de un sujeto ex vivo, resultando en la expresión de una proteína de fusión antígeno proteico del PVH-proteína de estrés, que inducirá una respuesta inmunológica contra los antígenos proteicos del PVH.
La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un antígeno proteico del PVH unido a una proteína de estrés en combinación con otro componente farmacológicamente aceptable. En otra realización, la composición comprende un conjugado que comprende una proteína de estrés unida a un antígeno proteico del PVH. En otra realización, la composición comprende una proteína de fusión (por ejemplo, proteínas expresadas desde pET65HE6 Y pET65HE7) en la que la proteína de estrés está fusionada a un antígeno proteico del PVH. Los conjugados y proteínas de fusión de estas composiciones también se reivindican como vectores de expresión que codifican para, y son capaces de dirigir la expresión de una proteína de fusión que comprende una proteína de estrés y una secuencia de antígeno proteico del PVH en las células de un sujeto.
La presente invención se refiere también a los usos de las composiciones para potenciar las respuestas inmunológicas contra los antígenos proteicos del PVH y, en realizaciones particulares, contra los tumores que muestran antígenos proteicos del PVH. Los artículos de la literatura científica y solicitudes de patente citados en este documento, especialmente aquéllos que se refieren a la preparación y uso de composiciones de la invención, se incorporan por referencia en su totalidad.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es una representación esquemática del constructo pET65H.
La figura 2 es una representación esquemática del constructo pET65HE6.
La figura 3 es una representación esquemática del constructo pET65HE7.
La figura 4 es un gráfico del porcentaje de incidencia de tumores frente a tiempo tras la acción tumoral de TC-1, que demuestra la inmunización exitosa de ratones con Hsp65-E6 y proteínas de fusión -E7 contra el tumor.
La figura 5 es un gráfico del porcentaje de lisis celular específica de células tumorales TC-1, frente a la proporción de células efectoras con respecto a células diana, que demuestra la respuesta citolítica mediada por células contra células tumorales diana que expresan antígeno (E7) del PVH en ratones inmunizados.
La figura 6 es un gráfico del porcentaje de lisis de diferentes células diana frente a la proporción de células efectoras con respecto a células diana, que demuestra la especificidad de la respuesta inmunológica citolítica mediada por células frente a células tumorales diana que expresan E7 del PVH en ratones inmunizados.
La figura 7 es un gráfico del porcentaje de incidencia de tumores en ratones en los que se ha administrado 1,3x10^{5} células tumorales TC-1 y se les ha inyectado posteriormente solución salina de proteína de fusión Hsp65-E7 o péptido E7 en IFA/solución salina frente a días tras la administración de células tumorales.
La figura 8 es un gráfico de porcentaje de incidencia de tumores en ratones a los que se les ha administrado 2x10^{5} células tumorales TC-1 y posteriormente se les ha inyectado solución salina de proteína de fusión Hsp65-E7 o péptido E7 en IFA/solución salina frente a días tras la administración de células tumorales.
La figura 9 es una representación esquemática del constructo pET/E7(H).
La figura 10 es un conjunto de gráficos que muestra la incorporación de timidina de un cultivo de células de nódulo linfático obtenido de ratones inmunizados con proteína de fusión Hsp65-E7 o proteína E7.
La figura 11 es una gráfico que muestra el efecto del tratamiento con proteína de fusión Hsp-E7 o con E7 sobre el tamaño de tumor en ratones con células tumorales TC-1.
La figura 12 es una representación esquemática del constructo pET65C.
La figura 13 es una representación esquemática del constructo pET65C/E7-1N.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que inducen una respuesta inmunológica en el sujeto frente a papilomavirus humano de células del sujeto que muestran un antígeno proteico de un PVH. En una realización, las composiciones comprenden un antígeno proteico del PVH y una proteína de estrés. En otra realización, las composiciones comprenden un vector de expresión capaz de dirigir la expresión de una proteína de fusión antígeno proteico de PVH-proteína de estrés.
Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse de manera profiláctica para elevar la inmunidad frente a un antígeno proteico de PVH, previniendo el establecimiento y proliferación del PVH o de células de un sujeto que expresan y muestran el antígeno proteico del PVH o presenta partes del mismo. Las composiciones también pueden utilizarse terapéuticamente en un sujeto previamente infectado con un PVH para prevenir la proliferación viral posterior o para eliminar células del sujeto que proliferan como consecuencia de una infección por PVH, incluyendo tumores que expresan y muestran un antígeno del PVH o presentan una parte del antígeno. Cuando se hace referencia en este documento a un antígeno proteico del PVH como diana de la respuesta inmunológica inducida por una composición de la presente invención, el antígeno proteico del PVH se entiende que incluye una proteína del PVH completa o una parte polipeptídica (peso molecular mayor que 10 kDa) de la proteína del PVH que es mostrada sobre la superficie del PVH o una célula infectada de un sujeto así como péptido mostrado por una célula infectada como resultado del procesado y presentación de una proteína del PVH, por ejemplo, a través de las trayectorias típicas MCH clase I ó II.
Se clonaron y caracterizaron por análisis de secuencias de ADN las secuencias genómicas de muchos tipos diferentes de PVH. Se dispone de vectores bacterianos que contienen genomas completos o partes de genoma de PVH, procedentes de diversas fuentes, entre ellas, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC, ["Colección Americana de Cultivos Tipo"]). Pueden aislarse y tipificarse otros tipos de PVH que resultan útiles para la puesta en práctica de la presente invención, por métodos que son bien conocidos en la técnica.
El PVH expresa seis o siete proteínas no estructurales y dos estructurales, y cada una de estas proteínas podría, en principio, servir como diana para las aproximaciones inmunoprofilácticas o inmunoterapéuticas destinadas a la eliminación de PVH y/o células infectadas. Las proteínas virales de cápsida L1 y L2 son las proteínas estructurales de PVH codificadas por genes tardíos. L1 es la principal proteína de cápsida que se halla altamente conservada entre diferentes especies de PVH. Las siete proteínas no estructurales son productos de los genes virales tempranos. Las proteínas E1, E2 y E4 desempeñan un importante papel en la replicación vírica. La proteína E4 actúa además durante la maduración de los virus. El papel de E5 es menos conocido. Las proteínas E6 y E7 son oncoproteínas críticas para la replicación vírica así como para la inmortalización y transformación de la célula-huésped. Estas proteínas, las cuales pueden ser incorporadas en las composiciones de la presente invención, se denominan antígenos proteicos de PVH.
Es de particular importancia en la aplicación de la presente invención al tratamiento profiláctico y terapéutico de cánceres asociados a PVH, la observación de que las proteínas de PVH, E6 y E7 son consistentemente expresadas en cánceres cervicales (Zur Hausen, Appl. Pathol. 5:19-24 (1987); Pater and Pater, Virology 145:313-8 (1985)). Kinoshita y otros, Br. J. Cancer 71:344-9 (1995)) han demostrado que los genes de E6 y E7 también son expresados en el carcinoma pulmonar. Además, se advirtieron algunas respuestas inmunológicas (humorales) naturales a la E7 en pacientes con cáncer cervical (Jochmus-Kudielka y otros, J. Nat'l Cancer Inst. 81:1698-704 (1989)). Finalmente, estudios de modelización han demostrado que la inmunización con una proteína modificada E7 protege a ratones contra agresiones con células pulmonares transformadas con un gen c-Ha-ras activado y genes E6/E7 de PVH (Lin y otros, Cancer Res. 56:21-26 (1996)). Desde los puntos de vista de que estas proteínas son típicamente expresadas en cánceres que son consecuencia de infección por PVH, de que las mismas proteínas son también los oncogenes que con mayor probabilidad desempeñaron un papel principal en el desarrollo y mantenimiento de los cánceres, y de que una respuesta inmunológica puede dirigirse contra estas proteínas, E6 y E7 son dianas preferentes en la inmunointervención o profilaxis, y, por tanto, son los antígenos proteicos de PVH preferentes de las composiciones de la presente invención para la prevención o tratamiento de cáncer asociado a PVH.
Se ha demostrado en varios modelos animales que péptidos de célula T citotóxica (CTL) pueden inducir inmunidad protectora contra ciertos virus (Kast y Melief, Immunol. Lett. 30:229 (1991)). Se ha observado que los individuos inmunosuprimidos desarrollan más a menudo carcinoma cervical que individuos inmunocompetentes (Schneider y otros, Acta Cytologica 27:220-4 (1983)). Esto sugiere poderosamente que el brazo celular del sistema inmunitario, en particular el sistema de células T, es de importancia fundamental en la defensa inmunológica contra malignidad asociada a PVH. La evidencia de soporte de la importancia de una respuesta CTL en la producción de inmunidad protectora contra células E6- y E7 transformadas, procede de un experimento en el que ratones vacunados con un epítopo CTL relevante de la E7 del PVH 16 estaban protegidos contra tumores transplantables inducidos por el PVH 16 (Feltkamp y otros, Eur. J. Immunol. 23:2242 (1993)). La presente invención se basa en nuestra observación de que la unión de una proteína de estrés a un antígeno proteico de PVH resulta en una composición que estimula fuertemente respuestas celulares, en particular respuestas citolíticas mediadas por células, contra el antígeno proteico de PVH ligado, respuestas que pueden matar las células que muestran el antígeno de PVH.
Un antígeno proteico de PVH de la presente invención puede ser cualquier polipéptico codificado por PVH. Además, puede ser una parte de una proteína de PVH, siempre y cuando la parte, cuando se encuentre unida a una proteína de estrés, retenga la capacidad de inducir una respuesta inmunológica contra el antígeno proteico de PVH mostrado por células infectadas o mostrado por el PVH. Se pueden producir composiciones de la invención que comprenden diversas partes de un antígeno del PVH, antes bien que un antígeno proteico completo de PVH, por métodos rutinarios tales como aquellos descritos a continuación en este documento o en libros de texto de biología molecular y bioquímica. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado molecular: un manual de laboratorio"], 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology ["Guía de enzimología de métodos de purificación de proteínas"], vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990). Cada composición con una parte particular de un antígeno proteico de PVH puede examinarse para el grado y calidad de la respuesta inmunológica contra el antígeno proteico de PVH en experimentos tales como aquellos descritos en los ejemplos descritos a continuación en este documento. Como mínimo, un antígeno proteico de PVH en una composición de la presente invención contendrá al menos un epítopo de célula B ó T (por ejemplo, un epítopo de CTL o de célula T ayudante) de una proteína de PVH. Cuando se hace referencia a composiciones de la presente invención, el término "antígeno proteico de PVH" incluye partes de un antígeno proteico de PVH, siempre y cuando tales partes retengan la capacidad de inducir una respuesta inmunológica contra el antígeno proteico de PVH mostrado por células infectadas o mostrado por PVH.
La E6 y particularmente la E7 son proteínas transformantes. En composiciones que incluyan como antígeno proteico de PVH una secuencia proteica completa de proteína E6 ó E7 de PVH, o una parte suficientemente completa para retener la capacidad transformante, la naturaleza transformante del antígeno puede o no representar un riesgo sustancial, dependiendo del método por el que se fabrique el antígeno de PVH. Por ejemplo, en casos en los que un antígeno proteico de PVH o una composición que incluya dicho antígeno se prepare por técnicas recombinantes que lleven asociadas un cierto riesgo de contaminación del ADN, puede ser prudente el realizar los pasos necesarios para eliminar la capacidad transformante del antígeno. Cuando se utilicen composiciones que incluyan un vector de expresión que dirija la expresión en un sujeto de proteína de fusión que incluya una secuencia proteica completa de E6 ó E7 de PVH o una parte suficientemente completa para retener capacidad transformante, puede ser necesario eliminar las secuencias que confieren poder transformante al producto proteico. Se obtuvieron variantes no transformantes de E6 y E7 por fusión de secuencias de E6 o E7 (PCT/AU95/00868). Por tanto, es posible que ciertas proteínas de fusión que incluyan secuencias de E6 ó E7 y secuencias de proteínas de estrés sean ya no transformantes. Alternativamente, pueden delecionarse selectivamente secuencias de E6 ó E7 utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, y que también han sido descritas en PCT/AU95/00868. Las deleciones pueden hacerse en vectores de expresión de secuencias de E6 ó E7 solamente o en vectores que expresan proteínas de fusión proteína de estrés E6 ó E7. Los resultados de dichas manipulaciones pueden evaluarse mediante la comprobación de la capacidad transformante de proteínas de deleción en un experimento de transfección. Por ejemplo, las células NIH3T3 puede ser transfectadas con un vector de expresión que incluya un gen para una proteína de deleción, y la capacidad transformante puede estimarse por un ensayo de formación de colonias en ágar blando. Este test o prueba particular también se describe en PCT/AU95/00868.
