CN106916852B

CN106916852B - 一种碱基编辑系统及其构建和应用方法

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Publication number: CN106916852B
Application number: CN201710239348.XA
Authority: CN
Inventors: 陈佳; 杨力; 杨贝; 薛尉; 王丽洁
Original assignee: ShanghaiTech University
Current assignee: ShanghaiTech University
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2037-04-13
Also published as: CN106916852A

Abstract

本发明提供了一种碱基编辑系统及其构建和应用方法。所述的碱基编辑系统，其特征在于，包括UGI表达载体和BE3表达载体，或包括UGI和BE3共表达载体。本发明在国际上首次通过增加CRISPR碱基编辑器产生的C‑T编辑率并降低CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率，从而增强了CRISPR碱基编辑器的功效，为CRISPR碱基编辑器在各物种的基因组中实施更为准确和安全的碱基编辑提供了新的方法和思路。

Description

一种碱基编辑系统及其构建和应用方法

技术领域

本发明涉及基因组编辑领域，具体涉及一种增强的CRISPR碱基编辑系统实现高效率和高精度的碱基水平基因组编辑方法及其应用。

背景技术

基因组编辑技术指利用可设计的核酸酶(分子剪刀)通过碱基插入、缺失或置换等方式，对生物体基因组DNA特定片段进行改造从而达到对目标基因进行编辑的一种基因工程技术。利用基因组编辑技术对细胞进行遗传学操纵，可广泛的应用于生命科学基础研究、生物技术开发、农业技术开发以及医药研发领域。例如：直接在体内校正引起遗传疾病的基因突变，将能够从根本上治疗遗传疾病；对农作物进行精确的基因工程改造，使其产量提高或能够抵抗环境污染或病原体的感染；对微生物基因组进行精准改造，从而促进可再生生物能源的开发等。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)基因组编辑系统自问世以来，就有着其它基因组编辑技术无可比拟的优势，被认为能够在活细胞中广泛使用，并且是迄今为止最有效、最便捷的基因组编辑系统。Cas9核酸酶利用引导RNA(guide RNA，gRNA)可在多种细胞的基因组特定靶点定位，对其进行切割从而产生DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)，然后利用细胞内源的DNA修复机制来实现编辑。根据不同DNA修复通路的激活，基因组编辑将会导致基因的失活或者突变的校正。通常来说，有两种主要的修复机制会被DSB所激活，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源性介导修复(homology-directed repair，HDR)。做为DNA双链断裂最主要的修复通路，NHEJ在修复过程中能在DSB附近的基因组位点引入随机性碱基插入或缺失，从而导致基因的失活。与NHEJ相反，当HDR被激活时能够以外源性供体DNA作为模版，利用同源重组机制将外源性供体DNA的序列替换靶点基因组DNA的序列，从而完成基因突变的校正。但实际上，由于同源重组机制本身的局限性，HDR介导的基因校正效率一直很低(通常小于5％)。因此，极大限制了CRISPR/Cas基因组编辑工具从科研向应用的转化，尤其是在精准基因治疗方面的应用，这也是基因编辑领域的一大难题。

为了提高基因突变的校正效率，碱基编辑器(base editor，BE)在近期内应运而生。这种碱基编辑器将CRISPR/Cas系统和APOBEC胞嘧啶脱氨酶家族成员整合在一起，可执行将胞嘧啶(cytosine，C)编辑为胸腺嘧啶(thymine，T)的功能。为了最大程度地提升C-T碱基编辑的效率，研究人员尝试了将完全丧失酶活性的dCas9或者具有切刻酶活性的nCas9与APOBEC整合，从而产生了碱基编辑器2(BE2)和碱基编辑器3(BE3)。相对于含有dCas9的BE2，含有nCas9的BE3虽然在靶点序列有着更高的C-T编辑效率，但BE3在靶点序列由CRISPR系统本身所引起的碱基插入或缺失(insertion/deletion，indel)率却更高，反而降低了碱基编辑的功效(C-T碱基编辑率与碱基插入或缺失率的比值，C-T editing rate/indel rate)及精确度。

因此，创造具有更高编辑功效的增强型碱基编辑系统，有助于实现高精度的碱基编辑，能极大地扩充我们对于碱基编辑器的应用，特别是在医疗领域进行精准基因治疗方面。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术碱基编辑功效低的缺陷，提供一种碱基编辑系统及方法，其利用共表达BE3与尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)的方法提高碱基编辑器的功效，实现高精度的碱基编辑，从而可以更为有效的在各物种基因组中进行碱基编辑。

为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种碱基编辑系统，其特征在于，包括UGI表达载体或其转录产物和BE3表达载体或其转录产物，或包括UGI和BE3共表达载体或其转录产物。

优选地，所述的UGI和BE3共表达载体为增强型CRISPR碱基编辑器eBEa表达载体，其序列包括SEQ ID NO：22。

优选地，所述的UGI和BE3共表达载体为增强型CRISPR碱基编辑器eBEb表达载体，其序列包括SEQ ID NO：23。

优选地，所述的UGI表达载体的序列包括SEQ ID NO：20。

优选地，所述的BE3表达载体的序列包括SEQ ID NO：21。

优选地，所述的碱基编辑系统还包括针对某物种的基因组靶点的sgRNA表达载体。

优选地，所述的碱基编辑系统还包括基因转导试剂。

优选地，所述的碱基编辑系统还包括真核细胞。

优选地，所述的UGI表达载体、BE3表达载体以及UGI和BE3共表达载体包括但不限于质粒载体。

优选地，所述的转录产物包括但不限于体外转录出的RNA。

本发明还提供了上述的碱基编辑系统的构建方法，其特征在于，包括扩增UGI基因，并连入真核表达载体中，得到UGI表达载体；或利用PCR方法扩增T2A-UGI编码序列，并同框连入BE3编码区的下游，得到增强型CRISPR碱基编辑器eBEa表达载体；或人工合成3×T2A-UGI编码序列，PCR扩增后同框连入BE3编码区的下游，得到到增强型CRISPR碱基编辑器eBEb表达载体。

本发明还提供了上述的碱基编辑系统的应用方法，其特征在于，包括构建针对某物种的基因组DNA靶点的sgRNA；在真核细胞中共引入sgRNA，BE3表达载体或其转录产物以及UGI表达载体或其转录产物，或者，在真核细胞中共引入sgRNA以及UGI和BE3共表达载体或其转录产物，使其在靶点基因组DNA发生C-T碱基编辑。

优选地，所述的碱基编辑系统的应用方法还包括：对处理后的真核细胞基因组DNA进行抽提，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量二代DNA测序文库，并进行高通量二代DNA测序。

