CN100410382C - 一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体，其优点表现在：本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。

Description

一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表述载体和pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体。

背景技术

DNA疫苗(DNA vaccine)又称核酸疫苗、基因疫苗(gene vaccine)，是指将编码某种目的抗原蛋白的外源基因插入真核细胞表达质粒，直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗不仅能刺激机体产生特异性的体液免疫，还能诱导产生特异性的具有细胞毒杀伤性功能的CTL效应(细胞免疫)，并可直接清除带有目的抗原的靶细胞，因此对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病具有广阔的治疗前景。表位疫苗(epitope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗，包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重组表位疫苗(recombinantepitope-based vaccine)及表位DNA疫苗(epitope DNA vaccine，minigenes/epigenes)，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，它是T细胞抗原受体(Tcell receptor，TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。主要组织相容性复合体(major histocompatibillitycomplex，MHC)是高度多态性的细胞表面分子，它将多肽片段递呈给T细胞。与MHC I类分子结合的抗原肽为8-12个氨基酸，是来自内源性抗原经蛋白酶降解后的产物。蛋白酶水解片段通过抗原加工相关转运体(transporterassociated with antigen processing，TAP)转运至内质网与新合成的MHCI类分子相结合，MHC肽复合体转移至细胞表面被CD8⁺细胞毒T淋巴细胞的TCR识别。MHC II类分子结合肽长度变化较大，为9-25个氨基酸，主要由外源蛋白通过溶酶体中的蛋白酶降解而来。在内体溶酶体中与MHC II类分子结合后，MHC肽复合体也转运至细胞表面被CIM T细胞TCR识别。据此可设计出两大类T细胞疫苗，即与相应的MHC I及MHC II类分子相关的CD8T细胞疫苗和CIM T细胞疫苗。CIM辅助性T细胞(helper T cell，Th)又分为分泌不同细胞因子却又交叉调节的两群，即Th1和Th2。

DNA疫苗作为第三代疫苗，与血源疫苗和基因工程疫苗相比，具有以下优点：在宿主体内合成所编码的蛋白质，具有与天然抗原相似的构象；能诱导机体产生全面的免疫应答；免疫应答持久；易于制备，化学结构稳定，便于保存和运输；可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；给药途径多样化等，为预防和治疗各种疾病提供了一种重要的思路。但是，由于机体组织对导入质粒有一定程度的破坏，外源基因的转染率较低，导入基因在体内不能也不应自我复制，都限制了核酸疫苗的使用效果。在免疫效果方面，总体而言动物尤其是小动物的试验效果优于人体试验，国内外研究者正谋求以多种方式提高免疫效果，如使用佐剂、改进导入方式、优化表达序列、多抗原表位结合等，使用的剂量也倾向加大。因此，如何增强核酸疫苗的免疫原性成了当前研究的重点。已有的增强DNA疫苗免疫效率的策略主要包括：①优化外源基因编码序列核酸疫苗不含病原体的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞凋控，将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的抗原的合成，进而促进免疫效果。研究表明，选用人体细胞偏好的密码可提高翻译效率，促进蛋白表达，显著提高细胞和体液免疫反应。②细胞因子的免疫佐剂效应细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质类肽性调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。业已发现多种细胞因子具有免疫佐剂作用，可调节免疫应答的强度和方向。Th1细胞主要产生IL-2、IFN-γ，在促进细胞免疫、清除细胞内病原体方面具有优势，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，以促进抗体产生为主，而IL-10又对Th1细胞因子产生明显的抑制作用，从而形成免疫调控网络。以细胞因子作为佐剂，可望提高核酸疫苗的免疫效果。在使用方式上，除可直接使用细胞因子外，还可以细胞因子基因与疫苗质粒共免疫，或构建二者的共表达质粒。③共刺激分子的佐剂效应共刺激分子如B7、ICAM-1、VCAM-1、LFA-3等T细胞激活的第二信号，目前研究较多的是B7-1和B7-2分子。T细胞受体与抗原结合产生T细胞活化的第一信号，而T细胞表面的CD28与抗原递呈细胞表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被充分活化。缺乏B7等共刺激分子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫耐受。④增加CpG免疫刺激序列(ISS)近年来发现一些非甲基化脱氧核苷酸片断(CpG DNA)能增加核酸疫苗的免疫效果，以细胞免疫反应尤为明显，因此称之为免疫刺激序列(ISS)。免疫刺激序列的基本骨架为5’-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3’，主要来源于细菌DNA，合成的相同序列具有相似的免疫增强作用，但是甲基化修饰或改变序列，则免疫刺激作用完全消失。CpG免疫刺激序列增强免疫反应的机理可能是直接诱导B细胞增殖活化并分泌IL-2、IL-6，保护B细胞免受细胞凋亡作用，刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞活化分泌TNF-α、IL-6、IL-12，刺激T细胞、NK细胞分泌IFN-γ。总之，CpG诱导Th1类细胞因子产生，增加特异性IgG2a抗体的产生，增强CTL反应。

