CN1769298B - 一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的融合蛋白的氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：5所示。本发明的具有抗肿瘤作用的融合蛋白可作为预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的适应症，特别是可作为预防和/或治疗宫颈癌、宫内上皮瘤样病变或肛门发育不全的疫苗。

Description

一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与以该融合蛋白为活性成分的预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤疫苗。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)属乳多孔病毒科A亚组，是异族主要侵犯人体皮肤粘膜的小DNA病毒，引起上皮的增生改变，具有明显的组织特异性。按照HPV感染与子宫颈癌发生的危险性，将HPV分为低危型(HPV1、5、6、11等)和高危型(HPV16、18、31、33、45等)。低危型HPV可引起表皮细胞良性增生，如乳头状瘤或疣；高危型HPV与子宫颈上皮内瘤的发生和恶变以及其它上皮型肿瘤的发生相关。其中HPV16与子宫颈癌的关系最为密切，在所有子宫颈癌标本中HPV16的检出率在50％以上。

根据核苷酸序列进行分型，现已鉴定出的HPV有100多个亚型。HPV病毒体直径约55nm，为二十面体对称结构，有外膜包被。其基因组是一闭环双链DNA，属双链DNA病毒，长约8Kb，分早期区、晚期区和调节区。早期区(early region，ER)包括6个不同的开放阅读框：E1、2、4-7。E1通过与DNA多聚酶α结合启动DNA复制。E2蛋白质是一个转录激活调节因子，有DNA结合特性。E4蛋白可能与病毒颗粒释放有关，E5编码一种疏水的膜蛋白，是血小板生长因子/表皮生长因子受体激活因子，具有一定转化潜能。E6、E7编码的蛋白有细胞转化功能，是高危型HPV致癌作用的主要蛋白质。体内体外研究表明他们有致肿瘤活性，主要表现在：高危型HPV的E6、E7蛋白可使原代细胞永生化；抑制细胞终末分化；影响细胞周期调控；以及E6或E7蛋白质转化的永生化细胞在裸鼠体内能形成肿瘤。E6基因编码的E6蛋白可与细胞P53蛋白结合而发挥转化功能，E6蛋白质与P53蛋白质结合后，加速P53蛋白质的降解，使之丧失“分子警察”的功能，失去抑癌活性；E7蛋白通过与抑癌基因产物Rb蛋白结合，从而影响Rb与转录因子E2F的结合，与Rb分离状态下的E2F对细胞有转录激活作用，能刺激细胞增殖。E6或E7蛋白质的单独作用已具有一定的转化功能，但两者的协同作用可极大地提高转化频率。

HPV感染与人体多种癌症，尤其是子宫颈癌的发病有关。不同型别HPV感染不同的上皮组织，引起的病理变化也不同，对身体不同部位的皮肤和粘膜的嗜向性不同，即HPV感染有明显的组织特异性。根据所感染上皮的不同，将HPV分为皮肤型和粘膜型，并将前者进一步分为寻常疣和疣状表皮结构不良两种类型。粘膜型HPV感染下生殖道或下泌尿道粘膜上皮，感染口腔和呼吸道粘膜者较少。按照与生殖道肿瘤的关系，将之分为低危型和高危型，低危型(HPV6、11)引起生殖道乳头状疣或尖锐湿疣的形成；高危型(HPV16、18、33)引起子宫颈上皮内瘤，并进而与子宫颈癌的发生有关。

HPV16至今还不能在体外组织中培养，且含有潜在致癌性DNA，故疫苗不能采用HPV减毒活疫苗或灭活疫苗。因此现在疫苗的研究重点在其他形式的疫苗，如基于晚期蛋白L1的亚单位疫苗、合成多肽疫苗、DNA重组活疫苗和DNA疫苗等。

(一)病毒样颗粒

HPV病毒体诱发的抗体，尤其是中和抗体，只能识别构象依赖性表位，因此不能用它们作为抗原和免疫原进行HPV16的抗体检测或制备疫苗。HPV16的L1和L2基因编码病毒衣壳蛋白，与病毒的侵袭性感染有关而无转化活性。最初利用大肠杆菌表达的L1和L2蛋白只能形成线性表位，缺乏翻译后修饰，用血清学检测时结果缺乏特异性，也不与病情相关，免疫学研究证明所诱发的抗体滴度低，不能形成有效保护。用沙门氏菌表达的L1和L2蛋白能装配成病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，可诱发高滴度抗体。与原核表达系统相比，真核系统表达的晚期蛋白更具有天然蛋白质的免疫原性。动物试验表明，用VLP免疫动物可产生有效的保护作用。此疫苗正在进行临床试验。

