PL196805B1 - Białko fuzyjne, kompozycja, cząsteczka kwasu nukleinowego, zastosowanie białka fuzyjnego, zastosowanie kwasu nukleinowego, komórka oraz sposób wytwarzania białka fuzyjnego - Google Patents

Białko fuzyjne, kompozycja, cząsteczka kwasu nukleinowego, zastosowanie białka fuzyjnego, zastosowanie kwasu nukleinowego, komórka oraz sposób wytwarzania białka fuzyjnego

Info

Publication number
PL196805B1
PL196805B1 PL338478A PL33847898A PL196805B1 PL 196805 B1 PL196805 B1 PL 196805B1 PL 338478 A PL338478 A PL 338478A PL 33847898 A PL33847898 A PL 33847898A PL 196805 B1 PL196805 B1 PL 196805B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
fusion protein
immune response
nucleic acid
hpv
Prior art date
Application number
PL338478A
Other languages
English (en)
Other versions
PL338478A1 (en
Inventor
Lee Mizzen
Randall Chu
Huacheng Bill Wu
Original Assignee
Nventa Biopharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21993829&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL196805(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Nventa Biopharma Corp filed Critical Nventa Biopharma Corp
Publication of PL338478A1 publication Critical patent/PL338478A1/xx
Publication of PL196805B1 publication Critical patent/PL196805B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6043—Heat shock proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Bia lko fuzyjne obejmuj ace antygen ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) lub jego antyge- now a cz esc oraz bia lko wstrz asu lub jego cz es c, przy czym (i) antygen HPV jest bia lkiem E6 albo E7; (ii) bia lko wstrz asu jest bia lkiem wstrz asu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) bia lko fuzyjne indukuje odpo- wied z odporno sciow a wobec antygenu HPV u ssaka, któremu podaje si e bia lko fuzyjne. 30. Kompozycja, znamienna tym, ze obejmuje bia lko fuzyjne okre slone w zastrz. 1 oraz farma- ceutycznie dopuszczaln a zaróbk e, no snik, rozcie nczalnik lub pod lo ze. 77. Zastosowanie bia lka fuzyjnego okre slonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do indukowa- nia odpowiedzi odporno sciowej przeciwko bia lku E6 lub E7. 97. Komórka obejmuj aca wektor ekspresyjny zawieraj acy sekwencj e kwasu nukleinowego, któ- ra koduje bia lko fuzyjne obejmuj ace antygen HPV lub jego antygenow a cz esc oraz bia lko wstrz asu, lub jego cz esc, przy czym (i) antygen HPV jest bia lkiem E6 albo E7; (ii) bia lko wstrz asu jest bia lkiem wstrz asu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) bia lko fuzyjne indukuje odpowied z odporno sciow a wobec anty- genu HPV u ssaka, któremu podaje si e bia lko fuzyjne. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 338478 (11) 196805 (13) B1
11» (22) Data zgłoszenia: 20.03.1998 (51) Int.Cl. C12N 15/70 (2006.01)
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: A61K 39/395 (2006.01)
20.03.1998, PCT/CA98/00246 A61K 39/12 (2006.01)
Urząd Patentowy (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: C07K 19/00 (2006.01)
Rzeczypospolitej Polskiej 18.02.1999, WO99/07860
PCT Gazette nr 07/99
Białko fuzyjne, kompozycja, cząsteczka kwasu nukleinowego, (54) zastosowanie białka fuzyjnego, zastosowanie kwasu nukleinowego, komórka oraz sposób wytwarzania białka fuzyjnego (73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:
05.08.1997,US,60/054,835
NVENTA BIOPHARMACEUTICALS CORPORATION,Victoria,CA (43) Zgłoszenie ogłoszono:
06.11.2000 BUP 23/00 (72) Twórca(y) wynalazku:
Lee Mizzen,Victoria,CA Randall Chu,Victoria,CA Huacheng Bill Wu,Victoria,CA (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
29.02.2008 WUP 02/08 (74) Pełnomocnik:
Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.
(57) 1. Białko fuzyjne obejmujące antygen ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) lub jego antygenową część oraz białko wstrząsu lub jego część, przy czym (i) antygen HPV jest białkiem E6 albo E7; (ii) białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) białko fuzyjne indukuje odpowiedź odpornościową wobec antygenu HPV u ssaka, któremu podaje się białko fuzyjne.
30. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje białko fuzyjne określone w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, rozcieńczalnik lub podłoże.
77. Zastosowanie białka fuzyjnego określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E6 lub E7.
97. Komórka obejmująca wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne obejmujące antygen HPV lub jego antygenową część oraz białko wstrząsu, lub jego część, przy czym (i) antygen HPV jest białkiem E6 albo E7; (ii) białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) białko fuzyjne indukuje odpowiedź odpornościową wobec antygenu HPV u ssaka, któremu podaje się białko fuzyjne.
PL 196 805 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, kompozycja, cząsteczka kwasu nukleinowego, zastosowanie białka fuzyjnego, zastosowanie kwasu nukleinowego, komórka oraz sposób wytwarzania białka fuzyjnego. Rozwiązania według wynalazku dotyczą ogólnie białek fuzyjnych obejmujących sprzężone białka wstrząsu i antygeny białkowe ludzkiego wirusa brodawczaka, które mogą być stosowanie do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciwko antygenom białkowym ludzkiego wirusa brodawczaka.
Zakażenie ludzkimi wirusami brodawczaków (HPV, ang. human papillomavirus) jest częste i wirusy te mogą być przenoszone drogą płciową. Ustalono, że zakażonych jest od 20 do 80% seksualnie czynnych dorosłych. Ponieważ większość zakażeń jest bezobjawowych, zakażenie może prowadzić do rozwoju kłykcin i nowotworu narządów płciowych i odbytu. Częstość występowania kłykcin wśród dorosłych wynosi 1-5%. Około jeden procent kobiet na całym świecie jest dotkniętych rakiem szyjki macicy, który jest najczęstszą przyczyną śmierci poniżej 50 roku życia. Rak szyjki macicy jest silnie związany z HPV, Frazer, Genitourin Med. 72: 398-403 (1996).
Obecnie nie są dostępne skuteczne kompozycje lecznicze lub profilaktyczne przeciwko HPV, tj. szczepionki, tak więc istnieje potrzeba opracowania skutecznych kompozycji. Niewielkie są szanse na opracowanie konwencjonalnych szczepionek z zabitych albo żywych atenuowanych wirusów. Według Frazera, HPV nie został jeszcze wyhodowany w hodowlach komórkowych i zarówno efekty wywoływania nowotworu przez zakażenie HPV, jak i pełna swoistość gatunkowa HPV powodują dodatkowe trudności, których nie można łatwo przezwyciężyć (Frazer, Genitourin. Med. 72: 398-403 (1996)). Zaproponowano, że fakt, że podstawowe białko kapsydowe w trakcie wyrażania w komórkach eukariotycznych tworzy wirusopodobne cząstki, które są immunogenne bez adiuwanta, może dostarczyć podstaw do opracowania szczepionki (Christensen i in., J. Gen. Virol. 75: 2271-6 (1994); patrz również PCT/EP95/03974 i PCT/US95/12914).
HPV należy do rodzaju A rodziny papovaviridae, obejmującej również SV40 i poliomawirusy. Scharakteryzowano ponad 68 rodzajów HPV, które są strukturalnie bardzo podobne, lecz są mniej niż w 50% identyczne na poziomie sekwencji DNA. Wszystkie znane rodzaje są wirusami epiteliotropowymi, które zakażają swoiste rodzaje nabłonka i często wywołują proliferację nabłonkową. Kilka rodzajów zostało zidentyfikowanych w zwykłych kłykcinach. Zakres chorób narządów płciowych i odbytu powodowanych przez te typy HPV waha się od kłykcin kończystych do inwazyjnego raka płaskokomórkowego. DNA HPV można zidentyfikować u ponad 80% kobiet z potwierdzonymi biopsją zmianami wewnątrz nabłonka płaskiego lub wewnątrznabłonkowym rakiem szyjki macicy. Kilka konkretnych typów, w tym HPV 16, 18 i 31 jest silnie związanych z wysokim stopniem owrzodzeń wewnątrznabłonkowych komórek płaskich i rakiem inwazyjnym szyjki macicy, pochwy, penisa i odbytu (Lorincz i in., Obstet. Gynecol. 79: 328-37 (1992)). Według Frazera rak szyjki macicy jest w 90-95% związany z HPV. Frazer, Genitourin Med. 72: 398-403 (1996). HPV jest zwią zany nie tylko z nowotworami narządów płciowych i odbytu, lecz jest również obecny w nowotworach gardła, krtani i pęcherza moczowego (Brachman i in., Cancer Res. 52: 4832-6 (1992); Rotola i in., Int. J. Cancer 52: 359-65 (1992)). Ostatnie badania dowiodły, że DNA HPV jest również obecne w 30% zbadanych raków płuc. Zidentyfikowane typy to HPV 6, 11, 16, 18, 31 i 33 (Soini i in., Thorax 51: 887-893 (1996)). Tak więc, najczęściej związane z nowotworami są 6, 11, 16, 18, 31 i 33, z których HPV 16 i 18 wykrywane w więcej niż 90% przypadkach raka szyjki macicy (van Driel i in., Ann. Med. 28: 471-477 (1996)) zostały przebadane najdokładniej.
Wirusy brodawczaka są wirusami DNA posiadającymi dwuniciowy, kolisty genom DNA o 7800 do 7900 parach zasad, wirion nagi i ikosaedralny kapsyd zbudowany z 72 kapsomerów. Genom zawiera trzy główne regiony, jeden kodujący geny późne, jeden kodujący geny wczesne i region nie kodujący (Park i in., Cancer 76: 1902-1913 (1995)). Region nie kodujący jest również określony jako region regulujący w kierunku do góry. Region ten jest długości około 400 par zasad i zawiera szereg miejsc wiążących dla różnych czynników transkrypcyjnych kontrolujących wyrażanie wczesnych i późnych genów. Region późnego genu posiada dwie odrębne ramki odczytu kodujące wirusowe białko kapsydowe L1 i L2. Białko L1 jest głównym białkiem kapsydowym, które jest wysoce konserwowane wśród różnych gatunków HPV. Region wczesnego genu obejmuje sześć otwartych ramek odczytu, oznaczonych jako E1, E2, E4, E5, E6 i E7. Białka E6 i E7 są białkami onkogennymi niezbędnymi zarówno do replikacji wirusowej, jak i unieśmiertelnienia komórek gospodarza i transformacji. Białka E1,
PL 196 805 B1
E2 i E4 również odgrywają ważną rolę w replikacji wirusowej. Dodatkowo, E4 odgrywa rolą w dojrzewaniu wirusa. Rola E5 jest mniej poznana.
Komórki nowotworów złośliwych wykazują dwie ważne cechy wzrostu. Są nieśmiertelne, tzn. nie starzeją się i są one zdolne do wzrostu niezależnego od zakotwiczenia. Wprowadzenie DNA HPV 16 albo 18 do nieśmiertelnych komórek gryzoni powoduje ich transformację, tj. nabywają zdolność do wzrostu w przypadku, kiedy nie są przyłączone do podłoża i są zdolne do tworzenia guzów po wstrzyknięciu ich myszom (Crook i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8820-24 (1988)). Odmienne wyniki uzyskuje się, gdy DNA HPV zostają wprowadzone we wczesne etapy pasażowania komórek nieunieśmiertelnionych; komórki stają się nieśmiertelne, lecz nie są transformowane (Woodworth i in., Cancer Res. 48: 4620-28 (1988)). Tak więc, jeden szlak, przez który nowotwory się rozwijają obejmuje zmianę powodującą unieśmiertelnienie komórek, po czym następuje wyrażanie genów HPV powodujące ich transformację. Geny HPV włączone w transformację komórek in vitro to geny kodujące E6 i/lub E7 (Bedell i in., J. Virol. 61: 3635-40 (1987)). Park i in., Cancer 76: 1902-1913 (1995) zaproponowali mechanizmy, przez które białka E6 i E7 mogą powodować transformację komórkową.
E6 jest małym (masa cząsteczkowa około 15000) polipeptydem zawierającym domeny wiążące Zn. Zasada jego czynności transformującej została poznana przez obserwację, że białko wiąże p53. Białko p53 jest dobrze znanym białkiem supresorowym nowotworów, które ujemnie reguluje postęp cyklu komórkowego i przez to wzrost i podział komórkowy. Wiązanie E6 do p53 powoduje upowszechnienie i ewentualną degradację tego drugiego białka, który to proces obejmuje inne białko komórkowe zwane jako „białko związane z E6”. W związku z tym komórki wyrażające E6 mogą posiadać zmniejszony podstawowy poziom p53. Poziomy p53 są podniesione w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Takie podwyższone poziomy powodują zwiększone wyrażanie p21, inhibitora kinaz zależnych od cykliny, białek pośredniczących w zahamowaniu cyklu komórkowego. Mechanizm ten dostarcza komórkom okienka czasowego, w trakcie którego możliwa jest naprawa uszkodzonego DNA przed jego replikacją, która prowadziłaby do utrwalenia uszkodzenia/mutacji. Przyspieszony obrót p53, w którym poś redniczy E6 moż e powstrzymać ten mechanizm przed dział aniem. Ostatnio stwierdzono, że E6 wpływa nie tylko na regulację cyklu komórkowego przez rzeczywiste przyspieszenie degradacji p53, lecz również bardziej bezpośrednio przez zablokowanie oddziaływań pomiędzy p53 a DNA (Thomas i in., Oncogene 10: 261-8 (1995)).
Białko E7 jest małą (masa cząsteczkowa około 10000) fosfoproteiną wiążącą Zn, zdolną do wiązania się z Rb, produktem genu retinoblastomy (glejaka siatkówki). Rb jest supresorem nowotworowym wiążącym i inaktywującym czynnik transkrypcyjny E2F. Czynnik ten kontroluje transkrypcję wielu genów związanych ze wzrostem, w tym te, które kodują kinazę tymidynową, c-myc, reduktazę dihydrofolianową i polimerazę alfa DNA. Tworzenie kompleksu Rb-E2F zapobiega wyrażaniu tego drugiego genu w fazach G0 i G1, ograniczając ich wyrażanie do fazy S, w której zaprogramowany jest rozpad kompleksów Rb-E2F, uwalniający aktywny czynnik transkrypcyjny E2F. Tworzenie kompleksów Rb-E7 zapobiega tworzeniu kompleksów Rb-E2F, co prowadzi do skrócenia prefaz S, tj. przyspieszenia postępu przez cykl komórkowy. Przez obserwację, że białka E6 z wysoce onkogennych typów HPV (np. HPV 16 i 18) wykazują wysoki stopień powinowactwa do p53 w porównaniu z odpowiednimi białkami typów nieonkogennych, i że białka E7 z wysoce onkogennych typów wykazują wysoki stopień powinowactwa do Rb, w porównaniu z odpowiednimi białkami typów nieonkogennych, dostarczono zgodnych dowodów na znaczenie tych mechanizmów.
W wię kszoś ci przypadków nowotworów szyjki macicy i uszkodzeń prekursorowych, DNA HPV jest zintegrowane z genomem komórki gospodarza (Cullen i in., J. Virol. 65: 606-12 (1991)). W większości przypadków wydaje się, że integracja obejmuje przerywanie genomowego DNA HPV w regionie E1/E2, z pozostawieniem nietkniętego regionu E6/E7. Konsekwencją przerwania regionu E1/E2 jest przerwanie otwartej ramki odczytu kodującej dwa różne białka E2, przy czym mniejsze z tych białek działa jako represor transkrypcyjny wczesnego wyrażania genu. Prowadzi to do zwiększenia wyrażania E6 i E7.
Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne obejmujące antygen ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) lub jego antygenową część oraz białko wstrząsu (białko wstrząsu cieplnego (Hsp)) lub jego część, przy czym (i) antygen HPV jest białkiem E6 albo E7; (ii) białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) białko fuzyjne indukuje odpowiedź odpornościową wobec antygenu HPV u ssaka, któremu podaje się biał ko fuzyjne.
PL 196 805 B1
Antygen białkowy HPV może być połączony z białkiem wstrząsu przez sprzężenie chemiczne, albo antygen i białko wstrząsu mogą być połączone na poziomie nukleotydowym pozwalającym na wyrażanie i izolację białka fuzyjnego zawierającego zarówno sekwencję antygenu, jak i białka wstrząsu.
Korzystnie antygen HPV w białku fuzyjnym według wynalazku jest białkiem E6 lub E7 pełnej długości. Również korzystnie, antygen HPV białka fuzyjnego według wynalazku jest nie transformującym wariantem białka E6 lub E7. Korzystnie białkiem wstrząsu w białku fuzyjnym według wynalazku jest Hsp60 lub Hsp70 pełnej długości.
Ponadto korzystnie antygen HPV białka fuzyjnego według wynalazku jest białkiem E6. Korzystniej antygen HPV jest antygenem HPV typu 16. Korzystnie antygen HPV białka fuzyjnego według wynalazku jest białkiem E7. Korzystniej antygen HPV jest antygenem HPV typu 16. Również korzystnie antygen HPV białka fuzyjnego według wynalazku obejmuje epitop limfocytu T. Korzystnie, epitop limfocytu T jest epitopem CTL albo epitopem limfocytów T pomocniczych.
Ponadto korzystnie białko wstrząsu białka fuzyjnego według wynalazku jest białkiem wstrząsu ssaka. Korzystnie białko wstrząsu jest bakteryjnym białkiem wstrząsu. Korzystne jest również białko wstrząsu będące białkiem wstrząsu mykobakterii. Korzystniej białkiem wstrząsu jest hsp65. Najkorzystniej białkiem wstrząsu jest hsp65 M. bovis BCG. Korzystne jest także białko fuzyjne według wynalazku, w którym białkiem wstrząsu jest hsp70.
Korzystnie odpowiedź odpornościowa indukowana przez białko według wynalazku obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową, a korzystniej cytolityczną odpowiedź komórkową. Korzystnie odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
Przedmiotem wynalazku jest w szczególności białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG oraz białko E7 otrzymane z HPV typu 16 oraz białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E7 otrzymanego z HPV typu 16.
Wynalazek dotyczy też białka fuzyjnego, które obejmuje białko hsp65 M. bovis BCG pełnej długości, resztę aminokwasową histydyny oraz białko E7 pełnej długości otrzymane z HPV typu 16, przy czym reszta histydyny znajduje się pomiędzy hsp65 M. bovis BCG a białkiem E7. Korzystnie białko hsp65 M. bovis BCG znajduje się na końcu aminowym białka fuzyjnego, a białko E7 znajduje się na końcu karboksylowym białka fuzyjnego.
Przedmiotem wynalazku jest również białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG pełnej długości, reszty aminokwasowej histydyny, oraz białka E7 pełnej długości otrzymanego z HPV typu 16, przy czym reszta histydyny znajduje się pomiędzy hsp65 M. bovis BCG a białkiem E7. Korzystnie białko hsp65 M. bovis BCG znajduje się na końcu aminowym białka fuzyjnego, a białko E7 znajduje się na końcu karboksylowym białka fuzyjnego.