En una realización de la presente invención, las composiciones comprenden dos grupos: una proteína de estrés y un antígeno proteico de PVH contra el cual se desea una respuesta inmunológica celular. Los dos grupos se unen para formar una sola unidad. Los dos grupos pueden estar conectados por conjugación, es decir, a través de un enlace covalente entre la proteína de estrés y el antígeno proteico de PVH. Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1996); Lussow, A.R. y otros, Eur. J. Immun. 21:2297-2302 (1991); Barrios, C. y otros, Eur. J. Immun. 22:1365-1372 (1992). Alternativamente, pueden utilizarse técnicas recombinantes para conectar y expresar los dos grupos, técnicas que resultan en una proteína recombinante de fusión que incluye la proteína de estrés y el antígeno proteico de PVH en una sola molécula. Esto hace posible el producir y purificar una sola molécula recombinante en el proceso de producción. Los dos grupos pueden unirse también no covalentemente. Cualquiera de varias interacciones conocidas de elevada afinidad pueden adaptarse para unir no covalentemente los dos grupos. Por ejemplo, un grupo biotina puede añadirse a un antígeno proteico de PVH, y la proteína de estrés a ser unida puede expresarse como una proteína de fusión avidina-proteína de estrés. La proteína de fusión avidina-proteína de estrés se enlazará fuertemente al antígeno proteico biotinilado del PVH. Análogamente, pueden unirse partes de los antígenos proteicos de PVH a una proteína de estrés completa o a partes de una proteína de estrés, y partes de una proteína de estrés pueden unirse a un antígeno proteico de PVH completo o a partes de un antígeno proteico de PVH, siempre y cuando las partes respectivas sean suficientes para inducir una respuesta inmunológica contra el antígeno proteico de PVH en un sujeto al que se le administre. En otra realización, las composiciones comprenden un vector de expresión capaz de dirigir la expresión de una proteína de fusión antígeno proteico de PVH-proteína de estrés.
Pueden utilizarse en las composiciones de la presente invención cualquier proteína de estrés adecuada (proteína de estrés térmico (hsp)). Por ejemplo, como se describe en los ejemplos, pueden utilizarse Hsp60 y/o Hsp70. En cuanto a las proteínas de estrés en general, las células responden a un estresor (típicamente el tratamiento de shock térmico) mediante el incremento de la expresión de un grupo de genes comúnmente denominados genes de estrés, o genes de estrés térmico. El tratamiento de shock térmico involucra la exposición de células u organismos a temperaturas que son de uno a varios grados centígrados por encima de la temperatura a la cual están adaptadas las células. Coordinadamente con la inducción de tales genes, se incrementan los niveles de las proteínas de estrés correspondientes en células estresadas. Como se utiliza en este documento, una "proteína de estrés", también conocida como "proteína de shock térmico" o "Hsp", es una proteína codificada por un gen de estrés, y es por tanto producida típicamente en cantidades significativamente mayores tras el contacto o exposición del estresor al organismo. Un "gen de estrés", también conocido como "gen de shock térmico", se utiliza en este documento como un gen que se activa o, de otro modo, que se regula positivamente en forma detectable debido al contacto o exposición de un organismo (que contiene el gen) a un estresor, tal como el shock térmico, hipoxia, privación de glucosa, sales de metales pesados, inhibidores del metabolismo energético y de la cadena electrónica, y desnaturalizadores de proteína, o a ciertas ansamicinas benzoquinonas. Nover, L., Heat Shock Response ["Respuestas de shock térmico"], CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991). "Gen de estrés" también se refiere a genes homólogos en familias conocidas de genes de estrés, tal como ciertos genes de estrés dentro de las familias de genes de estrés Hsp70 y Hsp90, aún cuando tales genes homólogos no son inducidos ellos mismos por un estresor. Cada uno de los términos gen de estrés y proteínas de estrés, tal y como se utilizan en la presente especificación, puede incluir el otro, a menos que el contexto indique lo contrario.
En realizaciones particulares, por ejemplo, en casos que involucren conjugados químicos entre una proteína de estrés y un antígeno proteico de PVH, las proteínas de estrés utilizadas en la presente invención son proteínas de estrés aisladas, lo que significa que las proteínas de estrés han sido seleccionadas y separadas de la célula-huésped en la que son producidas. Tal aislamiento puede ser llevado a cabo tal y como se describe en este documento utilizando métodos rutinarios de aislamiento de proteínas conocidos en la técnica. Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de laboratorio"], 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology ["Guía de enzimología de métodos de purificación proteínas"], vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990).
En las bacterias, las proteínas de estrés predominantes son proteínas con tamaños moleculares de unos 70 y 60 kDa, comúnmente denominadas Hsp70 y Hsp60, respectivamente. Éstas y otras proteínas de estrés específicas y los genes que las codifican se comentan después. En las bacterias, la Hsp70 y Hsp60 representan típicamente aprox. 1-3% de la proteína celular, basado en el patrón de tinción utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico y la tinción azul de Coomassie, pero se acumulan hasta niveles de hasta 25% en condiciones de estrés. Las proteínas de estrés aparentemente participan en importantes procesos celulares, como la síntesis proteica, tráfico intracelular, y el ensamblaje y desensamblaje de complejos proteicos. Aparentemente, los niveles elevados de proteínas de estrés sintetizadas durante los episodios de estrés sirven principalmente para minimizar las consecuencias del despliegue inducido de las proteínas. En efecto, la preexposición de las células a condiciones moderadamente estresantes que inducen la síntesis de proteínas de estrés, confiere protección a las células de los efectos deletéreos de estrés extremo subsiguiente.
Las proteínas de estrés principales aparentemente se expresan en todos los organismos y tipos de tejidos examinados hasta hoy. También parece que las proteínas de estrés representan el grupo más conservado de proteínas identificado hasta la fecha. Por ejemplo, cuando se comparan proteínas de estrés en organismos muy diversos, la Hsp90 y la Hsp70 exhiben una identidad de un 50% ó más a nivel de aminoácidos y comparten muchas similitudes en posiciones no idénticas. Se hace mención de que se dan niveles de homología similares o más elevados entre diferentes miembros de familias particulares de proteínas de estrés dentro de las especies.
Los genes que codifican para proteínas de estrés pueden estar presentes en una sola copia o en copias múltiples no idénticas en el genoma de una célula u organismo. Por ejemplo, se ha demostrado que el genoma humano contiene al menos una copia de un gen hsp100, al menos dos genes hsp90 diferentes, hasta diez genes hsp70 de los que al menos varios son copias no idénticas, varios genes de complejos T (genes Tcp) y al menos un gen que codifica para la proteína mitocondrial relacionada Hsp60, así como al menos tres copias de genes hsp pequeños que codifican para Hsps en el rango de dimensiones moleculares de 20-30 kDa. En la mayor parte de familias de genes de estrés existe al menos un gen cuyo nivel de expresión es relativamente alto y es completa y constitutivamente inducible su shock térmico, o sólo moderadamente inducible. Además, varias familias de genes de estrés incluyen miembros que no son regulados positivamente por el calor, sino por otros factores como niveles elevados de calcio, etc.
Las proteínas de estrés, en particular Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 y Hsp10, están entre los determinantes principales reconocidos por el sistema inmunitario huésped en la respuesta inmunológica a la infección por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. Young, R.A. y Elliott, T.J., Stress Proteins, Infection, And Immune Surveillance ["Proteínas de estrés, infección y vigilancia inmunitaria"], Cell 50:5-8 (1989). Además, algunas células T artritogénicas de rata reconocen epítopos de Hsp60. Van Eden, W. Y otros, Nature 331:171-173 (1988). Sin embargo, los individuos, incluyendo individuos sanos, sin historia de infección micobacteriana o enfermedad autoinmune también portan células T que reconocen epítopos de Hsp60 tanto bacterianos como humanos; una fracción considerable de células T en individuos sanos que se caracterizan por expresión del receptor gamma-delta de célula T reconocen proteínas de estrés tanto propias como extrañas. O'Brien, R. y otros, Cell 57:664-674 (1989). Así, los individuos, incluso individuos
sanos, poseen poblaciones de células T que reconocen epítopos de proteínas de estrés tanto extrañas como propias.
Este sistema que reconoce epítopos de proteínas de estrés presumiblemente constituye un "sistema de defensa temprana" contra organismos invasores. Murray, P.J. y Young, R.A., J. Bacteriol 174:4193-6(1992). El sistema podría mantenerse por estimulación frecuente por bacterias y virus. Como se ha comentado anteriormente, los individuos sanos tienen poblaciones de células T que reconocen proteínas de estrés propias. Así, la presencia de células T autorreactivas es compatible con el estado saludable y no causa enfermedad autoinmune; esto demuestra la seguridad de las proteínas de estrés dentro de un individuo. La seguridad de las proteínas de estrés se demuestra adicionalmente por el éxito y relativa seguridad de las vacunas BCG (Bacille Calmette Guerin, una cepa de Mycobacterium bovis), las cuales inducen respuestas inmunológicas contra las proteínas de estrés que son protectoras también contra Mycobacterium tuberculosis.
Son familias de genes y proteínas de estrés para uso en la presente invención aquéllas bien conocidas e incluyen, por ejemplo, la Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBPs, ciclofilinas, Hsp20-30, ClpP, GrpE, Hsp10, ubiquitina, calnexina, y proteínas isomerasas disulfuro. Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70, 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); Patente U.S. Nº 5.232.833 (Sanders y otros). Un grupo particular de proteínas de estrés incluye la Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30, más aún, preferentemente la Hsp70 y Hsp60.
Los ejemplos de Hsp100-200 incluyen la Grp170 (una proteína regulada por glucosa). La Grp170 reside en el lumen del RE, en el compartimiento pre-Golgi, y podría desempeñar un papel en el pliegue y ensamblaje de inmunoglobulinas.
Los ejemplos de Hsp100 incluyen la Hsp110 de mamíferos, la Hsp104 de levaduras, la ClpA, ClpB, ClpC, ClpX y ClpY. La Hsp104 de levadura y la ClpA de E. coli forman partículas hexaméricas, y la ClpB de E. coli, partículas tetraméricas cuyo ensamblaje aparentemente necesita de la unión del nucleótido adenina. La proteasa Clp proporciona un heterooligómero de 750 kDa compuesto de ClpP (una subunidad proteolítica) y de ClpA. Las ClpB-Y están es-
tructuralmente relacionadas con la ClpA, aunque, al contrario que la ClpA, no parece que formen complejos con ClpP.
Entre los ejemplos de Hsp90 se citan la HtpG de E. coli, la Hsp83 y Hsc83 de levaduras, y las Hsp90alfa, Hsp90beta y Grp94 en humanos. La Hsp90 enlaza grupos de proteínas, las cuales son típicamente moléculas de regulación celular como son receptores de hormonas esteroides (por ejemplo, receptores de glucocorticoides, estrógenos, progesterona, y testosterona), factores de transcripción y proteína quinasas que desempeñan un papel en mecanismos de transducción de señales. Las proteínas Hsp90 también participan en la formación de complejos grandes y abundantes de proteínas que incluyen otras proteínas de estrés.
Lon es una proteína tetramérica que funciona como proteasa ATP-dependiente en la degradación de proteínas no nativas de E. coli.
Entre los ejemplos de Hsp70 se citan las Hsp72 y Hsc73 de células de mamífero, la DnaK de bacterias, en particular micobacterias como la Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, y Mycobacterium bovis (tal como Bacille-Calmette Guerin, denominada en este documento Hsp71), DnaK de Escherichia coli, de levaduras, y de otros procariotas, y las BiP y Grp78. La Hsp70 es capaz de unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos y péptidos no plegados, participando así en el pliegue y despliegue de proteínas así como en el ensamblaje y desensamblaje de complejos proteicos.