(二)DNA重组活疫苗

DNA重组活疫苗的优势在于能使感染细胞内源性表达目的基因，有正确的翻译后修饰加工作用。痘苗病毒是最有吸引力的侯选表达载体，它对外源DNA容量大，可诱导宿主产生体液和细胞免疫反应。HPV16L1重组痘苗病毒可以刺激小鼠产生CTL反应，但它会引起免疫缺陷者的种痘后脑炎或进行性牛痘等副作用。腺病毒作为载体的毒性相对较小，经鼻腔免疫后可刺激肺和生殖道中IgA抗体分泌，这对HPV这种生殖道感染疾病具有吸引力，但临床试验并非预期的那样好。

(三)合成多肽疫苗

安全性好，容易制备和储存，有理想的靶特异性。但制备多肽疫苗的前提是明确抗原的决定簇结构。至今HPV16的中和表位和T细胞表位尚未完全确定，因此这种方式还有一定难度。

(四)DNA疫苗

DNA疫苗具有纯化技术简单、制备迅速、成本低廉、易于储存等特点。接种DNA疫苗后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与主要组织相容性复合体MHC I类或II类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，免疫应答全面，保护力强，维持时间久；尤其是在宿主细胞内表达的蛋白质抗原与其自然感染相似，按正常途径加工、处理、修饰，并以天然构象递呈给宿主免疫系统，激发免疫应答。HPV16L1的核酸疫苗动物实验显示具有良好的效果，可以诱导小鼠产生对HPV16L1的特异性体液和细胞免疫。但DNA疫苗在临床试验中的效果并不理想，并且DNA疫苗的安全性还需要进一步深入研究。

以上所介绍的各种HPV疫苗大多处于研究阶段，并且重点主要放在预防性疫苗上。其中效果最好的是病毒样颗粒，现正在进行临床试验。对于由HPV16感染引起的宫颈癌、宫颈上皮内瘤(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)等疾病这些预防性疫苗就会失去作用。针对这些疾病，需要开发相应的治疗性疫苗。

高危型HPV16 E7基因编码的蛋白质具有转化活性，在子宫颈癌组织中持续表达，被认为是病毒的癌基因，其表达的蛋白质被认为是肿瘤排斥抗原，因而是治疗HPV相关肿瘤和子宫颈癌高度特异型增生的最富有吸引力的靶抗原基因。

以E7为基础开发疫苗的方法主要有三种：

(1)用细菌、酵母或昆虫细胞表达系统制备野生型E7的完整蛋白质作抗原；

(2)将E7的完整或突变基因重组入不同的载体系统，如腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒，直接构建DNA疫苗；

(3)E7蛋白的CTL表位多肽作为亚单位疫苗。

现在已经知道，以上几种疫苗形式均可以激活体液或细胞免疫，但是本身都有其内在的缺点，如DNA疫苗，到目前为止国际上尚未有成熟产品上市；单独用E7蛋白的CTL表位多肽作为亚单位疫苗，疫苗的保护作用不能持久等。

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一类在分子进化上高度保守、广泛存在于细菌、原虫、蠕虫、酵母菌、植物、动物乃至人类的家族蛋白，其功能极为相似，具有分子伴侣作用，参与多种胞内蛋白的折叠、装配及转运；近年来发现，病原体Hsp与病原体抗原表位相结合可以成为免疫优势抗原(immunodominantantigens)引起抗感染免疫；Hsp还可以作为肿瘤病毒疫苗的载体，诱导机体肿瘤特异性CTL反应，其研究策略是：热休克蛋白和肿瘤特异性抗原肽融合表达，融合肽疫苗注射人体后可激活针对肿瘤细胞的特异性免疫反应。其理论基础是，Hsp可以通过受体介导的抗原提呈细胞(APC)的内吞作用对与其融合的抗原肽进行加工、递呈给树突状细胞的MHC-I分子，后者可被特异性CD8+T细胞识别，从而激活机体特异性细胞毒性T细胞(CTL)效应。

结核分支杆菌热休克蛋白65(HSP65)属于HSP70家族，结核分支杆菌的胞壁蛋白。在感染结核分支杆菌的患者的血清抗体中，有20％的抗体是针对这个蛋白的，说明它有很强的免疫原性。另外，它和人的HSP70有较高的同源性，如果和抗原肽结合，也可以进入人或小鼠MHC-I限制性抗原递呈途径，进而激活细胞免疫。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的具有抗肿瘤作用的融合蛋白，名称为HEZ，是具有序列表中的SEQ ID №：5的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中SEQ ID №：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗肿瘤作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：5由696个氨基酸残基组成。

HEZ由HSP65、HPV16E7和Z-tag结构域组成。Z-tag结构域使HEZ通过阳离子交换层析得到了有效纯化，并且提高了HEZ的疫苗活性。

上述具有抗肿瘤作用的融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述具有抗肿瘤作用的融合蛋白的编码基因，具体可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：4的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：4由2091个碱基组成，其融合蛋白的编码序列为自5’端第1到第1620位碱基为HSP65基因，第1621到第1914位碱基为HPV E7基因，第1915到第2088位碱基为Z-tag结构域基因片段，第2089到第2091位碱基为融合蛋白编码框的终止密码子。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围，如pET28a-HEZ，含有pET28a-HEZ的大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述具有抗肿瘤作用的融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述具有抗肿瘤作用的融合蛋白方法，是将含有上述具有抗肿瘤作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主菌，得到工程菌，培养所述工程菌，表达得到具有抗肿瘤作用的融合蛋白。

