CN100400099C - 预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和1至5个拷贝的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白，其中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的单拷贝多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的双单拷贝多肽具有SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。本发明的融合蛋白在应用于人体后可有效地预防和治疗前列腺癌。本发明还提供了编码这两种重组蛋白疫苗的基因。
Description
发明领域
本发明涉及一种基因工程重组蛋白疫苗，特别是涉及一种预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗。本发明还涉及编码这两种疫苗的基因。
发明背景
传统的前列腺癌治疗方法有手术、放射疗法、化学疗法、激素疗法等几种，但这些方法均各自具有局限性。
人前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)是表达在前列腺癌细胞的一种特异性抗原，已有人在研制治疗和预防人前列腺癌的PSA疫苗方面做了一些工作。如将PSA的基因克隆入哺乳动物细胞表达质粒制成了核酸疫苗，此疫苗在小鼠可诱导针对PSA的体液和细胞免疫(Kim JJ et al.Molecular and immunological analysis of genetic prostatespecific antigen(PSA)vaccine.Oncogene 1998 Dec 17；17(24)：3125-35)。还有人将重组PSA和类脂A(lipid A)的混合物以脂质体为载体制成的疫苗在前列腺癌患者诱导了PSA反应性T细胞(Meidenbauer N et al.Generation of PSA-reactive effector cells after vaccination with a PSA-basedvaccine in patients with prostate cancer.Prostate 2000 May 1；43(2)：88-100)。
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是人体杀伤肿瘤细胞的最高效的免疫细胞。任何一种激发机体抗肿瘤免疫的疫苗是否有效，决定于这种疫苗是否能激发肿瘤特异性CTL。外源性的蛋白类肿瘤抗原在免疫人体后，通常被抗原提呈细胞摄取、加工，进入MHC II类提呈途径，激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines by intracellularloading of gp96 with antigenic peptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)：69-74)，但不能有效激活肿瘤特异性的CTL的产生，因而不能产生有效的肿瘤预防和治疗作用。因此，赋予PSA特异性激活CTL的性质就成为研究以PSA为抗原的、预防和治疗前列腺癌疫苗的一个技术关键。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族。在免疫应答的过程中，热休克蛋白可表现如下三种基本的功能：1、协助抗原性物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞；2、在抗原提呈细胞中和加工处理的抗原物质相互作用使之进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性CTL；3、刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子。
近年的研究表明，HSP可使非共键结合的肿瘤抗原在抗原提呈细胞内加工后和MHC I类分子结合并提呈在其表面，有效地激活CTL去高效杀伤表达特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞。注射从自体肿瘤提取的热休克蛋白-抗原肽复合物可抑制荷瘤小鼠原发肿瘤的生长、降低肿瘤的转移率，延长荷瘤小鼠的生存时间(Tamura Y，Peng P，Liu K，Daou M，SrivastavaPK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shockprotein preparations.Science 1997 Oct 3；278(5335)：117-20)。用来源于前列腺肿瘤的热休克蛋白-肽复合物对小鼠的原发和转移的前列腺癌细胞有明显的生长抑制作用(Yedavelli SP，Guo L，Daou ME，Srivastava PK，Mittelman A，Tiwari RK.Preventive and therapeutic effect of tumor derivedheat shock protein，gp96，in an experimental prostate cancer model.Int J MolMed 1999 Sep；4(3)：243-8)。
发明内容
本发明的目的是提供一种卡介苗热休克蛋白65和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位融合形成的基因工程重组疫苗，它们对人前列腺癌有预防和治疗作用的。
本发明的另一个目的是提供两种编码本发明的疫苗的基因。
本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和1至5个拷贝的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白，其中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的单拷贝多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在本发明的重组蛋白疫苗中，卡介苗热休克蛋白65可以位于该融合蛋白的氨基端，人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位位于该融合蛋白的羧基端。
在本发明的重组蛋白疫苗中，所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的拷贝数可以为2，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