Entre los ejemplos de Hsp60 se citan la Hsp65 de micobacteria. La Hsp60 bacteriana también se conoce comúnmente como GroEL, como por ejemplo la GroEL de E. coli. La Hsp60 forma grandes complejos homooligoméricos, y parece que desempeña un papel en el pliegue de proteínas. Los hómologos de Hsp60 están presentes en mitocondrias eucarióticas y en cloroplastos.
Entre los ejemplos de TF55 se citan la Tcpl, TRiC y termosoma. Las proteínas típicamente se encuentran en el citoplasma de eucariotas y en algunas arqueobacterias, y forman anillos multi-miembro, promocionando el pliegue de proteínas.También son homólogos débiles de Hsp60.
Entre los ejemplos de Hsp40 se citan la DnaJ de procariotas como E. coli y micobacteria y la HSJ1, HDJ1 y Hsp40. La Hsp40 desempeña un papel de protector ("chaperone") molecular en el pliegue de proteínas, termotolerancia y replicación de ADN, entre otras actividades celulares.
Entre los ejemplos de FKBPs se citan la FKBP12, FKBP13, FKBP25, y la FKBP59, Fprl y Nepl. Las proteínas tienen típicamente actividad peptidil-prolil isomerasa e interaccionan con inmunosupresores como la FK506 y rapamicina. Las proteínas se encuentran típicamente en el citoplasma y retículo endoplasmático.
Entre los ejemplos de ciclofilina se citan las ciclofilinas A, B y C. Las proteínas tienen actividad peptidil-prolil isomerasa e interactúan con el inmunosupresor ciclosporina A. La proteína ciclosporina A se une a calcineurina (una proteína fosfatasa).
La Hsp20-30 también se denomina Hsp pequeña. La Hsp20-30 se encuentra típicamente en grandes complejos homooligoméricos o, posiblemente, también en complejos heterooligoméricos cuando un organismo o tipo celular expresa varios tipos diferentes de Hsps pequeñas. La Hsp20-30 interacciona con estructuras citoesqueléticas, y podría desempeñar un papel regulador en la polimerización/despolimerización de la actina. La Hsp20-30 se fosforila rápidamente bajo estrés o exposición de células inactivas a factores de crecimiento. Entre los homólogos de Hsp20-30 se incluye la alfa-cristalina.
La ClpP es una proteasa de E. coli involucrada en la degradación de proteínas anormales. Se encuentran homólogos de ClpP en cloroplastos. La ClpP forma un complejo heterooligomérico con ClpA.
La GrpE es una proteína de E. coli de unos 20 kDa involucrada tanto en el rescate de proteínas dañadas por estrés como en la degradación de proteínas dañadas. La GrpE desempeña un papel en la regulación de la expresión de genes de estrés en E. coli.
Entre los ejemplos de Hsp10 se citan la GroES y Cpn10. La Hsp10 se encuentra típicamente en E. coli y en mitocondrias y cloroplastos de células eucariotas. La Hsp10 forma un anillo de siete miembros que se asocia con oligómeros de Hsp60. La Hsp10 también está involucrada en el pliegue de proteínas.
Se ha descubierto que la ubiquitina se une a proteínas en coordinación con la eliminación proteolítica de proteínas por proteasas citosólicas ATP-dependientes.
En realizaciones particulares, las proteínas de estrés de la presente invención se obtienen de enterobacterias, micobacterias (en particular, M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis y M. bovis),E. coli, levaduras, Drosophila, vertebrados, aves, pollos, mamíferos, ratas, ratones, primates, o humanos.
Las proteínas de estrés pueden encontrarse en la forma de sales ácidas o básicas, o en forma neutra. Además, los residuos aminoácidos individuales pueden modificarse por oxidación o reducción. Además, pueden efectuarse varias sustituciones, deleciones, o adiciones a la secuencias aminoacídicas o nucleotídicas, el efecto neto de las cuales es la retención o incremento adicional de la actividad biológica elevada de la proteína de estrés. Debido a la degeneración del código, por ejemplo, puede darse considerable variación en las secuencias nucleotídicas que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. La presente invención también es adecuada para su uso con partes de proteínas de estrés o péptidos obtenidos de proteínas de estrés, siempre y cuando tales partes o péptidos incluyan los epítopos involucrados en la potenciación de la respuesta inmunológica frente al antígeno proteico de PVH seleccionado. Pueden obtenerse partes de proteínas de estrés por fragmentación utilizando proteinasas, o por métodos recombinantes, tal como la expresión de sólo una parte de una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de estrés (sea sola o fusionada con otra secuencia nucleotídica que codifica para una proteína). Pueden producirse también péptidos por tales métodos, o por síntesis química. Las proteínas de estrés pueden incluir mutaciones introducidas en lugares particulares por una variedad de técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado molecular: un manual de laboratorio"], 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Drinkwater y Klinedinst, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3402-3406 (1986); Liao y Wise, Gene 88:107-111 (1990); Horwitz y otros, Genome 3:112-117 (1989). El término proteína de estrés tal y como se utiliza en este documento se pretende que incluya tales partes y péptidos de una proteína de estrés.
Los métodos de identificación de un gen o de una proteína bajo consideración como un gen o proteína de estrés son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la conservación de los genes y proteínas de una familia particular de proteínas de estrés permite la comparación de la secuencia nucleotídica o de aminoácidos del gen/proteína bajo consideración con genes de estrés bien conocidos como el DnaK, GroEL o DnaJ, por ejemplo, por hibridación de ácidos nucleicos o secuenciado de ácidos nucleicos o aminoácidos seguido de análisis comparativo computerizado. Voellmy, R., y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:4949-4953 (1985). Alternativamente, puede utilizarse un ensayo para identificar y/o discriminar entre rasgos estructurales esenciales y/o propiedades funcionales de una proteína de estrés seleccionada. Por ejemplo, puede rastrearse una biblioteca de expresiones utilizando anticuerpos anti-Hsp. Es bien sabido que la Hsp90 se une a la geldanamicina ansamicina benzoquinona con elevada afinidad. Podría por tanto rastrearse una biblioteca de expresión con geldanamicina para descubrir homólogos putativos de Hsp90 como proteínas que se unen a la ansamicina benzoquinona. Podría confirmarse la naturaleza de la proteína codificada por el ácido nucleico aislado por otros ensayos, incluyendo ensayos basados en anticuerpos. Antibodies: A Laboratory Manual ["Anticuerpos: un manual de laboratorio"], Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988). Además, podría explotarse la actividad biológica de un grupo dado de proteínas de estrés. Guidon, P.T., y Hightower, L.E., Biochem. 25:3231-3239 (1986). Por ejemplo, la Hsp70 es capaz de unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos no plegados y péptidos en el ensamblaje de complejos de proteínas. Así, la mezcla de una proteína bajo consideración con una muestra que comprenda polipéptidos y péptidos apropiados, o ATP, seguida de la determinación de la presencia o ausencia de producción de complejos proteína-proteína o proteína-nucleótido indica la presencia o ausencia aparente de una proteína o gen Hsp70, cuya presencia o ausencia puede confirmarse utilizando otros ensayos como son los ensayos basados en anticuerpos.
La proteína de estrés, parte de proteína de estrés, homólogo de proteína de estrés y antígeno proteico de PVH a los cuales la proteína de estrés se encuentra conjugada o unida no covalentemente, presentes en la composición, pueden producirse u obtenerse utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, la proteína de estrés y/o el antígeno pueden obtenerse (aislarse) de una fuente en la que se sabe que existen, pueden producirse y recogerse de cultivos celulares o, en el caso de los antígenos, pueden obtenerse de células infectadas, pueden producirse por clonado, si es necesario, y mediante la expresión de un gen que codifique para la proteína de estrés o antígeno que se desee, o sintetizarse químicamente. Además, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de estrés deseada o el antígeno puede ser sintetizada químicamente. Una proteína de fusión que incluya una proteína de estrés y un antígeno proteico de PVH pueden ser producidos por métodos recombinantes. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de estrés puede unirse a cualquiera de los extremos de una secuencia nucleotídica que codifica el antígeno proteico de PVH de tal manera que las dos secuencias codificantes de proteína compartan un marco común de lectura de traducción y pueden expresarse como una proteína de fusión que incluya un antígeno proteico de PVH y una proteína de estrés. La secuencia combinada se inserta en un vector adecuado seleccionado según los rasgos de expresión que se desean y la naturaleza de la célula huésped. En los ejemplos que se proporcionan después en este documento, las secuencias nucleotídicas se ensamblan en un vector adecuado para la expresión de proteínas en la bacteria E. coli. Después de la expresión en la célula-huésped seleccionada, puede purificarse la proteína de fusión por técnicas separativas bioquímicas rutinarias o por métodos de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo de una u otra parte de la proteína de fusión. Alternativamente, el vector seleccionado puede añadir una marca a la secuencia de la proteína de fusión, por ejemplo, una marca de oligohistidina como se describe en los ejemplos presentados después en este documento, permitiendo la expresión de la proteína de fusión marcada que puede ser purificada por métodos de afinidad utilizando un anticuerpo u otro material con afinidad adecuadamente elevada para la marca. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado molecular: un manual de laboratorio"], 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M, Guide to Protein Purification Methods Enzymology ["Guía de enzimologia de métodos de purificación de proteínas"], vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990). Si se utiliza un vector adecuado para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, uno de los vectores comentados después, la proteína de fusión puede expresarse y purificarse desde células de mamífero. Alternativamente, el vector de expresión de mamífero (que incluye las secuencias codificantes de la proteína de fusión) puede administrarse a un sujeto para dirigir la expresión de la proteína de fusión en las células del sujeto. También puede producirse químicamente un ácido nucleico que codifique para una proteína de fusión que incluya una proteína de estrés y un antígeno proteico de PVH, y entonces insertarse en un vector adecuado para la producción de proteína de fusión, purificarse o administrarse a un sujeto. Finalmente, una proteína de fusión puede también prepararse químicamente.
Las composiciones que comprenden una proteína de estrés y un antígeno de PVH descritos en este documento pueden utilizarse para potenciar una respuesta inmunológica, en particular una respuesta citolítica mediada por células, contra un PVH, o célula infectada o transformada por un PVH, que expresa un antígeno de PVH. Preferentemente, las composiciones contendrán secuencias de antígeno proteico del tipo particular de PVH contra cuyas proteínas se ha de provocar una respuesta inmunológica.
Las composiciones que comprenden una proteína de estrés y un antígeno de PVH descritos en este documento, pueden administrarse a un sujeto de varias maneras. Las rutas de administración incluyen la intradérmica, transdérmica (por ejemplo, liberación lenta de polímeros), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural e intranasal. Puede utilizarse cualquier otra ruta conveniente de administración, por ejemplo, inyección de infusión o en bolos, o absorción a través de epitelios o mucocutánea. Además, las composiciones descritas en este documento pueden contener y ser administradas junto a otros componentes farmacológicamente aceptables, como son agentes biológicamente activos (por ejemplo, adyuvantes como "alum"), tensioactivos (por ejemplo, glicéridos), excipientes (por ejemplo, lactosa), portadores, diluyentes y vehículos. Además, las composiciones pueden utilizarse ex vivo como una manera de estimular a los glóbulos blancos obtenidos de un sujeto para promocionar, expandir y propagar células inmunes específicas de antígenos proteicos de PVH in vitro, que a continuación son reintroducidos en el sujeto.
Además, una proteína de fusión de proteína de estrés-antígeno proteico de PVH puede administrarse por expresión in vivo de un ácido nucleico que codifica para tales secuencias proteicas en un sujeto humano. También puede conseguirse la expresión de tal ácido nucleico ex vivo como un modo de estimular a los glóbulos blancos obtenidos de un sujeto para promocionar, expandir y propagar células inmunes específicas de antígenos de PVH in vitro que son a continuación reintroducidos en el sujeto. Los vectores de expresión adecuados para dirigir la expresión de fusiones de proteínas antígeno proteico de PVH-proteína de estrés pueden seleccionarse de una gran variedad de vectores de uso actual en este campo. Son preferentes los vectores que son capaces de producir elevados niveles de expresión y además son efectivos en la transducción de un gen de interés. Por ejemplo, pueden utilizarse el vector adenovirus recombinante pJM17 (All y otros, Gene Therapy 1:367-84 (1994); Berkner K. L., Biotechniques 6:616-24 (1988), el vector adenovirus de segunda generación DE1/DE4 (Wang y Finer, Nature Medicine 2:714-6 (1996)), o el vector viral adeno-asociado AAV/Neo (Muro-Cacho y otros, J. Immunotherapy 11:231-7 (1992)). Ademas, pueden utilizarse los vectores retrovirales recombinantes MFG (Jaffee y otros, Cancer Res. 53:2221-6 (1993)) o el LN, LNSX, LNCX, LXSN (Miller y Rosman, Biotechniques 7:980-9 (1989)). Sirven como alternativas los vectores basados en el virus Herpes simplex, tal como el pHSV1 (Geller y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. 87:8950-4 (1990) o vectores virales vaccinia tal como el MVA (Sutter y Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:10847-51 (1992)).