核酸疫苗可通过多种途径及方式接种到机体内，肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔、粘膜都可以是核酸疫苗的接种部位，合适的接种途径和方式有利于提高蛋白表达水平和减少个体差异对免疫应答效果的影响。肌纤维是已永久地有丝分裂后的细胞，转入的DNA不会因为细胞分裂而较快地稀释或丢失，可长期稳定表达。所以，肌肉注射成为最常用的DNA疫苗注射方式。不过，肌纤维对DNA的摄取效率低是重要的限制因素，可将局部肌肉组织经物理或化学因素处理(如局部冷敷、注射麻醉剂或蛇毒、心肌毒素等)，产生炎症反应，损伤的肌细胞在增生过程中，可增加质粒摄入，使目的抗原表达量增多。电脉冲技术的作用机制是使细胞膜双层磷脂结构在电场的作用下发生改变，形成瞬间可逆的微孔，于是DNA或其他物质分子得以进入细胞。在体电脉冲(in vivo electroporation，又称电穿孔技术)正是用上述这种基本原理，使得DNA能够注入到活细胞内以提高其治疗效果。同时，由于电脉冲造成组织的轻微损伤产生了局部组织的炎症反应，可增强抗原递呈细胞(APC)功能，从而进一步提高了DNA疫苗的免疫原性，诱导机体产生更强的免疫应答。另外，在体电脉冲技术增强DNA疫苗的免疫效果较常用的基因枪方法更为简单实用，具有一次导入的质粒DNA量大、成本低、易于推广等优点，有可能成为非病毒载体基因治疗接种方法中的一项主导性技术。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体；

(2)提供一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体构建方法；

(3)提供一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体；

(4)提供一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体构建方法；

(5)提供一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：本发明采用质粒pGL3/CMV-epitope-linker-β2m-TA-SV40-CD80-TA，其中pitope-linker-β2m融合基因以CMV为启动子，BGH PA为转录终止信号；CD80基因以SV40为启动子，SV40PA为转录终止信号。本发明采用质粒pcDNA3.1/β2M-IL15，带有β2微球蛋白基因启动子(β2M)，含有BGH PA转录终止信号及氨苄青霉素抗性基因。质粒DNA用Qiagen Plasmid MaxiKit大量制备、纯化，溶于生理盐水，调整浓度为1μg/μl。

取6-8周龄DBA/2雌性小鼠(购自中科院上海实验动物中心)，分组后腹腔给药麻醉小鼠，然后用无菌微量注射器将10-100ug质粒pGL3/CMV-epitope-linker-β2m-TA-SV40-CD80-TA注射入小鼠后腿股四头肌。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。用该质粒DNA每隔两周1次共3次免疫，方法同前。第3次免疫后的0-14天用10-100ug质粒pcDNA3.1/B2M-IL15注射入小鼠对侧后腿股四头肌，质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。第3次DNA免疫和加强免疫后的第18天采血，分离其单个核细胞或CD8⁺T细胞，用于四聚体分析和IFN-γELISPOT分析。