Wynalazek dostarcza też białka fuzyjnego, które kodowane jest przez plazmid pET65C/E7-1N, białka fuzyjnego obejmującego białko hsp65 M. bovis BCG i białko E6 otrzymane z HPV typu 16 oraz białka fuzyjnego składającego się z białka hsp65 M. bovis BCG i białka E6 otrzymanego z HPV typu 16.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja obejmująca białko fuzyjne według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, rozcieńczalnik lub podłoże. Korzystnie kompozycja według wynalazku ponadto obejmuje adiuwant lub środek powierzchniowo czynny.
Kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciwko antygenowi białka HPV u osobnika, któremu jest ona podawana. Odpowiedź odpornościowa może być odpowiedzią humoralną albo komórkową, a zwłaszcza komórkową, cytolityczną wobec antygenu białka HPV. Kompozycje można stosować profilaktycznie albo w celach leczniczych. W podawaniu zapobiegawczym, wywoływanie odpowiedzi odpornościowej odnosi się do wywołania reakcji odpornościowych ponad bardzo słabą podstawową odporność wrodzoną. W podawaniu leczniczym, wywoływanie odpowiedzi immunologicznej u osobnika odnosi się do wytwarzania odpowiedzi, które przekraczają zarówno ilościowo, jak i jakościowo odpowiedzi wcześniej wywoływane przez kontakt z antygenami biał kowymi HPV prezentowanymi zarówno przez wirus, albo przez komórki osobnika zakażone albo poddane transformacji. Kompozycje są stosowane do wywołania odpowiedzi odpornościowej wobec komórek nowotworowych wyrażających i prezentujących antygen białkowy HPV. Kompozycja jest skierowana na antygeny białkowe HPV, E6 i E7, wczesne białka wirusowe, o których wiadomo, że są niezmiennie wyrażane w nowotworach związanych z HPV. Kompozycje mogą być wprowadzone do osobnika albo stosowane ex vivo w celu stymulacji i/lub wywołania ekspansji komórek odpornościowych skierowanych na albo pośredniczących w nakierowaniu na HPV albo komórki, w tym komórki nowotworowe, prezentujące antygen białkowy HPV. Kompozycje są skuteczne w wywoływaPL 196 805 B1 niu odpowiedzi odpornościowej, jeśli są podawane jako niecząsteczkowe (tj. nie jako części wirusa albo cząstki wirusopodobne), białkowe roztwory w nieobecności adiuwanta.
Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne według wynalazku. Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje ponadto wektor ekspresyjny. Korzystniej wektorem ekspresyjnym jest wektor adenowirusowy lub wektor wirusa adenosatelitarnego (AAV). Również korzystniej wektorem ekspresyjnym jest wektor retrowirusowy.
Wektor ekspresyjny może zawierać ponadto elementy sekwencji kierujące transkrypcją i translacją sekwencji kodującej oraz może zawierać również elementy nasilające rozprzestrzenianie i utrzymywanie albo amplifikację kwasów nukleinowych w komórkach osobnika. Wektor ekspresyjny można wprowadzić do komórek osobnika albo można go zastosować do transdukcji komórek osobnika ex vivo, powodując wyrażanie białka fuzyjnego antygen białkowy HPV-białko wstrząsu, które wywołuje odpowiedź odpornościową przeciwko antygenowi białkowemu HPV.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E6 lub E7. Korzystnie odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową. Korzystniej, komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową. Również korzystnie odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E6 lub E7.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka obejmująca wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne według wynalazku. Korzystnie komórka według wynalazku obejmuje wektor, który zawiera ponadto sekwencję kwasu nukleinowego kodującą znacznik oligohistydynowy. Również korzystnie komórka według wynalazku jest komórką bakteryjną. Korzystniej komórką bakteryjną jest komórka E. coli.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka fuzyjnego obejmujący etapy:
(a) dostarczenia komórki według wynalazku; oraz (b) hodowania komórki w warunkach umożliwiających ekspresję białka fuzyjnego.
Publikacje literatury fachowej i cytowane tutaj zgłoszenia patentowe, szczególnie te dotyczące przygotowania i zastosowania kompozycji według wynalazku, są włączone niniejszym w całości na drodze odniesienia.
Krótki opis figur
Figura 1 jest schematycznym przedstawieniem konstruktu pET65H.
Figura 2 jest schematycznym przedstawieniem konstruktu pET65HE6.
Figura 3 jest schematycznym przedstawieniem konstruktu pET65HE7.
Figura 4 jest wykresem procentowym występowania guza w zależności od czasu po prowokacji nowotworowej TC-1, przedstawiającym pomyślną immunizację myszy białkami fuzyjnymi Hsp65-E6 i E-7 przeciwko nowotworowi.
Figura 5 jest wykresem procentowym swoistej lizy komórkowej komórek nowotworowych TC-1 w zależ noś ci od stosunku komórki efektorowej do komórek docelowych, przedstawiają cym komórkową odpowiedź cytolityczną przeciwko docelowym komórkom nowotworowym wyrażającym antygen HPV (E7) u immunizowanych myszy.
Figura 6 jest wykresem procentowym lizy różnych komórek docelowych w zależności od stosunku komórki efektorowe do komórek docelowych, przedstawiającym swoistość komórkowej cytolitycznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko docelowym komórkom nowotworowym wyrażającym antygen HPV (E7) u immunizowanych myszy.
Figura 7 jest wykresem procentowym występowania nowotworu u myszy, którym podawano 1,3 x 105 komórek nowotworowych TC-1, a następnie nastrzykiwano solą fizjologiczną, białkiem fuzyjnym Hsp65-E7 w soli fizjologicznej albo peptydem E7 w soli fizjologicznej/IFA w zależności od dni po podaniu komórek nowotworowych.
Figura 8 jest wykresem procentowym występowania nowotworu u myszy, którym podawano 2 x 105 komórek nowotworowych TC-1, a następnie nastrzykiwano solą fizjologiczną, białkiem fuzyjnym Hsp65-E7 w soli fizjologicznej albo peptydem E7 w soli fizjologicznej/IFA w zależności od dni po podaniu komórek nowotworowych.
Figura 9 jest schematycznym przedstawieniem konstruktu pET/E7(H).
Figura 10 jest zbiorem wykresów pokazujących włączanie tymidyny przez hodowlane komórki węzła chłonnego uzyskane od myszy immunizowanych białkiem fuzyjnym Hsp65-E7 albo białkiem E7.
PL 196 805 B1
Figura 11 jest wykresem pokazującym efekt leczenia białkiem fuzyjnym Hsp-E7 albo E7 na wielkość guza u myszy z komórkami nowotworowymi TC-1.
Figura 12 jest schematycznym przedstawieniem konstruktu pET65C.
Figura 13 jest schematycznym przedstawieniem konstruktu pET65C/E7-lN.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek dotyczy kompozycji, które indukują u osobnika reakcję odpornościową przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka w komórkach osobnika wykazujących antygen białkowy HPV. Kompozycje obejmują antygen białkowy HPV oraz białko wstrząsu. Kompozycje mogą też obejmować wektor ekspresyjny zdolny do kierowania ekspresją białka fuzyjnego obejmującego antygen białkowy HPV-białko wstrząsu.
Kompozycje według wynalazku można zastosować profilaktycznie w celu wywołania odporności przeciwko antygenowi białkowemu HPV, zapobiegając rozwojowi i proliferacji HPV albo komórek osobnika wyrażających i wykazujących antygen białkowy HPV albo prezentujących jego części. Kompozycje można również zastosować terapeutycznie u osobnika uprzednio zarażonego HPV, w celu zapobieżenia dalszej proliferacji wirusa albo w celu wyeliminowania komórek osobnika, które proliferują w wyniku zakażenia HPV, w tym nowotworów wyrażających i wykazujących antygen HPV albo prezentujących części jego antygenu. W odniesieniu do antygenu białkowego HPV jako celu reakcji odpornościowej indukowanej przez kompozycję według wynalazku, przez określenie „antygen białkowy HPV” rozumie się całe białko HPV albo polipeptydową część (ciężar cząsteczkowy większy niż 10 kDa) białka HPV eksponowanego na powierzchni HPV albo zakażonej komórce osobnika, jak również peptyd eksponowany na zakażonych komórkach w wyniku obróbki i prezentacji białka HPV, przykładowo w typowym szlaku MHC klasy I albo II.
Sekwencje genomowe wielu różnych rodzajów HPV klonowano i charakteryzowano przez analizę sekwencji DNA. Wektory bakteryjne zawierające kompletne albo częściowe genomy HPV dostępne są z różnych źródeł, w tym, przykładowo, z American Type Culture Collection (ATCC). Dodatkowe rodzaje HPV przydatne w odtwarzaniu rozwiązań według wynalazku można wyizolować i typować sposobami uprzednio ustalonymi w tym celu, które to sposoby są dobrze znane w dziedzinie.
HPV wyraża sześć albo siedem białek niestrukturalnych i dwa strukturalne, zaś każde z tych białek może w zasadzie służyć jako cel immunoprofilaktyki albo immunoterapii skierowanej na wyeliminowanie HPV i/lub zakażonych komórek. Białka wirusowego kapsydu L1 i L2 są białkami strukturalnymi HPV, które są kodowane przez geny późne. L1 jest głównym białkiem kapsydu, które jest silnie konserwowane wśród różnych gatunków HPV. Siedem białek niestrukturalnych stanowią produkty genów wczesnych. Białka E1, E2 i E4 odgrywają istotną rolę podczas replikacji wirusa. Dodatkowo E4 ma wpływ na dojrzewanie wirusa. Rola białka E5 jest mniej poznana. Białka E6 i E7 są onkoproteinami ważnymi dla replikacji wirusa, jak również dla unieśmiertelnienia i transformacji komórki gospodarza. Białka te, które można włączyć do kompozycji według wynalazku, określane są jako antygeny białkowe HPV.
Szczególnie istotne w zastosowaniu do profilaktycznego albo terapeutycznego leczenia nowotworów związanych z HPV jest obserwacja, że białka E6 i E7 HPV są stale wyrażane w rakach szyjki macicy (Zur Hausen, Appl. Pathol. 5: 19-24 (1987); Pater i Pater, Virology 145: 313-8 (1985)). Kinoshita i in., Br. J. Canc. 71: 344-9 (1995) wykazali, że geny E6 i E7 ulegają również ekspresji w raku płuc. Ponadto, zaobserwowano pewne naturalne reakcje odpornościowe (humoralne) przeciwko E7 u pacjentek z rakiem szyjki macicy (Jochmus-Kudielka i in., J. Natl. Cancer Inst. 81: 1698-704 (1989)). Na koniec, badania modelowe wykazują, że immunizacja modyfikowanym białkiem E7 chroni myszy przed prowokacją komórkami płuc, transformowanymi aktywowanym genem c-Ha-ras i genami E6/E7 HPV (Lin i in., Cancer Res. 56: 21-26 (1996)). Z punktu widzenia, że białka te są zwykle wyrażane w nowotworach powstających w wyniku zakażenia HPV, te same białka są również onkogenami, które zwykle odgrywają rolę w rozwoju i utrzymywaniu się nowotworów oraz że reakcja odpornościowa może być skierowana przeciwko tym białkom, E6 i E7 są korzystnymi celami do immunointerwencji i profilaktyki, a stą d są korzystnymi antygenami biał kowymi HPV kompozycji wedł ug wynalazku do stosowania w zapobieganiu albo leczeniu nowotworów związanych z HPV.
Wykazano w kilku modelach zwierzęcych, że peptydy cytotoksycznych limfocytów T (CTL) mogą wywoływać ochronną odporność przeciwko różnym wirusom (Kast i Melief, Immunol. Lett. 30: 229 (1991)). Zaobserwowano, że osobnicy poddani immunosupresji częściej rozwijają raka szyjki macicy, niż osobniki immunokompetentne (Schneider i in., Acta Cytol. 27: 220-4 (1983)). Wskazuje to, że komórkowa składowa układu odpornościowego, w szczególności układ limfocytów T jest niezwykle istotPL 196 805 B1 na w obronie immunologicznej przeciwko nowotworom związanym z HPV. Dowody na istotność reakcji CTL w wywoływaniu ochronnej odporności przeciwko komórkom transformowanym E6 i E7 pochodzą z doświadczeń, w których myszy szczepione odpowiednim epitopem CTL E7 HPV 16 były chronione przed przeszczepialnymi nowotworami wywołanymi HPV 16 (Feltkamp i in., Eur. J. Immunol. 23: 2242 (1993)). Rozwiązania według wynalazku są oparte jest na obserwacji, że połączenie białka wstrząsu z antygenem białkowym HPV daje kompozycję, która silnie pobudza reakcję komórkową, w szczególności cytolityczną reakcję komórkową, przeciwko antygenowi białkowemu HPV, która to reakcja może niszczyć komórki wykazujące antygen HPV.
Antygen białkowy HPV według wynalazku może być dowolnym polipeptydem kodowanym przez HPV. Oprócz tego, może być częścią białka HPV, zakładając, że ta część, po połączeniu z białkiem wstrząsu, zachowuje zdolność do indukowania reakcji odpornościowej przeciwko antygenowi białkowemu HPV eksponowanemu przez zakażone komórki albo HPV. Kompozycje obejmujące różne części antygenu HPV zamiast kompletnego antygenu białkowego HPV, można wytworzyć metodami rutynowymi, takimi jak opisane tu albo w podręcznikach biologii molekularnej i biochemii. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Deutscher, Guide to Protein Purification Methods Enzymology, tom 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990). Każdą kompozycję zawierającą szczególną część antygenu białkowego HPV można badać pod względem stopnia i jakości reakcji odpornościowej przeciwko antygenowi białkowemu HPV w doświadczeniach takich, jak opisane w dalszych przykładach. Antygen białkowy HPV w kompozycji według wynalazku zawierać będzie minimalnie jeden epitop limfocyta B albo T (np. epitop CTL albo limfocyta pomocniczego T) białka HPV. W odniesieniu do kompozycji według wynalazku, określenie „antygen białkowy HPV” obejmuje części antygenu białkowego HPV, zakładając, że takie części zachowują zdolność do indukowania reakcji odpornościowej przeciwko antygenowi białkowemu HPV eksponowanemu przez zakażone komórki albo HPV.
E6, zaś szczególnie E7 są białkami transformującymi. W kompozycjach zawierających jako antygen białkowy HPV sekwencje E6 albo E7, albo części wystarczające do zachowania właściwości transformujących, zdolność transformująca antygenu może, ale nie musi stanowić potencjalnego ryzyka, zależnie od sposobu wytwarzania antygenu HPV. Przykładowo, w przypadkach, w których antygen białkowy HPV albo kompozycja obejmująca taki antygen, jest wytwarzana technikami rekombinacyjnymi, które niosą ryzyko zanieczyszczenia DNA, może być konieczne podjęcie kroków eliminujących zdolność transformującą antygenu. Przy zastosowaniu kompozycji obejmujących wektor ekspresyjny kierujący ekspresją białka fuzyjnego obejmującego kompletną sekwencję E6 albo E7 HPV, albo części zachowujących zdolność transformującą, konieczne może być wyeliminowanie sekwencji, które powodują, że produkt białkowy jest transformujący. Nie transformujące odmiany E6 i E7 otrzymano przez poddanie fuzji sekwencji E6 i E7 (PCT/AU95/00868). Jest zatem możliwe, aby pewne białka fuzyjne obejmujące sekwencje E6 albo E7 i sekwencje białka wstrząsu mogły być nie transformujące.
Alternatywnie, sekwencje można selektywnie usunąć z E6 albo E7, stosując techniki, które są dobrze znane w dziedzinie i które opisano w PCT/AU95/00868. Delecje można przeprowadzić w wektorach ekspresyjnych wyrażających E6 albo E7 albo w wektorach wyrażających białka fuzyjne. Wyniki takich manipulacji można ocenić przez zbadanie zdolności transformacyjnej białek delecyjnych w doświadczeniach transfekcyjnych. Przykładowo, komórki NIH3T3 można transfekować wektorem ekspresyjnym obejmującym gen białka delecyjnego, zaś zdolność transformującą można ocenić w teście tworzenia kolonii w miękkim agarze. Test ten opisano w PCT/AU95/00868.
Białko fuzyjne według wynalazku obejmuje dwie domeny: białko wstrząsu oraz antygen białkowy HPV, przeciwko któremu pożądana jest reakcja odpornościowa. Te dwie domeny są połączone tworząc jedną całość. Dwie domeny można połączyć przez sprzęganie, tj. wiązaniem kowalencyjnym pomiędzy białkiem wstrząsu i antygenem białkowym HPV, Hermansson, G. T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc. San Diego, CA (1996); Lussow, A. R. i in., Eur. J. Immunol. 21: 2297-2302 (1991); Barrios, C. i in., Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372 (1992).
Alternatywnie, w celu połączenia i wyrażenia dwóch domen można zastosować techniki rekombinacji, które pozwalają uzyskać rekombinowane białko fuzyjne, które obejmuje białko wstrząsu i antygen białkowy HPV jako pojedynczą cząsteczkę. Umożliwia to wytworzenie i oczyszczenie pojedynczej rekombinowanej cząsteczki w procesie wytwarzania. Dwie domeny mogą być połączone nie kowalencyjnie. W celu nie kowalencyjnego połączenia obu cząsteczek można wykorzystać dowolne spośród znanych oddziaływanie o wysokim powinowactwie. Przykładowo, grupę biotynową można dodać do antygenu HPV, zaś białko wstrząsu wyrażać jako białko fuzyjne awidyna-białko wstrząsu.
PL 196 805 B1
Białko fuzyjne awidyna-białko wstrząsu wiąże się silnie z biotynowanym antygenem białkowym HPV. Analogicznie, część antygenu białkowego HPV można połączyć z kompletnym białkiem wstrząsu albo częścią białka wstrząsu, zaś część białka wstrząsu można połączyć z kompletnym antygenem białkowym HPV lub częścią antygenu białkowego HPV, przy założeniu, że odpowiednie części są wystarczające do wywołania reakcji odpornościowej przeciwko antygenowi białkowemu HPV u osobnika, któremu podaje się tak otrzymane kombinacje. Kompozycje mogą obejmować wektor ekspresyjny zdolny do kierowania ekspresją białka fuzyjnego antygenu białkowego HPV-białka wstrząsu.
W kompozycjach według wynalazku można zastosować dowolne białko wstrząsu (białko wstrząsu cieplnego (hsp)). Przykładowo, jak opisano w przykładach, można zastosować Hsp60 i/lub Hsp70. W odniesieniu do białek wstrząsu, komórki reagują na bodziec wstrząsowy (zwykle wstrząs termiczny) przez zwiększenie ekspresji grupy genów określanych powszechnie jako geny wstrząsu albo geny wstrząsu cieplnego. Wstrząs termiczny obejmuje eksponowanie komórek albo organizmów na temperatury, które są wyższe o od 1 do kilku stopni Celsjusza od temperatury, do której komórki są zaadaptowane. W koordynacji z indukcją tych genów, poziom odpowiednich białek wstrząsu rośnie w komórkach poddanych bodźcowi. W znaczeniu tu zastosowanym, „białko wstrząsu”, znane również jako „białko wstrząsu cieplnego” albo „Hsp, jest białkiem kodowanym przez gen wstrząsu, stąd zwykle wytwarzane jest w większych ilościach pod wpływem kontaktu albo ekspozycji organizmu na bodziec stresowy. „Gen wstrząsu”, znany również jako „gen wstrząsu cieplnego” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza gen, który jest aktywowany albo w inny sposób dodatnio regulowany pod wpływem kontaktu albo ekspozycji organizmu (posiadającego taki gen) na bodziec stresowy, taki jak wstrząs cieplny, hipoksja, deprywacja glukozy, sole metali ciężkich, inhibitory metabolizmu energii i transportu elektronów oraz czynniki denaturujące białko, albo pewne ansamycyny benzochinonowe (Nover, Heat Shock Response, CRC Pres, Inc., Boca Raton, FL (1991)). „Gen wstrząsu” obejmuje również geny homologiczne, w obrębie znanych rodzin genów wstrząsu, takie jak pewne geny w rodzinie genów wstrząsu Hsp70 i Hsp90, nawet gdy takie geny homologiczne same nie są indukowane przez bodziec stresowy. Każde z określeń „gen wstrząsu” i „białko wstrząsu” w znaczeniu tu zastosowanym może obejmować to drugie, o ile kontekst nie wskazuje inaczej.