所述宿主菌可为大肠杆菌、酵母菌或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)Plys。

所述工程菌优选为含有pET28a-HEZ的大肠杆菌BL21(DE3)。

用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的任何表达载体，如可在大肠杆菌中表达的pET28a、pBV220、pUC18、pUC19等表达载体。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

为了大规模工业化生产本发明的具有抗肿瘤作用的融合蛋白，根据大肠杆菌的微生物特性，采用了二阶段、高密度和分批补料的发酵方法(fermentationprotocol)：1.第一阶段，也称为生长期，将表达具有抗肿瘤作用的融合蛋白的工程菌作为种子菌接种在大肠杆菌高密度培养基内，所述培养基内的碳源为葡萄糖型碳源(葡萄糖、甘露糖或甘油)。当生长于含这种碳源的培养基时，该大肠杆菌工程菌表达外源基因被完全抑制，即只允许细胞分裂、增殖，细胞密度增加，而外源基因不被表达。该阶段具体可为在碳源为葡萄糖型碳源(葡萄糖、甘露糖或甘油)、pH为6-7的培养基中37℃培养至对数生长期。2.第二阶段，也称生产阶段，在这个阶段培养基内加入了化学诱导剂IPTG(0.5-1mmol/L)，继续发酵诱导表达3-8小时，在这期间表达产物开始源源不断累积，然后终止发酵。这种发酵方式称为分批补料方式(limited methanol fed-batch mode)。

本发明的具有抗肿瘤作用的融合蛋白HEZ在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌获得可溶性高表达，表达产物直接分泌到细胞周质，发酵液内分泌表达的水平高达1g/L融合蛋白，约占菌体总蛋的15％。如果通过发酵生产工艺的优化，大肠杆菌工程菌还有进一步提高表达量的潜力。

表达得到的具有抗肿瘤作用的融合蛋白经硫酸铵沉淀、阴离子色谱、疏水色谱和阳离子色谱纯化，其纯度达到90％以上。

本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的适应症疫苗。

本发明所提供的预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的适应症疫苗，它的活性成分是上述具有抗肿瘤作用的融合蛋白。

所述适应症可为宫颈癌、宫内上皮瘤样病变或肛门发育不全。

需要的时候，在上述疫苗中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂等。

本发明的疫苗可以制成注射液，该剂型的疫苗可以按照药学领域的常规方法制备。

上述疫苗的用量一般为20-200μg具有抗肿瘤治疗作用的融合蛋白/kg体重/次，基础免疫一次，14天后加强免疫一次，共需免疫2-4次。

以表达E7蛋白的小鼠细胞系TC-1作为宫颈癌的细胞模型，使用纯度达到90％以上的本发明的具有抗肿瘤作用的融合蛋白进行免疫治疗和预防试验，结果表明预防免疫可以使小鼠免受TC-1细胞的攻击；治疗免疫可使小鼠已有的肿瘤消退。说明本发明的具有抗肿瘤作用的融合蛋白可作为预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的适应症，特别是宫颈癌、宫内上皮瘤样病变、肛门发育不全疫苗。本发明初步建立起基于热休克蛋白的治疗性疫苗的技术平台，为开发其它由病毒感染引起的疾病及肿瘤治疗性疫苗打下技术基础。

附图说明

图1是HSP65基因PCR扩增产物鉴定图谱

图2是pET28a-hsp65的重组表达载体结构图谱

图3是pET28a-hsp65的酶切鉴定图谱

图4是HPV16E7基因的PCR扩增产物鉴定图谱

图5是pET28a-E7的物理图谱

图6是pET28a-E7的酶切鉴定图谱

图7是pET28a-HE的物理图谱

图8是pET28a-HE的酶切鉴定图谱

图9是pET28a-HEZ的物理图谱

图10是pET28a-HEZ的酶切鉴定图谱

图11是表达的HEZ的15％SDS-PAGE图谱

图12是融合蛋白HEZ纯化后的SDS-PAGE分析图谱

图13是HEZ的Western印迹图谱

图14a是预防组小鼠和对照组小鼠的肿瘤发生率-接种细胞时间的曲线

图14b是对照组小鼠注射TC-1细胞14天时的照片

图14c是对照组小鼠注射TC-1细胞28天时的照片

图14d是预防组小鼠注射TC-1细胞14天时的照片

图14e是预防组小鼠注射TC-1细胞28天时的照片

图15是治疗组小鼠和对照组小鼠注射肿瘤细胞时间-肿瘤体积百分比曲线

图16是治疗组小鼠注射TC-1细胞14天时的照片

图17是治疗组小鼠注射TC-1细胞28天时的照片

具体实施方式

菌株、质粒

大肠杆菌宿主菌DH5α，BL21(DE3)，BL21(DE3)Plys和原核表达载体pET28a购自博大生物公司。

限制性内切酶及工具酶

限制性内切酶NdeI、NcoI、NheI、EcoRI、XhoI和pyrobest高保真DNA聚合酶购自宝生物工程公司。Taq DNA聚合酶购自华美生物工程公司。

核酸及蛋白分子量标准(Marker)