检测免疫后细胞免疫功能，采用四聚体分析检测抗原表位特异性CD8⁺T细胞的数量和比例。IFN-γELISPOT分析检测抗原肽特异性、分泌IFN-γ的功能性T细胞。

一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述。

一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的构建如下：

(1)构建pcDNA3.1/P1A载体；

(2)构建pGL3/CD80载体；

(3)将pcDNA3.1载体上的epitope-linker-β2m融合基因表达

框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成pGL3/CD80-P1A共表达载体。

一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所述。

一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体，它的构建如下：

(1)克隆人β2微球蛋白基因启动子；

(2)克隆人白细胞介素15基因片断；

(3)构建pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体。

一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗，该疫苗包括pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体。首先将pGL3/CD80-P1A共表达载体注射免疫，诱生抗原表位特异性细胞免疫应答；然后在0到14天注射权利要求3所述的pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体增强其诱发的抗原表位特异性细胞免疫应答。

本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体，其优点表现在：本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。

附图说明

图1：本发明实施例所用P1A_35-43表位DNA疫苗pGL3/CMV-P1A-1inker-β2m-TA-SV40-CD80-TA(即pGL 3/CD80-P1A)质粒载体示意图；

图2：本发明所用含人β2微球蛋白基因启动子(β2M)的白细胞介素15(IL-15)真核表达载体pcDNA3.1/β2M-IL15质粒载体示意图；

图3A：表位DNA疫苗免疫接种后P1A_35-43表位特异性细胞免疫反应，质粒DNA注射免疫诱发表位特异性CD8⁺-T细胞反应的流式分析结果(单个核细胞)。

图3B：表位DNA疫苗免疫接种后P1A_35-43表位特异性细胞免疫反应，质粒DNA注射免疫诱发表位特异性CD8⁺-T细胞反应的流式分析结果(CD8⁺-T细胞)。

图3C：表位DNA疫苗免疫接种后P1A_35-43表位特异性细胞免疫反应，脾脏单个核细胞IFN-γELISPOT分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

1材料和方法

1.1材料

试剂：各种限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Boehringer Mannheim公司；PCR试剂购自TaKaRa公司；细胞总RNA抽提试剂TRIZOL、逆转录反应试剂购自InVitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA分离纯化试剂盒购自QIAGEN公司；琼脂糖购于Promega公司；酵母提取物，胰蛋白胨购于OXOID公司；Lamda DNA Hind III marker(华美公司)，100bpDNA Marker(天为时代公司)；单个核细胞分离液Lymphoprep^TM(Axis-Shield polAS)；MTT(华美公司)；ConA(购于晶美公司)；重组人IL-2购自PeproTech EC Ltd公司；R-PE labeled Pro5MHC PentamerH-2L^d/LPYLGWLVF，FITC标记大鼠抗小鼠CD8分子单克隆抗体(克隆号：KT15)和P1A九肽(LPYLGWLVF)均购自PROIMMUNE公司；Mouse IFN-γELISPOT kit(U-CyTech)。其他试剂均为国产分析纯。

质粒：pGL3/promoter(购自Promega公司)；pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)。pcDNA3/eb2m本室构建保存。