W przypadkach obejmują cych koniugaty chemiczne pomię dzy biał kiem wstrzą su i antygenem białkowym HPV, białka wstrząsu zastosowane według wynalazku są izolowanymi białkami wstrząsu, co oznacza, że białka wstrząsu wybrano i wydzielono z komórki gospodarza, w którym je wytworzono. Taką izolację można przeprowadzić jak to opisano, stosując rutynowe sposoby izolowania białek, znane w dziedzinie (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1982); Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, tom 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990)).
U bakterii, głównymi białkami wstrząsu są białka o ciężarze cząsteczkowym około 70 i 60 kDa, określane powszechnie jako, Hsp70 i Hsp60, odpowiednio. Te i inne swoiste białka oraz kodujące je geny wstrząsu omówione zostały poniżej. U bakterii, Hsp70 i Hsp60 zwykle stanowią około 1-3% białka komórek, w oparciu o wzorzec barwienia po elektroforezie na żelu poliakryloamidowym z solą sodową dodecylosiarczanu i barwieniu błękitem Coomassie, ale warunkach wstrząsu gromadzą się w ilościach dochodzących do 25%. Białka wstrząsu prawdopodobnie uczestniczą w istotnych procesach komórkowych, takich jak synteza białek, kierowanie wewnątrzkomórkowe, łączenie i rozłączanie kompleksów białkowych. Wydaje się, że zwiększone ilości białek wstrząsu są syntetyzowane podczas wstrząsu głównie w celu minimalizacji następstw indukowanego rozfałdowywania białek. W rzeczywistości, wstępna ekspozycja komórek na łagodny wstrząs, który indukuje syntezę białek wstrząsu, zapewnia ochronę komórek przed szkodliwymi skutkami kolejnego, silniejszego wstrząsu.
Główne białka wstrząsu wydają się być wyrażane w każdym, dotychczas zbadanym organizmie i tkance. Białka wstrząsu wydają się być najsilniej konserwowaną grupą białek zidentyfikowaną do tej pory. Przykładowo, przy porównywaniu białek wstrząsu w odległych organizmach, Hsp90 i Hsp70 wykazują 50% albo wyższą identyczność na poziomie aminokwasowym oraz wykazują wiele podobieństw w pozycjach, które nie są identyczne. Zauważono, że występuje podobny albo wyższy poziom homologii pomiędzy różnymi członkami konkretnej rodziny białek wstrząsu w obrębie gatunku.
Geny kodujące białka wstrząsu mogą występować w pojedynczej kopii albo w licznych, nie identycznych kopiach w genomie komórki albo organizmu. Przykładowo, wykazano, że ludzki genom zawiera przynajmniej jedną kopię genu hsp100, przynajmniej dwa różne geny hsp90, do 10 genów hsp70, spośród których przynajmniej kilka jest kopiami nie identycznymi, kilka genów kompleksu T
PL 196 805 B1 (geny Tcp) oraz przynajmniej jeden gen kodujący pokrewne białko mitochondrialne Hsp60, jak również przynajmniej 3 kopie małych genów hsp, kodujących Hsp w zakresie wielkości od 20 do 30 kDa. W większości rodzin genów wstrząsu, istnieje przynajmniej jeden gen, którego poziom ekspresji jest względnie wysoki, a który jest albo całkowicie konstytutywny albo jedynie nieznacznie indukowalny przez wstrząs. Ponadto, kilka rodzin genów wstrząsu obejmuje członków, którzy nie ulegają dodatniej regulacji przez ciepło, ale przez inne bodźce, takie jak podwyższony poziom wapnia itp.
Białka wstrząsu, szczególnie Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 i Hsp10 należą do głównych determinant rozpoznawanych przez układ odpornościowy gospodarza podczas reakcji odpornościowej na zakażenie Mycobacterium tuberculosis oraz Mycobacterium leprae (Young, R. A. i Elliott, T. J. Stress Proteins, Infection and Immune Surveillance, Cell 50: 5-8 (1989)). Dalej, niektóre z artretogennych limfocytów T szczura rozpoznają epitopy Hsp60 (Van Eden, W. i in., Nature 331: 171-173 (1988)). Jednakże, osobnicy, w tym zdrowi, bez epizodu zakażenia mykobakteriami albo choroby autoagresyjnej również niosą limfocyty T, które rozpoznają epitopy Hsp60 bakterii i ludzi; znaczna frakcja limfocytów T u zdrowych osobników, charakteryzująca się ekspresją receptora gamma-delta limfocytów T, rozpoznaje białka wstrząsu własne, jak i obce (O'Brien, R. i in., Cell 57: 664-674 (1989)). Tak więc, osobnicy, nawet zdrowi, posiadają populacje limfocytów T, które rozpoznają epitopy białek wstrząsu, własne i obce.
Układ rozpoznający białka wstrząsu prawdopodobnie stanowi „układ wczesnego reagowania” przeciwko inwazji drobnoustrojów (Murray, P. J. i Young, R. A, J. Bacteriol. 174: 4193-6 (1992)). Układ ten może być utrzymywany przez częste pobudzanie przez bakterie i wirusy. Jak omówiono wcześniej, zdrowi osobnicy posiadają populacje limfocytów T rozpoznających własne białka wstrząsu. Tak więc, obecność autoreaktywnych limfocytów T jest zgodna z normalnym stanem zdrowia i nie wywołuje choroby autoagresyjnej; pokazuje to bezpieczeństwo ze strony białek wstrząsu w organizmie. Bezpieczeństwo ze strony białek wstrząsu jest dodatkowo wykazywane przez powodzenie i względne bezpieczeństwo szczepień BCG (Bacillus Callmette Guerin, szczep Mycobacterium bovis), które wywołuje reakcję odpornościową przeciwko białkom wstrząsu, co chroni również przed Mycobacterium tuberculosis.
Rodziny genów i białek wstrząsu do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku są dobrze znane i obejmują, przykładowo, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBP, cyklofiliny, Hsp20-30, ClpP, GrpE, Hsp10, ubikwitynę, kalneksynę oraz izomerazy disiarczkowe (Macario, A. J. L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59-70, 1995; Parsell, D. A. i Lindquist, S., Ann. Rev. Genet. 27: 437-496 (1993); patent USA nr 5 232 833 (Sanders i in.). Szczególna grupa białek wstrząsu obejmuje Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30, korzystnie Hsp70 i Hsp60.
Hsp100-200 przykładowo obejmuje Grp170 (białko regulowane glukozą). Grp170 rezyduje w ś wietle ER, w przedziale poprzedzają cym aparat Golgi'ego i moż e odgrywać rolę w fa ł dowaniu i łączeniu immunoglobulin.
Przykłady Hsp100 obejmują ssacze Hsp110, drożdżowe Hsp104, ClpA, ClpB, ClpC, ClpX i ClpY. Hsp104 drożdży i ClpA E. coli tworzą heksameryczne, zaś ClpB E. coli tetrameryczne cząstki, których łączenie wydaje się wymagać wiązania adeninowych nukleotydów. Proteaza Cip daje heterooligomer 750 kDa, zbudowany z ClpP (podjednostki proteolitycznej) i ClpA. ClpB-Y są strukturalnie spokrewnione z ClpA, jakkolwiek w przeciwieństwie do ClpA nie wchodzą w kompleks z ClpP.
Hsp90 przykładowo obejmuje HtpG w E. coli, Hsp83 i Hsc83 drożdży oraz Hsp90alfa, Hsp90beta i Grp94 u ludzi. Hsp90 wiąże grupy białek, które są zwykle komórkowymi cząsteczkami regulującymi, takimi jak receptory hormonów steroidowych (np. receptory glukokortykoidów, estrogenu, progesteronu i testosteronu), czynniki transkrypcyjne albo kinazy białkowe, które odgrywają rolę w przekazywaniu sygnału. Białka Hsp90 również biorą udział w tworzeniu wielkich, powszechnie występujących kompleksów białek, które zawierają inne białka wstrząsu.
Lon jest tetramerycznym białkiem działającym jako zależna od ATP proteaza degradująca nienatywne białka w E. coli.
Hsp70 przykładowo obejmuje Hsp72 i Hsc73 z komórek ssaczych, DnaK z bakterii, szczególnie mykobakterii, takich jak Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium bovis (takie jak Bacillus Callmette Guerin, określane jako Hsp71), DnaK z E. coli, drożdży i innych prokariotów oraz BiP i Grp78. Hsp70 jest zdolne do swoistego wiązania ATP, jak również nie pofałdowanych polipeptydów i peptydów, uczestnicząc w ten sposób w fałdowaniu i rozfałdowywaniu białek, jak również w łączeniu i rozłączaniu kompleksów białek.
Przykłady Hsp60 obejmują Hsp65 z mykobakterii. Bakteryjna Hsp60 jest znana powszechnie jako GroEL, jak GroEL z E. coli. Hsp60 tworzy wielkie kompleksy homooligomeryczne i wydaje się
PL 196 805 B1 odgrywać kluczową rolę w fałdowaniu białek. Homologi Hsp60 występują w mitochondriach eukariotów i chloroplastach.
Przykłady TF55 obejmują Tcpl, TriC oraz termosomy. Białka zwykle występują w cytoplazmie eukariotów oraz niektórych archebakterii i tworzą wieloczłonowe pierścienie, ułatwiające fałdowanie białek. Są one również nieco homologiczne z Hsp60.
Hsp40 przykładowo obejmują DnaJ z prokariotów, takich jak E. coli i mykobakterii oraz HSJ1, HDJ1 i Hsp40. Hsp40 odgrywa rolę w różnych aktywnościach komórkowych m. in. jako białko opiekuńcze (ang. chaperone) podczas fałdowania białek, w tolerancji termicznej i replikacji DNA.
Przykłady FKBP obejmują FKBP12, FKBP13, FKBP25 i FKBP59, Fprl i Nepl. Białka wykazują zwykle aktywność izomerazy peptydyloprolilowej i oddziałują z substancjami immunosupresyjnymi, takimi jak FK506 i rapamycyna. Białka spotyka się zwykle w cytoplazmie i siateczce endoplazmatycznej.
Przykłady cyklofilin obejmują cyklofiliny A, B i C. Białka mają aktywność izomerazy peptydyloprolilowej i oddziałują z cyklosporyną A. Cyklosporyna A wiąże się z kalcyneuryną (fosfatazą białkową).
Hsp20-30 określane jest również jako małe Hsp. Hsp20-30 spotyka się zwykle w wielkich kompleksach homooligomerycznych albo ewentualnie kompleksach heterooligomerycznych, gdy organizm albo rodzaj komórek wyraża kilka różnych rodzajów małych Hsp. Hsp20-30 oddziałują ze strukturami cytoszkieletu i mogą odgrywać rolę regulacyjną w polimeryzacji/depolimeryzacji aktyny. Hsp20-30 ulega gwałtownej fosforylacji pod wpływem wstrząsu albo ekspozycji komórek spoczynkowych na czynnik wzrostowy. Homologi Hsp20-30 obejmują krystalinę alfa.
ClpP jest proteazą E. coli związaną z degradacją nieprawidłowych białek. Obecność homologów ClpP stwierdzono w chloroplastach. ClpP tworzy heterooligomeryczny kompleks z ClpA.
GrpE jest białkiem E. coli wielkości około 20 kDa, które jest związane z ratowaniem białek uszkodzonych przez wstrząs, jak również z degradacją uszkodzonych białek. GrpE odgrywa rolę w regulacji ekspresji genów wstrząsu w E. coli.
Hsp10 przykładowo obejmuje GroES i Cpn10. Hsp10 spotyka się zwykle w E. coli oraz mitochondriach i chloroplastach komórek eukariotycznych. Hsp10 tworzy siedmioczłonowy pierścień, który wiąże się z oligomerami Hsp60. Hsp10 jest również związane z fałdowaniem białek.
Stwierdzono, że ubikwityna wiąże białka w koordynacji z proteolitycznym usuwaniem białek przez zależne od ATP proteazy cytozolowe.
Białka wstrząsu znajdujące zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku otrzymuje się z enterobakterii, mykobakterii (szczególnie M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis i M. bovis), E. coli, drożdży, Drosophila, kręgowców, ptaków, kur, ssaków, szczurów, myszy, naczelnych albo ludzi.
Białka wstrząsu mogą być w postaci kwaśnych albo zasadowych soli, albo w postaci obojętnej. Oprócz tego, poszczególne reszty aminokwasowe można modyfikować przez utlenianie albo redukcję. Ponadto, można przeprowadzać różne zastąpienia, delecje albo addycje w sekwencji aminokwasowej albo sekwencji kwasu nukleinowego, których efektem jest zachowanie albo dalsze zwiększenie aktywności biologicznej białka wstrząsu. Z powodu degeneracji kodu genetycznego, przykładowo może występować istotna zmienność w sekwencjach nukleotydowych kodujących sekwencję aminokwasową. Możliwe jest również zastosowanie części białek wstrząsu albo peptydów otrzymanych z białek wstrząsu, zakładając, że takie części albo peptydy obejmują epitopy związane ze wzmocnieniem reakcji odpornościowej na wybrany antygen białkowy HPV. Części białek wstrząsu można otrzymać przez fragmentację z użyciem proteinaz albo metodami rekombinacji, takimi jak ekspresja części sekwencji nukleotydowych kodujących białka wstrząsu (same albo poddane fuzji z inną sekwencją kwasu nukleinowego). Peptydy można również wytworzyć takimi sposobami albo przez syntezę chemiczną. Białka wstrząsu mogą obejmować mutacje wprowadzone w konkretne loci różnymi znanymi technikami, patrz. np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Drinkwater i Klinedinst, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3402-3406 (1986); Liao i Wise, Gene 88: 107-111 (1990); Horwitz i in., Genome 3: 112-117 (1989). Określenie „białka wstrząsu” w znaczeniu tu stosowanym ma obejmować takie części i peptydy białek wstrząsu.
Sposoby identyfikowania danego genu albo białka jako genu albo białka wstrząsu są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, konserwowanie genów i białek konkretnej rodziny białek wstrząsu umożliwia porównanie sekwencji nukleotydowej albo aminokwasowej danego genu/białka, z dobrze znanymi genami wstrząsu, takimi jak DnaK, GroEL albo DNAJ, np. przez hybrydyzację kwasu nukleinowego albo sekwencjonowanie nukleotydów albo aminokwasów, a następnie analizę komputerową (Voellmy i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4949-4953 (1985)). Alternatywnie, można zastosować
PL 196 805 B1 test w celu identyfikacji i/lub rozróżnienia pomiędzy istotnymi cechami strukturalnymi i/lub właściwościami funkcjonalnymi wybranych białek wstrząsu. Przykładowo, bibliotekę ekspresyjną można badać przesiewowo stosując przeciwciała przeciwko Hsp. Hsp90, jak dobrze wiadomo, wiąże się ansamycyną benzochinonową, geldanamycyną, z dużym powinowactwem. Stąd bibliotekę ekspresyjną można badać przesiewowo stosując geldanamycynę, w celu ujawnienia domniemanych homologów Hsp90, jako białek wiążących ansamycynę benzochinonową. Cechy białek kodowanych przez wyizolowany kwas nukleinowy można dalej potwierdzić innymi testami, w tym testami opartymi na przeciwciałach (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Oprócz tego, można badać aktywność biologiczną danej grupy białek wstrząsu (Guidon, P. T. i Hightower, L. E., Biochem. 25: 3231-3239 (1986)). Przykładowo, Hsp70 ma zdolność swoistego wiązania ATP, jak również nie pofałdowanych polipeptydów i peptydów w zespoły kompleksów białka. Tak więc, mieszanie danego białka z próbką zawierającą odpowiednie polipeptydy, peptydy albo ATP, a następnie określanie obecności albo braku tworzenia kompleksów białko-białko albo białko-nukleotyd, wskazuje na obecność albo nieobecność biała albo genu Hsp70, co można potwierdzić wykorzystując inne testy, takie jak testy oparte na przeciwciałach.
Białka wstrząsu, części białek wstrząsu, homologi białek wstrząsu i antygen białkowy HPV, z którym sprzęgane albo łączone nie kowalencyjnie jest białko wstrząsu, można wytworzyć albo otrzymać stosując znane techniki. Przykładowo, białko wstrząsu i/lub antygen można otrzymać (wyizolować) ze źródła, w którym wiadomo, że występuje, można wytworzyć i zebrać z hodowli komórkowych albo, w przypadku antygenu, można otrzymać z zakażonych komórek, można wytworzyć przez klonowanie, jeżeli to konieczne i wyrazić gen kodujący pożądane białko wstrząsu albo antygen, albo wytworzyć chemicznie. Ponadto, sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą pożądane białko wstrząsu lub antygen można syntetyzować chemicznie. Białko fuzyjne obejmujące białko wstrząsu i białkowy antygen HPV można wytworzyć rekombinacyjnie. Przykładowo, kwas nukleinowy kodujący białko wstrząsu można połączyć z dowolnym końcem sekwencji kwasu nukleinowego kodującego antygen białkowy HPV, w taki sposób, że dwie sekwencje kodujące mają wspólną ramkę translacji i mogą ulegać ekspresji jako białko fuzyjne obejmujące antygen białkowy HPV i białko wstrząsu. Połączone sekwencje wprowadza się do odpowiedniego wektora wybranego w oparciu o pożądane cechy ekspresji. W poniższych przykładach, sekwencje kwasu nukleinowego są połączone w wektorze przydatnym do ekspresji białek w bakterii E. coli. Po ekspresji w wybranej komórce gospodarza, białko fuzyjne można oczyszczać rutynowymi technikami rozdziału białek albo metodami powinowactwa immunologicznego, stosując przeciwciało przeciwko jednej albo drugiej części białka fuzyjnego.
Alternatywnie, wybrany wektor może dodać znacznik do sekwencji białka fuzyjnego, np. znacznik oligohistydynowy, jak opisany w poniższych przykładach, umożliwiając ekspresję znakowanego białka fuzyjnego, które można oczyszczać metodami powinowactwa, stosując przeciwciała albo inny materiał o odpowiednio dużym powinowactwie wobec znacznika (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, tom 182, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990)). Jeżeli stosuje się wektor przydatny do ekspresji w komórkach ssaczych, np. jeden z dyskutowanych poniżej wektorów, białko fuzyjne można wyrazić i oczyścić z komórek ssaczych.