核酸分子量标准DL2000(宝生物工程公司)

蛋白分子量标准(14.4，20.1，30.0，43.0，67.0，94.0kDa)(Pharmacia公司)。

所有合成的引物

本发明涉及的所有寡聚DNA核苷酸片段分别在ABI DNA合成仪进行合成，所合成的引物如表1所示：

表1.所有合成的引物

1	Hsp65上游引物(EcoR I)	5’GG<u>GAATTC</u>ATGGCCAAGACAATTGCGTACG3’
			2	Hsp65下游引物(Sal I)	5’GG<u>GTCGAC</u>GGGGTCAGAAATCCATGCCAC3’
3	Hsp65上游引物(平头)	5’GAAAAGAATGGCCAAGACAATTGCGTACG3’
			4	Hsp65下游引物(Not I)	5’GG<u>GCGGCCGC</u>CGGTCAGAAATCCATGCCAC3’
5	Hsp65上游引物(Nde I)	5’GG<u>CATATG</u>GCCAAGACAATTGCGTAC3’
			6	Hsp65下游引物(Sal I)	5’GG<u>GTCGAC</u>GGGGTCAGAAATCCATGCCAC3’
7	Hsp65上游引物(SnaB I)	5’GG<u>TACGTA</u>ATGGCCAAGACAATTGCG3’
			8	Hsp65下游引物(EcoR I)	5’TCA<u>GAATTC</u>CATGCCACCCATGTCG3’
9	PET28a上游引物(Nco I)	5’GG<u>CCATGG</u>CCAAGACAATTGCGTAC3’
			10	PET28a下游引物(Nde I、Nhe I双酶切位点)	5’CC<u>GCTAGC</u>TCA<u>CATATG</u>GAAATCCATGCCACCCATGTC3’
11	E7上游引物(Nde I)	5’GGGTTAAC<u>CATATG</u>CATGGAGATACACCTAC3’
			12	E7下游引物(EcoR I)	5’CC<u>GAATTC</u>TTATGGTTTCTGAGAACAGATG3’
13	E7下游引物引入His<sub>(6)</sub>tag	5’GG<u>GAATTC</u>TTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTGAGAACAGATGGGGC3’
			14	pET28a上游引物	5’GATATACCATGGGCAGCAGCC3’
15	E7下游引物(加R、K tag)	5’CG<u>GAATTC</u>TATTAACGTTTCTTACGCTTCTTGCGACGTTTACGTGGTTTCTGAGAACAGATGG3’

1	Hsp65上游引物(EcoR I)	5’GG<u>GAATTC</u>ATGGCCAAGACAATTGCGTACG3’
			16	E7下游引物(无终止密码)	5’CC<u>GAATTC</u>TGGTTTCTGAGAACAGATG3’
17	Z-tag上游引物	5’AACAAATTCAACAAAGAACGTCGTCGTGCTCGTCGTGAAATCCGTCACCTGCCGAACCTGAACCGTGAACAGCGTCGTGCTTTCATCCGTTCTCTGCGT 3’
			18	Z-tag上游引物(重叠)	5’G<u>GAATTC</u>GTTGACAACAAATTCAACAAAGA3’
19	Z-tag下游引物	5’GAGCCTGAGCGTCGTTCAGTTTCTTAGCTTCAGCCAGCAGGTTAGCAGACTGGGACGGGTCGTCACGCAGAGAACGGATGAAAGCACGACGCTGTTCG 3’
			20	Z-tag下游引物(重叠)(XhoI)	5’CCG<u>CTCGAG</u>TTATTTCGGAGCCTGAGCGTCG3’
21	Hsp65上游引物(Nhe I)	5’GG<u>GCTAGC</u>GCCAAGACAATTGCGTAC3’

注：以上引物均由军事医学科学院生物工程研究所技术保障室合成。

培养基

大肠杆菌摇瓶培养基为LB；大肠杆菌高密度上罐培养基(g/L)：13g KH₂PO₄，3g(NH₄)₂HPO₄，4.6gNaH₂PO₄，2g MgSO₄·7H₂O，5g酵母抽提物，10g葡萄糖，1ml微量元素溶液。微量元素溶液的组成如下(g/L)：40g FeSO₄·7H₂O，40g CaCl₂·2H₂O，10gAlCl₃·6H₂O，10g MnSO₄·H₂O，4g CoCl₂·6H₂O，2g NaMoO₄·2H₂O，2g ZnSO₄·7H₂O，1g CuCl₂·2H₂O，0.5g H₃BO₃。