质粒pcDNA3.1/eb2m构建方法：

设计含有表位肽序列、linker及人β2m基因5’端的引物(pb2m)，以人DNA为模板，通过PCR方法扩增出融合基因，PCR产物再经酶切与同样酶切的pET-42b(+)质粒(购自Novagen公司)连接后，形成原核表达质粒pET-OVA-linker-β2m。再以质粒pET-OVA-linker-β2m为模板，eb2m(5)与eb2m(3)为引物，通过PCR方法扩增出含有信号肽序列的融合基因sOVA-linker-β2m，将该融合基因的PCR产物经过酶切与同样酶切的pcDNA3.1质粒连接后，获得真核表达载体pcDNA3.1/eb2m。引物序列如下：

pb2m(5)：5’CAG CAT ATG TCC ATA ATC AAC TTT GAA AAA CTC GGA GGA GGA

TCC GGA GGT GGC AGC ATC CAG CGT ACT CCA AAG 3’

pb2m(3)：5’CAA CTC GAG CAT GTC TCG ATC CCA C 3’

eb2m(5)：5’GAT AAG CTT ATG TCT CGC TCC GTG GCC TTA GCT GTG CTC GCG

CTA CTC TCT CTT TCT GGC CTG GAG GCT TCC ATA ATC AAC TTT G 3’

eb2m(3)：5’CAA CTC GAG CAT GTC TCG ATC CCA C 3’

菌株：JM109(大肠杆菌)为本室冻存。

动物：DBA/2(H-2^d)，6-8周龄，雌性。均购于中科院上海实验动物中心，饲养于本校实验动物科学部清洁级动物房。

主要仪器：低温台式离心机(Sorvall)，低温高速离心机(HITACHI)，紫外分光光度计(Eppendorf)，PCR仪(Biometra T3Thermocycler)，流式细胞仪(Becton Dickinson FACS calibui)，酶标仪(MAX250，MolecularDevices公司)，ELISPOT图像自动分析仪Bioreader4000(BIO-SYS GmbH)，电脉冲仪CUY21(NEPA公司)。

1.2方法

1.2.1人CD80基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法克隆人CD80基因，将PCR扩增产物双酶切后，克隆到pGL3/promoter载体中，替代该载体中原有的荧光素酶基因，从而获得在SV40启动子作用下的CD80基因真核表达载体pGL3/CD80。

1.2.2epitope-linker-β2m融合基因真核表达载体的构建

1.2.2.1pcDNA3.1/P1A真核表达载体的构建

通过设计含有P1A基因表位序列(P1A_35-43：LPYLGWLVF)的3’端下游引物：

5，CGGGATCCTCCTCCGAAGACCAGCCACCCTAGATAAGGCAGAGCCTCCAGGCCAGAAAG 3，；以及5’端上游引物：5’CCCAAGCTTATGTCTCGCTCCGTG3’。上、下游引物的5’端分别加上HindIII和Xba I限制性酶切位点。PCR反应条件：于94℃预变性5分钟，共进行30个循环，每个循环条件：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min。以pcDNA3.1/eb2m载体为模板，按以上条件进行PCR反应。然后利用pcDNA3.1/eb2m载体上的HindIII和BamHI酶切位点，双酶切去除原有的OVA表位后，将含有P1A_35-43表位序列的PCR产物引入pcDNA3.1/eb2m载体中，测序鉴定正确后，获得表达P1A_35-43-linker-β2m融合基因的真核表达载体pcDNA3.1/P1A。

1.2.2.2epitope-linker-β2m融合基因(如SEQ ID NO：1所述)和CD80基因双表达载体的构建

通过Bg1II和SmaI双酶切，将pcDNA3.1载体上的epitope-linker-β2m融合基因表达框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成epitope-linker-β2m融合基因和CD80基因双表达载体pGL3/CD80-P1A(见图1)。pGL3/CD80-P1A如SEQ ID NO：2所述。

1.2.3人IL-15基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法克隆人IL-15基因，然后双酶切PCR扩增产物，将IL-15基因克隆到pBluescript载体，阳性克隆送上海博亚公司测序鉴定。将测序正确的IL-15基因再通过BamHI和NotI双酶切，亚克隆到pcDNA3.1/β2M-EGFP载体，获得以β2M为启动子的IL-15基因真核表达载体pcDNA3.1/β2M-IL15(见图2)。pcDNA3.1/β2M-IL15如SEQ ID NO：3所述。