Alternatywnie, ssaczy wektor ekspresyjny (obejmujący sekwencje kodujące białko fuzyjne) można podać osobnikowi w celu kierowania ekspresji białka fuzyjnego w komórkach osobnika. Kwas nukleinowy kodujący białko fuzyjne obejmujące białko wstrząsu i antygen białkowy HPV można również wytworzyć chemicznie, a następnie wprowadzić do odpowiedniego wektora w celu wytwarzania i oczyszczania białka fuzyjnego przed podaniem osobnikowi. Na koniec, białko fuzyjne można wytworzyć również chemicznie.
Kompozycje obejmujące białko wstrząsu i antygen białkowy HPV można zastosować w celu zwiększenia reakcji odpornościowej, szczególnie komórkowej reakcji odpornościowej, przeciwko HPV albo komórkom zakażonym, albo transformowanym HPV, wyrażającym antygen HPV. Korzystnie, kompozycje będą zawierały sekwencje antygenu białkowego z konkretnego rodzaju HPV, wobec których ma być wywołana reakcja odpornościowa.
Kompozycje zawierające białko wstrząsu i antygen HPV, opisane wyżej, można podawać osobnikowi różnymi sposobami. Drogi podawania obejmują podawanie śródskórne, przezskórne (np. polimery do powolnego uwalniania), domięśniowe, dootrzewnowe, dożylne, podskórne, doustne, podoponowe i donosowe. Można zastosować dowolną przydatną drogę podawania, przykładowo infuzję albo wstrzyknięcie bolusa, albo wchłanianie przez wyściółki nabłonkowe albo śluzowe. Oprócz tego, opisa12
PL 196 805 B1 ne tu kompozycje mogą zawierać i być podawane wraz z innymi dopuszczalnymi farmakologicznie składnikami, takimi jak środki aktywne biologicznie (np. adiuwanty, takie jak alum), środki powierzchniowo czynne (np. glicerydy), zaróbki (np. laktoza), nośniki, rozcieńczalniki itp. Ponadto, kompozycje można zastosować ex vivo w celu pobudzenia białych krwinek uzyskanych od osobnika w celu otrzymania i namnożenia in vitro komórek odpornościowych swoistych wobec antygenu białkowego HPV, które są następnie wprowadzane ponownie do organizmu osobnika.
Ponadto, białko fuzyjne obejmujące białko wstrząsu-antygen białkowy HPV można podawać przez ekspresję in vivo kwasu nukleinowego kodującego takie sekwencje białka w organizmie człowieka. Ekspresję kwasu nukleinowego można uzyskać u osobnika w celu otrzymania i namnożenia komórek odpornościowych swoistych wobec antygenu HPV in vitro, które to komórki są następnie wprowadzane z powrotem do organizmu osobnika. Wektory ekspresyjne przydatne do kierowania ekspresją białek fuzyjnych antygenu białkowego HPV-białko wstrząsu można wybrać spośród wielu różnych wektorów stosowanych w dziedzinie. Korzystne będą wektory, które są zdolne do powodowania silnej ekspresji, jak również są skuteczne w transdukcji interesującego genu. Przykładowo, można zastosować rekombinowany wektor adenowirusowy pJM17 (Ali i in., Gene Ther. 1: 367-84 (1994); Berkner, K. L., Biotechniques 6: 616-24, 1988), wektor adenowirusowy drugiej generacji DE1/DE4 (Wang i Finer, Nature Medicine 2: 714-6 (1996)) albo wektor wirusa adenosatelitarnego AAV/Neo (Muro-Cacho i in., J. Immunotherapy 11: 231-7 (1992)). Ponadto, można zastosować rekombinowane wektory retrowirusowe MFG (Jaffee i in., Cancer Res. 53: 2221-6 (1993)) albo LN, LNSX, LNCX, LXSN (Miller i Rosman Biotechniques 7: 980-9 (1989)).
Jako alternatywa mogą służyć wektory oparte na wirusie opryszczki pospolitej, takie jak pHSVl (Geller i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8950-4 (1990)) albo wektory wirusa krowianki, takie jak MVA (Sutter i Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 10847-51 (1992)).
Często stosowane swoiste jednostki ekspresji obejmujące promotor i sekwencje 3' można znaleźć w plazmidzie CDNA3 (Invitrogen), plazmidzie AH5, pRC/CMV (Invitrogen), pCMUII (Paabo i in., EMBO J. 5: 1921-1927 (1986)), pZip-NEO SV (Cepko i in., Cell 37: 1053-1062 (1984)) i pSRa (DNAX, Palo Alto, CA). Wprowadzenie genów do jednostek ekspresji i/lub wektorów można uzyskać przez zastosowanie technik inżynierii genetycznej, jak to zostało opisane w podręcznikach, takich jak „Molecular Cloning” oraz „Current Protocols in Molecular Biology” (Sambrook, J. i in., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Ausubel F.M. i in., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates i Wiley-Interscience (1989)). Uzyskany kwas nukleinowy można wprowadzać z powrotem do komórek osobnika ludzkiego dowolną metodą powodującą umieszczenie kwasu nukleinowego w komórkach w postaci umożliwiającej ekspresję, przykładowo jako część wektora wirusowego, takiego jak opisany wyżej jako nagi plazmid albo inny DNA, albo kapsułkowany w ukierunkowanych liposomach, albo „duchach” erytrocytarnych (Friedman, Science 244: 1275-1281 (1989); Rabinovich i in., Science 265: 1401-1404 (1994)). Sposoby transdukcji obejmują bezpośrednie wstrzyknięcie DNA do tkanek i guzów, transfekcję liposomami (Fraley i in., Nature 370: 111-117 (1980)), endocytozę za pośrednictwem receptora (Zatloukal i in., Ann. NY Acad. Sci. 660: 136-153 (1992)) i transfer genów za pośrednictwem bombardowania cząstkami (Eisenbraun i in., DNA & Cell Biol. 12: 791-797 (1993)).
Ilość białka wstrząsu i antygenu białkowego HPV (poddanych fuzji, sprzęgniętych albo połączonych nie kowalencyjnie, jak to omówiono powyżej) w kompozycji według wynalazku stanowi ilość, która powoduje skuteczną reakcję immunostymulującą u osobnika. Ilością skuteczną jest ilość taka, że po podaniu powoduje indukcję reakcji odpornościowej. Oprócz tego, ilość białka wstrząsu i antygenu białkowego HPV podawana osobnikowi zależeć będzie od różnych czynników, w tym od rodzaju zastosowanego białka wstrząsu i antygenu białkowego HPV, wielkości, wieku, ciężaru ciała, stanu zdrowia, płci i diety osobnika, jak również od jego ogólnej reaktywności immunologicznej. Dostosowanie i manipulowanie zakresem dawek leży w zakresie możliwości specjalisty w dziedzinie. Przykładowo, ilość białka wstrząsu i antygenu może wynosić od około 1 μg do około 1 g, korzystnie od około
100 μg do około 1 g i od około 1 mg do około 1 g. Skuteczną ilością kompozycji obejmującej wektor ekspresyjny jest ilość taka, że po podaniu wywołuje reakcję odpornościową przeciwko antygenowi białkowemu HPV, który koduje. Ponadto, ilość podawanego wektora ekspresyjnego zależeć będzie od różnych czynników, w tym wyrażanego antygenu HPV i białka wstrząsu, wielkości, wieku, ciężaru ciała, stanu zdrowia, płci i diety osobnika, jak również od jego ogólnej reaktywności immunologicznej. Dodatkowe czynniki, które muszą być wzięte pod uwagę obejmują drogę podania i rodzaj zastosowanego wektora. Przykładowo, przy podawaniu profilaktycznym albo terapeutycznym wektora wirusowePL 196 805 B1 go zawierającego kwas nukleinowy kodujący białko fuzyjne antygen białkowy HPV-białko wstrząsu, skuteczna liczba będzie zawierać się w zakresie od 104 do 1012 pozbawionego wirusów pomocniczych, niezdolnego do replikacji wirusa na kg masy ciała, korzystnie w zakresie od 105 do 1011 wirusa na kg masy ciała, zaś najkorzystniej w zakresie od 106 do 1010 wirusa na kg masy ciała.
Wynalazek jest zilustrowany poniższymi przykładami, które nie mają na celu jego ograniczania.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Izolowanie rekombinowanych białek wstrząsu
Rekombinowane Hsp71 mykobakterii
Plazmid Y3111 zawiera gen hsp71 M. tuberculosis wprowadzony funkcjonalnie pomiędzy sekwencje kontrolujące ekspresję (Mehlert A. i Young, D. B., Mol. Microbiol. 3: 125-130 (1989)). Szczep CG2027 E. coli (otrzymany od C. Georgopoulos, University of Geneva, Szwajcaria) zawierający okrojony gen dnaK transformowano plazmidem Y3111 standardową procedurą (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).
Bakterie zawierające plazmid Y3111 hodowano przez noc w pożywce 2 x YT (20 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdży, 10 g NaCl na litr) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w 37°C, wytrząsając (250 obrotów na minutę). Z tej hodowli wykonano bulion w 10% glicerolu i przechowywano w -70°C. Kilka zadrapań z zamrożonego bulionu glicerolowego zastosowano do zaszczepienia większej hodowli, którą inkubowano jak przedtem, przez około 48 godzin. Po osiągnięciu gęstości optycznej przy 590 nm rzędu 2,5 do 3,5, komórki zebrano przez odwirowanie.
Poniższe etapy przeprowadzono w 4°C. Osad komórkowy zawieszono w 3 ml buforu litycznego na gram osadu bakterii. Bufor lityczny obejmował 10 mM Tris-HCl, 2 mM etylenodiaminotetraoctanu (EDTA), 5 mM β-merkaptoetanolu, 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny i 1 μg/ml pepstatyny. Lizozym dodano do zawiesiny komórkowej w stężeniu końcowym 0,14 mg/ml. Zawiesinę zamrożono w -70°C.
Zawiesinę komórkową rozmrożono, zaś komórki zniszczono przez sonikację. Produkt sonikacji poddano wirowaniu przy 17000 obrotów na minutę przez 30 minut (rotor JA-17, Beckmann). Do nadsączu dodano (NH4)2SO4 w postaci stałej, do 65% wysycenia (NH4)2SO4. Po 30 minutach inkubacji mieszaninę odwirowano jak wcześniej. Osad rozpuszczono w buforze A Q Sepharose. Do roztworu dodano 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny i l μg/ml pepstatyny, po czym roztwór dializowano przez noc wobec 65 objętości bufora A Q Sepharose. Bufor A Q Sepharose zawierał 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanolu. Dializowany roztwór klarowano przez odwirowanie, jak to opisano wcześniej.
Dializowany roztwór wprowadzono do kolumny Q Sepharose (Pharmacia) zrównoważonej buforem Q Sepharose. Kolumnę płukano 2 objętościami tego samego bufora. Elucję przeprowadzono gradientem od 0 do 600 mM NaCl. Frakcje badano przez SDS-PAGE i barwiono błękitem Coomassie na obecność głównego polipeptydu 71 kDa (tj. rekombinowanego białka Hsp71 M. tuberculosis). Frakcje zawierające polipeptyd zlewano i doprowadzano do 65% wysycenia przez dodanie (NH4)2SO4 w postaci stałej. Mieszaninę wirowano jak przedtem, osad rozpuszczano w buforze ATP Start (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 15 mM β-merkaptoetanolu, 0,1 mM EDTA), zaś powstały roztwór białka dializowano przez noc wobec 65 objętości tego samego bufora i klarowano przez wirowanie.
Dializowany roztwór białka wprowadzono do kolumny ATP-agaroza (Fluka) równoważonej buforem ATP Start. Kolumnę płukano 1 objętością buforu ATP Start z 1M NaCl. Elucję przeprowadzono przy użyciu buforu ATP Start z dodatkiem 10 mM ATP. Eluat doprowadzono do 65% nasycenia przez dodanie (NH4)2SO4, po czym strącone białko zebrano jak przedtem. Osad po wirowaniu rozpuszczono w oraz dializowano wobec 200 objętości bufora Blue Sepharose (30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 5 mM β-merkaptoetanolu).
Dializowany roztwór białka z ostatniego etapu wprowadzono do kolumny Blue Sepharose (Pharmacia) zrównoważonej buforem Blue Sepharose. Kolumnę płukano 1,5 objętości tego samego bufora. Frakcję przepływającą i płuczącą zlewano. Czystość preparatu końcowego oceniono przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie, analizą Western (Maniatis i in., Molecular Cloning. A Laboroatory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); (patrz Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) stosując mysie przeciwciała monoklonalne swoiste wobec Hsp71 mykobakterii i DnaK E. coli, odpowiednio oraz testy na aktywność ATPazy. Preparaty były zwykle w 90% czyste, w oparciu o wzo14
PL 196 805 B1 rzec barwienia w żelach barwionych błękitem Coomassie, korzystnie w ponad 95% czyste i zawierały mniej niż 1% GroEL E. coli i nie zawierały wykrywalnego DnaK E. coli.
Rekombinowane Hsp65 mykobakterii
Plazmid RIB 1300 zawiera gen hsp65 BCG M. bovis, wprowadzony funkcjonalnie pomiędzy sekwencje kontrolujące ekspresję (Thole i in., J. Exp. Med. 178: 343-8 (1993)). Szczep M1546 E. coli transformowano plazmidem RIB1300 stosując standardowe procedury (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Inokulum bakterii zawierających plazmid RIB 1300 hodowano do nasycenia w pożywce NCZYM (10 g N-Z Amine A, 5 g ekstraktu drożdżowego Bacto, 1 g hydrolizatu kazeiny w kwasie chlorowodorowym (Casamino acid), 5 g NaCl, 2 g (NH4)2SO4 · 7H2O na litr), zawierającej 200 μg/ml ampicyliny w 28°C, wytrząsając (250 obrotów na minutę). Hodowlę tę zastosowano do zaszczepienia większej hodowli, którą hodowano w tych samych warunkach do uzyskania gęstości optycznej przy 590 nm równej 0,3-0,6. Wytwarzanie białka rekombinowanego zapoczątkowano przez gwałtowne podwyższenie temperatury hodowli do 42°C przez inkubowanie w łaźni wodnej. Hodowlę utrzymywano w tej temperaturze przez 3 godziny wytrząsając. Następnie bakterie zebrano przez odwirowanie i zawieszono w 6 objętościach na wagę osadu bakterii w buforze litycznym. Bufor lityczny zawierał 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2 mM etylenodiaminotetraoctan (EDTA), 0,1 mM PMSF i 0,1% RIVM BA (0,104 g dichlorowodorku 4-aminobenzamidyny, 0,066 g kwasu epsilon-aminokapronowego na 50 ml). Lizozym dodano do zawiesiny komórkowej w stężeniu końcowym 0,1 mg/ml. Zawiesinę zamrożono w -70°C.
Zawiesinę bakteryjną rozmrożono i umieszczono w 4°C. Poniższą procedurę przeprowadzano w tej temperaturze. Całkowitą lizę bakterii uzyskano przez sonikację. Produkt sonikacji odwirowano przy 17000 obrotów na minutę przez 30 minut na rotorze JA-17 (Beckman). Nasycony (NH4)2SO4 dodano do roztworu do uzyskania 20% wysycenia. Precypitat usunięto przez wirowanie (jak wyżej) i odrzucono. Roztwór doprowadzono do wysycenia 55% przez dodanie nasyconego (NH4)2SO4. Osad powstały po kolejnym wirowaniu rozpuszczono w buforze TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 15 mM β-merkaptoetanolu, 1 mM EDTA). Roztwór białka w TE dializowano wobec 50 objętości buforu TE.
Po wirowaniu (jak wyżej), w celu usunięcia strąconego materiału, dializowany roztwór białka wprowadzono na kolumnę DEAE Sepharose (Pharmacia). Po płukaniu buforem TE, białka eluowano gradientem 0-300 mM NaCl w buforze TE. Frakcje zawierające Hsp65 BCG M. bovis identyfikowano przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie i zlewano. Do puli dodano 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny i 1 μg/ml pepstatyny, po czym zatężono ją w komorze Amicon stosując membranę YM30.
Zatężoną pulę wprowadzono do kolumny S-200 Sephacryl (Pharmacia) zrównoważonej buforem S200 (10 mM Na2HPO4 (pH 6,8), 150 mM NaCl, 15 mM β-merkaptoetanol). Elucję przeprowadzono tym samym buforem. Frakcje badano na obecność Hsp65 mykobakterii jak powyżej i zlewano wysoko oczyszczone frakcje oraz dializowano wobec buforu HAP (10 mM Na2HPO4 (pH 6,8), 15 mM β-merkaptoetanol).
Dializowaną pulę wprowadzono na kolumnę hydroksyapatytu (Bio-Rad; Bio-Gel HTP Gel) równoważoną buforem HAP. Kolumnę płukano 3 objętościami 1 mM MgCl2 i 15 mM β-merkaptoetanolem, a następnie 1 mM Na2HPO4 (pH 6,8) i 15 mM β-merkaptoetanolem. Białko eluowano w 10-60 mM gradiencie fosforanu. Frakcje badano jak wyżej i frakcje pozytywne zlewano, zatężano i wymieniano w 0,85% NaCl przez filtrację żelową przez PD10 (Pharmacia). Czystość Hsp65 mykobakterii oceniano przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie, jak również przez analizę metodą Western, stosując przeciwciała swoiste wobec DnaK i GroEL E. coli. Preparaty miały zwykle czystość równą 90% i zawierały nie więcej niż 0,5% GroEL E. coli i 0,1-0,2% DnaK E. coli, odpowiednio.
Preparaty Hsp można uczynić niepirogennymi przez chromatografię powinowactwa na żywicy DetoxiGel (Pierce), dodanie polimyksyny B albo przez ekstrakcję detergentami, takimi jak Triton X-114 albo X-100. Redukcję w zawartości lipopolisacharydu można badać testem z amebocytami limulus (LAL; Biowhittaker, QCL 1000). Preparaty Hsp można przechowywać w buforze w -70°C albo, korzystnie w -70°C jako suche peletki po liofilizacji.
P r z y k ł a d 2
Wytwarzanie koniugatów antygen białkowy-białko wstrząsu
Przykład ten przedstawiono jako ilustrację technik, które można wykorzystać w celu wytworzenia koniugatów pomiędzy białkiem wstrząsu i antygenem białkowym, w tym przykładzie peptyd pochodził z nukleoproteiny (NP )wirusa grypy.
PL 196 805 B1
Synteza białka wstrząsu (Hsp71) i antygenu (NP.B)
Hsp71 M. tuberculosis wytworzono zgodnie z przykładem 1. Peptyd NP (określany tu jako NP.B; Motal, U. M. A i in., Eur. J. Immunol. 25: 11214 (1995) i zawarte w nim odnośniki) o sekwencji aminokwasowej [C]VQLASNENMETM (Id. Sekw. nr 1; peptyd zawiera dodatkową resztę cysteiny na końcu aminowym) odpowiadający resztom 363-374 kompletnego NP i zawierający znany epitop CTL (w restrykcji H-2b) wytworzono syntetycznie (w skali 0,25 tnM) na syntezatorze peptydów Applied Biosystems model 431A, przy użyciu Fmoc (9-fluorenylometylooksykarbonylu) jako grupy ochronnej alfaaminowej i żywicy HMP (Wang) jako podłoża. Wszystkie aminokwasy i chemikalia do syntezy zakupiono w Applied Biosystems. NP.B odcięto od podłoża i usunięto grupy ochronne łańcuchów bocznych przez inkubowanie żywicy z NP.B w 2 ml mieszaniny otrzymanej przez zmieszanie 10 ml kwasu trifluorooctowego, 0,5 ml wody, 0,75 g krystalicznego fenolu, 0,25 ml etanoditiolu i 0,5 ml tioanizolu, przy ciągłym wytrząsaniu przez 3 godziny. Mieszaninę odcinającą filtrowano do 40 ml lodowatego eteru dietylowego. Nierozpuszczalny materiał zebrano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 8 minut. Eter zlano, zaś osad przemyto trzykrotnie przez zawieszenie w zimnym eterze dietylowym i odwirowanie. Po ostatnim płukaniu osad wysuszono na powietrzu, pobrano w wodzie destylowanej i liofilizowano.
