CN112322655B - 一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用；本发明基于TALEN技术，利用胞嘧啶脱氨酶结合UGI，通过不同的条件实验，找到了可以对靶位点进行碱基编辑的体系，命名为TALEN‑BE。通过在报告系统和內源基因的数据表明，TALEN‑BE系统可以实现胞嘧啶转换为胸腺嘧啶。该编辑系统的出现极大的拓展了碱基编辑的应用范围，同时TALEN技术所涉及的序列长度相对较小，可以包装进入AAV载体，从而对遗传疾病的基因治疗提供巨大的应用价值。

Description

一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用。
背景技术
分子生物学技术的发展，特别是基因编辑技术的出现，包括锌指核酸酶技术(zincfinger nucleases,ZFNs)、转录激活剂样效应核酸酶技术(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和聚集规则间隔短回文重复序列系统(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)，使得基因操作的效率得到了显著提高。一般意义上，这三种技术涉及精确靶向DNA序列以引入双链DNA断裂(double-strand breaks,DSB)，进而利用细胞的修复机制尝试修复双链断裂，通常通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或者同源重组的方法修复(homology-directed repair,HDR)。而这两种修复都可能导致碱基对的插入或缺失，进而引起移码突变。在临床上，利用这两种方法的效率和安全性均有待于提高。
在CRISPR/Cas9基础上发展出来的碱基编辑技术因为不引起DNA双链断裂，原位修复致病突变等高效安全的特点迅速成为了基因治疗的热点。胞嘧啶碱基编辑器是将dCas9或Cas9切口酶与大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1融合，它通过脱氨基作用将胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，之后通过DNA复制或修复，尿嘧啶(U)被转化成胸腺嘧啶(T)。其能够在目标基因中精确而有效地引入点突变，不需要双链DNA断裂或任何供体模板，展现出很大的基因编辑潜力。胞嘧啶碱基编辑器不需切割DNA造成DSB，形成的indel低于1％，实现的基因编辑更精确；而且，这种方式将脱靶效率降低到低于自然背景的10倍，实现的基因编辑更安全。目前碱基编辑系统已经广泛应用于多个领域，并显示出了不可估量的价值。
但基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术有几个明显的缺陷。一是CRISPR/Cas9系统依赖于PAM序列而发挥功能，这使得有些位点无法靶向。虽然目前开发了可以靶向多种PAM的系统，但总体看来，可以进行精确修复的致病突变只有25％左右。二是目前的碱基编辑系统存在着序列较大的缺点，超出了常用于基因治疗的AAV载体的容量，虽然目前开发了分开形式的编辑系统，但其效率受到大大的影响。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种不受基因序列限制的碱基编辑系统。
本发明的第二个目的是提供上述碱基编辑系统的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述碱基编辑系统的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种不受基因序列限制的碱基编辑系统TALEN-BE，是在TALEN基因编辑系统上进行优化得到的，其包括只能切割单链形式的TALEN系统、胞嘧啶脱氨酶和UGI，所述只能切割单链形式的TALEN系统由TALEN系统内使用的两个FOKI任意失活一个得到；其中胞嘧啶脱氨酶连接到失活形式一侧的TALEN表达载体的N端，UGI连接到未失活一侧的TALEN表达载体的N端。
TALEN基因编辑系统主要由TALE与FOKI核酸酶组成，其中FOKI核酸酶是一个相对固定的组成部分，该部分不具有特异性，主要负责DNA链的切割；而相比于FOKI，TALE是不固定的，包含大约16--18个识别模块，每一个模块对应识别一个DNA碱基。主要负责对DNA的识别和靶向。TALE部分对目标DNA序列进行编辑时，需要针对该序列的左边侧翼和右边侧翼分别设计构建一个TALEN表达载体，两个TALEN共同作用完成对目标序列的靶定和切割。
所述胞嘧啶脱氨酶，可以是APOBEC1、A3A、AID3。
本发明还提供上述编辑系统TALEN-BE的制备方法。
本发明还提供一种用于检测上述TALEN-BE系统突变效率的方法，是构建获得型报告系统/缺失型报告系统，并将TALEN-BE系统和获得型报告系统/缺失型报告系统共转染至哺乳动物细胞，检测荧光值的变化。
所述获得型报告系统在TALEN-BE系统编辑以后，荧光强度增强，以此确定编辑的发生与效率的高低；所述缺失型报告系统在TALEN-BE系统编辑以后，荧光强度降低，以此来确定编辑的发生与效率的高低。
所述获得型报告系统是将6个ACG融合进TALEN结合位点之间，最后连接到去掉ATG的GFP表达载体中得到；所述缺失型报告系统是将6个CAA融合进TALEN结合位点之间，最后插入到EGFP基因序列中间得到。
本发明还提供上述编辑系统TALEN-BE的应用，该编辑系统可以实现不受序列限制的碱基编辑。从而极大的提高了可以靶向的碱基编辑范围，为遗传疾病的基因治疗提供了有力的工具。
具体地，本发明提供利用TALEN-BE系统在内源性基因中实现胞嘧啶碱基编辑的方法。其特征在于，将TALEN-BE系统转染相应的哺乳动物细胞中，三天以后收集细胞，检测编辑效率。
所述转染可以选择脂质体转染或电转，更优选地，选择电转。转染时可以添加一定量的EGFP表达载体，作为荧光信号便于进行分选。
相应的质粒可以转录成mRNA进行电转。
转染以后的模板，PCR之后送深度测序进行效率的确定，同时分析indel的产生。
与现有技术相比，本发明具有以下进步：
本发明基于TALEN技术，利用胞嘧啶脱氨酶结合UGI，通过不同的条件实验，找到了可以对靶位点进行碱基编辑的体系，命名为TALEN-BE。通过在报告系统和內源基因的检测数据表明，TALEN-BE系统可以实现胞嘧啶转换为胸腺嘧啶。该编辑系统的出现极大的拓展了碱基编辑的应用范围，同时TALEN技术所涉及的序列长度相对较小，可以包装进入AAV载体，从而对遗传疾病的基因治疗提供巨大的应用价值。
附图说明
图1为TALEN组成及结构模式图；
图2为突变的变FOKI核酸内切酶，无法切割DNA双链；
图3为不同类型的TALEN-BE模式图；
图4为获得型报告系统的构建示意图；
图5为ACG报告系统检测结果；
图6为缺失型荧光报告系统的构建示意图；
图7为GTG报告系统的检测结果；
图8为內源基因编辑效率及产生indel分析。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1构建TALEN-BE系统
突变FOKI内切酶，并将胞嘧啶脱氨酶和UGI分别连接到TALEN的左右臂，其中脱氨酶连到突变FOKI的质粒的N端，UGI连到TALEN另一个臂的N端。
具体如下：
1、构建的原始TALEN质粒的效率检测
本实验室保留的TALEN质粒，是针对猪的B2M基因，靶向位点为SEQ ID NO.1。构建好的质粒分为左右臂，转染猪的PIEC细胞系，三天以后检测效率，通过测序结果，可以发现TALEN在此位点有明显的编辑(图1所示)。
2、突变FOKI核酸内切酶，不发生切割
对FOKI进行突变，突变形式为D450A，核苷酸的序列为gac->gcc。对突变后的TALEN进行编辑分析，没有发现DNA的切割(图2所示)。
3、将不同的胞嘧啶脱氨酶和UGI分别连接到TALEN载体中
利用同源重组的原理，将三种脱氨酶和UGI分别连到两个TALEN的N端，最终形成的结构如图3所示。最终形式的载体序列如下：