1.2.4质粒的大量制备和纯化

按质粒纯化试剂盒(QIAGEN plasmid midiprep kit)要求进行。简言之，取1ml已鉴定正确的菌液加至100mlLB中，振荡培养至对数生长期，6000rpm，4℃离心15分钟，沉淀中加入P1(含RNaseA)10ml，震荡重悬沉淀后，加入溶液P2 10ml，轻缓倒置离心管数次，最后加入预冷的溶液P3 10ml，轻缓倒置离心管数次，冰浴20分钟，13000rpm，4℃离心30分钟，上清转移到预先用10ml QC缓冲液平衡好的柱子(QIAGEN-Tip500)上，然后用30ml缓冲液QC洗柱2次，用15ml缓冲液QF洗脱质粒DNA，最后经0.7倍体积的异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤后，用适量TE溶解，260nm测定OD值，鉴定质粒的量和纯度，用适当的限制性内切酶酶切，电泳鉴定。

1.2.5质粒DNA注射和电脉冲转移条件

将质粒DNA溶于生理盐水中，调整浓度到1ug/ul。腹腔给药麻醉小鼠后，用无菌微量注射器将质粒DNA溶液(100ug/0.1ml)注射入小鼠后腿股四头肌就。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，两电极间距约5mm，电极直径0.5cm，进行电脉冲刺激。电击条件为长脉冲方波，电压100V，波宽60ms，频率0.75Hz，脉冲次数10次(正反各5次)。

1.2.6五聚体分析表位特异性CD8⁺T细胞

1.2.6.1质粒DNA肌肉注射诱导表位特异性T细胞免疫将DBA/2小鼠分为4组，每组3只。第1组注射生理盐水；第2组注射质粒pcDNA3.1；第3、4组注射质粒pGL3/CD80-P1A。分组后腹腔给药麻醉小鼠，然后用无菌微量注射器分别将100ul生理盐水或100ug质粒DNA注射入小鼠后腿股四头肌。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。分别用生理盐水或质粒DNA每隔两周1次共3次免疫，方法同前。第3次免疫后的第10天用100ug质粒pcDNA3.1/β2M-IL15分别注射第1、2、3组小鼠对侧后腿股四头肌，第4组注射生理盐水对照，质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。在第一次免疫后第35天处死小鼠，分离脾脏单个核细胞，用于五聚体分析。

1.2.6.2五聚体分析具体步骤

1.2.6.2.1取5×10⁵脾脏单个核细胞，用洗涤缓冲液(含0.1％叠氮钠和0.1％BSA的PBS)洗涤两次，重悬于50ul洗涤液中。

1.2.6.2.2加入10ulPE标记的五聚体(H-2L^d/LPYLGWLVF)，置于暗处，室温孵育10-15分钟。

1.2.6.2.3用洗涤液洗涤一次，重悬于100ul洗涤液中，加入1ul FITC标记的抗小鼠CD8抗体，置于暗处，冰上孵育20-30分钟。

1.2.6.2.4用洗涤液洗涤2次后，重悬于200ul的固定液(含1％胎牛血清和2.5％甲醛的PBS)中，避光保存或直接用于流式细胞分析。

1.2.7ELISPOT分析

制备各种肿瘤细胞悬液，同位素(铯¹³⁷)细胞辐照仪照射后，1×10⁶细胞皮下注射免疫2次，间隔一周。最后一次免疫后10天取脾脏，分离其脾脏单个核细胞。调整单个核细胞浓度为2×10⁶/ml，按照小鼠IFN-γELISPOT试剂盒方法进行ELISPOT分析，步骤简述如下：

1.2.7.1将250ul无菌去离子水加入包被抗体瓶中，混合15秒，室温放置5分钟，避免剧烈震荡。取出50u l加入5ml的无菌PBS，混匀。然后加入ELISPOT板，每孔50ul。再每孔加入50ulPBS，盖上板盖，4℃过夜。

