ES2266652T3 - Respuestas inmunologicas contra los antigenos de hpv provocadas por compuestos que contienen un antigeno de hpv y una proteina de stress o un vector de expresion capaz de expresar dichas proteinas. - Google Patents
Respuestas inmunologicas contra los antigenos de hpv provocadas por compuestos que contienen un antigeno de hpv y una proteina de stress o un vector de expresion capaz de expresar dichas proteinas. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína de fusión que comprende el antígeno proteico HPV 16 E7 y la proteína M. Bovis BCG Hsp65, siendo codificada por un plásmido que se puede obtener por el siguiente proceso: (a) amplificar el gen de M. Bovis BCG hsp65 contenido en el plásmido RIB 1300 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5¿-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG-3¿ y un cebador inverso que tiene la secuencia 5¿-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT GCC-3¿; (b) digerir el producto amplificado con Ncol y Nhel; (c) purificar el producto amplificado; (d) ligar el producto amplificado a un plásmido digerido con Ncol y Nhel; (e) amplificar el gen E7 del ADN genómico de HPV 16 contenido en el plásmido pSK/HPV16 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5¿- CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3¿ y un cebador inverso que tiene la secuencia 5¿-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3¿; (f) digerir el producto amplificado con Ndel y EcoRI; (g) purificar el producto amplificado; y (h) ligar el producto amplificado a dicho plásmido obtenido en la etapa (d) digerido con Ndel y EcoRI.
Description
Respuestas inmunológicas contra los antígenos de
HPV provocadas por compuestos que contienen un antígeno de HPV y una
proteína de estrés o un vector de expresión capaz de expresar dichas
proteínas.
La presente invención se refiere de manera
general a los métodos y composiciones que involucran proteínas de
estrés ligadas y proteínas antigénicas de papilomavirus humanos para
la inducción de respuesta inmune contra las proteínas antigénicas de
papilomavirus humanos.
La infección por papilomavirus humano (PVH) es
común, y el virus puede ser transmitido sexualmente. Se estima que
entre 20 y 80% de los adultos activos sexualmente se encuentran
infectados. Aún cuando la mayor parte de las infecciones son
asintomáticas, la infección puede llevar al desarrollo de verrugas
genitales y cáncer del tracto anogenital. Las verrugas genitales
tienen una frecuencia de 1-5% entre adultos.
Alrededor de un uno por ciento de las mujeres en todo el mundo
sufren cáncer cervical, el cual es la causa más común de muerte en
mujeres de menos de 50 años. El cáncer cervical está íntimamente
asociado con el PVH. Frazer, Genitourin Med
72:398-403 (1996).
En la actualidad, no se dispone de composiciones
terapéuticas o profilácticas efectivas, es decir, vacunas contra el
PVH, y hay, por tanto, una necesidad para el desarrollo de
composiciones eficaces. Las expectativas de encontrar una vacuna
muerta convencional o una vacuna viva atenuada son pocas. Según
Frazer, el PVH no se ha podido propagar todavía en cultivos
celulares, y los efectos de promotor de tumor de la infección por
PVH así como la especificidad del PVH para especies completas
representan dificultades adicionales que no son fácilmente
superables (Frazer, Genitourin Med 72:398-403
(1996)). Se ha propuesto que la observación de que las proteínas de
cápsida principales, al expresarse en células eucarióticas, forman
partículas viroides que son inmunogénicas sin adyuvante, puede
proporcionar una base para el desarrollo de una vacuna (Christensen
y otros, J Gen Virol 75:2271-6 (1994); ver
también PCT/EP95/03974 y PCT/US95/12914).
El PVH pertenece al género A de la familia
papovaviridae, la cual también incluye al SV40 y a los poliomavirus.
Se han caracterizado más de 68 tipos diferentes de PVH, los cuales
están estructuralmente muy relacionados pero que comparten menos de
un 50% de sus secuencias de ADN. Todos los tipos conocidos son virus
epiteliotrópicos que infectan tipos específicos de epitelio y que
frecuentemente producen proliferaciones epiteliales. Se
identificaron varios tipos en verrugas comunes. Se conocen
veintitrés tipos que infectan el tracto anogenital masculino y
femenino. Las enfermedades anogenitales causadas por estos tipos de
PVH van desde Condylomata acuminata a carcinoma celular
escamoso invasivo. Se confirma la presencia de ADN de PVH en más de
80% de las mujeres con lesiones escamosas intraepiteliales o
neoplasias intraepiteliales del cerviz confirmadas por biopsia.
Algunos casos particulares, entre ellos el PVH 16, 18, y 31, están
muy ligados con lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado y
cáncer invasivo del cerviz, vulva, pene y ano (Lorincz y otros,
Obstet Gynecol 79:328-37 (1992)). Según
Frazer, el cáncer cervical está asociado en un
90-95% con PVH. Frazer, Genitourin Med
72:398-403 (1996). El PVH no está sólo asociado
con cáncer del sistema anogenital, sino que también está presente en
carcinomas faríngeos, laríngeos y de la vejiga (Brachman y otros,
Cancer Res 52:4832-6 (1992); Rotola y otros,
Int J Cancer 52:359-65 (1992)). Un estudio
reciente informó que el ADN de PVH se encuentra también presente en
el 30% de carcinomas de pulmón examinados. Los tipos identificados
incluían PVH 6, 11, 16, 18, 31 y 33 (Soini y otros, Thorax
51:887-893 (1996)). Por tanto, los tipos de PVH que
con mayor frecuencia se asocian con cáncer son el 6, 11, 16, 18, 31
y 33, de los cuales los PVH 16 y 18, detectados en más de un 90% de
los carcinomas cervicales (van Driel y otros, Ann Med
28:471-477 (1996)), son los que se han investigado
en mayor profundidad.
Los papilomavirus son virus ADN con un genoma de
ADN circular de doble hebra de 7800 a 7900 pares de bases, un virión
sin envoltura y una cápsida icosaédrica de 72 capsómeros. El genoma
contiene tres regiones principales, una codifica para genes tardíos,
otra codifica para genes tempranos y otra región no codifica (Park y
otros, Cancer 76:1902-1913 (1995)). La región
no codificante también se denomina región reguladora de la línea de
entrada. Esta región tiene una longitud de unos 400 pares de bases y
contiene una serie de sitios de unión para los diversos factores de
transcripción que controlan la expresión de genes tempranos y
tardíos. La región de genes tardíos presenta dos marcos separados de
lectura abierta que codifican proteínas virales de la cápsida L1 y
L2. La proteína L1 es la proteína de cápsida más importante de las
que están altamente conservadas entre diferentes especies de PVH. La
región de genes tempranos incluye seis marcos de lectura abierta,
denominados E1, E2, E4, E5, E6 y E7. Las proteínas E6 y E7 son
oncoproteínas críticas en la replicación viral, así como para la
inmortalización y transformación de la
célula-huésped. Las proteínas E1, E2 y E4 también
desempeñan un importante papel en la replicación vírica. Además, la
E4 actúa durante la maduración del virus. El papel de E5 es menos
conocido.
Las células de los tumores malignos compartan
dos características de crecimiento. Son inmortales, o sea, no
envejecen, y son capaces de crecimiento sin dependencia de anclaje.
La introducción de ADN de PVH 16 o PVH 18 en células inmortalizadas
de roedor resulta en su transformación, es decir, adquieren la
capacidad de crecer en ausencia de sustratos de anclaje y la
capacidad para formar tumores al inyectarlas en ratones (Crook y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8820-24
(1988)). Se obtiene un resultado diferente cuando se introducen los
ADNs de PVH en células jóvenes ("early pasagge") no
inmortalizadas: las células se hacen inmortales pero no se
transforman (Woodworth y otros, Cancer Res.
48:4620-28 (1988)). Así, un camino por el cual se
desarrolla un tumor, involucra un cambio que resulta en la
inmortalización de células seguida de la expresión de genes del PVH
que resultan en su transformación. Los genes de PVH involucrados en
la transformación de células in vitro son aquéllos que
codifican para la E6 y/o E7 (Bedell y otros, J Virol
61:3635-40 (1987)). Ya se han propuesto mecanismos
por los que las proteínas E6 y E7 pueden causar la transformación
celular (Park y otros, Cancer 76:1902-1913
(1995) y referencias citadas en la misma publicación).
E6 es un polipéptido pequeño (aproximadamente
15.000 de PM) que contiene dominios para la unión de Zn. Una pista a
su función transformadora la proporcionó la observación de que la
proteína se une a p53. La proteína p53 es una proteína supresora de
tumores bien conocida que regula negativamente la progresión del
ciclo celular y, en consecuencia, el crecimiento y división
celulares. La unión de E6 a p53 resulta en la ubiquinación y
posterior degradación de la última proteína, proceso que involucra
otra proteína celular denominada "proteína
E6-asociada". En consecuencia, las células que
expresan la E6 tendrán un nivel basal reducido de p53. Los niveles
de p53 se elevan en respuesta al daño al ADN. Tales niveles elevados
resultan en un aumento en la expresión de p21, el cual es un
inhibidor de quinasas ciclina-dependientes, cuya
proteína interviene en la detención del ciclo celular. Este
mecanismo proporciona a las células una ventana de tiempo durante la
cual pueden reparar ADN dañado antes de que empiece a replicarse,
lo que resultaría en la producción de un daño/mutación. El
incremento de producción de p53 mediado por E6 puede evitar que
opere este mecanismo. Recientemente, también se ha encontrado que
E6 afecta no sólo a la regulación del ciclo celular por aceleración
de la degradación de la p53, sino también, más directamente, por
bloqueo de la interacción de la p53 con el ADN (Thomas y otros,
Oncogene 10:261-8 (1995)).
La proteína E7 es una fosfoproteína pequeña
(aproximadamente 10.000 de PM) que se une a Zn, y es capaz de
unirse al producto Rb del gen del retinoblastoma. El Rb es un
supresor de tumor que se une al factor de transcripción E2F e
inactiva al mismo. El último factor controla la transcripción de un
número de genes relacionados con el crecimiento celular, entre
ellos los que codifican la timidina quinasa, c-myc,
dihidrofolato reductasa y ADN polimerasa alfa. La formación del
complejo Rb-E2F previene la expresión de los genes
mencionados en las fases G0 y G1, restringiendo su expresión a la
fase S, en la que los complejos Rb-E2F están
programados para disociarse, liberando el factor de transcripción
E2F activo. La formación de complejos Rb-E7 previene
la formación de complejos Rb-E2F con el resultado
de un acortamiento de las fases pre-S, es decir, se
acelera la progresión a través del ciclo celular. Son evidencia
correlativa de la importancia de estos mecanismos, las
observaciones de que las proteínas E6 de tipos PVH altamente
oncogénicos (por ejemplo, los PVHs 16 y 18) tienen afinidades más
elevadas con p53 que las proteínas correspondientes de tipos no
oncogénicos, y que las proteínas E7 de tipos altamente oncogénicos
tienen afinidades más elevadas con el Rb que las proteínas
correspondientes de tipos no oncogénicos.
En la mayoría de los cánceres cervicales y
lesiones precursoras, el ADN del PVH está integrado en el genoma de
la célula-huésped (Cullen y otros, J Virol.
65:606-12 (1991)). Parece que en muchos casos, la
integración involucra la rotura del ADN genómico del PVH en la
región E1/E2, dejando a la región E6/E7 intacta. Una consecuencia
de la rotura en la región E1/E2 es una interrupción del marco de
lectura abierta que codifica para dos proteínas E2 diferentes, la
más pequeña de las cuales funciona como represor transcripcional de
expresión génica temprana. Esto conduce a una regulación positiva
de la expresión de E6 y E7.
La presente invención se refiere a composiciones
para la inducción de una respuesta inmunológica contra un antígeno
proteico del PVH en un sujeto al que se le administran. La respuesta
inmunológica puede ser una respuesta humoral o celular, en
particular, una respuesta citolítica mediada por células a un
antígeno proteico del PVH. Las composiciones pueden utilizarse
profiláctica o terapéuticamente. En una aplicación profiláctica, la
inducción de una respuesta inmunológica se refiere a la producción
de respuestas inmunes sobre un fondo muy reducido de inmunidad
inherente. En una aplicación terapéutica, la inducción de una
respuesta inmunológica en un sujeto se refiere a la generación de
respuestas que exceden, o en magnitud o en calidad, a las respuestas
previamente provocadas por el contacto con antígenos proteicos del
PVH mostrados o por el virus o por células infectadas o
transformadas del sujeto. En realizaciones particulares, las
composiciones se utilizan para generar respuestas inmunológicas a
células tumorales que expresan y muestran antígenos proteicos del
PVH. En estas realizaciones, los antígenos proteicos del PVH
preferentes que son dianas de las composiciones, son las proteínas
virales tempranas E6 y E7, las cuales se sabe que son
consistentemente expresadas en tumores asociados al PVH. En una
realización, las composiciones comprenden un antígeno proteico del
PVH unido a una proteína de shock (o proteína de shock térmico
(Hsp)). El antígeno proteico del PVH puede unirse a la proteína de
estrés por conjugación química, o pueden unirse el antígeno y
proteína de estrés a nivel de nucleótido, permitiendo la expresión y
aislamiento de una proteína de fusión que contenga tanto las
secuencias del antígeno como de la proteína de estrés. Las
composiciones pueden administrarse a un sujeto o utilizarse ex
vivo para estimular y/o causar la expansión del número de
células inmunitarias de un sujeto que atacan o intermedian en el
ataque contra el PVH o contra células, incluyendo células
tumorales, que muestran un antígeno proteico del PVH. Las
composiciones son eficaces en la estimulación de una respuesta
inmunológica cuando se administran como soluciones proteicas no
particuladas (por ejemplo, no como parte de un virus o partícula
viroide) en ausencia de adyuvante.
En otra realización, las composiciones
comprenden un vector de expresión que incluye secuencias
nucleotídicas que codifican para un antígeno proteico de PVH y una
proteína de estrés. El vector de expresión comprende además
elementos de secuencia que dirigen la transcripción y traducción de
las secuencias codificantes y puede también incluir elementos que
facilitan la entrega y persistencia o amplificación de ácidos
nucleicos en células de un sujeto. El vector de expresión puede
introducirse en células de un sujeto, o puede utilizarse para
transducir células de un sujeto ex vivo, resultando en la
expresión de una proteína de fusión antígeno proteico del
PVH-proteína de estrés, que inducirá una respuesta
inmunológica contra los antígenos proteicos del PVH.
