JP2003510334A - 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法 - Google Patents

癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法

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Abstract

(57)【要約】 ストレスタンパク質複合体およびこのような複合体をコードする関連分子またはこのような分子を提示する細胞を含む薬学的組成物が提供される。ストレスタンパク質複合体は、免疫原性ポリペプチドと複合体化されたhsp110またはgrp170ポリペプチドを含む。ストレスタンパク質複合体の免疫原性ポリペプチドは癌または感染症に関連し得る。本発明の薬学的組成物は被検体に投与することができ、それにより、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)感染を阻害する方法、腫瘍増殖を阻害する方法、癌の発生を阻害する方法、および感染症を治療または予防する方法が提供される。本発明は、T細胞を、hsp110またはgrp170ポリペプチドおよび腫瘍またはヒト型結核菌感染細胞に関連する免疫原性ポリペプチドを提示するように改変されたAPCと接触させる、腫瘍細胞またはヒト型結核菌感染細胞に向かうT細胞を産生する方法をさらに提供する。この方法により産生されるT細胞およびこのようなT細胞を含む薬学的組成物が本発明に含まれる。ヒト型結核菌感染細胞を殺傷する方法において、前記のT細胞とヒト型結核菌感染細胞を接触させることができ、または腫瘍細胞を殺傷する方法において、前記のT細胞と腫瘍細胞を接触させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本明細書は、米国仮出願である1999年9月30日に出願された第60/156,821号、1
999年11月2日に出願された第60/163,168号、及び2000年6月30日に出願された第6
0/215,497号の恩典を請求するものであり、それら各々の内容全体が本明細書に
参照として組入れられている。本明細書を通じて、様々な文献が参照される。こ
れらの文献の内容は、本発明が属する技術分野の状況をより十分に説明するため
に、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】 本明細書に開示された発明は、米国の国立衛生研究所(NIH)の基金第GM 45994
号の支援の下で行われた研究の一環である。米政府は、本発明に対し一定の権利
を有する。
【０００３】技術分野 本発明は概して、癌及び感染症の予防及び治療に関する。本発明はより詳細に
述べると、免疫原性ポリペプチドに複合された、熱ショックタンパク質110(hsp1
10)又はグルコース調節タンパク質170(grp170)のようなストレスタンパク質の少
なくとも一部を含むポリペプチド、並びにこのようなストレスタンパク質及び免
疫原性ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに加え、ストレスタンパ
ク質及び免疫原性ポリペプチドを提示する抗原提示細胞に関する。このようなポ
リペプチド、ポリヌクレオチド及び抗原提示細胞は、癌及び感染症の予防及び治
療のためのワクチン及び薬学的組成物において使用することができる。本発明は
更に、加熱などによるストレスタンパク質複合体の効力の増強に関する。
【０００４】発明の背景 癌及び感染症は、世界中で重大な健康上の問題である。これらの疾患の検出及
び治療において進展が見られるが、予防又は治療のためのワクチンもしくは他の
万能の方法は現時点で利用することができない。一般に化学療法又は手術及び放
射線療法の組合せを基にした現在の療法は、多くの患者において不適切であるこ
とが証明され続けている。
【０００５】 例えば、原発性乳癌は、外科的切除により効率良く治療されることが多い。し
かし更に疾患が再発した場合、追加療法の選択肢には制限があり、かつ全身疾患
の治療の効果的手段はない。自家腫瘍に対する免疫応答が認められるものの、こ
れらは疾患の管理には効力がない。更なる抗腫瘍反応を刺激するための努力が、
ワクチンに有用な腫瘍抗原の同定に向けられている。これに関連する方法は、熱
ショックタンパク質、例えばhsp70の雑多なペプチド結合特性を利用している。
これらの分子シャペロンは、ペプチドに結合し、かつ多くのタンパク質フォール
ディング、輸送及び集成法に関連し、かつMHC複合体の抗原提示経路に関連して
いる可能性がある。
【０００６】 哺乳類細胞の熱ショックタンパク質は、関連するタンパク質の配列のいくつか
のファミリーに分類することができる。タンパク質発現レベルを基にした主な哺
乳類hspsは、質量(およそ)25kDa(hsp25)、70kDa(hsp70)、90kDa(hsp90)及び110k
Da(hsp110)である細胞質／核タンパク質である。しかしhspsに加え、ストレスタ
ンパク質の第2のセットは、小胞体(ER)に局在している。これらのストレスタン
パク質の誘導は、hspsのように高温ストレスに容易に反応しないが、ERの機能を
妨害するようなストレス(例えば、グルコース飢餓及びグリコシル化の阻害、無
酸素状態、及び還元状態、又はカルシウムホメオスタシスを妨害する特定の物質
)により調節される。これらのストレスタンパク質は、グルコース調節タンパク
質(grps)と称される。主なgrpsは、発現を基に、近似サイズ78kDa(grp78)、94kD
a(grp94)、及び170kDa(grp170)を有する。grp78は、細胞質hsp70と相同性を有し
、一方grp94はhsp90と相同性を有する。
【０００７】 数年来個々のストレスタンパク質について研究されているが(例えばhsp70のよ
うに、場合によっては集中的に研究されている)、前述のhsp及びgrp群の最大で
ある、hsp110及びgrp170はほとんど注目されていない。両者とも、配列解析によ
り、hsp70ファミリーの巨大かつ高度に多様な関係物を示していることがわかっ
た。hsp70ファミリー、hsp110ファミリー、及びgrp170ファミリーは、共通の進
化の起源を共有している真核細胞の3種の識別可能なストレスタンパク質群を含
むことが認められた。(明らかに)全ての真核細胞の細胞質中のhsp70に平行したh
sp110の存在及びER中のgrp78に平行したgrp170の存在は、これらの疎遠な関係の
タンパク質ファミリーの重要な他と異なる機能について議論がある。しかし全て
のストレスタンパク質が、ワクチンとして機能するわけではなく、かつ異なるも
のは異なる活性を示すであろうと予想することができる。
【０００８】 感染症及び癌の療法に関する膨大な研究にもかかわらず、これらの疾患は効率
的診断及び治療に困難を留めている。従って、当技術分野において、癌及び感染
症を治療するための改善された方法が必要である。本発明は、これらの必要性を
満たし、かつ更にその他の関連した利点を提供するものである。
【０００９】発明の概要 本発明は、ストレスタンパク質複合体を含有する薬学的組成物を提供する。こ
のストレスタンパク質複合体は、hsp110又はgrp170ポリペプチド及び免疫原性ポ
リペプチドを含む。一部の態様において、hsp110又はgrp170ポリペプチドは、例
えば非共有結合型相互作用によるか又は共有結合型相互作用により、免疫原性ポ
リペプチドと複合され、これは融合タンパク質を含む。一部の態様において、こ
の複合体は腫瘍に由来している。別の態様において、この複合体は感染性物質に
感染した細胞に由来している。ストレスタンパク質複合体の免疫原性ポリペプチ
ドは、癌又は感染症に関連することができる。本発明のストレスタンパク質複合
体は更に、hsp70、hsp90、grp78及びgrp94ストレスタンパク質ファミリーの構成
要員を含む、追加のストレスポリペプチドを含むことができる。ある態様におい
て、このストレスタンパク質複合体は、hsp70及び／又はhsp25に複合されたhsp1
10を含む。
【００１０】 本発明は更に、hsp110又はgrp170ポリペプチドをコードしている第1のポリヌ
クレオチド及び免疫原性ポリペプチドをコードしている第2のポリヌクレオチド
を含有する薬学的組成物を提供する。第一及び第2のポリペプチドに関連してい
る一部の態様において、第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチドに連
結されている。本発明の薬学的組成物は更に、生理的に許容される担体及び／又
はアジュバントを含有することができる。効力のある薬学的組成物は更に、GM-C
SF-分泌細胞も含む。あるいは、GM-CSF-分泌細胞は、薬学的組成物の投与前、投
与中又は投与後に投与することにより、本発明の薬学的組成物と同時投与するこ
とができる。GM-CSF-分泌細胞の使用は、薬学的組成物の効力を増大する。
【００１１】 一部の態様において、前述の複合体は、腫瘍から又は感染性物質により感染し
た細胞から精製される。このような態様において、精製されたストレスポリペプ
チドは、1種以上の免疫原性ポリペプチドと複合される。ストレスポリペプチド
の免疫原性ポリペプチドへの結合は、ストレス、例えば熱への曝露、無酸素状態
及び／又は虚血状態、もしくはタンパク毒素によるストレスなどにより、変更及
び／又は増強することができる。特に、本発明のストレスタンパク質複合体は、
免疫原性ポリペプチドと複合されたストレスポリペプチドを含むことができ、こ
こでこの複合体は加熱されている。このような加熱は、特にストレスポリペプチ
ドが熱誘導ストレスタンパク質を含む場合に、ストレスタンパク質複合体のワク
チンとしての効力を増強する。熱誘導性ストレスタンパク質の例は、hsp7O及びh
sp110を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１２】 一部の態様において、免疫原性ポリペプチドが公知である。免疫原性ポリペプ
チドが公知の分子である場合、この免疫原性ポリペプチドは、ストレスポリペプ
チドとの混合物として、又はストレスポリペプチドとの複合体として提供するこ
とができる。hsp110又はgrp170ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドと、非共
有結合により複合され得る。あるいは、この複合体は、融合タンパク質を含むこ
とができ、ここでこのストレスポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドに連結さ
れている。免疫原性ポリペプチドの例は、癌又は感染症に関連する抗原、例えば
乳癌抗原her2/neu又はヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原Mtb8.4
及びMtb39などを含むが、これらに限定されるものではない。免疫原性ポリペプ
チドが不明である場合、これは癌又は感染症の被験者の組織からのストレスポリ
ペプチドの精製に不随して得ることができる。
【００１３】 同じくhsp110又はgrp170ポリペプチド及び免疫原性ポリペプチドを提示するよ
うに修飾された抗原提示細胞(APC)を含有する薬学的組成物も提供される。ある
いは、APCは、癌細胞及び感染性物質に感染した細胞を含む疾患細胞からのhsp11
0又はgrp170の精製により得られた免疫原性ポリペプチドを提示するように修飾
することができる。好ましくは、APCは、樹状細胞又はマクロファージである。A
PCは、ペプチド負荷及び免疫原性ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドによるトランスフェクションを含むが、これらに限定されるものではない様々
な手段により修飾することができる。
【００１４】 本発明の薬学的組成物は、被験者に投与することができ、これによりヒト型結
核菌感染症を阻害し、腫瘍増殖を阻害し、癌の発症を阻害し、及び癌又は感染症
を治療又は予防する方法が提供される。
【００１５】 更に本発明は、腫瘍細胞に対するＴ細胞を産生する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を抗原提示細胞(APC)と接触させる段階を含み、ここでAPCは、hsp110
又はgrp170ポリペプチド及び腫瘍細胞に関連する免疫原性ポリペプチドを提示す
るように修飾される。このようなＴ細胞は、腫瘍細胞死滅の方法において使用す
ることができ、ここで腫瘍細胞はＴ細胞と接触される。同様に本発明は、ヒト型
結核菌感染細胞に対するＴ細胞を産生する方法を提供し、ここでＴ細胞は、hsp1
10又はgrp170ポリペプチド及びヒト型結核菌感染細胞に関連する免疫原性ポリペ
プチドを提示するように修飾されたAPCと接触される。本発明は、本方法により
産生されたＴ細胞、並びにこのようなＴ細胞を含有する薬学的組成物を含む。Ｔ
細胞は、ヒト型結核菌感染細胞を死滅する方法において、ヒト型結核菌感染細胞
と接触させることができる。Ｔ細胞は、CD4+又はCD8+であることができる。
【００１６】 本発明は更に、生体試料から腫瘍細胞を除去する方法を提供する。この方法は
、生体試料を、本発明のＴ細胞と接触させる段階を含む。好ましい態様において
、生体試料は、血液又はその画分である。更に、被験者において腫瘍増殖を阻害
する方法も提供される。この方法は、抗原提示細胞(APC)を伴う被験者から単離
されたCD4+及び／又はCD8+ Ｔ細胞をインキュベーションする段階を含み、ここ
でAPCは、hsp110又はgrp170ポリペプチド及び腫瘍細胞に関連する免疫原性ポリ
ペプチドを提示するように修飾され、Ｔ細胞を増殖する。この方法は更に、有効
量の増殖したＴ細胞を被験者に投与し、これにより被験者における腫瘍増殖を阻
害することを含む。別の態様において、被験者における腫瘍増殖を阻害する方法
は、抗原提示細胞(APC)を有する被験者から単離されたCD4+及び／又はCD8+ Ｔ細
胞をインキュベーションする段階、ここでAPCは、hsp110又はgrp170ポリペプチ
ド及び腫瘍細胞に関連する免疫原性ポリペプチドを提示するように修飾され、Ｔ
細胞を増殖し、少なくとも1種の増殖した細胞をクローニングし、かつクローン
化されたＴ細胞を有効量患者に投与し、これにより被験者における腫瘍増殖を阻
害することを含む。
【００１７】発明の詳細な説明 本発明は、ストレスタンパク質hsp110及びgrp170は、腫瘍抗原と複合された場
合に、抗腫瘍ワクチンとして著しく有効であるという発見を基にしている。これ
らのストレスタンパク質複合体の効力は、予防的状況及び治療的状況の両方にお
いて明らかにされている。これらのストレスタンパク質の効果的免疫応答を促進
する能力の発見は、癌及び感染症の予防及び治療における使用のための様々な抗
原の提示におけるそれらの用途の基本を提供している。Hsp110及びgrp170は両方
とも拡大された(enlarged)ペプチド結合クレフト(peptide binding cleft)を有
し、かつhsp70と比べより効果的に伸びた(unforded)ペプチド鎖を安定化するこ
とができるので、これらの分子は、先に得られたものとは異なる免疫学的反応を
誘起することができる。
【００１８】ストレスタンパク質hsp110及びgrp170の概略 ほとんどの細胞タンパク質の発現は、突然の温度上昇に曝された哺乳類細胞に
おいて顕著に低下されるが、熱ショックタンパク質は、これらの条件下で発現増
加を示す。様々なストレッサーに反応して生じた熱ショックタンパク質は、非天
然の状態(例えば、熱又は塩化グアニジン処理により)で他のタンパク質に結合す
る能力を有し、特にリボソームから遊離するか又は小胞体から押出されているよ
うな新生ペプチドに結合する能力を有する(Hendrick及びHartl、Ann. Rev. Bioc
hem.、62:349-384(1993)；Hartl、Nature、381:571-580(1996))。熱ショックタ
ンパク質は更に、細胞質、小胞体及びミトコンドリア内のタンパク質の適切なフ
ォールディング及び集成における重要な役割を意味するシャペロン機能に役立つ
ことも示されている(Frydmanら、Nature、370:111-117(1994))。
【００１９】 哺乳類の熱ショックタンパク質ファミリーは、hsp28、hsp70、hsp90及びhsp11
0を含む。これらの主な熱ショックタンパク質は、細胞質において発見されてお
り、かつより少ない量が核において発見されている。ストレスタンパク質の別の
セットで、グルコース調節タンパク質(grp)として知られているものは、小胞体
中に存在する。グルコース調節タンパク質の主要ファミリーは、grp78、grp74、
grp170を含む。この範疇のストレスタンパク質は、それらのプロモーター中に、
熱ショック要素を欠いており、かつ熱により誘導されないが、他のストレス条件
、例えば無酸素症などにより誘導される。
【００２０】 Hsp110は、豊富かつ強力な誘導可能な哺乳類の熱ショックタンパク質である。
ヒトhsp110は、KIAA0201、NY-CO-25、HSP105α及びHSP105βとしても公知である
。マウスのhsp110も、HSP105α、HSP105β、42℃特異性熱ショックタンパク質、
及びhsp-E7Iとして公知である。Hsp110は、hsp70と比べてより大きいサイズ及び
異なる結合親和性を有するペプチドに結合することが可能な、ATP結合βシート
領域及びαヘリックス領域を有する。Hsp110は、より短いペプチド(12mer)に結
合することが示されており、かつhsp110への結合のための好ましいコンセンサス
モチーフが決定されている(すなわち、塩基性、極性、芳香族性／塩基性、プロ
リン、塩基性、酸性、芳香族性、芳香族性、塩基性、芳香族性、プロリン、塩基
性、X(優先的でない)、塩基性/芳香族性)。この配列は、hsp70ファミリーの構成
要員に結合するために先に同定された好ましい配列モチーフとは異なる。
【００２１】 Hsp110は、hsp70と比べて、より効果的に熱変性されたタンパク質を安定化し
、これは等モルベースで4倍以上の効率である。Hsp70及びhsp110のペプチド結合
特性は、これらを、変性したペプチド鎖への結合により変性したタンパク質が凝
集することを阻害する上で効果的なものにしている。熱及び塩化グアニジン曝露
の2種の異なる変性条件を用いると、hsp110は、ルシフェラーゼ及びクエン酸シ
ンターゼが1:1のモル比で存在する場合のこれらの凝集の阻害において、ほとん
ど全ての効力を示している。Hsp70ファミリーの構成要員は、同様の機能を発揮
するが、顕著に低い効率である。
【００２２】 Grp170は、小胞体に存在するhsp110に対する強力な構造ホモログである(Linら
、Mol. Biol. Cell、4:1109-19(1993)；Chenら、FEBS Lett、380:68-72(1996))
。Grp170は、hsp110と同じ二次構造の特徴を示し、これは拡大されたペプチド結
合ドメインを含む。Grp170は、その中心近傍にβシートドメインを、よりC末端
側にα-ヘリックスドメインを、及び両方に連結しているhsp110に存在するルー
プドメインよりもはるかに長いループドメイン(アミノ酸長200個対アミノ酸長10
0個)を含み、かつDnakは存在しないことが予想される。加えて、grp170は恐らく
タンパク質の哺乳類小胞体への輸送に必要な重要なATPaseである(Dierksら、EMB
O J.、15:6931-42(1996))。Grp170は、ORP15O(ヒト及びラットの両方で同定され
た酸素-調節タンパク質)及びCBP-140(マウスにおいて同定されたカルシウム結合
タンパク質)としても公知である。Grp170は更に、hsp70よりも、変性タンパク質
をより効率的に安定化することが示されている。
【００２３】 ワクチンとしてgrp170及びhsp110の両方が機能するという本明細書に記された
発見は、これまで利用できる戦略よりも、癌及び感染症の治療及び予防における
使用のための、新規及びより効果的なワクチンの可能性を提供する。
【００２４】定義 本明細書において使用された全ての科学用語及び技術用語は、特に記さない限
りは、当技術分野において通常使用される意味を有する。本明細書において使用
される場合に、下記の単語及び句は、特定の意味を有する。
【００２５】 本明細書で使用される「ポリペプチド」とは、天然の給源から単離された、組
換え技術により作出された又は化学的に合成されたかに関わらず、タンパク質、
タンパク質断片、及びペプチドを含む。本発明のポリペプチドは典型的には、少
なくとも約6個のアミノ酸を含む。
【００２６】 本明細書で使用される「ベクター」とは、対象となる1種以上の遺伝子又は配
列を宿主細胞へ送達し、かつ好ましくは発現することが可能である、構築物を意
味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、裸のDNA又はRNA発現ベクター、プ
ラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合されたDNA
又はRNAの発現ベクター、リボソームに封入されたDNA又はRNA発現ベクター、及
びある種の真核細胞、例えばプロデューサー細胞を含むが、これらに限定される
ものではない。
【００２７】 本明細書で使用される「発現調節配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列
を意味する。発現調節配列は、構成的又は誘導性プロモーターのようなプロモー
ター、又はエンハンサーであることができる。発現調節配列は転写される核酸配
列に機能的に連結される。
【００２８】 「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、1本鎖又は2本鎖の形状のデ
オキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、かつ特に記さ
ない限りは、核酸に天然のヌクレオチドと同様の方法でハイブリダイズする天然
のヌクレオチドの公知の類似体を包含している。
【００２９】 本明細書において使用される「抗原提示細胞」又は「APC」とは、抗原の操作
及びリンパ球への提示が可能な細胞を意味する。APCの例は、マクロファージ、
ランゲルハンス-樹状細胞、濾胞性樹状細胞、Ｂ細胞、単球、繊維芽細胞、及び
繊維細胞を含むが、これらに限定されるものではない。樹状細胞は、抗原提示細
胞の好ましい型である。樹状細胞は、多くの非リンパ系組織において発見されて
いるが、輸入リンパ又は血流を介してリンパ系臓器のＴ細胞-依存領域へ移動す
ることができる。非リンパ系臓器において、樹状細胞は、ランゲルハンス細胞及
び間質性樹状細胞を含む。リンパ及び血液において、これらは各々、輸入リンパ
中のベール細胞及び血液樹状細胞を含む。リンパ系臓器において、これらはリン
パ系樹状細胞及び指状嵌入細胞を含む。
【００３０】 本明細書において使用されるエピトープを提示するように「修飾された」とは
、天然又は組換え法によりエピトープを提示するように操作される抗原提示細胞
(APC)を意味する。例えば、APCは、ペプチド負荷の、単独又は混合物の一部とし
ての、単離された抗原への曝露により、もしくは1種以上のエピトープを含むポ
リペプチドを発現するためのAPCの遺伝的修飾により、修飾することができる。
【００３１】 本明細書において使用される「腫瘍タンパク質」とは、腫瘍細胞により発現さ
れるタンパク質である。腫瘍タンパク質であるタンパク質は、免疫アッセイ法(E
LISAなど)において、癌患者由来の抗血清と、検出できるように反応することも
できる。
【００３２】 本明細書において使用される「熱誘導性ストレスポリペプチド」とは、上昇し
た温度によりその発現が誘導されるようなストレスポリペプチド又はタンパク質
を意味する。熱誘導性ストレスポリペプチドの一例は、そのプロモーター内に1
種以上の熱ショックエレメントを含むストレスタンパク質を含む。
【００３３】 本明細書において「免疫原性ポリペプチド」とは、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞表
面抗原受容体により認識される(すなわち特異的に結合される)タンパク質の一部
である。このような免疫原性ポリペプチドは、一般に癌又は感染症に関連するタ
ンパク質の少なくとも5個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは少なくとも10
個の、及び更により好ましくは少なくとも20個のアミノ酸残基を含む。ある好ま
しい免疫原性ポリペプチドは、N末端リーダー配列及び／又は膜貫通ドメインが
欠失しているようなペプチドを含む。他の好ましい免疫原性ポリペプチドは、成
熟タンパク質に比べ、小さいN末端及び／又はC末端欠失(例えば、1〜30個のアミ
ノ酸、 好ましくは5〜15個のアミノ酸)を含むことがある。
【００３４】 本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」とは、活性成分と組
合わせた場合に、成分の生物学的活性を保持しかつ被験者の免疫系と反応しない
ような物質のいずれかを含む。例として、標準の薬学的担体、例えばリン酸緩衝
生理食塩水、水など、油/水乳剤のような乳剤、及び様々な種類の湿潤剤がある
が、これらに限定されるものではない。エアゾール及び非経口投与のための好ま
しい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水又は通常の(0.9％)生理食塩水である。
【００３５】 このような担体を含有する組成物は、周知の従来の方法により製剤される(例
えば、レミントン（Remington）「薬科学（Pharmaceutical Science）」、第43
章、14版、Mack Publishing社、イーストン、PA、18042、USAを参照のこと)。
【００３６】 本明細書において使用される「アジュバント」とは、免疫応答を促進するため
に当技術分野において通常使用されるアジュバントを含む。アジュバントの例は
、ヘルパーペプチド；アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル(アルム)
又はリン酸アルミニウムなど；フロイントの不完全アジュバント及び完全アジュ
バント(Difco Laboratories社、デトロイト、MI)；メルクアジュバント65(Merck
社、ローウェイ、NJ)；AS-2(Smith-Kline Beecham社)；QS-21(Aquilla Biopharn
iaceuncal社)；MPL又は3d-MPL(Corixa社、ハミルトン、MT)；LEIF；カルシウム
、鉄、又は亜鉛の塩；アシル化されたチロシンの不溶性懸濁液；アシル化された
糖質；カチオン性又はアニオン性誘導された多糖；ポリホスファゼン；生分解性
ミクロスフェア；モノホスホリルリピドA及びクイルA；ムラミルトリペプチドホ
スファチジルエタノールアミン、又はサイトカインを含む免疫賦活複合体(例え
ば、GM-CSF又はインターロイキン-2、-7もしくは-12)、及び免疫賦活性DNA配列
である。一部の態様において、ポリヌクレオチドワクチンの使用同様、ヘルパー
ペプチド又はサイトカインのようなアジュバントが、アジュバントをコードして
いるポリヌクレオチドを介して提供され得る。
【００３７】 本明細書において「1つの(a)」又は「1つの(an)」とは、特に明確に指示しな
い限りは、少なくとも1個を意味する。
【００３８】本発明のポリヌクレオチド 本発明は、hsp110又はgp170のような1種以上のストレスタンパク質、又はそれ
らの一部もしくは他の変種をコードしている第1のポリヌクレオチド、並びに1種
以上の免疫原性ポリペプチド、又はそれらの一部もしくは他の変種をコードして
いる第2のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。一部の態様
において、これらの第一及び第2のポリヌクレオチドは連結され、ストレスタン
パク質複合体をコードしている単独のポリヌクレオチドを形成する。この単独の
ポリヌクレオチドは、様々な方法で第一及び第2のタンパク質を発現することが
でき、例えば、単独の融合タンパク質として又は複合体を形成することが可能で
あるような2種の個別のタンパク質としてである。
【００３９】 好ましいポリヌクレオチドは、ストレスタンパク質又は免疫原性ポリペプチド
の一部をコードしている、少なくとも15個の連続ヌクレオチド、好ましくは少な
くとも30個の連続ヌクレオチド、及びより好ましくは少なくとも45個の連続ヌク
レオチドを含む。より好ましくは、第1のポリヌクレオチドは、ストレスタンパ
ク質のペプチド結合部分をコードし、かつ第2のポリヌクレオチドは、免疫原性
ポリペプチドの免疫原性部分をコードしている。このような配列のいずれかに相
補的であるポリヌクレオチドも、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、1
本鎖(コード又はアンチセンス)もしくは2本鎖であることができ、かつDNA(ゲノ
ム、cDNA又は合成)又はRNA分子であることができる。RNA分子は、イントロンを
含みかつ1対1の方法でDNA分子に対応しているようなHnRNA分子、並びにイントロ
ンを含まないmRNA分子を含む。追加のコード又は非コード配列は、本発明のポリ
ヌクレオチド内に存在することができるが、必ずしもではなく、かつポリヌクレ
オチドは、他の分子及び／又は支持物質に連結することができるが、必ずしもで
はない。
【００４０】 ポリヌクレオチドは、天然の配列(すなわち、ストレスタンパク質、免疫原性
ポリペプチド又はそれらの一部をコードしている内因性配列)を含むことができ
、もしくはこのような配列の変種を含むことができる。ポリヌクレオチド変種は
、1個以上の置換、付加、欠失及び／又は挿入を含み、その結果コードされたポ
リペプチドの免疫原性が、天然のストレスタンパク質に比して減弱されることは
ない。コードされたポリペプチドの免疫原性に対する作用は、一般に本明細書に
記されたように評価することができる。変種は、天然のストレスタンパク質又は
その一部をコードしているポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくと
も約70％の同一性を、より好ましくは少なくとも約80％の同一性を及び最も好ま
しくは少なくとも約90％の同一性を示す。
【００４１】 2種のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、以下に説明するように対応
が最大になるように並べた場合に、これら2種の配列の中のヌクレオチド又はア
ミノ酸配列が同じである場合に、「同一」であると称される。2個の配列間の比
較は、典型的には、配列類似性の局部領域を同定しかつ比較するための比較ウイ
ンドウに広がる配列の比較により行われる。本明細書において使用された「比較
ウインドウ」は、少なくとも約20個の、通常は30〜約75個の、40〜約50個の連続
位置のセグメントを意味し、ここで配列は、2個の配列が最適に並べられた後、
同じ番号の連続位置の参照配列と比較され得る。
【００４２】 比較のための最適な配列アラインメントは、Lasergeneの生体情報学統合ソフ
トウェア(IDNASTAR社、マジソン、WI)において、Megalianプログラムを用い、デ
フォルトのパラメータで行うことができる。このプログラムは、下記の参考文献
において説明された、いくつかのアラインメント方式を具体化している：Dayhof
f, M.O.、(1978)、「タンパク質の進化的変化モデル-遠縁の検出マトリックス」
；Dayhoff, M.O.(編集)、タンパク質配列及び構造のアトラス、National Biomed
ical Research Foundation、ワシントンDC、第5巻補遺3、345-358頁；Hein J.、
(1990)、「アラインメント及び系統学のための統一法」、626-645頁、Methods i
n Enzymology、第183巻、Academic Press社、サンディエゴ、CA；Higgins, D.G.