优选地，所述的某物种的基因组DNA靶点包括但不限于人的FANCF和RNF2靶点中的至少一个。

优选地，所述的sgRNA的序列为SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25。

本发明提供了一种共表达BE3与UGI的方法，首先通过构建UGI单独表达载体载体，并与BE3表达载体和sgRNA表达载体共转染真核生物细胞，使其在靶点基因组DNA发生C-T碱基编辑，从而提高了BE3的功效。

为进一步优化实验，本发明在BE3编码框的下游利用T2A自剪切肽段同框连接1×或者3×UGI基因，从而得到增强型CRISPR碱基编辑器eBEa和eBEb表达载体，并将其与sgRNA表达载体共转染真核细胞，从而实现了高功效高精度的碱基编辑。本发明以人基因组DNA靶点FANCF(实施例1)和RNF2(实施例2)位点为例，实施了高功效高精度的C-T碱基编辑。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明在国际上首次通过增加CRISPR碱基编辑器产生的C-T编辑率并降低CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率，从而增强了CRISPR碱基编辑器的功效，为CRISPR碱基编辑器在各物种的基因组中实施更为准确和安全的碱基编辑提供了新的方法和思路。

本发明所述的单/双载体共表达CRISPR碱基编辑器与UGI的方法，可以在各种真核生物的基因组中实施高功效高精度的C-T碱基编辑。

本发明所述的单/双载体共表达CRISPR碱基编辑器和UGI的方法，可以提高多种CRISPR碱基编辑器的C-T碱基编辑率，并降低CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率，从而增强多种CRISPR碱基编辑器的功效。

附图说明

图1A：实施例1双载体共表达BE3与UGI的方法示意图

图1B：实施例1双载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的功效。C6、C7、C8、C11代表其靶点序列中的第6、7、8、11位的胞嘧啶。

图1C：实施例1双载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的C-T编辑率。C6、C7、C8、C11代表其靶点序列中的第6、7、8、11位的胞嘧啶。

图1D：实施例1双载体共表达BE3与UGI的方法抑制了CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率。

图1E：实施例1单载体共表达BE3与UGI的方法示意图

图1F：实施例1单载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的功效。C6、C7、C8、C11代表其靶点序列中的第6、7、8、11位的胞嘧啶。

图1G：实施例1单载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的C-T编辑率。C6、C7、C8、C11代表其靶点序列中的第6、7、8、11位的胞嘧啶。

图1H：实施例1单载体共表达BE3与UGI的方法抑制了CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率。

图2A：实施例2双载体共表达BE3与UGI的方法示意图

图2B：实施例2双载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的功效。C3、C6代表其靶点序列中的第3、6位的胞嘧啶。

图2C：实施例2双载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的C-T编辑率。C3、C6代表其靶点序列中的第3、6位的胞嘧啶。

图2D：实施例2双载体共表达BE3与UGI的方法抑制了CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率。

图2E：实施例2单载体共表达BE3与UGI的方法示意图

图2F：实施例2单载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的功效。C3、C6代表其靶点序列中的第3、6位的胞嘧啶。

图2G：实施例2单载体共表达BE3与UGI的方法提高了碱基编辑器的C-T编辑率。C3、C6代表其靶点序列中的第3、6位的胞嘧啶。

图2H：实施例2单载体共表达BE3与UGI的方法抑制了CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率。

具体实施方式

本发明的共表达BE3与UGI的方法，首先通过构建UGI单独表达载体载体，并与BE3表达载体和sgRNA表达载体共转染真核生物细胞，从而提高了BE3的功效。为进一步优化实验，本发明在BE3编码框的下游利用T2A自剪切肽段同框连接1×或者3×UGI基因，从而得到增强型CRISPR碱基编辑器eBEa和eBEb表达载体，并将其与sgRNA表达载体共转染真核细胞，从而实现了高功效高精度的碱基编辑。本发明以人基因组DNA靶点FANCF(实施例1)和RNF2(实施例2)位点为例，实施了高功效高精度的C-T碱基编辑。

具体的，实验方法包括下列步骤：

1)构建表达载体。

将UGI基因从BE3表达载体中利用PCR扩增出来，并连入真核表达载体pcDNA3中，得到UGI单独表达载体载体。

利用PCR方法扩增T2A-UGI编码序列，并同框连入BE3编码区的下游，得到到增强型CRISPR碱基编辑器eBEa表达载体。

人工合成3×T2A-UGI编码序列，PCR扩增后同框连入BE3编码区的下游，得到到增强型CRISPR碱基编辑器eBEb表达载体。

构建针对人基因组DNA靶点FANCF和RNF2的sgRNA。

2)转染真核细胞。

在真核细胞中共转染sgRNA，BE3表达载体以及低、中、高不同浓度的UGI表达载体。

在真核细胞中共转染sgRNA和eBEa、eBEb表达载体。

3)基因组DNA抽提扩增。

抽提转染后的真核细胞基因组DNA，然后利用针对靶点FANCF和RNF2的特异性引物进行PCR扩增。

4)基因组DNAPCR产物的高通量二代DNA测序。

利用基因组DNA的PCR产物构建高通量二代DNA测序文库，并进行高通量二代DNA测序。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、细胞生物学、重组DNA技术及相关领域的常规技术，这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1

一种碱基编辑系统，包括UGI表达质粒(序列为SEQ ID NO：20)和BE3表达质粒(序列为SEQ ID NO：21)，或包括UGI和BE3共表达质粒。所述的UGI和BE3共表达质粒为增强型CRISPR碱基编辑器eBEa表达质粒(序列为SEQ ID NO：22)或增强型CRISPR碱基编辑器eBEb表达质粒(序列为SEQ ID NO：23)。

人基因组FANCF位点利用上述的碱基编辑系统实施高功效高精度的碱基编辑：

一.实验材料

1)试剂

引物按常规方法合成自上海博尚生物有限公司；

限制性内切酶、DNA连接酶、高保真DNA聚合酶

购自NEB公司；

质粒重组试剂盒Clone

购自Vazyme公司；

pCMV-BE3购自addgene网站，序列为SEQ ID NO：21；

DNA胶回收试剂盒购自Coming公司；

转染试剂

2000，

购自Thermo Fisher公司；

QuickExtract^TM基因组DNA抽提试剂、高通量DNA二代测序文库构建试剂盒TmSeqChIPLibary Preparation Kit购自Illumina公司。

2)细胞株

人胎肾细胞HEK293FT(ThermoFisher Scientific，R70007)在加入了1ml含有1％双抗的DMEM(Gibco，10566)+10％FBS(Gbico，16000-044)培养基的6孔板中贴壁培养至单孔细胞个数为八十万。

二.实验方法

1、碱基编辑系统的构建

1.1 UGI单独表达质粒的构建

使用以下引物1和含有核定位序列(NLS)的引物2将UGI基因从pCMV-BE3质粒(addgene，#73021)中PCR扩增出来，之后用质粒重组试剂盒Clone