La presente invención también se refiere a
composiciones que comprenden un antígeno proteico del PVH unido a
una proteína de estrés en combinación con otro componente
farmacológicamente aceptable. En otra realización, la composición
comprende un conjugado que comprende una proteína de estrés unida a
un antígeno proteico del PVH. En otra realización, la composición
comprende una proteína de fusión (por ejemplo, proteínas expresadas
desde pET65HE6 Y pET65HE7) en la que la proteína de estrés está
fusionada a un antígeno proteico del PVH. Los conjugados y
proteínas de fusión de estas composiciones también se reivindican
como vectores de expresión que codifican para, y son capaces de
dirigir la expresión de una proteína de fusión que comprende una
proteína de estrés y una secuencia de antígeno proteico del PVH en
las células de un sujeto.
La presente invención se refiere también a los
usos de las composiciones para potenciar las respuestas
inmunológicas contra los antígenos proteicos del PVH y, en
realizaciones particulares, contra los tumores que muestran
antígenos proteicos del PVH. Los artículos de la literatura
científica y solicitudes de patente citados en este documento,
especialmente aquéllos que se refieren a la preparación y uso de
composiciones de la invención, se incorporan por referencia en su
totalidad.
La figura 1 es una representación esquemática
del constructo pET65H.
La figura 2 es una representación esquemática
del constructo pET65HE6.
La figura 3 es una representación esquemática
del constructo pET65HE7.
La figura 4 es un gráfico del porcentaje de
incidencia de tumores frente a tiempo tras la acción tumoral de
TC-1, que demuestra la inmunización exitosa de
ratones con Hsp65-E6 y proteínas de fusión -E7
contra el tumor.
La figura 5 es un gráfico del porcentaje de
lisis celular específica de células tumorales TC-1,
frente a la proporción de células efectoras con respecto a células
diana, que demuestra la respuesta citolítica mediada por células
contra células tumorales diana que expresan antígeno (E7) del PVH en
ratones inmunizados.
La figura 6 es un gráfico del porcentaje de
lisis de diferentes células diana frente a la proporción de células
efectoras con respecto a células diana, que demuestra la
especificidad de la respuesta inmunológica citolítica mediada por
células frente a células tumorales diana que expresan E7 del PVH en
ratones inmunizados.
La figura 7 es un gráfico del porcentaje de
incidencia de tumores en ratones en los que se ha administrado
1,3x10^{5} células tumorales TC-1 y se les ha
inyectado posteriormente solución salina de proteína de fusión
Hsp65-E7 o péptido E7 en IFA/solución salina frente
a días tras la administración de células tumorales.
La figura 8 es un gráfico de porcentaje de
incidencia de tumores en ratones a los que se les ha administrado
2x10^{5} células tumorales TC-1 y posteriormente
se les ha inyectado solución salina de proteína de fusión
Hsp65-E7 o péptido E7 en IFA/solución salina frente
a días tras la administración de células tumorales.
La figura 9 es una representación esquemática
del constructo pET/E7(H).
La figura 10 es un conjunto de gráficos que
muestra la incorporación de timidina de un cultivo de células de
nódulo linfático obtenido de ratones inmunizados con proteína de
fusión Hsp65-E7 o proteína E7.
La figura 11 es una gráfico que muestra el
efecto del tratamiento con proteína de fusión Hsp-E7
o con E7 sobre el tamaño de tumor en ratones con células tumorales
TC-1.
La figura 12 es una representación esquemática
del constructo pET65C.
La figura 13 es una representación esquemática
del constructo pET65C/E7-1N.
La presente invención se refiere a composiciones
que inducen una respuesta inmunológica en el sujeto frente a
papilomavirus humano de células del sujeto que muestran un antígeno
proteico de un PVH. En una realización, las composiciones
comprenden un antígeno proteico del PVH y una proteína de estrés. En
otra realización, las composiciones comprenden un vector de
expresión capaz de dirigir la expresión de una proteína de fusión
antígeno proteico de PVH-proteína de estrés.
Las composiciones de la presente invención
pueden utilizarse de manera profiláctica para elevar la inmunidad
frente a un antígeno proteico de PVH, previniendo el establecimiento
y proliferación del PVH o de células de un sujeto que expresan y
muestran el antígeno proteico del PVH o presenta partes del mismo.
Las composiciones también pueden utilizarse terapéuticamente en un
sujeto previamente infectado con un PVH para prevenir la
proliferación viral posterior o para eliminar células del sujeto que
proliferan como consecuencia de una infección por PVH, incluyendo
tumores que expresan y muestran un antígeno del PVH o presentan una
parte del antígeno. Cuando se hace referencia en este documento a
un antígeno proteico del PVH como diana de la respuesta inmunológica
inducida por una composición de la presente invención, el antígeno
proteico del PVH se entiende que incluye una proteína del PVH
completa o una parte polipeptídica (peso molecular mayor que 10 kDa)
de la proteína del PVH que es mostrada sobre la superficie del PVH o
una célula infectada de un sujeto así como péptido mostrado por una
célula infectada como resultado del procesado y presentación de una
proteína del PVH, por ejemplo, a través de las trayectorias típicas
MCH clase I ó II.
Se clonaron y caracterizaron por análisis de
secuencias de ADN las secuencias genómicas de muchos tipos
diferentes de PVH. Se dispone de vectores bacterianos que contienen
genomas completos o partes de genoma de PVH, procedentes de diversas
fuentes, entre ellas, por ejemplo, la American Type Culture
Collection (ATCC, ["Colección Americana de Cultivos Tipo"]).
Pueden aislarse y tipificarse otros tipos de PVH que resultan útiles
para la puesta en práctica de la presente invención, por métodos que
son bien conocidos en la técnica.
El PVH expresa seis o siete proteínas no
estructurales y dos estructurales, y cada una de estas proteínas
podría, en principio, servir como diana para las aproximaciones
inmunoprofilácticas o inmunoterapéuticas destinadas a la
eliminación de PVH y/o células infectadas. Las proteínas virales de
cápsida L1 y L2 son las proteínas estructurales de PVH codificadas
por genes tardíos. L1 es la principal proteína de cápsida que se
halla altamente conservada entre diferentes especies de PVH. Las
siete proteínas no estructurales son productos de los genes virales
tempranos. Las proteínas E1, E2 y E4 desempeñan un importante papel
en la replicación vírica. La proteína E4 actúa además durante la
maduración de los virus. El papel de E5 es menos conocido. Las
proteínas E6 y E7 son oncoproteínas críticas para la replicación
vírica así como para la inmortalización y transformación de la
célula-huésped. Estas proteínas, las cuales pueden
ser incorporadas en las composiciones de la presente invención, se
denominan antígenos proteicos de PVH.
Es de particular importancia en la aplicación de
la presente invención al tratamiento profiláctico y terapéutico de
cánceres asociados a PVH, la observación de que las proteínas de
PVH, E6 y E7 son consistentemente expresadas en cánceres cervicales
(Zur Hausen, Appl. Pathol. 5:19-24 (1987);
Pater and Pater, Virology 145:313-8 (1985)).
Kinoshita y otros, Br. J. Cancer 71:344-9
(1995)) han demostrado que los genes de E6 y E7 también son
expresados en el carcinoma pulmonar. Además, se advirtieron algunas
respuestas inmunológicas (humorales) naturales a la E7 en pacientes
con cáncer cervical (Jochmus-Kudielka y otros, J.
Nat'l Cancer Inst. 81:1698-704 (1989)).
Finalmente, estudios de modelización han demostrado que la
inmunización con una proteína modificada E7 protege a ratones
contra agresiones con células pulmonares transformadas con un gen
c-Ha-ras activado y genes E6/E7 de
PVH (Lin y otros, Cancer Res. 56:21-26
(1996)). Desde los puntos de vista de que estas proteínas son
típicamente expresadas en cánceres que son consecuencia de
infección por PVH, de que las mismas proteínas son también los
oncogenes que con mayor probabilidad desempeñaron un papel principal
en el desarrollo y mantenimiento de los cánceres, y de que una
respuesta inmunológica puede dirigirse contra estas proteínas, E6 y
E7 son dianas preferentes en la inmunointervención o profilaxis, y,
por tanto, son los antígenos proteicos de PVH preferentes de las
composiciones de la presente invención para la prevención o
tratamiento de cáncer asociado a PVH.
Se ha demostrado en varios modelos animales que
péptidos de célula T citotóxica (CTL) pueden inducir inmunidad
protectora contra ciertos virus (Kast y Melief, Immunol.
Lett. 30:229 (1991)). Se ha observado que los individuos
inmunosuprimidos desarrollan más a menudo carcinoma cervical que
individuos inmunocompetentes (Schneider y otros, Acta
Cytologica 27:220-4 (1983)). Esto sugiere
poderosamente que el brazo celular del sistema inmunitario, en
particular el sistema de células T, es de importancia fundamental en
la defensa inmunológica contra malignidad asociada a PVH. La
evidencia de soporte de la importancia de una respuesta CTL en la
producción de inmunidad protectora contra células E6- y E7
transformadas, procede de un experimento en el que ratones vacunados
con un epítopo CTL relevante de la E7 del PVH 16 estaban protegidos
contra tumores transplantables inducidos por el PVH 16 (Feltkamp y
otros, Eur. J. Immunol. 23:2242 (1993)). La presente
invención se basa en nuestra observación de que la unión de una
proteína de estrés a un antígeno proteico de PVH resulta en una
composición que estimula fuertemente respuestas celulares, en
particular respuestas citolíticas mediadas por células, contra el
antígeno proteico de PVH ligado, respuestas que pueden matar las
células que muestran el antígeno de PVH.
Un antígeno proteico de PVH de la presente
invención puede ser cualquier polipéptico codificado por PVH.
Además, puede ser una parte de una proteína de PVH, siempre y
cuando la parte, cuando se encuentre unida a una proteína de
estrés, retenga la capacidad de inducir una respuesta inmunológica
contra el antígeno proteico de PVH mostrado por células infectadas
o mostrado por el PVH. Se pueden producir composiciones de la
invención que comprenden diversas partes de un antígeno del PVH,
antes bien que un antígeno proteico completo de PVH, por métodos
rutinarios tales como aquellos descritos a continuación en este
documento o en libros de texto de biología molecular y bioquímica.
Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
["Clonado molecular: un manual de laboratorio"], 2ª ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M., Guide to
Protein Purification Methods Enzymology ["Guía de enzimología
de métodos de purificación de proteínas"], vol. 182, Academic
Press, Inc., San Diego, CA (1990). Cada composición con una parte
particular de un antígeno proteico de PVH puede examinarse para el
grado y calidad de la respuesta inmunológica contra el antígeno
proteico de PVH en experimentos tales como aquellos descritos en los
ejemplos descritos a continuación en este documento. Como mínimo, un
antígeno proteico de PVH en una composición de la presente invención
contendrá al menos un epítopo de célula B ó T (por ejemplo, un
epítopo de CTL o de célula T ayudante) de una proteína de PVH.
Cuando se hace referencia a composiciones de la presente invención,
el término "antígeno proteico de PVH" incluye partes de un
antígeno proteico de PVH, siempre y cuando tales partes retengan la
capacidad de inducir una respuesta inmunológica contra el antígeno
proteico de PVH mostrado por células infectadas o mostrado por
PVH.
La E6 y particularmente la E7 son proteínas
transformantes. En composiciones que incluyan como antígeno proteico
de PVH una secuencia proteica completa de proteína E6 ó E7 de PVH,
o una parte suficientemente completa para retener la capacidad
transformante, la naturaleza transformante del antígeno puede o no
representar un riesgo sustancial, dependiendo del método por el que
se fabrique el antígeno de PVH. Por ejemplo, en casos en los que un
antígeno proteico de PVH o una composición que incluya dicho
antígeno se prepare por técnicas recombinantes que lleven asociadas
un cierto riesgo de contaminación del ADN, puede ser prudente el
realizar los pasos necesarios para eliminar la capacidad
transformante del antígeno. Cuando se utilicen composiciones que
incluyan un vector de expresión que dirija la expresión en un
sujeto de proteína de fusión que incluya una secuencia proteica
completa de E6 ó E7 de PVH o una parte suficientemente completa para
retener capacidad transformante, puede ser necesario eliminar las
secuencias que confieren poder transformante al producto proteico.
Se obtuvieron variantes no transformantes de E6 y E7 por fusión de
secuencias de E6 o E7 (PCT/AU95/00868). Por tanto, es posible que
ciertas proteínas de fusión que incluyan secuencias de E6 ó E7 y
secuencias de proteínas de estrés sean ya no transformantes.
Alternativamente, pueden delecionarse selectivamente secuencias de
E6 ó E7 utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, y que
también han sido descritas en PCT/AU95/00868. Las deleciones pueden
hacerse en vectores de expresión de secuencias de E6 ó E7 solamente
o en vectores que expresan proteínas de fusión proteína de estrés
E6 ó E7. Los resultados de dichas manipulaciones pueden evaluarse
mediante la comprobación de la capacidad transformante de proteínas
de deleción en un experimento de transfección. Por ejemplo, las
células NIH3T3 puede ser transfectadas con un vector de expresión
que incluya un gen para una proteína de deleción, y la capacidad
transformante puede estimarse por un ensayo de formación de colonias
en ágar blando. Este test o prueba particular también se describe en
PCT/AU95/00868.
En una realización de la presente invención, las
composiciones comprenden dos grupos: una proteína de estrés y un
antígeno proteico de PVH contra el cual se desea una respuesta
inmunológica celular. Los dos grupos se unen para formar una sola
unidad. Los dos grupos pueden estar conectados por conjugación, es
decir, a través de un enlace covalente entre la proteína de estrés y
el antígeno proteico de PVH. Hermanson, G.T., Bioconjugate
Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1996); Lussow, A.R.
y otros, Eur. J. Immun. 21:2297-2302 (1991);
Barrios, C. y otros, Eur. J. Immun.
22:1365-1372 (1992). Alternativamente, pueden
utilizarse técnicas recombinantes para conectar y expresar los dos
grupos, técnicas que resultan en una proteína recombinante de fusión
que incluye la proteína de estrés y el antígeno proteico de PVH en
una sola molécula. Esto hace posible el producir y purificar una
sola molécula recombinante en el proceso de producción. Los dos
grupos pueden unirse también no covalentemente. Cualquiera de
varias interacciones conocidas de elevada afinidad pueden adaptarse
para unir no covalentemente los dos grupos. Por ejemplo, un grupo
biotina puede añadirse a un antígeno proteico de PVH, y la proteína
de estrés a ser unida puede expresarse como una proteína de fusión
avidina-proteína de estrés. La proteína de fusión
avidina-proteína de estrés se enlazará fuertemente
al antígeno proteico biotinilado del PVH. Análogamente, pueden
unirse partes de los antígenos proteicos de PVH a una proteína de
estrés completa o a partes de una proteína de estrés, y partes de
una proteína de estrés pueden unirse a un antígeno proteico de PVH
completo o a partes de un antígeno proteico de PVH, siempre y cuando
las partes respectivas sean suficientes para inducir una respuesta
inmunológica contra el antígeno proteico de PVH en un sujeto al que
se le administre. En otra realización, las composiciones comprenden
un vector de expresión capaz de dirigir la expresión de una
proteína de fusión antígeno proteico de PVH-proteína
de estrés.