及びSharp, P.M.、(1989)、CABIOS、5:151-153；Myers, E.W.及びMuller W.、(1
988)、CABIOS、4:11-17；Robinson, E.D.(1971)、Comb. Theor.、11:105；Santo
u, N.、Nes, M.、(1987)、Mol. Biol. Evol.、4:406-425；Sneath, P.H.A.及びS
okal, R.R.、(1973)、Numerical Taxonomy the Principlcs and Practice of Nu
merical Taxonomy、Freeman Press、サンフランシスコ、CA；Wilbur, W.J.及びL
ipman D.J. (1983)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80:726-730)。
【００４３】 好ましくは、「配列同一性の割合(％)」は、2個の最適に並べた配列を少なく
とも20位の比較ウィンドウについて比較することにより決定することができ、こ
こで比較ウインドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部は、これ
ら2個の配列の最適アラインメントにおいて、参照配列(これは付加又は欠失を含
まない)と比較して、20％以下、通常5〜15％、又は10〜12％の付加又は欠失(す
なわちギャップ)を含むことができる。この割合は、合致した位置の数を得るた
めに、両方の配列において同じ核酸塩基又はアミノ酸残基が生じるような位置の
数を決定し、合致した位置の数を参照配列の位置の総数(すなわちウインドウサ
イズ)で割り、かつこの結果に100を掛け、配列同一性のパーセントを得ることに
より算出される。
【００４４】 変種は更に、又はあるいは、天然の遺伝子、又はそれらの一部もしくは相補体
と実質的に相同であることができる。このようなポリヌクレオチド変種は、天然
のストレスタンパク質をコードしている天然のDNA配列(又は相補配列)に生じる
中程度のストリンジェント条件下で、ハイブリダイズすることが可能である。適
当な中等度のストリンジェントな条件は、5XSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)
の溶液中での予備洗浄；50〜65℃での、5XSSC、一晩のハイブリダイゼーション
；それに続く、各々、0.1％SDSを含有する、2X、0.5X及び0.2X SSCによる、65℃
、20分間の洗浄2回を含む。
【００４５】 当業者には、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記されたポリペプチド
をコードしている多くのヌクレオチド配列が存在することは理解されると思われ
る。このようなポリヌクレオチドの一部は、天然の遺伝子のヌクレオチド配列に
対して最小の相同性を生じる。しかしながら、コドン用法の差異のために変動す
るポリヌクレオチドは、本発明により具体的に考慮されている。更に本明細書に
提供されたポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内
である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加及び／又は置換などの、1種
以上の変異の結果変動する内因性遺伝子である。得られるmRNA及びタンパク質は
、変更された構造又は機能を有するが、必ずしもではない。対立遺伝子は、標準
技術を用いて同定することができる(例えば、ハイブリダイゼーション、増幅及
び／又はデータベースの配列比較)。
【００４６】 ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の様々な技術のいずれかを用い
て調製することができる。ストレスタンパク質をコードしているDNAは、ストレ
スタンパク質mRNAを発現している組織から調製されたcDNAライブラリーから得る
ことができる。従って、ヒトhsp110又はgrp170 DNAは、ヒト組織から調製された
cDNAライブラリーから簡便に得ることができる。ストレスタンパク質-コードし
ている遺伝子も、ゲノムライブラリー又はオリゴヌクレオチド合成から得ること
ができる。ライブラリーは、対象となる遺伝子又はそれによりコードされたタン
パク質を同定するためにデザインされたプローブ(例えば、ストレスタンパク質
に対する抗体又は少なくとも約20〜80塩基のオリゴヌクレオチドなど)でスクリ
ーニングすることができる。具体的なライブラリーは、ヒト肝cDNAライブラリー
(ヒト肝5'伸長＋cDNA、Clontech Laboratories社)及びマウス腎cDNAライブラリ
ー(マウス腎5'-伸長cDNA、Clontech laboratories社)を含む。選択されたプロー
ブによるcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることは、Sambrookら
の著書(Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (ニューヨーク、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press社、1989))に記された方法のような、常法を用いて
行うことができる。hap110又はgrp170をコードしている遺伝子を単離する別の手
段を、PCR法に使用することができる(Sambrookら、前掲；Dieffenbachら、PCR P
rimer：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press社、1995)
。
【００４７】 プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さ及び偽陽性
を最小にするために十分に曖昧でないものでなければならない。オリゴヌクレオ
チドは好ましくは、スクリーニングされるライブラリー内のDNAへのハイブリダ
イゼーション時に検出することができるように標識される。標識法は、当技術分
野において周知であり、かつ32P-標識されたATPのような放射標識、ビオチン化
又は酵素標識の使用を含む。中等度のストリンジェンシー及び高いストリンジェ
ンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookらの著書(前掲)に提供さ
れている。
【００４８】 このようなライブラリースクリーニング法で同定された配列は、寄託された別
の公知の配列及びGenBank又は他のプライベートな配列データベースのような公
開されたデータベースで入手することができる配列と比較されかつ並べることが
できる。分子の限定された領域内又は完全長配列に及ぶ配列同一性(アミノ酸又
はヌクレオチドのいずれかのレベル)は、相同性を測定するために様々なアルゴ
リズムを使用する、コンピュータソフトウェアプログラムを用いる配列アライン
メントを通じて決定することができる。
【００４９】 タンパク質コード配列を有する核酸分子は、選択されたcDNAライブラリー又は
ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、かつ必要ならば、Sambro
okら(前掲)に記された通常のプライマー伸長法を用い、cDNAに逆転写されていな
いmRNAの前駆体及びプロセシング中間体を検出することにより得ることができる
。
【００５０】 ポリヌクレオチド変種は一般に、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成など
による化学合成を含む当技術分野において公知のいずれかの方法により調製する
ことができる。更にポリヌクレオチド配列の修飾は、オリゴヌクレオチド位置指
定突然変異誘発のような、標準の突然変異誘発技術を用いて導入することもでき
る(Adelmanら、DNA、2:183(1983)を参照)。あるいは、DNAが適当なRNAポリメラ
ーゼプロモーター(T7又はSP6など)と共にベクターに組入れられているならば、R
NA分子は、ストレスタンパク質又はその一部をコードしているDNA配列のインビ
トロ又はインビボ転写により作製することができる。ある種のタンパク質は、本
明細書に記されたような、コードされたポリペプチドを調製するために使用する
ことができる。加えて、あるいは代わりに一部を患者に投与することができ、そ
の結果そのコードされたポリペプチドがインビボにおいて作出される(例えば、
ストレスポリペプチドコードしているcDNA構築物による、樹状細胞のような抗原
提示細胞のトランスフェクション、及びトランスフェクションされた細胞の患者
への投与)。
【００５１】 ポリヌクレオチドを、インビボにおける安定性を増大するように更に修飾して
もよい。可能性のある修飾は、5'及び／又は3'末端へのフランキング配列の付加
；主鎖におけるホスホジエステル結合(phosphodiesterase linkage)の代わりの
ホスホロチオエート又は2'-O-メチルの使用；及び／又は、イノシン、クエオシ
ン(queosin)、及びウィブトシン(wybutosin)のような従来型でない塩基に加え、
アデニン、シチジン、グアニン、チミジン及びウリジンのアセチル-、メチル-、
チオ-及びその他の修飾された形の封入を含むが、これらに限定されるものでは
ない。
【００５２】 ヌクレオチド配列は、確立された組換えDNA技術を用いて、様々な他のヌクレ
オチド配列と一緒にすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミ
ド、ファージミド、ラムダファージ誘導体及びコスミドを含む、様々なクローニ
ングベクターのいずれかにクローニングすることができる。特に対象となるベク
ターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター及びシークエンシ
ングベクターを含む。概して、ベクターは、少なくとも1種の生物において機能
する複製起点、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ切断部位及び1個以上の選択
マーカーを含む。他のエレメントは、望ましい用途によって決まり、かつ当業者
には自明のことであると思われる。
【００５３】 ある態様において、ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞への進入を可能にし、か
つそこでの発現を可能にするように製剤することができる。このような製剤は、
特に下記に記すような治療目的に有用である。当業者は、標的細胞におけるポリ
ヌクレオチドの発現を実現するには多くの方法があり、かついずれか適当な方法
を用いることができることを理解すると思われる。例えば、ポリヌクレオチドは
、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、又はワクシニアウイ
ルスもしくは他のポックスウイルス(例えば、トリポックスウイルス)などがある
が、これらに限定されるものではないようなウイルスベクターに組込むことがで
きる。DNAのこのようなベクターへの導入技術は、当業者には周知である。レト
ロウイルスベクターは更に、遺伝子に、選択マーカー(形質導入された細胞の同
定又は選択を補助するため)及び／又はベクターを標的特異性にするための特定
の標的細胞上の受容体のリガンドをコードしている遺伝子のような標的部位を、
導入又は組込むことができる。標的化は、当業者に公知の方法により抗体を用い
実現することもできる。
【００５４】 治療目的の他の製剤は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビ
ーズ、並びに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベー
スのシステムのような、コロイド分散システムを含む。インビトロ及びインビボ
送達ビヒクルとしての用途に好ましいコロイドシステムは、リポソーム(すなわ
ち、人工膜小胞)である。このようなシステムの調製及び使用は、当技術分野に
おいて周知である。
【００５５】ストレスポリペプチド及び免疫原性ポリペプチド 本発明の状況において、ストレスポリペプチド及びストレスタンパク質は、少
なくともhsp110及び／又はgrp170タンパク質及び／又はそれらの変種のペプチド
結合部分を含む。本明細書に記されたようなポリペプチドは、いかなる長さであ
ってもよい。天然のタンパク質及び／又は異種配列由来の追加の配列が存在する
ことができ、かつこのような配列は、更なるペプチド結合、免疫原性又は抗原性
特性を有するが、必ずしもではない。一部の態様において、ストレスポリペプチ
ドは更に、hsp70、hsp90、grp78及びgrp94ストレスタンパク質ファミリーの構成
要員の全て又は一部を含む。
【００５６】 Hsp110のシャペロン化活性及びペプチド結合活性を媒介することが可能である
ようなhsp110の機能ドメイン及び変種は、Oh, HJらにより(J. Biol. Chem.、274
(22):15712-18(1999))同定されている。Grp170の機能ドメインは、hsp110のもの
に相似している。本明細書に記されたストレスポリペプチドの候補断片及び変種
は、熱-変性されたルシフェラーゼを可溶化しかつウサギの網状赤血球溶解物の
存在下でルシフェラーゼを再生(refold)するそれらの能力を評価することにより
、シャペロン化活性を有することを確定することができる(Ohら、前掲)。
【００５７】 いくつかの態様において、免疫原性ポリペプチドは、癌又は前癌状態に関連し
ている。癌に関連する免疫原性ポリペプチドの一例は、her-2/neuペプチドであ
る(Bargmannら、Nature、319(6050):226-30(1986)；Bargmannら、Cell、45(5):6
49-57(1986))。her-2/neuペプチドの例は、her-2/neuの細胞内ドメイン(アミノ
酸残基676-1255；Bargmnannら、前記文献参照)、her-2/neuの細胞外ドメインのp
369(E75としても公知； ）、及びher-2/neuの膜貫通領域のp546( ）を含むがこれらに限定されるものではない。別の態様において、免疫原性ポリ
ペプチドは、感染症に関連している。感染症に関連する免疫原性ポリペプチドの
一例は、ヒト型結核菌抗原Mtb8.4(Colerら、J. Immunol.、161:(5):2356-64(199
8))又はMtb39(Mtb39Aとしても公知；Dillonら、Infect. Immun.、67(6):2941-5O
(1999))のような、ヒト型結核菌由来の抗原である。
【００５８】 免疫原性ポリペプチドは既知のものでも未知のものでもよい。未知の免疫原性
ポリペプチドは、癌又は前癌状態の被験者又は感染症の被験者の組織からのhsp1
10又はgrp170の精製に付随して得ることができる。別の態様において、免疫原性
ポリペプチドは既知の抗原を含む。
【００５９】 免疫原性ポリペプチドは一般に、Paulの「基礎免疫学(Fundamental Immunolog
y)」、第4版、663-665(Lippincott-Raven Publishers社、1999)及びそこに引用
された参考文献に要約されているような、周知の技術を用いて同定され得る。こ
のような技術は、抗原特異性抗体、抗血清及び／又はＴ細胞株又はクローンと反
応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングを含む。本明細書に使用さ
れるように、抗血清及び抗体は、これらが特異的に抗原に結合する場合は、抗原
特異性である(すなわち、これらはELISA又は他のイムノアッセイ法においてタン
パク質と反応し、かつ無関係のタンパク質とは検出できるように反応しない)。
このような抗血清及び抗体は、周知の技術を用いて調製することができる。免疫
原性ポリペプチドは、このような抗血清及び／又はＴ細胞と、完全長ポリペプチ
ドの反応性よりも実質的に低くはないようなレベルで反応する(例えば、ELISA及
び／又はＴ細胞反応性アッセイ法において)ような天然のタンパク質の一部であ
ることができる。このような免疫原性部分は、このようなアッセイ法内で、完全
長ポリペプチドの反応性と同様の又はより大きいレベルで反応することができる
。このようなスクリーニングは、Harlow及びLaneの「抗体：実験マニュアル(Ant
ibodies: A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory社、1988に
記されているもののような当業者に周知の方法を用いて、一般に行うことができ
る。例えば、ポリペプチドは、固相支持体上に固定され、かつ患者の血清と接触
され、血清中の抗体を固定されたポリペプチドに結合させる。その後未結合の血
清は取除かれ、かつ結合された抗体は、例えば125I-標識したプロテインAを用い
て検出される。
【００６０】 本発明のストレスタンパク質複合体は、様々な方法を通じて得ることができる
。ある例において、組換えhsp110又はgrp170は、細胞物質(例えば溶解液)と混合
され、ストレスポリペプチドが細胞物質内の1種以上の免疫原性ポリペプチドと
結合される。このような結合は、この混合物の加熱のような、ストレス条件によ
り増強又は変更することができる。別の例において、標的細胞は、以後の精製の
ために標識(例えばHISタグ)されているhsp110又はgrp170でトランスフェクショ
ンされる。この例は、免疫原性物質の存在下で組換えストレスポリペプチドを作
出する方法を提供する。更に別の例においては、熱又は他のストレス条件を用い
て、ストレスポリペプチドの精製前に、標的細胞内にhsp110又はgrp170を誘導す
る。このストレス処理は、インサイチュー、インビトロ又は細胞培養で行うこと
ができる。
【００６１】 一部の態様において、本発明は、ストレスポリペプチド及び免疫原性ポリペプ
チドを含有する、増強された免疫原性を有するストレスタンパク質複合体を提供
し、ここで複合体は加熱されている。このような加熱は、特にストレスポリペプ
チドが熱誘導性ストレスタンパク質を含む場合、ストレスタンパク質複合体のワ
クチンとしての効力を増大することができる。熱誘導性ストレスタンパク質の例
は、hsp70及びhsp110を含むが、これらに限定されるものではない。ある態様に
おいて、加熱は、ストレスタンパク質複合体を含む組織を少なくともおよそ38℃
の温度に曝し、かつこの温度を、例えば一度に1℃毎、望ましい加熱レベルが得
られるまで、徐々に上げていくことを含む。好ましくは、組織の温度は、およそ
39.5±0.5℃となる。加熱時には、組織は、インビボ、インビトロであるか、又
は宿主環境内に位置することができる。
【００６２】 本発明のストレスタンパク質複合体は、天然のストレスタンパク質の変種を含
むことができる。本明細書で使用されるポリペプチド「変種」は、そのポリペプ
チドの免疫原性は実質的に低下されないように、1個以上の置換、欠失、付加及
び／又は挿入において天然のストレスタンパク質と異なるポリペプチドである。
別の表現をすると、抗原-特異性抗血清と反応する変種の能力は、天然のタンパ
ク質に対して増強されるか又は変化しないか、もしくは天然のタンパク質に対し
て50％未満、好ましくは20％未満に減少され得る。このような変種は、一般に前
述のポリペプチド配列のひとつの修飾、及び本明細書に記されたような抗原-特
異性抗体又は抗血清による修飾されたポリペプチドの反応性の評価により同定さ
れ得る。好ましい変種は、1個以上の部分、例えばN末端リーダー配列もしくは膜
貫通ドメインなどが除去されているようなものを含む。別の好ましい変種は、小
さい部分(例えば、1〜30個のアミノ酸、好ましくは5〜15個のアミノ酸)が成熟タ
ンパク質のN末端及び／又はC末端から除去されているような変種を含む。
【００６３】 ポリペプチド変種は、同定されたポリペプチドに対して好ましくは少なくとも
約70％、より好ましくは少なくとも約90％及び最も好ましくは少なくとも約95％
の同一性(前述のように決定された)を示す。
【００６４】 好ましくは、変種は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、アミノ酸が、
同様の特性を有する別のアミノ酸と置換されるようなものであり、ペプチド化学
分野の業者は、実質的に変更されることのないポリペプチドの二次構造及び疎水
親水の特徴を予想すると思われる。アミノ酸置換は一般に、残基の極性、電荷、
溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の特徴のような類似性を基に行うこ
とができる。例えば、負帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸
を含み；正帯電したアミノ酸は、リシン及びアルギニンを含み；及び、同様の親
水度を有する非帯電の極性ヘッド基(polar head)を伴うアミノ酸は、ロイシン、
イソロイシン及びバリンであり；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグル
タミン；並びに、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンがある。
保存的変化を示し得る他のアミノ酸の群は、以下を含む：(1)ala、pro、gly、gl
u、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met
、ala、phe；(4)lys、arg、his；及び、(5)phe、tyr、trp、his。変種は更に、
又は代わりに、非保存的変化を含むこともできる。好ましい態様において、変種
ポリペプチドは、5個以下のアミノ酸の置換、欠失又は付加により、天然の配列
とは異なる。変種は更に(又は代わりに)、例えばポリペプチドの免疫原性、二次
構造及び疎水親水性に対し最小の影響を及ぼすような欠失又は付加により修飾す
ることができる。
【００６５】 ポリペプチドは、翻訳時又は翻訳後にタンパク質の導入を指示するようなシグ
ナル(又はリーダー)配列をタンパク質のN末端に含むことができる。ポリペプチ
ドは更に、ポリペプチドの合成、精製又は同定を容易にするため、もしくはポリ
ペプチドの固相支持体への結合を増強するために、リンカー又は他の配列に複合
すること(例えば、poly-FEs)もできる。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリ
ンFc領域に複合することができる。
【００６６】 ポリペプチドは、下記実施例1に記された精製技術を含む、様々な周知の技術
のいずれかを用いて調製することができる。ある態様において、ストレスポリペ
プチド及び免疫原性ポリペプチドは、この精製技術の結果として腫瘍細胞又は病
原体に感染された細胞から同時精製される。一部の態様において、腫瘍細胞又は
感染細胞は、免疫原性ポリペプチドのストレスポリペプチドへの結合を増強する
ために、精製前に、ストレス処理される。例えば、この細胞は、数時間低レベル
での加熱(39.5〜40℃)又は約1〜約2時間の高レベルでの加熱(およそ43℃)により
、インビトロにおいてストレス処理することができる。加えて、これらの細胞は
、無酸素及び／又は虚血性又はタンパク毒素条件に曝露することにより、インビ
トロにおいてストレス処理することができる。被験者から摘出された腫瘍は、細
断されかつ精製前にインビトロにおいて加熱される。
【００６７】 一部の態様において、ポリペプチドは、組成物が投与される予定の同一被験者
から精製される。これらの態様において、腫瘍又は感染細胞の数を増加すること
が望ましい。このような細胞のスケールアップは、インビトロ又はインビボにお
いて、例えばSCIDマウスシステムを用いて行うことができる。SCIDマウス宿主に
おけるヒト被験者腫瘍の増大によるように、細胞が非ヒト細胞の存在下でスケー
ルアップされる場合、腫瘍を浸潤しているであろうあらゆる非ヒト(例えばマウ
ス)細胞からヒト細胞を精製するよう注意しなければならない。ポリペプチドが
精製されたのと同じ被験者に組成物が投与されるようなこれらの態様において、
hap110及びgrp17Oの両方の精製に加え、制限された量の出発材料の効力を最適化
するための追加のポリペプチドのストレス処理が望ましい。
【００６８】 前述のようにDNA配列によりコードされた組換えポリペプチドは、当業者に公
知の様々な発現ベクターのいずれかを用いDNA配列から容易に調製することがで
きる。発現は、組換えペプチドをコードしているDNA分子を含む発現ベクターで
形質転換又はトランスフェクションされたいずれか適当な宿主細胞において実現
することができる。適当な宿主細胞は、原核生物、酵母及び高等真核生物の細胞
を含む。好ましくは、使用される宿主細胞は、大腸菌（E. coli）、酵母、昆虫
細胞又は哺乳類細胞株、例えばCOS又はCHOである。組換えタンパク質又はポリペ
プチドを培養培地に分泌する適当な宿主/ベクターシステムから得た上清は、最
初に市販のフィルターを用いて濃縮することができる。濃縮後、濃縮物を、アフ
ィニティーマトリックス又はイオン交換樹脂のような適当な精製マトリックスに
適用することができる。最後に、1回以上の逆相HPLC工程を用い、組換えポリペ
プチドを更に精製することができる。
【００６９】 約100個未満のアミノ酸、及び一般には約50個未満のアミノ酸を有する一部分
又は他の変種は、当業者に周知の技術を用いる合成手段により作出することもで
きる。例えば、このようなポリペプチドは、アミノ酸が成長しつつあるアミノ酸
鎖に順次追加される、Merrifield固相合成法のような、市販の固相技術のいずれ
かを用いて合成することができる。Merrifield、J. Am. Chem. Soc.、85:2149-2
146(1963)を参照のこと。ポリペプチドの自動合成装置は、Perkin Elmer/Applie
d BioSystems Division社(フォスターシティ、CA)などの供給業者から市販され
ており、かつ製造業者の指示に従い操作することができる。
【００７０】 ポリペプチドは、Perkin Elmer/Applied BioSystems Division社の430Aペプチ
ド合成装置において、HPTU(O-ベンゾトリアゾールN,N,N',N'-テトラメチルウロ
ニウムヘキサフルオロリン酸)活性化によるFMOC化学を用い合成することができ
る。Gly-Cys-Gly配列は、固定された表面に結合するか、もしくはペプチドを標
識する複合の方法を提供するために、ペプチドのアミノ末端に結合することがで
きる。ペプチドの固相支持体からの切断は、下記の切断混合物；トリフルオロ酢
酸:エタンジチオール:チオアニソール：水：フェノール(40：1：2：2：3)を用い
て行うことができる。切断の2時間後、ペプチドは、冷メチル-t-ブチル-エーテ
ル中で沈殿することができる。その後このペプチドペレットは、0.1％トリフル
オロ酢酸(TFA)を含有する水中に溶解され、かつC18逆相HPLCによる精製前に凍結
乾燥される。水を溶媒とするアセトニトリル(0.1％TFA含有)の0％〜60％勾配を