Chemiczne sprzęganie peptydu NP.B z Hsp71 i anatoksyną błoniczą
Koniugację przeprowadzono z Hsp71 oraz w celu porównania skuteczności swoistego pobudzenia aktywności CTL z powszechnie stosowanym białkiem nośnikowym, anatoksyną błoniczą (w skrócie DT; DT otrzymano z Wako Chemical).
Roztwór aktywowanego białka nośnikowego: 9 mg Hsp71 rozpuszczono w 4,5 ml 0,1 M buforu boranu sodu, pH 8,0. Do białka dodano sulfo-MBS (ester m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysulfobursztynianowy) (2,3 mg w 100 μΐ dimetylosulfoksaminy) i inkubowano mieszaninę reakcyjną przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie pH doprowadzono do 6,0 i dializowano mieszaninę reakcyjną przez noc w 4°C wobec 1 l 20 mM fosforanu sodu i 150 mM NaCl, pH 5,6. DT traktowano w podobny sposób.
Roztwory zredukowanego białka: do każdej reakcji sprzęgania, 3 mg peptydu rozpuszczono w 100 μl 0,1 M β-metkaptoetanolu. Po 1 godzinie inkubacji w celu zredukowania peptydu, czynnik redukujący usuwano przez wysuszenie mieszaniny reakcyjnej w wirówce SpeedVac. Peptyd rozpuszczono w 0,5 ml wody destylowanej, do której dodano 5 μl porcje 1N NaOH, dopóki peptyd nie rozpuścił się całkowicie. Do doświadczeń nad sprzęganiem z DT, 6 mg peptydu redukowano i rozpuszczano w 1 ml wody.
pH roztworu aktywowanego białka nośnikowego doprowadzano do 6,8 przy użyciu 0,1 N NaOH. Roztwór zawierający 3 mg aktywowanego białka nośnikowego poddano reakcji z 0,5 ml roztworu zredukowanego białka (albo 1 ml roztworu zredukowanego białka do wytworzenia koniugatów z DT) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. W celu usunięcia nieprzereagowanego peptydu, powstały roztwór zawierający koniugat dializowano przez noc w 4°C wobec 1 l 20 mM fosforanu sodu i 150 mM NaCl, pH 7. Stężenie białka określano testem BCA. Wydajność koniugacji osiągniętą przez tą procedurę określano we wstępnym doświadczeniu pilotowym z użyciem znakowanego radioaktywnie peptydu NP.B. Peptyd: stwierdzono, że stosunek białek wynosi 17,5 dla koniugatu NP.B-Hsp71 (71.NP) i 10,1 dla NP.B-DT (DT.NP).
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie genów fuzyjnych HSP-E6 i HSP-E7
Wytwarzanie bakteryjnego wektora ekspresyjnego pET65H
Plazmid RIB1300 zawierał gen hsp65 BCG M. bovis (Thole, J. E. R. i in., J. Exp. Med. 178: 343-8 (1993)). Parę starterów do amplifikacji genu Hsp65 syntetyzowano na automatycznym syntezatorze oligonukleotydowym i oczyszczono stosując rutynowe procedury. Starter 5' zawierał miejsce restrykcyjne Ndel i miał sekwencję 5'AATCACTTCCATATGGCCAAGACAATT. Starter wsteczny zawierał miejsca EcoRI i Nhel flankujące kodon stop i miał sekwencję nukleotydową 5'CGCTCGGACGAATTCTCAGCTAGCGAAATCCATGCC.
Reakcję łańcuchową polimerazy (PGR) przeprowadzono stosując powyższą parę starterów i RIB1300 jako matrycę DNA. Fragmenty PGR podwójnie trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Ndel i EcoRI i poddano ligacji z pET28a (Invitrogen) trawionym Ndel/EcoRI stosując rutynowe techniki klonowania (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Zdolne do transformacji komórki szczepu DH5a E. coli transformowano mieszaniną ligacyjną i wysiano na agar zawierający 100 μg/ml ampicyliny. Kolonie transformowa16
PL 196 805 B1 nych komórek izolowano, po czym izolowano z nich plazmidowy DNA i analizowano na obecność genu hsp65 i sekwencji wektora przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie nukleotydów. Prawidłowe konstrukty (nazwane pET65H) zawierające gen hsp65 mykobakterii zidentyfikowano i transformowano do szczepu BL21 E. coli (DES; Novagen), w celu analizy ekspresji genu hsp65. Schematyczną mapę konstruktu pET65H przedstawiono na fig. 1. W celu zbadania ekspresji Hsp65, transformowane bakterie szczepu BL1 hodowano, indukowano i zbierano według instrukcji producenta (Novagen). Bakterie poddano lizie, po czym rozpuszczalny materiał, jak również materiał solubilizowany z ciałek wtrętowych przy użyciu chlorowodorku guanidyny (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)) poddano elektroforezie na SDS-PAGE i zbadano metodą immunologiczną przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, swoistych wobec białka wstrząsu z mykobakterii.
Wytwarzanie konstruktu do ekspresji białka fuzyjnego Hsp65-E6 HPV16 w bakteriach
Kompletny region kodujący E6 HPV16 wprowadzono na końcu karboksylowym genu hsp65 w pET65H.
Plazmid pHPV16 zawiera kompletny genom HPV16 w wektorze Bluescript SK (ATCC 45113). Sekwencję nukleotydową genomu HPV16 opublikowano w Seedorf i in., Virology 145: 181-5 (1985). Parę starterów do amplifikacji genu E6 syntetyzowano na automatycznym syntezatorze oligonukleotydów i oczyszczono stosując rutynowe procedury. Starter „do przodu” zawierał miejsce restrykcyjne Nhel i miał sekwencję nukleotydową 5'AAAAGCAGAGCTAGCATGCACCAAAAG. Starter wsteczny zawierał miejsce restrykcyjne EcoRI i kodon stop i miał sekwencję nukleotydową 5'CTCCATGAATTCTTACAGCTGGGT.
Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując powyższą parę starterów i pHPV16 jako matrycę DNA. Fragmenty PCR podwójnie trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Nhel i EcoRI i poddano ligacji z pET65H podwójnie trawionym Nhel/EcoRI, stosując rutynowe techniki klonowania (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY (1989)). Zdolne do transformacji komórki szczepu DH5a E. coli transformowano mieszaniną ligacyjną i wysiano na agar zawierający 100 μg/ml ampicyliny. Kolonie transformowanych komórek izolowano, po czym izolowano z nich plazmidowy DNA i analizowano na obecność genu fuzyjnego hsp65-E6 i sekwencji wektora przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie nukleotydów. Prawidłowe konstrukty (nazwane pET65HE6) zawierające gen fuzyjny hsp65-E6 zidentyfikowano i transformowano do szczepu BL21 E. coli (DES; Novagen), w celu analizy ekspresji genu fuzyjnego. Schematyczną mapę konstruktu pET65HE6 przedstawiono na fig. 2. W celu zbadania ekspresji Hsp65-E6, transformowane bakterie szczepu BL1 hodowano, indukowano i zbierano według instrukcji producenta (Novagen). Bakterie poddano lizie, po czym rozpuszczalny materiał, jak również materiał solubilizowany z ciałek wtrętowych przy użyciu chlorowodorku guanidyny (Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)) poddano elektroforezie na SDS-PAGE. Jako wzorzec, równolegle puszczono oczyszczone Hsp65. Ekspresję Hsp65-E6 oceniono przez pojawienie się silnie barwiącego się błękitem Coomassie prążka, migrującego nieco wolniej (pozorna masa cząsteczkowa (MOO) rzędu 73 kDa) niż Hsp65 (masa cząsteczkowa około 56 kDa) w próbce z bakterii transformowanych pET65HE6, który nie występował w odpowiednich nie transformowanych bakteriach.
Wytwarzanie konstruktu do ekspresji białka fuzyjnego Hsp65-E7 HPV16 w bakteriach
Kompletny region kodujący E7 HPV16 wprowadzono na końcu karboksylowym genu hsp65 w pET65H.
Parę starterów do amplifikacji genu E7 syntetyzowano na automatycznym syntezatorze oligonukleotydów i oczyszczono stosując rutynowe procedury. Starter „do przodu” zawierał miejsce restrykcyjne Nhel i miał sekwencję nukleotydową 5'AACCCACCTGCTAGCATGCATGGAGAT. Starter wsteczny zawierał miejsce restrykcyjne EcoRI i kodon stop i miał sekwencję nukleotydową
5'AGCCATGAATTCTTATGGTTTCTG.
Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując powyższą parę starterów i pHPV16 jako matrycę DNA. Fragmenty PCR podwójnie trawiono endonukleazami restrykcyjnymi Nhel i EcoRI i poddano ligacji z pET65H podwójnie trawionym Nhel/EcoRI stosując rutynowe techniki klonowania. Zdolne do transformacji komórki szczepu DH5a E. coli transformowano mieszaniną ligacyjną i wysiano na agar zawierający 100 μg/ml ampicyliny. Kolonie transformowanych komórek izolowano, po czym izolowano z nich plazmidowy DNA i analizowano na obecność genu fuzyjnego hsp65-E7 i sekwencji wektora przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie nukleotydów. Prawidłowe konstrukty (nazwane pET65HE7) zawierające gen fuzyjny hsp65-E7 zidentyfikowano i transformowaPL 196 805 B1 no do szczepu BL21 E. coli (DES; Novagen), w celu analizy ekspresji genu fuzyjnego. Schematyczną mapę konstruktu pET65HE7 pokazano na fig. 3. W celu zbadania ekspresji Hsp65-E7, transformowane bakterie szczepu BL1 hodowano, indukowano i zbierano według instrukcji producenta (Novagen). Bakterie poddano lizie, po czym rozpuszczalny materiał, jak również materiał solubilizowany z ciałek wtrętowych przy użyciu chlorowodorku guanidyny poddano elektroforezie na SDS-PAGE i badano przeciwciałem monoklonalnym przeciwko E7 HPY16 (Zymed Laboratory Inc., nr kat. 28-0006).
P r z y k ł a d 4
Ekspresja i oczyszczanie białek fuzyjnych
Ekspresja i oczyszczanie białka fuzyjnego Hsp65-E6: procedura 1
Konstrukt pET65HE6 transformowano do szczepu BL1 E. coli (DE3; Novagen) i transformowane komórki hodowano w 6 litrach pożywki 2 x YT (20 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdży, 10 g NaCl na litr) zawierającej 30 μg/ml kanamycyny w 30°C. Dla każdej hodowli, po uzyskaniu gęstości optycznej 0,5 (OD590), ekspresję białka fuzyjnego indukowano 0,5 mM izopropylo-tio-galaktopiranozydem i hodowlę inkubowano przez dodatkowe trzy godziny w 37°C. Komórki zebrano przez odwirowanie, zawieszono w 90 ml buforu litycznego (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5) zawierającego 200 μg/ml lizozymu i zamrażano w -70°C. Dzień później, zamrożoną zawiesinę komórkową odmrożono w łaźni wodnej 37°C i dodano 2 μg/ml aprotyniny, 2 μg/ml leupeptyny, 2 μg/ml pepstatyny i 2 mM PMSF. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono w 0-4°C. Lizę komórek osiągnięto przez sonikację, zaś cały nierozpuszczalny materiał zebrano przez odwirowanie przy 17000 obrotów na minutę przez 15 minut (rotor JA-17, Beckman). Żwirowany materiał płukano dwukrotnie buforem litycznym, a następnie solubilizowano przez sonikację w 90 ml buforu A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6M chlorowodorek guanidyny). Rozpuszczony materiał wprowadzono do kolumny zawierającej 50 ml nasyconej niklem żywicy chelatującej metal (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia), którą zrównoważono buforem A. Związane białko fuzyjne powoli fałdowano na żywicy stosując gradient 0-1 M NaCl. Żywicę płukano 5 objętościami buforu B (1M NaCl) w celu usunięcia zalegającego chlorowodorku guanidyny i 5 objętościami buforu C (50 mM imidazol, pH 7,5, 0,5 mM β-merkaptoetanol, 150 mM NaCl) w celu usunięcia białek zanieczyszczających. Białko fuzyjne eluowano 6 objętościami liniowego gradientu 50-500 mM imidazolu w buforze C. Zlewane, eluowane białko dializowano przez noc wobec około 40 objętości roztworu soli buforowanego fosforanem Dulbecco (2,7 mM KH2PO4, 4,3 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 0,137 M NaCl), zatężano przez ultrafiltrację (Amicon, MW odcięcia 30 kDa) i przepuszczano przez żywicę Detoxigel równoważoną roztworem soli buforowanym fosforanem Dulbecco w celu usunięcia endotoksyny.
Ekspresja i oczyszczanie białka fuzyjnego Hsp65-E6: procedura 2
Konstrukt pET65HE6 transformowano do szczepu BL21 E. coli (DES; Novagen) i transformowane komórki hodowano w 12 litrach pożywki 2 x YT (20 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdży, 10 g NaCl na litr) zawierającej 30 μg/ml kanamycyny w 30°C. Dla każdej hodowli, po uzyskaniu gęstości optycznej 0,5 (OD590), ekspresję białka fuzyjnego indukowano 0,5 mM izopropylo-tio-galaktopiranozydem i hodowlę inkubowano przez dodatkowe trzy godziny w 37°C. Komórki zebrano przez odwirowanie, zawieszono w 180 ml buforu litycznego (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM μ-merkaptoetanol, pH 7,5) zawierającego 200 μg/ml lizozymu i zamrażano w -70°C. Dzień później, zamrożoną zawiesinę komórkową odmrożono w łaźni wodnej 37°C i dodano 2 μg/ml, aprotyniny, 2 μg/ml leupeptyny, 2 μg/ml pepstatyny
2 mM PMSF. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono w 0-4°C. Lizę komórek osiągnięto przez sonikację, zaś cały nierozpuszczalny materiał zebrano przez odwirowanie przy 17000 obrotów na minutę przez 15 minut (rotor JA-17, Beckman). Żwirowany materiał płukano dwukrotnie buforem litycznym, a następnie solubilizowano, przy pomocy sonikacji w 180 ml buforu A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6M chlorowodorek guanidyny). Rozpuszczony materiał wprowadzono do kolumny zawierającej 50 ml nasyconej niklem żywicy chelatującej metal (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia), którą zrównoważono buforem A. Związane białko fuzyjne płukano buforem D (Bufor A z dodatkiem 5% Triton X100), a następnie powoli fałdowano na żywicy gradientem 0-1 M NaCl. Żywicę płukano 5 objętościami buforu E (1M NaCl, 1% Triton X-100) i 5 objętościami buforu B (1M NaCl) w celu usunięcia pozostałości chlorowodorku guanidyny, a następnie 5 objętościami buforu F (50 mM imidazol, pH 7,5, 0,5 mM β-merkaptoetanol, 0,5 mM NaCl, 15% gliceryna) w celu usunięcia zanieczyszczających białek. Białko fuzyjne eluowano 6 objętościami liniowego gradientu 50-500 mM imidazolu w buforze F. Zlewane, eluowane białko dializowano przez noc wobec 40 objętości buforu G (30 mM Tris-HCl, pH 6,5, mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanol, 15% gliceryna) i wprowadzono do kolumny 50 ml SP-Sepharose równoważonej tym samym buforem. Białko fuzyjne (około 42 mg, stanowiące około 50% całkowitego
PL 196 805 B1 białka fuzyjnego obecnego we frakcjonowanym ekstrakcie) odzyskane we frakcji opuszczającej kolumnę, dializowano przez noc wobec 40 objętości roztworu soli buforowanego fosforanem Dulbecco (2,7 mM KH2PO4, 4,3 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 0,137 M NaCl) i zatężano przez ultrafiltrację (Amicon, odcięcie przy masie cząsteczkowej 30 kDa).
Białko fuzyjne Hsp70-E7 wyrażano i oczyszczano tymi samymi procedurami. Czystość białka fuzyjnego oceniono przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie. Czystość białka po procedurze 1 wynosiła zwykle 70-90% i około 90% po korzystnej procedurze 2. Poziom endotoksyny po oczyszczaniu procedurą 2 wynosił poniżej 20 EU/mg białka.
P r z y k ł a d 5
Immunizacja przy użyciu HSP65-E6 I HSP65-E7
Samice myszy C57B1/6 w wieku 6-8 tygodni otrzymano z Charles River Laboratory (St. Constant, Quebec, Kanada). Grupy po 6 do 8 myszy na grupę immunizowano podskórnie w kark przy użyciu równych ilości białek fuzyjnych Hsp65-E6 i Hsp65-E7 w roztworze soli buforowanym fosforanem Dulbecco opisanym w przykładzie 4. Dawki całkowite podawanych białek fuzyjnych wynosiły 20 μg albo 200 μg, odpowiednio.
Kontrolne immunizacje negatywne wykonywano przy użyciu niekompletnego adiuwanta Freunda w roztworze soli (IFA), zaś kontrolne immunizacje pozytywne przeprowadzano przy użyciu 100 μg syntetycznego peptydu E7 HPV16 obejmującego reszty 44 do 62 w IFA i roztworze soli. Względem dawek zastosowanego białka fuzyjnego, ilość peptydu E7 stanowiła 20 albo 200-krotny nadmiar odpowiednio. Immunizacje powtarzano 14 dni później. 12 dni po drugiej immunizacji, myszy eksponowano na podskórne wstrzyknięcie w ogolony region grzbietu 1,3 x 105 komórek linii TC-1 wyrażających E7. Występowanie guzów oceniono jako obecność albo nieobecność nowotworu w oparciu o obserwację i palpację co dwa dni przez 50 dni.
Linia komórek nowotworowych TC-1 wyrażająca białko E7 HPV16 pochodziła z pierwotnej linii komórek płuc myszy C57B1/6 unieśmiertelnionych i transformowanych genami E6 i E7 HPV16 oraz aktywowanym genem c-Ha-ras, jak to opisano w Lin i in. (Cancer Res. 56: 21-26 (1996)). W celu zaszczepienia nowotworu, komórki TC-1 dostarczone przez dr T.-C. Wu (The Johns Hopkins Medical Institution, Baltimore, MD) hodowano do 60--70% zlewności w 37°C w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (HyClone, Logan, UT), niezbędnych aminokwasów, glutaminy, pirogronianu, gentamycyny, β-merkaptoetanolu, 0,4 mg/ml fienetycyny (Life Technologies, Grand Island, NY) i 0,2 mg/ml higromycyny B. Komórki zebrano przez trypsynizację i zawieszono w roztworze Hank'a w gęstości 6,5 x 105 komórek/ml.