(Vazyme，C112-02)按试剂盒操作说明将下游连有NLS的UGI基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)(ThermoFisher Scientific，V79020)中，得到UGI单独表达质粒pUGI-NLS(序列为SEQ IDNO：20)。

1.2 eBEa、eBEb表达质粒的构建

利用以下引物3和引物4以pCMV-BE3质粒(addgene，#73021)为模版进行PCR扩增，将PCR产物用质粒重组试剂盒Clone

(Vazyme，C112-02)按试剂盒操作说明重组至pCMV-BE3质粒(addgene，#73021)中得到含有Apa I(NEB，R0114S)、Pme I(NEB，R0560L)酶切位点的质粒pCMV-BE3AP。利用以下引物5和引物6以化学合成的DNA序列(序列为SEQ ID NO：19)为模版进行PCR扩增，将PCR产物经限制性内切酶Apa I(NEB，R0114S)、Pme I(NEB，R0560L)消化后利用T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)按试剂说明连入同样经限制性内切酶ApaI(NEB，R0114S)、Pme I(NEB，R0560L)消化后的pCMV-BE3AP(25℃，2hr)，得到eBEb表达质粒pCMV-eBEb(序列为SEQ ID NO：23)。

利用以下引物3，引物7，引物8和引物9以pCMV-BE3为模版进行PCR扩增，将两段PCR产物用质粒重组试剂盒Clone

(Vazyme，C112-02)按试剂盒操作说明重组至pCMV-BE3质粒(addgene，#73021)中得到pCMV-BE3T。

利用以下引物5和引物10以pCMV-BE3T为模版进行PCR扩增，将PCR产物经限制性内切酶Apa I(NEB，R0114S)、Pme I(NEB，R0560L)消化后利用T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)按试剂说明连入同样经限制性内切酶Apa I(NEB，R0114S)、Pme I(NEB，R0560L)消化后的pCMV-BE3AP(25℃，2hr)，得到eBEa表达质粒pCMV-eBEa(序列为SEQ ID NO：22)。

2、碱基编辑系统的应用

2.1 sgRNA表达质粒的构建

将以下引物11和引物12退火，将退火产物利用T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)按照试剂说明连入经限制性内切酶BsaI(NEB，R3535L)消化后的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene，#51133)后，得到靶向人基因组FANCF位点的sgRNA表达质粒psgFANCF(序列为SEQ ID NO：24)。

表1引物

步骤1.2、1.2和2.1中质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下：

Phusion(NEB，M0535L)1μl；5×buffer(NEB，B0518S)4μl；Forward Primer(5μM)1μl；Reverse Primer(5μM)1μl；Template10ng；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：95℃，2min；95℃，15sec，55℃，30sec，72℃，1min，30循环；72℃，3min。

2.2真核细胞转染

2.2.1双载体共表达BE3和UGI

将psgFANCF、pCMV-BE3和得到的序列正确的pUGI-NLS质粒按照1.6μg/2.5μg/0ng(BE3_no UGI)，1.6μg/2.5μg/50ng(BE3_low UGI)，1.6μg/2.5μg/100ng(BE3_medium UGI)，1.6μg/2.5μg/200ng(BE3_highUGI)，0μg/0μg/0ng(no BE3)的比例混合入250μlOpti-MEM中，再混入含有

2000(Thermo Fisher，15338100)转染试剂的250μlOpti-MEM(Thermo Fisher，51985-042)，室温放置30分钟后加入含有1ml 1％双抗的DMEM(Gibco，10566)+10％FBS(Gbico，16000-044)培养基和八十万HEK293FT细胞的6孔板中进行转染。转染24h后换含有1ug/ml puromycine(Invivogen，ant-pr-1)抗生素的新鲜培养基，继续培养48小时。

2.2.2单载体共表达BE3和UGI

将psgFANCF和pCMV-BE3(或得到的序列正确的pCMV-eBEa或pCMV-eBEb)质粒按照1.6μg/2.5μg的比例混合入250μlOpti-MEM中，再混入含有

2000(ThermoFisher，15338100)转染试剂的250μlOpti-MEM(Thermo Fisher，51985-042)，室温放置30分钟后加入含有1ml 1％双抗的DMEM(Gibco，10566)+10％FBS(Gbico，16000-044)培养基和八十万HEK293FT细胞的6孔板中进行转染。转染24h后换含有1ug/ml puromycine(Invivogen，ant-pr-1)抗生素的新鲜培养基，继续培养48小时。

2.3基因组DNA抽提和PCR扩增

利用QuickExtract^TM(Epicenter/Illumina，QE09050)试剂按照试剂操作说明抽提转染后HEK293FT细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA利用以下引物13和引物14进行PCR扩增，并利用

DNA胶回收试剂(AP-GX-500G)按照试剂操作说明对PCR产物进行切胶回收，用于后续的高通量二代DNA测序文库的构建。

表2引物

编号	引物名	序列
			13	hFANCF_GC1F	cacagtatgtctctggcgtt
14	hFANCF_GC1R	tctcttggagtgtctcctca

扩增基因组DNA使用PCR体系如下：

Phusion(NEB，M0535L)1μl；5×buffer(NEB，B0518S)4μl；Forward Primer(5μM)1μl；Reverse Primer(5μM)1μl；Template10ng；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：95℃，2min；95℃，15sec，55℃，15sec，72℃，30sec，30循环；72℃，3min。

2.4高通量二代DNA测序

对PCR产物进行DNA-seq的高通量测序文库制备。具体来说，首先分别使用QubitFluorometer和AglientBioanalyzer 2100对PCR产物进行浓度质检和纯度鉴定；质检合格的样品，再使用Covaris S220超声波DNA破碎仪将PCR产物进行片段化；然后利用Illumina官方试剂盒TruSeqChIP Sample Preparation Kit，对不同的PCR产物加上不同生物素标记barcode，进行PCR扩增富集，完成测序文库的制备，并对已经构建完成的文库进行浓度和片段大小质检；最后使用IlluminaHiseq 2500测序仪进行高通量测序。

2.5实验结果

通过将sgFANCF表达质粒、BE3表达质粒和UGI表达质粒共转染真核生物细胞(图1A)，使其在靶点基因组DNA发生C-T碱基编辑，并在PCR扩增靶点基因组DNA之后，利用高通量二代DNA测序检测sgFANCF靶点基因组DNA发生的C-T碱基编辑率和碱基插入或缺失率，最终计算所述系统的碱基编辑功效。和未表达UGI的对照组相比，共表达UGI能够在sgFANCF靶点基因组DNA的4个C位点提高碱基编辑器的功效，并且其功效随着UGI转染量的增加而提高(图1B)。同时，sgFANCF靶点基因组DNA的4个C位点的C-T碱基编辑率也得到提高(图1C)，而CRISPR系统本身所引起的碱基插入或缺失率则得到抑制(图1D)。