细胞培养用RPMI 1640培养基(GIBCO)：1mM丙酮酸钠，2mM非必需氨基酸，50单位/ml青霉素，0.05mg/ml链霉素，以上成分占90％，另外补加10％小牛血清。非必需氨基酸浓度如下：L-丙氨酸890mg/ml，L天东酰胺1320mg/ml，L-天东氨酸1330mg/ml，L-谷氨酸1470mg/ml，甘氨酸750mg/ml，L-脯氨酸1150mg/ml，L-丝氨酸1050mg/ml

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验指南(第三版)(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、HEZ的表达

一、HEZ基因的制备

1、HSP65基因的克隆及其表达载体的构建

(1)HSP65基因的克隆

利用表1中的引物9和4组成的引物对，以结核分支杆菌基因组DNA为模板，利用宝生物公司的高保真酶pyrobest PCR扩增hsp65基因。采用降落PCR(touchdownPCR)，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min50sec，5个循环；然后退火温度改为55℃，其它条件不变，30个循环。扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，表明得到一条1600bp左右的条带。扩增条带经回收后，克隆至pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的hsp65基因具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，与NCBI数据库中的序列(M15467)完全一致。其编码序列为自5’端第1到第1623位碱基。

(2)HSP65表达载体pET28a-hsp65的构建

引物9的5’端有NcoI酶切位点，引物4的5’端有NotI酶切位点，PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段切胶回收后用玻璃奶试剂盒回收，回收片段按照常规方法经Nco I、Nde I双酶切后用T₄ DNA连接酶连接入经同样酶切的pET28a载体(购自博大生物公司)。取大肠杆菌DH5α加入含有上述连接产物的连接反应体系中，冰浴30min，然后42℃热休克90秒，快速将管转移冰浴中冷却2min。加入LB培养基，在37℃摇床温浴30min，然后涂布到含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的LB平板上，37℃培养12小时。待平板上长出菌落，挑选菌落，利用引物9和4进行菌落PCR筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到试管培养12小时后采用promega公司的质粒小抽试剂盒抽提质粒，得到表达载体pET28a-hsp65(其物理图谱如图2所示)，表达载体pET28a-hsp65经Nco I、Nhe I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，表明得到1650bp左右的条带，与理论预测一致。图3中，泳道1为pET28a-hsp65经Nco I、Nhe I双酶切的电泳结果，泳道M为Marker(DL2000)。

(3)没有终止密码的HSP65表达载体pET28a-hsp65’的构建

在hsp65基因终止密码子之前有一个NdeI酶切位点，为便于E7基因的插入，按照如下方法构建没有终止密码子的HSP65表达载体pET28a-hsp65’：以pET28a-hsp65质粒作模板，用表1中的引物9、10扩增hsp65基因，扩增反应条件同步骤(1)。扩增产物和pET28a载体经Nco I、Nhe I双酶切后，用T₄ DNA连接酶连接。连接产物按照步骤(2)中的方法转化大肠杆菌DH5α并涂布含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的平板。平板上长出菌落后，利用引物9和10进行经菌落PCR筛选阳性克隆，摇瓶抽质粒后酶切鉴定，结果表明得到结构正确的pET28a-hsp65’。

2、HPV16 E7基因的克隆及其表达载体的构建

(1)HPV16 E7基因的克隆

从山东一宫颈癌患者体内分离的被HPV16感染的细胞标本作为起始材料，抽提其基因组DNA，以此基因组DNA为模板，利用引物11和12进行PCR扩增，克隆出HPV16基因组的E7基因片段，具体的PCR反应体系如下：

人基因组DNA模板(0.5μg)       0.5μl

dNTP(浓度为20mmol/L)          2μl

引物11(浓度为10μmol/L)       2μl

引物12(浓度为10μmol/L)       2μl

10×扩增缓冲液                5μl

pyrobest高保真酶(3-5单位)     0.3μl

ddH2O                         38.2μl

总体积                        50μl

循环条件为：94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，共进行30个循环。

扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，得到一条300bp左右的条带。图4中，泳道M为Marker(DL2000)，泳道1为E7基因PCR扩增产物。

扩增条带经回收后连接入pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的HPV16 E7基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，其编码序列为自5’端第1到第297位碱基。与NCBI数据库中HPV16 E7基因序列基本一致。该序列共编码98个氨基酸，其中，自5′端第229-231位碱基为多态性位点，从Stressgen所报道的密码子tgt突变为cgt，氨基酸由C突变为R。