Son unidades específicas de expresión utilizadas frecuentemente que incluyen secuencias promotoras y secuencias 3' las que se encuentran en el plásmido CDNA3 (Invitrogen), el plásmido AH5, pRC/CMV (Invitrogen), pCMU II (Paabo y otros, EMBO J. 5:1921-1927 (1986)), pZip-Neo SV (Cepko y otros, Cell 37:1053-1062 (1984)) y pSRa (DNAX, Palo Alto, CA). La introducción de genes en unidades de expresión y/o vectores puede conseguirse utilizando técnicas de ingeniería genética, como se describe en manuales como Molecular Cloning and Current Protocols in Molecular Biology ["Clonado molecular y protocolos actuales en biología molecular"] (Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning [Clonado molecular], Cold Spring Harbor Press (1989); Ausubel, F.M. y otros, Current Protocols in Molecular Biology ["Protocolos actuales en biología molecular"], Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989)). Un ácido nucleico resultante expresable puede introducirse en células de un sujeto humano por cualquier método capaz de colocar ácidos nucleicos dentro de células en una forma expresable, por ejemplo formando parte de un vector viral como el que se ha descrito anteriormente, como plásmido desnudo u otro ADN, o encapsulado en liposomas diana o en eritrocitos "fantasma" (Friedman, T., Science, 244:1275-1281 (1989); Rabinovich, N.R. y otros, Science, 265:1401-1404 (1994)). Entre los métodos de transducción se incluyen la inyección directa en tejidos y tumores, transfección liposomal (Fraley y otros, Nature 370:111-117 (1980)), endocitosis mediada por receptores (Zatloukal y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-153 (1992)), y transferencia génica mediada por el bombardeo de partículas (Eisenbraun y otros, DNA & Cell Biol. 12:791-797 (1993)).
La cantidad de proteína de estrés y antígeno proteico de PVH (fusionado, conjugado o unido no covalentemente como se ha comentado anteriormente) en las composiciones de la presente invención es una cantidad que produce una respuesta inmunoestimulatoria efectiva en un sujeto. Una cantidad efectiva es una cantidad tal que cuando se administra, resulta en una inducción de respuesta inmunológica. Además, la cantidad de proteína de estrés y antígeno proteico PVH administrado al sujeto variará dependiendo de una serie de factores, entre ellos el antígeno proteico de PVH y proteína de estrés empleados, el tamaño, edad, peso corporal, salud general, sexo, y dieta del sujeto, así como en su grado general de respuesta inmunológica. El ajuste y manipulación de rangos establecidos de dosis están claramente dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Por ejemplo, la cantidad de proteína de estrés y antígeno puede ser de entre aprox. 1 microgramo hasta aprox. 1 gramo, preferentemente entre aprox. 100 microgramos y aprox. 1 gramo, y desde aprox. 1 miligramo hasta aproximadamente 1 gramo. Una cantidad efectiva de una composición que comprende un vector de expresión es una cantidad tal que cuando se administra, induce una respuesta inmunológica contra el antígeno proteico de PVH que codifica. Además, la cantidad de vector de expresión administrado al sujeto variará dependiendo de una variedad de factores, entre ellos el antígeno proteico de PVH y la proteína de estrés que se exprese, el tamaño, edad, peso corporal, salud general, sexo, y dieta del sujeto así como en su grado general de respuesta inmunológica. Son factores adicionales a tener en cuenta la ruta de aplicación y el tipo de vector utilizado. Por ejemplo, cuando se lleve a cabo tratamiento profiláctico o terapéutico con un vector viral que contenga un ácido nucleico que codifique una proteína de fusión antígeno proteico de PVH-proteína de estrés, la cantidad efectiva estará en el rango de 10^{4} a 10^{12} virus libres de ayudante y defectivos para la replicación, por kg de peso corporal, preferentemente en el rango de 10^{5} a 10^{11} virus por kg de peso corporal y más preferentemente en el rango de 10^{6} a 10^{10} virus por kg de peso corporal.
Se ilustra la presente invención mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser restrictivos en modo alguno.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de proteínas de estrés recombinantes Hsp71 micobacteriano recombinante
El plásmido Y3111 contiene un gen hsp71 de M. tuberculosis funcionalmente insertado entre las secuencias de control de expresión (Mehlert, A. y Young, D.B., Mol. Microbiol. 3:125-130 (1989)). Se transformó la cepa E. coli CG2027 (obtenida de C. Georgopoulos, Universidad de Ginebra, Suiza) que contiene un gen dnaK truncado, con el plásmido Y3111 por procedimientos estándar. (Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).
Se cultivaron bacterias que contenían plásmido Y3111 durante una noche en medio 2xYT (20 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 10 g NaCl por litro) con 100 microgramos/ml de ampicilina a 37ºC, bajo agitación (250 rpm). Se preparó un linaje al 10% de glicerol con este cultivo y se almacenó a -70ºC. Se utilizaron varias raspaduras del linaje de glicerol congelado para inocular un cultivo grande incubado como antes durante 48 h. Cuando la densidad óptica a 590 nm alcanzó de 2,5 a 3,5, las células se recogían por centrifugación.
Los pasos siguientes se llevaron a cabo a 4ºC. El pellet celular se resuspendió en 3 ml de tampón de lisis por gramo de células en el pellet. La composición del tampón de lisis era de Tris-HCl 10 mM, etilendiamina tetraacetato (EDTA) 2 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, 10 microgramos/ml aprotinina, 10 microgramos/ml leupeptina, y 1 microgramo/ml pestatina. Se añadió lisozima a la suspensión celular hasta una concentración final de 0,14 mg/ml. Se congeló entonces la suspensión a -70ºC.
Se descongeló la suspensión celular, y las células se rompieron por sonicación. El sonicado se sometió a centrifugación a 17.000 rpm durante 30 min (rotor JA-17, Beckmann). Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la solución de sobrenadante hasta que la solución estaba saturada al 65% con (NH_{4})_{2}SO_{4}. Tras una incubación de 30 min, la mezcla se volvió a centrifugar como antes. El pellet se disolvió en tampón A de Q SEFAROSA. A esta solución se añadieron 10 microgramos/ml de aprotinina, 10 microgramos/ml de leupeptina, y 1 microgramo/ml de pepstatina, y la solución se dializó durante la noche contra 65 volúmenes de Q SEFAROSA tampón A. El tampón A de Q SEFAROSA contenía Tris-HCl 30 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM. La solución dializada se clarificó por centrifugación como se ha descrito anteriormente.
La solución dializada se aplicó a una columna de Q SEFAROSA (Pharmacia) equilibrada en tampón A de Q SEFAROSA. La columna se lavó con 2 volúmenes del mismo tampón. La elución se llevó a cabo con un gradiente de 0 a 600 mM de NaCl. Se testearon las fracciones por SDS-PAGE y tiñeron con azul de Coomassie para detectar la presencia de un polipéptido principal de 71 kDa (es decir, la proteína Hsp71 recombinante de M. tuberculosis). Se reunieron las fracciones que contenían el polipéptido, y el "pool" se llevó a una saturación del 65% por adición del (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido. Se centrifugó la mezcla como se ha descrito antes, se disolvió el pellet en tampón ATP Start (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 20 mM, MgCl_{2} 5 mM, beta-mercaptoetanol 15 mM, EDTA 0,1 mM), y la solución proteica resultante se dializó durante la noche frente a 65 volúmenes del mismo tampón y se clarificó por centrifugación.
La solución proteica dializada se pasó entonces por una columna ATP-agarosa (Fluka) equilibrada con tampón ATP Start. Se lavó la columna con 1 volumen de columna de tampón ATP Start con NaCl 1 M. La elución se consiguió con tampón ATP Start suplementada con ATP 10 mM. El eluído se llevó a una saturación del 65% con (NH_{4})_{2}SO_{4}, y el precipitado de proteína se recogió como se ha descrito anteriormente. El pellet de centrifugación se disolvió y se dializó frente a 200 volúmenes de tampón azul de SEFAROSA (Tris-HCl 30 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM).
La solución de proteína dializada del último paso se pasó por una columna de azul de SEFAROSA (Pharmacia) equilibrada con tampón de azul de SEFAROSA. La columna se lavó con 1,5 volúmenes de columna del mismo tampón. El eluído y fracciones de lavado (que contienen Hsp71) se recogieron juntos. La pureza de la preparación final se evaluó mediante SDS-PAGE y tinción de azul de Coomassie, y análisis de Western blot (Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)); (ver Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory press, NY (1989)) utilizando anticuerpos monoclonales de ratón específicos para el Hsp71 micobacteriano y el DnaK de E. coli, respectivamente, y por ensayos de actividad ATPasa. Las preparaciones son típicamente de un 90% de pureza, basadas en el patrón de tinción de la preparación en geles teñidos con azul de Coomassie, y preferentemente de pureza superior al 95%, y contienen menos de un 1% de GroEL de E. coli, y cantidades indetectables de DnaK de E. coli.
Hsp65 recombinante micobacteriano
El plásmido RIB 1300 contiene un gen hsp65 BCG de M. bovis funcionalmente insertado entre secuencias de control de expresión (Thole, J.E.R. y otros, J. Exp. Med. 178:343-8 (1993)). La cepa M1546 de E. coli se transformó con el plásmido RIB1300 (Thole, J.E.R., supra) utilizando procedimientos estándar. Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Se cultivó un inóculo de bacterias que contenían el plásmido RIB 1300 hasta la saturación en medio NCZYM (10 g de N-Z amina A, 5 g de extracto Bacto de levadura, 1 g de ácidos Casamino, 5 g de NaCl, 2 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}-7H_{2}O por litro) que contenía 200 microgramos/ml de ampicilina a 28ºC y bajo agitación (250 rpm). Este cultivo se utilizó para inocular un cultivo mayor, cultivado bajo las mismas condiciones que el cultivo de inóculo, hasta una densidad óptica a 590 nm del cultivo de entre 0,3 y 0,6. Se inició la producción de la proteína recombinante incrementando rápidamente la temperatura del cultivo hasta los 42ºC por incubación en un baño de agua caliente. El cultivo se mantuvo a esta temperatura durante 3h bajo agitación. Se recogieron entonces las bacterias por centrifugación y resuspendieron en 6 volúmenes por peso de pellet bacteriano de tampón de lisis. El tampón de lisis contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), etilendiamina tetraacetato (EDTA) 10 mM, PMSF 0,1 mM y RIVM BA 0,1% (0,104 g de 4-amino-benzamidina-2HCl, 0,066 g de ácido epsilon-amino caproico por 50 ml). Se añadió lisozima a una concentración de 0,1 mg/ml, y la suspensión se congeló a -70ºC.
Se descongeló la suspensión bacteriana, dejándola después a 4ºC. Las operaciones siguientes se realizaron a esta temperatura. Se consiguió la lisis completa de las bacterias por sonicación. El sonicado se centrifugó a 17.000 rpm durante 30 min en un rotor JA-17 (Beckman). Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado a la solución de sobrenadante hasta alcanzar una saturación del 20%. Se separaron los precipitados por centrifugación (ver más arriba) y se descartaron. La solución sobrenadante se llevó a una saturación del 55% por adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado. El pellet resultante de la centrifugación subsiguiente se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), beta-mercaptoetanol 15 mM, EDTA 1 mM). La solución proteica en TE se dializó entonces frente a 50 volúmenes de tampón TE.