进一步的，本发明利用T2A自剪切肽段在BE3编码区下游同框接入1×或者3×UGI基因，得到增强型碱基编辑器a(enhanced base editor，eBEa)和增强型碱基编辑器b(eBEb)。在将sgFANCF表达质粒和BE3、eBEa或eBEb表达质粒共转染真核细胞之后(图1E)，按照上述方法检测sgFANCF靶点基因组DNA发生的C-T碱基编辑率和碱基插入或缺失率，并计算增强型碱基编辑器的功效。和BE3相比，eBEa和eBEb的功效均得到提高，并且同框接入3×UGI基因的eBEb功效为最高(图1F)。同时，eBEa和eBEb在sgFANCF靶点基因组DNA的4个C位点所诱导的C-T碱基编辑率也比BE3更高(图1G)，而CRISPR系统本身所引起的碱基插入或缺失率则较BE3更低(图1H)。

实施例2

人基因组RNF2位点利用实施例1中的碱基编辑系统实施高功效高精度的碱基编辑：

1.实验材料

1)试剂

同实施例1。

2)细胞株和载体

同实施例1。

2.实验方法

1、碱基编辑系统的构建

1.1 UGI单独表达质粒的构建

同实施例1。

1.2 eBEa、eBEb表达质粒的构建

同实施例1。

2、碱基编辑系统的应用

2.1 sgRNA表达质粒的构建

将以下引物15和引物16退火，将退火产物利用T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)按照试剂说明连入经限制性内切酶BsaI(NEB，R3535L)消化后的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene，#51133)后，得到靶向人基因组RNF2位点的sgRNA表达质粒psgRNF2(序列为SEQ ID NO：25)。

表3引物

编号	引物名	序列
			15	fwd_RNF2	accggtcatcttagtcattacctg
16	rev_RNF2	aaaccaggtaatgactaagatgac

质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下：

2.2真核细胞转染

2.2.1双载体共表达BE3和UGI

将psgRNF2、pCMV-BE3和得到的序列正确的pUGI-NLS质粒按照1.6μg/2.5μg/0ng(BE3_no UGI)，1.6μg/2.5μg/50ng(BE3_low UGI)，1.6μg/2.5μg/100ng(BE3_medium UGI)，1.6μg/2.5μg/200ng(BE3_high UGI)，0μg/0μg/0ng(no BE3)的比例混合入250μlOpti-MEM(Thermo Fisher，51985-042)中，再混入含有

2000(Thermo Fisher，15338100)转染试剂的250μlOpti-MEM，室温放置30分钟后加入含有1ml DMEM DMEM(Gibco，10566)+10％FBS(Gbico，16000-044)培养基和八十万HEK293FT细胞的6孔板中进行转染。转染24h后换含有1ug/ml puromycine(Invivogen，ant-pr-1)抗生素的新鲜培养基，继续培养48小时。

2.2.1双载体共表达BE3和UGI

将psgRNF2和pCMV-BE3(或得到的序列正确的pCMV-eBEa或pCMV-eBEb)质粒按照1.6μg/2.5μg的比例混合入250μlOpti-MEM(Thermo Fisher，51985-042)中，再混入含有

2000(Thermo Fisher，15338100)转染试剂的250μlOpti-MEM，室温放置30分钟后加入含有1ml 1％双抗的DMEM(Gibco，10566)+10％FBS(Gbico，16000-044)培养基和八十万HEK293FT细胞的6孔板中进行转染。转染24h后换含有1ug/ml puromycine(Invivogen，ant-pr-1)抗生素的新鲜培养基，继续培养48小时。

2.3基因组DNA抽提和PCR扩增

利用QuickExtract^TM试剂按试剂操作说明抽提转染后HEK293FT细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA利用以下引物17和引物18进行PCR扩增，并利用

DNA胶回收试剂按试剂操作说明对PCR产物进行切胶回收，用于后续的高通量二代DNA测序文库的构建。

表4引物

编号	引物名	序列
			17	hRNF2_G2F	aggaggacttgcccaacttt
18	hRNF2_G2R	ctgtgtcagaacatgctggaa

扩增基因组DNA使用PCR体系如下：

2.4高通量二代DNA测序

同实施例1。

2.5实验结果

通过将sgRNF2表达质粒、BE3表达质粒和UGI表达质粒共转染真核生物细胞(图2A)，使其在靶点基因组DNA发生C-T碱基编辑，并在PCR扩增靶点基因组DNA之后，利用高通量二代DNA测序检测sgRNF2靶点基因组DNA发生的C-T碱基编辑率和碱基插入或缺失率，最终计算所述系统的碱基编辑功效。和未表达UGI的对照组相比，共表达UGI能够在sgRNF2靶点基因组DNA的2个C位点提高碱基编辑器的功效，并且其功效随着UGI转染量的增加而提高(图2B)。同时，sgRNF2靶点基因组DNA的2个C位点的C-T碱基编辑率也得到提高(图2C)，而CRISPR系统本身所引起的碱基插入或缺失率则得到抑制(图2D)。

进一步的，在将sgRNF2表达质粒和BE3、eBEa或eBEb表达质粒共转染真核细胞之后(图2E)，按照上述方法检测sgRNF2靶点基因组DNA发生的C-T碱基编辑率和碱基插入或缺失率，并计算增强型碱基编辑器的功效。和BE3相比，eBEa和eBEb的功效均得到提高，并且同框接入3×UGI基因的eBEb功效为最高(图2F)。同时，eBEa和eBEb在sgRNF2靶点基因组DNA的2个C位点所诱导的C-T碱基编辑率也比BE3更高(图2G)，而CRISPR系统本身所引起的碱基插入或缺失率则较BE3更低(图2H)。

<110>上海科技大学

<120>一种碱基编辑系统及其构建和应用方法

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 1

gtgctggata tctgcagaat tcatgactaa tctgtcagat at 42

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 2

ttggtaccga gctcggatcc ctagactttc ctcttcttct tggggagcat cttaatctt 59

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 3

aaatggccga aaacggatgt 20

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 4

gaggctgatc agcgggttta aactcaatgg tgagggcccg actttcctct tcttcttgg 59

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 5

aaagtcgggc ccgagggcag aggaagtctg ct 32

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 6

cagcgggttt aaactcacac ctttcttttt tttttagg 38

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 7

agaaccacca gagtcacccc caagctgtga 30

<210> 8

<211> 89

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 8

gactctggtg gttctgaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 60

cctggcccaa ctaatctgtc agatattat 89

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 9

cgaggctgat cagcgggttt aaactcaatg gtgatggtga 40

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 10

cagcgggttt aaacttagac tttcctcttc ttcttggg 38

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 11

accggaatcc cttctgcagc acc 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 12

aaacggtgct gcagaaggga ttc 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 13

cacagtatgt ctctggcgtt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 14

tctcttggag tgtctcctca 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 15

accggtcatc ttagtcatta cctg 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 16