(2)HPV16 E7基因的表达载体PET28a-E7的构建

E7基因经Nde I和EcoR I双酶切，与经同样双酶切的pET28a质粒连接，连接产物按照步骤1的(2)中的方法转化大肠杆菌DH5α，并涂布含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的平板。平板上长出菌落后，利用引物11和12进行经菌落PCR筛选阳性克隆，摇瓶抽质粒后进行Nde I和EcoR I酶切鉴定，酶切鉴定结果如图6所示，表明得到大小为300bp、5400bp的两个片段，说明得到结构正确的pET28a-E7(图5)。图6中，泳道M为Marker(DL2000)，泳道1为pET28a-E7的双酶切结果。

3、Z-tag结构域的化学合成及其表达载体的构建

(1)Z-tag结构域的化学合成

Z-tag结构域的核酸序列片段在ABI DNA合成仪上进行合成。Z-tag编码的多肽中含有3个α螺旋结构，合成的DNA片段经HPLC用C₁₈柱脱盐，收集液用真空抽干，鉴定纯度。供合成基因用的每个DNA寡核苷酸片段的纯度应达到或超过90％，如果纯度不够，必须被重新纯化。合成的Z-tag结构域的DNA片段具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其编码序列为自5’端第1到第177位碱基。

(2)pET28a-Zag载体的构建

Z-tag基因通过17、18、19、20四对引物的重叠PCR获得，PCR反应体系如下：

引物17(浓度为10μmol/L)    2μl

引物18(浓度为10μmol/L)    1μl

引物19(浓度为10μmol/L)    2μl

引物20(浓度为10μmol/L)    2μl

dNTP(浓度为20μmol/L)      2μl

10×扩增缓冲液             5μl

pyrobest聚合酶(3-5单位)    3μl

ddH₂O                      33μl

总体积                     50μl

循环条件为：94℃30秒，55℃30秒，72℃20秒，共进行30个循环。PCR扩增产物经XhoI和EcoR I双酶切，与经同样双酶切的pET28a质粒连接，连接产物按照步骤1的(2)中的方法转化大肠杆菌DH5α(购自博大生物公司)，并涂布含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的平板。平板上长出菌落后，利用引物18和20进行经菌落PCR筛选阳性克隆，摇瓶提质粒后进行Xho I和EcoR I酶切鉴定，鉴定结果表明得到结构正确的pET28a-Zag。

4、表达载体pET28a-HEZ表达载体的构建和鉴定

(1)Hsp65、E7融合基因表达载体pET28a-HE的构建

按照构建pET28a-E7载体时E7基因的扩增条件，以引物11、12扩增E7基因。pET28a-hsp65’载体和E7基因扩增产物经Nde I和EcoR I双酶切，酶切后的载体和基因用T4DNA连接酶连接。连接产物按照步骤1的(2)中的方法转化大肠杆菌DH5α并涂布含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的LB平板。平板上长出菌落后利用引物9和12进行菌落PCR筛选阳性克隆，摇瓶抽质粒后进行Nde I，Nco I和EcoR I酶切鉴定，结果如图8所示，表明得到大小为300bp，1650bp，5400bp的酶切片段，结果与理论预测一致，得到结构正确的pET28a-HE(图7)。图8中，泳道M为Marker(DL2000)，泳道1为pET28a-HE的酶切结果。

(2)Hsp65、E7和Zag融合基因表达载体pET28a-HEZ的构建

以pET28a-HE质粒为模板，用引物9、16扩增hsp65-E7融合基因，扩增条件如下，94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min30sec，30个循环。pET28a-Zag载体和hsp65-E7融合基因扩增产物经Nco I和EcoR I双酶切，酶切后的载体和基因用T₄ DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的LB平板。平板上长出菌落后利用引物9和20进行菌落PCR筛选阳性克隆，摇瓶抽质粒后进行Xho I，Nde I，Nco I和EcoR I酶切鉴定，结果如图10所示，表明得到多条条带(hsp65基因内部有两个Xho I酶切位点)，各个片段及其大小与理论预测一致，得到结构正确的pET28a-HEZ(图9)。图10中，泳道M为Marker(DL2000)，泳道1为pET28a-HEZ的酶切结果。HEZ基因测序结果表明HEZ基因具有序列表中序列4的核苷酸序列，编码序列表中序列5的氨基酸残基序列。

二、HEZ基因的表达

将pET28a-HEZ通过CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自博大生物公司)，在含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的LB平板上筛选得到阳性克隆，挑取单菌落接种到含有卡那霉素(浓度为30μg/ml)的LB培养基中37℃摇床振荡培养。定时取样测定OD600，当OD600约为0.5时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导3小时后，离心沉淀菌体，超声破碎菌体，离心，取上清和沉淀(镜检全部为细胞碎片)分别进行15％SDS-PAGE电泳，结果如图11所示，表明在75KD处有一特异性的目的蛋白表达条带，与分子量理论值相符；融合蛋白大部分以可溶形式存在。图11中，M为蛋白分子量，泳道1为空菌(该空菌是指没有目的基因的空表达载体转化的宿主菌)，2为超声破碎后的上清，3为超生破碎后的沉淀。凝胶扫描显示，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的15％。