Wyniki jednego z doświadczeń pokazano na fig. 4. Krótko po prowokacji, występowanie guzów narastało we wszystkich traktowanych grupach (pomiędzy 5 i 15 dniem po prowokacji). O ile częstość występowania pozostawała wysoka dla grup IFA, u grup traktowanych 200 μg białka fuzyjnego albo peptydu E7 w IFA spadała dramatycznie do 0%.
Wyniki pośrednie uzyskano dla grup leczonych 20 μg białek fuzyjnych. Tak więc, immunizacja białkami fuzyjnymi Hsp65-E6 i Hsp65-E7 pod nieobecność adiuwantów skutecznie chroniła myszy przed letalną ekspozycją na komórki nowotworowe wyrażające E7. Podsumowanie wyników pokazano w tabeli 1.
T a b e l a 1
Reakcja na drugą ekspozycję na komórki TC-1
Grupa immunizacji Procent częstości występowania guzów*
Po 1 prowokacji (dzień 54) Po 2 prowokacji (dzień 79)
IFA albo nic** 83 (5/6) 100 (4/4)
μ9 białka fuzyjnego 25 (2/8) 25 (1/4)
μg białka fuzyjnego 0 (0/8) 0 (0/4)
peptyd E7 w IFA 0 (0/8) 0 (0/4)
* W nawiasach podano liczbę zwierząt z guzem/całkowitą liczbę zwierząt w grupie. W prawej kolumnie zwierzęta obserwowano w kierunku obecności albo nieobecności nowotworu przez dodatkowe 25 dni (po 2 prowokacji) ** Jako kontrola do 2 prowokacji na nowotwór, grupę nie immunizowanych zwierząt włączono dla porównania
PL 196 805 B1
P r z y k ł a d 6
Ekspozycja immunizowanych zwierząt na drugą prowokację komórkami nowotworowymi
W celu oceny długotrwałoś ci reakcji odpornościowej na antygeny HPV, grupy 4 zwierząt, które przeżyły poprzedni eksperyment (w dniu 54) z grup leczonych białkiem fuzyjnym i z grupy peptydu E7/IFA, poddano ekspozycji drugi raz przy użyciu 1,3 x 105 żywych komórek nowotworowych TC-1 na zwierzę. Jako grupę kontrolną włączono grupę myszy naiwnych, eksponowanych na taką samą prowokację komórkami nowotworowymi. Występowanie nowotworów oceniano 25 dni później.
Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Zwierzęta uprzednio immunizowane białkami fuzyjnymi albo peptydem E7/IFA były całkowicie albo niemal całkowicie chronione przed drugą prowokacją, podczas gdy zwierzęta nie immunizowane wykazywały 100% występowanie nowotworów.
P r z y k ł a d 7
Aktywność cytolityczna splenocytów zwierząt immunizowanych i nieimmunizowanych
Grupy po dwie myszy immunizowane białkiem fuzyjnym, peptydem albo nieimmunizowane zabito przez przerwanie rdzenia kręgowego i pobrano im śledziony. Wytworzono zawiesinę jednokomórkową zebranych w pulę śledzion i płukano roztworem buforu Hank'a z dodatkiem 5% surowicy płodowej cielęcej. Komórki limfoidalne stymulowano przez hodowanie 20 x 106 żywych komórek z 2 x 106 traktowanych mitomycyną C komórek TC-1 przez 5 dni w RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μΜ 22-merkaptoetanolu i 50 μg/ml siarczanu gentamycyny w 37°C i 5% CO2. Splenocyty (komórki efektorowe) zebrano i zastosowano w teście aktywności CTL, jak opisano niżej.
Jako komórki docelowe wybrano komórki TC-1 i dobrane pod względem HLA linie EL4 i MC57G nie wyrażające epitopu E7. Komórki inkubowano przez 90 minut ze 150 μ^ Na2 51CrO4, zaś w przypadku EL4 również z 10 μg peptydu366-374 nukleoproteiny wirusa grypy na 106 komórek. Po intensyw3 nym płukaniu w celu usunięcia nadmiaru znacznika radioaktywnego, 5 x 103 znakowanych komórek docelowych hodowano wraz z pobudzonymi komórkami efektorowymi przy różnych stosunkach liczby komórek efektorowych do liczby komórek docelowych. Po 4-5 godzinach inkubacji, płytki hodowlane odwirowano przez 5 minut w 200 x g i 100 μg porcje nadsączu zawierającego znacznik radioaktywny pobrano z komórek do probówek Beckman Ready Caps. Radioaktywność mierzono zliczaniem impulsów scyntylacyjnych. W celu określenia radioaktywności spontanicznie uwolnionej i całkowitej radioaktywności, nadsącze z hodowli zawierających tylko komórki docelowe albo z komórek docelowych, podano lizie przez dodanie Triton X100, zaś radioaktywność określono jak wyżej. Wyniki wyrażono w % skorygowanej lizy, w oparciu o następujący wzór:
Procent poprawionej lizy = 100 x (cpmtest. - cpmspont.) / (cpmcałk. + cpmspont.) w którym cpmtest. oznacza radioaktywność uwolnioną z konkretnej hodowli, cpmspont. oznacza radioaktywność uwolnioną spontanicznie w hodowli komórek docelowych, zaś cpmcałk. oznacza radioaktywność uwolnioną pod wpływem lizy komórek docelowych przez Triton X-100.
Wyniki doświadczenia z użyciem komórek TC-1 jako komórek docelowych przedstawiono na fig. 5. 40% i 25% lizy komórek TC-1 zachodziło pod wpływem komórek efektorowych (zastosowanych jako 100-krotny nadmiar nad komórkami docelowymi) otrzymanych od zwierząt immunizowanych przy użyciu, odpowiednio, 200 μg i 20 μg białka fuzyjnego.
W drugim doświadczeniu, swoistość aktywności CTL badano przy użyciu splenocytów od zwierząt immunizowanych 20 μg białka fuzyjnego. Wyniki przedstawione na fig. 6 pokazują skuteczna lizę komórek TC-1 transformowanych E6/E7 HPV16. Liza dwóch innych rodzajów komórek (EL4 i MC57G) nie wyrażających antygenu HPV zachodziła ze znacznie mniejszym natężeniem, wskazując na swoistość reakcji CTL wywołanej przez immunizację białkami fuzyjnymi Hsp65-E6 i -E7.
P r z y k ł a d 8
Regresja guzów TC-1 u myszy po leczeniu białkiem fuzyjnym HSP65-E7
W doświadczeniu zastosowano 3 grupy po 8 myszy C57/B16. Każde ze zwierząt zaszczepiano podskórnie w ogoloną skórę grzbietu przy użyciu 1,3 x 105 komórek TC-1. Dwa dni później, pierwszej grupie podano roztwór soli (kontrola negatywna), drugiej grupie 100 μg/zwierzę białka fuzyjnego Hsp65-E7 w roztworze soli, zaś trzeciej grupie 100 μg/zwierzę peptydu E7 w roztworze soli i IFA (kontrola pozytywna). Wszystkie wstrzyknięcia (0,2 ml) podawano podskórnie w fałd skóry na karku. 14 dni później (16 dnia po zaszczepieniu nowotworu), wstrzyknięcia powtórzono. Począwszy od pierwszego
PL 196 805 B1 dnia po zaszczepieniu nowotworu, a następnie co dwa dni, myszy badano na obecność albo nieobecność guza obserwacją i palpacją.
Figura 7 wykazuje, że 9 dni po wszczepieniu guza wszystkie z grup wykazywały maksimum obecności guzów (wyrażone jako procent zwierząt niosących guzy), w zakresie od 85 do 100%. Jednakże, 17 dnia grupa leczona białkiem fuzyjnym Hsp65-E7, jak również grupa leczona peptydem E7 w IFA, wykazywały znaczne zmniejszenie występowania guzów, które zmniejszyło się do około 15%. W przeciwieństwie, grupa leczona roztworem soli wciąż wykazywała 100% obecności guzów. Wyniki te pokazują, że białko fuzyjne Hsp-E7 podawane bez adiuwantu, indukuje istotną regresję guzów wywołanych HPV.
Wyniki z podobnego doświadczenia przedstawiono na fig. 8. W tym doświadczeniu, zwierzęta zaszczepiono wyższą dawką komórek nowotworowych (2 x 105 komórek/zwierzę) niż w poprzednim doświadczeniu. Otrzymane wyniki są podobne do otrzymanych w poprzednim doświadczeniu.
P r z y k ł a d 9
Porównanie zdolności białka E7 i białka fuzyjnego HSP65-E7 do wywołania komórkowej reakcji odpornościowej
Białko fuzyjne Hsp65-E7 wytworzono i oczyszczono jak to opisano w przykładzie 4. Białko E7 HPV pełnej długości otrzymano według następującej procedury.
Gen E7 amplifikowano z genomowego DNA HPY16 (pSK/HPV16 otrzymanego z American Type Culture Collection) przy użyciu polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer). Starter „do przodu” (5'AACCCAGCTGCTAGCATGCATGGAGAT3') zawierał miejsce Nhel bezpośrednio powyżej kodonu start ATG, zaś starter wsteczny (5'AGCCATGAATTCTTATGGTTTCTG3') zawierał miejsce EcoRI bezpośrednio poniżej kodonu stop TAA sekwencji kodującej E7. Produkt PGR trawiono Nhel i EcoRI, oczyszczano z żelu agarozowego i poddano ligacji w pET28a, który trawiono tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Transformowanie bakterii, izolowanie kolonii zawierających rekombinanty i izolowanie plazmidowego DNA z namnożonych kolonii przeprowadzono standardowymi procedurami (patrz Ausubel i in. (red.), Short Protocols in Molecular Biology, wyd. 3, John Wiley and Sons, Inc. (1995)). Identyczność powstałego konstruktu plazmidowego pET/E7(H) potwierdzono trawieniem restrykcyjnym i analizą sekwencji DNA. Schematyczną mapę pET/E7(H) przedstawiono na fig. 9.
litrów pożywki 2 x YT zawierającej 30 μg/ml kanamycyny zaszczepiono hodowlą E. coli BL21 (DE3) zawierających pET/E7(H) i inkubowano przez noc w 30°C z napowietrzaniem. Gdy gęstość optyczna osiągnęła 0,5, hodowle indukowano 0,5 mM IPTG przez 3 godziny. Komórki zebrano przez odwirowanie, zawieszono w 180 ml buforu litycznego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM β-merkaptoetanol) wzbogaconego 200 μg/ml lizozymu i zamrożono w -70°C na noc. Zawiesinę komórkową rozmrożono w łaźni wodnej 37°C w obecności 2 μg/ml aprotyniny, 2 μg/ml leupeptyny i 2 μg/ml pepstatyny. Po dodaniu 2 mM PMSF zawiesinę poddano energicznej sonikacji, a nierozpuszczalne białka oddzielono przez wirowanie. Osad białka solubilizowano przez sonikację w buforze A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 M chlorowodorek guanidyny, 1 mM 2-merkaptoetanol), po czym nierozpuszczalny materiał usunięto przez wirowanie. Solubilizowane białka wprowadzono do 50 ml kolumny chelatującej Ni (2,6 cm x 12 cm; Pharmacia), którą zrównoważono buforem A. Związane białko płukano 5 objętościami buforu E (Bufor A z 2% Triton X-100) i fałdowano gradientem chlorowodorku guanidyny/chlorku sodu (0,1 M NaCl/6,0 M chlorowodorek guanidyny; 5 objętości kolumny) w obecności 1% Triton X-100. Fałdowane białko płukano 5 objętościami kolumny w buforze F (30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl, 15% gliceryna, 2% Triton X-100, 1 mM 2-merkaptoetanol), a następnie 5 objętościami kolumny buforem G (Bufor F bez Triton K-100) w celu usunięcia Triton X-100. Kolumnę dalej płukano 5 objętościami kolumny buforem H (50 mM imidazol, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 15% gliceryny, 1 mM 2-merkaptoetanol) w celu usunięcia słabo związanych białek. Białko E7 eluowano liniowym gradientem imidazolu (50 mM do 1M imidazol w buforze H). Białko E7 zatężano i dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem Dulbecco z dodatkiem 25% gliceryny. Rozpuszczalne białko przechowywano w -70°C. W oparciu o SDS-PAGE i barwienie stwierdzono, że preparat E7 był zasadniczo homogenny.
Stężenie endotoksyny w preparacie białka oceniono testem z amebocytami limulus i stwierdzono, że nie jest wyższe niż 50 jednostek endotoksyny ma miligram białka.
Grupy po 5 myszy C57BL/6 immunizowano przez wstrzyknięcie w podstawę ogona roztworu soli albo 0,055, 0,55, albo 1,8 nanmola białka E7, albo białka fuzyjnego Hsp65-E7 w roztworze soli. Objętość wstrzykiwana wynosiła 0,2 ml. 10 dni później od każdego zwierzęcia pobierano aseptycznie węzły chłonne pachwinowe (LN), po czym węzły chłonne od zwierząt danej grupy umieszczano w jednej puli. Zawiesiny komórkowe wytwarzano standardowymi metodami. Dla każdej puli komórek
PL 196 805 B1
LN (2 x 106 komórek/ml), wysiewano płaskodenną płytkę 96-studzienkową po 4 x 105 komórek/studzienkę. Komórki badano w potrójnym powtórzeniu pod względem reakcji proliferacyjnej po dodaniu pożywki, 10 albo 50 μg/ml białka E7, 10 albo 100 μg/ml białka fuzyjnego Hsp65-E7 albo 1 albo 10 μg/ml peptydu E7 („pep”; reszty 44-57). Po dodaniu, komórki inkubowano przez 4 dni w 37°C i 5% CO2. Do każdej hodowli dodano trytowaną tymidynę (1 μΩ). Po 15 godzinach dalszej inkubacji, komórki zebrano i przygotowano do zliczania scyntylacyjnego. Dane przedstawiono na fig. 10 jako średnią cpm radioaktywności włączonej ± odchylenie standardowe.
Różne panele pokazują testy z komórkami LN od zwierząt immunizowanych różnymi ilościami białka fuzyjnego Hsp65-E7 albo białka E7. Wyniki pokazują, że immunizacja białkiem fuzyjnym Hsp65-E7 wywołuje odporność komórkową przeciwko samemu białku fuzyjnemu (wykres górny i środkowy po lewej stronie), jak również przeciwko białku E7 (wykres środkowy po lewej stronie). W przeciwieństwie, nie obserwowano reakcji proliferacyjnej z komórkami LN immunizowanymi różnymi ilościami białka E7 (wykres środkowy i dolny po prawej stronie) albo immunizowanymi pozornie roztworem soli. Komórki izolowane ze zwierząt immunizowanych białkiem E7 były żywe, co wykazano ich zdolnością do proliferacji w reakcji na mitogen limfocytów T, ConA. Podsumowując, w porównaniu z immunizacją E7, immunizacja białkiem fuzyjnym Hsp65-E7 wywołuje silniejszą reakcję komórkową niż E7, co oceniono proliferacją komórek LN od zwierząt immunizowanych.
P r z y k ł a d 10
Traktowanie białkiem fuzyjnym HSP65-E7 powoduje regresję wielkości ustalonych guzów
W celu zbadania skuteczności białka fuzyjnego Hsp65-E7 w terapii nowotworów, myszy C57/BL/6 zaszczepiono 1,3 x 105 komórek TC-1 przez wstrzyknięcie podskórne w ogoloną skórę grzbietu. 7 dni później, gdy wszystkie zwierzęta rozwinęły mierzalne palpacją guzy, rozdzielono je do trzech grup leczenia. Każda grupa obejmowała 12-14 zwierząt. Wszystkie terapie podawano podskórnie, w objętości 0,2 ml, w fałd skóry na karku. Pierwszej grupie podawano 100 μg białka fuzyjnego Hsp65-E7, druga grupa otrzymywała 20 μg białka E7 (co odpowiadało podobnej molarnie ilości, co 100 μg białka fuzyjnego), zaś trzecia grupa otrzymywała roztwór soli. Począwszy od pierwszego dnia po wstrzyknięciu nowotworu, myszy badano wizualnie i przez palpację na obecność guza. Objętości guzów określano stosując pomiar w dwóch prostopadłych kierunkach. Z tych pomiarów wyliczano objętości stosując wzór opisany przez Naito i in., Cancer Res. 46: 4109 (1986). Wyniki przedstawiono na figurze 11 jako średnią objętości guza w każdej grupie ± błąd standardowy.
Wyniki pokazują, że leczenie białkiem fuzyjnym Hsp65-E7 powoduje całkowitą regresję mierzalnych guzów. Efekt ten zaznaczał się u każdego leczonego zwierzęcia. W przeciwieństwie, ani leczenie pozorne, ani leczenie białkiem E7 nie powodowało nic z wyjątkiem przejściowej regresji guzów. Badanie statystyczne pomiarów guzów, przeprowadzone w trzech punktach czasowych przedstawiono w tabeli 2.
Jak widać z obliczonych wartości p, wpływ na wielkość guza po leczeniu Hsp65-E7 jest statystycznie różny od efektów innego leczenia.
T a b e l a 2
Porównanie statystyczne grup leczenia
Porównanie Dzień pomiaru Wartość p
Roztwór soli względem Hsp65-E7 30 0,048
33 0,079
35 0,046
Roztwór soli względem E7 30 0,853
33 1
35 0,86
Należy zaznaczyć, że w poprzednich przykładach białko Hsp65-E7 zostało wytworzone jako białko znakowane znacznikiem histydynowym. W celu wykazania, że obserwowany efekt terapeutyczny nie jest związany z obecnością w białku fuzyjnym znacznika histydynowego, wytworzono białko fuzyjne Hsp65-E7 pozbawione znacznika histydynowego i zastosowano w tym przykładzie. Białko fuzyjne otrzymano stosując następującą procedurę.
PL 196 805 B1
W celu skonstruowania plazmidu ET65C (fig. 12), gen hsp65 Bacillus Calmette Guerin (BCG) amplifikowano z plazmidu RIB 1300 (Van Eden i in., Nature 331: 171, 1988) stosując polimerazę DNA AmpliTaq (Perkin Elmer). Zastosowany starter „do przodu” (5'TTCGCCATGGCCAAGACAATTGCG3') zawierał miejsce Ndel obejmujące kodon start ATG genu hsp65, zaś starter wsteczny (5'CGCTCGGACGCTAGCTCACATATGGAAATCCATGCC3') zawierał miejsce Ndel bezpośrednio poniżej kodonu stop TGA sekwencji kodującej Hsp65 i miejsce Nhel bezpośrednio poniżej. Produkt PGR trawiono Ncol i Nhel, oczyszczano na żelu agarozowym i poddawano ligacji z podobnie trawionym pET28a. Mieszaninę ligacyjną transformowano do DH5a E. coli, izolowano kolonie oporne na antybiotyk i amplifikowano w celu wyizolowania plazmidowego DNA. Plazmid ET65C zidentyfikowano trawieniem restrykcyjnym i analizą sekwencji DNA.