Tras la centrifugación (como anteriormente) para separar el material precipitado, se pasó la solución proteica que había sido dializada por una columna DEAE SEFAROSA (Pharmacia). Tras lavar con tampón TE, se eluyeron las proteínas con un gradiente 0-300 mM de NaCl en tampón TE. Las fracciones que contenían el Hsp65 BCG de M. bovis se identificaron por SDS-PAGE y tinción de azul de Coomassie y se agruparon. Se añadieron 10 microgramos/ml de aprotinina, 10 microgramos/ml de leupeptina y 1 microgramo/ml de pepstatina al "pool", el cual se concentró entonces en una célula Amicon utilizando una membrana YM30.
El "pool" concentrado se pasó por una columna S-200 SEPHACRYL (Pharmacia) equilibrada con tampón S200 (Na_{2}HPO_{4} 10 mM (pH 6,8), NaCl 150 mM y beta-mercaptoetanol 15 mM). La elución se realizó con el mismo tampón. Se comprobó la presencia de Hsp65 micobacteriano en las fracciones como anteriormente, y las fracciones positivas que contenían la proteína altamente purificada se agruparon y dializaron durante la noche frente a tampón HAP (Na_{2}HPO_{4} (pH 6,8) 10 mM, beta-mercaptoetanol 15 mM).
El pool dializado se pasó por una columna de hidroxiapatito (Bio-Rad; Bio-Gel HTP Gel) equilibrada en tampón HAP. La columna se lavó con 3 volúmenes de MgCl_{2} 1 mM y beta-mercaptoetanol 15 mM y a continuación con Na_{2}HPO_{4} 1 mM (pH 6,8) y beta-mercaptoetanol 15 mM. Las proteínas se eluyeron con un gradiente 10-60 mM de fosfato. Las fracciones se examinaron como anteriormente, y las fracciones positivas se agruparon, concentraron e intercambiaron en NaCl 0,85% por medio de filtración en gel a través de PD10 (Pharmacia). Se evaluó la pureza en Hsp65 micobacteriano por SDS-PAGE y tinción de azul de Coomassie, así como por análisis de Western blot utilizando anticuerpos específicos para el DnaK y GroEL de E. coli. Las preparaciones eran típicamente de pureza superior al 90%, y contenían no más de 0,5% de GroEL de E. coli y 0,1-0,2% de DnaK de E. coli, respectivamente.
Las preparaciones de Hsp pueden ser despirogenadas por cromatografía de afinidad en resina DetoxiGel (Pierce), por adición de polimixina B, o por extracción con detergentes como el Triton X-114 ó X-100. Puede realizarse el test del amebocito de limulus (LAL; Biowhittaker, QCL 1000) tras la reducción en contenido lipopolisacárido. Las preparaciones de Hsp pueden guardarse en tampón a -70ºC, o pueden guardarse, preferentemente a -70ºC, como pellets secos tras su liofilización.
Ejemplo 2 Preparación de conjugados de antígeno proteico-proteína de estrés
Este ejemplo se proporciona como ilustración de técnicas que pueden utilizarse para preparar conjugados entre una proteína de estrés y un antígeno proteico, en este ejemplo de péptido derivado de nucleoproteína de virus influenza (NP).
Síntesis de proteína de estrés (Hsp71) y antígeno (NP.B)
La Hsp71 de M. tuberculosis se preparó como se describe en el Ejemplo 1. El péptido NP (denominado en este documento NP.B; Motal, U.M.A. y otros, Eur. J. Immunol. 25:11214 (1995) y referencias citadas en el mismo) con la secuencia aminoacídica [C]VQLASNENMETM (SEQ ID NO: 1; el péptido contiene un residuo adicional cisteína amino-terminal) correspondiente a los residuos 363-374 en el NP completo y que contiene un epítopo CTL conocido (H-2b-restringido), fue producido sintéticamente (escala 0,25 mM) en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems modelo 431A utilizando Fmoc (9-fluorenilmetiloxi-carbonil) como el grupo alfa-amino protector y resina HMP (Wang) como soporte sólido. Todos los compuestos químicos de síntesis y aminoácidos se adquirieron de Applied Biosystems. Se separó la NP.B del soporte y se separaron los grupos laterales protectores de cadena por incubación del NP.B bajo agitación continua durante 3 horas en 2 ml de una mezcla preparada por combinación de 10 ml de ácido trifluoroacético, 0,5 ml de agua, 0,75 g de fenol cristalizado, 0,25 ml de etaneditiol y 0,5 ml de tioanisol. La mezcla se filtró en 40 ml de dietil éter helado. El material insoluble se recogió por centrifugación a 5000 x g durante 8 min. Se decantó el éter y el pellet se lavó tres veces por resuspensión en dietil éter frío seguido de centrifugación. Tras el último lavado se secó el pellet al aire, se recogió en agua destilada y liofilizó.
Conjugación química del péptido NP.B a Hsp71 y toxoide diftérico
Las conjugaciones se llevaron a cabo con Hsp71 y, para tener un estándar para la comparación de las eficacias en la estimulación específica de la actividad CTL, la proteína portadora de uso común, toxoide diftérico (abreviado TD; TD fue obtenido de Wako Chemical).
Soluciones de proteína portadora activada: nueve mg de Hsp71 se disolvieron en 4,5 ml de tampón borato sódico 0,1 M, pH 8,0. Se añadió sulfo-MBS (éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-sulfosuccinimida) (2,3 mg en 100 \mul de dimetil sulfoxamina) a la proteína, y la mezcla de reacción se incubó durante una hora a temperatura ambiente. El pH se ajustó entonces a 6,0 y la reacción de mezcla se dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 litro de fosfato sódico 20 mM y NaCl 150 mM, pH 5,6. Se sometió a tratamiento similar al TD.
Soluciones de péptido reducido: Para cada reacción de conjugación, se disolvieron 3 mg de péptido en 100 \mul de beta-mercaptoetanol 0,1 M. Tras 1 hora de incubación para permitir la reducción del péptido, se retiró el agente reductor por secado de la mezcla de reacción en una centrifugadora SpeedVac. El péptido se redisolvió en 0,5 ml de agua destilada a la cual se añadieron alícuotas de 5 \mul de NaOH 1 N hasta que el péptido estaba completamente disuelto. Para los experimentos de conjugación con TD, se redujeron 6 mg de péptido y se redisolvieron entonces en 1 ml de agua.
El pH de las soluciones proteicas portadoras activadas se ajustó a 6,8 utilizando NaOH 0,1 N. Se hizo reaccionar la solución que contenía 3 mg de proteína portadora activada con 0,5 ml de la solución de péptido reducido (ó 1 ml de solución de péptido reducido para la preparación de conjugados con TD) durante 3 horas a temperatura ambiente bajo mezcla continua. Para retirar el péptido que no había reaccionado, la solución resultante que contenía el conjugado se dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 litro de fosfato sódico 20 mM y NaCl 150 mM, pH 7. Se determinó la concentración de proteína mediante un ensayo BCA. La eficiencia de conjugación alcanzada por este procedimiento se ha determinado en experimentos-piloto previos utilizando péptido NP.B marcado radioactivamente. La proporción péptido:proteína se encontró que era de 17,5 para el conjugado NP.B-Hsp71 (71.NP) y 10,1 para NP.B-TD (TD.NP).
Ejemplo 3 Preparación de genes de fusión Hsp-E6 y Hsp-E7 Preparación del vector de expresión bacteriana pET65H
El plásmido RIB1300 contiene un gen hsp65 BCG de Mycobacterium bovis (Thole, J.E.R. y otros J. Exp. Med. 178:343-8 (1993)). Se sintetizó un par cebador para la amplificación del gen hsp65 en un sintetizador automático de oligonucleótidos y se purificó utilizando procedimientos rutinarios. El cebador delantero ("forward") incluía un sitio de restricción NdeI y preentaba una secuencia nucleotídica 5' AAT CAC TTC CAT ATG GCC AAG ACA ATT. El cebador reverso incluía sitios EcoRI y NheI flanqueando a un codón de parada y presentaba la secuencia nucleotídica 5' CGC TCG GAC GAA TTC TCA GCT AGC GAA ATC CAT GCC.
Se llevó a cabo una reacción polimerasa en cadena ("polymerase chain reaction")(PCR) utilizando el par cebador anteriormente citado y pRIB 1300 como cadena molde de ADN. Se digerieron doblemente los fragmentos PCR con las endonucleasas de restricción NdeI y EcoRI y se ligaron a pET28a (Invitrogen) NdeI/EcoRI-doblemente-digerido utilizando procedimientos de subclonado rutinarios (Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado Molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989)). Se transformaron células competentes de la cepa DH5alfa de E. coli con la mezcla de ligación y se hicieron placas en agar que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se preparó ADN de plásmido y analizó para detectar la presencia del gen hsp65 y secuencias del vector, por mapeo de restricción y secuenciación de nucleótidos. Se identificaron los constructos correctos (denominados pET65H), incluyendo el gen hsp65 micobacteriano, y se transformó la cepa BL21 de E. coli (DE3; Novagen) para analizar la expresión del gen hsp65. Se muestra un mapa esquemático del constructo pET65H en la Fig. 1. Para examinar la expresión de Hsp65, se cultivaron bacterias transformadas de la cepa BL21, se indujeron y recogieron siguiendo instrucciones del fabricante (Novagen). Se lisaron las bacterias, y el material soluble así como material solubilizado de cuerpos de inclusión con cloruro de guanidina (Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989)), se sometió a electroforesis en SDS-PAGE y a inmunoblot anti-Hsp65 utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la proteína de estrés micobacteriana.
Preparación de un constructo para la expresión de una proteína de fusión Hsp65-PVH16 E6 en bacterias
Se insertó una región completa de PVH16 codificante de E6 en el extremo carboxi-terminal de un gen hsp65 en pET65H.
El plásmido pPVH16 contiene un genoma de PVH16 completo en el vector Bluescript SK(ATCC 45113). Para la secuencia nucleotídica del genoma de PVH16, ver Seedorf y otros, Virology 145:181-5 (1985). Se sintetizó un par cebador para la amplificación del gen E6 en un sintetizador automático de oligonucleótidos y se purificó utilizando procedimientos rutinarios. El cebador delantero incluía un sitio de restricción NheI y presentaba una secuencia nucleotídica 5' AAA AGC AGA GCT AGC ATG CAC CAA AAG. El cebador reverso incluía sitio EcoRI y un codón de parada y presentaba una secuencia nucleotídica 5' CTC CAT GAA TTC TTA CAG CTG GGT.
Se llevó a cabo reacción polimerasa en cadena ("polymerase chain reaction")(PCR) utilizando el par cebador anteriormente mencionado y pPVH16 como cadena molde de ADN. Los fragmentos PCR se digerieron doblemente con las endonucleasas de restricción NheI y EcoRI y se ligaron a pET65H NheI/EcoRI-doblemente-digerido utilizando procedimientos rutinarios de subclonado (Maniatis y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonado molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989)). Se transformaron células competentes de la cepa DH5alfa de E. coli con la mezcla de ligado y se prepararon placas de ágar que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se preparó el plásmido ADN y analizó para detectar la presencia del gen de fusión hsp65-E6 y las secuencias de vectores, por medio de mapeo de restricción y secuenciación de ácidos nucleicos. Los constructos correctos (denominados pET65EH6) que incluían el gen de fusión hsp65-E6 se identificaron y transformaron en la cepa BL21(DE3; Novagen) de E. coli para el análisis de la expresión del gen de fusión. Se muestra un mapa esquemático del constructo pET65HE6 en la figura 2. Para examinar la expresión de Hsp65-E6, se cultivaron bacterias de la cepa BL2 1 transformadas con pET65HE6, indujeron y recogieron utilizando las instrucciones del fabricante (Novagen). Se lisaron las bacterias, y el material soluble así como material de los cuerpos de inclusión solubilizado por el cloruro de guanidina (Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado molecular: un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989)) se sometieron a electroforesis SDS-PAGE. Se hizo circular en paralelo el Hsp65 purificado, como estándar. La expresión de Hsp65-E6 se evaluó por la aparición de una banda de fuerte tinción con azul de Coomassie que migraba ligeramente más despacio (peso molecular aparente (MOO) de aproximadamente o 73 kDa) que el auténtico Hsp65 (PM aparente de aproximadamente 56 kDa) en muestras de la bacteria pET65HE6-transformada que no estaba presente en la bacteria no transformada correspondiente.