aaaccaggta atgactaaga tgac 24

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 17

aggaggactt gcccaacttt 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>引物

<400> 18

ctgtgtcaga acatgctgga a 21

<210> 19

<211> 1482

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>化学合成的PCR模板DNA

<400> 19

gctagcgccg gagagcttca aaaggggaac gaactcgcac taccgtctaa atacgtgaat 60

ttcctgtatt tagcgtccca ttacgagaag ttgaaaggtt cacctgaaga taacgaacag 120

aagcaacttt ttgttgagca gcacaaacat tatctcgacg aaatcataga gcaaatttcg 180

gaattcagta agagagtcat cctagctgat gccaatctgg acaaagtatt aagcgcatac 240

aacaagcaca gggataaacc catacgtgag caggcggaaa atattatcca tttgtttact 300

cttaccaacc tcggcgctcc agccgcattc aagtattttg acacaacgat agatcgcaaa 360

cgatacactt ctaccaagga ggtgctagac gcgacactga ttcaccaatc catcacggga 420

ttatatgaaa ctcggataga tttgtcacag cttgggggtg actctggtgg ttctcccaag 480

aagaagagga aagtcgaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 540

cctggcccaa ctaatctgtc agatattatt gaaaaggaga ccggtaagca actggttatc 600

caggaatcca tcctcatgct cccagaggag gtggaagaag tcattgggaa caagccggaa 660

agcgatatac tcgtgcacac cgcctacgac gagagcaccg acgagaatgt catgcttctg 720

actagcgacg cccctgaata caagccttgg gctctggtca tacaggatag caacggtgag 780

aacaagatta agatgctccc caagaagaag aggaaagtcg ctactaactt cagcctgctg 840

aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctacca acctgtccga tatcattgag 900

aaagagaccg gcaaacagct ggtgatccag gagagcatcc tgatgctgcc cgaagaggtg 960

gaggaagtga tcggcaacaa gcccgagtcc gacatcctgg tgcacacagc ctatgatgaa 1020

tccaccgacg agaacgtgat gctgctgacc tccgatgctc ccgagtataa accctgggca 1080

ctggtgatcc aggactctaa tggagagaac aagatcaaga tgctgcccaa gaagaagagg 1140

aaagtcgaag gacggggctc cctcctgacc tgtggcgatg tggaagagaa ccccggcccc 1200

acaaacctca gtgacattat cgagaaggaa acaggaaaac agctcgtcat tcaagaatct 1260

attcttatgt tgcctgagga agtcgaagag gttattggca ataaacctga atctgatatt 1320

cttgtccata ccgcttacga tgagtccaca gatgaaaatg ttatgctgct cacatctgac 1380

gcaccagagt acaaaccatg ggcgctcgtt attcaagatt ccaacggcga aaacaaaatc 1440

aaaatgcttt ctggtggttc tcctaaaaaa aaaagaaagg tg 1482

<210> 20

<211> 5711

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGI表达载体pUGI-NLS

<400> 20

actcgagcgg ccgccactgt gctggatatc tgcagaattc atgactaatc tgtcagatat 60

tattgaaaag gagaccggta agcaactggt tatccaggaa tccatcctca tgctcccaga 120

ggaggtggaa gaagtcattg ggaacaagcc ggaaagcgat atactcgtgc acaccgccta 180

cgacgagagc accgacgaga atgtcatgct tctgactagc gacgcccctg aatacaagcc 240

ttgggctctg gtcatacagg atagcaacgg tgagaacaag attaagatgc tccccaagaa 300

gaagaggaaa gtctagggat ccgagctcgg taccaagctt aagtttaaac cgctgatcag 360

cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 420

tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 480

attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 540

aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg 600

cggaaagaac cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa 660

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 720

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 780

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 840

aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 900

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 960

cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 1020

attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt 1080

gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 1140

gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 1200

tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 1260

cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 1320

tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 1380

cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg 1440

atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatggaa gcgggtaggc ctttggggca 1500

gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt tctgggctca gaggctggga aggggtgggt 1560

ccgggggcgg gctcaggggc gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagg tcctccggag 1620

gcccggcatt ctgcacgctt caaaagcgca cgtctgccgc gctgttctcc tcttcctcat 1680

ctccgggcct ttcgacctgc agcccaagct taccatgacc gagtacaagc ccacggtgcg 1740

cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga 1800

ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct 1860

gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga 1920

cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc 1980

cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat 2040

ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg 2100

cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga 2160

ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc 2220

cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg 2280

cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc 2340

gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 2400

aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 2460

ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 2520

taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 2580

ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag 2640

agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 2700

ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 2760

taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 2820

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 2880

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 2940

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 3000

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 3060

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 3120

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 3180

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 3240

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 3300

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 3360

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 3420

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 3480

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 3540

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtttt 3600

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 3660

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 3720

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 3780

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 3840

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 3900

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 3960

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 4020

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 4080

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 4140

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 4200

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 4260

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 4320

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 4380

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 4440

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 4500

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 4560

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 4620

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 4680

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 4740

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 4800

ccacctgacg tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtgcact ctcagtacaa 4860

tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg 4920

ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca 4980

tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata 5040

cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 5100

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 5160

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 5220

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 5280

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 5340

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 5400

acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 5460

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 5520

tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 5580

cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 5640

ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc 5700

aagctggcta g 5711

<210> 21

<211> 8532

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BE3表达载体pCMV-BE3

<400> 21

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120

ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180

cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240

atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300

ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360

agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gagctcagag 420

actggcccag tggctgtgga ccccacattg agacggcgga tcgagcccca tgagtttgag 480

gtattcttcg atccgagaga gctccgcaag gagacctgcc tgctttacga aattaattgg 540

gggggccggc actccatttg gcgacataca tcacagaaca ctaacaagca cgtcgaagtc 600

aacttcatcg agaagttcac gacagaaaga tatttctgtc cgaacacaag gtgcagcatt 660

acctggtttc tcagctggag cccatgcggc gaatgtagta gggccatcac tgaattcctg 720

tcaaggtatc cccacgtcac tctgtttatt tacatcgcaa ggctgtacca ccacgctgac 780

ccccgcaatc gacaaggcct gcgggatttg atctcttcag gtgtgactat ccaaattatg 840

actgagcagg agtcaggata ctgctggaga aactttgtga attatagccc gagtaatgaa 900

gcccactggc ctaggtatcc ccatctgtgg gtacgactgt acgttcttga actgtactgc 960

atcatactgg gcctgcctcc ttgtctcaac attctgagaa ggaagcagcc acagctgaca 1020

ttctttacca tcgctcttca gtcttgtcat taccagcgac tgcccccaca cattctctgg 1080

gccaccgggt tgaaaagcgg cagcgagact cccgggacct cagagtccgc cacacccgaa 1140

agtgataaaa agtattctat tggtttagcc atcggcacta attccgttgg atgggctgtc 1200

ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag aaatttaagg tgttggggaa cacagaccgt 1260

cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc ctcctattcg atagtggcga aacggcagag 1320

gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga aggtatacac gtcgcaagaa ccgaatatgt 1380

tacttacaag aaatttttag caatgagatg gccaaagttg acgattcttt ctttcaccgt 1440

ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac aagaaacatg aacggcaccc catctttgga 1500

aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa aagtacccaa cgatttatca cctcagaaaa 1560

aagctagttg actcaactga taaagcggac ctgaggttaa tctacttggc tcttgcccat 1620

atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt gagggtgatc taaatccgga caactcggat 1680

gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa acctataatc agttgtttga agagaaccct 1740

ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct attcttagcg cccgcctctc taaatcccga 1800

cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc ggagagaaga aaaatgggtt gttcggtaac 1860

cttatagcgc tctcactagg cctgacacca aattttaagt cgaacttcga cttagctgaa 1920

gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg tacgatgacg atctcgacaa tctactggca 1980

caaattggag atcagtatgc ggacttattt ttggctgcca aaaaccttag cgatgcaatc 2040

ctcctatctg acatactgag agttaatact gagattacca aggcgccgtt atccgcttca 2100

atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa gacttgacac ttctcaaggc cctagtccgt 2160

cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata ttctttgatc agtcgaaaaa cgggtacgca 2220

ggttatattg acggcggagc gagtcaagag gaattctaca agtttatcaa acccatatta 2280

gagaagatgg atgggacgga agagttgctt gtaaaactca atcgcgaaga tctactgcga 2340

aagcagcgga ctttcgacaa cggtagcatt ccacatcaaa tccacttagg cgaattgcat 2400

gctatactta gaaggcagga ggatttttat ccgttcctca aagacaatcg tgaaaagatt 2460

gagaaaatcc taacctttcg cataccttac tatgtgggac ccctggcccg agggaactct 2520

cggttcgcat ggatgacaag aaagtccgaa gaaacgatta ctccatggaa ttttgaggaa 2580

gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgacaag 2640

aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag cacagtttac tttacgagta tttcacagtg 2700

tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc actgagggca tgcgtaaacc cgcctttcta 2760

agcggagaac agaagaaagc aatagtagat ctgttattca agaccaaccg caaagtgaca 2820

gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag aaaattgaat gcttcgattc tgtcgagatc 2880

tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca cttggtacgt atcatgacct cctaaagata 2940

attaaagata aggacttcct ggataacgaa gagaatgaag atatcttaga agatatagtg 3000

ttgactctta ccctctttga agatcgggaa atgattgagg aaagactaaa aacatacgct 3060

cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag ttaaagaggc gtcgctatac gggctgggga 3120

cgattgtcgc ggaaacttat caacgggata agagacaagc aaagtggtaa aactattctc 3180

gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat aggaacttta tgcagctgat ccatgatgac 3240

tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag gcacaggttt ccggacaagg ggactcattg 3300

cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg ccagccatca aaaagggcat actccagaca 3360

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<223> eBEb表达载体pCMV-eBEb

<400> 23

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120

ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180

cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240

atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300

ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360

agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gagctcagag 420

actggcccag tggctgtgga ccccacattg agacggcgga tcgagcccca tgagtttgag 480

gtattcttcg atccgagaga gctccgcaag gagacctgcc tgctttacga aattaattgg 540

gggggccggc actccatttg gcgacataca tcacagaaca ctaacaagca cgtcgaagtc 600

aacttcatcg agaagttcac gacagaaaga tatttctgtc cgaacacaag gtgcagcatt 660

acctggtttc tcagctggag cccatgcggc gaatgtagta gggccatcac tgaattcctg 720

tcaaggtatc cccacgtcac tctgtttatt tacatcgcaa ggctgtacca ccacgctgac 780

ccccgcaatc gacaaggcct gcgggatttg atctcttcag gtgtgactat ccaaattatg 840

actgagcagg agtcaggata ctgctggaga aactttgtga attatagccc gagtaatgaa 900

gcccactggc ctaggtatcc ccatctgtgg gtacgactgt acgttcttga actgtactgc 960

atcatactgg gcctgcctcc ttgtctcaac attctgagaa ggaagcagcc acagctgaca 1020

ttctttacca tcgctcttca gtcttgtcat taccagcgac tgcccccaca cattctctgg 1080

gccaccgggt tgaaaagcgg cagcgagact cccgggacct cagagtccgc cacacccgaa 1140

agtgataaaa agtattctat tggtttagcc atcggcacta attccgttgg atgggctgtc 1200

ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag aaatttaagg tgttggggaa cacagaccgt 1260

cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc ctcctattcg atagtggcga aacggcagag 1320

gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga aggtatacac gtcgcaagaa ccgaatatgt 1380

tacttacaag aaatttttag caatgagatg gccaaagttg acgattcttt ctttcaccgt 1440

ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac aagaaacatg aacggcaccc catctttgga 1500

aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa aagtacccaa cgatttatca cctcagaaaa 1560

aagctagttg actcaactga taaagcggac ctgaggttaa tctacttggc tcttgcccat 1620

atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt gagggtgatc taaatccgga caactcggat 1680

gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa acctataatc agttgtttga agagaaccct 1740

ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct attcttagcg cccgcctctc taaatcccga 1800

cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc ggagagaaga aaaatgggtt gttcggtaac 1860

cttatagcgc tctcactagg cctgacacca aattttaagt cgaacttcga cttagctgaa 1920

gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg tacgatgacg atctcgacaa tctactggca 1980

caaattggag atcagtatgc ggacttattt ttggctgcca aaaaccttag cgatgcaatc 2040

ctcctatctg acatactgag agttaatact gagattacca aggcgccgtt atccgcttca 2100

atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa gacttgacac ttctcaaggc cctagtccgt 2160

cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata ttctttgatc agtcgaaaaa cgggtacgca 2220

ggttatattg acggcggagc gagtcaagag gaattctaca agtttatcaa acccatatta 2280

gagaagatgg atgggacgga agagttgctt gtaaaactca atcgcgaaga tctactgcga 2340

aagcagcgga ctttcgacaa cggtagcatt ccacatcaaa tccacttagg cgaattgcat 2400

gctatactta gaaggcagga ggatttttat ccgttcctca aagacaatcg tgaaaagatt 2460

gagaaaatcc taacctttcg cataccttac tatgtgggac ccctggcccg agggaactct 2520

cggttcgcat ggatgacaag aaagtccgaa gaaacgatta ctccatggaa ttttgaggaa 2580

gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgacaag 2640

aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag cacagtttac tttacgagta tttcacagtg 2700

tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc actgagggca tgcgtaaacc cgcctttcta 2760