Pueden utilizarse en las composiciones de la
presente invención cualquier proteína de estrés adecuada (proteína
de estrés térmico (hsp)). Por ejemplo, como se describe en los
ejemplos, pueden utilizarse Hsp60 y/o Hsp70. En cuanto a las
proteínas de estrés en general, las células responden a un estresor
(típicamente el tratamiento de shock térmico) mediante el
incremento de la expresión de un grupo de genes comúnmente
denominados genes de estrés, o genes de estrés térmico. El
tratamiento de shock térmico involucra la exposición de células u
organismos a temperaturas que son de uno a varios grados centígrados
por encima de la temperatura a la cual están adaptadas las células.
Coordinadamente con la inducción de tales genes, se incrementan los
niveles de las proteínas de estrés correspondientes en células
estresadas. Como se utiliza en este documento, una "proteína de
estrés", también conocida como "proteína de shock térmico" o
"Hsp", es una proteína codificada por un gen de estrés, y es
por tanto producida típicamente en cantidades significativamente
mayores tras el contacto o exposición del estresor al organismo. Un
"gen de estrés", también conocido como "gen de shock
térmico", se utiliza en este documento como un gen que se activa
o, de otro modo, que se regula positivamente en forma detectable
debido al contacto o exposición de un organismo (que contiene el
gen) a un estresor, tal como el shock térmico, hipoxia, privación
de glucosa, sales de metales pesados, inhibidores del metabolismo
energético y de la cadena electrónica, y desnaturalizadores de
proteína, o a ciertas ansamicinas benzoquinonas. Nover, L., Heat
Shock Response ["Respuestas de shock térmico"], CRC Press,
Inc., Boca Raton, FL (1991). "Gen de estrés" también se refiere
a genes homólogos en familias conocidas de genes de estrés, tal como
ciertos genes de estrés dentro de las familias de genes de estrés
Hsp70 y Hsp90, aún cuando tales genes homólogos no son inducidos
ellos mismos por un estresor. Cada uno de los términos gen de estrés
y proteínas de estrés, tal y como se utilizan en la presente
especificación, puede incluir el otro, a menos que el contexto
indique lo contrario.
En realizaciones particulares, por ejemplo, en
casos que involucren conjugados químicos entre una proteína de
estrés y un antígeno proteico de PVH, las proteínas de estrés
utilizadas en la presente invención son proteínas de estrés
aisladas, lo que significa que las proteínas de estrés han sido
seleccionadas y separadas de la célula-huésped en
la que son producidas. Tal aislamiento puede ser llevado a cabo tal
y como se describe en este documento utilizando métodos rutinarios
de aislamiento de proteínas conocidos en la técnica. Maniatis y
otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado
molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Sambrook y otros,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado molecular,
un manual de laboratorio"], 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification
Methods Enzymology ["Guía de enzimología de métodos de
purificación proteínas"], vol. 182, Academic Press, Inc., San
Diego, CA (1990).
En las bacterias, las proteínas de estrés
predominantes son proteínas con tamaños moleculares de unos 70 y 60
kDa, comúnmente denominadas Hsp70 y Hsp60, respectivamente. Éstas y
otras proteínas de estrés específicas y los genes que las codifican
se comentan después. En las bacterias, la Hsp70 y Hsp60 representan
típicamente aprox. 1-3% de la proteína celular,
basado en el patrón de tinción utilizando electroforesis en gel de
poliacrilamida dodecil sulfato sódico y la tinción azul de
Coomassie, pero se acumulan hasta niveles de hasta 25% en
condiciones de estrés. Las proteínas de estrés aparentemente
participan en importantes procesos celulares, como la síntesis
proteica, tráfico intracelular, y el ensamblaje y desensamblaje de
complejos proteicos. Aparentemente, los niveles elevados de
proteínas de estrés sintetizadas durante los episodios de estrés
sirven principalmente para minimizar las consecuencias del
despliegue inducido de las proteínas. En efecto, la preexposición de
las células a condiciones moderadamente estresantes que inducen la
síntesis de proteínas de estrés, confiere protección a las células
de los efectos deletéreos de estrés extremo subsiguiente.
Las proteínas de estrés principales
aparentemente se expresan en todos los organismos y tipos de tejidos
examinados hasta hoy. También parece que las proteínas de estrés
representan el grupo más conservado de proteínas identificado hasta
la fecha. Por ejemplo, cuando se comparan proteínas de estrés en
organismos muy diversos, la Hsp90 y la Hsp70 exhiben una identidad
de un 50% ó más a nivel de aminoácidos y comparten muchas
similitudes en posiciones no idénticas. Se hace mención de que se
dan niveles de homología similares o más elevados entre diferentes
miembros de familias particulares de proteínas de estrés dentro de
las especies.
Los genes que codifican para proteínas de estrés
pueden estar presentes en una sola copia o en copias múltiples no
idénticas en el genoma de una célula u organismo. Por ejemplo, se ha
demostrado que el genoma humano contiene al menos una copia de un
gen hsp100, al menos dos genes hsp90 diferentes, hasta diez genes
hsp70 de los que al menos varios son copias no idénticas, varios
genes de complejos T (genes Tcp) y al menos un gen que codifica
para la proteína mitocondrial relacionada Hsp60, así como al menos
tres copias de genes hsp pequeños que codifican para Hsps en el
rango de dimensiones moleculares de 20-30 kDa. En la
mayor parte de familias de genes de estrés existe al menos un gen
cuyo nivel de expresión es relativamente alto y es completa y
constitutivamente inducible su shock térmico, o sólo moderadamente
inducible. Además, varias familias de genes de estrés incluyen
miembros que no son regulados positivamente por el calor, sino por
otros factores como niveles elevados de calcio, etc.
Las proteínas de estrés, en particular Hsp70,
Hsp60, Hsp20-30 y Hsp10, están entre los
determinantes principales reconocidos por el sistema inmunitario
huésped en la respuesta inmunológica a la infección por
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae.
Young, R.A. y Elliott, T.J., Stress Proteins, Infection, And
Immune Surveillance ["Proteínas de estrés, infección y
vigilancia inmunitaria"], Cell 50:5-8
(1989). Además, algunas células T artritogénicas de rata reconocen
epítopos de Hsp60. Van Eden, W. Y otros, Nature
331:171-173 (1988). Sin embargo, los individuos,
incluyendo individuos sanos, sin historia de infección
micobacteriana o enfermedad autoinmune también portan células T que
reconocen epítopos de Hsp60 tanto bacterianos como humanos; una
fracción considerable de células T en individuos sanos que se
caracterizan por expresión del receptor gamma-delta
de célula T reconocen proteínas de estrés tanto propias como
extrañas. O'Brien, R. y otros, Cell
57:664-674 (1989). Así, los individuos, incluso
individuos
sanos, poseen poblaciones de células T que reconocen epítopos de proteínas de estrés tanto extrañas como propias.
sanos, poseen poblaciones de células T que reconocen epítopos de proteínas de estrés tanto extrañas como propias.
Este sistema que reconoce epítopos de proteínas
de estrés presumiblemente constituye un "sistema de defensa
temprana" contra organismos invasores. Murray, P.J. y Young,
R.A., J. Bacteriol 174:4193-6(1992).
El sistema podría mantenerse por estimulación frecuente por
bacterias y virus. Como se ha comentado anteriormente, los
individuos sanos tienen poblaciones de células T que reconocen
proteínas de estrés propias. Así, la presencia de células T
autorreactivas es compatible con el estado saludable y no causa
enfermedad autoinmune; esto demuestra la seguridad de las proteínas
de estrés dentro de un individuo. La seguridad de las proteínas de
estrés se demuestra adicionalmente por el éxito y relativa seguridad
de las vacunas BCG (Bacille Calmette Guerin, una cepa de
Mycobacterium bovis), las cuales inducen respuestas
inmunológicas contra las proteínas de estrés que son protectoras
también contra Mycobacterium tuberculosis.
Son familias de genes y proteínas de estrés para
uso en la presente invención aquéllas bien conocidas e incluyen,
por ejemplo, la Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon,
Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBPs, ciclofilinas,
Hsp20-30, ClpP, GrpE, Hsp10, ubiquitina, calnexina,
y proteínas isomerasas disulfuro. Macario, A.J.L., Cold Spring
Harbor Laboratory Res. 25:59-70, 1995; Parsell,
D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet.
27:437-496 (1993); Patente U.S. Nº 5.232.833
(Sanders y otros). Un grupo particular de proteínas de estrés
incluye la Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30, más aún,
preferentemente la Hsp70 y Hsp60.
Los ejemplos de Hsp100-200
incluyen la Grp170 (una proteína regulada por glucosa). La Grp170
reside en el lumen del RE, en el compartimiento
pre-Golgi, y podría desempeñar un papel en el
pliegue y ensamblaje de inmunoglobulinas.
Los ejemplos de Hsp100 incluyen la Hsp110 de
mamíferos, la Hsp104 de levaduras, la ClpA, ClpB, ClpC, ClpX y
ClpY. La Hsp104 de levadura y la ClpA de E. coli forman
partículas hexaméricas, y la ClpB de E. coli, partículas
tetraméricas cuyo ensamblaje aparentemente necesita de la unión del
nucleótido adenina. La proteasa Clp proporciona un heterooligómero
de 750 kDa compuesto de ClpP (una subunidad proteolítica) y de ClpA.
Las ClpB-Y están es-
tructuralmente relacionadas con la ClpA, aunque, al contrario que la ClpA, no parece que formen complejos con ClpP.
tructuralmente relacionadas con la ClpA, aunque, al contrario que la ClpA, no parece que formen complejos con ClpP.
Entre los ejemplos de Hsp90 se citan la HtpG de
E. coli, la Hsp83 y Hsc83 de levaduras, y las Hsp90alfa,
Hsp90beta y Grp94 en humanos. La Hsp90 enlaza grupos de proteínas,
las cuales son típicamente moléculas de regulación celular como son
receptores de hormonas esteroides (por ejemplo, receptores de
glucocorticoides, estrógenos, progesterona, y testosterona),
factores de transcripción y proteína quinasas que desempeñan un
papel en mecanismos de transducción de señales. Las proteínas Hsp90
también participan en la formación de complejos grandes y
abundantes de proteínas que incluyen otras proteínas de estrés.
Lon es una proteína tetramérica que funciona
como proteasa ATP-dependiente en la degradación de
proteínas no nativas de E. coli.
Entre los ejemplos de Hsp70 se citan las Hsp72 y
Hsc73 de células de mamífero, la DnaK de bacterias, en particular
micobacterias como la Mycobacterium leprae, Mycobacterium
tuberculosis, y Mycobacterium bovis (tal como
Bacille-Calmette Guerin, denominada en este
documento Hsp71), DnaK de Escherichia coli, de levaduras, y
de otros procariotas, y las BiP y Grp78. La Hsp70 es capaz de
unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos y péptidos no
plegados, participando así en el pliegue y despliegue de proteínas
así como en el ensamblaje y desensamblaje de complejos
proteicos.
Entre los ejemplos de Hsp60 se citan la Hsp65 de
micobacteria. La Hsp60 bacteriana también se conoce comúnmente como
GroEL, como por ejemplo la GroEL de E. coli. La Hsp60 forma
grandes complejos homooligoméricos, y parece que desempeña un papel
en el pliegue de proteínas. Los hómologos de Hsp60 están presentes
en mitocondrias eucarióticas y en cloroplastos.
Entre los ejemplos de TF55 se citan la Tcpl,
TRiC y termosoma. Las proteínas típicamente se encuentran en el
citoplasma de eucariotas y en algunas arqueobacterias, y forman
anillos multi-miembro, promocionando el pliegue de
proteínas.También son homólogos débiles de Hsp60.
Entre los ejemplos de Hsp40 se citan la DnaJ de
procariotas como E. coli y micobacteria y la HSJ1, HDJ1 y
Hsp40. La Hsp40 desempeña un papel de protector ("chaperone")
molecular en el pliegue de proteínas, termotolerancia y replicación
de ADN, entre otras actividades celulares.
Entre los ejemplos de FKBPs se citan la FKBP12,
FKBP13, FKBP25, y la FKBP59, Fprl y Nepl. Las proteínas tienen
típicamente actividad peptidil-prolil isomerasa e
interaccionan con inmunosupresores como la FK506 y rapamicina. Las
proteínas se encuentran típicamente en el citoplasma y retículo
endoplasmático.
Entre los ejemplos de ciclofilina se citan las
ciclofilinas A, B y C. Las proteínas tienen actividad
peptidil-prolil isomerasa e interactúan con el
inmunosupresor ciclosporina A. La proteína ciclosporina A se une a
calcineurina (una proteína fosfatasa).
La Hsp20-30 también se denomina
Hsp pequeña. La Hsp20-30 se encuentra típicamente en
grandes complejos homooligoméricos o, posiblemente, también en
complejos heterooligoméricos cuando un organismo o tipo celular
expresa varios tipos diferentes de Hsps pequeñas. La
Hsp20-30 interacciona con estructuras
citoesqueléticas, y podría desempeñar un papel regulador en la
polimerización/despolimerización de la actina. La
Hsp20-30 se fosforila rápidamente bajo estrés o
exposición de células inactivas a factores de crecimiento. Entre los
homólogos de Hsp20-30 se incluye la
alfa-cristalina.
La ClpP es una proteasa de E. coli
involucrada en la degradación de proteínas anormales. Se encuentran
homólogos de ClpP en cloroplastos. La ClpP forma un complejo
heterooligomérico con ClpA.
La GrpE es una proteína de E. coli de
unos 20 kDa involucrada tanto en el rescate de proteínas dañadas por
estrés como en la degradación de proteínas dañadas. La GrpE
desempeña un papel en la regulación de la expresión de genes de
estrés en E. coli.
Entre los ejemplos de Hsp10 se citan la GroES y
Cpn10. La Hsp10 se encuentra típicamente en E. coli y en
mitocondrias y cloroplastos de células eucariotas. La Hsp10 forma
un anillo de siete miembros que se asocia con oligómeros de Hsp60.
La Hsp10 también está involucrada en el pliegue de proteínas.
Se ha descubierto que la ubiquitina se une a
proteínas en coordinación con la eliminación proteolítica de
proteínas por proteasas citosólicas
ATP-dependientes.