Preparación de un constructo para la expresión de una proteína de fusión Hsp65-PVH16 E7 en bacterias
Se insertó una región codificante completa de PVH16 E7 en el extremo carboxi-terminal de un gen hsp65 en pET65H.
Se sintetizó un par cebador para la amplificación de un gen E7 en un sintetizador automático de oligonucleótidos y se purificó utilizando procedimientos rutinarios. El cebador delantero incluía un sitio de restricción NheI y presentaba una secuencia nucleotídica 5' AAC CCA CCT GCT AGC ATG CAT GGA GAT. El cebador reverso incluía sitio EcoRI y un codón de parada y presentaba la secuencia nucleotídica 5' AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG.
Se llevó a cabo una reacción polimerasa en cadena ("polymerase chain reaction")(PCR) utilizando el par cebador anteriormente mencionado y pPVH16 como cadena molde de ADN. Los fragmentos PCR se digerieron doblemente con las endonucleasas de restricción NheI y EcoRI y se ligaron a pET65H NheI/EcoRI-doblemente digerido utilizando procedimientos rutinarios de subclonado. Se transformaron células competentes de la cepa DH5alfa de E. coli con la mezcla de ligado y se prepararon placas en ágar que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se preparó el plásmido de ADN y analizó para detectar la presencia de gen de fusión hsp65-E7 y secuencias del vector, mediante mapeo de restricción y secuenciación de ácidos nucleicos. Se identificaron los constructos correctos (denominados pET65HE7), incluyendo el gen de fusión hsp65-E7 y se transformaron en la cepa BL21(DE3; Invitrogen) de E. coli para el análisis de la expresión del gen de fusión. Se muestra un mapa esquemático del constructo pET65HE6 en la figura 3. Para examinar la expresión de Hsp65-E7, se cultivaron bacterias de la cepa BL21 transformadas con pET65HE7, se indujeron y se recogieron utilizando técnicas rutinarias. Las bacterias se lisaron, y el material soluble así como el material solubilizado de los cuerpos de inclusión por el cloruro de guanidina se sometieron a electroforesis SDS-PAGE y se sometieron a un blot anti-E7 utilizando anticuerpos monoclonales específicos para PVH16 E7 (Zymed Laboratory Inc., número de catálogo 28-0006).
Ejemplo 4 Expresión y purificación de proteínas de fusión Expresión y purificación de una proteína de fusión Hsp65-E6: procedimiento 1
Se transformó el constructo pET65HE6 en una cepa BL21(DE3; Novagen) de E. coli, y se cultivaron las células transformadas en cultivos de 6 litros de medio 2xYT (20 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 10 g NaCl por litro) que contenía 30 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Para cada cultivo, cuando la densidad alcanzaba 0,5 (OD_{590}), se inducía la expresión de proteína de fusión utilizando isopropil-tio-galactopiranósido 0,5 mM, y se incubó el cultivo durante tres horas más a 37ºC. Se recogieron las células por centrifugación, se suspendieron en 90 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, beta-mercaptoetanol 0,5 mM, pH 7,5) que contenía 200 \mug/ml de lisozima, y se congelaron a -70ºC. Un día después, la suspensión celular congelada se descongeló al baño maría a 37ºC, y se suplementó con 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, 2 \mug/ml de pepstatina y PMSF 2 mM. Todos los pasos siguientes se realizaron a 0-4ºC. Se lisaron las células por sonicación, el material insoluble se recogió por centrifugación a 17.000 rpm durante 15 min (rotor JA-17, Beckmann). El material pellet se lavó dos veces con tampón de lisis y entonces se solubilizó, con ayuda de sonicación, en 90 ml de tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, cloruro de guanidina 6 M). El material insoluble se retiró por centrifugación como anteriormente. El material solubilizado se pasó entonces por una columna que contenía 50 ml de una resina cargada con níquel, quelante de metales, (Chelating Sepharose Fast Flow; Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón A. La proteína de fusión unida se re-plegó lentamente en la resina con un gradiente 0-1 M de NaCl. La resina se lavó con cinco volúmenes de tampón B (NaCl 1 M) para eliminar cloruro de guanidina residual, y con cinco volúmenes de tampón C (imidazol 50 mM, pH 7,5, beta-mercaptoetanol 0,5 mM, NaCl 150 mM) para eliminar proteínas contaminantes. Se eluyó la proteína de fusión con seis volúmenes de un gradiente lineal 50-500 mM de imidazol en tampón C. Se agruparon las proteínas eluídas y dializaron durante la noche frente a aproximadamente 40 volúmenes de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 0,137 M), se concentró por ultrafiltración (Amicon, peso molecular de corte: 30 kDa) y se pasó a través de una resina Detoxigel equilibrada con solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato para la eliminación de endo-
toxinas.
Expresión y purificación de proteína de fusión Hsp65-E6: procedimiento 2
Se transformó el constructo pET65HE6 en la cepa BL21(DE3; Novagen) de E. coli, y las células transformadas se cultivaron en cultivos de 12 litros de medio 2xYT (20 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 10 g NaCl por litro) que contenía 30 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Para cada cultivo, cuando la densidad alcanzaba 0,5 (OD_{590}), se inducía la expresión de la proteína de fusión con isopropil-tio-galactopiranósido 0,5 mM, y el cultivo se incubaba durante tres horas más a 37ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se suspendieron en 180 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, beta-mercaptoetanol 0,5 mM, pH 7,5) que contenía 200 \mug/ml de lisozima, y se congeló a -70ºC. Un día después, la suspensión celular congelada se descongeló al baño maría a 37ºC, y se suplementó con 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, 2 \mug/ml de pepstatina y PMSF 2 mM. Todos los pasos siguientes se realizaron a 0-4ºC. Se lisaron las células por sonicación, y el material insoluble se recogió por centrifugación a 17.000 rpm durante 15 min (rotor JA-17, Beckmann). El material pellet se lavó dos veces con tampón de lisis y entonces se solubilizó, con ayuda de sonicación, en 180 ml de tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, cloruro de guanidina 6 M). El material insoluble se retiró por centrifugación como anteriormente. El material solubilizado se aplicó entonces a una columna que contenía 50 ml de una resina cargada con níquel, quelante de metales ("Chelating Sepharose Fast Flow"; Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón A. La proteína unida se lavó con tampón D (tampón A con Triton X100 al 5%) y entonces se re-plegó lentamente en la resina con un gradiente 0-1 M de NaCl. Se lavó la resina con cinco volúmenes de tampón E (NaCl 1 M, Triton X 100 al 1%) y cinco volúmenes de tampón B (NaCl 1 M) para eliminar cloruro de guanidina residual, y cinco volúmenes de tampón F (imidazol 50 mM, pH 7,5, beta-mercaptoetanol 0,5 mM, NaCl 0,5 M, glicerol 15%) para eliminar proteínas contaminantes. Se eluyó la proteína de fusión con seis volúmenes de un gradiente lineal 50-500 mM de imidazol en tampón F. Las proteínas eluídas se agruparon y dializaron durante la noche frente a 40 volúmenes de tampón G (Tris-HCl 30 mM, pH 6,5, EDTA 2 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol 15%) y se pasó por una columna SP-Sefarosa de 50 ml en el mismo tampón. Se recuperó la proteína de fusión (unos 42 mg, representando aprox. 50% del total de proteína de fusión presente en el extracto no fraccionado) en la fracción eluída, se dializó durante la noche frente a 40 volúmenes de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 0,137 M), y se concentró por ultrafiltración (Amicon; peso molecular de corte
30 kDa).
La proteína de fusión Hsp65-E7 se expresó y purificó utilizando los mismos procedimientos. Se estimó la pureza de las proteínas de fusión por SDS-PAGE y tinción de los geles con azul de Coomassie. Las proteínas eran típicamente de una pureza del 70-90% tras el procedimiento 1, y de una pureza de aproximadamente el 95% tras el procedimiento preferente 2. Los niveles de endotoxina tras la purificación mediante el procedimiento 2 estaban por debajo de 20 EU/mg de proteína.
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Ejemplo 5 Inmunización con Hsp65-E6 y Hsp65-E7
Se obtuvieron ratones hembra C57/BL/6, de seis a ocho semanas de edad, de Charles River Laboratory (St. Constant, Quebec, Canada). Se inmunizaron subcutáneamente en la nuca a grupos de seis a ocho ratones por grupo con idénticas cantidades de proteínas de fusión Hsp65-E6 y Hsp65-E7 en solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato y purificada como se ha descrito en el Ejemplo 4. Las dosis de proteínas de fusión totales administradas fueron de 20 microgramos o 200 microgramos, respectivamente. A los controles negativos de inmunización se les administró adyuvante incompleto de Freund en solución salina (IFA), y a los controles positivos de inmunización, 100 microgramos de un péptido sintético PVH16 E7 que incluía los residuos 44 a 65, en IFA y solución salina. En relación a las dosis aplicadas de proteínas de fusión, esta cantidad de péptido E7 administrado representaba un exceso en un factor de 20 ó 200, respectivamente. Se repitieron las inmunizaciones 14 días después. Doce días después de la segunda inmunización, se infectó a los ratones por inyección subcutánea en un área afeitada de la espalda con 1,3 x 10^{5} células tumorales de la línea TC-1 que expresaban E7. Se registró la incidencia de tumores como la presencia o ausencia de tumor basada en la observación visual y palpación cada dos días durante cincuenta días. La línea celular tumoral TC-1 que expresaba la proteína PVH16 E7 se derivó de células pulmonares primarias de ratones C57/BI/6 por inmortalización y transformación con los genes PVH16 E6 Y E7 y un gen humano activado c-Ha-ras como han descrito Lin y otros (Cancer Res. 56:21-26 (1996)). Para la inoculación de tumores, se cultivaron células TC-1, suministradas por Dr. T.C. Wu (The Johns Hopkins Medical Institution, Baltimore, MD), hasta una confluencia del 60-70% en un medio RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (Hyclone, Logan, UT), aminoácidos no esenciales, glutamina, piruvato, gentamicina, beta-mercaptoetanol, 0,4 mg/ml Geneticina® (Life Technologies, Grand Island, N.Y.) y 0,2 mg/ml de higromicina B a 37ºC. Las células se recogieron por tripsinización y se resuspendieron en solución tampón de Hank a una densidad de 6,5 x 10^{5} células/ml.
Se muestran los resultados de un experimento de este tipo en la figura 4. Poco después de la infección provocada, la incidencia de tumores se incrementó en todos los grupos de tratamiento (entre 5 y 15 días después de la infección). Mientras que la incidencia permaneció elevada en el grupo IFA, cayó rápidamente a 0% en los grupos tratados con 200 microgramos de mezcla de proteína de fusión o con péptido E7 en IFA. Se obtuvo un resultado intermedio en el grupo tratado con 20 microgramos de proteínas de fusión. Así, la inmunización con mezclas de proteínas de fusión Hsp65-E6 y Hsp65-E7 en ausencia de cualquier adyuvante, protegió eficazmente a los ratones contra la infección mortal con células tumorales que expresaban E7. Se muestra un resumen de los resultados en la Tabla 1.
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TABLA 1 Respuesta de una segunda infección con tumor TC-1
Grupo de inmunización Porcentaje de incidencia de tumor*
Tras la primera infección Tras la segunda infección
(Día 54) (Día 79)
IFA o Nada** 83 (5/6) 100 (4/4)
20 microgramos de proteínas de fusión 25 (2/8) 25 (1/4)
200 microgramos de proteínas de fusión 0 (0/8) 0 (0/4)
Péptido E7 en IFA 0 (0/8) 0 (0/4)
* \begin{minipage}[t]{155mm} \hskip0,1cm En paréntesis, se indica el número de animales con tumor/número total de animales por grupo. En la columna {}\hskip0,1cm de la derecha, se registró la presencia o ausencia de tumor en los animales durante 25 días adicionales (tras la {}\hskip0,1cm segunda infección).\end{minipage}
** \begin{minipage}[t]{155mm}Como control para la segunda infección de tumor, se ha incluído un grupo de animales no inmunizados para su comparación.\end{minipage}
Ejemplo 6 Exposición de animales inmunizados a una segunda infección con células tumorales
Para evaluar la longevidad de la respuesta inmunológica a los antígenos PVH, se infectó una segunda vez a grupos de cuatro animales supervivientes del experimento anterior (en el día 54), de tanto los grupos tratados con proteína de fusión como del grupo péptido E7/IFA, con 1,3 x 10^{5} células tumorales vivas TC-1 por animal. Como control, se incluyó un grupo de ratones nuevos, expuestos a infección por el mismo tumor. Se evaluó la incidencia de tumores 25 días después.