1.2.7.2取出ELISPOT板，去掉液体，用无菌PBST(含0.01％Tween-20的PBS)洗涤5-10次。加入200u l/孔无菌PBS-BSA，37℃，1小时。去掉液体(不用洗板)，加入100ul已准备好的细胞。细胞总数为2×10⁵/孔。每个样品分为两组，一组不加肽作为对照组；另一组加8ug/ml的P1A 9肽(LPYLGWLVF)作为刺激组。各设6个复孔。置于37℃，5％CO²孵育24小时。

1.2.7.3取出ELISPOT板，去除培养细胞。加入冰冻去离子水200ul/孔，将板放置在冰上10分钟。PBST洗板10次。加入生物素标记的检测抗体100ul/孔，37℃，1小时。洗板5-10次。加入50ul/孔的酶标记抗体(GABA)，37℃孵育1小时。洗板5-10次(最后一次用PBS，避免Tween-20对显色剂的影响)。

1.2.7.4取出1.5ml显色剂I和1.5ml显色剂II，4℃暗处混合，加入30ul/孔新鲜配制的显色剂I/II，放置暗处，室温孵育20-30分钟(至显微镜下可以观察到斑点为止)。去除显色液，使用去离子水清洗ELISPOT板，室温干燥后，于Bioreader4000读板仪读板记数。

1.2.8统计学处理所有数据均采用未配对资料的t检验进行统计分析。1.2.9结果第1、2、3、4组四聚体和CD8双阳性细胞占整个脾脏单个核细胞比例分别为0.5％、0.61％、2.7％、1.85％(图3A)。以CD8⁺T细胞作为整体看，第1、2、3、4组四聚体和CD8双阳性细胞的比例分别是2.94％、3.88％、26.75％、12.92％(图3B)。以第3、4免疫方案诱发的抗原表位特异性CD8+T细胞数量较多，与第1、2组相比具有显著差异(P＜0.01)。其中第3种免疫方案效果显著优于第4种方案(P＜0.01)，即注射质粒pcDNA3.1/β2M-IL15的能增强抗原表位特异性T细胞反应。

IFN-γELISPOT分析按照小鼠IFN-γELISPOT试剂盒(购自英国U-CyTech公司)方法进行。结果表明(见图3C)，第1、2、3、4组小鼠脾脏2×10⁵单个核细胞中平均IFN-γ分泌细胞数分别为10、16、73、60。其中第3、4免疫方案IFN-γ分泌细胞数显著多于第1、2免疫方案(P＜0.01)，并且注射质粒pcDNA3.1/β2M-IL15的第3免疫方案IFN-γ分泌细胞数显著多于未注射质粒pcDNA3.1/β2M-IL15的第4免疫方案(P＜0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110>上海交通大学医学院

<120>一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体

<130>/

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>411

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct     60

ctgccttatc tagggtggct ggtcttcgga ggaggatccg gaggtggcag catccagcgt    120

actccaaaga ttcaggttta ctcacgtcat ccagcagaga atggaaagtc aaatttcctg    180

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ctcttgtact acactgaatt cacccccact gaaaaagatg agtatgcctg ccgtgtgaac    360

catgtgactt tgtcacagcc caagatagtt aagtgggatc gagacatgta a             411

<210>2

<211>6584

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gagctttttg caaaagccta ggcctccaaa      60

aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggcagag gcggcctcgg cctctgcata     120