En realizaciones particulares, las proteínas de
estrés de la presente invención se obtienen de enterobacterias,
micobacterias (en particular, M. leprae, M. tuberculosis, M.
vaccae, M. smegmatis y M. bovis),E. coli, levaduras,
Drosophila, vertebrados, aves, pollos, mamíferos, ratas, ratones,
primates, o humanos.
Las proteínas de estrés pueden encontrarse en la
forma de sales ácidas o básicas, o en forma neutra. Además, los
residuos aminoácidos individuales pueden modificarse por oxidación o
reducción. Además, pueden efectuarse varias sustituciones,
deleciones, o adiciones a la secuencias aminoacídicas o
nucleotídicas, el efecto neto de las cuales es la retención o
incremento adicional de la actividad biológica elevada de la
proteína de estrés. Debido a la degeneración del código, por
ejemplo, puede darse considerable variación en las secuencias
nucleotídicas que codifican para la misma secuencia de aminoácidos.
La presente invención también es adecuada para su uso con partes de
proteínas de estrés o péptidos obtenidos de proteínas de estrés,
siempre y cuando tales partes o péptidos incluyan los epítopos
involucrados en la potenciación de la respuesta inmunológica frente
al antígeno proteico de PVH seleccionado. Pueden obtenerse partes
de proteínas de estrés por fragmentación utilizando proteinasas, o
por métodos recombinantes, tal como la expresión de sólo una parte
de una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de
estrés (sea sola o fusionada con otra secuencia nucleotídica que
codifica para una proteína). Pueden producirse también péptidos por
tales métodos, o por síntesis química. Las proteínas de estrés
pueden incluir mutaciones introducidas en lugares particulares por
una variedad de técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, Sambrook y
otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ["Clonado
molecular: un manual de laboratorio"], 2ª Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989); Drinkwater y Klinedinst, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83:3402-3406 (1986); Liao y Wise,
Gene 88:107-111 (1990); Horwitz y otros,
Genome 3:112-117 (1989). El término proteína
de estrés tal y como se utiliza en este documento se pretende que
incluya tales partes y péptidos de una proteína de estrés.
Los métodos de identificación de un gen o de una
proteína bajo consideración como un gen o proteína de estrés son
bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la conservación de los
genes y proteínas de una familia particular de proteínas de estrés
permite la comparación de la secuencia nucleotídica o de aminoácidos
del gen/proteína bajo consideración con genes de estrés bien
conocidos como el DnaK, GroEL o DnaJ, por ejemplo, por hibridación
de ácidos nucleicos o secuenciado de ácidos nucleicos o aminoácidos
seguido de análisis comparativo computerizado. Voellmy, R., y otros,
Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:4949-4953
(1985). Alternativamente, puede utilizarse un ensayo para
identificar y/o discriminar entre rasgos estructurales esenciales
y/o propiedades funcionales de una proteína de estrés seleccionada.
Por ejemplo, puede rastrearse una biblioteca de expresiones
utilizando anticuerpos anti-Hsp. Es bien sabido que
la Hsp90 se une a la geldanamicina ansamicina benzoquinona con
elevada afinidad. Podría por tanto rastrearse una biblioteca de
expresión con geldanamicina para descubrir homólogos putativos de
Hsp90 como proteínas que se unen a la ansamicina benzoquinona.
Podría confirmarse la naturaleza de la proteína codificada por el
ácido nucleico aislado por otros ensayos, incluyendo ensayos basados
en anticuerpos. Antibodies: A Laboratory Manual
["Anticuerpos: un manual de laboratorio"], Harlow y Lane
(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988). Además, podría
explotarse la actividad biológica de un grupo dado de proteínas de
estrés. Guidon, P.T., y Hightower, L.E., Biochem.
25:3231-3239 (1986). Por ejemplo, la Hsp70 es capaz
de unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos no plegados
y péptidos en el ensamblaje de complejos de proteínas. Así, la
mezcla de una proteína bajo consideración con una muestra que
comprenda polipéptidos y péptidos apropiados, o ATP, seguida de la
determinación de la presencia o ausencia de producción de complejos
proteína-proteína o
proteína-nucleótido indica la presencia o ausencia
aparente de una proteína o gen Hsp70, cuya presencia o ausencia
puede confirmarse utilizando otros ensayos como son los ensayos
basados en anticuerpos.
La proteína de estrés, parte de proteína de
estrés, homólogo de proteína de estrés y antígeno proteico de PVH a
los cuales la proteína de estrés se encuentra conjugada o unida no
covalentemente, presentes en la composición, pueden producirse u
obtenerse utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, la proteína de
estrés y/o el antígeno pueden obtenerse (aislarse) de una fuente en
la que se sabe que existen, pueden producirse y recogerse de
cultivos celulares o, en el caso de los antígenos, pueden obtenerse
de células infectadas, pueden producirse por clonado, si es
necesario, y mediante la expresión de un gen que codifique para la
proteína de estrés o antígeno que se desee, o sintetizarse
químicamente. Además, la secuencia nucleotídica que codifica la
proteína de estrés deseada o el antígeno puede ser sintetizada
químicamente. Una proteína de fusión que incluya una proteína de
estrés y un antígeno proteico de PVH pueden ser producidos por
métodos recombinantes. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica
una proteína de estrés puede unirse a cualquiera de los extremos de
una secuencia nucleotídica que codifica el antígeno proteico de PVH
de tal manera que las dos secuencias codificantes de proteína
compartan un marco común de lectura de traducción y pueden
expresarse como una proteína de fusión que incluya un antígeno
proteico de PVH y una proteína de estrés. La secuencia combinada se
inserta en un vector adecuado seleccionado según los rasgos de
expresión que se desean y la naturaleza de la célula huésped. En
los ejemplos que se proporcionan después en este documento, las
secuencias nucleotídicas se ensamblan en un vector adecuado para la
expresión de proteínas en la bacteria E. coli. Después de la
expresión en la célula-huésped seleccionada, puede
purificarse la proteína de fusión por técnicas separativas
bioquímicas rutinarias o por métodos de inmunoafinidad utilizando
un anticuerpo de una u otra parte de la proteína de fusión.
Alternativamente, el vector seleccionado puede añadir una marca a
la secuencia de la proteína de fusión, por ejemplo, una marca de
oligohistidina como se describe en los ejemplos presentados después
en este documento, permitiendo la expresión de la proteína de
fusión marcada que puede ser purificada por métodos de afinidad
utilizando un anticuerpo u otro material con afinidad adecuadamente
elevada para la marca. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual ["Clonado molecular: un manual de
laboratorio"], 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989); Deutscher, M, Guide to Protein Purification Methods
Enzymology ["Guía de enzimologia de métodos de purificación de
proteínas"], vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA
(1990). Si se utiliza un vector adecuado para la expresión en
células de mamífero, por ejemplo, uno de los vectores comentados
después, la proteína de fusión puede expresarse y purificarse desde
células de mamífero. Alternativamente, el vector de expresión de
mamífero (que incluye las secuencias codificantes de la proteína de
fusión) puede administrarse a un sujeto para dirigir la expresión de
la proteína de fusión en las células del sujeto. También puede
producirse químicamente un ácido nucleico que codifique para una
proteína de fusión que incluya una proteína de estrés y un antígeno
proteico de PVH, y entonces insertarse en un vector adecuado para la
producción de proteína de fusión, purificarse o administrarse a un
sujeto. Finalmente, una proteína de fusión puede también prepararse
químicamente.
Las composiciones que comprenden una proteína de
estrés y un antígeno de PVH descritos en este documento pueden
utilizarse para potenciar una respuesta inmunológica, en particular
una respuesta citolítica mediada por células, contra un PVH, o
célula infectada o transformada por un PVH, que expresa un antígeno
de PVH. Preferentemente, las composiciones contendrán secuencias de
antígeno proteico del tipo particular de PVH contra cuyas proteínas
se ha de provocar una respuesta inmunológica.
Las composiciones que comprenden una proteína de
estrés y un antígeno de PVH descritos en este documento, pueden
administrarse a un sujeto de varias maneras. Las rutas de
administración incluyen la intradérmica, transdérmica (por ejemplo,
liberación lenta de polímeros), intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, oral, epidural e intranasal. Puede
utilizarse cualquier otra ruta conveniente de administración, por
ejemplo, inyección de infusión o en bolos, o absorción a través de
epitelios o mucocutánea. Además, las composiciones descritas en este
documento pueden contener y ser administradas junto a otros
componentes farmacológicamente aceptables, como son agentes
biológicamente activos (por ejemplo, adyuvantes como "alum"),
tensioactivos (por ejemplo, glicéridos), excipientes (por ejemplo,
lactosa), portadores, diluyentes y vehículos. Además, las
composiciones pueden utilizarse ex vivo como una manera de
estimular a los glóbulos blancos obtenidos de un sujeto para
promocionar, expandir y propagar células inmunes específicas de
antígenos proteicos de PVH in vitro, que a continuación son
reintroducidos en el sujeto.
Además, una proteína de fusión de proteína de
estrés-antígeno proteico de PVH puede administrarse
por expresión in vivo de un ácido nucleico que codifica para
tales secuencias proteicas en un sujeto humano. También puede
conseguirse la expresión de tal ácido nucleico ex vivo como
un modo de estimular a los glóbulos blancos obtenidos de un sujeto
para promocionar, expandir y propagar células inmunes específicas de
antígenos de PVH in vitro que son a continuación
reintroducidos en el sujeto. Los vectores de expresión adecuados
para dirigir la expresión de fusiones de proteínas antígeno
proteico de PVH-proteína de estrés pueden
seleccionarse de una gran variedad de vectores de uso actual en
este campo. Son preferentes los vectores que son capaces de producir
elevados niveles de expresión y además son efectivos en la
transducción de un gen de interés. Por ejemplo, pueden utilizarse el
vector adenovirus recombinante pJM17 (All y otros, Gene
Therapy 1:367-84 (1994); Berkner K. L.,
Biotechniques 6:616-24 (1988), el vector
adenovirus de segunda generación DE1/DE4 (Wang y Finer, Nature
Medicine 2:714-6 (1996)), o el vector viral
adeno-asociado AAV/Neo (Muro-Cacho y
otros, J. Immunotherapy 11:231-7 (1992)).
Ademas, pueden utilizarse los vectores retrovirales recombinantes
MFG (Jaffee y otros, Cancer Res. 53:2221-6
(1993)) o el LN, LNSX, LNCX, LXSN (Miller y Rosman,
Biotechniques 7:980-9 (1989)). Sirven como
alternativas los vectores basados en el virus Herpes simplex,
tal como el pHSV1 (Geller y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci.
87:8950-4 (1990) o vectores virales vaccinia tal
como el MVA (Sutter y Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci.
89:10847-51 (1992)).
Son unidades específicas de expresión utilizadas
frecuentemente que incluyen secuencias promotoras y secuencias 3'
las que se encuentran en el plásmido CDNA3 (Invitrogen), el plásmido
AH5, pRC/CMV (Invitrogen), pCMU II (Paabo y otros, EMBO J.
5:1921-1927 (1986)), pZip-Neo SV
(Cepko y otros, Cell 37:1053-1062 (1984)) y
pSRa (DNAX, Palo Alto, CA). La introducción de genes en unidades de
expresión y/o vectores puede conseguirse utilizando técnicas de
ingeniería genética, como se describe en manuales como Molecular
Cloning and Current Protocols in Molecular Biology ["Clonado
molecular y protocolos actuales en biología molecular"]
(Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning [Clonado molecular],
Cold Spring Harbor Press (1989); Ausubel, F.M. y otros, Current
Protocols in Molecular Biology ["Protocolos actuales en
biología molecular"], Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (1989)). Un ácido nucleico
resultante expresable puede introducirse en células de un sujeto
humano por cualquier método capaz de colocar ácidos nucleicos
dentro de células en una forma expresable, por ejemplo formando
parte de un vector viral como el que se ha descrito anteriormente,
como plásmido desnudo u otro ADN, o encapsulado en liposomas diana
o en eritrocitos "fantasma" (Friedman, T., Science,
244:1275-1281 (1989); Rabinovich, N.R. y otros,
Science, 265:1401-1404 (1994)). Entre los
métodos de transducción se incluyen la inyección directa en tejidos
y tumores, transfección liposomal (Fraley y otros, Nature
370:111-117 (1980)), endocitosis mediada por
receptores (Zatloukal y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci.
660:136-153 (1992)), y transferencia génica mediada
por el bombardeo de partículas (Eisenbraun y otros, DNA &
Cell Biol. 12:791-797 (1993)).
La cantidad de proteína de estrés y antígeno
proteico de PVH (fusionado, conjugado o unido no covalentemente
como se ha comentado anteriormente) en las composiciones de la
presente invención es una cantidad que produce una respuesta
inmunoestimulatoria efectiva en un sujeto. Una cantidad efectiva es
una cantidad tal que cuando se administra, resulta en una inducción
de respuesta inmunológica. Además, la cantidad de proteína de estrés
y antígeno proteico PVH administrado al sujeto variará dependiendo
de una serie de factores, entre ellos el antígeno proteico de PVH y
proteína de estrés empleados, el tamaño, edad, peso corporal, salud
general, sexo, y dieta del sujeto, así como en su grado general de
respuesta inmunológica. El ajuste y manipulación de rangos
establecidos de dosis están claramente dentro de la capacidad de los
expertos en la materia. Por ejemplo, la cantidad de proteína de
estrés y antígeno puede ser de entre aprox. 1 microgramo hasta
aprox. 1 gramo, preferentemente entre aprox. 100 microgramos y
aprox. 1 gramo, y desde aprox. 1 miligramo hasta aproximadamente 1
gramo. Una cantidad efectiva de una composición que comprende un
vector de expresión es una cantidad tal que cuando se administra,
induce una respuesta inmunológica contra el antígeno proteico de PVH
que codifica. Además, la cantidad de vector de expresión
administrado al sujeto variará dependiendo de una variedad de
factores, entre ellos el antígeno proteico de PVH y la proteína de
estrés que se exprese, el tamaño, edad, peso corporal, salud
general, sexo, y dieta del sujeto así como en su grado general de
respuesta inmunológica. Son factores adicionales a tener en cuenta
la ruta de aplicación y el tipo de vector utilizado. Por ejemplo,
cuando se lleve a cabo tratamiento profiláctico o terapéutico con
un vector viral que contenga un ácido nucleico que codifique una
proteína de fusión antígeno proteico de PVH-proteína
de estrés, la cantidad efectiva estará en el rango de 10^{4} a
10^{12} virus libres de ayudante y defectivos para la replicación,
por kg de peso corporal, preferentemente en el rango de 10^{5} a
10^{11} virus por kg de peso corporal y más preferentemente en el
rango de 10^{6} a 10^{10} virus por kg de peso corporal.