本发明的重组蛋白疫苗最好具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码本发明的重组蛋白疫苗的基因。该基因可以具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双单拷贝多肽分别连接于卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白(序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示)在进入人体后均可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)发动对表达PSA的人前列腺癌细胞的攻击和杀伤，因而对人前列腺癌有预防和治疗的作用。由于人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝多肽比人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽可提供更多的前列腺特异性抗原的抗原信息，因而可产生更强的免疫效果。
卡介苗热休克蛋白65是一种来源于卡介苗的蛋白质，它在和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝多肽或人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽形成融合蛋白后，可以协助它们进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并进入MHC I类途径加工提呈，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)对表达前列腺特异性抗原的人前列腺癌细胞进行攻击和杀伤。此外，卡介苗热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子，这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可激活细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
本发明的重组蛋白疫苗可通过已知的方法进行生产。
本发明的重组蛋白疫苗可通过皮下注射的方式给人接种，接种的剂量为100-500μg。为了加强效果，可进行2-3次的加强免疫。时间间隔可为2周-2月。
实施例1
获取结核杆菌65KD热休克蛋白(BCG HSP65)的编码基因
卡介苗结核杆菌来源于长春生物制品研究所。采用苏通马铃薯培养基培养卡介苗结核杆菌，培养的温度为37-39℃，生长出的卡介苗结核杆菌呈现干皱浅黄色的菌膜。收集菌膜，从中提取卡介苗结核杆菌基因组DNA。
提取结核杆菌基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells，9.16-9.22，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR方法自结核杆菌分离热休克蛋白65(HSP65)结构基因。采用的5′端引物序列为5′CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3′(SEQ IDNO：9)，3′端引物序列为5′GAA ATC CAT GCC ACC CAT3′(SEQID NO：10)。
所述PCR操作程序是：在一500(1微量离心管中加入下列试剂：模板cDNA 5μl(mmol/L)
10(PCR缓冲液(含氯化镁)5μl
dNTPs(10mmol/L)1μl
5′端和3′端引物(0.01mmol/L)各0.5μl
Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl
加去离子水至终体积50μl
混合后加入矿物油3滴
反应条件：94℃，30″；55℃，1′；72℃，2′，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。
采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)：5)。
按常规方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。
实施例2
构建卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽融合蛋白的基因
采用PCR方法合成HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的CTL细胞表位的融合基因，模板为结核杆菌65KD热休克蛋白(HSP)的编码基因(浓度为0.01pmol/L)，PCR引物的为，5′端引物序列为：5′CCATG GCC AAGACA ATT GCG3′(SEQ ID NO：11)，3′端引物的序列为：5′AAGCTTTTTAGTAACTTTCTGCGGGTGAACCTGAGCGCAAACGTCGTTAGAGATAACGTG CAGGTCAACGCACTGCAGTTTTTTCGGAGTCAG GAA GAA ATC CAT GCC ACC CAT GTC 3′(SEQ ID NO：12)。
反应条件为：94℃，30″；55℃，1′；72℃，2′，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。
用NcoI和HindIII在37℃消化PCR产物，时间为2小时。
消化产物琼经脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1(TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。
20(TAE缓冲液：0.8mol/L Tris base
0.4mol/L NaOAc
0.04mol/L Na2 EDTA
用冰醋酸调pH8.3。
在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带。将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下(多少？)，置-70℃冷冻15分钟，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。
将回收的PCR产物克隆入经限制性内切酶NcoI和HindIII消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游。
质粒DNA的消化反应：
1μg质粒DNA
1μl 10(缓冲液(见Promega Corporation产品说明书)。
1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)
1μl限制性内切酶HindIII(10单位/μl)
用双蒸水补齐至10μl
混合后37℃温育30-120分钟。
连接反应：
质粒DNA(0.5μg/μl)2μl
DNA插入片段(300ng/μl)5μl
10(连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μl
T4 DNA连接酶1μl
用双蒸水补齐至10μl
混合后置14-16℃水浴6-12小时。
将含HSP-65基因的重组pET-28a(+)质粒转化大肠杆菌。