TALEN-APOBEC1:SEQ ID NO.2； TALEN-A3A:SEQ ID NO.3；
TALEN-AID:SEQ ID NO.4； TALEN-UGI:SEQ ID NO.5。
实施例2 TALEN-BE编辑效率检测(构建获得型荧光报告系统)
在哺乳动物细胞系中，利用TALEN-BE系统对获得型报告系统进行碱基编辑。获得型报告系统即荧光增强型报告系统。包括如下步骤：
1、获得型报告系统的构建
荧光获得型报告系统就是在构建GFP荧光表达载体时，将起始密码子ATG突变为ACG或GTG使GFP不能正常表达(图4)。如果TALEN-base editor碱基编辑系统具有诱导C-T突变的能力，则ACG将突变为ATG起始密码子；而由于互补链的C突变为T，GTG将突变为起始密码子ATG，从而使GFP能够正常表达。我们将这两种荧光获得型报告系统分别命名为ACG报告系统与GTG报告系统。
2、哺乳动物细胞系转染TALEN-BE系统和获得型报告系统
(1)HEK293T细胞接种培养含10％FBS的DMEM培养液中(HyClone,SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
(2)转染前一天将细胞分至6孔板。次日，待密度至70％-80％时进行转染。
(3)按照LipofectamineTM 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将2μg TALEN-BE质粒与200ng对应的荧光报告质粒混匀，共转染至细胞中，6-8小时后换液，72小时后进行荧光数据检测，结果如图5，从图5右图可以看出构建的3个TALEN-BE系统GFP荧光信号均增强，说明编辑系统在细胞内实现了基因突变。
实施例3 TALEN-BE编辑效率检测(构建缺失型荧光报告系统)
在哺乳动物细胞系中，利用TALEN-BE系统对缺失型报告系统进行碱基编辑。缺失型报告系统即荧光缺失型报告系统。包括以下步骤：
1、缺失型报告系统的构建
荧光缺失型报告系统，即在正常表达GFP的载体ATG起始密码子后面引入CAA与TGG序列，如果TALEN-base editor碱基编辑系统能够引起C-T替换，则CAA将突变为终止密码子TAA；而由于互补链C-T的突变，TGG将突变为TGA、TAG或TAA终止密码子(图6)，从而终止GFP的表达。我们将这两种荧光缺失型报告系统分别命名为CAA报告系统与TGG报告系统。
2、哺乳动物细胞系转染TALEN-BE系统和获得型报告系统
(1)HEK293T细胞接种培养含10％FBS的DMEM培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
(2)转染前一天将细胞分至6孔板。次日，待密度至70％-80％时进行转染。
(3)按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将2μg TALEN-BE质粒与200ng对应的荧光报告质粒混匀,共转染至细胞中，6-8小时后换液，72小时后进行荧光数据检测，结果如图7所示，从图7右图可以看出构建的3个TALEN-BE系统GFP荧光信号均降低，说明编辑系统在细胞内实现了基因突变。
实施例3利用TALEN-BE系统编辑內源基因
在哺乳动物细胞中，利用TALEN-BE质粒对内源基因进行编辑。并利用高通量测序的方法检测突变效率。具体步骤如下。
1、细胞的培养与转染
(1)以猪的PIEC细胞(购自ATCC)为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：PIEC细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。
(3)转染以脂质体转染为例。按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen:11668-019)的操作手册，将2μg TALEN-BE质粒转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，72小时后收取细胞。
(4)收取部分细胞在裂解液(10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1％SDS)中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μL去离子水中。对目的片段进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物。
2、高通量测序方法检测突变效率及indel情况
为了进一步确认编辑效率，采用PE150高通量测序方式，对目的片段进行测序，统计编辑效率，结果如图8所示。
序列表
<110> 肇庆华夏凯奇生物技术有限公司
肇庆市华师大光电产业研究院
<120> 一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用
<130> ZM201333ZL
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> swine
<400> 1
tctttcagca aggactggtc tttctacctt ctggtccaca ctgagttcac tccta 55
<210> 2
<211> 8698
<212> DNA
<213> swine
<400> 2
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aggctcttga gacggttcag cgcctccttc cagttctctg tcaagcccac ggactcaccc 3120
cagatcaagt tgtagcgatt gctagtaaca atggtggcaa acaggctctt gaaaccgtac 3180
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<210> 3
<211> 8611
<212> DNA
<213> swine
<400> 3
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
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gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 5160
ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 5220
ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc 5280
tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 5340
ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 5400
ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 5460
gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct 5520
ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 5580
ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 5640
cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 5700
ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 5760
cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 5820
gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 5880
tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 5940
ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 6000
agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 6060
ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg 6120
ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc 6180
gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc 6240
cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat 6300
aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 6360
cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg 6420
acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat 6480
ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc 6540
taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 6600
aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 6660
attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 6720
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 6780
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 6840
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 6900
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 6960
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 7020
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 7080
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 7140
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 7200
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 7260
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 7320
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 7380
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 7440
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 7500
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 7560
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 7620
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 7680
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 7740
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 7800
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 7860
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 7920
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 7980
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 8040
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 8100
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 8160
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 8220
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 8280
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 8340
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 8400
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 8460
tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 8520
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 8580
tttccccgaa aagtgccacc tgacgtc 8607

Claims (4)

1.一种不受基因序列限制的碱基编辑系统TALEN-BE，其特征在于，其包括只能切割单链形式的TALEN系统、胞嘧啶脱氨酶和UGI，所述只能切割单链形式的TALEN系统由TALEN系统内使用的两个FOKI任意失活一个得到；其中胞嘧啶脱氨酶连接到失活形式一侧的TALEN表达载体的N端，UGI连接到未失活一侧的TALEN表达载体的N端；
所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、A3A、AID3；
所述FOKI的失活形式是D450A；所述碱基编辑系统TALEN-BE的序列如SE ID NO：2-4中任一序列。
2.权利要求1所述的碱基编辑系统TALEN-BE的制备方法。
3.权利要求1所述的碱基编辑系统TALEN-BE的非疾病诊断或治疗目的的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述碱基编辑系统TALEN-BE在内源性基因中实现胞嘧啶碱基编辑。
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TALE nickase mediates high efficient targeted transgene integration at the human multi-copy ribosomal DNA locus;Yong Wu 等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20140328;第446卷(第1期);第261左栏第1段至第265页右栏第1段，图1 *

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