Se ilustra la presente invención mediante los
siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser restrictivos en
modo alguno.
El plásmido Y3111 contiene un gen hsp71 de M.
tuberculosis funcionalmente insertado entre las secuencias de
control de expresión (Mehlert, A. y Young, D.B., Mol.
Microbiol. 3:125-130 (1989)). Se transformó la
cepa E. coli CG2027 (obtenida de C. Georgopoulos, Universidad
de Ginebra, Suiza) que contiene un gen dnaK truncado, con el
plásmido Y3111 por procedimientos estándar. (Maniatis y otros,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular,
un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y. (1982)).
Se cultivaron bacterias que contenían plásmido
Y3111 durante una noche en medio 2xYT (20 g de triptona, 10 g de
extracto de levadura, 10 g NaCl por litro) con 100 microgramos/ml de
ampicilina a 37ºC, bajo agitación (250 rpm). Se preparó un linaje
al 10% de glicerol con este cultivo y se almacenó a -70ºC. Se
utilizaron varias raspaduras del linaje de glicerol congelado para
inocular un cultivo grande incubado como antes durante 48 h. Cuando
la densidad óptica a 590 nm alcanzó de 2,5 a 3,5, las células se
recogían por centrifugación.
Los pasos siguientes se llevaron a cabo a 4ºC.
El pellet celular se resuspendió en 3 ml de tampón de lisis por
gramo de células en el pellet. La composición del tampón de lisis
era de Tris-HCl 10 mM, etilendiamina tetraacetato
(EDTA) 2 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, 10
microgramos/ml aprotinina, 10 microgramos/ml leupeptina, y 1
microgramo/ml pestatina. Se añadió lisozima a la suspensión celular
hasta una concentración final de 0,14 mg/ml. Se congeló entonces la
suspensión a -70ºC.
Se descongeló la suspensión celular, y las
células se rompieron por sonicación. El sonicado se sometió a
centrifugación a 17.000 rpm durante 30 min (rotor
JA-17, Beckmann). Se añadió
(NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la solución de sobrenadante
hasta que la solución estaba saturada al 65% con
(NH_{4})_{2}SO_{4}. Tras una incubación de 30 min, la
mezcla se volvió a centrifugar como antes. El pellet se disolvió en
tampón A de Q SEFAROSA. A esta solución se añadieron 10
microgramos/ml de aprotinina, 10 microgramos/ml de leupeptina, y 1
microgramo/ml de pepstatina, y la solución se dializó durante la
noche contra 65 volúmenes de Q SEFAROSA tampón A. El tampón A de Q
SEFAROSA contenía Tris-HCl 30 mM (pH 7,5), EDTA 1
mM, beta-mercaptoetanol 5 mM. La solución dializada
se clarificó por centrifugación como se ha descrito
anteriormente.
La solución dializada se aplicó a una columna de
Q SEFAROSA (Pharmacia) equilibrada en tampón A de Q SEFAROSA. La
columna se lavó con 2 volúmenes del mismo tampón. La elución se
llevó a cabo con un gradiente de 0 a 600 mM de NaCl. Se testearon
las fracciones por SDS-PAGE y tiñeron con azul de
Coomassie para detectar la presencia de un polipéptido principal de
71 kDa (es decir, la proteína Hsp71 recombinante de M.
tuberculosis). Se reunieron las fracciones que contenían el
polipéptido, y el "pool" se llevó a una saturación del 65% por
adición del (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido. Se centrifugó
la mezcla como se ha descrito antes, se disolvió el pellet en tampón
ATP Start (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 20 mM,
MgCl_{2} 5 mM, beta-mercaptoetanol 15 mM, EDTA 0,1
mM), y la solución proteica resultante se dializó durante la noche
frente a 65 volúmenes del mismo tampón y se clarificó por
centrifugación.
La solución proteica dializada se pasó entonces
por una columna ATP-agarosa (Fluka) equilibrada con
tampón ATP Start. Se lavó la columna con 1 volumen de columna de
tampón ATP Start con NaCl 1 M. La elución se consiguió con tampón
ATP Start suplementada con ATP 10 mM. El eluído se llevó a una
saturación del 65% con (NH_{4})_{2}SO_{4}, y el
precipitado de proteína se recogió como se ha descrito
anteriormente. El pellet de centrifugación se disolvió y se dializó
frente a 200 volúmenes de tampón azul de SEFAROSA
(Tris-HCl 30 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM,
beta-mercaptoetanol 5 mM).
La solución de proteína dializada del último
paso se pasó por una columna de azul de SEFAROSA (Pharmacia)
equilibrada con tampón de azul de SEFAROSA. La columna se lavó con
1,5 volúmenes de columna del mismo tampón. El eluído y fracciones de
lavado (que contienen Hsp71) se recogieron juntos. La pureza de la
preparación final se evaluó mediante SDS-PAGE y
tinción de azul de Coomassie, y análisis de Western blot (Maniatis y
otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado
molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)); (ver Sambrook y otros,
Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring
Harbor Laboratory press, NY (1989)) utilizando anticuerpos
monoclonales de ratón específicos para el Hsp71 micobacteriano y el
DnaK de E. coli, respectivamente, y por ensayos de actividad
ATPasa. Las preparaciones son típicamente de un 90% de pureza,
basadas en el patrón de tinción de la preparación en geles teñidos
con azul de Coomassie, y preferentemente de pureza superior al 95%,
y contienen menos de un 1% de GroEL de E. coli, y cantidades
indetectables de DnaK de E. coli.
El plásmido RIB 1300 contiene un gen hsp65 BCG
de M. bovis funcionalmente insertado entre secuencias de
control de expresión (Thole, J.E.R. y otros, J. Exp. Med.
178:343-8 (1993)). La cepa M1546 de E. coli
se transformó con el plásmido RIB1300 (Thole, J.E.R., supra)
utilizando procedimientos estándar. Maniatis y otros, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de
laboratorio"], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1982).
Se cultivó un inóculo de bacterias que contenían
el plásmido RIB 1300 hasta la saturación en medio NCZYM (10 g de
N-Z amina A, 5 g de extracto Bacto de levadura, 1 g
de ácidos Casamino, 5 g de NaCl, 2 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}-7H_{2}O por
litro) que contenía 200 microgramos/ml de ampicilina a 28ºC y bajo
agitación (250 rpm). Este cultivo se utilizó para inocular un
cultivo mayor, cultivado bajo las mismas condiciones que el cultivo
de inóculo, hasta una densidad óptica a 590 nm del cultivo de entre
0,3 y 0,6. Se inició la producción de la proteína recombinante
incrementando rápidamente la temperatura del cultivo hasta los 42ºC
por incubación en un baño de agua caliente. El cultivo se mantuvo a
esta temperatura durante 3h bajo agitación. Se recogieron entonces
las bacterias por centrifugación y resuspendieron en 6 volúmenes por
peso de pellet bacteriano de tampón de lisis. El tampón de lisis
contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), etilendiamina
tetraacetato (EDTA) 10 mM, PMSF 0,1 mM y RIVM BA 0,1% (0,104 g de
4-amino-benzamidina-2HCl,
0,066 g de ácido epsilon-amino caproico por 50 ml).
Se añadió lisozima a una concentración de 0,1 mg/ml, y la suspensión
se congeló a -70ºC.
Se descongeló la suspensión bacteriana,
dejándola después a 4ºC. Las operaciones siguientes se realizaron a
esta temperatura. Se consiguió la lisis completa de las bacterias
por sonicación. El sonicado se centrifugó a 17.000 rpm durante 30
min en un rotor JA-17 (Beckman). Se añadió
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturado a la solución de
sobrenadante hasta alcanzar una saturación del 20%. Se separaron los
precipitados por centrifugación (ver más arriba) y se descartaron.
La solución sobrenadante se llevó a una saturación del 55% por
adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado. El pellet
resultante de la centrifugación subsiguiente se disolvió en tampón
TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0),
beta-mercaptoetanol 15 mM, EDTA 1 mM). La solución
proteica en TE se dializó entonces frente a 50 volúmenes de tampón
TE.
Tras la centrifugación (como anteriormente) para
separar el material precipitado, se pasó la solución proteica que
había sido dializada por una columna DEAE SEFAROSA (Pharmacia). Tras
lavar con tampón TE, se eluyeron las proteínas con un gradiente
0-300 mM de NaCl en tampón TE. Las fracciones que
contenían el Hsp65 BCG de M. bovis se identificaron por
SDS-PAGE y tinción de azul de Coomassie y se
agruparon. Se añadieron 10 microgramos/ml de aprotinina, 10
microgramos/ml de leupeptina y 1 microgramo/ml de pepstatina al
"pool", el cual se concentró entonces en una célula Amicon
utilizando una membrana YM30.
El "pool" concentrado se pasó por una
columna S-200 SEPHACRYL (Pharmacia) equilibrada con
tampón S200 (Na_{2}HPO_{4} 10 mM (pH 6,8), NaCl 150 mM y
beta-mercaptoetanol 15 mM). La elución se realizó
con el mismo tampón. Se comprobó la presencia de Hsp65
micobacteriano en las fracciones como anteriormente, y las
fracciones positivas que contenían la proteína altamente purificada
se agruparon y dializaron durante la noche frente a tampón HAP
(Na_{2}HPO_{4} (pH 6,8) 10 mM,
beta-mercaptoetanol 15 mM).
El pool dializado se pasó por una columna de
hidroxiapatito (Bio-Rad; Bio-Gel HTP
Gel) equilibrada en tampón HAP. La columna se lavó con 3 volúmenes
de MgCl_{2} 1 mM y beta-mercaptoetanol 15 mM y a
continuación con Na_{2}HPO_{4} 1 mM (pH 6,8) y
beta-mercaptoetanol 15 mM. Las proteínas se eluyeron
con un gradiente 10-60 mM de fosfato. Las
fracciones se examinaron como anteriormente, y las fracciones
positivas se agruparon, concentraron e intercambiaron en NaCl 0,85%
por medio de filtración en gel a través de PD10 (Pharmacia). Se
evaluó la pureza en Hsp65 micobacteriano por
SDS-PAGE y tinción de azul de Coomassie, así como
por análisis de Western blot utilizando anticuerpos específicos
para el DnaK y GroEL de E. coli. Las preparaciones eran
típicamente de pureza superior al 90%, y contenían no más de 0,5%
de GroEL de E. coli y 0,1-0,2% de DnaK de
E. coli, respectivamente.
Las preparaciones de Hsp pueden ser
despirogenadas por cromatografía de afinidad en resina DetoxiGel
(Pierce), por adición de polimixina B, o por extracción con
detergentes como el Triton X-114 ó
X-100. Puede realizarse el test del amebocito de
limulus (LAL; Biowhittaker, QCL 1000) tras la reducción en contenido
lipopolisacárido. Las preparaciones de Hsp pueden guardarse en
tampón a -70ºC, o pueden guardarse, preferentemente a -70ºC, como
pellets secos tras su liofilización.
Este ejemplo se proporciona como ilustración de
técnicas que pueden utilizarse para preparar conjugados entre una
proteína de estrés y un antígeno proteico, en este ejemplo de
péptido derivado de nucleoproteína de virus influenza (NP).
La Hsp71 de M. tuberculosis se preparó
como se describe en el Ejemplo 1. El péptido NP (denominado en este
documento NP.B; Motal, U.M.A. y otros, Eur. J. Immunol. 25:11214
(1995) y referencias citadas en el mismo) con la secuencia
aminoacídica [C]VQLASNENMETM (SEQ ID NO: 1; el péptido
contiene un residuo adicional cisteína
amino-terminal) correspondiente a los residuos
363-374 en el NP completo y que contiene un epítopo
CTL conocido (H-2b-restringido),
fue producido sintéticamente (escala 0,25 mM) en un sintetizador de
péptidos Applied Biosystems modelo 431A utilizando Fmoc
(9-fluorenilmetiloxi-carbonil) como
el grupo alfa-amino protector y resina HMP (Wang)
como soporte sólido. Todos los compuestos químicos de síntesis y
aminoácidos se adquirieron de Applied Biosystems. Se separó la NP.B
del soporte y se separaron los grupos laterales protectores de
cadena por incubación del NP.B bajo agitación continua durante 3
horas en 2 ml de una mezcla preparada por combinación de 10 ml de
ácido trifluoroacético, 0,5 ml de agua, 0,75 g de fenol
cristalizado, 0,25 ml de etaneditiol y 0,5 ml de tioanisol. La
mezcla se filtró en 40 ml de dietil éter helado. El material
insoluble se recogió por centrifugación a 5000 x g durante 8 min. Se
decantó el éter y el pellet se lavó tres veces por resuspensión en
dietil éter frío seguido de centrifugación. Tras el último lavado se
secó el pellet al aire, se recogió en agua destilada y
liofilizó.
Las conjugaciones se llevaron a cabo con Hsp71
y, para tener un estándar para la comparación de las eficacias en
la estimulación específica de la actividad CTL, la proteína
portadora de uso común, toxoide diftérico (abreviado TD; TD fue
obtenido de Wako Chemical).
Soluciones de proteína portadora activada: nueve
mg de Hsp71 se disolvieron en 4,5 ml de tampón borato sódico 0,1 M,
pH 8,0. Se añadió sulfo-MBS (éster
m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-sulfosuccinimida)
(2,3 mg en 100 \mul de dimetil sulfoxamina) a la proteína, y la
mezcla de reacción se incubó durante una hora a temperatura
ambiente. El pH se ajustó entonces a 6,0 y la reacción de mezcla se
dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 litro de fosfato sódico 20
mM y NaCl 150 mM, pH 5,6. Se sometió a tratamiento similar al
TD.
Soluciones de péptido reducido: Para cada
reacción de conjugación, se disolvieron 3 mg de péptido en 100
\mul de beta-mercaptoetanol 0,1 M. Tras 1 hora de
incubación para permitir la reducción del péptido, se retiró el
agente reductor por secado de la mezcla de reacción en una
centrifugadora SpeedVac. El péptido se redisolvió en 0,5 ml de agua
destilada a la cual se añadieron alícuotas de 5 \mul de NaOH 1 N
hasta que el péptido estaba completamente disuelto. Para los
experimentos de conjugación con TD, se redujeron 6 mg de péptido y
se redisolvieron entonces en 1 ml de agua.