用いて、ペプチドを溶離することができる。純粋な画分の凍結乾燥後、このペプ
チドを、電子スプレー(electrospray)又は他の種類の質量分析法及びアミノ酸解
析により、ペプチドの特徴を決定することができる。
【００７１】融合タンパク質 一部の態様において、ポリペプチドは、本明細書に記されたような複数のポリ
ペプチドを含む、又は本明細書に記されたような少なくとも1種のポリペプチド
及び無関係の配列を含む融合タンパク質である。一部の態様において、この融合
タンパク質は、hsp110及び／又はgrp170のストレスポリペプチド及び免疫原性ポ
リペプチドを含む。免疫原性ポリペプチドは、腫瘍タンパク質又は感染症に関連
するタンパク質の全て又は一部を含むことができる。
【００７２】 追加の融合パートナーを付加することができる。融合パートナーは、例えば、
Tヘルパーエピトープ、好ましくはヒトにより認識されるTヘルパーエピトープの
供給を補助することにより、免疫原性融合パートナーとして利用することができ
る。別の例の融合パートナーは、天然の組換えタンパク質よりもより高い収量で
タンパク質の発現を補助する、発現エンハンサーとして利用することができる。
ある好ましい融合パートナーは、免疫原性及び発現増強性の両方の融合パートナ
ーである。別の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を増大するか、又はタン
パク質が望ましい細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするよう
に選択することができる。更に別の融合パートナーは、タンパク質の精製を促進
するような、アフィニティータグを含む。
【００７３】 融合タンパク質は概して、化学共役を含む標準方法を用いて調製することがで
きる。好ましくは、融合タンパク質は、発現システムにおいて、組換えタンパク
質として発現され、非融合タンパク質に対して上昇したレベルの産生を可能にす
る。簡単に述べると、ポリペプチド成分をコードしているDNA配列は、個別に集
成され、かつ適当な発現ベクターに連結される。あるポリペプチド成分をコード
しているDNA配列の3'末端は、ペプチドリンカーを伴う又は伴わずに、第2のポリ
ペプチド成分をコードしているDNA配列の5'末端に連結され、その結果これらの
配列のリーディングフレームは相内(in phase)にある。これは、両方の成分ポリ
ペプチドの生体活性を維持している単独の融合タンパク質への翻訳を可能にする
。
【００７４】 ペプチドリンカー配列は、第一及び第2のポリペプチド成分を、各ポリペプチ
ドの二次構造及び三次構造へのフォールディングを確実にするのに十分な距離で
隔てるために使用することができる。このようなペプチドリンカー配列は、当技
術分野において周知の標準方法を用いて、融合タンパク質に組込まれる。適当な
ペプチドリンカー配列は、下記の要因を基に選択することができる：(1)柔軟な
拡大された立体構造を成すそれらの能力；(2)第一及び第2のポリペプチド上で機
能性エピトープと相互作用することができる二次構造を成すそれらの能力のなさ
；並びに、(3)ポリペプチド機能性エピトープと反応し得るような疎水性又は帯
電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn及びSer残基を
含む。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばThr及びAlaなども、リンカー配列におい
て使用することができる。リンカーとして有用に利用されるアミノ酸配列は、Ma
rateaら、Gene、40:39-46(1985)；Murphyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83:
8258-8262(1986)；米国特許第4,935,233号及び米国特許第4,751,180号に開示さ
れている。このリンカー配列は一般に、長さが1〜約50個のアミノ酸により形成
されている。第一及び第2のポリペプチドが、機能ドメインを分離しかつ立体配
置的干渉を防ぐために使用される非必須のN末端アミノ酸領域を有する場合は、
リンカー配列を必要としない。
【００７５】 連結されたDNA配列は、適当な転写又は翻訳の調節エレメントに機能的に連結
されている。DNAの発現に寄与する調節エレメントは、第1のポリペプチドをコー
ドしているDNA配列の5'側に位置する。同様に、翻訳の終結に必要な終結コドン
及び転写終結シグナルは、第2のポリペプチドをコードしているDNA配列の3'側に
存在する。
【００７６】 本発明のポリペプチドを無関係の免疫原性タンパク質と共に含むような融合タ
ンパク質も提供される。好ましくはこの免疫原性タンパク質は、記憶応答を誘起
することが可能である。このようなタンパク質の例は、破傷風、結核及び肝炎タ
ンパク質を含む(例えば、Stouteら、New Engl. J. Med.、336:86-91(1997)を参
照のこと)。
【００７７】 好ましい態様において、免疫原性融合パートナーは、グラム陰性菌Haemophilu
s influenza Bの表面タンパク質であるプロテインDに由来する(国際公開公報第9
1/18926号)。好ましいプロテインD誘導体は、ほぼ1/3のタンパク質(例えば、最
初のN末端側の100〜110個のアミノ酸)を含み、かつプロテインD誘導体は、脂質
化(lipidate)される。ある好ましい態様において、リポタンパク質D融合パート
ナーの最初の109個の残基はN末端に含まれ、追加の外来性T-細胞エピトープを伴
うポリペプチドを提供し、かつ、大腸菌における発現レベルを増大する(従って
、発現エンハンサーとして機能する)。リピド尾は、抗原の抗原提示細胞への最
適な提示を確実にする。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の
非構造タンパク質であるNS I(ヘマグルチニン)を含む。典型的には、N末端側の8
1個のアミノ酸が使用されるが、T-ヘルパーエピトープを含む異なる断片を使用
することができる。
【００７８】 別の態様において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして公知のタンパク質
、又はその一部である(好ましくはC末端部分)。LYTAは、肺炎連鎖球菌（Strepto
coccus pneumoniae）に由来し、これはアミダーゼLYTAとして公知のN-アセチル-
L-アラニンアミダーゼを合成する(LytA遺伝子によりコードされる；Gene、43:26
5-292(1986))。LYTAは、ペプチドグリカン主鎖中のある結合を特異的に分解する
自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリン又はDEARのよ
うな一部のコリン類似体への親和性に寄与している。この特性は、融合タンパク
質の発現に有用な大腸菌CLYTA発現プラスミドの開発に活用されている。アミノ
末端にC-LYTA断片を含むハイブリッドタンパク質の精製が説明されている(Biote
chnology、10:795-798(1992)参照)。好ましい態様において、LYTAの反復部分を
、融合タンパク質に組込むことができる。反復部分は、残基178で始まるC末端領
域に認められる。特に好ましい反復部分は、残基188〜305に組込まれる。
【００７９】 概して、本明細書に記されたポリペプチド(融合タンパク質を含む)及びポリヌ
クレオチドは単離される。「単離された」ポリペプチド又はポリヌクレオチドと
は、その当初の環境から取除かれたものである。例えば、天然のタンパク質が、
天然のシステムにおいて同時に存在する物質の一部又は全てから分離されている
場合は、単離されている。
【００８０】 好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも純度約90％であり、より
好ましくは少なくとも純度約95％であり、及び最も好ましくは少なくとも純度約
99％である。ポリヌクレオチドは、例えば天然の環境の一部ではないベクターに
クローニングされる場合に、単離されていると見なされる。
【００８１】Ｔ細胞 免疫療法用組成物は、更に、又は代わりに、免疫原性ポリペプチドに複合され
たストレスタンパク質(「ストレスタンパク質複合体」)に特異的なＴ細胞を含む
ことができる。このような細胞は一般に、常法を用い、インビトロ又はエクスビ
ボにおいて調製される。例えば、Ｔ細胞は、Nexeil Therapeutics社(アービン、
CA)から入手できるISOLEX(登録商標)磁気細胞選択システム(同じく米国特許第5,
536,475号参照)；又は、Pan T Cell Isolation Kit、CD4+ T Cell Isolation Ki
t、及びCD8+ T Cell Isolation Kitを含む、Miltenyi Biotec社のMACS細胞分離
技術(同じく米国特許第5,240,856号；米国特許第5,215,926号；国際公開公報第8
9/06280号；国際公開公報第91/16116号及び国際公開公報第92/07243号も参照)の
ような、市販の細胞分離システムを用い、患者の骨髄、末梢血、又は骨髄もしく
は末梢血の画分から単離することができる。あるいは、Ｔ細胞は、関連する又は
無関係のヒト、非ヒト哺乳類、細胞株又は培養物に由来することができる。
【００８２】 Ｔ細胞は、ストレスタンパク質複合体、ストレスタンパク質複合体をコードし
ているポリヌクレオチド及び／又はストレスタンパク質複合体を発現している抗
原提示細胞(APC)で刺激することができる。この刺激は、ポリペプチドに特異的
なＴ細胞の生成を可能にするような条件下及び十分な時間で行われる。ストレス
ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、特異的Ｔ細胞の生成を促進するために、
ミクロスフェアのような、送達ビヒクル内に存在することが好ましい。
【００８３】 Ｔ細胞がポリペプチドで被覆された又はポリペプチドをコードしている遺伝子
を発現している標的細胞を殺傷するならば、このＴ細胞は、ストレスポリペプチ
ドに特異的であると考えられる。Ｔ細胞特異性は、様々な標準技術のいずれかを
用いて評価することができる。例えば、クロム放出アッセイ法又は増殖アッセイ
法において、溶解及び／又は増殖において、陰性対照と比較して2倍以上大きい
刺激指数は、Ｔ細胞特異性を示している。このようなアッセイ法は、例えばChen
ら、Cancer Res.、54:1065-1070(1994)に記されている。
【００８４】 Ｔ細胞増殖の検出は、様々な公知の技術により達成することができる。例えば
Ｔ細胞増殖は、DNA合成の増加率を測定することにより検出することができる(例
えば、トリチウム化されたチミジンによるＴ細胞培養物のパルス-標識により、
及びDNAに組込まれたトリチウム化されたチミジンの量の測定により)。ストレス
タンパク質複合体(100ng/ml〜100μg/ml、好ましくは200ng/ml〜25μg/ml)との3
〜7日間の接触は、Ｔ細胞増殖の少なくとも2倍の増加を生じるはずである。前述
の2〜3時間の接触は、標準のサイトカインアッセイ法を用いて測定されるような
、Ｔ細胞の活性化を生じ、ここではサイトカイン(例えばTNF又はIFN-γ)放出レ
ベルの2倍の増加がＴ細胞活性化を示している(Coliganら「免疫学最新プロトコ
ール(Current Prorocols in Immunology)」、第1巻、Wiley Intescience社、(Gr
eene, 1998))。ストレスポリペプチド、ポリヌクレオチド又はポリペプチド発現
APCへの反応により活性化されているＴ細胞は、CD4+及び／又はCD8+であること
ができる。Ｔ細胞は、標準技術を用いて増殖することができる。
【００８５】 好ましい態様において、Ｔ細胞は、患者又は関連するもしくは無関係のドナー
のいずれかに由来し、かつ刺激及び増殖後に、その患者に投与することができる
。治療目的で、ストレスポリペプチド、ポリヌクレオチド又はAPCへの反応によ
り増殖されるCD4+又はCD8+ Ｔ細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかにお
いて数の上で増大することができる。インビトロにおけるこのようなＴ細胞の増
殖は、様々な方法で達成することができる。例えば、Ｔ細胞は、インターロイキ
ン-2のようなＴ細胞増殖因子、及び／又はストレスタンパク質複合体を合成する
刺激細胞(stimulator cell)の添加のあり又はなしで、免疫原性ポリペプチドと
複合されたストレスポリペプチドに再曝露することができる。あるいは、ストレ
スタンパク質複合体の存在下で増殖する1種以上のＴ細胞は、クローニングによ
り数の上で増殖することができる。細胞のクローニング法は当技術分野において
周知であり、かつ限定希釈法を含む。
【００８６】薬学的組成物及びワクチン 本発明は、免疫原性組成物(すなわち、ワクチン)を含む薬学的組成物に混入さ
れている、ストレスタンパク質複合体ポリペプチド、ポリヌクレオチド、Ｔ細胞
及び／又は抗原提示細胞を提供する。薬学的組成物は、1種以上のこのような化
合物、及び任意に生理的に許容される担体を含有している。ワクチンは、1種以
上のこのような化合物、及び非特異的免疫応答能賦活剤として利用するアジュバ
ントを含むことができる。アジュバントは、外来性抗原に対する免疫応答を賦活
するいずれかの物質であることができる。アジュバントの例は、通常のアジュバ
ント、生分解性ミクロスフェア(例えば、ポリ乳酸ガラクチド(polylactic galac
tide))、免疫刺激性オリゴヌクレオチド及びリポソーム(その中に化合物が混入
されている；例えばFellertonの米国特許第4,235,877号参照のこと)を含む。ワ
クチン調製は一般に、例えばM.F. Powell及びM.J. Newman.編集「ワクチンデザ
イン(サブユニット及びアジュバント法)」、Plenum Press社(NY、1995)に記され
ている。本発明の範囲内の薬学的組成物及びワクチンは更に、生物学的に活性又
は不活性であることができるような他の化合物を含有することができる。例えば
、他の腫瘍抗原の1種以上の免疫原性部分が、組成物又はワクチン内に、融合ポ
リペプチドに混入されるか又は個別の化合物としてのいずれかで、存在すること
ができる。
【００８７】 薬学的組成物又はワクチンは、前述の1種以上のポリペプチドをコードしてい
るDNAを含むことができ、その結果ポリペプチドがインサイチューにおいて生成
される。前述のように、DNAは、核酸発現システム、細菌及びウイルスの発現シ
ステムを含む、当業者に公知の様々な送達システムのいずれかの中に存在するこ
とができる。多くの遺伝子送達技術が、当技術分野において周知であり、例とし
てRolland、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems、15:143-198(1998)、及
びそこに引用された文献に記されている。適当な核酸発現システムは、患者にお
ける発現に必要なDNAシステムを含む(適当なプロモーター及び終結シグナルなど
)。細菌送達システムは、その細胞表面にポリペプチドの免疫原性部分を発現し
かつそのようなエピトープを分泌する細菌(Bacillus-Calmette-Guerrinなど)の
投与に関連している。
【００８８】 好ましい態様において、DNAは、ウイルス発現システム(例えば、ワクシニア又
は他のポックスウイルス、レトロウイルス、もしくはアデノウイルス)を用いて
導入することができ、これらは非病原性(防御性)、複製コンピテントウイルスの
使用に関連している。適当なシステムは、例えばFisher-Hochら、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA、86:317-321(1989)；Flexnerら、Ann. N. Y. Acad. Sci.、569:8
6-101(1989)；Flexnerら、Vaccine、8:17-21(1990)；米国特許第4,603,112号、
同第4,769,330号、及び同第5,017,487号；国際公開公報第89/01973号；米国特許
第4,777,127号；英国特許第2,200,651号；欧州特許第0,345,242号；国際公開公
報第91/02805号；Berkner、Biotechniques、6:616-627(1988)；Rosenfeldら、Sc
ience、252:431-434(1991)；Kollsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:215-21
9(1994)；Kass-Eislerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:11498-11502(1993)
；Guzmanら、Circulation、88:2838-2848(1993)；及び、Guzmanら、Cir. Res.、
73:1202-1207(1993)に開示されている。このような発現システムへのDNAの混入
技術は、当業者には周知である。これらのDNAは更に、例えばUlmerら、Science
、259:1745-1749(1993)に説明され、かつCohen、Science、259:1691-1692(1993)
において検証されたように、「裸」であることができる。裸のDNAの取り込みは
、細胞に効率的に輸送される、生分解性ビーズ上をDNA被覆することにより増加
することができる。
【００８９】 当業者に公知のいずれか適当な担体を本発明の薬学的組成物において利用する
ことができるが、担体の種類は投与様式に応じて変動すると思われる。本発明の
組成物は、例えば局所、経口、点鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下又は筋肉内
投与を含む、投与のいずれか適当な方法のために製剤することができる。皮下注
射のような非経口投与について、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、
ワックス又は緩衝液を含むことが好ましい。経口投与について、マンニトール、
乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、
セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウムのような、前述の
担体又は固形担体のいずれかを使用することができる。生分解性ミクロスフェア
(例えばポリラクテートポリグリコレート)も、本発明の薬学的組成物のための担
体として使用することができる。適当な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国
特許第4,897,268号及び第5,075,109号に開示されている。
【００９０】 このような組成物は更に、緩衝液(例えば、中性に緩衝した生理食塩水又はリ
ン酸緩衝生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロース
、又はデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシ
ンのようなアミノ酸、酸化防止剤、キレート剤、例えばEDTA又はグルタチオン、
アジュバント(例えば水酸化アルミニウム)及び／又は保存剤も含むことができる
。あるいは、本発明の組成物は凍結乾燥剤として製剤することもできる。化合物
は、周知の技術を用いてリポソーム内に封入することもできる。
【００９１】 様々なアジュバントのいずれかを、本発明のワクチンにおいて使用することが
できる。ほとんどのアジュバントは、急激な代謝から抗原を保護するようにデザ
インされた基質、例えば水酸化アルミニウム又は鉱油、及び免疫応答賦活剤、例
えばリピドA、百日咳菌（Bortadella pertussis）又はヒト型結核菌（Mycobacte
rium tuberculosis）由来のタンパク質などを含む。適当なアジュバントは市販
されており、例としてフロイントの不完全アジュバント及び完全アジュバント(D
ifco Laboratories社、デトロイト、MI)；メルクアジュバント65(Merck社、ロー
ウェイ、NJ)；水酸化アルミニウムゲル(アルム)又はリン酸アルミニウムのよう
なアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化されたチロシン、ア
シル化された糖の不溶性懸濁液；カチオン性又はアニオン性の多糖誘導体；ポリ
ホスファゼン生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドA及びクイルAがあ
る。GM CSF又はインターロイキン2、-7又は-12のようなサイトカイン類も、アジ
ュバントとして使用することができる。
【００９２】 本明細書において提供されたワクチンにおいて、アジュバント組成物は、主に
Th1型免疫応答を誘導するようにデザインされることが好ましい。高レベルのTh1
型サイトカイン類(例えば、IFN-α、IL-2及びIL-12)は、投与された抗原に対す
る細胞媒介型免疫応答を誘起するのに好ましい傾向がある。対照的に、高レベル
のTh2型サイトカイン類(例えば、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及びTNF-β)は、体液
性免疫応答を誘起するのに好ましい傾向がある。本明細書において提供されるよ
うなワクチンの適応後、患者は、Th1-及びTh2-型応答を含む免疫応答を支持する
と思われる。主に応答がTh1-型であるような好ましい態様において、Th1-型サイ
トカインのレベルは、Th2-型サイトカインのレベルよりもはるかに大きく増大す
ると思われる。これらのサイトカインのレベルは、標準アッセイ法を用い、容易
に評価することができる。サイトカインファミリーの検証については、Mosmann
及びCoffman、Ann. Rev. Immunol.、7:145-173(1989)を参照のこと。
【００９３】 主にTh1-型応答の誘起に使用するのに好ましいアジュバントは、例えばモノホ
スホリルリピドA、好ましくは3-デ-O-アシル化されたモノホスホリルリピドA(3D
-MPL)のアルミニウム塩との組合せを含む。MPLアジュバントは、Corixa社(ハミ
ルトン、MT)から入手することができる(米国特許第4,436727号；同第4,877,611
号；同第4,866,034号、及び同第4,912,094号を参照のこと)。CpG-含有オリゴヌ
クレオチド(CpGジヌクレオチドはメチル化されていない)も、主にTh1-応答を誘
導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、かつ国際公開公報第96/0
2555号に開示されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくは
QS21であり、これは単独で又は他のアジュバントと併用することができる。例え
ば、増強されたシステムは、モノホスホリルリピドA及びのようなサポニン誘導
体の組合せ、例えば国際公開公報第94/00153号に開示されているようなQS21及び
313MPLの組合せ、もしくは国際公開公報第96/33739号に開示されたQS21がコレス
テロールにより消滅されるような、余り反応によって生成されない(reactogenic
)組成物に関連する。他の好ましい製剤は、水中油型乳剤及びトコフェノールを
含有している。水中油型乳剤中のQS21、3D-MPL及びトコフェロールに関連する特
に効力のあるアジュバント製剤は、国際公開公報第95/17210号に開示されている
。使用することができる別のアジュバントは、AS-2である(Smith-Kline Beecham
社)。本明細書において提供されたあらゆるワクチンは、抗原、免疫応答賦活剤
及び適当な担体又は賦形剤の組合せを生じるような周知の方法を用いて調製する
ことができる。
【００９４】 本発明のストレスポリペプチドは、更にTh1-型応答を主に誘起するアジュバン
トとしても使用することができる。ストレスポリペプチドは、免疫原性ポリペプ
チド及び任意に追加のアジュバントを含む他のワクチン成分と組合せて使用する
ことができる。
【００９５】 本明細書に記した組成物は、徐放性製剤(すなわち、投与後の化合物の緩徐な
放出を実現するカプセル又はスポンジ型の製剤)の一部として投与することがで
きる。このような製剤は概して、周知の技術を用いて調製することができ、かつ
例えば経口的、経直腸的又は皮下埋植により、もしくは所望の標的部位への移植
により投与することができる。徐放性製剤は、担体マトリックス中に分散された
及び／又は速度制御膜で周囲を取り囲まれた貯蔵器に含まれたポリペプチド、ポ
リヌクレオチド又は抗体を含有することができる。このような製剤に使用するた
めの担体は、生体適合性であり、かつ更に生分解性であり；好ましくはこの製剤
は、比較的一定レベルの有効成分の放出をもたらす。徐放性製剤内に含まれた有
効化合物の量は、移植部位、放出の速度及び期待される期間、並びに治療又は予
防される病態の性質により左右される。
【００９６】抗原提示細胞 様々な送達ビヒクルのいずれかを、薬学的組成物及びワクチンにおいて、腫瘍
細胞又は感染細胞を標的化する抗原-特異性免疫応答の成立を促進するために使
用することができる。送達ビヒクルは、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単
球及び効果的APCであるように操作され得る他の細胞のような、抗原提示細胞(AP
C)を含む。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大し、Ｔ細胞応答の活性
化及び／又は維持を改善し、それ自身抗腫瘍又は抗感染作用を有し、及び／又は
受容者に免疫学的に適合できる(すなわちBLAハロタイプの合致)ように遺伝子修
飾されるが、必ずしもではない。APCは一般に、様々な生物学的液体並びに腫瘍
及び前癌組織を含む器官のいずれかから単離され、かつ自家細胞、異系細胞、同
系細胞又は異種細胞であることができる。
【００９７】 ある好ましい本発明の態様は、抗原提示細胞として、樹状細胞又はそれらの前
駆体を使用する。樹状細胞は、高度に効力のあるAPCであり(Banchereau及びStei
nman、Nature、392:245-251(1998))、かつ予防的又は治療的抗腫瘍免疫を誘起す
るのに生理的アジュバントとして有効であることが示されている(Timmerman及び
Levy、Ann. Rev. Med.、5O:507-529(1999)を参照)。一般に樹状細胞は、それら
の典型的形状を基に(インサイチュー星状、インビトロにおいて認められる細胞
質プロセシング(樹状突起))、並びに標準アッセイ法により決定されるＢ細胞(CD
19及びCD20)、Ｔ細胞(CD3)、単球(CD14)及びナチュラルキラー細胞(CD56)の識別
マーカーの欠損を基に同定することができしている。樹状細胞は、当然、インビ
ボ又はエクスビボにおいて樹状細胞上に通常は認められないような特異的細胞表