感受态细胞的制备方法是：将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时)；将菌液冰浴2小时，然后2,500 Xg，4℃离心20分钟收集菌体；加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；1,800 Xg，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；按每份200ul分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。
转化的方法是：将200ul感受态细胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入3-5μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；
42℃ 45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；加入2ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；4,000 Xg离心10秒钟，弃上清，用200ul LB培养液重悬菌体；将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。
重组质粒冰冻保存于-20℃。含重组质粒的菌株在含20-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。
卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽融合蛋白的基因的测序(采用双脱氧末端终止法，具体方法见文献：于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)：5)结果表明，所得到的卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝多肽融合蛋白的基因和设计的完全一致。
实施例3构建人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝融合蛋白疫苗的基因
含EcoR1切点和Bgl II切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的构建：
采用5‘端特异性引物
[5’GCCGAGAATTCGAGCCTGAAGAGTTCCTGACTCCGAAAAAA3’
(SEQ ID NO：13)(含EcoR1切点)]和3端特异性引物
[5’GGGCGAGATCTACACAGCATGAATTTAGTAACTTTCTGCGG 3’
(SEQ ID NO：14)(含BglII切点)]，以人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝融合蛋白疫苗的基因为模板，做PCR放大，得到含EcoR1切点和Bgl II切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的DNA片段，其序列是：GCCGAGAATT CGAGCCTGAA GAG TTCCTGACTC CGAAAAAACT GCAGTGCGTTGACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAAAGTTACTAAA TTCATGCTGT GTAGATCTCGCCC(SEQ ID NO：15)
含BamH I切点和HindIII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的构建：
采用5‘端特异性引物
[5‘GCGTGGATCCGAGCCTGAAGAGTTCCTGACTCCGAAAAAA(SEQ ID NO：16)(含BamH I切点)]和3端特异性引物[5’CGCCGAAGCTTGCACAGCATGAATTTAGTAACTTTCTGCGG(SEQID NO：17)3’(含Bgl II切点)]，以人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝融合蛋白疫苗的基因为模板，做PCR放大，得到含含BamH I切点和HindIII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因的DNA片段，其序列是：GCGTGGATCCGAGCCTGAAGAG TTCCTGACTC CGAAAAAACTGCAGTGCGTTGACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAAAGTTACTAAA TTCATGCTGTGCAAGCTTCGGCG(SEQ ID NO：18)
将上述两个DNA片段分别克隆的到pMD18-T上，一种质粒含含EcoR1切点和Bgl II切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因，命名为pMD18-T-EcoR1 Bgl II，另一种质粒含BamH I切点和HindIII切点人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位单拷贝基因，命名为pMD18-T-BamH I HindIII。
将pMD18-T-EcoR1 Bgl II用Bgl II酶切消化，去磷酸化；将pMD18-T-BamH I HindIII用BamH I酶切消化。连接消化物，得到5‘端带EcoR1切点，3’端带HindIII切点的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝融合蛋白疫苗的基因片段，其序列是：
GAATTCGAGCCTGAAGAG TTCCTGACTC CGAAAAAACT GCAGTGCGTT 1680
1681 GACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAA AGTTACTAAA 1740
1741 TTCATGCTGT GTAGATCCGA GCCTGAAGAG TTCCTGACTC CGAAAAAACT GCAGTGCGTT 1800
1801 GACCTGCACG TTATCTCTAA CGACGTTTGC GCTCAGGTTC ACCCGCAGAA AGTTACTAAA 1860
1861 TTCATGCTGT GCAAGCTT(SEQ ID NO：19)
用将EcoR1和HindIII消化此片段，将其克隆入用EcoR1和HindIII双酶切消化的pET28-HSP65-P1质粒，此质粒的插入片段含卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位双拷贝融合蛋白疫苗的结构基因。将其转化大肠杆菌得克隆菌。
关于具体的实验操作和实施例2的相似。
实施例4
卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位多肽融合蛋白的基因的表达
将单菌落的细菌接种于50ml LB培养基中，于250ml三角烧瓶中，37C水浴震荡培养至OD600为0.6。加入IPTG使其终浓度为0.4mM，37C水浴震荡培养2-3小时。置三角烧瓶于冰上5分钟，4C离心5分钟(5000xg)。吸弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。