El pH de las soluciones proteicas portadoras
activadas se ajustó a 6,8 utilizando NaOH 0,1 N. Se hizo reaccionar
la solución que contenía 3 mg de proteína portadora activada con 0,5
ml de la solución de péptido reducido (ó 1 ml de solución de
péptido reducido para la preparación de conjugados con TD) durante 3
horas a temperatura ambiente bajo mezcla continua. Para retirar el
péptido que no había reaccionado, la solución resultante que
contenía el conjugado se dializó durante la noche a 4ºC frente a 1
litro de fosfato sódico 20 mM y NaCl 150 mM, pH 7. Se determinó la
concentración de proteína mediante un ensayo BCA. La eficiencia de
conjugación alcanzada por este procedimiento se ha determinado en
experimentos-piloto previos utilizando péptido NP.B
marcado radioactivamente. La proporción péptido:proteína se
encontró que era de 17,5 para el conjugado
NP.B-Hsp71 (71.NP) y 10,1 para
NP.B-TD (TD.NP).
El plásmido RIB1300 contiene un gen hsp65 BCG de
Mycobacterium bovis (Thole, J.E.R. y otros J. Exp.
Med. 178:343-8 (1993)). Se sintetizó un par
cebador para la amplificación del gen hsp65 en un sintetizador
automático de oligonucleótidos y se purificó utilizando
procedimientos rutinarios. El cebador delantero ("forward")
incluía un sitio de restricción NdeI y preentaba una secuencia
nucleotídica 5' AAT CAC TTC CAT ATG GCC AAG ACA ATT. El cebador
reverso incluía sitios EcoRI y NheI flanqueando a un codón de parada
y presentaba la secuencia nucleotídica 5' CGC TCG GAC GAA TTC TCA
GCT AGC GAA ATC CAT GCC.
Se llevó a cabo una reacción polimerasa en
cadena ("polymerase chain reaction")(PCR) utilizando el par
cebador anteriormente citado y pRIB 1300 como cadena molde de ADN.
Se digerieron doblemente los fragmentos PCR con las endonucleasas de
restricción NdeI y EcoRI y se ligaron a pET28a (Invitrogen)
NdeI/EcoRI-doblemente-digerido
utilizando procedimientos de subclonado rutinarios (Maniatis y
otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ["Clonado
Molecular, un manual de laboratorio"], Cold Spring Harbor Lab.,
Cold Spring Harbor, NY (1989)). Se transformaron células
competentes de la cepa DH5alfa de E. coli con la mezcla de
ligación y se hicieron placas en agar que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se
preparó ADN de plásmido y analizó para detectar la presencia del gen
hsp65 y secuencias del vector, por mapeo de restricción y
secuenciación de nucleótidos. Se identificaron los constructos
correctos (denominados pET65H), incluyendo el gen hsp65
micobacteriano, y se transformó la cepa BL21 de E. coli (DE3;
Novagen) para analizar la expresión del gen hsp65. Se muestra un
mapa esquemático del constructo pET65H en la Fig. 1. Para examinar
la expresión de Hsp65, se cultivaron bacterias transformadas de la
cepa BL21, se indujeron y recogieron siguiendo instrucciones del
fabricante (Novagen). Se lisaron las bacterias, y el material
soluble así como material solubilizado de cuerpos de inclusión con
cloruro de guanidina (Maniatis y otros, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual ["Clonado molecular, un manual de
laboratorio"], Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY
(1989)), se sometió a electroforesis en SDS-PAGE y a
inmunoblot anti-Hsp65 utilizando un anticuerpo
monoclonal específico para la proteína de estrés micobacteriana.
Se insertó una región completa de PVH16
codificante de E6 en el extremo carboxi-terminal de
un gen hsp65 en pET65H.
El plásmido pPVH16 contiene un genoma de PVH16
completo en el vector Bluescript SK(ATCC 45113). Para la
secuencia nucleotídica del genoma de PVH16, ver Seedorf y otros,
Virology 145:181-5 (1985). Se sintetizó un par
cebador para la amplificación del gen E6 en un sintetizador
automático de oligonucleótidos y se purificó utilizando
procedimientos rutinarios. El cebador delantero incluía un sitio de
restricción NheI y presentaba una secuencia nucleotídica 5' AAA AGC
AGA GCT AGC ATG CAC CAA AAG. El cebador reverso incluía sitio EcoRI
y un codón de parada y presentaba una secuencia nucleotídica 5' CTC
CAT GAA TTC TTA CAG CTG GGT.
Se llevó a cabo reacción polimerasa en cadena
("polymerase chain reaction")(PCR) utilizando el par cebador
anteriormente mencionado y pPVH16 como cadena molde de ADN. Los
fragmentos PCR se digerieron doblemente con las endonucleasas de
restricción NheI y EcoRI y se ligaron a pET65H
NheI/EcoRI-doblemente-digerido
utilizando procedimientos rutinarios de subclonado (Maniatis y
otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonado
molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, NY (1989)). Se transformaron células competentes de
la cepa DH5alfa de E. coli con la mezcla de ligado y se
prepararon placas de ágar que contenían 100 \mug/ml de
ampicilina. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se
preparó el plásmido ADN y analizó para detectar la presencia del
gen de fusión hsp65-E6 y las secuencias de vectores,
por medio de mapeo de restricción y secuenciación de ácidos
nucleicos. Los constructos correctos (denominados pET65EH6) que
incluían el gen de fusión hsp65-E6 se identificaron
y transformaron en la cepa BL21(DE3; Novagen) de E.
coli para el análisis de la expresión del gen de fusión. Se
muestra un mapa esquemático del constructo pET65HE6 en la figura 2.
Para examinar la expresión de Hsp65-E6, se
cultivaron bacterias de la cepa BL2 1 transformadas con pET65HE6,
indujeron y recogieron utilizando las instrucciones del fabricante
(Novagen). Se lisaron las bacterias, y el material soluble así como
material de los cuerpos de inclusión solubilizado por el cloruro de
guanidina (Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual ["Clonado molecular: un manual de laboratorio"],
Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (1989)) se
sometieron a electroforesis SDS-PAGE. Se hizo
circular en paralelo el Hsp65 purificado, como estándar. La
expresión de Hsp65-E6 se evaluó por la aparición de
una banda de fuerte tinción con azul de Coomassie que migraba
ligeramente más despacio (peso molecular aparente (MOO) de
aproximadamente o 73 kDa) que el auténtico Hsp65 (PM aparente de
aproximadamente 56 kDa) en muestras de la bacteria
pET65HE6-transformada que no estaba presente en la
bacteria no transformada correspondiente.
Se insertó una región codificante completa de
PVH16 E7 en el extremo carboxi-terminal de un gen
hsp65 en pET65H.
Se sintetizó un par cebador para la
amplificación de un gen E7 en un sintetizador automático de
oligonucleótidos y se purificó utilizando procedimientos
rutinarios. El cebador delantero incluía un sitio de restricción
NheI y presentaba una secuencia nucleotídica 5' AAC CCA CCT GCT AGC
ATG CAT GGA GAT. El cebador reverso incluía sitio EcoRI y un codón
de parada y presentaba la secuencia nucleotídica 5' AGC CAT GAA TTC
TTA TGG TTT CTG.
Se llevó a cabo una reacción polimerasa en
cadena ("polymerase chain reaction")(PCR) utilizando el par
cebador anteriormente mencionado y pPVH16 como cadena molde de ADN.
Los fragmentos PCR se digerieron doblemente con las endonucleasas
de restricción NheI y EcoRI y se ligaron a pET65H
NheI/EcoRI-doblemente digerido utilizando
procedimientos rutinarios de subclonado. Se transformaron células
competentes de la cepa DH5alfa de E. coli con la mezcla de
ligado y se prepararon placas en ágar que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina. Se aislaron las colonias de células transformadas, y se
preparó el plásmido de ADN y analizó para detectar la presencia de
gen de fusión hsp65-E7 y secuencias del vector,
mediante mapeo de restricción y secuenciación de ácidos nucleicos.
Se identificaron los constructos correctos (denominados pET65HE7),
incluyendo el gen de fusión hsp65-E7 y se
transformaron en la cepa BL21(DE3; Invitrogen) de E.
coli para el análisis de la expresión del gen de fusión. Se
muestra un mapa esquemático del constructo pET65HE6 en la figura 3.
Para examinar la expresión de Hsp65-E7, se
cultivaron bacterias de la cepa BL21 transformadas con pET65HE7, se
indujeron y se recogieron utilizando técnicas rutinarias. Las
bacterias se lisaron, y el material soluble así como el material
solubilizado de los cuerpos de inclusión por el cloruro de
guanidina se sometieron a electroforesis SDS-PAGE y
se sometieron a un blot anti-E7 utilizando
anticuerpos monoclonales específicos para PVH16 E7 (Zymed Laboratory
Inc., número de catálogo 28-0006).
Se transformó el constructo pET65HE6 en una cepa
BL21(DE3; Novagen) de E. coli, y se cultivaron las
células transformadas en cultivos de 6 litros de medio 2xYT (20 g de
triptona, 10 g de extracto de levadura, 10 g NaCl por litro) que
contenía 30 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Para cada cultivo,
cuando la densidad alcanzaba 0,5 (OD_{590}), se inducía la
expresión de proteína de fusión utilizando
isopropil-tio-galactopiranósido 0,5
mM, y se incubó el cultivo durante tres horas más a 37ºC. Se
recogieron las células por centrifugación, se suspendieron en 90 ml
de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM,
beta-mercaptoetanol 0,5 mM, pH 7,5) que contenía 200
\mug/ml de lisozima, y se congelaron a -70ºC. Un día después, la
suspensión celular congelada se descongeló al baño maría a 37ºC, y
se suplementó con 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de
leupeptina, 2 \mug/ml de pepstatina y PMSF 2 mM. Todos los pasos
siguientes se realizaron a 0-4ºC. Se lisaron las
células por sonicación, el material insoluble se recogió por
centrifugación a 17.000 rpm durante 15 min (rotor
JA-17, Beckmann). El material pellet se lavó dos
veces con tampón de lisis y entonces se solubilizó, con ayuda de
sonicación, en 90 ml de tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH
7,5, cloruro de guanidina 6 M). El material insoluble se retiró por
centrifugación como anteriormente. El material solubilizado se pasó
entonces por una columna que contenía 50 ml de una resina cargada
con níquel, quelante de metales, (Chelating Sepharose Fast Flow;
Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón A. La proteína de
fusión unida se re-plegó lentamente en la resina con
un gradiente 0-1 M de NaCl. La resina se lavó con
cinco volúmenes de tampón B (NaCl 1 M) para eliminar cloruro de
guanidina residual, y con cinco volúmenes de tampón C (imidazol 50
mM, pH 7,5, beta-mercaptoetanol 0,5 mM, NaCl 150 mM)
para eliminar proteínas contaminantes. Se eluyó la proteína de
fusión con seis volúmenes de un gradiente lineal
50-500 mM de imidazol en tampón C. Se agruparon las
proteínas eluídas y dializaron durante la noche frente a
aproximadamente 40 volúmenes de solución salina de Dulbecco
tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4}
4,3 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 0,137 M), se concentró por ultrafiltración
(Amicon, peso molecular de corte: 30 kDa) y se pasó a través de una
resina Detoxigel equilibrada con solución salina de Dulbecco
tamponada con fosfato para la eliminación de endo-
toxinas.
toxinas.
Se transformó el constructo pET65HE6 en la cepa
BL21(DE3; Novagen) de E. coli, y las células
transformadas se cultivaron en cultivos de 12 litros de medio 2xYT
(20 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 10 g NaCl por
litro) que contenía 30 \mug/ml de kanamicina a 30ºC. Para cada
cultivo, cuando la densidad alcanzaba 0,5 (OD_{590}), se inducía
la expresión de la proteína de fusión con
isopropil-tio-galactopiranósido 0,5
mM, y el cultivo se incubaba durante tres horas más a 37ºC. Las
células se recogieron por centrifugación, se suspendieron en 180 ml
de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM,
beta-mercaptoetanol 0,5 mM, pH 7,5) que contenía
200 \mug/ml de lisozima, y se congeló a -70ºC. Un día después, la
suspensión celular congelada se descongeló al baño maría a 37ºC, y
se suplementó con 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de
leupeptina, 2 \mug/ml de pepstatina y PMSF 2 mM. Todos los pasos
siguientes se realizaron a 0-4ºC. Se lisaron las
células por sonicación, y el material insoluble se recogió por
centrifugación a 17.000 rpm durante 15 min (rotor
JA-17, Beckmann). El material pellet se lavó dos
veces con tampón de lisis y entonces se solubilizó, con ayuda de
sonicación, en 180 ml de tampón A (Tris-HCl 50 mM,
pH 7,5, cloruro de guanidina 6 M). El material insoluble se retiró
por centrifugación como anteriormente. El material solubilizado se
aplicó entonces a una columna que contenía 50 ml de una resina
cargada con níquel, quelante de metales ("Chelating Sepharose Fast
Flow"; Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón A. La
proteína unida se lavó con tampón D (tampón A con Triton X100 al 5%)
y entonces se re-plegó lentamente en la resina con
un gradiente 0-1 M de NaCl. Se lavó la resina con
cinco volúmenes de tampón E (NaCl 1 M, Triton X 100 al 1%) y cinco
volúmenes de tampón B (NaCl 1 M) para eliminar cloruro de guanidina
residual, y cinco volúmenes de tampón F (imidazol 50 mM, pH 7,5,
beta-mercaptoetanol 0,5 mM, NaCl 0,5 M, glicerol
15%) para eliminar proteínas contaminantes. Se eluyó la proteína de
fusión con seis volúmenes de un gradiente lineal
50-500 mM de imidazol en tampón F. Las proteínas
eluídas se agruparon y dializaron durante la noche frente a 40
volúmenes de tampón G (Tris-HCl 30 mM, pH 6,5, EDTA
2 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol 15%) y se
pasó por una columna SP-Sefarosa de 50 ml en el
mismo tampón. Se recuperó la proteína de fusión (unos 42 mg,
representando aprox. 50% del total de proteína de fusión presente en
el extracto no fraccionado) en la fracción eluída, se dializó
durante la noche frente a 40 volúmenes de solución salina de
Dulbecco tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 2,7 mM,
Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 0,137 M), y se concentró
por ultrafiltración (Amicon; peso molecular de corte
30 kDa).
30 kDa).
La proteína de fusión Hsp65-E7
se expresó y purificó utilizando los mismos procedimientos. Se
estimó la pureza de las proteínas de fusión por
SDS-PAGE y tinción de los geles con azul de
Coomassie. Las proteínas eran típicamente de una pureza del
70-90% tras el procedimiento 1, y de una pureza de
aproximadamente el 95% tras el procedimiento preferente 2. Los
niveles de endotoxina tras la purificación mediante el procedimiento
2 estaban por debajo de 20 EU/mg de proteína.