面受容体又はリガンドを発現するように操作することができ、かつこのような修
飾された樹状細胞は、本発明により考察されている。樹状細胞の代わりに、分泌
型小胞抗原-負荷した樹状細胞(いわゆるエキソソーム)は、ワクチンにおいて使
用される(Zitvogelら、Nature Med.、4:594-600(1998))。
【００９８】 樹状細胞及び前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍-浸潤細胞、腫瘍周辺組織-浸潤
細胞、リンパ節、脾、皮膚、臍帯血又はいずれか適当な組織又は液体から得るこ
とができる。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球培養物へ、GM-CSF
、IL-4、IL-13及び／又はTNFαのようなサイトカインの組合せの添加により、エ
クスビボにおいて分化することができる。あるいは、末梢血、臍帯血又は骨髄か
ら収集されたCD34陽性細胞は、GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3
リガンド及び／又は樹状細胞の成熟及び増殖を誘導する他の成分の組合せの培養
培地への添加により、樹状細胞に分化することができる。
【００９９】 樹状細胞は、都合良く「未成熟」及び「成熟」細胞として分類され、これら2
種の良く特徴付けられた表現型の間の識別する簡単な方法がある。しかし、この
命名法は、全ての可能性のある分化の中間段階を排除するようには構築されない
。未成熟な樹状細胞は、抗原取り込み及びプロセシングの高い能力を伴うAPCと
して特徴付けられ、これはFcγ受容体、マンノース受容体及びDEC-205マーカー
の高い発現に相関している。成熟表現型は典型的には、これらのマーカーの比較
的低い発現、しかしクラスI及びクラスII NMC、接着分子(例えばCD54及びCD11)
、並びに補助的刺激分子(例えばCD4O、CD8O及びCD86)のような、Ｔ細胞活性化に
寄与する細胞表面分子の高い発現により特徴付けられる。
【０１００】 APCは一般に、ストレスタンパク質(又はその一部もしくは他の変種)をコード
しているポリヌクレオチドによりトランスフェクションされ、その結果ストレス
ポリペプチド又はその免疫原性部分は細胞表面に発現される。このようなトラン
スフェクションは、エクスビボで生じ、かつ次にこのようなトランスフェクショ
ンされた細胞を含有する組成物又はワクチンは、本明細書に記されたように治療
目的に使用することができる。あるいは、樹状細胞又は他の抗原提示細胞を標的
化する遺伝子送達ビヒクルを、患者に投与することができ、その結果インビボで
トランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボ及びエクスビボトランスフ
ェクションは、例えば一般に国際公開公報第97/24447号に開示されているような
当技術分野において公知の技術、又はMahviら、Immunology and Cell Biology、
5:456-460(1997)に記された遺伝子銃法を用いて実施される。樹状細胞の抗原負
荷は、樹状細胞又は前駆細胞を、ストレスポリペプチド、DNA(裸の又はプラスミ
ドベクター内)もしくはRNAと；又は抗原を発現している組換え細菌もしくはウイ
ルス(例えば、ワクシニア、トリポックス、アデノウイルス又はレンチウイルス
ベクター)と、インキュベーションすることにより実現することができる。負荷
の前に、このポリペプチドは、Ｔ細胞補助(例えば担体分子)を提供する免疫原性
パートナーと共有結合的に複合することができる。あるいは、樹状細胞は、複合
されていない免疫学的パートナーで、個別に又はポリペプチドの存在下でパルス
することができる。
【０１０１】治療的及び予防的方法 本発明のストレスタンパク質複合体及び薬学的組成物は、被験者に投与するこ
とができ、これによりヒト型結核菌感染を阻害し、腫瘍増殖を阻害し、癌の発症
を阻害し、及び癌又は感染症を治療又は予防する方法が提供される。
【０１０２】 処置は、予防及び治療を含む。予防又は治療は、単独の時点又は複数の時点で
の、単独又は複数の部位への単独直接注射(single direct injection)により実
施することができる。更に投与は、複数の部位にほぼ同時に行うことができる。
【０１０３】 患者又は被験者は、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、及
びヒツジ動物を含む。被験者はヒトが好ましく、かつ癌又は疾患に罹患していて
もしていなくともよい。
【０１０４】 一部の態様において、治療又は予防される病態は、癌又は前癌状態(例えば、
過形成、形成異常、異形成)である。癌の例は、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫
、脊索肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、偽性粘
液腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋腫、横紋筋腫、
結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、
汗管腺腫、脂腺腺腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌
、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛上皮癌、精上皮腫、胎生期癌、ウイルムス腫瘍
、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮細胞癌、神経膠腫、星状
細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神
経腫、希突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病
、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び
H鎖疾患を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】 一部の態様において、治療又は予防されるべき病態は、感染症である。感染症
の例は、病原体、ウイルス、細菌、真菌又は寄生体の感染症を含むが、これらに
限定されるものではない。ウイルスの例は、B型又はC型肝炎、インフルエンザ、
水痘、アデノウイルス、I型又はII型単純ヘルペスウイルス、牛痘、ライノウイ
ルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイ
ルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボーウイ
ルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイル
ス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスI型又はII型を含む
が、これらに限定されるものではない。細菌の例は、ヒト型結核菌、ミコバクテ
リウム、マイコプラズマ、ナイセリア及びレジオネラを含むが、これらに限定さ
れるものではない。寄生体の例は、リケッチア及びクラミジアを含むが、これら
に限定されるものではない。
【０１０６】 従って、前述の薬学的組成物及びワクチンは、癌又は感染症の発症の防止もし
くは癌又は感染症に罹患した患者の治療に使用することができる。癌は、悪性腫
瘍の存在を含む、当技術分野において一般に受け入れられている診断基準を用い
て診断することができる。薬学的組成物及びワクチンを、手術による原発性腫瘍
除去及び／又は放射線療法又は通常の化学療法薬の投与のような治療の、以前又
は以後に投与することができる。
【０１０７】 ある態様において、免疫療法は、能動免疫療法であってよく、この場合治療は
、免疫応答修飾物質(本明細書に記されたポリペプチド及びポリヌクレオチドな
ど)の投与が腫瘍又は感染細胞に対し反応するように内因性宿主免疫系をインビ
ボ刺激することに頼っている。
【０１０８】 別の態様において、免疫療法は、受動免疫療法であってよく、この場合治療は
、抗腫瘍作用を直接又は間接に媒介することができかつ完全な宿主免疫系には必
ずしも左右されないような、確立された腫瘍免疫反応性を伴う物質(エフェクタ
ー細胞又は抗体など)の送達に関連している。エフェクター細胞の例は、前述の
ようなＴ細胞、Tリンパ球(CD8+細胞傷害性Tリンパ球及びCD4+ T-ヘルパー腫瘍-
浸潤リンパ球)、キラー細胞(ナチュラルキラー細胞及びリンホカイン活性化キラ
ー細胞)、Ｂ細胞及び本明細書で提供されたポリペプチドを発現している抗原提
示細胞(樹状細胞及びマクロファージなど)を含む。好ましい態様において、樹状
細胞は、インビトロにおいて、ポリペプチドを発現するように修飾され、かつこ
れらの修飾されたAPCが被験者に投与される。本明細書で言及されたポリペプチ
ドに特異的なＴ細胞受容体及び抗体受容体は、養子免疫療法のためには、クロー
ニングされ、発現され、かつ他のベクター又はエフェクター細胞に導入される。
本明細書に提供されたポリペプチドは、受動免疫療法のために、抗体又は抗イデ
ィオタイプ抗体の作製に使用することができる(前記及び米国特許第4,918,164号
に開示)。
【０１０９】 エフェクター細胞は、一般に本明細書に記されたようなインビトロにおいて増
殖することにより養子免疫療法に十分な量得ることができる。単独の抗原特異性
エフェクター細胞をインビボでの抗原認識を維持しつつ数の上で数十億個に増殖
する培養条件は、当技術分野において周知である。このようなインビトロ培養条
件は、典型的には、抗原による間欠刺激を使用し、サイトカイン(IL-2など)及び
非分割フィーダー細胞の存在下であることが多い。前述のように、本明細書に記
された免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法に十分な数の細胞を作製するための
、抗原特異性Ｔ細胞培養物の迅速な増殖に使用することができる。
【０１１０】 特に、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞及び／又はＢ細胞のよう
な抗原提示細胞は、当技術分野において周知の標準技術を用い免疫反応性ポリペ
プチドでパルスするか、もしくは1種以上のポリヌクレオチドによりトランスフ
ェクションすることができる。例えば、抗原提示細胞を、組換えウイルス又は他
の発現システムにおける発現の増大に適したプロモーターを有するポリヌクレオ
チドでトランスフェクションすることができる。治療に使用するために培養した
エフェクター細胞は、増殖しかつ広範に分布し、かつインビボにおいて長期間生
存することができる。培養したエフェクター細胞は、IL-2を補充した抗原による
反復刺激により、インビボ増殖し、かつかなりの数が長期間生存するように誘導
することができる(例えばCheeverら、Immunological Reviews、157:177(1997)参
照)。
【０１１１】 あるいは、本明細書で言及したポリペプチドを発現しているベクターは、患者
から採取された抗原提示細胞に導入され、かつ同じ患者への戻し移植のためにエ
クスビボにおいてコロニー増殖される。トランスフェクションされた細胞は、当
技術分野において公知の手段を用い、好ましくは静脈内、腔内、腹腔内又は腫瘍
内投与により無菌型で、患者に再導入することができる。
【０１１２】投与及び用量 前記組成物は、多くは薬学的に許容される担体と共に、いずれか適当な方法で
投与される。本発明の状況における被験者への適当な細胞投与法を利用でき、か
つ1種よりも多い経路を用いて特定の細胞組成物を投与することができるが、特
定の経路が、他の経路よりもより迅速かつより効果的な反応を提供することが多
い。
【０１１３】 患者に投与される用量は、本発明の状況において、長期にわたり患者において
有益な治療反応を実現するか、もしくは感染又は感染に起因した疾患を阻害する
のに十分なものでなければならない。従って、組成物は、被験者に、特異的抗原
に対する効果的免疫応答を惹起するか、及び／又は、疾患又は感染症の症状及び
／又は合併症を緩和、軽減、治癒又は少なくとも一部停止するのに十分な量で投
与される。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」と定義される。
【０１１４】 本明細書に開示された治療用組成物の投与経路及び頻度、更には用量は、個体
毎に変動し、かつ標準技術を用いて容易に確立することができる。概して、薬学
的組成物及びワクチンは、注射(例えば、皮内、腫瘍内、筋肉内、静脈内、又は
皮下)、点鼻(例えば、吸引)又は経口により投与することができる。好ましくは
、1〜10回投与量を、52週間にわたって投与する。好ましくは、6回投与量を、1
ヶ月間隔で投与し、かつその後定期的に追加免疫ワクチンが投与される。別のプ
ロトコールが個々の患者に適していることがある。ある態様において、組成物の
2回の皮内注射が10日間間をあけて投与される。
【０１１５】 適当な投与量は、前述のように投与された場合に、抗腫瘍免疫応答を促進する
ことが可能であり、かつこれは基準レベル(未治療)よりも少なくとも1O〜50％高
いような化合物の量である。このような応答は、例えば、患者内の抗腫瘍抗体を
測定するか又はインビボにおいて患者の腫瘍細胞を殺傷することが可能であるよ
うな細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン-依存型生成によりモニタリングさ
れる。このようなワクチンは、更に、ワクチン投与された患者において、ワクチ
ン投与されない患者と比べて、改善された臨床の転帰(例えば、より頻繁な寛解
、完全又は部分的又は長期の疾患を伴わない生存)につながるような免疫応答を
惹起することが可能である。概して1種以上のポリペプチドを含有する薬学的組
成物及びワクチンについて、1回投与量中に存在する各ポリペプチドの量は、約1
00μg〜5mg/宿主体重kgである。適当な容量は、患者のサイズによって変動する
が、典型的には約0.1mL〜約5mLである。
【０１１６】 概して、適当な用量及び治療方式は、治療的及び／又は予防的利点を提供する
のに十分な量の有効化合物を提供する。このような反応は、治療を受けた患者に
おいて、未治療の患者よりもより改善された臨床の転帰(例えば、より頻繁な寛
解、完全又は部分的又は長期の疾患を伴わない生存)を確立することにより、モ
ニタリングすることができる。腫瘍タンパク質に対する予め存在する免疫応答の
増加は、一般に改善された臨床の転帰に相関している。このような免疫応答は、
一般に標準の増殖アッセイ法、細胞毒性アッセイ法又はサイトカインアッセイ法
を用いて評価され、これらは治療前及び後の患者から得た試料を用いて行うこと
ができる。
【０１１７】実施例 以下の実施例は、本発明を例示するために、ならびに当業者が本発明を製造お
よび使用するのを助けるために示される。実施例は、それ以外の点で本発明の範
囲を制限することがどのようにも意図されない。
【０１１８】実施例1:hsp110、grp170、およびgrp78の精製 本実施例は、hsp110およびgrp170の精製ならびにgrp78の精製の手順について
述べる。この結果は、調製物の同一性および純度を裏付ける。
【０１１９】 材料および方法 ダンス型ホモジナイザーを用いて、5倍体積の低張緩衝液(30mM重炭酸ナトリウ
ム(pH7.2)、1mM PMSF)中で、細胞ペレットまたは組織をホモジナイズした。溶解
産物を4500g、次いで100,000gで遠心分離して、破壊されなかった細胞、核、お
よび他の組織破片を除去した。上清を100,000gで2時間さらに遠心分離した。上
清を、20mM Tris-HCl、50mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM MnCl2で予め平
衡化されたコンカナバリンA-セファロースビーズ(最初の材料1ml当たりカラム体
積1ml)にアプライした。結合タンパク質を、15％ a-D-メチルマンノシド(a-D-MM
)を含む結合緩衝液Aで溶出した。
【０１２０】 Hsp110の精製のために、ConA-セファロースに結合しなかった材料を、20mM Tr
is-HCl(pH7.5)、200mM NaClで平衡化されたMono Q(Pharmacia)10/10カラムにア
プライした。結合タンパク質を、同じ緩衝液を用いて、500mM塩化ナトリウムま
での直線塩勾配(FR:3ml/分,40％〜60％B/60分)により溶出した。画分を収集し、
SDS-PAGEにより、次に、抗hsp110抗体を用いたイムノブロッティングにより分析
した。hsp110を含むプールされた画分(270mM〜300mM)をセントリプラス(Centrip
lus)(Amicon,Beverly,MA)により濃縮し、スーパーロース(Superose)12カラムに
アプライした。タンパク質を、流速0.2ml/分で、40mM Tris HCl(pH8.0)、150mM
NaClにより溶出した。画分をイムノブロットおよび銀染色により検査した。
【０１２１】 Grp170の精製のために、10％α-メチルマンノシドにより溶出されたConA-セフ
ァロースに結合した材料を、最初に、20mM Tris HCl(pH7.5)、150mM NaClで平衡
化されたMono Qカラムにアプライし、150〜500mM NaCl勾配により溶出した。Grp
170は300mM〜350mM NaClの間で溶出された。プールされた画分を濃縮し、スーパ
ーロース12カラムにアプライした。均一なgrp170を含む画分を収集し、SDS-PAGE
により、次に、抗grp170抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した。
【０１２２】 Grp78(Bip)の精製のために、ConA-セファロースに結合しなかったタンパク質
を、結合緩衝液B(20mM Tris-酢酸(pH7.5)、20mM NaCl、15mM β-メルカプトエタ
ノール、3mM MgCl2、0.5mM PMSF)で平衡化されたADP-アガロースカラム(Sigma C
hemical Co.,St.Louis,MO)にかけた。カラムを、0.5M NaClを含む結合緩衝液Bで
洗浄し、5mM ADPを含む緩衝液Bと共に室温で30分間インキュベートした。その後
、タンパク質を同じ緩衝液(約5倍のカラム体積)で溶出した。溶出物をMono Qカ
ラムを用いてFPLC装置で分離し、20〜500mM NaCl勾配により溶出した。Grp78は
、200mMから400mM塩の間に溶出された画分中に存在した。肝臓からHspまたはGrp
を精製するために、100,000g上清を、最初に、ブルーセファロース(blue sephar
ose)カラム(Pharmacia)にアプライして、アルブミンを除去した。全タンパク質
をブラッドフォード法(BioRad,Richmond,CA)で定量し、SDS-PAGE、次いで、Stre
ssGen Biotechnologies Corp.(Victoria,BC,Canada)から入手したgrp78に対する
抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した。
【０１２３】 結果 タンパク質hsp110、grp170、およびgrp78は腫瘍および肝臓から共に精製され
た。これら3つのタンパク質の均一な調製物が得られ、イムノブロッティングに
よりそれぞれの抗体に認識された。タンパク質の純度をSDS-PAGEおよび銀染色に
より評価した(図1)。
【０１２４】実施例2:腫瘍拒絶アッセイ法 本実施例は、腫瘍由来hsp110およびgrp170による免疫化が腫瘍抗原投与からマ
ウスを保護することを証明する。この結果は、予防免疫による腫瘍増殖の遅延な
らびに治療的免疫化による生存期間の延長を示す。
【０１２５】 材料および方法 BALB/cJマウス(ウイルス抗原を含まない)をジャクソン研究所(Jackson Labora
tory)(Bar Harbor,ME)から入手し、ロズウェルパーク癌研究所(Roswell Park Ca
ncer Institute)にあるマウス施設で飼育した。メチルコラントレンにより誘発
された線維肉腫(MethA)をプラモンド(Pramond)K.スリバスタヴァ(Srivastava)博
士(コネティカット大学医学部(University of Connecticut School of Medicine
),Farmington, Connecticut)から入手し、毎週200万個の細胞を継代することに
よりBALB/cJマウスからの腹水中で維持した。
【０１２６】 マウス(6〜8週齢の雌;1群当たり5匹のマウス)をPBSで免疫化するか、または腫
瘍もしくは肝臓に由来する様々な量のhsp110もしくはgrp170をPBS 200μlに溶解
して免疫化し、7日後に追加免疫した。最後の免疫化の7日後、マウスの右側腹部
に、2×104個のcolon26腫瘍細胞(生存率＞99％)を皮下注射した。colon26腫瘍は
、非常に治療抵抗性であるマウス腫瘍モデルの良い例である。他の実験において
、第2の免疫化の7日後にマウスをMethA腫瘍細胞の皮内注射により抗原投与した
。2方向の径を測定することにより、腫瘍増殖をモニターした。
【０１２７】 結果 hsp110およびgrp170によるワクチン接種の結果を、それぞれ、図2Aおよび図2B
に示す。PBSおよび肝臓由来hsp110またはgrp170で免疫化されたマウスは全て急
速に増殖する腫瘍を発生した。対照的に、腫瘍由来hsp110およびgrp170で免疫化
されたマウスは、著しい腫瘍増殖の遅延を示した。従って、腫瘍タンパク質と複
合体化されたhsp110またはgrp170は腫瘍増殖を著しく阻害する。
【０１２８】 この阻害効果は、腫瘍由来hsp110またはgrp170の用量に直接依存している。(
注射1回当たり)20μgのhsp110またはgrp170で免疫化されたマウスは、colon26腫
瘍増殖の阻害をわずかに示したか、または全く示さなかったのに対して、40μg
または60μgのhsp110またはgrp170で免疫化されたマウスは、ますます著しい腫
瘍増殖の遅延を示した。検査をしたそれぞれの日で(抗原投与の15、21、27日後)
、40μgおよび60μgの用量のhsp110およびgrp170で免疫化されたマウスにおいて
発生した腫瘍の平均体積は対照マウスのものより著しく小さかった(ｐ＜0.01、
スチューデントt検定)。しかしながら、PBSまたは肝臓由来hsp調製物を注射され
た群の平均体積の差は統計的有意性に達しなかった。
【０１２９】 さらに多量の腫瘍細胞(50,000個および100,000個)でマウスを抗原投与するこ
とにより、さらなる腫瘍拒絶アッセイ法を行った。同様の阻害結果が腫瘍由来hs
p110またはgrp170について得られたが、予想通り、これらの腫瘍はさらに急速に
増殖した。grp170はconA-セファロースカラムにより精製されたが、防御免疫が
腫瘍に由来するgrp170調製物で免疫化されたマウスでのみ観察され、正常肝臓組
織に由来するgrp170調製物で免疫化されたマウスでは観察されなかったので、co
nAによる汚染は除外することができる。
【０１３０】 等モル量で、grp170はhsp110より免疫原性があるように見える。grp78の免疫
原性も40μgのタンパク質を注射することにより試験したが、腫瘍増殖の遅延は
観察されなかった。この結果は、grp78には免疫原性がないか、または低いレベ
ルでしか免疫原性がないことを示している。
【０１３１】 これらの観察の一般性を他の系において試験するために、hsp110およびgrp170
の免疫原性を、メチルコラントレンにより誘発された(MethA)線維肉腫において
試験した。colon26腫瘍モデルでの免疫化データに基づいて、マウスを40μgのhs
p110またはgrp170で2回免疫化し、皮内注射により導入された100,000個のMethA
細胞で抗原投与した。
【０１３２】 図4A〜図4Cの折れ線図は、それぞれ個々の動物における腫瘍増殖の速度論を示
す。免疫化に反応した腫瘍増殖の注目に値する個体間差がgrp170群で観察された
。PBSで免疫化されたマウスはMethA腫瘍を発生した(図4A)。しかしながら、hsp1
10(図4B)またはgrp170(図4C)で免疫化されたマウスは保護された。ほとんどの動
物は初期に腫瘍を発生したが、その後、腫瘍は消失した。grp170で免疫化された
マウスにおいて、5匹のマウスのうち2匹が触診可能な腫瘍を完全に発生しなかっ
た(図4C)。
【０１３３】 治療的免疫化 進行性のcolon26腫瘍をまた治療モデルにおいて調べた。腫瘍細胞(500,000個)
を側腹部に注射し、腫瘍が目に見え触診可能になった時(例えば、6日目)から、
マウス(1群当たり10匹)に、肝臓またはcolon26由来hsp110またはgrp170を2回(7
日空けて)ワクチン接種した。マウスの生存を、様々な時点での腫瘍抗原投与後
に生残しているマウスのパーセントとして記録した。
【０１３４】 結果を図3Aおよび図3Bに示す。腫瘍由来(autologus)のhsp110(図3A)またはgrp
170(図3B)調製物で処置された、腫瘍を有するマウスは、未処置マウスまたは肝
臓由来hsp110もしくはgrp170で免疫化されたマウスと比較して、著しく長い生存
期間を示した。対照動物は全て30日以内に死んだが、各群の約半分が40日まで生
残し、grp170で処置されたマウスの20％が60日まで生残した。これらの結果は腫
瘍拒絶アッセイ法から得られたデータと一致し、grp170およびhsp110が有効な抗
癌ワクチンであることを再度示している。これらのデータはまた、grp170が、等
モルで、これらの2種類のタンパク質のうちより有効なタンパク質であるように
見えることを示している。
【０１３５】実施例3:CTLアッセイ法 抗腫瘍効果の媒介に細胞性免疫が重要であるように思われるので、腫瘍由来hs
p110またはgrp170調製物がCD8+T細胞反応を誘発する能力を分析するために、細
胞傷害性Tリンパ球(CTL)アッセイ法を行った。この結果は、腫瘍由来hsp110また
はgrp170によるワクチン接種が有効な腫瘍特異的CTL反応を誘発することを示す
。
【０１３６】 材料および方法 前記のようにマウスを2回免疫化した。第2の免疫化の10日後に脾臓を取り出し
、脾細胞(1×107個)を、7日間の免疫化に用いられた放射線照射された腫瘍細胞(
5×105個)との混合リンパ球腫瘍培養(MLTC) (10％FCS、1％ペニシリン/ストレプ
トマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、および50μM 2-メルカプトエタノール
を添加)において共培養した。次いで、脾細胞をフィコールパーク(Ficoll-Paque
)(Pharmacia)密度遠心分離により精製し、エフェクター細胞として用いた。細胞
により媒介される溶解を、標準的な51Cr遊離アッセイ法を用いてインビトロで測
定した。簡単に述べると、エフェクター細胞を、50:1、25:1、12.5:1、および6.