agcggagaac agaagaaagc aatagtagat ctgttattca agaccaaccg caaagtgaca 2820

gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag aaaattgaat gcttcgattc tgtcgagatc 2880

tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca cttggtacgt atcatgacct cctaaagata 2940

attaaagata aggacttcct ggataacgaa gagaatgaag atatcttaga agatatagtg 3000

ttgactctta ccctctttga agatcgggaa atgattgagg aaagactaaa aacatacgct 3060

cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag ttaaagaggc gtcgctatac gggctgggga 3120

cgattgtcgc ggaaacttat caacgggata agagacaagc aaagtggtaa aactattctc 3180

gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat aggaacttta tgcagctgat ccatgatgac 3240

tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag gcacaggttt ccggacaagg ggactcattg 3300

cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg ccagccatca aaaagggcat actccagaca 3360

gtcaaagtag tggatgagct agttaaggtc atgggacgtc acaaaccgga aaacattgta 3420

atcgagatgg cacgcgaaaa tcaaacgact cagaaggggc aaaaaaacag tcgagagcgg 3480

atgaagagaa tagaagaggg tattaaagaa ctgggcagcc agatcttaaa ggagcatcct 3540

gtggaaaata cccaattgca gaacgagaaa ctttacctct attacctaca aaatggaagg 3600

gacatgtatg ttgatcagga actggacata aaccgtttat ctgattacga cgtcgatcac 3660

attgtacccc aatccttttt gaaggacgat tcaatcgaca ataaagtgct tacacgctcg 3720

gataagaacc gagggaaaag tgacaatgtt ccaagcgagg aagtcgtaaa gaaaatgaag 3780

aactattggc ggcagctcct aaatgcgaaa ctgataacgc aaagaaagtt cgataactta 3840

actaaagctg agaggggtgg cttgtctgaa cttgacaagg ccggatttat taaacgtcag 3900

ctcgtggaaa cccgccaaat cacaaagcat gttgcacaga tactagattc ccgaatgaat 3960

acgaaatacg acgagaacga taagctgatt cgggaagtca aagtaatcac tttaaagtca 4020

aaattggtgt cggacttcag aaaggatttt caattctata aagttaggga gataaataac 4080

taccaccatg cgcacgacgc ttatcttaat gccgtcgtag ggaccgcact cattaagaaa 4140

tacccgaagc tagaaagtga gtttgtgtat ggtgattaca aagtttatga cgtccgtaag 4200

atgatcgcga aaagcgaaca ggagataggc aaggctacag ccaaatactt cttttattct 4260

aacattatga atttctttaa gacggaaatc actctggcaa acggagagat acgcaaacga 4320

cctttaattg aaaccaatgg ggagacaggt gaaatcgtat gggataaggg ccgggacttc 4380

gcgacggtga gaaaagtttt gtccatgccc caagtcaaca tagtaaagaa aactgaggtg 4440

cagaccggag ggttttcaaa ggaatcgatt cttccaaaaa ggaatagtga taagctcatc 4500

gctcgtaaaa aggactggga cccgaaaaag tacggtggct tcgatagccc tacagttgcc 4560

tattctgtcc tagtagtggc aaaagttgag aagggaaaat ccaagaaact gaagtcagtc 4620

aaagaattat tggggataac gattatggag cgctcgtctt ttgaaaagaa ccccatcgac 4680

ttccttgagg cgaaaggtta caaggaagta aaaaaggatc tcataattaa actaccaaag 4740

tatagtctgt ttgagttaga aaatggccga aaacggatgt tggctagcgc cggagagctt 4800

caaaagggga acgaactcgc actaccgtct aaatacgtga atttcctgta tttagcgtcc 4860

cattacgaga agttgaaagg ttcacctgaa gataacgaac agaagcaact ttttgttgag 4920

cagcacaaac attatctcga cgaaatcata gagcaaattt cggaattcag taagagagtc 4980

atcctagctg atgccaatct ggacaaagta ttaagcgcat acaacaagca cagggataaa 5040

cccatacgtg agcaggcgga aaatattatc catttgttta ctcttaccaa cctcggcgct 5100

ccagccgcat tcaagtattt tgacacaacg atagatcgca aacgatacac ttctaccaag 5160

gaggtgctag acgcgacact gattcaccaa tccatcacgg gattatatga aactcggata 5220

gatttgtcac agcttggggg tgactctggt ggttctacta atctgtcaga tattattgaa 5280

aaggagaccg gtaagcaact ggttatccag gaatccatcc tcatgctccc agaggaggtg 5340

gaagaagtca ttgggaacaa gccggaaagc gatatactcg tgcacaccgc ctacgacgag 5400

agcaccgacg agaatgtcat gcttctgact agcgacgccc ctgaatacaa gccttgggct 5460

ctggtcatac aggatagcaa cggtgagaac aagattaaga tgctctctgg tggttctccc 5520

aagaagaaga ggaaagtcgg gcccgagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc 5580

gaggagaatc ctggcccaac taatctgtca gatattattg aaaaggagac cggtaagcaa 5640

ctggttatcc aggaatccat cctcatgctc ccagaggagg tggaagaagt cattgggaac 5700

aagccggaaa gcgatatact cgtgcacacc gcctacgacg agagcaccga cgagaatgtc 5760

atgcttctga ctagcgacgc ccctgaatac aagccttggg ctctggtcat acaggatagc 5820

aacggtgaga acaagattaa gatgctcccc aagaagaaga ggaaagtcgc tactaacttc 5880

agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg gacctaccaa cctgtccgat 5940

atcattgaga aagagaccgg caaacagctg gtgatccagg agagcatcct gatgctgccc 6000

gaagaggtgg aggaagtgat cggcaacaag cccgagtccg acatcctggt gcacacagcc 6060

tatgatgaat ccaccgacga gaacgtgatg ctgctgacct ccgatgctcc cgagtataaa 6120

ccctgggcac tggtgatcca ggactctaat ggagagaaca agatcaagat gctgcccaag 6180

aagaagagga aagtcgaagg acggggctcc ctcctgacct gtggcgatgt ggaagagaac 6240

cccggcccca caaacctcag tgacattatc gagaaggaaa caggaaaaca gctcgtcatt 6300

caagaatcta ttcttatgtt gcctgaggaa gtcgaagagg ttattggcaa taaacctgaa 6360

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acatctgacg caccagagta caaaccatgg gcgctcgtta ttcaagattc caacggcgaa 6480

aacaaaatca aaatgctttc tggtggttct cctaaaaaaa aaagaaaggt gtgagtttaa 6540

acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 6600

cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 6660

gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 6720

gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 6780

atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctcgatac cgtcgacctc tagctagagc 6840

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ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 7080

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cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 7200

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 7260

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aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 7380

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gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 7500