\newpage
Se obtuvieron ratones hembra C57/BL/6, de seis a
ocho semanas de edad, de Charles River Laboratory (St. Constant,
Quebec, Canada). Se inmunizaron subcutáneamente en la nuca a grupos
de seis a ocho ratones por grupo con idénticas cantidades de
proteínas de fusión Hsp65-E6 y
Hsp65-E7 en solución salina de Dulbecco tamponada
con fosfato y purificada como se ha descrito en el Ejemplo 4. Las
dosis de proteínas de fusión totales administradas fueron de 20
microgramos o 200 microgramos, respectivamente. A los controles
negativos de inmunización se les administró adyuvante incompleto de
Freund en solución salina (IFA), y a los controles positivos de
inmunización, 100 microgramos de un péptido sintético PVH16 E7 que
incluía los residuos 44 a 65, en IFA y solución salina. En relación
a las dosis aplicadas de proteínas de fusión, esta cantidad de
péptido E7 administrado representaba un exceso en un factor de 20 ó
200, respectivamente. Se repitieron las inmunizaciones 14 días
después. Doce días después de la segunda inmunización, se infectó a
los ratones por inyección subcutánea en un área afeitada de la
espalda con 1,3 x 10^{5} células tumorales de la línea
TC-1 que expresaban E7. Se registró la incidencia
de tumores como la presencia o ausencia de tumor basada en la
observación visual y palpación cada dos días durante cincuenta días.
La línea celular tumoral TC-1 que expresaba la
proteína PVH16 E7 se derivó de células pulmonares primarias de
ratones C57/BI/6 por inmortalización y transformación con los genes
PVH16 E6 Y E7 y un gen humano activado
c-Ha-ras como han descrito Lin y
otros (Cancer Res. 56:21-26 (1996)). Para la
inoculación de tumores, se cultivaron células TC-1,
suministradas por Dr. T.C. Wu (The Johns Hopkins Medical
Institution, Baltimore, MD), hasta una confluencia del
60-70% en un medio RPMI1640 suplementado con suero
fetal bovino al 10% (Hyclone, Logan, UT), aminoácidos no esenciales,
glutamina, piruvato, gentamicina,
beta-mercaptoetanol, 0,4 mg/ml Geneticina® (Life
Technologies, Grand Island, N.Y.) y 0,2 mg/ml de higromicina B a
37ºC. Las células se recogieron por tripsinización y se
resuspendieron en solución tampón de Hank a una densidad de 6,5 x
10^{5} células/ml.
Se muestran los resultados de un experimento de
este tipo en la figura 4. Poco después de la infección provocada,
la incidencia de tumores se incrementó en todos los grupos de
tratamiento (entre 5 y 15 días después de la infección). Mientras
que la incidencia permaneció elevada en el grupo IFA, cayó
rápidamente a 0% en los grupos tratados con 200 microgramos de
mezcla de proteína de fusión o con péptido E7 en IFA. Se obtuvo un
resultado intermedio en el grupo tratado con 20 microgramos de
proteínas de fusión. Así, la inmunización con mezclas de proteínas
de fusión Hsp65-E6 y Hsp65-E7 en
ausencia de cualquier adyuvante, protegió eficazmente a los ratones
contra la infección mortal con células tumorales que expresaban E7.
Se muestra un resumen de los resultados en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupo de inmunización | Porcentaje de incidencia de tumor* | |
Tras la primera infección | Tras la segunda infección | |
(Día 54) | (Día 79) | |
IFA o Nada** | 83 (5/6) | 100 (4/4) |
20 microgramos de proteínas de fusión | 25 (2/8) | 25 (1/4) |
200 microgramos de proteínas de fusión | 0 (0/8) | 0 (0/4) |
Péptido E7 en IFA | 0 (0/8) | 0 (0/4) |
* \begin{minipage}[t]{155mm} \hskip0,1cm En paréntesis, se indica el número de animales con tumor/número total de animales por grupo. En la columna {}\hskip0,1cm de la derecha, se registró la presencia o ausencia de tumor en los animales durante 25 días adicionales (tras la {}\hskip0,1cm segunda infección).\end{minipage} | ||
** \begin{minipage}[t]{155mm}Como control para la segunda infección de tumor, se ha incluído un grupo de animales no inmunizados para su comparación.\end{minipage} | ||
Para evaluar la longevidad de la respuesta
inmunológica a los antígenos PVH, se infectó una segunda vez a
grupos de cuatro animales supervivientes del experimento anterior
(en el día 54), de tanto los grupos tratados con proteína de fusión
como del grupo péptido E7/IFA, con 1,3 x 10^{5} células tumorales
vivas TC-1 por animal. Como control, se incluyó un
grupo de ratones nuevos, expuestos a infección por el mismo tumor.
Se evaluó la incidencia de tumores 25 días después.
\newpage
Se muestran los resultados en la Tabla 1. Los
animales previamente inmunizados con proteínas de fusión o con
péptido E7/IFA estaban completamente o casi completamente protegidos
de la segunda infección, mientras que los animales no inmunizados
mostraron una incidencia de tumor del 100%.
Se realizó eutanasia de grupos de dos ratones de
los tratamientos de proteína de fusión, péptido o animales no
inmunizados, por dislocación cervical, extrayéndoles después el
bazo. Se prepararon suspensiones celulares de todos los bazos
agrupados y lavaron una vez con solución tampón de Hank suplementada
con suero fetal bovino 5%. Las células linfoides se reestimularon
por cultivo de 20 x 10^{6} células viables con 2 x 10^{6}
células TC-1 tratadas con mitomicina C durante 5
días en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal
bovino 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM,
2-mercaptoetanol 50 \muM y 50 \mug/ml de
gentamicina sulfato a 37ºC y CO_{2} 5%. Se recogieron entonces los
esplenocitos (células efectoras) y utilizaron en el ensayo de
actividad CTL como se describe a continuación.
Se utilizaron como células diana las líneas
celulares EL4 y MC57G tipos emparejados con TC-1 y
HLA, que no expresaban el epítopo E7. Se incubaron las células
durante 90 min con 150 \muCi Na_{2}^{51}CrO_{4} y, en el
caso de células EL4, también con 10 \mug de
péptido_{366-374} de nucleoproteína de virus
influenza por cada 10^{6} células. Después del lavado extensivo
para eliminar el exceso de marca radioactiva, se
co-cultivaron 5 x 10^{3} células dianas marcadas
con células efectoras reestimuladas a varias razones de célula
efectora a célula diana. Tras 4-5 horas de
incubación, las placas de cultivo se centrifugaron durante 5 min a
200 x g, y alícuotas de 100 \mul de las soluciones de
sobrenadante que contenía marcaje radioactivo liberado por las
células se recogieron en "Beckman Ready Caps". Se midió la
radioactividad por conteo de centelleo líquido. Para determinar
radioactividad liberada espontáneamente y total liberable, se
recogieron las soluciones sobrenadantes de los cultivos que
contenían las células diana solamente o de las células diana lisadas
por adición de Triton X100, y se determinó su radioactividad como
anteriormente. Los resultados se expresan
como % lisis corregida, calculada a partir de la fórmula siguiente:
como % lisis corregida, calculada a partir de la fórmula siguiente:
Porcentaje
Lisis Corregida = 100 x (cpm_{test} - cpm
_{espont})/(cpm_{total} -
cpm_{espont}),
donde cpm_{test} es la
radioactividad liberada de un co-cultivo particular,
cpm_{espont} es la radioactividad espontáneamente liberada de un
cultivo celular diana y cpm_{total} es la radioactividad liberada
por lisis con Triton X100 de células diana. Los ensayos CTL se
llevaron a cabo por triplicado, y se dan los valores
medios.
Se muestran los resultados de un experimento
utilizando células TC-1 como células diana en la
figura 5. Un 40% y un 25% de lisis de células TC-1
fue mediado por células efectoras (utilizadas en un exceso de un
factor de 100 sobre las células diana) obtenidas de animales
inmunizados con 200 \mug y 20 \mug de proteínas de fusión,
respectivamente.
En un segundo experimento, se testeó la
especificidad de la actividad CTL utilizando esplenócitos de
animales inmunizados con 20 \mug de proteínas de fusión. Los
resultados mostrados en la figura 6 demuestran lisis efectiva de
células TC-1 transformadas con PVH16 E6/E7. La lisis
de los otros dos tipos celulares (EL4 y MC57G) que no expresaban el
antígeno PVH tuvo lugar con una eficiencia mucho más reducida,
demostrando la especificidad de la respuesta CTL provocada por la
inmunización con proteínas de fusión Hsp65-E6 y
-E7.
Se utilizaron tres grupos de ocho ratones
C57/BIJ6 en este experimento. Se le inocularon 1,3 x 10^{5}
células TC-1 a cada animal, subcutáneamente por un
área afeitada de la espalda. Dos días después, se le administró a
un primer grupo solución salina (control negativo), a un segundo
grupo 100 \mug/animal de proteína de fusión
Hsp65-E7 y a un tercer grupo 100 \mug/animal de
péptido E7 en solución salina e IFA (control positivo). Todas las
inyecciones (0,2 ml) se hicieron subcutáneamente en la nuca. Catorce
días después (16 días después de la inoculación de tumor), se
repitieron las inyecciones. Se examinaron los ratones un día después
de la inoculación de tumor, y cada dos días a partir de entonces,
se comprobaron la presencia o ausencia de tumor por inspección
visual y palpación.
La figura 7 revela que 9 días después de la
inoculación de tumor, todos los grupos de tratamiento mostraron
incidencia máxima de tumores (expresada como porcentaje de animales
con tumor), en un rango de entre 85 y 100%. Llegados al día 17, sin
embargo, el grupo tratado con proteína de fusión
Hsp65-E7, así como el grupo que recibió péptido E7
en IFA, mostraron una reducción altamente significativa en
incidencia de tumor que se estabilizó en aprox. un 15%. En
contraste, el grupo tratado con solución salina continuó teniendo
una incidencia de tumor de casi el 100% durante el resto del
período de observación. Estos resultados demuestran que la proteína
de fusión Hsp65-E7, administrada en ausencia de
adyuvante, induce una drástica regresión en un tumor inducido por
PVH.
Se muestran en la figura 8 resultados de un
experimento similar. En este experimento, los animales fueron
inoculados con una dosis de tumor más elevada (2 x 10^{5}/animal)
que en el experimento anterior. Los resultados obtenidos fueron muy
parecidos a aquellos del experimento anterior.
Se produjo y purificó la proteína de fusión
Hsp65-E7 como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se
obtuvo una proteína de longitud completa PVH E7 siguiendo el
siguiente procedimiento.
El gen E7 se amplificó a partir de ADN genómico
de PVH16 (pSK/PVH16 obtenido de la "American Tissue Collecion"
["Colección americana de tejidos"]), utilizando una ADN
polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). El cebador "forward"
(5'-AAC CCA GCT GCT AGC ATG CAT GGA
GAT-3') contenía un sitio NheI inmediatamente
corriente arriba del codón de parada ATG, mientras que el cebador
reverso (5'-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT
CTG-3') contenía un sitio EcoRI inmediatamente
corriente debajo de un codón de parada TAA de la secuencia
codificante de E7. El producto PCR se digerió con NheI y EcoRI, se
purificó de un gel de agarosa, y se ligó a pET28a que había sido
digerido con los mismos enzimas de restricción. Se llevó a cabo la
transformación de bacterias, aislamiento de colonias que contenían
recombinantes, y la preparación de plásmido de ADN de las colonias
expandidas, mediante procedimientos estándar. Ver, por ejemplo,
Ausubel y otros (eds.), Short Protocols in Molecular Biology
["Protocolos breves en biología molecular"], 3ª edición (John
Wiley & Sons, Inc. 1995). La identidad del constructo plásmido
resultante, pET/E7 (H) se confirmó por digestión diagnóstica de
restricción y análisis de secuencias de ADN. Se presenta un mapa
esquemático de pET/ET(H) en la figura 9.
Se inocularon doce litros de medio 2xYT que
contenía 30 \mug/ml de kanamicina con un cultivo de E. coli
BL21(DE3) que contenía pET/E7 (H) y se incubó durante la
noche a 30ºC con aireación. Cuando se alcanzó una densidad óptica de
0,5, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM durante tres horas. Se
recogieron entonces las células por centrifugación, se
resuspendieron en 180 ml de tampón de lisis
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,5,
2-mercaptoetanol 0,5 mM), se suplementaron con 200
\mug/ml de lisozima y congelaron a -70ºC durante la noche. Se
descongeló la suspensión celular al baño maría a 37ºC en presencia
de 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, y 2
\mug/ml de pepstatina. Tras la adición de PMSF 2 mM, se sometió a
la suspensión celular a sonicación vigorosa, y se recogieron las
proteínas insolubles por centrifugación. Se resuspendieron dos veces
los pellets de proteína en tampón de lisis, resonicaron y recogieron
por centrifugación. Se solubilizaron entonces los pellets de
proteína por sonicación en tampón A (Tris-HCl 50 mM,
pH 7,5, cloruro de guanidina 6 M, 2-mercaptoetanol 1
mM), y el material insoluble se eliminó por centrifugación. Las
proteínas solubilizadas se pasaron por una columna de 50 ml
Ni-quelante (2,6 cm x 12 cm; Pharmacia) que había
sido pre-equilibrada con tampón A. Se lavó la
proteína unida con 5 volúmenes de lecho de tampón E (tampón A con
Triton X-100 2%) y se re-plegaron
con un gradiente de cloruro de guanidina-cloruro
sódico (NaCl 0,1 M/cloruro de guanidina 6,0 M; 5 volúmenes de lecho
en presencia de Triton X-100 1%. La proteína
re-plegada se lavó con 5 volúmenes de lecho) de
tampón F (Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, NaCl 1 M,
glicerol 15%, Triton X-100 2%,
2-mercaptoetanol 1 mM) y a continuación con 5
volúmenes de lecho de tampón G (tampón F sin Triton
X-100) para eliminar el Triton
X-100. La columna se lavó posteriormente con 5
volúmenes de lecho de tampón H (imidazol 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M,
glicerol 15%, 2-mercaptoetanol 1 mM) para eliminar
proteínas débilmente unidas. Se eluyó la proteína E7 con un
gradiente lineal de imidazol (imidazol de 50 mM a 1 M en tampón H).
La proteína E7 se concentró y dializó frente a solución salina de
Dulbecco tamponada con fosfato y suplementada con glicerol 25%. Se
guardó la proteína soluble a -70ºC. La preparación de E7 se
comprobó que era esencialmente homogénea utilizando
SDS-PAGE y tinción de proteínas.
Las concentraciones de endotoxina de las
preparaciones de proteínas se evaluaron utilizando el test del
amebocito de Limulus y se halló que no eran superiores a 50
unidades de endotoxina por miligramo de proteína.