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atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac accctaactg     360

acacacattc cacagaatta attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac     420

caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg     480

agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa     540

gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt     600

tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt     660

agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga     720

gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc     780

gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtgg ggataccccc tagagcccca gctggttctt     840

tccgcctcag aagccataga gcccaccgca tccccagcat gcctgctatt gtcttcccaa     900

tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca ccccccagaa tagaatgaca cctactcaga     960

caatgcgatg caatttcctc attttattag gaaaggacag tgggagtggc accttccagg    1020

gtcaaggaag gcacggggga ggggcaaaca acagatggct ggcaactaga aggcacagtc    1080

gaggctgatc agcgggttta aacgggccct ctagattaca tgtctcgatc ccacttaact    1140

atcttgggct gtgacaaagt cacatggttc acacggcagg catactcatc tttttcagtg    1200

ggggtgaatt cagtgtagta caagagatag aaagaccagt ccttgctgaa agacaagtct    1260

gaatgctcca ctttttcaat tctctctcca ttcttcagta agtcaacttc aatgtcggat    1320

ggatgaaacc cagacacata gcaattcagg aaatttgact ttccattctc tgctggatga    1380

cgtgagtaaa cctgaatctt tggagtacgc tggatgctgc cacctccgga tcctcctccg    1440

aagaccagcc accctagata aggcagagcc tccaggccag aaagagagag tagcgcgagc    1500

acagctaagg ccacggagcg agacataagc ttaagtttaa acgctagcca gcttgggtct    1560

ccctatagtg agtcgtatta atttcgataa gccagtaagc agtgggttct ctagttagcc    1620

agagagctct gcttatatag acctcccacc gtacacgcct accgcccatt tgcgtcaatg    1680

gggcggagtt gttacgacat tttggaaagt cccgttgatt ttggtgccaa aacaaactcc    1740

cattgacgtc aatggggtgg agacttggaa atccccgtga gtcaaaccgc tatccacgcc    1800

cattgatgta ctgccaaaac cgcatcacca tggtaatagc gatgactaat acgtagatgt    1860

actgccaagt aggaaagtcc cataaggtca tgtactgggc ataatgccag gcgggccatt    1920

taccgtcatt gacgtcaata gggggcgtac ttggcatatg atacacttga tgtactgcca    1980

agtgggcagt ttaccgtaaa tactccaccc attgacgtca atggaaagtc cctattggcg    2040

ttactatggg aacatacgtc attattgacg tcaatgggcg ggggtcgttg ggcggtcagc    2100

caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa cgcggaactc catatatggg ctatgaacta    2160

atgaccccgt aattgattac tattaataac tagtcaataa tcaatgtcaa cgcgtatatc    2220

tggcccgtac atcgcgaagc agcgcaaaac gcctaaccct aagcagattc ttcatgcaat    2280

tgtcggtcaa gccttgcctt gttgtagctt aaattttgct cgcgcactac tcagcgacct    2340

ccaacacaca agcagggagc agatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac    2400

tgagagtgca ccatagggga tcgggagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc    2460

atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct    2520

ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct    2580

gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt    2640

atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt    2700

cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag    2760

gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca    2820

caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac    2880

atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc    2940

attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag    3000

tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct    3060

gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata    3120

atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa    3180

gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt    3240

agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat    3300

ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct    3360

gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata    3420

tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg    3480

agaagggaaa gtgtacgccc tgtataatct agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag    3540

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat    3600

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata    3660

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg    3720

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa aatcgataag gatccgtcga    3780

ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact    3840

atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca    3900

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc    3960

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg    4020

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct    4080

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca    4140

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct    4200

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc    4260

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt    4320

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc    4380

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc    4440

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg    4500

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc    4560

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag    4620

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga    4680

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat    4740

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag    4800

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat    4860

cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc    4920

cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat    4980

accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag    5040

ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg    5100

ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc    5160

tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca    5220

acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg    5280

tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc    5340

actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta    5400

ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc    5460

aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg    5520

ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc    5580

cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc    5640

aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat    5700

actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag    5760

cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc    5820

ccgaaaagtg ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt    5880

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt    5940

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc    6000

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga    6060

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc    6120

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt    6180

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct  6240

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttgccattc  6300

gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg  6360

ccagcccaag ctaccatgat aagtaagtaa tattaaggta cgggaggtac ttggagcggc  6420

cgcaataaaa tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata  6480

gtactaacat acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct  6540

gtccccagtg caagtgcagg tgccagaaca tttctctatc gata                   6584

<210>3

<211>5265

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

gacggatcgg gagatccctg aagtcctaga atgagcgccc ggtgtcccaa gctggggcgc    60

gcaccccaga tcggagggcg ccgatgtaca gacagcaaac tcacccagtc tagtgcatgc   120

cttcttaaac atcacgagac tctaagaaaa ggaaactgaa aacgggaaag tccctctctc   180

taacctggca ctgcgtcgct ggcttggaga caggtgacgg tccctgcggg ccttgtcctg   240

attggctggg cacgcgttta atataagtgg aggcgtcgcg ctggcgggca ttcctgaagc   300

tgacagcatt cgggccgagg gtaccatgag aatttcgaaa ccacatttga gaagtatttc   360

catccagtgc tacttgtgtt tacttctaaa cagtcatttt ctaactgaag ctggcattca   420

tgtcttcatt ttgggctgtt tcagtgcagg gcttcctaaa acagaagcca actgggtgaa   480

tgtaataagt gatttgaaaa aaattgaaga tcttattcaa tctatgcata ttgatgctac   540

tttatatacg gaaagtgatg ttcaccccag ttgcaaagta acagcaatga agtgctttct   600

cttggagtta caagttattt cacttgagtc cggagatgca agtattcatg atacagtaga   660

aaatctgatc atcctagcaa acaacagttt gtcttctaat gggaatgtaa cagaatctgg   720

atgcaaagaa tgtgaggaac tggaggaaaa aaatattaaa gaatttttgc agagttttgt   780

acatattgtc caaatgttca tcaacacttc ttgagcggcc gctcgagtct agagggcccg   840

tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc   900

cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa   960

atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg  1020

ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg  1080

gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc  1140

cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac  1200

ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg  1260

ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt  1320

tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc  1380

cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct  1440

tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga  1500

ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga  1560

attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg  1620

cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg  1680

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc  1740

gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca    1800

tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt    1860

ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc    1920

ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga    1980

acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga    2040

ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg    2100

gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga    2160

ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt    2220

tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct    2280

gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct    2340

gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg    2400

agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca    2460

ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga    2520

tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt    2580

ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt    2640

ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct    2700

ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt    2760

cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca    2820

cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg    2880

gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc    2940

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca    3000

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct    3060

tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg    3120

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata    3180

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca    3240

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc    3300

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg    3360

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta    3420

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc    3480

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag    3540

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac    3600

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc    3660

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt    3720

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc    3780

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga    3840

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta    3900

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta    3960

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga    4020

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc    4080

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg    4140

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag    4200

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg    4260

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt    4320

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca    4380

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca    4440

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc    4500

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt    4560

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg    4620

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc    4680

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg    4740

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga    4800

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga    4860

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta    4920

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg    4980

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact    5040

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata    5100

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt    5160

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa    5220

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc                    5265

Claims (4)

1. 一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述。

2. 根据权利要求1所述的pGL3/CD80-P1A共表达载体，它的构建如下：

(1)构建pcDNA3.1/P1A载体；

(2)构建pGL3/CD80载体；

(3)将pcDNA3.1载体上的epitope-linker-β2m融合基因表达框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成pGL3/CD80-P1A共表达载体。

3. 一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗，其特征在于：该疫苗包括权利要求1所述的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体，真核表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所述。

4. 根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：首先将权利要求1所述的pGL3/CD80-P1A共表达载体注射免疫，诱生抗原表位特异性细胞免疫应答；然后在0到14天注射pcDNA3.1/β2M-IL15真核表达载体增强其诱发的抗原表位特异性细胞免疫应答。

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