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Se muestran los resultados en la Tabla 1. Los animales previamente inmunizados con proteínas de fusión o con péptido E7/IFA estaban completamente o casi completamente protegidos de la segunda infección, mientras que los animales no inmunizados mostraron una incidencia de tumor del 100%.
Ejemplo 7 Actividad citolítica de esplenócitos de animales inmunizados y no inmunizados
Se realizó eutanasia de grupos de dos ratones de los tratamientos de proteína de fusión, péptido o animales no inmunizados, por dislocación cervical, extrayéndoles después el bazo. Se prepararon suspensiones celulares de todos los bazos agrupados y lavaron una vez con solución tampón de Hank suplementada con suero fetal bovino 5%. Las células linfoides se reestimularon por cultivo de 20 x 10^{6} células viables con 2 x 10^{6} células TC-1 tratadas con mitomicina C durante 5 días en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM y 50 \mug/ml de gentamicina sulfato a 37ºC y CO_{2} 5%. Se recogieron entonces los esplenocitos (células efectoras) y utilizaron en el ensayo de actividad CTL como se describe a continuación.
Se utilizaron como células diana las líneas celulares EL4 y MC57G tipos emparejados con TC-1 y HLA, que no expresaban el epítopo E7. Se incubaron las células durante 90 min con 150 \muCi Na_{2}^{51}CrO_{4} y, en el caso de células EL4, también con 10 \mug de péptido_{366-374} de nucleoproteína de virus influenza por cada 10^{6} células. Después del lavado extensivo para eliminar el exceso de marca radioactiva, se co-cultivaron 5 x 10^{3} células dianas marcadas con células efectoras reestimuladas a varias razones de célula efectora a célula diana. Tras 4-5 horas de incubación, las placas de cultivo se centrifugaron durante 5 min a 200 x g, y alícuotas de 100 \mul de las soluciones de sobrenadante que contenía marcaje radioactivo liberado por las células se recogieron en "Beckman Ready Caps". Se midió la radioactividad por conteo de centelleo líquido. Para determinar radioactividad liberada espontáneamente y total liberable, se recogieron las soluciones sobrenadantes de los cultivos que contenían las células diana solamente o de las células diana lisadas por adición de Triton X100, y se determinó su radioactividad como anteriormente. Los resultados se expresan
como % lisis corregida, calculada a partir de la fórmula siguiente:
Porcentaje Lisis Corregida = 100 x (cpm_{test} - cpm _{espont})/(cpm_{total} - cpm_{espont}),
donde cpm_{test} es la radioactividad liberada de un co-cultivo particular, cpm_{espont} es la radioactividad espontáneamente liberada de un cultivo celular diana y cpm_{total} es la radioactividad liberada por lisis con Triton X100 de células diana. Los ensayos CTL se llevaron a cabo por triplicado, y se dan los valores medios.
Se muestran los resultados de un experimento utilizando células TC-1 como células diana en la figura 5. Un 40% y un 25% de lisis de células TC-1 fue mediado por células efectoras (utilizadas en un exceso de un factor de 100 sobre las células diana) obtenidas de animales inmunizados con 200 \mug y 20 \mug de proteínas de fusión, respectivamente.
En un segundo experimento, se testeó la especificidad de la actividad CTL utilizando esplenócitos de animales inmunizados con 20 \mug de proteínas de fusión. Los resultados mostrados en la figura 6 demuestran lisis efectiva de células TC-1 transformadas con PVH16 E6/E7. La lisis de los otros dos tipos celulares (EL4 y MC57G) que no expresaban el antígeno PVH tuvo lugar con una eficiencia mucho más reducida, demostrando la especificidad de la respuesta CTL provocada por la inmunización con proteínas de fusión Hsp65-E6 y -E7.
Ejemplo 8 Regresión de tumor TC-1 en ratones tras tratamiento con proteína de fusión Hsp65-E7
Se utilizaron tres grupos de ocho ratones C57/BIJ6 en este experimento. Se le inocularon 1,3 x 10^{5} células TC-1 a cada animal, subcutáneamente por un área afeitada de la espalda. Dos días después, se le administró a un primer grupo solución salina (control negativo), a un segundo grupo 100 \mug/animal de proteína de fusión Hsp65-E7 y a un tercer grupo 100 \mug/animal de péptido E7 en solución salina e IFA (control positivo). Todas las inyecciones (0,2 ml) se hicieron subcutáneamente en la nuca. Catorce días después (16 días después de la inoculación de tumor), se repitieron las inyecciones. Se examinaron los ratones un día después de la inoculación de tumor, y cada dos días a partir de entonces, se comprobaron la presencia o ausencia de tumor por inspección visual y palpación.
La figura 7 revela que 9 días después de la inoculación de tumor, todos los grupos de tratamiento mostraron incidencia máxima de tumores (expresada como porcentaje de animales con tumor), en un rango de entre 85 y 100%. Llegados al día 17, sin embargo, el grupo tratado con proteína de fusión Hsp65-E7, así como el grupo que recibió péptido E7 en IFA, mostraron una reducción altamente significativa en incidencia de tumor que se estabilizó en aprox. un 15%. En contraste, el grupo tratado con solución salina continuó teniendo una incidencia de tumor de casi el 100% durante el resto del período de observación. Estos resultados demuestran que la proteína de fusión Hsp65-E7, administrada en ausencia de adyuvante, induce una drástica regresión en un tumor inducido por PVH.
Se muestran en la figura 8 resultados de un experimento similar. En este experimento, los animales fueron inoculados con una dosis de tumor más elevada (2 x 10^{5}/animal) que en el experimento anterior. Los resultados obtenidos fueron muy parecidos a aquellos del experimento anterior.
Ejemplo 9 Comparación de la capacidad de la proteína E7 y la proteína de fusión Hsp65-E7 para inducir respuestas inmunológicas celulares
Se produjo y purificó la proteína de fusión Hsp65-E7 como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se obtuvo una proteína de longitud completa PVH E7 siguiendo el siguiente procedimiento.
El gen E7 se amplificó a partir de ADN genómico de PVH16 (pSK/PVH16 obtenido de la "American Tissue Collecion" ["Colección americana de tejidos"]), utilizando una ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). El cebador "forward" (5'-AAC CCA GCT GCT AGC ATG CAT GGA GAT-3') contenía un sitio NheI inmediatamente corriente arriba del codón de parada ATG, mientras que el cebador reverso (5'-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3') contenía un sitio EcoRI inmediatamente corriente debajo de un codón de parada TAA de la secuencia codificante de E7. El producto PCR se digerió con NheI y EcoRI, se purificó de un gel de agarosa, y se ligó a pET28a que había sido digerido con los mismos enzimas de restricción. Se llevó a cabo la transformación de bacterias, aislamiento de colonias que contenían recombinantes, y la preparación de plásmido de ADN de las colonias expandidas, mediante procedimientos estándar. Ver, por ejemplo, Ausubel y otros (eds.), Short Protocols in Molecular Biology ["Protocolos breves en biología molecular"], 3ª edición (John Wiley & Sons, Inc. 1995). La identidad del constructo plásmido resultante, pET/E7 (H) se confirmó por digestión diagnóstica de restricción y análisis de secuencias de ADN. Se presenta un mapa esquemático de pET/ET(H) en la figura 9.
Se inocularon doce litros de medio 2xYT que contenía 30 \mug/ml de kanamicina con un cultivo de E. coli BL21(DE3) que contenía pET/E7 (H) y se incubó durante la noche a 30ºC con aireación. Cuando se alcanzó una densidad óptica de 0,5, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM durante tres horas. Se recogieron entonces las células por centrifugación, se resuspendieron en 180 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 0,5 mM), se suplementaron con 200 \mug/ml de lisozima y congelaron a -70ºC durante la noche. Se descongeló la suspensión celular al baño maría a 37ºC en presencia de 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, y 2 \mug/ml de pepstatina. Tras la adición de PMSF 2 mM, se sometió a la suspensión celular a sonicación vigorosa, y se recogieron las proteínas insolubles por centrifugación. Se resuspendieron dos veces los pellets de proteína en tampón de lisis, resonicaron y recogieron por centrifugación. Se solubilizaron entonces los pellets de proteína por sonicación en tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, cloruro de guanidina 6 M, 2-mercaptoetanol 1 mM), y el material insoluble se eliminó por centrifugación. Las proteínas solubilizadas se pasaron por una columna de 50 ml Ni-quelante (2,6 cm x 12 cm; Pharmacia) que había sido pre-equilibrada con tampón A. Se lavó la proteína unida con 5 volúmenes de lecho de tampón E (tampón A con Triton X-100 2%) y se re-plegaron con un gradiente de cloruro de guanidina-cloruro sódico (NaCl 0,1 M/cloruro de guanidina 6,0 M; 5 volúmenes de lecho en presencia de Triton X-100 1%. La proteína re-plegada se lavó con 5 volúmenes de lecho) de tampón F (Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, glicerol 15%, Triton X-100 2%, 2-mercaptoetanol 1 mM) y a continuación con 5 volúmenes de lecho de tampón G (tampón F sin Triton X-100) para eliminar el Triton X-100. La columna se lavó posteriormente con 5 volúmenes de lecho de tampón H (imidazol 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, glicerol 15%, 2-mercaptoetanol 1 mM) para eliminar proteínas débilmente unidas. Se eluyó la proteína E7 con un gradiente lineal de imidazol (imidazol de 50 mM a 1 M en tampón H). La proteína E7 se concentró y dializó frente a solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato y suplementada con glicerol 25%. Se guardó la proteína soluble a -70ºC. La preparación de E7 se comprobó que era esencialmente homogénea utilizando SDS-PAGE y tinción de proteínas.
Las concentraciones de endotoxina de las preparaciones de proteínas se evaluaron utilizando el test del amebocito de Limulus y se halló que no eran superiores a 50 unidades de endotoxina por miligramo de proteína.
Se inmunizaron grupos de 5 ratones C57BL/6 por inyección en la base de la cola con solución salina, o con 0,055, 0,55 ó 1,8 nanomoles de proteína E7 o proteína de fusión Hsp65-E7 en solución salina. Los volúmenes de inyección fueron de 0,2 ml. Diez días después, se extirparon asépticamente los nódulos linfáticos inguinales (NL) de cada animal, y se agruparon los NL de cada uno de los cinco animales de cada grupo. Se prepararon suspensiones celulares por procedimiento estándar. Para cada pool de células NL (2 x 10^{6} células/ml), se sembraron placas de fondo plano de 96 pocillos con 4 x 10^{5} células por pocillo. Se examinaron las células por triplicado para comprobar las respuestas proliferativas a la adición de cada medio, 10 ó 50 \mug/ml de proteína E7, 10 ó 100 \mug/ml de proteína de fusión Hsp65-E7, ó 1 ó 10 \mug/ml de péptido E7 ("pep": residuos 44-57). Tras las adiciones, se incubaron las células durante cuatro días a 37ºC y 5% de CO_{2}. Se añadió timidina tritiada (1 \muCi) a cada cultivo. Tras 15 horas más de incubación, las células se recogieron y prepararon para el conteo de centelleo. Los datos se presentan en la figura 10, como cpm medios de radioactividad incorporada +/- desviación estándar.