实施例5
卡介苗热休克蛋白65人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位多肽融合蛋白的纯化
将大肠杆菌细胞(3g湿重)于室温下解冻。组织经组织破碎器短暂匀浆后，重悬于20ml含0.2％脱氧胆酸钠(DOC)的缓冲液A。缓冲液A(1000ml)的配方是1mol/L Tris.HCL(pH7.9)50ml 50mmol/L，0.5mol/L EDTA 1ml，0.5mmol/L，5mol/L NaCL 10ml 50mmol/L，100％甘油50ml 5％。
用台式超声细胞破碎仪(SANYO，MSE SONIPREP 150)，设8个循环和50％的时间间隔，在冰浴中超声90秒破菌，搅拌10-20min。
加DOC，使终浓度为0.2％(即，加约240ul的20％脱氧胆酸钠(DOC)。混匀，静置10min。20％脱氧胆酸钠(DOC)贮存液应提前1天配制，配方为10g无水DOC，溶于水中，调体积至50ml。得粗制裂解物(A)。
13000rpm，4℃离心10min。轻轻倾出上清。
加18ml缓冲液A和2ml 20％DOC贮存液于包涵体沉淀。用组织破碎器充分重悬沉淀，室温下静置至少10分钟。将悬液于4℃离心10min，13000rpm，
加39.4ml缓冲液A和0.6ml 20％十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液(SKL净浓度为0.3％)。剧烈搅动使沉淀慢慢溶解。静置至少30分钟。十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液的配制方法是：10g无水十二烷基肌氨酸钠(SKL)，溶于H2O中，调体积至50ml。
将悬液于4℃离心10min，13000rpm。用缓冲液A+0.3％ SKL稀释溶解的蛋白质使其浓度为1mg/ml。用缓冲液A将溶解的蛋白质稀释10倍，使其浓度为0.1mg/ml，SKL的终浓度为0.03％。
在4℃溶解的蛋白质制备物(体积约为400ml)对缓冲液A(体积约为4000ml)透析8小时，同时充分搅拌。然后换新鲜缓冲液并重复。
从透析袋(口径1cm)中移出经透析的蛋白质溶液，4℃、8000rpm离心20min，去除所有的的聚集物。留取上清，做镊-Saphrose-4-B层析分离HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的T细胞表位的融合基因融合蛋白。
采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gelelectrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)。鉴定HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的T细胞表位的基因融合蛋白的纯度，纯度为：98％。
实施例6
一、抑制小鼠前列腺癌细胞生长实验
1、材料
C2细胞(美国ATCC)：表达前列腺限制的SV40 T抗原，可在小鼠形成自发性的原位实体肿瘤(Eugene D.Kwon，et al.Elimination ofresidual metastatic prostate cancer after surgery and adjunctive cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4(CTLA-4)blockade immunotherapy.PNAS，vol.96，26，15074-15079，Dec 21，1999)。将人PSA的全编码cDNA稳定转染C2细胞得到PSA-C2细胞，此细胞即可在小鼠形成自发性的原位实体肿瘤基因也可表达人PSA。
2、实验动物：6-8周的雄性C57BL/6小鼠(吉林大学医学部实验动物中心)，疫苗组和对照组各20只。
3、实验方法
1)采用DMEM培养基培养C2细胞和PSA-C2细胞。在注射之前，用无血清DMEM将细胞洗三次。每只小鼠注射2.5(106个C2细胞或PSA-C2细胞，注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下。在6周以后，测量小鼠肿瘤块基底部的面积。
2)在接种肿瘤30天前和15天前，疫苗组分别腹腔注射100微克结核杆菌热休克蛋白-人前列腺特异性抗原融合蛋白基因工程疫苗；对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水。
4、实验结果及结论
动物肿瘤块基底部面积的平均值：疫苗组为53mm2，对照组为250mm2。注射后6周测量。
表明所实验药物能明显抑制自发性前列腺肿瘤的生长。
二、清除残存前列腺癌细胞实验
1、材料：C2细胞
2、实验动物：6-8周的雄性C57BL/6小鼠，疫苗组和对照组各20只
3、实验方法
1)采用DMEM培养基培养C2细胞和PSA-C2细胞。在注射之前，用无血清DMEM将细胞洗三次。每只小鼠注射2.5(106个C2细胞或PSA-C2细胞，注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下。在6周以后，用外科手术的方法切除肿块。在切除肿块后的21天处死小鼠，测量小鼠复发肿瘤块基底部的面积。
2)在手术后的第4、7和10天，疫苗组分别腹腔注射100微克结核杆菌热休克蛋白-人前列腺特异性抗原融合蛋白基因工程疫苗；对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水。
4、实验结果及结论
动物肿瘤块基底部面积的平均值：疫苗组为36mm2，对照组为252mm2。表明该受试药物能明显清除残存前列腺癌细胞。
序列表
<110>北京迪威华宇生物技术有限公司
<120>预防和治疗人前列腺癌的重组蛋白疫苗
<130>I2001290
<160>19
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>90
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(90)
<223>
<400>1
ttc ctg act ccg aaa aaa ctg cag tgc gtt gac ctg cac gtt atc tct 48
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser
1 5 10 15
aac gac gtt tgc gct cag gtt cac ccg cag aaa gtt act aaa 90
Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys
20 25 30
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser
1 5 10 15
Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys
20 25 30
<210>3
<211>210
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Recombinant Gene
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(210)
<223>
<400>3
ttc ctg act ccg aaa aaa ctg cag tgc gtt gac ctg cac gtt atc tct 48
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser
1 5 10 15
aac gac gtt tgc gct cag gtt cac ccg cag aaa gtt act aaa ttc atg 96
Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met
20 25 30
ctg tgt aga tcc gag cct gaa gag ttc ctg act ccg aaa aaa ctg cag 144
Leu Cys Arg Ser Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln
35 40 45
tgc gtt gac ctg cac gtt atc tct aac gac gtt tgc gct cag gtt cac 192
Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His
50 55 60
ccg cag aaa gtt act aaa 210
Pro Gln Lys Val Thr Lys
65 70
<210>4
<211>70
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Recombinant Gene
<400>4
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser
1 5 10 15
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aagcttttta gtaactttct gcgggtgaac ctgagcgcaa acgtcgttag agataacgtg 60
caggtcaacg cactgcagtt ttttcggagt caggaagaaa tccatgccac ccatgtc 117
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>13
gccgagaatt cgagcctgaa gagttcctga ctccgaaaaa a 41
<210>14
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>14
gggcgagatc tacacagcat gaatttagta actttctgcg g 41
<210>15
<211>136
<212>DNA
<213>Artificial
<400>15
gccgagaatt cgagcctgaa gagttcctga ctccgaaaaa actgcagtgc gttgacctgc 60
acgttatctc taacgacgtt tgcgctcagg ttcacccgca gaaagttact aaattcatgc 120
tgtgtagatc tcgccc 136
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<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>16
gcgtggatcc gagcctgaag agttcctgac tccgaaaaaa 40
<210>17
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>17
cgccgaagct tgcacagcat gaatttagta actttctgcg g 41
<210>18
<211>135
<212>DNA
<213>Artificial
<400>18
gcgtggatcc gagcctgaag agttcctgac tccgaaaaaa ctgcagtgcg ttgacctgca 60
cgttatctct aacgacgttt gcgctcaggt tcacccgcag aaagttacta aattcatgct 120
gtgcaagctt cggcg 135
<210>19
<211>246
<212>DNA
<213>Artificial
<400>19
gaattcgagc ctgaagagtt cctgactccg aaaaaactgc agtgcgttga cctgcacgtt 60
atctctaacg acgtttgcgc tcaggttcac ccgcagaaag ttactaaatt catgctgtgt 120
agatccgagc ctgaagagtt cctgactccg aaaaaactgc agtgcgttga cctgcacgtt 180
atctctaacg acgtttgcgc tcaggttcac ccgcagaaag ttactaaatt catgctgtgc 240
aagctt 246
Claims (5)
1.一种重组蛋白疫苗，它具有卡介苗热休克蛋白65和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白，其中所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，卡介苗热休克蛋白65位于该融合蛋白的氨基端，所述人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位多肽位于该融合蛋白的羧基端。
2.按照权利要求1的重组蛋白疫苗，其中所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
3.按照权利要求1的重组蛋白疫苗，其中所述的融合蛋白具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
4.一种基因，其编码具有卡介苗热休克蛋白65和人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位相连接而形成的融合蛋白，其中所述的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，卡介苗热休克蛋白65位于该融合蛋白的氨基端，所述人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位多肽位于该融合蛋白的羧基端。
5.按照权利要求4的基因，其具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的序列。
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