实施例2、重组融合蛋白HEZ的纯化和纯度分析

表达重组融合蛋白HEZ的菌体经超声破碎、离心、过滤处理后，先用30％的硫酸铵沉淀，阴离子柱(阴离子交换介质为Q高效琼脂糖凝胶介质，即Q Sepharose Highperformance)(购自瑞典安发玛西亚公司，Amersham Biosciences)层析纯化；经阴离子柱纯化后的融合蛋白再经调整盐浓度和pH值后进行疏水柱(疏水介质为苯基高效琼脂糖凝胶介质，即Phenyl Sepharose High Performance)(购自瑞典安发玛西亚公司，Amersham Biosciences)纯化，蛋白纯度达到80％。融合蛋白再经阳离子柱(阳离子交换介质为S快速琼脂糖凝胶介质，即S Sepharose F.F.1.6×20cm)(购自瑞典安发玛西亚公司，Amersham Biosciences)纯化后，样品获得了较高的纯度，凝胶扫描分析显示纯度达到了90％以上(图12)。图12中，M为分子量标准，泳道1为上样前样品，2为穿过峰，3-6为各个洗脱峰。

实施例3、HEZ的Western印迹

以小鼠抗人乳头瘤病毒E7蛋白抗体(购自TBD生物工程公司)，小鼠抗人热休克蛋白65抗体(购自TBD生物工程公司)为一抗，以HRP标记山羊抗小鼠抗体(购自华美生物工程公司)为二抗，按照常规方法对实施例2中纯化得到的HEZ蛋白样品进行Western印迹实验。结果如图13所示，只有融合蛋白一条带。

实施例4、动物实验测定HEZ的活性

1、预防肿瘤形成实验

疫苗的活性测定采用TC-1细胞系，购自美国菌种保藏中心(American Typeculture conservation，ATCC)，TC-1来源于C57BL/6小鼠上皮细胞，它是由人乳头瘤病毒16 E6、E7基因和Ras基因共转化而引起永生化的一株细胞，皮下注射给C57BL/6小鼠，4000个细胞的致肿瘤率为100％；被攻击小鼠为C57BL/6，购自军事医学科学院实验动物中心。

实验采用6周龄的C57BL/6雄性小鼠20只，随机分成两组，每组10只。预防实验组小鼠每只在后颈皮下注射100μg溶于PBS中的实施例2纯化的HEZ蛋白，14天后再加强注射一次；对照组每只注射相同体积的PBS缓冲液。加强注射12天后，两组小鼠分别在右后肢上部皮下注射1.3×10⁵个用PBS悬浮的TC-1细胞，定期用游标卡尺测量所成肿瘤的大小。采用成组设计的统计方法即t检验处理数据。

实验结果见表2和表3以及图14a-14c所示。表2和图14a表明预防组小鼠在接种TC-1细胞42天时肿瘤全部消失，而对照组小鼠则全都长了肿瘤；图14b表明，对照组小鼠注射TC-1细胞14天后，可见到明显的肿瘤生长与瘤体的形成；图14c表明，对照组小鼠注射TC-1细胞28天时，小鼠的肿瘤已经非常硕大；图14d表明预防组小鼠注射TC-1细胞14天时，小鼠的肿瘤明显小于相应的对照组；图14e表明预防组小鼠注射TC-1细胞28天时，小鼠的肿瘤已基本消失，与相应的对照组小鼠比较存在显著性差异。图14-14e中，圆圈示肿瘤位置及大小。表3的统计结果表明从第一周开始两组小鼠的肿瘤大小具有显著性差异(P＜0.01)，预防组小鼠肿瘤大小明小于对照组，说明疫苗有较好的预防作用。

表2.接种TC-1细胞后不同时间后的预防组和对照组的肿瘤发生率(％)

表3.接种TC-1细胞后不同时间后的预防组和对照组的肿瘤瘤体的大小比较

2、治疗肿瘤实验

实验采用6周龄的C57BL/6雄性小鼠20只，随机分成两组，每组10只。这20只小鼠首先每只在右后肢上部皮下注射1.3×10⁵个用PBS悬浮的TC-1细胞。在注射后的第7天和第21天治疗组在颈后皮下注射100μg溶于PBS中的实施例2纯化的HEZ蛋白进行治疗。而对照组仅用PBS治疗。定期用游标卡尺测量所成肿瘤的大小并做记录。采用成组设计的统计方法即t检验处理数据。实验结果如表4、5、6及图15-图17所示，表4和图15表明出治疗组小鼠在7周时肿瘤已基本消失；表5的统计结果显示在前两周治疗组与对照组两组的肿瘤大小没有显著性差异；从第三周开始两组小鼠的肿瘤大小有显著性差异，P＜0.01，图16和图17表明治疗组小鼠的肿瘤明显小于对照组，说明疫苗有较好的治疗价值。图16和图17中，圆圈示肿瘤的位置及大小。图6表明两组小鼠的生存时间有明显差异，治疗组小鼠的存活时间明显长于对照组，P＜0.01。