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 7560

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 7620

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 7680

tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 7740

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 7800

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ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 7920

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atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 8040

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 8100

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 8160

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 8220

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gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 8400

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 8460

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 8520

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 8580

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 8640

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 8700

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 8760

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 8820

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 8880

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tatacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 9300

gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 9360

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<210> 24

<211> 4949

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sgFANCF表达载体

<400> 24

ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60

cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 120

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 180

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 240

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 300

tgtggaaagg acgaaacacc ggaatccctt ctgcagcacc gttttagagc tagaaatagc 360

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 420

tttaaagaat tctcgacctc gagacaaatg gcagtattca tccacaattt taaaagaaaa 480

ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc aacagacata 540

caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttcgggt ttattacagg 600

gacagcagag atccactttg gccgcggctc gagggggttg gggttgcgcc ttttccaagg 660

cagccctggg tttgcgcagg gacgcggctg ctctgggcgt ggttccggga aacgcagcgg 720

cgccgaccct gggactcgca cattcttcac gtccgttcgc agcgtcaccc ggatcttcgc 780

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ggggtgtggg gcggtagtgt gggccctgtt cctgcccgcg cggtgttccg cattctgcaa 1080

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ccagggggat ccaccggagc ttaccatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac 1200

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cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc 1380

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ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 2940

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 3000

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tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 3120

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 3180

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tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gggacccacg 3360

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 3420

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 3480

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gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 3600

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 3660

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 3720

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 3780

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ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 4140

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 4200

tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 4260

cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 4320

cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 4380

tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 4440

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tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 4560

ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 4620

taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcc cattcgccat tcaggctgcg 4680

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc ccaagctacc 4740

atgataagta agtaatatta aggtacggga ggtacttgga gcggccgcaa taaaatatct 4800

ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact aacatacgct 4860

ctccatcaaa acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc cagtgcaagt 4920

gcaggtgcca gaacatttct ctatcgata 4949

<210> 25

<211> 4950

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sgRNF2表达载体

<400> 25

ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60

cccccttcac cgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 120

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 180

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 240

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 300

tgtggaaagg acgaaacacc ggtcatctta gtcattacct ggttttagag ctagaaatag 360

caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt 420

ttttaaagaa ttctcgacct cgagacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa 480

aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat 540

acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag 600

ggacagcaga gatccacttt ggccgcggct cgagggggtt ggggttgcgc cttttccaag 660

gcagccctgg gtttgcgcag ggacgcggct gctctgggcg tggttccggg aaacgcagcg 720

gcgccgaccc tgggactcgc acattcttca cgtccgttcg cagcgtcacc cggatcttcg 780

ccgctaccct tgtgggcccc ccggcgacgc ttcctgctcc gcccctaagt cgggaaggtt 840

ccttgcggtt cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc actagtaccc 900

tcgcagacgg acagcgccag ggagcaatgg cagcgcgccg accgcgatgg gctgtggcca 960

atagcggctg ctcagcaggg cgcgccgaga gcagcggccg ggaaggggcg gtgcgggagg 1020

cggggtgtgg ggcggtagtg tgggccctgt tcctgcccgc gcggtgttcc gcattctgca 1080

agcctccgga gcgcacgtcg gcagtcggct ccctcgttga ccgaatcacc gacctctctc 1140

cccaggggga tccaccggag cttaccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca 1200

cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg 1260

ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac 1320

tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg 1380

cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg 1440

gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc 1500

tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc 1560

ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg 1620

agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaaa cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg 1680

agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt 1740

gcatgacccg caagcccggt gcctgacgcc cgccccacga cccgcagcgc ccgaccgaaa 1800

ggagcgcacg accccatgca tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 1860

atcttagcca ctttctagag tcggggcggc cggccgcttc gagcagacat gataagatac 1920

attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 1980

atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac 2040

aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 2100

aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc gataaggatc cgtcgaccga tgcccttgag 2160

agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact 2220

tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt 2280

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2340

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2400

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2460

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2520

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2580

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2640

tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2700

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2760

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2820

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2880

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2940

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 3000

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 3060

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3120

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 3180

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 3240

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 3300

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgggacccac 3360

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 3420

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 3480

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 3540

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 3600

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 3660

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3720

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3780

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 3840

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 3900

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 3960

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 4020

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 4080

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 4140

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 4200

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4260

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 4320

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 4380

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 4440

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 4500

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 4560

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 4620

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccattcgcca ttcaggctgc 4680

gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag cccaagctac 4740

catgataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca ataaaatatc 4800

tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac taacatacgc 4860

tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc ccagtgcaag 4920

tgcaggtgcc agaacatttc tctatcgata 4950

Claims

1.一种碱基编辑系统，其特征在于，包括尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil glycosylaseinhibitor，UGI)表达载体或其转录产物和碱基编辑器3(base editor 3，BE3)表达载体或其转录产物，或包括尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor，UGI)和碱基编辑器3(base editor 3，BE3)共表达载体或其转录产物，所述共表达载体利用T2A自剪切肽段在BE3编码区下游同框接入UGI基因；以及还包括针对某物种的基因组靶点的sgRNA表达载体。

2.如权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述的UGI和BE3共表达载体为增强型CRISPR碱基编辑器eBEa表达载体，其序列为SEQ ID NO:22。

3.如权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述的UGI和BE3共表达载体为增强型CRISPR碱基编辑器eBEb表达载体，其序列为SEQ ID NO:23。

4.如权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述的UGI表达载体的序列包括SEQID NO:20。

5.如权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述的碱基编辑系统还包括真核细胞和基因转导试剂。

6.权利要求1-5中任一项所述的碱基编辑系统的构建方法，其特征在于，包括扩增UGI基因，并连入真核表达载体中，得到UGI表达载体；或利用PCR方法扩增T2A-UGI编码序列，并同框连入BE3编码区的下游，得到增强型CRISPR碱基编辑器eBEa表达载体；或人工合成3×T2A-UGI编码序列，PCR扩增后同框连入BE3编码区的下游，得到增强型CRISPR碱基编辑器eBEb表达载体。

7.权利要求1-5中任一项碱基编辑系统的应用方法，其特征在于，包括构建针对某物种的基因组DNA靶点的sgRNA；在真核细胞中共引入sgRNA，BE3表达载体或其转录产物以及UGI表达载体或其转录产物，或者，在真核细胞中共引入sgRNA以及UGI和BE3共表达载体或其转录产物，使其在靶点基因组DNA发生C-T碱基编辑。

8.如权利要求7所述的碱基编辑系统的应用方法，其特征在于，还包括：对处理后的真核细胞基因组DNA进行抽提，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量二代DNA测序文库，并进行高通量二代DNA测序。

9.如权利要求7所述的碱基编辑系统的应用方法，其特征在于，所述的某物种的基因组DNA靶点为人的FANCF或RNF2靶点。