W celu wytworzenia plazmidu ET65C/E7-1N zawierającego gen nieznakowanego białka fuzyjnego Hsp65-E7, gen E7 amplifikowano z genomowego DNA HPY16 (pSK/HPV16 otrzymanego z American Type Culture Collection) przy użyciu polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer). Starter „do przodu” (5'CCAGCTGTACATATGCATGGAGAT3') zawierał miejsce Ndel, które obejmowało kodon start ATG, zaś starter wsteczny (5'AGCCATGAATTCTTATGGTTTCTG3') zawierał miejsce EcoRI bezpośrednio poniżej kodonu stop TAA sekwencji kodującej E7. Produkt PGR trawiono Ndel i EcoRI, oczyszczano z żelu agarozowego i poddano ligacji w pET65C, który trawiono tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Transformowanie bakterii, izolowanie kolonii zawierających rekombinanty i izolowanie plazmidowego DNA z namnożonych kolonii przeprowadzono standardowymi procedurami (patrz Ausubel i in. (red.), Short Protocols in Molecular Biology, wyd. 3, John Wiley and Sons, Inc. (1995)). Identyczność powstałego konstruktu plazmidowego pET65C/E7-lN potwierdzono trawieniem restrykcyjnym analizą sekwencji DNA. Schematyczną mapę pET65C/E7-lN przedstawiono na fig. 13.
litrów pożywki 2 x YT zawierającej 30 μg/ml kanamycyny zaszczepiono hodowlą E. coli BL21 (DE3) zawierających pET65C/E7-lN i inkubowano przez noc w 30°C z napowietrzaniem. Gdy gęstość optyczna osiągnęła 0,5, hodowle indukowano 0,5 mM IPTG przez 3 godziny. Komórki zebrano przez odwirowanie, zawieszono w 180 ml buforu litycznego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM β-merkaptoetanol) wzbogaconego 200 μg/ml lizozymu i zamrożono w -70°C na noc. Zawiesinę komórkową rozmrożono w łaźni wodnej 37°C w obecności 2 μg/ml aprotyniny, 2 μg/ml leupeptyny i 2 μg/ml pepstatyny. Po dodaniu 2 mM PMSF, zawiesinę poddano energicznej sonikacji, po czym nierozpuszczalne białko oddzielono przez wirowanie.
Stwierdzono, że większość nieznakowanego białka Hsp65-E7 znajduje się w fazie rozpuszczalnej. W celu usunięcia endotoksyny, do frakcji białek rozpuszczalnych dodano 1% Triton X-114 i schłodzono mieszaninę na lodzie (5 minut albo dłużej), po czym dokładnie wymieszano. Mieszaninę podgrzano przez 10 minut w 30°C łaźni wodnej, a następnie poddano wirowaniu w 24°C. Klarowny nadsącz (górną warstwę) przeniesiono do czystej probówki. Wirowanie powtórzono 3-4 razy w celu usunięcia resztek Triton X-114. Frakcję nadsączu poddano frakcjonowaniu siarczanem amonu. Białko fuzyjne odzyskano we frakcji 0-15% (wag./obj.) siarczanu amonu. Wytrącane białka rozpuszczono w buforze B (30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M mocznik, 1 mM EDTA, 1 mM 2-merkaptoetanol) i wprowadzono do 170 ml kolumny Source Q (3,5 cm x 20 cm, Pharmacia) zrównoważonej buforem B. Kolumnę płukano 3 objętościami kolumny buforem C (Bufor B bez mocznika), a następnie 3 objętościami kolumny buforem D (bufor C z dodatkiem 250 mM NaCl). Białko fuzyjne eluowano liniowym gradientem soli (250 mM - 1M NaCl w buforze C) (pula A), a następnie 6M chlorowodorkiem guanidyny (bufor A) (pula B). Pulę B wprowadzono do 50 ml kolumny chelatującej Ni (2,6 cm x 12 cm; Pharmacia), którą zrównoważono buforem A.
Związane białko płukano 5 objętościami kolumny buforem E (Bufor A z 2% Triton X-100) i fałdowano gradientem chlorowodorku guanidyny/chlorku sodu (0,1 M NaCl/6,0 M chlorowodorek guanidyny; 5 objętości kolumny) w obecności 1% Triton X-100. Fałdowane białko płukano 5 objętościami kolumny w buforze F (30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl, 15% gliceryna, 2% Triton X-100, 1 mM merkaptoetanol), a następnie 5 objętościami kolumny buforem G (Bufor F bez Triton X-100), w celu usunięcia Triton X-100.
Kolumnę dalej płukano 5 objętościami kolumny buforem H (50 mM imidazol, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 15% gliceryny, 1 mM 2-merkaptoetanol), w celu usunięcia słabo związanych białek. Białko E7 eluowano liniowym gradientem w imidazolu (50 mM do 1M imidazol w buforze H). Nieznakowane białko Hsp65-E7 zatężano i dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem Dulbecco z dodatkiem 25% gliceryny. Rozpuszczalne białko przechowywano w -70°C. Analiza SDS-PAGE i barwienie białka wykazały, że preparat był w 90% czysty.
PL 196 805 B1
W celu dalszego wykazania braku istotności znacznika histydynowego, skuteczność znakowanego histydyną białka fuzyjnego Hsp65-E7 i nieznakowanego białka fuzyjnego Hsp65-E7 porównano bezpośrednio w doświadczeniu zasadniczo identycznym jak opisane wyżej. Oba białka fuzyjne powodowały regresję nowotworów z podobną skutecznością.
Specjalista w dziedzinie rozpozna, albo będzie w stanie stwierdzić stosując jedynie rutynowe doświadczenia, liczne ekwiwalenty konkretnych wykonań opisanego niniejszym wynalazku. Zamierzone jest ujęcie tych i innych ekwiwalentów poniższymi zastrzeżeniami patentowymi.

Claims (131)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Białko fuzyjne obejmujące antygen ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) lub jego antygenową część oraz białko wstrząsu lub jego część, przy czym (i) antygen HPV jest białkiem E6 albo E7; (ii) białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) białko fuzyjne indukuje odpowiedź odpornościową wobec antygenu HPV u ssaka, któremu podaje się białko fuzyjne.
  2. 2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen HPV jest białkiem E6 lub E7 pełnej długości.
  3. 3. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen HPV jest nie transformującym wariantem białka E6 lub E7.
  4. 4. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70 pełnej długości.
  5. 5. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen HPV jest białkiem E6.
  6. 6. Białko fuzyjne według zastrz. 5, znamienne tym, że antygen HPV jest antygenem HPV typu 16.
  7. 7. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen HPV jest białkiem E7.
  8. 8. Białko fuzyjne według zastrz. 7, znamienne tym, że antygen HPV jest antygenem HPV typu 16.
  9. 9. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen HPV obejmuje epitop limfocytu T.
  10. 10. Białko fuzyjne według zastrz. 9, znamienne tym, że epitop limfocytu T jest epitopem CTL.
  11. 11. Białko fuzyjne według zastrz. 9, znamienne tym, że epitop limfocytu T jest epitopem limfocytów T pomocniczych.
  12. 12. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu ssaka.
  13. 13. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że białko wstrząsu jest bakteryjnym białkiem wstrząsu.
  14. 14. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu mykobakterii.
  15. 15. Białko fuzyjne według zastrz. 14, znamienne tym, że białkiem wstrząsu jest hsp65.
  16. 16. Białko fuzyjne według zastrz. 15, znamienne tym, że białkiem wstrząsu jest hsp65 M. bovis BCG.
  17. 17. Białko fuzyjne według zastrz. 14, znamienne tym, że białkiem wstrząsu jest hsp70.
  18. 18. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  19. 19. Białko fuzyjne według zastrz. 18, znamienne tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  20. 20. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  21. 21. Białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG oraz białko E7 otrzymane z HPV typu 16.
  22. 22. Białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E7 otrzymanego z HPV typu 16.
  23. 23. Białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG pełnej długości, resztę aminokwasową histydyny oraz białko E7 pełnej długości otrzymane z HPV typu 16, przy czym reszta histydyny znajduje się pomiędzy hsp65 M. bovis BCG a białkiem E7.
    PL 196 805 B1
  24. 24. Białko fuzyjne według zastrz. 23, znamienne tym, że białko hsp65 M. bovis BCG znajduje się na końcu aminowym białka fuzyjnego, a białko E7 znajduje się na końcu karboksylowym białka fuzyjnego.
  25. 25. Białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG pełnej długości, reszty aminokwasowej histydyny oraz białka E7 pełnej długości otrzymanego z HPV typu 16, przy czym reszta histydyny znajduje się pomiędzy hsp65 M. bovis BCG a białkiem E7.
  26. 26. Białko fuzyjne według zastrz. 25, znamienne tym, że białko hsp65 M. bovis BCG znajduje się na końcu aminowym białka fuzyjnego, a białko E7 znajduje się na końcu karboksylowym białka fuzyjnego.
  27. 27. Białko fuzyjne kodowane przez plazmid pET65C/E7-lN.
  28. 28. Białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG oraz białko E6 otrzymane z HPV typu 16.
  29. 29. Białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E6 otrzymanego z HPV typu 16.
  30. 30. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje białko fuzyjne określone w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, rozcieńczalnik lub podłoże.
  31. 31. Kompozycja według zastrz. 30, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant lub środek powierzchniowo czynny.
  32. 32. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje białko fuzyjne określone w zastrz. 24 oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, rozcieńczalnik lub podłoże.
  33. 33. Kompozycja według zastrz. 32, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant lub środek powierzchniowo czynny.
  34. 34. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje białko fuzyjne określone w zastrz. 26 oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, rozcieńczalnik lub podłoże.
  35. 35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant lub środek powierzchniowo czynny.
  36. 36. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje białko fuzyjne określone w zastrz. 27 oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, nośnik, rozcieńczalnik lub podłoże.
  37. 37. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant lub środek powierzchniowo czynny.
  38. 38. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne określone w zastrz. 1.
  39. 39. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że obejmuje ponadto wektor ekspresyjny.
  40. 40. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że antygen HPV jest białkiem E6 lub E7 pełnej długości.
  41. 41. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że antygen HPV jest nietransformującym wariantem białka E6 lub E7.
  42. 42. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70 pełnej długości.
  43. 43. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że antygen HPV jest białkiem E6.
  44. 44. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 43, znamienna tym, że antygen HPV jest antygenem HPV typu 16.
  45. 45. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że antygen HPV jest białkiem E7.
  46. 46. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 45, znamienna tym, że antygen HPV jest antygenem HPV typu 16.
  47. 47. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że antygen HPV obejmuje epitop limfocytu T.
  48. 48. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 47, znamienna tym, że epitop limfocytu T jest epitopem CTL.
  49. 49. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 47, znamienna tym, że epitop limfocytu T jest epitopem limfocytów T pomocniczych.
  50. 50. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu ssaka.
    PL 196 805 B1
  51. 51. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że białko wstrząsu jest bakteryjnym białkiem wstrząsu.
  52. 52. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu mykobakterii.
  53. 53. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 52, znamienna tym, że białkiem wstrząsu jest hsp65.
  54. 54. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 53, znamienna tym, że białkiem wstrząsu jest hsp65 M. bovis BCG.
  55. 55. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że białkiem wstrząsu jest hsp70.
  56. 56. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  57. 57. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 56, znamienna tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  58. 58. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 38, znamienna tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  59. 59. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 39, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor adenowirusowy lub wektor wirusa adenosatelitarnego (AAV).
  60. 60. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 39, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor retrowirusowy.
  61. 61. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne obejmujące hsp65 M. bovis BCG oraz białko E7 otrzymane z HPV typu 16.
  62. 62. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E7 otrzymanego z HPV typu 16.
  63. 63. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne określone w zastrz. 23.
  64. 64. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne określone w zastrz. 25.
  65. 65. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne określone w zastrz. 27.
  66. 66. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 63, znamienna tym, że ponadto obejmuje wektor ekspresyjny.
  67. 67. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 66, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor adenowirusowy lub wektor wirusa adenosatelitarnego (AAV).
  68. 68. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 66, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor retrowirusowy.
  69. 69. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 64, znamienna tym, że ponadto obejmuje wektor ekspresyjny.
  70. 70. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 69, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor adenowirusowy lub wektor wirusa adenosatelitarnego (AAV).
  71. 71. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 69, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor retrowirusowy.
  72. 72. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 65, znamienna tym, że ponadto obejmuje wektor ekspresyjny.
  73. 73. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 72, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor adenowirusowy lub wektor wirusa adenosatelitarnego (AAV).
  74. 74. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 72, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest wektor retrowirusowy.
  75. 75. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG oraz białko E6 otrzymane z HPV typu 16.
  76. 76. Cząsteczka kwasu nukleinowego składająca się z sekwencji kodującej białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E6 otrzymanego z HPV typu 16.
  77. 77. Zastosowanie białka fuzyjnego określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E6 lub E7.
  78. 78. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 39 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E6 lub E7.
    PL 196 805 B1
  79. 79. Zastosowanie według zastrz. 77, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  80. 80. Zastosowanie według zastrz. 79, znamienne tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  81. 81. Zastosowanie według zastrz. 77, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  82. 82. Zastosowanie białka fuzyjnego określonego w zastrz. 23 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E7.
  83. 83. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 63 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E7.
  84. 84. Zastosowanie według zastrz. 82, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  85. 85. Zastosowanie według zastrz. 84, znamienne tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  86. 86. Zastosowanie według zastrz. 82, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  87. 87. Zastosowanie białka fuzyjnego określonego w zastrz. 25 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E7.
  88. 88. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 64 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E7.
  89. 89. Zastosowanie według zastrz. 87, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  90. 90. Zastosowanie według zastrz. 89, znamienne tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  91. 91. Zastosowanie według zastrz. 87, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  92. 92. Zastosowanie białka fuzyjnego określonego w zastrz. 27 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E7.
  93. 93. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 65 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciwko białku E7.
  94. 94. Zastosowanie według zastrz. 92, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  95. 95. Zastosowanie według zastrz. 94, znamienne tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  96. 96. Zastosowanie według zastrz. 92, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  97. 97. Komórka obejmująca wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne obejmujące antygen HPV lub jego antygenową część oraz białko wstrząsu, lub jego część, przy czym (i) antygen HPV jest białkiem E6 albo E7; (ii) białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70; oraz (iii) białko fuzyjne indukuje odpowiedź odpornościową wobec antygenu HPV u ssaka, któremu podaje się białko fuzyjne.
  98. 98. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że antygen HPV jest białkiem E6 lub E7 pełnej długości.
  99. 99. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że antygen HPV jest nie transformującym wariantem białka E6 lub E7.
  100. 100. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu Hsp60 lub Hsp70 pełnej długości.
  101. 101. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że antygen HPV jest białkiem E6.
  102. 102. Komórka według zastrz. 101, znamienna tym, że antygen HPV jest antygenem HPV typu 16.
  103. 103. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że antygen HPV jest białkiem E7.
  104. 104. Komórka według zastrz. 103, znamienna tym, że antygen HPV jest antygenem HPV typu 16.
  105. 105. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że antygen HPV obejmuje epitop limfocytu T.
  106. 106. Komórka według zastrz. 105, znamienna tym, że epitop limfocytu T jest epitopem CTL.
    PL 196 805 B1
  107. 107. Komórka według zastrz. 105, znamienna tym, że epitop limfocytu T jest epitopem limfocytów T pomocniczych.
  108. 108. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu ssaka.
  109. 109. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że białko wstrząsu jest bakteryjnym białkiem wstrząsu.
  110. 110. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że białko wstrząsu jest białkiem wstrząsu mykobakterii.
  111. 111. Komórka według zastrz. 110, znamienna tym, że białkiem wstrząsu mykobakterii jest hsp65.
  112. 112. Komórka według zastrz. 111, znamienna tym, że białkiem wstrząsu mykobakterii jest hsp65 M. bovis BCG.
  113. 113. Komórka według zastrz. 110, znamienna tym, że białkiem wstrząsu mykobakterii jest hsp70.
  114. 114. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje komórkową odpowiedź odpornościową.
  115. 115. Komórka według zastrz. 114, znamienna tym, że komórkowa odpowiedź odpornościowa obejmuje cytolityczną odpowiedź komórkową.
  116. 116. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że odpowiedź odpornościowa obejmuje humoralną odpowiedź odpornościową.
  117. 117. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG oraz białko E7 otrzymane z HPV typu 16.
  118. 118. Komórka według zastrz. 117, znamienna tym, że białko fuzyjne składające się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E7 otrzymanego z HPV typu 16.
  119. 119. Komórka obejmująca wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne obejmujące białko hsp65 M. bovis BCG pełnej długości, resztę aminokwasową histydyny oraz białko E7 pełnej długości otrzymane z HPV typu 16, przy czym reszta histydyny znajduje się pomiędzy hsp65 M. bovis BCG a białkiem E7.
  120. 120. Komórka według zastrz. 119, znamienna tym, że białko hsp65 M. bovis BCG znajduje się na końcu aminowym białka fuzyjnego, a białko E7 znajduje się na końcu karboksylowym białka fuzyjnego.
  121. 121. Komórka według zastrz. 119, znamienna tym, że białko fuzyjne składa się z białka hsp65 M. bovis BCG pełnej długości, reszty aminokwasowej histydyny oraz białka E7 pełnej długości otrzymanego z HPV typu 16.
  122. 122. Komórka według zastrz. 121, znamienna tym, że białko hsp65 M. bovis BCG znajduje się na końcu aminowym białka fuzyjnego, a białko E7 znajduje się na końcu karboksylowym białka fuzyjnego.
  123. 123. Komórka obejmująca plazmid pET65C/E7-1N.
  124. 124. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że wektor ponadto obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą znacznik oligohistydynowy.
  125. 125. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że jest komórką bakteryjną.
  126. 126. Komórka według zastrz. 125, znamienna tym, że komórką bakteryjną jest komórka E. coli.
  127. 127. Komórka według zastrz. 97, znamienna tym, że białko fuzyjne obejmuje białko hsp65 M. bovis BCG oraz białko E6 otrzymane z HPV typu 16.
  128. 128. Komórka według zastrz. 127, znamienna tym, że białko fuzyjne składa się z białka hsp65 M. bovis BCG oraz białka E6 otrzymanego z HPV typu 16.
  129. 129. Sposób wytwarzania białka fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) dostarczenia komórki określonej w zastrz. 119; oraz (b) hodowania komórki w warunkach umożliwiających ekspresję białka fuzyjnego.
  130. 131. Sposób wytwarzania białka fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) dostarczenia komórki określonej w zastrz. 121; oraz (b) hodowania komórki w warunkach umożliwiających ekspresję białka fuzyjnego.
  131. 132. Sposób wytwarzania białka fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje etapy:
    (a) dostarczenia komórki określonej w zastrz. 123; oraz (b) hodowania komórki w warunkach umożliwiających ekspresję białka fuzyjnego.