25:1の様々なエフェクター:標的比を用いて、V底96ウェルプレート(Costar,Camb
rige,MA)中で3回繰り返して系列希釈した。標的細胞(5×106個)を、100μCiのク
ロム酸[51Cr]ナトリウムを用いて37℃で1〜2時間標識した。51Crで標識された腫
瘍細胞(5,000個)を添加して、最終体積200μl/ウェルにした。
【０１３７】 標的細胞と培地だけを含んでいたウェル、または標的細胞と0.5％ TritonX-10
0だけを含んでいたウェルは、それぞれ自発遊離対照または最大遊離対照として
の役割を果たした。37℃および5％CO2で4時間のインキュベーション後、ガンマ
カウンターで上清150μlの放射能を分析した。特異的溶解率(％)を以下の式:特
異的溶解％＝100×(実験による遊離−自発遊離)/(最大遊離−自発遊離)により計
算した。自発遊離は最大遊離の＜10％であった。
【０１３８】 結果 図5に示すように、grp170またはhsp110の精製に用いられた腫瘍に対する腫瘍
特異的細胞傷害性が観察された。しかしながら、未処置マウスからの細胞は標的
細胞を溶解することができなかった。さらに、colon26に由来するhsp110またはg
rp170調製物で免疫化されたマウスからの脾細胞は、colon26腫瘍に特異的な溶解
を示したが、MethA腫瘍細胞に特異的な溶解を示さなかった。同様に、MethAに由
来するhsp110またはgrp170は、MethAに特異的な溶解を示したが、colon26細胞に
特異的な溶解を示さなかった。これらの結果は、腫瘍由来hsp110またはgrp170に
よるワクチン接種が有効な腫瘍特異的CTL反応を誘発することを証明する。
【０１３９】実施例4:腫瘍由来タンパク質を投与された樹状細胞によるワクチン接種 本実施例は、抗原提示細胞が、hsp110またはgrp170免疫化により誘発された抗
腫瘍反応において役割を果たす能力を証明する。この結果は、樹状細胞(DC)がhs
p110またはgrp170シャペロン化ペプチド(chaperoned peptide)を提示することが
できることを示す。さらに、hsp110またはgrp170を投与されたDCによる免疫療法
がタンパク質による直接的な免疫化より有効であった。
【０１４０】 材料および方法 骨髄を四肢の長骨から流し、塩化アンモニウムを用いて骨髄から赤血球を除去
した。RPMI-10 10ml(200U/ml(＝20 ng/ml)マウスGM-CSF(R＆D System)、10mM HE
PES、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5
0mM 2-メルカプトエタノールを添加)を入れた細菌用ペトリ皿に、白血球をペト
リ皿1枚あたり2×106個でプレーティングした。培地を3日目および6日目に交換
した。8日目に、細胞を使用するために回収した。DC調製物の量を細胞表面マー
カー分析および形態分析で特徴付けた。DC(1×107/ml)に、腫瘍由来hsp110また
はgrp170(200μg)を37℃で3時間投与した。細胞を洗浄し、腹腔内注射のためにP
BSに再懸濁した(マウス1匹当たり、106個の投与されたDCをPBS 100μlに懸濁し
た)。全ての工程を10日後に繰り返した(処置マウス1匹当たり合計2回の免疫化)
。第2の免疫化の10日後、マウスをcolon26腫瘍細胞(2×104個)で抗原投与した。
【０１４１】 結果 PBSまたは樹状細胞のみを与えたマウスにおいて腫瘍は進行性で増殖した(図6)
。しかしながら、腫瘍由来hsp110またはgrp170を投与されたDCで免疫化されたマ
ウスにおいて、腫瘍増殖の著しい遅延が観察された。これらの結果は、hsp110ま
たはgrp170による直接的な免疫化の研究と一致している。タンパク質による直接
的な免疫化(タンパク質40μgの2回の皮下注射)と、投与されたDC(タンパク質20
μgを投与された106個のDC)による免疫化を比較すると、投与されたDCに基づく
免疫療法は、直接的な免疫化に基づく免疫療法より有効であり、かつ少ないタン
パク質を用いたので、より効率的であることが示唆される。
【０１４２】実施例5:熱処置によるより有効なワクチンの産生 本実施例は、熱処置された腫瘍から精製されたストレスタンパク質が、熱処置
されていない腫瘍から精製されたストレスタンパク質より、腫瘍サイズの減少に
さらに有効であることを証明する。この効力の増大は、高温でのペプチド結合の
改善、ならびに他の熱により誘導される変化を反映している可能性がある。
【０１４３】 最初に、マウスの側腹部に、100,000個のcolon26腫瘍細胞を皮下接種した。腫
瘍が約1/1cmのサイズに達した後、以前に述べられたようにWBHを行った。簡単に
述べると、マウスを、餌、床敷、および水を備える38℃に予め温めたマイクロア
イソレーターケージに入れた。次いで、予め温めた新鮮な空気が入ってくる重力
対流オーブン(gravity convection oven)(MemmentモデルBE500,East Troy,WI)に
ケージを入れた。39.5℃(±0.5℃)の核心温度に達するまで、体温を30分毎に1℃
徐々に上げた。マウスを6時間オーブン内で維持した。マウスの核心温度を、Ele
ctric laboratory Animal Monitoring system Pocket Scanner(Maywood,NJ)を用
いてモニターした。hsp110、grp170、およびhsp70を精製するために、翌日、腫
瘍を取り出した。免疫化を、前記のように、1週間置いて2回、PBS、40μgの腫瘍
由来hsp110、40μgのWBH処置腫瘍由来hsp110、40μgの腫瘍由来grp170、40μgの
WBH処置腫瘍由来grp170、40μgの腫瘍由来hsp70、または40μgのWBH処置腫瘍由
来hsp70を用いて行った。次いで、マウスを、20,000個のcolon26腫瘍生細胞で抗
原投与した。腫瘍体積(mm3)を、腫瘍抗原投与の0、3、6、9、12、15、18、およ
び21日後に測定した。
【０１４４】 結果を図7に示す。腫瘍抗原投与の12日後および15日後で、hsp110およびhsp70
で処置された群は両方とも、PBS処置マウスと比較して著しく減少した腫瘍体積
を示した。腫瘍抗原投与の15日後までに、WBH処置腫瘍から精製されたhsp110ま
たはhsp70は、熱処置されていない腫瘍から精製されたhsp110またはhsp70と比較
して、腫瘍体積の減少に著しく有効であった。しかしながら、15日までに、熱処
置されていない腫瘍から精製されたgrp170は、WBH処置腫瘍からのgrp170より有
効であった。
【０１４５】 これらのデータは、発熱様の暴露が、colon26腫瘍から精製されたこれら2種類
の(熱誘導性)hspの抗原提示経路および/またはペプチド結合特性に影響を及ぼす
が、熱不感受性grpについては影響を及ぼさない可能性があることを示す。従っ
て、hsp70およびhsp110のワクチン能力は発熱レベルの治療後に著しく高まる。
このことは、プロテオソーム活性の上昇、hspのペプチド結合の強化、hspに結合
するタンパク質の範囲の変化、または他の要因に起因する可能性がある。hspは8
時間のハイパーサーミア暴露の16時間後に精製されたので、この効果は37℃でし
ばらく維持される。この免疫原性強化につながる要因は、hsp結合ペプチドの抗
原性プロフィールの変化および/または強化に由来する可能性が高い。ハイパー
サーミア出現後の安定性は、その後に長時間なお存在する、抗原処理における上
流変化(例えば、プロテオソーム活性の刺激)を示唆している。発熱様ハイパーサ
ーミアの別の特徴は、colon26腫瘍における非常に著しいhsp誘導である。従って
、調べられたhspの場合、発熱様の加熱はより効率的なワクチンをもたらすだけ
でなく、よりに多くのワクチンをももたらす。最後に、ハイパーサーミアに起因
する観察されたワクチン効率の上昇がhsp110およびhsc70にだけ見られたことは
興味深い。別組のストレス条件(例えば、酸素欠乏および他の還元状態)により調
節されるが、熱により調節されないgrp170は、熱によってそのワクチン能力が減
少する。
【０１４６】 これらの観察に加えて、図7に示すデータは、加熱されていない対照腫瘍(マウ
ス)から精製されたgrp170が、等質量でhsp70またはhsp110(加熱なし)と比較した
場合、ワクチン効率において著しく効率的であることを示している。この、hsp1
10と比較して増大したgrp170の効率はまた前記の研究に反映されている。この比
較は、等質量のこれらのタンパク質の投与に基づいており、分子サイズを考慮に
入れた場合(すなわち、モルで比較を行った場合)、増大したgrp170の効率はさら
に悪化する。第3に、ここで、hsp70は、ワクチン効率が(もう一度、等モルでは
なく等質量で) hsp110とほぼ等しいように見える。
【０１４７】実施例6:Grp170およびHsp110のシャペロン活性 本実施例は、タンパク質凝集アッセイ法により、grp170およびhsp110がタンパ
ク質のシャペロンとなり、凝集を妨げることができることを証明する。この結果
は、hsp70について証明された効率(オー(Oh)ら,1997,J.Biol.Chem.272:31636-31
640)と比較して、増大したgrp170およびhsp110の効率を示す。
【０１４８】 レポータータンパク質であるホタルルシフェラーゼの存在下で熱処理をした際
に得られる光散乱の増加の抑制により、熱処理により誘導されるタンパク質凝集
を妨げるストレスタンパク質の能力を評価した。ルシフェラーゼを、等モル量の
hsp110またはgrp170と共に43℃で30分間インキュベートした。320nmでの光学密
度の増加を測定することにより、凝集をモニターした。単独で加熱されたルシフ
ェラーゼの光学密度を100％に設定した。
【０１４９】 結果を図8に示す。ルシフェラーゼ単独で観察された100％の凝集と比較して、
ルシフェラーゼと1:1モル比のhsp110は凝集を約20％まで抑えた。ルシフェラー
ゼと1:1モル比のgrp170は約40％の凝集をもたらした。これらは、ルシフェラー
ゼと1:1モル比のhsp70が70％の凝集をもたらした、オーら,1997,J.Biol.Chem.27
2:31636-31640により用いられた条件と同じ条件である。従って、grp170およびh
sp110は、タンパク質結合および凝集阻止においてhsp70より大きな効率を示す。
hsp110のループドメインを欠失させた研究(オーら,1999,J.Biol.Chem.272(22):1
5712-15718)に基づいて、このシャペロン活性効率の増大は、hsp110およびgrp17
0の両方に見出される、より大きなループドメインに起因する可能性が高い。
【０１５０】 hsp110およびgrp170は両方ともペプチド結合クレフトを示すように思われる。
しかしながら、hsp110およびgrp170はそのC末端ドメインがhsp70とは劇的に異な
る。hsp70タンパク質の場合、C末端ドメインはペプチド結合クレフトの蓋として
機能するらしく、結合ペプチド/タンパク質の性質および/または会合ペプチド/
タンパク質に対する親和性に重大な影響を及ぼす可能性がある。hsp110およびgr
p170は両方とも、hsc70と比較して、熱変性タンパク質への結合および熱変性タ
ンパク質の安定化に著しく効率的であるように見える。このことはこれらの構造
的な違いを反映し、ストレスタンパク質がワクチンとして機能する能力の一要因
であるペプチド結合特性に影響を及ぼす可能性がある。hsp70およびhsp110はワ
クチン効率がほぼ同じであるが、異なるサブセットのペプチドを結合するのかも
しれない。すなわち、hsp110は、hsc70に容易に結合しない抗原エピトープを運
ぶ可能性がある。すなわち、hsp70およびhsp110は、異なる(質量)効率とはいか
ないまでも異なるワクチン能力を示す可能性がある。grp170について同様に論じ
ることができる。これらのストレスタンパク質のモル効率における著しい差は、
ペプチド結合親和性が異なること、それぞれのストレスタンパク質ファミリーに
結合されるペプチドの性質が異なること、またはこれら4種類の各ストレスタン
パク質群と相互作用する抗原提示細胞の親和性が異なることに起因する可能性が
ある。この群において最も効率的なワクチンであるgrp170が群の唯一の糖タンパ
ク質であることもまた注目に値する。
【０１５１】実施例7:hsp110とhsp25およびhsp70との相互作用 本実施例は、大きな分子複合体に存在することが発見されたhsp110の天然の相
互作用を証明する。イムノブロット分析および共免疫沈降研究により、この複合
体の成分として他の2つの熱ショックタンパク質hsp70およびhsp25が同定された
。精製されたhsp25、hsp70、およびhsp110はインビトロで調べられた場合、大き
な複合体を自発的に形成し、互いと直接相互作用することが観察された。このイ
ンビトロ系にルシフェラーゼを添加すると、熱ショック後に、ルシフェラーゼは
このシャペロン複合体の中に移動することが観察された。2種類のhsp110欠失変
異体を調べることにより、hsp110のペプチド結合ドメインがhsp25との相互作用
に必要とされるが、hsp70との相互作用には必要とされないことが証明された。h
sp110-hsp70-hsp25複合体の潜在的な機能について検討する。
【０１５２】 材料および方法 試薬 ウサギ抗hsp110抗体はリーヨーン(Lee-Yoon),Dら,1995,J.Biol.Chem.270,1572
5-15733により特徴付けられている。アフィニティ精製されたマウス抗hsc70モノ
クローナル抗体、ウサギ抗マウスhsp25抗体、ラット抗hsp90抗体、およびラット
抗TCP-1aモノクローナル抗体、ならびに組換えhsc70およびマウスhsp25は全てSt
ressGen Biotechnological Corp(Victoria,Canada)から入手した。抗His抗体はA
mershamから購入した。colon26腫瘍細胞は、5％CO2インキュベーター内で、10％
ウシ血清を添加したDMEM中で培養した。
【０１５３】 プラスミド構築および発現 組換えの、Hisタグ融合された、hsp110およびここで用いた2種類の欠失変異体
の精製は、オー,H.J.ら,1997,J.Biol.Chem.272,31636-31640およびオー,H.J.ら,
1997,J.Biol.Chem.274:15712-15718に記載されている。簡単に述べると、hsp110
変異体の構築のために、プライマー (変異体＃1、アミノ酸375〜858)および (変異体＃2、アミノ酸508〜858)をポリメラーゼ連鎖反応に用いた。PCR産物をpR
SETAベクター(Invitrogen)にクローニングし、His6-(エンテロキナーゼ認識配列
)および追加のAsp-Arg-Trp-Gly-Ser(変異体＃1用)またはAsp-Arg-Trp(変異体＃2
用)をhsp110変異体のN末端に付加した。プラスミドで大腸菌JM109(DE3)株を形質
転換し、発現産物をNi2-ニトリロ三酢酸-アガロースカラム(QIAGEN,Inc.)により
精製した。Bio-Radタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定し
た。
【０１５４】 天然hsp110の精製 細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、Teflonホモジナイザーを用いて、5倍体積
の緩衝液(30mM NaHCO3(pH7.5)、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル)と共にホ
モジナイズした。ホモジネートを12,000×gで20分間遠心分離し、上清を、100,0
00×gで2時間さらに遠心分離した。最初に、細胞抽出物をConA-セファロースカ
ラムにアプライし、非結合タンパク質を収集し、20mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM
NaCl、0.1mMジチオスレイトールで平衡化されたイオン交換カラム(MonoQ,Pharma
cia)にかけた。結合タンパク質を直線塩勾配(200mM〜350mM NaCl)で溶出した。
プールされたhsp110画分をセントリコン(centricon)30(Amicon)を用いて濃縮し
、20mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1mM DTTで平衡化された高速液体クロマ
トグラフィー(HPLC)用サイズ排除カラム(スーパーロース6,Pharmacia)にアプラ
イし、次いで、0.2ml/分の流速で溶出した。タンパク質マーカーとして、チログ
ロブリン(669kDa)、フェリチン(440kDa)、カタラーゼ(158kDa)、アルブミン(67k
Da)、およびオボアルブミン(43kDa)を用いた。
【０１５５】 ウエスタンブロット分析 細胞をPBSで洗浄し、50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2mM EDTA、1％Trit
on X-100、およびプロテアーゼ阻害剤中で溶解した。氷上で30分間のインキュベ
ーション後、細胞抽出物を、等量のSDS試料緩衝液(50mM Tris-HCl(pH6.8)、5％
β-メルカプトエタノール、2％SDS、10％グリセロール)と共に10分間煮沸し、10
,000gで20分間遠心分離した。等量のタンパク質試料を7.5〜10％SDS-PAGEにかけ
、イモビロン(immobilon)-Pメンブレン(Millipore,Ltd.,UK)に電気的に移した。
メンブレンを、TBST(20mM Tris-HCl(pH7.4)、137mM NaCl、0.05％Tween-20)に溶
解した5％脱脂乳を用いて室温で1時間ブロッキングし、次いで、TBSTで1:1000に
希釈された一次抗体と共に2時間インキュベートした。洗浄後、メンブレンを、T
BSTで1:2000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGまた
はヤギ抗マウスIgGと共にインキュベートした。化学発光増幅(Enhanced Chemilu
minescence)検出システム(Amersham,Arlington Heights,IL)を用いて、免疫反応
性を検出した。
【０１５６】 免疫沈降 細胞を冷PBSで3回洗浄し、緩衝液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、2mM E
DTA、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、1％NP40、10μg/mlロイペ
プチン、25μg/mlアプロチニン、1mM ABESF、0.025％NaN3)中で溶解した。溶解
産物を遠心分離し、上清を、プロテインAビーズ30mlと共に0.05倍体積の免疫前
血清で1時間、前吸着(presorb)させた。溶解産物を、hsp110抗体(1:100)またはh
sc70抗体(1:200)またはhsp25抗体(1:100)と共に4℃で一晩インキュベートした。
シャペロンとの相互作用をインビトロで分析するために、組換え野生型hsp110お
よびhsp110変異体を、最初に、hsc70またはhsp25と共に30℃でインキュベートし
た。次いで、hsc70抗体またはhsp25抗体を添加し、4℃で一晩さらにインキュベ
ートした。免疫複合体を、プロテインA-アガロース(30μl)で2時間、沈降させた
。沈降物を、50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.1％SDS、0.5％デオキシコ
ール酸ナトリウム、1％NP40で3回洗浄し、SDS試料緩衝液30〜40μlを添加し、5
分間煮沸した。上清を7.5〜12％SDS-PAGEにかけ、イムノブロッティングにより
分析した。
【０１５７】 ルシフェラーゼとHSPとの相互作用 25mM Hepes(pH7.9)、5mM酢酸マグネシウム、50mM KCl、5mM b-メルカプトエタ
ノール、および1mM ATPに溶解したhsp110、hsc70、およびhsp25(各150nM)と共に
、ルシフェラーゼ(Boehringer Mannheim)を室温または43℃で30分間インキュベ
ートした。溶液を16,000gで20分間遠心分離し、20mM Tris-HCl(pH7.8)、150mM N
aCl、および2mM DTTで平衡化されたセファクリル(Sephacryl)S-300カラム(Pharm
acia)に上清を負荷した。タンパク質を、0.24ml/分の流速で、4℃で溶出した。
画分を収集し、ウエスタンブロッティングにより分析した。
【０１５８】 結果 hsp110はhsc70およびhsp25を含む大きな複合体として存在する hsp110の生理学的役割を調べるために、Colon26細胞における天然hsp110の特
徴付けを行った。細胞抽出物を、ConA-セファロースカラムおよびMonoQカラムで
の連続クロマトグラフィーにかけた後、部分的に精製されたhsp110画分をスーパ
ーロース6サイズ排除カラム(最大分解能5,000kDa)にかけた。ConAおよびイオン
交換により精製されたhsp110画分は、スーパーロースカラムから、200kDa〜700k
Daのサイズ範囲の画分に溶出することが観察された(図9A)。セファクリル300(デ
キストランアリル/ビスアクリルアミドマトリックス)カラムを用いて作業を繰返
し、分析により同様のデータが得られた。
【０１５９】 hsp110が高分子量の１本の広いピークとして溶出されたので、この大きなイン
サイチューhsp110複合体がまた、さらなる成分(潜在的に、他の分子シャペロン
および/またはhsp110と相互作用し得る細胞基質を含む)を含む可能性があること
は理にかなっている。この可能性を調べるために、イオン交換カラムおよびサイ
ズ排除カラムから得られた精製hsp110画分を、入手可能な抗体を用いる他のHSP
のイムノブロッティングにより調べた。図9Bに示すように、hsp90、hsc70、T-複
合体ポリペプチド1(TCP-1)、およびhsp25に対する抗体を用いた。4種類全てのタ
ンパク質を全細胞溶解産物で容易に検出することができた(レーン1、3、5、およ
び7)。hsp110画分を調べた場合に、TCP-1およびhsp90は観察されなかった(レー
ン2および6)。しかしながら、hsc70およびhsp25は両方ともhsp110と同時に精製
されることが判明し、hsc70の全細胞画分はhsp25の全細胞画分より著しく多かっ
た。サイズ排除カラムからのhsc70およびhsp25のクロマトグラフィープロフィー
ルもまた、hsp110のものと同様のパターンを示した(図9A)。
【０１６０】 この同時精製もまたこれら3種類の分子シャペロン間の相互作用を反映したの
か確かめるために、Colon26細胞抽出物およびhsp110画分を用いて、相互的な共
免疫沈降分析を行った。hsc70およびhsp25は、抗hsp110抗体を用いてhsp110と共
に沈降することが示された(図10A)。逆に、hsp110は、抗hsc70抗体または抗hsp2
5抗体で共沈された(図10Bおよび図10C、上部)。対応する負の結果を伴う陰性対
照として免疫沈降を行うために、免疫前血清も用いた。最後に、hsc70とhsp25と
の相互作用を、hsc70抗体およびhsp25抗体を用いて分析した。もう一度、これら
2種類のタンパク質は互いと共免疫沈降することが観察された(図10Bおよび図10C
、下部)。前記の研究から、hsp110、hsc70、およびhsp25はインサイチューで直
接的または間接的に相互作用すると結論づけることができる。
【０１６１】 インビトロでのhsp110とhsc70およびhsp25との相互作用の分析 hsp110、hsc70、およびhsp25がインビトロで相互作用するか、ならびに精製タ
ンパク質成分を用いることにより高分子量複合体を形成することができるかを確
かめるために、この混合物にルシフェラーゼを潜在的な基質として添加した。hs
p110は、熱変性後に、このレポータータンパク質を可溶化できることが示されて
いる。ルシフェラーゼを、hsp110、hsc70、およびhsp25混合物と共に(1:1のモル
比で)室温または43℃で30分間インキュベートした。可溶性画分をセファクリルS
-300カラムにかけ、溶出された画分をSDS-PAGE上で移動させ、hsp110、hsc70、h
sp25、およびルシフェラーゼに対する抗体を用いたイムノブロッティングにより
分析した。
【０１６２】 この研究の結果を図11Aおよび図11Bに示す。再度、hsp110、hsc70、およびhsp
25は高分子量画分に存在することが判明した。しかしながら、これらの画分は、
インビボで見られるもの(図11A)より著しく大きな分子サイズで溶出された。さ
らに、熱処理は、hsp110、hsc70、およびhsp25の溶出パターンを変えないことが
分かった。しかしながら、加熱前にhsp110複合体と同時に溶出しなかった(単量
体として存在する)ルシフェラーゼは、熱暴露後に高分子量構造に移動すること
が観察された(図11B)。これらの実験において、ルシフェラーゼのほとんど全て
が可溶性形態で維持された。ルシフェラーゼは単独で加熱された場合、急速に不
溶性になった。熱ショックは、3種類のhsp110、hsc70、またはhsp25の可溶性に
影響を及ぼさなかった。
【０１６３】 前記のデータにより、hsp110、hsc70、およびhsp25はインビトロで高分子量構
造で同時精製され、同様に、ルシフェラーゼも存在すれば加熱後に同時精製され
ることが分かる。このことは、これらのタンパク質がどのようにそれら自身と相
互作用するのか、またはこれらのいずれか2つが相互作用することを全く示して
いない。しかしながら、加熱されたルシフェラーゼが可溶性のままであることは
、これらのシャペロンの少なくとも1つと相互作用した証拠である。これらのシ
ャペロンがどのように相互作用するかを確かめるために、共免疫沈降実験を、精
製タンパク質の対を用いて再度行った。hsc70およびhsp110はhsp25の非存在下で
相互作用することが判明し(図12、レーン1)、それに対応して、hsp110は、hsc70
の非存在下でhsp25単独と共に沈降することが観察された(レーン4)。最後に、hs
c70およびhsp25はまたhsp110の非存在下で共沈する(レーン8)。
【０１６４】 最後に、hsp110シャペロンの最も単純化した形態(すなわち、機能形態および
非機能形態)であることが以前に示されている2種類のhsp110欠失変異体(オー,H.