Se inmunizaron grupos de 5 ratones C57BL/6 por
inyección en la base de la cola con solución salina, o con 0,055,
0,55 ó 1,8 nanomoles de proteína E7 o proteína de fusión
Hsp65-E7 en solución salina. Los volúmenes de
inyección fueron de 0,2 ml. Diez días después, se extirparon
asépticamente los nódulos linfáticos inguinales (NL) de cada
animal, y se agruparon los NL de cada uno de los cinco animales de
cada grupo. Se prepararon suspensiones celulares por procedimiento
estándar. Para cada pool de células NL (2 x 10^{6} células/ml),
se sembraron placas de fondo plano de 96 pocillos con 4 x 10^{5}
células por pocillo. Se examinaron las células por triplicado para
comprobar las respuestas proliferativas a la adición de cada medio,
10 ó 50 \mug/ml de proteína E7, 10 ó 100 \mug/ml de proteína de
fusión Hsp65-E7, ó 1 ó 10 \mug/ml de péptido E7
("pep": residuos 44-57). Tras las adiciones,
se incubaron las células durante cuatro días a 37ºC y 5% de
CO_{2}. Se añadió timidina tritiada (1 \muCi) a cada cultivo.
Tras 15 horas más de incubación, las células se recogieron y
prepararon para el conteo de centelleo. Los datos se presentan en la
figura 10, como cpm medios de radioactividad incorporada +/-
desviación estándar.
Los diferentes paneles muestran ensayos con
células NL de animales inmunizados con las diferentes cantidades de
proteína de fusión Hsp65-E7 o de proteína E7,
cantidades ya citadas anteriormente. Los resultados muestran que la
inmunización con proteína de fusión Hsp65-E7 inducen
inmunidad celular frente a la proteína de fusión misma (arriba y en
medio-izquierda) así como frente a la proteína E7
(en medio-izquierda). El reconocimiento de la
proteína E7 queda aún más demostrada por la inducción observada en
la proliferación del péptido E7, péptido que se sabe que representa
un epítopo de célula T ayudante (en
medio-izquierda). En contraste, no se observaron
respuestas proliferativas con células NL de animales inmunizados con
diferentes cantidades de proteína E7 (en
medio-derecha y abajo) o
falsos-inmunizados con solución salina. Las células
preparadas de animales inmunizados con proteína E7 eran viables,
como evidencia su capacidad para proliferar en respuesta al mitógeno
ConA de célula T. En resumen, cuando se compara la inmunización con
E7, la inmunización con proteína de fusión Hsp65-E7
provoca una respuesta inmunológica celular a E7 superior, medida a
partir de la proliferación de células NL de animales
inmunizados.
Para examinar la eficacia de la proteína de
fusión Hsp65-E7 en la terapia tumoral, se inocularon
ratones C57/BL/6 con 1,3 x 10^{5} células tumorales
TC-1 por inyección subcutánea en áreas afeitadas de
la espalda. Siete días después, cuando todos los animales habían
desarrollado tumores palpables/medibles, se asignaron
arbitrariamente a todos los animales tres grupos de tratamiento.
Cada grupo incluía 12-14 animales. Todos los
tratamientos fueron por inyección subcutánea de un volumen de 0,2
ml en la nuca. El primer grupo recibió inyecciones de 100 \mug de
proteína de fusión Hsp65-E7, el segundo grupo
recibió 20 \mug de proteína E7 (correspondiente a una cantidad
molar similar a los 100 \mug de proteína de fusión), y el tercer
grupo recibió solución salina. Un día después de la inoculación de
tumores, se inspeccionaron visualmente y por palpación los ratones
para la presencia de tumores. Se determinaron los volúmenes de los
tumores utilizando calibradores en dos direcciones ortogonales. Se
obtuvieron los volúmenes a partir de estas medidas utilizando las
fórmulas de conversión descritas en Naito y otros, Cancer Research
46:4109 (1986). Los resultados se presentan en la figura 11 como
volumen tumoral medio en cada grupo +/- error estándar.
Los resultados demuestran que el tratamiento con
proteína de fusión Hsp65-E7 resultó en la completa
regresión de tumores establecidos de tamaño considerable. El efecto
fue manifiesto en cada uno de los animales tratados. En contraste,
ni el tratamiento en falso ni el tratamiento con proteína E7 causó
más que una regresión transitoria de los tumores. Se presenta en la
Tabla 2 una evaluación estadística de las medidas de los tumores,
realizada en tres momentos tardíos del experimento. Como evidencian
los valores de p calculados, los efectos sobre el tamaño tumoral
del tratamiento con proteína de fusión Hsp65-E7 son
estadísticamente diferentes de los efectos con los otros
tratamientos.
Comparación | Día de la medida | Valor de p |
Solución salina vs. Hsp65-E7 | 30 | 0,048 |
33 | 0,079 | |
35 | 0,046 | |
Solución salina vs. E7 | 30 | 0,853 |
33 | 1 | |
35 | 0,86 |
Nótese que en los Ejemplos previos, la proteína
Hsp65-E7 había sido producida como proteína marcada
con histidina. Para demostrar sin ambigüedades que los efectos
terapéuticos observados no se relacionan de modo alguno con la
presencia en la proteína de fusión de una secuencia
oligo-histidina, se preparó proteína de fusión
Hsp65-E7 sin marca de histidina y se utilizó en
este Ejemplo. Se obtuvo la proteína de fusión utilizando el
procedimiento siguiente.
Para la construcción de plásmido ET65C (figura
12), se amplificó el gen hsp65 de Bacillus Calmette Guerin (BCG)
desde el plásmido RIB 1300 (Van Eden y otros, Nature 331:171,
1988) utilizando ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). El cebador
delantero utilizado (5'-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT
GCG-3') contenía un sitio NdeI que incluía el codón
de inicio ATG del gen hsp65, y el cebador reverso
(5'-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT
GCC-3') contenía un sitio NdeI inmediatamente más
abajo del codón de paro TGA de la secuencia de codificación de
Hsp65 y un sitio NheI inmediatamente corriente abajo. El producto
PCR se digerió con NcoI y NheI, se purificó en un gel agarosa, y se
ligó a pET28a digerido de manera similar. La mezcla de ligación se
transformó en E. coli DH5alfa, y se aislaron las colonias
resistentes a antibiótico y se amplificaron para la preparación de
plásmido ADN. El plásmido ET65C se identificó por digestiones de
restricción diagnóstica y análisis de secuencias de ADN.
Para preparar el plásmido
ET65C/E7-1N que contenía un gen de proteína de
fusión Hsp65-E7 sin marca, se amplificó el gen E7 a
partir de ADN genómico de PVH 16 (se obtuvo pSK/PVH16 de la
"American Tissue Culture Collection" ["Colección americana
de cultivos de tejidos"] utilizando ADN polimerasa AmpliTaq
(Perkin Elmer). El cebador "forward" (5'-CCA
GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3') contenía un sitio
NdeI que incluía un codón de inicio ATG, mientras que el cebador
reverso (5'-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT
CTG-3') contenía un sitio EcoRI inmediatamente
corriente debajo de un codón de parada TAA de la secuencia que
codifica para E7. El producto PCR se digerió con NdeI y EcoRI, se
purificó en gel agarosa, y se ligó a pET65C que había sido digerido
con los mismos enzimas de restricción. Se llevó a cabo la
transformación de las bacterias, aislamiento de colonias que
contenían recombinantes, y preparación de plásmido ADN de las
colonias expandidas, utilizando procedimientos estándar. Ver, por
ejemplo, Ausubel y otros (eds.), Short Protocols in Molecular
Biology ["Protocolos breves en biología molecular"], 3ª
edición (John Wiley & Sons, Inc. 1995). Se confirmó la identidad
del constructo plásmido resultante, pET65C/E7-1N
por digestión de restricción diagnóstica y análisis de secuencias de
ADN. Se presentó un mapa esquemático de pET65C/E7-1N
en la figura 13.
Se inocularon doce litros de medio 2xYT con 30
\mug/ml de kanamicina con un cultivo de E. coli
BL21(DE3) que contenía pET65C/E7-1N y se
incubó durante la noche a 30ºC con aireación. Al alcanzar una
densidad óptica de 0,5, se indujo al cultivo con IPTG 0,5 mM
durante tres horas. Se recogieron entonces las células por
centrifugación, resuspendieron en 180 ml de tampón de lisis
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,5,
2-mercaptoetanol 0,5 mM) suplementado con 200
\mug/ml de lisozima y se congeló a -70ºC durante la noche. Se
descongelaron las suspensiones celulares al baño maría a 37ºC en
presencia de 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, y
2 \mug/ml de pepstatina. Tras la adición de PMSF 2 mM, se sometió
a las suspensiones celulares a sonicación vigorosa, y se eliminaron
las proteínas insolubles por centrifugación. La mayor parte de
proteína Hsp65-E7 sin marcar se halló que estaba en
la fracción proteica soluble. Para eliminar las endotoxinas, se
añadió Triton X-114 1% a la fracción proteica
soluble, y se enfrió la mezcla en hielo (durante 5 minutos o más) y
se mezcló concienzudamente. La mezcla se calentó entonces durante
10 minutos al baño maría a 30ºC y se sometió a centrifugación a
24ºC. La fracción clarificada sobrenadante (capa superior) se
transfirió a un tubo limpio. Se repitio la centrifugación
3-6 veces para eliminar el Triton
X-114 residual. Se sometió entonces a la fracción
sobrenadante a fraccionamiento de sulfato amónico. Se recuperó la
proteína de fusión en la fracción 0-15% de sulfato
amónico (p/v). Se disolvió la proteína precipitada en tampón B
(Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, urea 3 M, EDTA 1 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM) y se pasó por una columna de
170 ml Source Q (3,5 cm x 20 cm; Pharmacia)
pre-equilibrada con tampón B. Se lavó la columna con
3 volúmenes de lecho de tampón C (tampón B menos urea) y entonces
con 3 volúmenes de tampón D (tampón C suplementado con NaCl 250 mM).
Se eluyó la proteína de fusión con un gradiente lineal salino (NaCl
250 mM-1 M en tampón C) (pool A) y a continuación
con cloruro de guanidina 6 M (tampón A)(pool B). Se pasó entonces el
pool B por una columna de 50 ml Ni-quelante (2,6 cm
x 12 cm; Pharmacia) pre-equilibrada con tampón A. Se
lavó la proteína unida con 5 volúmenes de lecho de tampón E (tampón
A con Triton-X-100 2%) y se
re-plegó con un gradiente de cloruro de
guanidina-cloruro sódico (NaCl 0,1 M/cloruro de
guanidina 6,0 M; 5 volúmenes de lecho) en presencia de Triton
X-100 1%. La proteína re-plegada se
lavó con 5 volúmenes de lecho de tampón F (Tris-HCl
30 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, glicerol 15%, Triton X-100
2%, 2-mercaptoetanol 1 mM) y a continuación con 5
volúmenes de lecho de tampón G (tampón F sin Triton
X-100) para eliminar el Triton
X-100. Se lavó una vez más la columna con 5
volúmenes de lecho de tampón H (imidazol 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M,
glicerol 15%, 2-mercaptoetanol 1 mM) para eliminar
las proteínas débilmente unidas. Se eluyó la proteína de fusión con
un gradiente lineal de imidazol (imidazol 50 mM a 1 M en tampón H).
La proteína Hsp65-E7 sin marcar se concentró y
dializó frente a solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato y
suplementada con glicerol 25%. Se guardó la proteína soluble a
-70ºC. El análisis por SDS-PAGE y tinción de
proteínas reveló que la preparación tenía una pureza aproximada del
90%.
Como demostración adicional de la no relevancia
de la marca histidina, se compararon directamente las eficacias de
Hsp65-E7 marcada con histidina y Hsp65—E7 sin marcar
en un experimento sustancialmente idéntico al descrito
anteriormente. Se encontró que las dos proteínas de fusión
provocaban la regresión de tumores con eficacias similares.
Los expertos en la técnica podrán conocer, o
serán capaces de asegurar, utilizando exclusivamente experimentación
rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de
la invención descrita en el presente documento. Éstos y todos los
demás equivalentes se pretende que se hallen incluídos en las
reivindicaciones siguientes.
Claims (14)
1. Proteína de fusión que comprende el antígeno
proteico HPV 16 E7 y la proteína M. Bovis BCG Hsp65, siendo
codificada por un plásmido que se puede obtener por el siguiente
proceso:
- (a)
- amplificar el gen de M. Bovis BCG hsp65 contenido en el plásmido RIB 1300 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5'-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG-3' y un cebador inverso que tiene la secuencia 5'-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT GCC-3';
- (b)
- digerir el producto amplificado con NcoI y NheI;
- (c)
- purificar el producto amplificado;
- (d)
- ligar el producto amplificado a un plásmido digerido con NcoI y NheI;
- (e)
- amplificar el gen E7 del ADN genómico de HPV 16 contenido en el plásmido pSK/HPV16 utilizando un cebador adaptativo que tiene la secuencia 5'-CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3' y un cebador inverso que tiene la secuencia 5'-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3';
- (f)
- digerir el producto amplificado con NdeI y EcoRI;
- (g)
- purificar el producto amplificado; y
- (h)
- ligar el producto amplificado a dicho plásmido obtenido en la etapa (d) digerido con NdeI y EcoRI.
2. Molécula de ácido nucleico que codifica la
proteína de fusión de la reivindicación 1.
3. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 2, que comprende además un vector de expresión.
4. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 3, en la que el vector de expresión es un vector de
adenovirus o un vector vírico adeno-asociado.
5. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 3, en la que el vector de expresión es un vector
retrovírico.
6. Compuesto que incluye la proteína de fusión
de la reivindicación 1.
7. Compuesto, según la reivindicación 6, en el
que la proteína induce una respuesta inmune celular.
8. Compuesto, según la reivindicación 6, en el
que la proteína induce una respuesta inmune humoral.
9. Compuesto, según la reivindicación 6, que
comprende además un coadyuvante, un tensoactivo, un excipiente, un
portador o un diluyente.
10. Compuesto, según la reivindicación 6, para
inducir una respuesta inmune contra el antígeno de la proteína
HPV.
11. Utilización del compuesto de la
reivindicación 6, para la fabricación de un medicamento para inducir
respuesta inmune contra un antígeno de la proteína HPV.
12. Compuesto que comprende un vector de
expresión para inducir una respuesta inmune contra un antígeno de
la proteína HPV 16 E7, en el que el vector de expresión comprende
una secuencia que codifica la proteína de fusión de la
reivindicación 1.
13. Compuesto, según la reivindicación 12, en el
que el vector de expresión es un vector de adenovirus o un vector
vírico adeno-asociado.
14. Compuesto, según la reivindicación 12, en el
que el vector de expresión es un vector retrovírico.
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