Los diferentes paneles muestran ensayos con células NL de animales inmunizados con las diferentes cantidades de proteína de fusión Hsp65-E7 o de proteína E7, cantidades ya citadas anteriormente. Los resultados muestran que la inmunización con proteína de fusión Hsp65-E7 inducen inmunidad celular frente a la proteína de fusión misma (arriba y en medio-izquierda) así como frente a la proteína E7 (en medio-izquierda). El reconocimiento de la proteína E7 queda aún más demostrada por la inducción observada en la proliferación del péptido E7, péptido que se sabe que representa un epítopo de célula T ayudante (en medio-izquierda). En contraste, no se observaron respuestas proliferativas con células NL de animales inmunizados con diferentes cantidades de proteína E7 (en medio-derecha y abajo) o falsos-inmunizados con solución salina. Las células preparadas de animales inmunizados con proteína E7 eran viables, como evidencia su capacidad para proliferar en respuesta al mitógeno ConA de célula T. En resumen, cuando se compara la inmunización con E7, la inmunización con proteína de fusión Hsp65-E7 provoca una respuesta inmunológica celular a E7 superior, medida a partir de la proliferación de células NL de animales inmunizados.
Ejemplo 10 El tratamiento con proteína de fusión Hsp65-E7 causa la regresión de tumores establecidos de tamaño considerable
Para examinar la eficacia de la proteína de fusión Hsp65-E7 en la terapia tumoral, se inocularon ratones C57/BL/6 con 1,3 x 10^{5} células tumorales TC-1 por inyección subcutánea en áreas afeitadas de la espalda. Siete días después, cuando todos los animales habían desarrollado tumores palpables/medibles, se asignaron arbitrariamente a todos los animales tres grupos de tratamiento. Cada grupo incluía 12-14 animales. Todos los tratamientos fueron por inyección subcutánea de un volumen de 0,2 ml en la nuca. El primer grupo recibió inyecciones de 100 \mug de proteína de fusión Hsp65-E7, el segundo grupo recibió 20 \mug de proteína E7 (correspondiente a una cantidad molar similar a los 100 \mug de proteína de fusión), y el tercer grupo recibió solución salina. Un día después de la inoculación de tumores, se inspeccionaron visualmente y por palpación los ratones para la presencia de tumores. Se determinaron los volúmenes de los tumores utilizando calibradores en dos direcciones ortogonales. Se obtuvieron los volúmenes a partir de estas medidas utilizando las fórmulas de conversión descritas en Naito y otros, Cancer Research 46:4109 (1986). Los resultados se presentan en la figura 11 como volumen tumoral medio en cada grupo +/- error estándar.
Los resultados demuestran que el tratamiento con proteína de fusión Hsp65-E7 resultó en la completa regresión de tumores establecidos de tamaño considerable. El efecto fue manifiesto en cada uno de los animales tratados. En contraste, ni el tratamiento en falso ni el tratamiento con proteína E7 causó más que una regresión transitoria de los tumores. Se presenta en la Tabla 2 una evaluación estadística de las medidas de los tumores, realizada en tres momentos tardíos del experimento. Como evidencian los valores de p calculados, los efectos sobre el tamaño tumoral del tratamiento con proteína de fusión Hsp65-E7 son estadísticamente diferentes de los efectos con los otros tratamientos.
TABLA 2 Comparación estadística de los grupos de tratamiento
Comparación Día de la medida Valor de p
Solución salina vs. Hsp65-E7 30 0,048
33 0,079
35 0,046
Solución salina vs. E7 30 0,853
33 1
35 0,86
Nótese que en los Ejemplos previos, la proteína Hsp65-E7 había sido producida como proteína marcada con histidina. Para demostrar sin ambigüedades que los efectos terapéuticos observados no se relacionan de modo alguno con la presencia en la proteína de fusión de una secuencia oligo-histidina, se preparó proteína de fusión Hsp65-E7 sin marca de histidina y se utilizó en este Ejemplo. Se obtuvo la proteína de fusión utilizando el procedimiento siguiente.
Para la construcción de plásmido ET65C (figura 12), se amplificó el gen hsp65 de Bacillus Calmette Guerin (BCG) desde el plásmido RIB 1300 (Van Eden y otros, Nature 331:171, 1988) utilizando ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). El cebador delantero utilizado (5'-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG-3') contenía un sitio NdeI que incluía el codón de inicio ATG del gen hsp65, y el cebador reverso (5'-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT GCC-3') contenía un sitio NdeI inmediatamente más abajo del codón de paro TGA de la secuencia de codificación de Hsp65 y un sitio NheI inmediatamente corriente abajo. El producto PCR se digerió con NcoI y NheI, se purificó en un gel agarosa, y se ligó a pET28a digerido de manera similar. La mezcla de ligación se transformó en E. coli DH5alfa, y se aislaron las colonias resistentes a antibiótico y se amplificaron para la preparación de plásmido ADN. El plásmido ET65C se identificó por digestiones de restricción diagnóstica y análisis de secuencias de ADN.
Para preparar el plásmido ET65C/E7-1N que contenía un gen de proteína de fusión Hsp65-E7 sin marca, se amplificó el gen E7 a partir de ADN genómico de PVH 16 (se obtuvo pSK/PVH16 de la "American Tissue Culture Collection" ["Colección americana de cultivos de tejidos"] utilizando ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). El cebador "forward" (5'-CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3') contenía un sitio NdeI que incluía un codón de inicio ATG, mientras que el cebador reverso (5'-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3') contenía un sitio EcoRI inmediatamente corriente debajo de un codón de parada TAA de la secuencia que codifica para E7. El producto PCR se digerió con NdeI y EcoRI, se purificó en gel agarosa, y se ligó a pET65C que había sido digerido con los mismos enzimas de restricción. Se llevó a cabo la transformación de las bacterias, aislamiento de colonias que contenían recombinantes, y preparación de plásmido ADN de las colonias expandidas, utilizando procedimientos estándar. Ver, por ejemplo, Ausubel y otros (eds.), Short Protocols in Molecular Biology ["Protocolos breves en biología molecular"], 3ª edición (John Wiley & Sons, Inc. 1995). Se confirmó la identidad del constructo plásmido resultante, pET65C/E7-1N por digestión de restricción diagnóstica y análisis de secuencias de ADN. Se presentó un mapa esquemático de pET65C/E7-1N en la figura 13.
Se inocularon doce litros de medio 2xYT con 30 \mug/ml de kanamicina con un cultivo de E. coli BL21(DE3) que contenía pET65C/E7-1N y se incubó durante la noche a 30ºC con aireación. Al alcanzar una densidad óptica de 0,5, se indujo al cultivo con IPTG 0,5 mM durante tres horas. Se recogieron entonces las células por centrifugación, resuspendieron en 180 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 0,5 mM) suplementado con 200 \mug/ml de lisozima y se congeló a -70ºC durante la noche. Se descongelaron las suspensiones celulares al baño maría a 37ºC en presencia de 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, y 2 \mug/ml de pepstatina. Tras la adición de PMSF 2 mM, se sometió a las suspensiones celulares a sonicación vigorosa, y se eliminaron las proteínas insolubles por centrifugación. La mayor parte de proteína Hsp65-E7 sin marcar se halló que estaba en la fracción proteica soluble. Para eliminar las endotoxinas, se añadió Triton X-114 1% a la fracción proteica soluble, y se enfrió la mezcla en hielo (durante 5 minutos o más) y se mezcló concienzudamente. La mezcla se calentó entonces durante 10 minutos al baño maría a 30ºC y se sometió a centrifugación a 24ºC. La fracción clarificada sobrenadante (capa superior) se transfirió a un tubo limpio. Se repitio la centrifugación 3-6 veces para eliminar el Triton X-114 residual. Se sometió entonces a la fracción sobrenadante a fraccionamiento de sulfato amónico. Se recuperó la proteína de fusión en la fracción 0-15% de sulfato amónico (p/v). Se disolvió la proteína precipitada en tampón B (Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, urea 3 M, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM) y se pasó por una columna de 170 ml Source Q (3,5 cm x 20 cm; Pharmacia) pre-equilibrada con tampón B. Se lavó la columna con 3 volúmenes de lecho de tampón C (tampón B menos urea) y entonces con 3 volúmenes de tampón D (tampón C suplementado con NaCl 250 mM). Se eluyó la proteína de fusión con un gradiente lineal salino (NaCl 250 mM-1 M en tampón C) (pool A) y a continuación con cloruro de guanidina 6 M (tampón A)(pool B). Se pasó entonces el pool B por una columna de 50 ml Ni-quelante (2,6 cm x 12 cm; Pharmacia) pre-equilibrada con tampón A. Se lavó la proteína unida con 5 volúmenes de lecho de tampón E (tampón A con Triton-X-100 2%) y se re-plegó con un gradiente de cloruro de guanidina-cloruro sódico (NaCl 0,1 M/cloruro de guanidina 6,0 M; 5 volúmenes de lecho) en presencia de Triton X-100 1%. La proteína re-plegada se lavó con 5 volúmenes de lecho de tampón F (Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, glicerol 15%, Triton X-100 2%, 2-mercaptoetanol 1 mM) y a continuación con 5 volúmenes de lecho de tampón G (tampón F sin Triton X-100) para eliminar el Triton X-100. Se lavó una vez más la columna con 5 volúmenes de lecho de tampón H (imidazol 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, glicerol 15%, 2-mercaptoetanol 1 mM) para eliminar las proteínas débilmente unidas. Se eluyó la proteína de fusión con un gradiente lineal de imidazol (imidazol 50 mM a 1 M en tampón H). La proteína Hsp65-E7 sin marcar se concentró y dializó frente a solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato y suplementada con glicerol 25%. Se guardó la proteína soluble a -70ºC. El análisis por SDS-PAGE y tinción de proteínas reveló que la preparación tenía una pureza aproximada del 90%.
Como demostración adicional de la no relevancia de la marca histidina, se compararon directamente las eficacias de Hsp65-E7 marcada con histidina y Hsp65—E7 sin marcar en un experimento sustancialmente idéntico al descrito anteriormente. Se encontró que las dos proteínas de fusión provocaban la regresión de tumores con eficacias similares.
Equivalentes
Los expertos en la técnica podrán conocer, o serán capaces de asegurar, utilizando exclusivamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento. Éstos y todos los demás equivalentes se pretende que se hallen incluídos en las reivindicaciones siguientes.

Claims (14)

1. Proteína de fusión que comprende el antígeno proteico HPV 16 E7 y la proteína M. Bovis BCG Hsp65, siendo codificada por un plásmido que se puede obtener por el siguiente proceso:
(a)
amplificar el gen de M. Bovis BCG hsp65 contenido en el plásmido RIB 1300 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5'-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG-3' y un cebador inverso que tiene la secuencia 5'-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT GCC-3';
(b)
digerir el producto amplificado con NcoI y NheI;
(c)
purificar el producto amplificado;
(d)
ligar el producto amplificado a un plásmido digerido con NcoI y NheI;
(e)
amplificar el gen E7 del ADN genómico de HPV 16 contenido en el plásmido pSK/HPV16 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5'-CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3' y un cebador inverso que tiene la secuencia 5'-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3';
(f)
digerir el producto amplificado con NdeI y EcoRI;
(g)
purificar el producto amplificado; y
(h)
ligar el producto amplificado a dicho plásmido obtenido en la etapa (d) digerido con NdeI y EcoRI.
2. Molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.
3. Molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 2, que comprende además un vector de expresión.
4. Molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 3, en la que el vector de expresión es un vector de adenovirus o un vector vírico adeno-asociado.
5. Molécula de ácido nucleico, según la reivindicación 3, en la que el vector de expresión es un vector retrovírico.
6. Compuesto que incluye la proteína de fusión de la reivindicación 1.
7. Compuesto, según la reivindicación 6, en el que la proteína induce una respuesta inmune celular.
8. Compuesto, según la reivindicación 6, en el que la proteína induce una respuesta inmune humoral.
9. Compuesto, según la reivindicación 6, que comprende además un coadyuvante, un tensoactivo, un excipiente, un portador o un diluyente.
10. Compuesto, según la reivindicación 6, para inducir una respuesta inmune contra el antígeno de la proteína HPV.
11. Utilización del compuesto de la reivindicación 6, para la fabricación de un medicamento para inducir respuesta inmune contra un antígeno de la proteína HPV.
12. Compuesto que comprende un vector de expresión para inducir una respuesta inmune contra un antígeno de la proteína HPV 16 E7, en el que el vector de expresión comprende una secuencia que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.
13. Compuesto, según la reivindicación 12, en el que el vector de expresión es un vector de adenovirus o un vector vírico adeno-asociado.
14. Compuesto, según la reivindicación 12, en el que el vector de expresión es un vector retrovírico.
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