J.ら,1999,J.Biol.Chem.274:15712-15718)を調べることにより、hsp110、hsc70
、およびhsp25間の相互作用を明らかにするこのインビトロ研究を展開した。調
べられた第1の変異体(＃1)は、hsp110のN末端ATP結合ドメインを欠いているが、
残りの配列(すなわち、隣接するβシートペプチド結合ドメインおよび他のC末端
配列)を含む(サイズ:75kDaおよびアミノ酸375〜858を含む)。この変異体は、フ
ォールディング可能な状態に熱変性ルシフェラーゼを安定化する能力おいて十分
に機能的であることが示されている。ここで用いられた第2の変異体(＃2)は、AT
P結合ドメインならびに隣接するβシート(ペプチド結合)ドメインを欠いている
が、残りのC末端配列を含んでいた(サイズ:62kDaおよびアミノ酸508〜858を含む
)。最近、この変異体は、熱変性ルシフェラーゼを可溶性状態に維持するシャペ
ロン機能を遂行できないことが示されている。
【０１６５】 変異体＃1(ATP結合ドメインなし)は、hsp70(レーン2)およびhsp25(レーン5)の
両方と共沈することが観察された。このことから、これらの相互作用はATP結合
ドメインを必要としないことが分かる。しかしながら、変異体＃2(hsp110のATP
領域およびペプチド結合領域の両方を欠く)はhsp70とだけ会合することが観察さ
れた(レーン3)。このことから、hsp25およびhsp70は異なる部位でhsp110と相互
作用することができ、hsp110とhsp25との会合にはhsp110のペプチド結合ドメイ
ンが必要であることが分かる。
【０１６６】 考察 本実施例は、Colon26細胞におけるhsp110の天然の相互作用の研究について述
べる。この結果から、hsp110はhsc70およびhsp25と同時に精製されること、さら
に、これら3種類のタンパク質を共免疫沈降できることが分かる。共免疫沈降の
結果はこれらのシャペロン間の直接的な相互作用を反映している可能性があるこ
とを確かめるために、また、これらの相互作用を明確にするために、精製された
hsp110、hsc70、およびhsp25を用いてインビトロ研究を行った。これら3種類の
シャペロンはまたインビトロで大きな分子複合体を自発的に形成することが判明
した。さらに、この複合体は添加基質の非存在下で形成するが、熱ストレスによ
って、基質(ルシフェラーゼ)を複合体内に移動するように誘導することができる
。
【０１６７】 これらのタンパク質の各対(すなわち、hsc70とhsp110、hsc70とhsp25、および
hsp110とhsp25)は直接的に相互作用できることも分かった。このことと、細胞溶
解産物から得られた共沈データから、これらの相互作用はインサイチューで自然
に起こることが強く示される。さらに、2種類のhsp110欠失変異体を用いること
により、hsp110のペプチド結合ドメインはhsp25結合に必要とされるが、hsc70結
合には必要とされず、hsp110のATP結合ドメインは、hsc70との相互作用にもhsp2
5との相互作用にも必要とされないことが証明された。このことから、hsp110は
そのペプチド結合ドメインを介してhsp25に結合することが示唆される。hsc70-
hsp110結合がhsp110ペプチド結合ドメインの非存在下で起こることから、hsc70
はその(すなわちhsc70の)ペプチド結合ドメインを介してhsp110に能動的に結合
している可能性があることが示唆されるが、この2つのタンパク質が他のC末端ド
メインの関与によって相互作用する可能性はなくならない。
【０１６８】 これらのhsp110とhsc70との相互作用は、これらのタンパク質が協同的に機能
することができる方法に関する可能性を提起する。hsc70およびhsp110のペプチ
ド結合ドメインは、シャペロン機能の遂行における、これらのシャペロンの「実
働部隊(business end)」に相当すると思われるので、これらのペプチド結合ドメ
インは基質と能動的に会合するが、互いに会合しないことが予想される。このこ
とは、この複合体が細胞の要求を待ち受けるシャペロン「収納区画(storage com
partment)」に相当するという可能性を提起する。しかしながら、熱ショック後
に熱変性ルシフェラーゼがこの画分に移動することは、この複合体それ自体に能
動的なシャペロン活性があることを示している。基質をhsp110からhsc70に移動
させて、その後にDnaJホモログおよび他のシャペロンと連携してフォールディン
グを行うように、hsc70はhsp110を上にのせている可能性がある。
【０１６９】 hsp110は、hsc70と同様に(オー,H.J.ら,1997,J.Biol.Chem.272:31636-31640;
オー,H.J.ら,1999,J.Biol.Chem.274:15712-15718)、DnaJコシャペロン(co-chape
ron)と連携したフォールディング機能を有することがまだ示されてない。しかし
ながら、hsp110はhsp70とは異なるATP結合特性を示し、hsp110の可能性のあるコ
シャペロンが発見される可能性がある。以前のインビトロ研究から、sHSP(例え
ば、hsp25)は非天然タンパク質を結合するが、リフォールディングにはhsp70の
存在が依然として必要とされることが証明されている(リー(Lee),G.J.ら,1997,E
MBO J.16,659-671;ヤコブ(Jakob),U.ら,1993,J.Biol.Chem.268,7414-7421;メル
ク(Merck),K.B.ら,1993, J.Biol.Chem.268,1046-1052;カンピンガ(Kampinga),H.
H. ら,1994,Biochem.Biophys.Res.Commun.204,170-1177;エルンスパーガー(Ehrn
sperger),M. ら,1997, EMBO J.16,221-229)。hsp110およびsHSPは、シャペロン
機構を含むhsp70-DnaJへの後の往復(shuttling)のために、広範囲の様々な基質
の特異的な結合に作用する可能性がある。
【０１７０】 これら3種類のシャペロンが相互作用することは一般的な現象を示している可
能性がある。最近、プレソフスキ・ビグ(Plesofsky-Vig)およびブランブル(Bram
bl)は、アカパンカビ(Neurospora crassa)の小HSP(hsp30と呼ばれる)が2種類の
細胞タンパク質hsp70およびhsp88に結合することを示した。hsp88のクローニン
グおよび分析から、hsp88はアカパンカビのhsp110に相当することが分かった(プ
レソフスキ・ビグ,N.およびブランブル,R.,1998,J.Biol.Chem.273,11335-11341)
。このことから、ここで述べた相互作用は系統学的に保存されていることが示唆
される。さらに、ハタヤマ(Hatayama)は、FM3A細胞におけるhsp110(hsp105と呼
ばれる)とhsp70との相互作用について述べている(ハタヤマ,Tら,1998,Biochem.B
iophys.Res.Comm.248,394-401)。本実施例で観察されたhsp110複合体のサイズお
よびhsc70との相互作用(これもさらなるイオン交換クロマトグラフィー段階を用
いた)は、この最近の報告と明らかに似ており、非常によく一致している。最後
に、ステロイドホルモン受容体におけるhsc70および他のタンパク質との会合が
以前に確認されたにもかかわらず、本研究ではhsp90およびTCP-1はhsp110複合体
において観察されなかった。しかしながら、最近、hsp110ファミリーの酵母の構
成要員をコードするSSE1は糖質コルチコイド受容体の機能に必要とされ、hsp90
と物理的に会合していることが示された(リウ(Liu),X.D.ら,1999, J.Biol.Chem.
274,26654-26660)。
【０１７１】 本実施例で示したデータから、この複合体は、より多種多様な基質タンパク質
をフォールディング可能な状態に保つ、および/またはより効率的に基質タンパ
ク質をフォールディング可能な状態に保つ、改善した能力をもたらすことが示唆
される。この結果から、さらなるシャペロンの存在下で変性タンパク質をリフォ
ールディングするために獲得された改善した能力があり得ることがさらに示唆さ
れる。
【０１７２】実施例8:ストレスポリペプチド複合体のインビトロ形成および安定性 本実施例は、ストレスポリペプチドと免疫原性ポリペプチドの複合体がインビ
トロで生成でき、このような複合体が凍結融解後に安定なままであることを証明
する。さらに、hsp110およびgrp170は両方とも、異なるペプチド(癌および感染
症と関連する抗原を含む)と複合体を形成することができる。
【０１７３】 図13は、インビトロで結合複合体を形成した後の、抗hsp110抗体および抗grp1
70抗体を用いたher-2/neu細胞内ドメイン(ICD)免疫沈降の結果を示す。レーン1
は205kDa〜7.4kDaのタンパク質標準である。レーン2はhsp110＋抗hsp110抗体で
ある。レーン3はhsp110＋ICDである。レーン4はgrp170＋ICD(結合緩衝液に溶解)
である。レーン5はgrp170＋ICD(PBSに溶解)である。レーン6はICDである。レー
ン7はhsp110である。
【０１７４】 図14は、抗hsp110抗体を用いた複合体免疫沈降後の、新鮮な試料(左レーン)お
よび凍結融解試料(中央レーン)におけるhsp110-ICD複合体を示すウエスタンブロ
ットである。右レーンはICDである、これらの結果から、hsp110-ICD複合体は凍
結融解後に安定であることが分かる。
【０１７５】 図15は、改良ELISAおよびp546(HLA-A2結合親和性およびhsp110に対する予想さ
れる結合のために選択された、her-2/neu膜貫通ドメインの10merペプチド を用いた、hsp-ペプチド結合を示す棒グラフである。このペプチドをビオチン化
し、インビトロでhsp110と混合した(PBS 150μl中、ペプチド 60μgおよびhsp11
0 60μg)。混合物を43℃で30分間、次いで、37℃で1時間インキュベートした。
混合物を、セントリコン-10遠心分離機を用いて精製して、非結合ペプチドを除
去した。BSA(1％)もまたビオチン化ペプチド100μgと共に同じ条件下でインキュ
ベートし、精製した。ウェルを、コーティング緩衝液に溶解した異なる濃度の精
製混合物、ビオチン化ペプチド(陽性対照)、またはBSA(陰性対照)でコーティン
グした。4℃で一晩のインキュベーション後、ウェルをPBS-Tween20(0.05％)で3
回洗浄し、PBSに溶解した1％BSAを用いて室温で1時間ブロッキングした。洗浄後
、1:1000ストレプトアビジン-HRPをウェルに添加し、プレートを室温で1時間イ
ンキュベートした。TMB基質を添加することにより発色させ、450nmでの吸光度を
読み取った。精製混合物の濃度は、1μg/ml(白い棒)、10μg/ml(斜交平行線の棒
)、および100μg/ml(濃い点描の棒)であった。
【０１７６】 図16は、新鮮な試料および凍結融解されている試料を用いて、インビトロで結
合複合体を形成した後の、抗hsp110抗体を用いたヒト型結核菌抗原Mtb8.4および
Mtb39免疫沈降の結果を示す。レーン1は205kDa〜7.4kDaのタンパク質標準である
。レーン2はhsp110＋Mtb8.4である。レーン3はhsp110＋Mtb8.4(凍結融解後)であ
る。レーン4はMtb8.4である。レーン5はhsp110である。レーン6はhsp110＋Mtb39
である。レーン7はhsp110＋Mtb39(凍結融解後)である。レーン8はMtb39である。
レーン9は抗hsp110抗体である。
【０１７７】実施例9:ストレスポリペプチド複合体は細胞性免疫反応を誘発する 本実施例は、her-2/neuに由来するペプチド(her-2/neuの細胞内ドメイン(ICD;
アミノ酸残基676〜1255)、細胞外ドメイン 、または膜貫通領域(p546)を含む)と複合体化されたhsp110が、刺激されたCTLに
よるγ-インターフェロン(IFN-γ)産生により測定されるように免疫原性である
ことを証明する。このデータから、ICDと複合体化されたhsp110は、her-2/neuの
他のペプチドと複合体化されたhsp110より強いCTL反応を生じることが分かる。
【０１７８】 図17は、組換えマウスhsp110-ICD複合体25μgを用いた腹腔内免疫後のA2/Kbト
ランスジェニックマウス(1群当たり5匹の動物)のT細胞によるIFN-γ産生(ELISPO
Tアッセイ法でのスポットの数により測定される)を示す棒グラフである。これら
のマウスは、HLA-A2提示が可能であり、ならびにマウスポリα3ドメインを保持
し、さらなる細胞表面タンパク質相互作用をもたらすように、ハイブリッドヒト
/マウスクラスI分子の遺伝子が導入されている。2週間後に動物を追加免疫し、
その2週間後に屠殺した。対照群は25μgのICDもしくはhsp110を注射されたか、
または免疫化されなかった。抗CD8抗体でコーティングしたダイナビーズ(Dynabe
ads)および磁気分離を用いてCD8 T細胞を枯渇させた。総脾細胞または枯渇した
細胞(5×106細胞/ml)を25μg/ml PHA(チェックの棒)または20μg/ml ICD(濃い点
描の棒)と共にインビトロで一晩培養し、ELISPOTアッセイ法を用いてIFN-γ分泌
を検出した。
【０１７９】 図18は、インビトロで再構成されたhsp110-ペプチド複合体の免疫原性(IFN-γ
分泌用ELISPOTアッセイ法での陽性スポットの数により測定される)を示す棒グラ
フである。組換えハムスターhsp110(100μg)を、HLA-A2結合剤である9mer her-2
/neuペプチドp369(100μg)と共に43℃で30分間インキュベートし、その後、室温
で60分間インキュベートした。この複合体を、セントリコン-10遠心分離機を用
いて精製して、非結合ペプチドを除去した。8週齢のHLA-A2トランスジェニック
マウス(n=4)を、PBS 200μlに溶解した60μgのhsp110＋ペプチド複合体(群A, 斜
交平行線の棒)またはペプチドのみ(群B, 濃い点描の棒)で腹腔内免疫し、2週間
後に追加免疫した。最後の注射の2週間後に、動物を屠殺した。PHA(陽性対照)、
免疫用ペプチド、またはhsp110を15U/mlのヒト組換えIL-2と共に添加した時に、
動物の脾細胞(107細胞/ml)が、PHA(陽性対照)、免疫用ペプチド、またはhsp110
によりインビトロで刺激された。非刺激細胞(陰性対照)のカウントは＜40であり
、刺激細胞のカウントから引かれた。
【０１８０】 図19は、インビトロで再構成されたhsp110-ペプチド複合体の免疫原性(IFN-γ
分泌用ELISPOTアッセイ法での陽性スポットの数により測定される)を示す棒グラ
フである。組換えハムスターhsp110(100μg)を、HLA-A2結合剤である10mer her-
2/neuペプチドp546(100μg)と共に43℃で30分間インキュベートし、その後、室
温で60分間インキュベートした。この複合体を、セントリコン-10遠心分離機を
用いて精製して、非結合ペプチドを除去した。8週齢のHLA-A2トランスジェニッ
クマウス(n=2)を、PBS 200μlに溶解した60μgのhsp110＋ペプチド複合体(群A,
斜交平行線の棒)またはペプチドのみ(群B, 濃い点描の棒)で腹腔内免疫し、2週
間後に追加免疫した。最後の注射の2週間後に動物を屠殺した。PHA(陽性対照)、
免疫用ペプチド、またはhsp110を15U/mlのヒト組換えIL-2と共に添加した時に、
動物の脾細胞(107細胞/ml)が、PHA(陽性対照)、免疫用ペプチド、またはhsp110
によりインビトロで刺激された。非刺激細胞(陰性対照)のカウントは＜40であり
、刺激細胞のカウントから引かれた。
【０１８１】実施例10:ストレスポリペプチド複合体は特異的抗体反応を誘発する 本実施例は、A2/Kbトランスジェニックマウスにおけるhsp110-her-2/neu ICD
複合体による免疫化が抗体反応を誘発することを証明する。この反応は特異的で
あり、her-2/neu ICDのみの投与により起こる反応より著しく大きい。従って、
本発明のストレスタンパク質複合体は、細胞性免疫および体液性免疫の両方を刺
激することができる。
【０１８２】 図20は、hsp110-ICD(her-2/neu)複合体で腹腔内免疫した後の、A2/Kbトランス
ジェニックマウスにおける特異的な抗hsp110抗体反応を示すグラフである。血清
および抗体の希釈の関数として、ELISA結果を450nmでの光学密度(OD)としてプロ
ットした。抗hsp110の陽性対照(黒四角)、非関連抗体の陰性対照(白丸)、ならび
に0日目(黒丸)、14日目(白四角、点線)、および28日目(白四角、実線)の血清に
ついての結果を示す。これらの結果から、マウスはhsp110に対する自己免疫反応
を起さなったことが確認される。
【０１８３】 図21は、hsp110-ICD複合体で腹腔内免疫した後の、A2/Kbトランスジェニック
マウスにおける特異的な抗ICD抗体反応を示すグラフである。血清および抗体の
希釈の関数として、ELISA結果を450nmでの光学密度(OD)としてプロットした。抗
ICDの陽性対照(黒四角)、非関連抗体の陰性対照(白菱形)、ならびに0日目(黒丸)
、14日目(白四角、点線)、および28日目(白四角、実線)の血清についての結果を
示す。これらの結果から、マウスは、ストレスタンパク質複合体による免疫化の
後に、her-2/neuのICDに対する特異的な抗体反応を起こしたことが確認される。
【０１８４】 図22は、異なるワクチン処方で初回刺激した2週間後の、A2/Kbトランスジェニ
ック動物における特異的な抗ICD抗体反応を比較した棒グラフである。結果を、
血清および抗体の様々な希釈に対する450nmでのODとしてプロットした。棒は、h
sp110-ICD(点描の棒)、完全フロイントアジュバントに溶解したICDの陽性対照(C
FA;チェックの棒)、ICDのみ(斜交平行線の棒) で初回刺激された動物、抗ICD抗
体(濃い点描の棒)、および非関連抗体の陰性対照(白い棒)のデータを示す。
【０１８５】 図23は、hsp110-ICD複合体を用いてA2/Kbトランスジェニックを皮下初回刺激
または腹腔内初回刺激した2週間後の、特異的な抗ICD抗体の生成を比較した棒グ
ラフである。結果を、血清および抗体の様々な希釈に対する450nmでのODとして
プロットした。棒は、0日目での血清(点描の棒)、14日目での血清(腹腔内)(チェ
ックの棒)、14日目での血清(皮下)(斜交平行線の棒)、抗ICD抗体(濃い点描の棒)
、および非関連抗体の陰性対照(白い棒)を示す。
【０１８６】実施例11:Hsp110ベクターでトランスフェクトされた腫瘍細胞はHsp110を過剰発
現する 本実施例は、hsp110をコードするベクターでトランスフェクトされたcolon26
細胞(CT26)(CT26-hsp110細胞)を特徴付けたデータを示す。これらのCT26-hsp110
細胞は、イムノブロットおよび免疫蛍光染色により証明されるようにhsp110を過
剰発現する。
【０１８７】 図24Aは、CT26-hsp110細胞のhsp110発現が、トランスフェクトされていないCT
26細胞および空のベクターでトランスフェクトされたCT26細胞(CT26-ベクター)
と比較して増加していることを示すイムノブロットである。CT26(レーン1)、CT2
6-ベクター(レーン2)、およびCT26-hsp110(レーン3)からの等量のタンパク質試
料を10％SDS PAGEにかけ、イモビロン-Pメンブレンに移した。メンブレンをhsp1
10抗体でプロービングした。洗浄後、メンブレンを、TBSTで1:2,000に希釈され
た西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGまたはヤギ抗マウスIgGと共
にインキュベートした。化学発光増幅検出システムを用いて、免疫反応性を検出
した。
【０１８８】 図24Bは、CT26-hsp110細胞のhsc70発現が、トランスフェクトされていないCT2
6細胞または空のベクターでトランスフェクトされたCT26細胞と比較して増加し
ていないことを示す。メンブレンをhsc/hsp70抗体でプロービングした以外は図2
4と同様に、CT26(レーン1)、CT26-ベクター(レーン2)、およびCT26-hsp110(レー
ン3)からの等量のタンパク質試料を調製した。
【０１８９】 図25Aは、CT26細胞におけるhsp110の免疫蛍光染色を示す顕微鏡写真である。
染色の前日に細胞をカバーガラスに播種した。次いで、カバーガラスをウサギ抗
hsp110抗体(1:500希釈)と共にインキュベートし、その後、FITC標識イヌ抗ウサ
ギIgG染色を行った。正常ウサギIgGを陰性対照として用いた。
【０１９０】 図25Bは、空のベクターでトランスフェクトされたCT26細胞におけるhsp110の
免疫蛍光染色を示す顕微鏡写真である。図25Aと同様に細胞を調製し、免疫染色
した。
【０１９１】 図25Cは、hsp110過剰発現細胞におけるhsp110の免疫蛍光染色を示す顕微鏡写
真である。図25Aと同様に細胞を調製し免疫染色した。
【０１９２】実施例12:Hsp110を過剰発現する腫瘍細胞の増殖特性 本実施例は、CT26-hsp110細胞のインビボおよびインビトロ増殖特性を特徴付
けるデータを示す。
【０１９３】 図26は、播種1〜5日後の細胞数としてプロットされた、野生型およびhsp110ト
ランスフェクト細胞株のインビトロ増殖特性を示すグラフである。細胞を、2×1
04細胞/ウェルの密度で播種した。24時間後に、細胞をカウントした(0日目と指
定した)。示された日に、3個のウェルからの細胞をカウントした。結果は、野生
型CT26細胞(丸)、空のベクターでトランスフェクトされたCT26細胞(四角)、およ
びhsp110トランスフェクトCT26細胞(三角)を用いた3つの独立した実験の平均±S
Dである。
【０１９４】 図27は、軟寒天におけるコロニー形成能力に及ぼすhsp110過剰発現の影響を示
す棒グラフである。野生型CT26細胞、空のベクターでトランスフェクトされたCT
26-ベクター細胞、およびhsp110過剰発現CT26-hsp110細胞を0.3％寒天にプレー
ティングし、軟寒天においてコロニーを形成する能力(≧0.2)について分析した
。CT26-ベクターと比較してP＜0.05であった(スチューデントt検定により評価し
た)。
【０１９５】 図28は、野生型およびhsp110トランスフェクトCT26細胞株のインビボ増殖特性
を示すグラフである。5×104個の細胞をbalb/cマウスの側腹部に皮下接種した。
キャリパスで縦径および横径を測定して、腫瘍増殖を毎週2回記録した。CT26野
生型細胞(丸)、空のベクターでトランスフェクトされたCT26細胞(四角)、hsp110
でトランスフェクトされたCT26細胞(5×104個)(上向き三角)、およびhsp110でト
ランスフェクトされたCT26細胞(5×105個)(下向き三角)についての腫瘍体積(mm3 )を腫瘍移植後の日数の関数としてプロットした。
【０１９６】実施例13:CT26-Hsp110細胞による免疫化は腫瘍抗原投与から保護する 本実施例は、放射線照射されたhsp110過剰発現CT26細胞で免疫化されたマウス
が、CT26生細胞による後の抗原投与から保護されることを証明する。さらに、CT
26-hsp110細胞による免疫化は、腫瘍特異的なCTL反応および抗体反応を誘発する
。
【０１９７】 図29は、CT26生細胞による抗原投与に対する反応に及ぼす、放射線照射された
hsp110過剰発現細胞を注射した影響を示すプロットである。マウスの左側腹部に
、5×105個の放射線照射された(9,000rad)CT26-hsp110細胞を皮下注射した。2週
間後、マウスの右側腹部にCT26生細胞を用いて抗原投与した。予備免疫(preimmu
nization)なしのマウスにおける腫瘍増殖も示した。結果を、腫瘍抗原投与後の
日数の関数として、PBSで免疫化され、5×105個のCT26細胞で抗原投与されたマ
ウス(丸);放射線照射された、空のベクターを有するCT26細胞で免疫化され、5×
105個のCT26細胞で抗原投与されたマウス（四角）；放射線照射された、空のベ
クターを有するCT26細胞で免疫化され、5×106個のCT26細胞で抗原投与されたマ
ウス(上向き三角); 放射線照射されたCT26-hsp110細胞で免疫化され、5×105個
のCT26細胞で抗原投与されたマウス(下向き三角);および放射線照射されたCT26-
hsp110細胞で免疫化され、5×106個のCT26細胞で抗原投与されたマウス(菱形)に
ついての腫瘍の無いマウスのパーセントとしてプロットした。
【０１９８】 図30は、腫瘍由来hsp110による免疫化により誘発された腫瘍特異的なCTL反応
を示すグラフである。マウスに、5×105個の放射線照射された(9,000rad)CT26-
空のベクターおよびCT26-hsp110細胞を皮下注射した。2週間後、脾細胞をエフェ
クター細胞として単離し、放射線照射されたColon26を用いてインビトロで5日間
、再刺激した。標的細胞として51Cr標識Colon26を用いて、リンパ球の細胞傷害
活性を分析した。この実験においてMethA腫瘍細胞も標的として用い、細胞溶解
は観察されなかった。結果を、エフェクター:標的比の関数として、対照(丸)、
放射線照射されたCT26細胞(四角)、および放射線照射されたCT26-hsp110細胞(三
角)についての特異的溶解率(％)としてプロットした。
【０１９９】 図31は、放射線照射されたhsp110過剰発現細胞で免疫化した後の、CT26細胞に
対する抗体反応を示すグラフである。マウスに、5×105個の放射線照射された(9
,000rad)CT26-空のベクターおよびCT26-hsp110細胞を皮下注射した。2週間後、
血清を収集し、ELISAを用いて抗体反応についてアッセイした。結果を、血清希
釈の関数として、対照(丸)、CT26-空のベクター(四角)、およびCT26-hsp110(三
角)についての450nmでのODとしてプロットした。
【０２００】実施例14:GM-CSF分泌細胞はCT26-Hsp110細胞の保護効果を高める 本実施例は、GM-CSF遺伝子でトランスフェクトされた細胞がCT26-hsp110細胞
と同時に注射された場合、この併用療法で処置された全てのマウスを腫瘍の無い
ままにする、腫瘍抗原投与に対する保護の強化をもたらすことを証明する。
【０２０１】 図32は、hsp110過剰発現細胞の増殖に及ぼす、バイスタンダー(bystander)細
胞からのGM-CSFの影響を示すグラフである。マウスに、以下のとおり5×104個の
腫瘍生細胞を皮下注射した：CT26-空のベクター細胞(丸)、CT26-ベクター細胞＋
放射線照射されたB78H1GM-CSF細胞(2:1の比;四角)、CT26-hsp110細胞＋放射線照
射されたB78H1GM-CSF細胞(2:1の比;上向き三角)、CT26-hsp110細胞(下向き三角)