表4.接种TC-1细胞后不同时间的治疗组和对照组的肿瘤体积百分比(％)

表5.接种TC-1细胞后不同时间的治疗组和对照组的小鼠肿瘤瘤体的大小比较

注：^*代表因数据严重偏离均值，而在统计处理时舍弃的数据。

表6.接种TC-1细胞后的治疗组和对照组的小鼠存活天数的比较

注：“-”表示到观察结束时小鼠仍然存活

序列表

<160>5

<210>1

<211>1623

<212>DNA

<213>分枝杆菌属结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>1

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac     60

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa    120

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag    180

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc    240

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc    300

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa    360

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag    420

gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc    480

gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc    540

tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg    600

tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg    660

gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga    720

gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg    780

gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc    840

gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc    900

gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag    960

gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc    1020

gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt    1080

gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt    1140

gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat    1200

gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg    1260

gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg    1320

aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc    1380

gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt    1440

gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg    1500

ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac    1560

aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc    1620

tga                                                                  1623

<210>2

<211>297

<212>DNA

<213>乳多孔病毒科A亚组人乳头瘤病毒

<400>2

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact     60

gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt    120

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag    180

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa    240

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa       297

<210>3

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gttgacaaca aattcaacaa agaacgtcgt cgtgctcgtc gtgaaatccg tcacctgccg     60

aacctgaacc gtgaacagcg tcgtgctttc atccgttctc tgcgtgacga cccgtcccag    120

tctgctaacc tgctggctga agctaagaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaataa       177

<210>4

<211>2091

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac      60

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa     120

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag     180

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc     240

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc     300

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa     360

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag     420

gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc     480

gccgaggcga tggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc     540

tttgggctgc agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg     600

tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg     660

gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga     720

gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg     780

gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc     840

gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc     900

gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag     960

gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc    1020

gccggacgag tggcccagat ccgccaggag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt    1080

gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt    1140

gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat    1200

gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg    1260

gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg    1320

aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc    1380

gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt    1440

gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg    1500

ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt cgttgccgac    1560

aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc    1620

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact    1680

gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt    1740

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag    1800

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa    1860

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accagttgac    1920

aacaaattca acaaagaacg tcgtcgtgct cgtcgtgaaa tccgtcacct gccgaacctg    1980

aaccgtgaac agcgtcgtgc tttcatccgt tctctgcgtg acgacccgtc ccagtctgct    2040

aacctgctgg ctgaagctaa gaaactgaac gacgctcagg ctccgaaata a             2091

<210>5

<211>696

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu

1               5                   10                  15

Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

            20                  25                  30

Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile

        35                  40                  45

Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

    50                  55                  60

Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr

65                  70                  75                  80

Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln

                85                  90                  95

Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro

            100                 105                 110

Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu

        115                 120                 125

Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala

    130                 135                 140

Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile

145                 150                 155                 160

Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

                165                 170                 175

Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg

            180                 185                 190

Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg

        195                 200                 205

Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys

    210                 215                 220

Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly

225                 230                 235                 240

Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala

                245                 250                 255

Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val

            260                 265                 270

Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln

        275                 280                 285

Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly

    290                 295                 300

Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys

305                 310                 315                 320

Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

                325                 330                 335

Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu

            340                 345                 350

Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

        355                 360                 365

Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu

    370                 375                 380

Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn

385                 390                 395                 400

Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr

                405                 410                 415

Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp

            420                 425                 430

Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu

        435                 440                 445

Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu

    450                 455                 460

Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly

465                 470                 475                 480

Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val

                485                 490                 495

Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu

            500                 505                 510

Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser

        515                 520                 525

Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe Met His Gly Asp

    530                 535                 540

Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

545                 550                 555                 560

Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp

                565                 570                 575

Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr

            580                 585                 590

Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys

        595                 600                 605

Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met

    610                 615                 620

Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Val Asp

625                 630                 635                 640

Asn Lys Phe Asn Lys Glu Arg Arg Arg Ala Arg Arg Glu Ile Arg His

                645                 650                 655

Leu Pro Asn Leu Asn Arg Glu Gln Arg Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu

            660                 665                 670

Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys

        675                 680                 685

Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

    690                 695

Claims (12)

1.具有抗肿瘤作用的融合蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：5所示。

2.权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0：4所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的细胞系。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.一种表达权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的融合蛋白的方法，是将含有权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主菌，得到工程菌，培养所述工程菌，表达得到具有抗肿瘤作用的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌、酵母菌、或枯草杆菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述工程菌的培养方法为：将所述工程菌在碳源为葡萄糖型碳源、pH为6-7的培养基中37℃培养至对数生长期，然后以0.5-1mmol/L的IPTG诱导表达3-8小时。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述工程菌为含有如图9所示的pET28a-HEZ的大肠杆菌BL21(DE3)。

12.预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的适应症疫苗，它的活性成分是权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的融合蛋白。

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