PL338478A 1997-08-05 1998-03-20 Białko fuzyjne, kompozycja, cząsteczka kwasu nukleinowego, zastosowanie białka fuzyjnego, zastosowanie kwasu nukleinowego, komórka oraz sposób wytwarzania białka fuzyjnego PL196805B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5483597P 1997-08-05 1997-08-05
PCT/CA1998/000246 WO1999007860A1 (en) 1997-08-05 1998-03-20 Immune responses against hpv antigens elicited by compositions comprising an hpv antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL338478A1 PL338478A1 (en) 2000-11-06
PL196805B1 true PL196805B1 (pl) 2008-02-29

Family

ID=21993829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL338478A PL196805B1 (pl) 1997-08-05 1998-03-20 Białko fuzyjne, kompozycja, cząsteczka kwasu nukleinowego, zastosowanie białka fuzyjnego, zastosowanie kwasu nukleinowego, komórka oraz sposób wytwarzania białka fuzyjnego

Country Status (19)

Country Link
US (4) US6524825B1 (pl)
EP (1) EP1002110B2 (pl)
JP (2) JP4198315B2 (pl)
KR (2) KR100843109B1 (pl)
CN (3) CN1680451A (pl)
AT (2) ATE327259T1 (pl)
AU (1) AU6492498A (pl)
BR (1) BR9812272A (pl)
CA (1) CA2298840A1 (pl)
DE (2) DE69811087T2 (pl)
DK (1) DK1002110T3 (pl)
ES (2) ES2191929T3 (pl)
HK (2) HK1028981A1 (pl)
HU (1) HUP0003601A3 (pl)
IL (1) IL134341A0 (pl)
NZ (3) NZ538399A (pl)
PL (1) PL196805B1 (pl)
PT (2) PT1336621E (pl)
WO (1) WO1999007860A1 (pl)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69429723T2 (de) 1993-06-04 2002-09-26 Whitehead Institute For Biomedical Research, Cambridge Stressproteine und ihre verwendung
US7157089B1 (en) 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
ATE327259T1 (de) * 1997-08-05 2006-06-15 Stressgen Biotechnologies Corp Immunantwort gegen hpv antigene hervorgerufen von zusammensetzungen die ein hpv antigen und ein stressprotein enthalten oder einem expressionsvektor fähig zur expression dieser proteine
CA2378097A1 (en) 1999-07-08 2001-01-18 Stressgen Biotechnologies Corporation Induction of a th1-like response in vitro
US20050244434A1 (en) * 1999-08-12 2005-11-03 Cohen David I Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same
US20050226890A1 (en) * 1999-08-12 2005-10-13 Cohen David I Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same
AUPQ233799A0 (en) * 1999-08-19 1999-09-09 Minister For Agriculture, Minister For Land And Water Conservation For And On Behalf Of The State Of New South Wales Recombinant sub-unit vaccine
US20050100928A1 (en) * 1999-09-16 2005-05-12 Zycos Inc., A Delaware Corporation Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
JP2003510334A (ja) * 1999-09-30 2003-03-18 コリクサ コーポレイション 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
AU784605B2 (en) * 1999-10-20 2006-05-11 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
US8128922B2 (en) 1999-10-20 2012-03-06 Johns Hopkins University Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen
EP1253939B1 (en) 2000-01-14 2009-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo ctl elicitation by heat shock protein fusion proteins maps to a discrete atp binding domain and is cd4+ t cell-independent
AU2001261515A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-26 The Regents Of The University Of California Treatment of human papillomavirus (hpv)-infected cells
EP1296711B1 (en) * 2000-06-26 2006-05-17 Stressgen Biotechnologies Corporation Hpv-e7 for human papilloma virus treatment
AU2001278117A1 (en) 2000-08-03 2002-02-18 Johns Hopkins University Molecular vaccine linking an endoplasmic reticulum chaperone polypeptide to an antigen
CN100400099C (zh) * 2001-01-04 2008-07-09 北京迪威华宇生物技术有限公司 预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗
EP1363660A4 (en) * 2001-02-01 2006-06-21 Univ Johns Hopkins HIGHER MOLECULAR VACCINE BASED ON AUTOMPLICATIVE RNA, SUICIDE DNA OR UNDNA DNA VECTOR, WHICH LINKS ANTIGEN WITH A POLYPEPTIDE WHICH PROMOTES THE PRESENTATION OF THE ANTIGEN
US6921534B2 (en) * 2001-02-05 2005-07-26 Stressgen Biotechnologies Corporation Hepatitis B virus treatment
AUPR446801A0 (en) 2001-04-18 2001-05-17 University Of Queensland, The Novel compositions and uses therefor
KR100785397B1 (ko) * 2001-06-28 2007-12-13 아피메즈 주식회사 인체 파필로마 바이러스 유사 입자를 생산하는 재조합아데노바이러스 벡터 및 자궁경부암 생백신
KR100474114B1 (ko) * 2001-12-24 2005-03-08 대한민국 소 타일레리아병에 대한 면역원성이 증진된 융합단백질, 및 그의 제조방법 및 용도
WO2004062584A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Regents Of The University Of Colorado Therapeutic and prophylactic vaccine for the treatment and prevention of papillomavirus infection
US7211257B2 (en) * 2003-02-10 2007-05-01 Rosalind Franklin University Of Medicine And Science Methods for inducing apoptosis in ovarian carcinoma cells using an anti-regeneration and tolerance factor antibody
WO2004098526A2 (en) 2003-05-05 2004-11-18 Johns Hopkins University Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein
AU2004272972A1 (en) 2003-05-22 2005-03-24 Fraunhofer Usa, Inc. Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides
EP1670507A4 (en) 2003-09-12 2007-10-17 Antigenics Inc VACCINE FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF INFECTION CAUSED BY HERPES SIMPLEX VIRUS
US7304139B2 (en) * 2003-10-28 2007-12-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. Polynucleotides and polypeptides of Anaplasma phagocytophilum and methods of using the same
US7927580B2 (en) * 2004-03-16 2011-04-19 Nanirx, Inc. Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use
FR2868781B1 (fr) * 2004-04-13 2008-02-22 Immutep Composition de vaccin comprenant un ligand cmh de classe ii couple a un antigene, procede de preparation et utilisations
CN1727362B (zh) * 2004-07-30 2010-12-01 中国人民解放军第二军医大学 癌胚抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用
CN1769298B (zh) * 2004-11-05 2010-04-07 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用
CA2594040A1 (en) 2005-01-06 2006-07-13 The Johns Hopkins University Rna interference that blocks expression of pro-apoptotic proteins potentiates immunity induced by dna and transfected dendritic cell vaccines
CN1299769C (zh) * 2005-01-31 2007-02-14 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 人乳头瘤病毒和热休克蛋白重组蛋白疫苗及其用途
DE602006021408D1 (de) * 2005-04-27 2011-06-01 Univ Leiden Medical Ct Behandlung von hpv-induzierter intraepithelialer anogenitaler neoplasien
KR101446025B1 (ko) 2005-08-03 2014-10-01 아이바이오, 인크. 면역글로불린의 생산을 위한 조성물 및 방법
US9216212B2 (en) 2005-08-05 2015-12-22 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
US7951384B2 (en) * 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
WO2007038083A2 (en) * 2005-09-21 2007-04-05 New York University Heat shock proteins from mycobacterium leprae and uses thereof
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
US7972776B2 (en) * 2005-11-15 2011-07-05 Oncohealth Corporation Protein chips for HPV detection
EP1984388B1 (en) * 2006-02-13 2016-07-06 iBio, Inc. Hpv antigens, vaccine compositions, and related methods
AU2007215080A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antigens, vaccine compositions, and related methods
US8277816B2 (en) * 2006-02-13 2012-10-02 Fraunhofer Usa, Inc. Bacillus anthracis antigens, vaccine compositions, and related methods
MX2008015293A (es) * 2006-05-31 2009-03-13 Nventa Biopharmaceuticals Corp Composiciones bioactivas purificadas de hspe7.
CN100410382C (zh) * 2006-08-18 2008-08-13 上海交通大学医学院 一种可诱生细胞免疫应答的共表达载体和真核表达载体
US8968995B2 (en) * 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
AR064500A1 (es) * 2006-12-22 2009-04-08 Dow Agrosciences Llc Vacunas del virus west nile (wnv) de plantas, vectores y secuencias optimizadas de codones de plantas
US9085638B2 (en) 2007-03-07 2015-07-21 The Johns Hopkins University DNA vaccine enhancement with MHC class II activators
US20080311145A1 (en) * 2007-04-04 2008-12-18 Specigen, Inc. Protein cage immunotherapeutics
WO2008134643A2 (en) * 2007-04-28 2008-11-06 Fraunhofer Usa, Inc. Trypanosoma antigens, vaccine compositions, and related methods
WO2008154867A1 (en) * 2007-06-18 2008-12-24 Shanghai Zerun-Ankegens Biopharmaceutical Co., Ltd Material with immunogenicity
US8088392B2 (en) * 2007-06-18 2012-01-03 Yunxu Cao Capsid proteins and uses therefore
CA2692933C (en) 2007-07-11 2016-10-18 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
CU23674A1 (es) 2007-07-31 2011-05-27 Ct Ingenieria Genetica Biotech Péptidos penetradores a células fusionados a una biomolécula con acción terapéutica
WO2009026397A2 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Fraunhofer Usa, Inc. Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
EP2271361A1 (en) * 2008-04-16 2011-01-12 Université de Lausanne Method and vaccine for optimizing the specific immune responses
EP2285397B1 (en) * 2008-04-18 2017-07-19 The General Hospital Corporation Immunotherapies employing self-assembling vaccines
US8734803B2 (en) 2008-09-28 2014-05-27 Ibio Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
US8580270B2 (en) 2008-09-30 2013-11-12 University Of Massachusetts Respiratory synctial virus (RSV) sequences for protein expression and vaccines
BRPI1009215B1 (pt) 2009-03-23 2019-10-29 Nanirx Inc composição farmacêutica compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) e uso de um polipeptídeo derivado de tat para tratar câncer
EP2427763A4 (en) 2009-05-07 2013-08-21 Oncohealth Corp IDENTIFICATION OF HIGH GRADE OR CIN2 FOR DETECTION, MONITORING AND DIAGNOSIS, AT EARLY STAGES AND ADVANCED STAGES, OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) AND HPV ASSOCIATED CANCERS
US8784819B2 (en) 2009-09-29 2014-07-22 Ibio Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions and related methods
JP5819851B2 (ja) 2010-01-08 2015-11-24 オンコヘルス コーポレーション Ｈｐｖ関連の癌の治療及びスクリーニングのための細胞に基づいた高処理能力ｈｐｖ免疫アッセイ
CA2793838C (en) 2010-03-19 2019-09-17 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Integrin interaction inhibitors for the treatment of cancer
US20140155469A1 (en) 2011-04-19 2014-06-05 The Research Foundation Of State University Of New York Adeno-associated-virus rep sequences, vectors and viruses
EP2734231A1 (en) * 2011-07-21 2014-05-28 Biotech Tools S.A. Dosage of dnak
US9993534B2 (en) * 2013-03-12 2018-06-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of treating fungal infection
RU2537233C2 (ru) * 2013-03-26 2014-12-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова" (КБГУ) Применение комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот в качестве дополнения к стандартным методам терапии и способ лечения папилломавирус-ассоциированных предраковых заболеваний шейки матки и профилактики канцерогенеза при папилломавирусной инфекции
JP2016533352A (ja) 2013-10-04 2016-10-27 ピーアイエヌ ファーマ インコーポレイテッド 免疫刺激性ＨＩＶ Ｔａｔ誘導体ポリペプチドによる癌の治療
FR3011850B1 (fr) * 2013-10-15 2018-04-06 Cfl Biotech Vaccin therapeutique contre le cancer a base de proteines de stress rendues immunogenes
EP3270958A4 (en) * 2015-03-18 2018-11-14 Omnicyte Fusion proteins comprising modified alpha virus surface glycoproteins and tumor associated antigen and methods thereof
WO2017015504A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Scheibel Steven Frederick Treatment and prevention of anal conditions
CN108484776B (zh) * 2018-03-19 2019-11-05 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种融合蛋白、制备方法及其应用

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US550405A (en) * 1895-11-26 Island
GB8404280D0 (en) 1984-02-17 1984-03-21 Stanford J L Biological preparations
IL71683A0 (en) 1984-04-27 1984-09-30 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions for treating arthritis type diseases comprising fractions obtained from mycobacteria
US4906742A (en) 1986-07-31 1990-03-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Encoding antigens of M. Leprae
US6007806A (en) 1986-08-13 1999-12-28 Transgene S.A. Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor
NL8701163A (nl) 1986-09-09 1988-04-05 Nederlanden Staat Gebruik van een peptide voor de bereiding van preparaten voor het verlichten, het behandelen en de diagnose van autoimmuunziekten, in het bijzonder arthritische toestanden, verbindingen die met dit peptide verwant zijn, alsmede farmaceutische en diagnostische preparaten en testkits.
EP0345299A1 (en) 1987-02-02 1989-12-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Mycobacterium tuberculosis genes encoding protein antigens
US4952395A (en) 1987-02-26 1990-08-28 Scripps Clinic And Research Foundation Mycobacterial recombinants and peptides
WO1990015873A1 (en) 1989-06-19 1990-12-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Vector-mediated genomic insertion and expression of dna in bcg
US5504005A (en) 1987-03-02 1996-04-02 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Recombinant mycobacterial vaccine
US4918166A (en) 1987-04-10 1990-04-17 Oxford Gene Systems Limited Particulate hybrid HIV antigens
NL8703107A (nl) 1987-12-22 1989-07-17 Nederlanden Staat Polypeptiden en derivaten daarvan, alsmede de toepassing daarvan in farmaceutische en diagnostische preparaten.
CA1338778C (en) 1988-06-15 1996-12-10 Richard A. Young Stress proteins and uses therefor
US5114844A (en) 1989-03-14 1992-05-19 Yeda Research And Development Co., Ltd. Diagnosis and treatment of insulin dependent diabetes mellitus
GB8919321D0 (en) 1989-08-25 1989-10-11 Univ London Treatment of chronic inflammatory conditions
GB9007194D0 (en) 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
US5348945A (en) 1990-04-06 1994-09-20 Wake Forest University Method of treatment with hsp70
ES2104731T3 (es) 1990-11-08 1997-10-16 Univ London Micobacterium utilizado como adyuvante para antigenos.
GB9024320D0 (en) 1990-11-08 1990-12-19 Univ London Treatment of uveitis
GB2251186A (en) 1990-12-04 1992-07-01 Randall Neal Gatz Polypeptide for use in treatment of autoimmune disease
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
WO1993022343A1 (en) 1992-05-01 1993-11-11 The Rockfeller University Multiple antigen peptide system having adjuvant properties and vaccines prepared therefrom
GB9211736D0 (en) 1992-06-03 1992-07-15 Univ Cardiff Allergic treatment
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5736146A (en) 1992-07-30 1998-04-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them
JP2541081B2 (ja) * 1992-08-28 1996-10-09 日本電気株式会社 バイオセンサ及びバイオセンサの製造・使用方法
DE69429723T2 (de) 1993-06-04 2002-09-26 Whitehead Institute For Biomedical Research, Cambridge Stressproteine und ihre verwendung
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
US5997873A (en) 1994-01-13 1999-12-07 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes
US5750119A (en) 1994-01-13 1998-05-12 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer
US5961979A (en) 1994-03-16 1999-10-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Stress protein-peptide complexes as prophylactic and therapeutic vaccines against intracellular pathogens
IL109790A0 (en) * 1994-05-25 1994-08-26 Yeda Res & Dev Peptides used as carriers in immunogenic constructs suitable for development of synthetic vaccines
GB9419979D0 (en) 1994-10-04 1994-11-16 Medeva Holdings Bv Vaccine compositions
AUPN015794A0 (en) * 1994-12-20 1995-01-19 Csl Limited Variants of human papilloma virus antigens
WO1996026277A1 (en) * 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
IL123218A0 (en) * 1995-08-18 1998-09-24 Sloan Kettering Inst Cancer Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies
US5935576A (en) 1995-09-13 1999-08-10 Fordham University Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens
US5985270A (en) 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
WO1997010000A1 (en) 1995-09-13 1997-03-20 Fordham University Therapeutic and prophylactic methods using heat shock proteins
US5837251A (en) 1995-09-13 1998-11-17 Fordham University Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases
WO1997026910A2 (de) 1996-01-27 1997-07-31 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Tumorimpfstoff für die immuntherapie von malignen tumoren
US6130087A (en) 1996-10-07 2000-10-10 Fordham University Methods for generating cytotoxic T cells in vitro
JP4484969B2 (ja) 1996-11-26 2010-06-16 ヌベンタ バイオファーマスティカル コーポレイション ストレスタンパク質を含む組成物を使用する免疫応答
US6017540A (en) 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US5830464A (en) 1997-02-07 1998-11-03 Fordham University Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy
WO1998035705A1 (en) 1997-02-18 1998-08-20 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of heat shock proteins to deliver moieties into cells
ATE327259T1 (de) * 1997-08-05 2006-06-15 Stressgen Biotechnologies Corp Immunantwort gegen hpv antigene hervorgerufen von zusammensetzungen die ein hpv antigen und ein stressprotein enthalten oder einem expressionsvektor fähig zur expression dieser proteine
US6007821A (en) 1997-10-16 1999-12-28 Fordham University Method and compositions for the treatment of autoimmune disease using heat shock proteins
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
CA2378097A1 (en) * 1999-07-08 2001-01-18 Stressgen Biotechnologies Corporation Induction of a th1-like response in vitro

Also Published As

Publication number Publication date
KR100843109B1 (ko) 2008-07-02
CN1680451A (zh) 2005-10-12
DE69834671T2 (de) 2007-05-10
KR20010022637A (ko) 2001-03-26
EP1002110B2 (en) 2009-07-29
US20030148456A1 (en) 2003-08-07
HUP0003601A3 (en) 2003-03-28
NZ538399A (en) 2007-05-31
CA2298840A1 (en) 1999-02-18
HK1058367A1 (en) 2004-05-14
EP1002110B1 (en) 2003-01-29
EP1002110A1 (en) 2000-05-24
PT1002110E (pt) 2003-06-30
ES2266652T3 (es) 2007-03-01
BR9812272A (pt) 2000-07-18
AU6492498A (en) 1999-03-01
US20050037017A1 (en) 2005-02-17
JP4198315B2 (ja) 2008-12-17
JP2001512749A (ja) 2001-08-28
US6524825B1 (en) 2003-02-25
JP2006001939A (ja) 2006-01-05
NZ502568A (en) 2003-01-31
KR20060111731A (ko) 2006-10-27
HUP0003601A2 (hu) 2001-02-28
CN100489105C (zh) 2009-05-20
ATE231917T1 (de) 2003-02-15
US7262014B2 (en) 2007-08-28
DE69811087T2 (de) 2003-05-22
DE69834671D1 (de) 2006-06-29
DK1002110T3 (da) 2003-05-26
CN1270635A (zh) 2000-10-18
PT1336621E (pt) 2006-08-31
NZ522653A (en) 2005-03-24
IL134341A0 (en) 2001-04-30
PL338478A1 (en) 2000-11-06
US6900035B2 (en) 2005-05-31
HK1028981A1 (en) 2001-03-16
US20080050399A1 (en) 2008-02-28
DE69811087D1 (de) 2003-03-06
CN1915425A (zh) 2007-02-21
ES2191929T3 (es) 2003-09-16
WO1999007860A1 (en) 1999-02-18
ATE327259T1 (de) 2006-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4198315B2 (ja) Ｈｐｖ抗原およびストレスタンパク質またはこれらのタンパク質の発現が可能な発現ベクターを含む組成物によって誘起されるｈｐｖ抗原に対する免疫応答
US6797491B2 (en) Human papilloma virus treatment
JP4163253B2 (ja) 熱ショックタンパク質に基づくワクチンおよび免疫療法
AU779770B2 (en) Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins
EP1336621B1 (en) Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins
AU2005201826B2 (en) Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins
CZ2000422A3 (cs) Imunitní odpověď proti HPV antigenům vyvolaná prostředky obsahujícími HPV antigen a stresový protein nebo expresní vektor schopný exprese těchto proteinů
MXPA00001299A (en) Immune responses against hpv antigens elicited by compositions comprising an hpv antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20110320