、CT26-hsp110細胞＋放射線照射されたB78H1細胞(2:1の比;菱形)。B78H1GM-CSF
は、CM-CSF遺伝子でトランスフェクトされたB16細胞であるのに対して、B78H1は
野生型細胞である。腫瘍増殖を、腫瘍の大きさを測定することにより記録し、移
植後の日数の関数として腫瘍体積(mm3)としてプロットした。
【０２０２】 図33は、野生型CT26腫瘍細胞抗原投与に対する反応に及ぼす、放射線照射され
たhsp110過剰発現腫瘍ワクチンおよびGM-CSF分泌バイスタンダー細胞を同時注射
した影響を示すグラフである。マウスを、以下のとおり、放射線照射された5×1
05個の腫瘍細胞で皮下免疫した：CT26-空のベクター細胞、CT26-ベクター細胞＋
B78H1GM-CSF細胞(2:1の比;四角)、CT26-hsp110細胞＋B78H1GM-CSF細胞(2:1;上向
き三角)、CT26-hsp110細胞(下向き三角)、CT26-hsp110細胞＋B78H1細胞(2:1;菱
形)。PBS(丸)でのみ免疫化されたマウスの結果も示す。マウスを別の部位にCT26
野生型細胞で抗原投与し、1日おきに腫瘍発生についてモニターした。結果を、
腫瘍抗原投与後の示された日数での、腫瘍の無いマウスのパーセントとしてプロ
ットした。
【０２０３】実施例15:腫瘍由来ストレスタンパク質複合体による免疫化は細胞性免疫を刺激
し、転移性腫瘍増殖を阻害する 本実施例は、本発明の腫瘍由来ストレスタンパク質複合体を用いて、細胞性免
疫を刺激し、転移性腫瘍増殖を阻害することができることを証明する。インター
フェロン-γの分泌が、colon26腫瘍由来hsp110およびgrp170ならびにB16F10由来
grp170を用いた免疫化により刺激された。B16F10由来grp170による免疫化はまた
、腫瘍特異的CTL反応および肺転移の減少を誘発することが示された。
【０２０４】 図34は、colon26由来hsp110またはgrp170による免疫化がインターフェロン(IF
N)γの分泌を刺激することを示す棒グラフである。マウスをhsp110またはgrp170
で免疫化した1週間後に、ELISPOTアッセイ法のために脾細胞を単離した。フィト
ヘマグルチニン(PHA)処理リンパ球を陽性対照のために用いた。
【０２０５】 図35は、B16F10腫瘍由来grp170を用いた免疫化により誘発された腫瘍特異的CT
L反応を示すグラフである。マウスをgrp170(40μg)で1週間おきに2回免疫化した
。第2の免疫化の1週間後、脾細胞をエフェクター細胞として単離し、放射線照射
されたB16F10細胞を用いて5日間インビトロで再刺激した。51Cr標識されたB16F1
0細胞またはMethA細胞を標的細胞として用いて、脾細胞の細胞傷害活性を分析し
た。結果を、エフェクター:標的比の関数として、対照(丸)、肝臓由来grp170(四
角)、B16F10由来grp170(上向き三角)、およびMethA由来grp170(下向き三角)につ
いての特異的溶解率(％)としてプロットした。
【０２０６】 図36は、B16F10由来grp170による免疫化がIFN-γ分泌を刺激することを示す。
マウスをhsp110またはgrp170で免疫化した1週間後に、ELISPOTアッセイ法のため
に脾細胞を単離した。
【０２０７】 図37はマウスの肺転移を示し、ここで、1×105個のB16F10細胞を、それぞれの
C57BL/6マウスの尾静脈に静脈内接種した。腫瘍細胞を注射した24時間後に、マ
ウスをPBS(黒丸)、肝臓由来grp170(白丸)、または腫瘍由来grp170(40μg)で処置
した。3種類の処置を全実験計画の間に行った。腫瘍注射の3週間後に動物を屠殺
し、肺を取り出し、表面コロニーをカウントした。
【０２０８】 前記から、本発明の特定の態様が例示のために本明細書で説明されたが、本発
明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がされ得ることが理解さ
れると思われる。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって制限される
場合を除いて制限されることはない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 精製されたhspタンパク質の銀染色及び分析を示す。腫瘍由来
のhsp110及びhsp70のゲル染色は、各々、レーン1及び2に示す。レーン3及び4は
、各々、hsp110抗体及びhsp70抗体によるイムノブロット分析の結果を示す。
【図１Ｂ】 精製されたgrpタンパク質の銀染色及び分析を示し、腫瘍由来
のgrp170のゲル染色はレーン1に、肝由来のgrp170のゲル染色はレーン2に、腫瘍
由来のgrp78のゲル染色はレーン3に、肝由来のgrp78のゲル染色はレーン4に示す
。grp170抗体及びgrp78抗体によるイムノブロット分析の結果は、各々、レーン5
〜6及び7〜8に示す。
【図２Ａ】 精製したhsp110による免疫化後の腫瘍増殖を示す。腫瘍容積(m
m3)は、PBS(丸)、肝由来のhsp110 40μg(四角)、腫瘍由来のhsp110 20μg(上向
き三角)、腫瘍由来のhsp110 40μg(下向き三角)、及び腫瘍由来のhsp110 60μg(
菱形)で免疫化されたマウスについて、20,000個のcolon26腫瘍細胞で抗原投与後
の日数に対してプロットした。
【図２Ｂ】 精製したgrp170による免疫化後の腫瘍増殖を示す。腫瘍容積(m
m3)は、PBS(丸)、肝由来のgrp170 40μg(四角)、腫瘍由来のgrp170 20μg(上向
き三角)、腫瘍由来のgrp170 40μg(下向き三角)、及び腫瘍由来のgrp170 60μg(
菱形)で免疫化されたマウスについて、20,000個のcolon26腫瘍細胞で抗原投与後
の日数に対してプロットした。
【図３Ａ】 腫瘍由来のhsp110で免疫化後、colon26腫瘍を生じるBalb/Cマ
ウスの生存を示すプロットである。生存率は、PBS(対照、丸)、肝由来のhsp110
40μg(四角)、及び腫瘍由来のhsp110 40μg(三角)で免疫化されたマウスへの、
腫瘍接種後の日数の関数としてプロットした。
【図３Ｂ】 腫瘍由来のgrp170で免疫化後、colon26腫瘍を生じるBalb/Cマ
ウスの生存を示すプロットである。生存率は、PBS(対照、丸)、肝由来のgrp170
40μg(四角)、及び腫瘍由来のgrp170 40μg(三角)で免疫化されたマウスへの、
腫瘍接種後の日数の関数としてプロットした。
【図４Ａ】 PBS(対照)で免疫化したマウスにおける腫瘍抗原投与後の日数
の関数としての、腫瘍サイズを示すグラフである。個々の線は、動物間の変動を
示すための個々のマウスを示す。
【図４Ｂ】 MethAで誘導された腫瘍由来のhsp110で免疫化したマウスにお
ける腫瘍抗原投与後の日数の関数としての、腫瘍サイズを示すグラフである。個
々の線は、動物間の変動を示すための個々のマウスを示す。
【図４Ｃ】 MethAで誘導された腫瘍由来のgrp170で免疫化したマウスにお
ける腫瘍抗原投与後の日数の関数としての、腫瘍サイズを示すグラフである。個
々の線は、動物間の変動を示すための個々のマウスを示す。
【図５Ａ】 colon26腫瘍細胞を標的化するCTLアッセイ法の結果を示すグラ
フである。特異的溶解率(％)は、対照Ｔ細胞(丸)、colon26腫瘍細胞由来のhsp11
0に対するＴ細胞(四角)、及びMethA腫瘍細胞由来のhsp110に対するＴ細胞につい
ての、エフェクター：標的の比の関数としてプロットした。
【図５Ｂ】 colon26腫瘍細胞を標的化するCTLアッセイ法の結果を示すグラ
フである。特異的溶解率(％)は、対照Ｔ細胞(丸)、colon26腫瘍細胞由来のgrp17
0に対するＴ細胞(四角)、及びMethA腫瘍細胞由来のgrp170に対するＴ細胞につい
ての、エフェクター：標的の比の関数としてプロットした。
【図５Ｃ】 MethA腫瘍細胞を標的化するCTLアッセイ法の結果を示すグラフ
である。特異的溶解率(％)は、対照Ｔ細胞(丸)、colon26腫瘍細胞由来のhsp110
に対するＴ細胞(四角)、及びMethA腫瘍細胞由来のhsp110に対するＴ細胞につい
ての、エフェクター：標的の比の関数としてプロットした。
【図５Ｄ】 MethA腫瘍細胞を標的化するCTLアッセイ法の結果を示すグラフ
である。特異的溶解率(％)は、対照Ｔ細胞(丸)、colon26腫瘍細胞由来のgrp170
に対するＴ細胞(四角)、及びMethA腫瘍細胞由来のgrp170に対するＴ細胞につい
ての、エフェクター：標的の比の関数としてプロットした。
【図６】 grp170によりパルスした樹状細胞(三角)、対照樹状細胞(四角)、
又はPBS(丸)で免疫化したマウスにおける腫瘍抗原投与後の日数の関数としての
、腫瘍容積(mm3)を示すグラフである。
【図７】 PBS(白丸)、腫瘍由来のgrp170(四角)、全身熱処理したマウスの
腫瘍由来のgrp170(上向き三角)、腫瘍由来のhsp110(下向き三角)、全身熱処理し
たマウスの腫瘍由来のhsp110(菱形)、腫瘍由来のhsp70(六角形)、全身熱処理し
たマウスの腫瘍由来のhsp70(黒丸)で免疫化したマウスにおける腫瘍抗原投与後
の日数の関数としての、腫瘍容積(mm3)を示すグラフである。
【図８】 ルシフェラーゼと共に、hsp110＋hsp70＋hsp25のモル比1:1:1:1(
四角)、hsp110 1:1(三角)、hsp25 1:1(×)、grp17O 1:1(アスタリスク)、又はル
シフェラーゼ単独(丸)でのインキュベーションに関する、時間(分)の関数として
の、タンパク質凝集率(％)(光散乱により決定)を示すグラフである。
【図９Ａ】 hsp110複合体の特徴決定のためのFPLC用のサイズ排除カラムに
より分離された天然のhsp110のクロマトグラフィープロフィールを示す。Hsp110
は、Con-Aセファロース及びモノQカラム上での連続クロマトグラフィーにより一
部精製した。一緒にした画分は、スーパーロース6カラムに負荷し、各画分のタ
ンパク質を、hsp110、hsc70、及びhsp25(1:1000)の抗体によるイムノブロッティ
ングにより検出した。
【図９Ｂ】 天然のhsp110の組成分析を示すイムノブロットである。精製し
たhsp110画分は、hsp90(レーン1、2)、hsc70(レーン3、4)、TCP-1(レーン5、6)
、及びhsp25(レーン7、8)の抗体により検出した。更に総細胞抽出物を陽性対照(
レーン1、3、5、7)として使用した。
【図１０Ａ〜Ｃ】 hsp110及びhsp70、hsp25の間の相反免疫沈降を示すイム
ノブロットである。同定された抗体とのインキュベーション後、プロテインA-セ
ファロースに添加し、かつ更に4℃で一晩インキュベーションし、hsp110、hsp70
、及びhsp25抗体を用いた免疫沈降により試験した。更に総細胞抽出物を陽性対
照(レーン1)として使用した。
【図１０Ａ】 細胞溶解液(レーン2)を、hsp110の抗体(1:100)とインキュベ
ーションした場合に認められた結果を示す。
【図１０Ｂ】 細胞溶解液(レーン2)を、hsp70の抗体(1:200)とインキュベ
ーションした場合に認められた結果を示す。
【図１０Ｃ】 細胞溶解液(レーン2)を、hsp25の抗体(1:100)とインキュベ
ーションした場合に認められた結果を示す。
【図１１Ａ】 ルシフェラーゼ及びHspを室温で30分間インキュベーション
し、16,000gで遠心分離後、可溶性画分をセファクリルS-300カラムに負荷した場
合に調製されたイムノブロットを示す。溶離された画分を、Hspの抗体及びルシ
フェラーゼによるイムノブロットにより分析した。
【図１１Ｂ】 ルシフェラーゼ及びHspを43℃で30分間インキュベーション
し、16,000gで遠心分離後、可溶性画分をセファクリルS-300カラムに負荷した場
合に調製されたイムノブロットを示す。溶離された画分を、Hspの抗体及びルシ
フェラーゼによるイムノブロットにより分析した。
【図１２】 hsp110変異体及びhsp70、hsp25のインビトロにおける相互作用
分析の結果を示す。完全長hsp110(レーン1、4)及び変異体#1(レーン2、5)、変異
体#2(レーン3、6)を発現した大腸菌を、hsc70又はhsp25と共に30℃で1時間イン
キュベーションし、その後、抗hsc70抗体又は抗hsp25抗体を添加した。免疫沈降
物を、抗His抗体で検出した。hsc70及びhsp25の間のインビトロ相互作用も、前
述の方法と同じ方法で検出した；hsc70抗体を使用し、免疫沈降物を試験した(レ
ーン8)。総細胞溶解液を、陽性対照(レーン7)として使用した。各アッセイ法に
は、野生型hsp110、hsp110変異体、hsc70及びhsp25の同量のタンパク質(2μg)が
含まれた。
【図１３】 her2/neu細胞内ドメイン(ICD)の抗hsp110抗体及び抗grp170抗
体との、インビトロにおける結合複合体形成後の免疫沈降の結果を示す。レーン
1は205kDa〜7.4kDaのタンパク質標準であり；レーン2はhsp110＋抗hsp110抗体で
あり；レーン3はhsp110＋ICDであり；レーン4はgrp170＋ICDであり(結合緩衝液
中)；レーン5はgrp170＋ICD(PBS中)であり；レーン6はICDであり；並びに、レー
ン7はhsp110である。
【図１４】 複合体の抗hsp110抗体との免疫沈降後の、新鮮な試料(左側レ
ーン)及び凍結融解試料(中央レーン)中のhsp110-ICD複合体を示すウェスタンブ
ロットである。右側レーンはICDである。
【図１５】 変法ELISA並びにそのHLA-A2結合親和性及びhsp110への予想さ
れる結合について選択されたher-2/neuの10-merペプチドであるp546を用いるhsp
-ペプチド結合を示す棒グラフである。ペプチドはビオチン化し、かつhsp110と
インビトロにおいて混合した。精製した混合物濃度は、1μg/ml(白い棒)、10μg
/ml(斜交平行線の棒)、及び100μg/ml(黒い点描の棒)であった。
【図１６】 新鮮な試料及び凍結融解試料の両方を使用した、ヒト型結核菌
抗原Mtb8.4及びMtb39と抗hsp110抗体との、インビトロにおいて結合複合体形成
後の免疫沈降の結果を示す。レーン1はタンパク質標準205kDa〜7.4kDaであり；
レーン2はhsp110＋Mtb8.4であり；レーン3はhsp110＋Mtb8.4(凍結融解後)であり
；レーン4はMtb8.4であり；レーン5はhsp110であり；レーン6はhsp110＋Mtb39で
あり；レーン7はhsp110＋Mtb39であり(凍結融解後)；レーン8はMtb39であり；並
びに、レーン9は抗hsp110抗体である。
【図１７】 A2/Kbトランスジェニックマウス(1群当たり動物5匹)における
、組換えマウスhsp110-ICD複合体25μgの腹腔内免疫化後の、Ｔ細胞によるγイ
ンターフェロン(IFN-γ)産生(ELISPOTアッセイ法におけるスポット数で決定)を
示す棒グラフである。総脾細胞又は枯渇した細胞(5 x106個細胞/ml)を、25μg/m
l PHA(チェックの棒)又は20μg/ml ICD(黒い点描の棒)と共に、一晩インビトロ
培養し、かつIFN-γ分泌をELISPOTアッセイ法を用いて検出した。
【図１８】 IFN-γ分泌のためのELISPOTアッセイ法における陽性スポット
数で決定した、インビトロにおいて再構築されたhsp110-ペプチド複合体の免疫
原性を示す棒グラフである。組換えハムスターhsp110(100μg)を、100μgの9-me
r her-2/neuペプチドp369、HLA-A2結合剤と共にインキュベーションした。8週齢
のHLA-A2トランスジェニックマウス(n=4)を、hsp110＋ペプチド複合体(群A、斜
交平行線の棒)又はペプチド単独群(群B、黒い点描の棒)のいずれかで、腹腔内免
疫化した。未刺激細胞(陰性対照)の数は、＜40であり、かつ刺激された細胞数か
らこれを減じた。
【図１９】 IFN-γ分泌のためのELISPOTアッセイ法における陽性スポット
数で決定した、インビトロにおいて再構築されたhsp110-ペプチド複合体の免疫
原性を示す棒グラフである。組換えハムスターhsp110(100μg)を、100μgの10-m
er her-2/neuペプチドp546、HLA-A2結合剤と共にインキュベーションした。8週
齢のHLA-A2トランスジェニックマウス(n=2)を、hsp110＋ペプチド複合体(群A、
斜交平行線の棒)又はペプチド単独群(群B、黒い点描の棒)のいずれかで、腹腔内
免疫化した。未刺激細胞(陰性対照)の数は、＜40であり、かつ刺激された細胞数
からこれを減じた。
【図２０】 hsp110-ICD(her2/neu)複合体で腹腔内免疫化したA2/Kbトラン
スジェニックマウスにおける特異的抗hsp110抗体応答を示すグラフである。ELIS
Aの結果は、血清及び抗体希釈率の関数として450nmでの光学密度(OD)に対してプ
ロットした。結果は、抗hsp110の陽性対照(黒四角)、非関連抗体の陰性対照(白
丸)、及び0日目の血清(黒丸)、14日目(白四角、破線)、及び28日目(白四角、実
線)について示した。これらの結果は、マウスがhsp110に対する自己免疫応答を
生じていないことを確認している。
【図２１】 hsp110-ICD複合体で腹腔内免疫化したA2/Kbトランスジェニッ
クマウスにおける特異的抗ICD抗体応答を示すグラフである。ELISAの結果は、血
清及び抗体希釈率の関数として450nmでの光学密度(OD)に対してプロットした。
結果は、抗ICDの陽性対照(黒四角)、非関連抗体の陰性対照(白丸)、及び0日目の
血清(黒丸)、14日目(白四角、破線)、及び28日目(白四角、実線)について示した
。これらの結果は、マウスが、ストレスタンパク質複合体による免疫化後、her2
/neuのICDに対する特異的抗体応答を生じたことを確認している。
【図２２】 様々なワクチン製剤で初回刺激して2週間後の、A2/Kbトランス
ジェニックマウスにおける特異的抗ICD抗体応答を比較する棒グラフである。結
果は、血清及び抗体希釈率の関数として450nmでのODに対してプロットし、かつ
棒は、hsp110-ICD(点描の棒)；フロイント完全アジュバント中のICD陽性対照(チ
ェックの棒)、ICD単独(斜交平行線の棒)、抗ICD抗体(濃い点描の棒)、及び非関
連抗体の陰性対照(白い棒)で初回刺激した動物のデータを示す。
【図２３】 hsp110-ICD複合体でA2/Kbトランスジェニックを皮下又は腹腔
内へ初回刺激して2週間後の、特異的抗ICD抗体産生を比較する棒グラフである。
結果は、様々な血清及び抗体希釈率の関数として450nmでのODに対してプロット
し、かつ棒は、0日目の血清(点描の棒)、腹腔内14日目の血清(チェックの棒)、
皮下14日目の血清(斜交平行線の棒)、抗ICD抗体(濃い点描の棒)、及び非関連抗
体の陰性対照(白い棒)を示す。
【図２４Ａ】 hsp110をコードしているベクターでトランスフェクションさ
れたcolon26細胞(CT26)が、非トランスフェクションCT26細胞及び空のベクター
でトランスフェクションされたCT26細胞と比較して、増大したhsp110発現を示す
ことを示すイムノブロットである。CT26(レーン1)、CT26-ベクター(レーン2)、
及びCT26-hsp110(レーン3)からの同等のタンパク質試料に、10％SDS PAGEを行い
、かつイモビロン(immobilon)-Pメンブレン上に移した。メンブレンを、hap110
に対する抗体でプロービングした。洗浄後、メンブレンを、TBST中に1:2,000希
釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに複合したヤギ抗ウサギIgGまたはヤギ抗マ
ウスIgGと共にインキュベーションした。免疫反応性を化学発光増幅検出システ
ムを用いて検出した。
【図２４Ｂ】 CT26-hsp110細胞は、非トランスフェクションCT26細胞及び
空のベクターでトランスフェクションされたCT26細胞と比較して、増強されたhs
c70発現を示さないことを示す。CT26(レーン1)、CT26-ベクター(レーン2)、及び
CT26-hsp110(レーン3)からの同等のタンパク質試料は、hsc/hsp70に対する抗体
でメンブレンをプロービングした以外は、図24Aのように調製した。
【図２５Ａ】 CT26細胞中のhsp110の免疫蛍光染色を示す、光学顕微鏡写真
である。細胞を、染色の1日前に、カバースリップ上に播種した。その後カバー
スリップを、ウサギ抗hsp110抗体(1:500希釈)と共にインキュベーションし、引
き続きFITC標識したイヌ抗ウサギIgG染色した。正常なウサギIgGを陰性対照とし
て使用した。
【図２５Ｂ】 空のベクターでトランスフェクションされたCT26細胞中のhs
p110の免疫蛍光染色を示す光学顕微鏡写真である。細胞は、図25Aのように調製
しかつ免疫染色した。
【図２５Ｃ】 hsp110を過剰発現している細胞中のhsp110の免疫蛍光染色を
示す光学顕微鏡写真である。細胞は、図25Aのように調製しかつ免疫染色した。
【図２６】 播種後1〜5日間の細胞数としてプロットした、野生型及びhsp1
10によりトランスフェクションされた細胞株のインビトロ増殖特性を表すグラフ
である。細胞は1ウェルあたり2x104個の密度で播種した。24時間後、細胞を計数
した(0日目に相当)。3つ組のウェルから細胞数を指定した日に計数した。結果は
、野生型CT26細胞(丸)、空のベクターでトランスフェクションされたCT26細胞(
四角)、及びhsp110-トランスフェクションされたCT26細胞(三角)を用いた3回の
独立した実験の平均±SDである。
【図２７】 hsp110の過剰発現の軟寒天中でのコロニー形成能への作用を示
す棒グラフである。野生型CT26細胞、空のベクターでトランスフェクションされ
たCT26-ベクター細胞及びhsp110を過剰発現しているCT26-hsp110細胞を、0.3％
寒天中に播種し、かつ軟寒天中でのそれらのコロニー形成能を分析した(≧0.2)
。スチューデントt検定により解析し、CT26-ベクターと比べ、P＜0.05であった
。
【図２８】 野生型及びhsp110トランスフェクションされた細胞株のインビ
ボ増殖特性を表すグラフである。細胞5x104個を、balb/cマウスの脇腹領域に皮
下接種した。腫瘍増殖を、キャリパスで縦横両方向の直径を測定し、毎週2回記
録した。腫瘍容積(mm3)を、野生型CT26細胞(丸)、空のベクターでトランスフェ
クションされたCT26細胞(四角)、hsp110でトランスフェクションされたCT26細胞
、5x104個(上向き三角)、及びhsp110でトランスフェクションされたCT26細胞、5
x105個(下向き三角)について、腫瘍移植後の日数の関数としてプロットした。
【図２９】 放射線照射したhsp110過剰発現細胞の注射の、生存CT26細胞に
よる抗原投与に対する反応への作用を示すプロットである。マウスに、5x105個
の放射線照射した(9,000rad)CT26-hsp110細胞を、左脇腹に皮下注射した。2週間
後、マウスを、生存CT26細胞で右脇腹に抗原投与した。予備免疫していないマウ
スにおける腫瘍増殖も示した。結果は、PBSで免疫化しかつ5x104個のCT26細胞(
丸)；空のベクターを伴う放射線照射したCT26細胞/5x105個のCT26細胞(四角)；
空のベクターを伴う放射線照射したCT26細胞/5x106個のCT26細胞(上向き三角)；
放射線照射したCT26-hsp110細胞/5x105個のCT26細胞(下向き三角)；及び、放射
線照射したCT26-hsp110細胞/5x106個のCT26細胞(菱形)で抗原投与したマウスに
ついて、腫瘍抗原投与後の日数の関数として、腫瘍を有さないマウスの割合とし
てプロットした。
【図３０】 腫瘍由来のhsp110による免疫化により誘起された腫瘍特異性CT
L反応を示すグラフである。マウスに、5x105個の放射線照射した(9,000rad)CT26
-空ベクター細胞及びCT26-hsp110細胞を皮下注射した。2週間後、エフェクター
細胞として、脾細胞を単離し、かつ放射線照射したcolon26で、インビトロにお
いて5日間再刺激した。リンパ球を、51Cr-標識したcolon26を標的細胞として用
い、細胞傷害性活性について分析した。この実験では、MethA腫瘍細胞も標的と
して用い、かつ細胞溶解は認められなかった。結果は、対照(丸)、放射線照射し
たCT26細胞(四角)、及び放射線照射したCT26-hsp110細胞(三角)について、エフ
ェクター：標的比の関数として、特異的溶解率(％)をプロットした。
【図３１】 放射線照射したhsp110-過剰発現細胞による免疫化後の、CT26
細胞に対する抗体反応を示すグラフである。マウスには、5x105個の放射線照射
した(9,000rad)CT26-空ベクター細胞及びCT26-hsp110細胞を皮下注射した。2週
間後、血清を収集し、かつELISAを用いて抗体反応をアッセイした。結果は、対
照(丸)、CT26-空ベクター(四角)、及びCT26-hsp110(三角)についての血清希釈の
関数として、450nmでのODをプロットした。
【図３２】 hsp110過剰発現細胞の増殖に対する、バイスタンダー(bystand
er)細胞由来のGM-CSFの作用を示している。マウスには、下記の5x104個の生存腫
瘍細胞を皮下注射した：CT26-空ベクター細胞(丸)、CT26-ベクター細胞＋放射線
照射したB78H1GM-CSF細胞(比2:1；四角)、CT26-hsp110細胞＋放射線照射したB78
H1GM CSF細胞(比2:1；上向き三角)；CT26-hsp110細胞(下向き三角)；CT26-hsp11
0＋放射線照射したB78H1細胞(比2:1；菱形)。B78H1GM-CSFは、CM-CSF遺伝子でト
ランスフェクションされたB16細胞であり、B78H1は、野生型細胞である。腫瘍増
殖は、腫瘍サイズを測定することにより記録し、かつ移植後の日数の関数として
の腫瘍容積(mm3)をプロットした。
【図３３】 放射線照射したhsp110を過剰発現している腫瘍ワクチン及びGM
-CSFを分泌しているバイスタンダー細胞の同時注射の、野生型CT26腫瘍細胞抗原
投与の反応に対する作用を示すグラフである。マウスは、以下のような、放射線
照射した5x105個の腫瘍細胞により皮下に免疫化した：CT26-空のベクター細胞、
CT26-ベクター細胞＋B78H1GM-CSF細胞(比2:1；四角)、CT26-hsp110細胞＋B78H1
GM-CSF細胞(比2:1；上向き三角)、CT26-hsp110細胞(下向き三角)、CT26-hsp110
＋B78H1細胞(2:1；菱形)。更に、PBS(丸)のみで免疫化したマウスについての結
果も示す。マウスは、個別の部位を、CT26野生型細胞で抗原投与し、かつ腫瘍出
現について1日おきにモニタリングした。結果は、腫瘍抗原投与後の指定日に腫
瘍を有さないマウスの割合としてプロットした。
【図３４】 colon26由来のhsp110又はgrp170による免疫化が、インターフ
ェロン(IFN)γ分泌を刺激することを示す棒グラフである。マウスをhsp110又はg
rp170で免疫化して1週間後、ELISPOTアッセイ法のために脾細胞単離した。植物
凝集素(PHA)処理したリンパ球を陽性対照として用いた。
【図３５】 B16F10腫瘍由来のgrp170による免疫化により誘起された腫瘍特
異性CTL反応を示すグラフである。マウスは、grp170(40μg)で1週間間隔で2回免
疫化した。2回目の免疫化の1週間後、脾細胞をエフェクター細胞として単離し、
かつ放射線照射したB16F10細胞でインビトロにおいて5日間再刺激した。リンパ
球を、51Cr標識B16F10又はMetAを標的細胞として用い、細胞傷害性活性について
分析した。結果を、対照(丸)、肝由来のgrp170(四角)、B16F10由来のgrp170(上
向き三角)、及びMeth A由来のgrp170(下向き三角)についてのエフェクター：標
的の比の関数として、特異的溶解率(％)をプロットした。
【図３６】 B16F10由来のgrp170による免疫化は、IFNγの分泌を刺激する
ことを示している。マウスをhsp110又はgrp170で免疫化した1週間後、脾細胞をE
LISPOTアッセイ法のために単離した。
【図３７】 C57BL/6マウスについての、1x105個のB16F10細胞を各マウスの
尾静脈へ静脈内接種した場合の肺転移を示している。腫瘍細胞注射後24時間で、
マウスをPBS(黒丸)、肝由来のgrp170(白丸)、又は腫瘍由来のgrp170(40μg)で処
置した。全部のプロトコールの間に、処置を3回行った。動物は腫瘍注射の3週間
後に屠殺し、肺を摘出し、かつ表面コロニー数を数えた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｎ 5/06 14/47 5/10 14/82 // Ｃ０７Ｋ 14/195 19/00 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ 14/82 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 19/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/09 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／２１５，４９７ (32)優先日 平成12年６月30日(2000．6．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 サブジェック ジョン アール． アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ウィリ アムズビル フランクハウザー ロード 66 (72)発明者 ヘンダーソン ロバート エイ． アメリカ合衆国 ワシントン州 シアトル ウエスト ガバメント ウェイ 3316 (72)発明者 リパスキー エリザベス エイ． アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ウィリ アムズビル フランクハウザー ロード 66 (72)発明者 カジム ラティフ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 アマー スト ストーンクロフト レーン 41 (72)発明者 ワン シャン−ヤン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 バッフ ァロー ノース パール ストリート 150 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA36 CA01 CA07 DA02 DA03 GA11 4B065 AA36Y AA93Y AB01 AC14 BA01 BA30 BD50 CA24 CA45 4C084 AA02 AA03 AA13 BA22 BA41 BA44 NA14 ZB261 ZB352 4C085 BA09 BB01 CC03 EE06 4H045 AA11 AA30 BA41 CA11 CA40 DA86 EA22 EA31 FA72 FA74 【要約の続き】 または腫瘍細胞を殺傷する方法において、前記のT細胞 と腫瘍細胞を接触させることができる。

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ストレスタンパク質複合体を含有する薬学的組成物であって
    、該複合体がhsp110又はgrp170ポリペプチド及び免疫原性ポリペプチドを含み、
    該免疫原性ポリペプチドが癌に関連している、薬学的組成物。
  2. 【請求項２】 免疫原性ポリペプチドがher-2/neuペプチドを含む、請求項
    １記載の薬学的組成物。
  3. 【請求項３】 her-2/neuペプチドが、her-2/neuの細胞内ドメインに由来す
    る、請求項２記載の薬学的組成物。
  4. 【請求項４】 ストレスタンパク質複合体を含有する薬学的組成物であって
    、該複合体がhsp110又はgrp170ポリペプチド及び免疫原性ポリペプチドを含み、
    該免疫原性ポリペプチドがヒト型結核菌（M. tuberculosis）抗原を含んでいる
    、薬学的組成物。
  5. 【請求項５】 ヒト型結核菌抗原がMtb8.4又はMtb39である、請求項４記載
    の薬学的組成物。
  6. 【請求項６】 hsp110又はgrp170ポリペプチドが免疫原性ポリペプチドに複
    合されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の薬学的組成物。
  7. 【請求項７】 hsp110又はgrp170ポリペプチドが、非共有結合型相互作用に
    より免疫原性ポリペプチドに複合されている、請求項６記載の薬学的組成物。
  8. 【請求項８】 複合体が融合タンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか１
    項記載の薬学的組成物。
  9. 【請求項９】 複合体が腫瘍に由来している、請求項１、２又は３記載の薬
    学的組成物。
  10. 【請求項１０】 複合体がヒト型結核菌感染細胞に由来している、請求項４
    記載の薬学的組成物。
  11. 【請求項１１】 ストレスタンパク質複合体が、hsp70、hsp90、grp78、及
    びgrp94ストレスタンパク質ファミリーの構成要員からなる群より選択されるポ
    リペプチドをさらに含む、請求項１〜10のいずれか１項記載の薬学的組成物。
  12. 【請求項１２】 ストレスタンパク質複合体が、hsp70及びhsp25に複合され
    たhsp110を含む、請求項１〜11のいずれか１項記載の薬学的組成物。
  13. 【請求項１３】 hsp110又はgrp170ポリペプチドをコードしている第1のポ
    リヌクレオチド及び免疫原性ポリペプチドをコードしている第2のポリヌクレオ
    チドを含み、該免疫原性ポリペプチドが癌に関連している、薬学的組成物。
  14. 【請求項１４】 hsp110又はgrp170ポリペプチドをコードしている第1のポ
    リヌクレオチド及び免疫原性ポリペプチドをコードしている第2のポリヌクレオ
    チドを含み、該免疫原性ポリペプチドがヒト型結核菌抗原を含む、薬学的組成物
    。
  15. 【請求項１５】 第1のポリヌクレオチドが第2のポリヌクレオチドに連結さ
    れている、請求項13又は14記載の薬学的組成物。
  16. 【請求項１６】 hsp110又はgrp170ポリペプチド及び免疫原性ポリペプチド
    を提示するように修飾された抗原提示細胞(APC)を含み、該免疫原性ポリペプチ
    ドが癌に関連している、薬学的組成物。
  17. 【請求項１７】 hsp110又はgrp170ポリペプチド及び免疫原性ポリペプチド
    を提示するように修飾された抗原提示細胞(APC)を含み、該免疫原性ポリペプチ
    ドがヒト型結核菌抗原を含む、薬学的組成物。
  18. 【請求項１８】 APCが樹状細胞又はマクロファージである、請求項16又は1
    7記載の薬学的組成物。
  19. 【請求項１９】 APCがペプチド負荷により修飾されている、請求項16、17
    又は18記載の薬学的組成物。
  20. 【請求項２０】 APCが、hsp110又はgrp170ポリペプチドをコードしている
    第1のポリヌクレオチド及び免疫原性ポリペプチドをコードしている第2のポリヌ
    クレオチドによるトランスフェクションにより修飾されている、請求項16、17又
    は18記載の薬学的組成物。
  21. 【請求項２１】 第1のポリヌクレオチドが第2のポリヌクレオチドに連結さ
    れている、請求項20記載の薬学的組成物。
  22. 【請求項２２】 複合体が、hsp110又はgrp170ポリペプチドと免疫原性ポリ
    ペプチドとの結合を増強するように加熱されている、請求項１〜21のいずれか１
    項記載の薬学的組成物。
  23. 【請求項２３】 生理的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜22のい
    ずれか１項記載の薬学的組成物。
  24. 【請求項２４】 アジュバントをさらに含む、請求項１〜23のいずれか１項
    記載の薬学的組成物。
  25. 【請求項２５】 Ｔ細胞を抗原提示細胞(APC)と接触させる段階を含み、該A
    PCがhsp110又はgrp170ポリペプチド及び腫瘍細胞に関連する免疫原性ポリペプチ
    ドとの接触により修飾されている、腫瘍細胞に対するＴ細胞を作製する方法。
  26. 【請求項２６】 Ｔ細胞がCD4+又はCD8+ Ｔ細胞である、請求項25記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 請求項24又は25記載の方法により作製されたＴ細胞。
  28. 【請求項２８】 腫瘍細胞を殺傷するための組成物の調製のための、請求項
    27記載のＴ細胞の使用。
  29. 【請求項２９】 Ｔ細胞を抗原提示細胞(APC)と接触させる段階を含み、該A
    PCがhsp110又はgrp170ポリペプチド及びヒト型結核菌感染細胞に関連する免疫原
    性ポリペプチドとの接触により修飾されている、ヒト型結核菌感染細胞に対する
    Ｔ細胞を作製する方法。
  30. 【請求項３０】 Ｔ細胞がCD4+又はCD8+ Ｔ細胞である、請求項29記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】 請求項29又は30記載の方法により作製されたＴ細胞。
  32. 【請求項３２】 ヒト型結核菌感染細胞を殺傷するための組成物の調製のた
    めの、請求項31記載のＴ細胞の使用。
  33. 【請求項３３】 被験者においてヒト型結核菌感染を阻害するための組成物
    の調製のための、請求項４〜８、10〜12、15又は17〜24のいずれか１項記載の薬
    学的組成物の使用。
  34. 【請求項３４】 被験者において腫瘍増殖を阻害するための組成物、被験者
    において癌の発症を阻害するための組成物、もしくは被験者において癌抗原に対
    する免疫応答を増強するための組成物の調製のための、請求項１〜３、６〜９、
    11〜13、15〜16又は18〜24のいずれか１項記載の薬学的組成物の使用。
  35. 【請求項３５】 請求項27記載のＴ細胞と生体試料を接触させる段階を含む
    、生体試料から腫瘍細胞を除去する方法。
  36. 【請求項３６】 生体試料が血液又はその画分である、請求項35記載の方法
    。
  37. 【請求項３７】 ストレスタンパク質複合体を加熱する段階を含み、該スト
    レスタンパク質複合体が熱誘導性ストレスポリペプチド及び免疫原性ポリペプチ
    ドを含んでいる、ストレスタンパク質複合体の免疫原性を増強する方法。
  38. 【請求項３８】 加熱段階がストレスタンパク質複合体を約39〜40℃の温度
    に加熱する段階を含む、請求項37記載の方法。
  39. 【請求項３９】 ストレスポリペプチドがhsp110又はhsp70を含む、請求項
    37又は38記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005068632A1 (ja) * 2004-01-20 2005-07-28 Aichi Prefecture ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性Ｅｐ−ＣＡＭ特異的ＣＴＬが認識するエピトープ・ペプチド及びその用途
WO2005123935A1 (ja) * 2004-06-15 2005-12-29 Japan Welfare Co., Ltd. 治療に有用な産物の生産法およびシステム

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5750119A (en) * 1994-01-13 1998-05-12 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer
US20040247563A1 (en) * 2000-11-02 2004-12-09 Lynch David H. Method of enhancing lymphocyte-mediated immune responses
ES2433915T3 (es) 2002-05-21 2013-12-13 Irun R. Cohen Vacunas de ADN que codifican proteínas de choque térmico
SI1530628T1 (sl) * 2002-08-16 2011-02-28 Glycotope Gmbh Postopek za proizvodnjo s temperaturo induciranih lizatov tumorskih celic za uporabo kot imunogenske spojine
US8017388B2 (en) 2003-08-18 2011-09-13 Glycotope Gmbh Tumour cell lines and uses thereof
SG159554A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
US20060120995A1 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Shah Maulik R Neoadjuvant genetic compositions and methods
US7585945B2 (en) 2006-08-25 2009-09-08 Health Research, Inc. Use of recombinant heat shock protein complexed to kidney cancer antigen
BRPI0716997B8 (pt) 2006-09-10 2021-05-25 Glycotope Gmbh proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma
PL1920781T3 (pl) * 2006-11-10 2015-06-30 Glycotope Gmbh Kompozycje zawierające core-1-dodatnie mikroorganizmy i ich zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce nowotworów
AU2014201488B2 (en) * 2007-06-01 2016-06-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc Vaccine for the Prevention of Breast Cancer Relapse
EP2162149B1 (en) 2007-06-01 2013-11-06 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Vaccine for the prevention of breast cancer relapse
WO2009059281A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Health Research Inc. Compositions and methods for using ca9 protein to stimulate an immune response
GB0816242D0 (en) * 2008-09-05 2008-10-15 Immunobiology Ltd Method of purifying protien complexes
WO2010115118A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Antigenics, Inc. Methods for preparing and using multichaperone-antigen complexes
CA2844543A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Glycotope Gmbh Microorganisms carrying a tumor antigen
WO2014093950A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Virginia Commonwealth University Immune modulator for immunotherapy and vaccine formulation
JP7387603B2 (ja) * 2017-11-29 2023-11-28 フィジーン、エルエルシー 活性化のための線維芽細胞と免疫細胞との相互作用及びそれらの使用
CN117815404A (zh) 2018-05-18 2024-04-05 第一三共株式会社 抗-muc1抗体-药物缀合物
WO2023056334A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 The Children's Medical Center Corporation Tlr4 agonist for modulating immune response

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5066579A (en) * 1986-12-31 1991-11-19 Genelabs Incorporated HTLV-I peptide antigen and assay
WO1994029459A1 (en) 1993-06-04 1994-12-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Stress proteins and uses therefor
ES2106033T3 (es) * 1989-05-19 1997-11-01 Genentech Inc Dominio extracelular de her2.
US6268213B1 (en) * 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5750119A (en) * 1994-01-13 1998-05-12 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
US5961979A (en) 1994-03-16 1999-10-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Stress protein-peptide complexes as prophylactic and therapeutic vaccines against intracellular pathogens
US6015507A (en) * 1994-11-08 2000-01-18 Minolta Co., Ltd. Liquid crystal element having composite layer
US6331299B1 (en) * 1995-08-18 2001-12-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for treatment of cancer and infectious disease and compositions useful in same
IL123219A0 (en) 1995-08-18 1998-09-24 Sloan Kettering Inst Cancer Method for treatment of cancer and infectious diseases and compositions useful in same
US5985270A (en) * 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
US5837251A (en) * 1995-09-13 1998-11-17 Fordham University Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases
AU727673B2 (en) 1995-09-13 2000-12-21 Fordham University Therapeutic and prophylactic methods using heat shock proteins
WO1997026910A2 (de) 1996-01-27 1997-07-31 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Tumorimpfstoff für die immuntherapie von malignen tumoren
US5747332A (en) * 1996-09-20 1998-05-05 University Of New Mexico Methods for purifying and synthesizing heat shock protein complexes
IN183280B (ja) * 1996-09-20 1999-10-30 Univ New Mexico
PT941315E (pt) * 1996-11-26 2006-06-30 Stressgen Biotechnologies Corp Proteinas de stress contendo proteinas de fusao para induzir respostas imunitarias
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
US6017540A (en) * 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US5830464A (en) 1997-02-07 1998-11-03 Fordham University Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy
EP1047451A1 (en) 1997-02-18 2000-11-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of heat shock proteins to deliver moieties into cells
US5891432A (en) * 1997-07-29 1999-04-06 The Immune Response Corporation Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same
EP1002110B2 (en) 1997-08-05 2009-07-29 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses against hpv antigens elicited by compositions comprising an hpv antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins
US5888795A (en) * 1997-09-09 1999-03-30 Becton, Dickinson And Company Thermostable uracil DNA glycosylase and methods of use
WO2000044899A1 (en) 1999-01-29 2000-08-03 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005068632A1 (ja) * 2004-01-20 2005-07-28 Aichi Prefecture ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性Ｅｐ−ＣＡＭ特異的ＣＴＬが認識するエピトープ・ペプチド及びその用途
JPWO2005068632A1 (ja) * 2004-01-20 2007-12-27 愛知県 ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性Ｅｐ−ＣＡＭ特異的ＣＴＬが認識するエピトープ・ペプチド及びその用途
US7619058B2 (en) 2004-01-20 2009-11-17 Aichi Prefecture Epitope/peptide recognized by HLA-A2402-restricted Ep-CAM-specific CTL and use of the same
US7846651B2 (en) 2004-01-20 2010-12-07 Aichi Prefecture Epitope/peptide recognized by HLA-A2402-restricted Ep-CAM-specific CTL and use of the same
WO2005123935A1 (ja) * 2004-06-15 2005-12-29 Japan Welfare Co., Ltd. 治療に有用な産物の生産法およびシステム

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001023421A9 (en) 2002-09-26
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US7976846B2 (en) 2011-07-12

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