CZ20022874A3

CZ20022874A3 - Imunogenní prostředek

Info

Publication number: CZ20022874A3
Application number: CZ20022874A
Authority: CZ
Inventors: Teresa Elisa Virginia Cabezon-Silva; Jean-Pol Cassart; Thierry Coche; Swann Roman Jean-Thomas Gaulis; Y De Bassols Carlota Vinals
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2003-02-12
Also published as: NZ520673A; CZ303468B6; US20060171953A1; KR100919916B1; KR20090085697A; US8535690B2; US20030157118A1; DK1650221T3; CN1254541C; AU2001256156B2; IL151097A0; US7803379B2; NO332141B1; BR0108654A; ATE487733T1; AU2006201042A1; PL209127B1; PT1650221E; MXPA02008279A; PL362698A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká farmaceutických prostředků a způsobu indukce imunitní odpovědi proti antigenům souvisejícím s tumory. Vynález se zvláště týká polynukleotidů, které jsou zde označovány jako polynukleotídy CASB7439, jimi kódovaných polypeptidů (označovaných zde jako polypeptidy CASB7439), rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se vynález týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů včetně léčby rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, a autoimunitních onemocnění a jiných příbuzných stavů. V dalším provedení se vynález týká farmaceutických prostředků s obsahem polypeptidů a polynukleotidů CASB7439, způsobů jejich výroby a jejich použití v lékařství. Další provedení vynálezu se týká způsobů identifikace sloučenin s agonistickými a antagonistickými/inhibičními účinky s použitím materiálů poskytovaných vynálezem a léčení stavů souvisejících s. nerovnováhou polypeptidů CASB7439 s uvedenými sloučeninami. Ještě další provedení vynálezu se týká diagnostických „ testů pro detekci onemocnění souvisejících s nevhodnou aktivitou nebo hladinou polypeptidů CASB7439.

Podstata vynálezu

Přepokládá se, že polypeptidy a polynukleotídy podle předkládaného vynálezu jsou důležité imunogeny pro specifickou preventivní nebo léčebnou imunizaci proti tumorům, protože jsou specificky exprimovány nebo se dosahuje jejich velmi vysoké exprese v tumorech ve srovnání s normálními buňkami, a mohou být tedy zacíleny imunitními mechanismy specifickými pro antigen, vedoucími • · k destrukci tumorové buňky. Mohou být také použity pro diagnostiku výskytu tumorových buněk. Jejich nesprávná exprese za určitých okolností může dále způsobit indukci autoimunitních, nesprávných imunitních odpovědí, které by mohly být korigovány vhodnou vakcinací s použitím stejných polypeptidů nebo polynukleotidů. V tomto ohledu jsou pro účely předkládaného vynálezu nejdůležitější antigenní a imunogenní____biologické__aktivity polypeptidu podle předkládaného vynálezu. Polypeptid podle předkládaného vynálezu může také mít alespoň jednu další biologickou aktivitu polypeptidu CASB7439, která by tento polypeptid učinila vhodným cílem pro terapeutický nebo preventivní zásah odlišný od zásahu souvisejícího s imunitní odpovědí.

V prvním provedení se předkládaný vynález týká polypeptidů CASB7439. Tyto peptidy zahrnují izolované polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou is alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu se sekvencí SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14 po celé délce SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID

No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14, s podmínkou, že uvedený izolovaný polypeptid není sekvence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14. Takové polypeptidy zahrnují polypeptidy obsahující aminokyseliny ze SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10 a SEQ ID No. 11.

Mezi další peptidy podle předkládaného vynálezu patří izolované polypeptidy, u kterých má aminokyselinová sekvence alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2, SEQ ID

No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14 po celé délce SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID

- 3 No. 14, s podmínkou, že takovým izolovaným polypeptidem není SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14. Tyto polypeptidy zahrnují polypeptidy SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10 a SEQ ID No. 11.

Výše uvedené polypeptidy se s výhodou vyrábějí rekombinantním způsobem. Nejvýhodněji se polypeptidy podle vynálezu čistí, a jsou v podstatě prosté jakýchkoli jiných proteinů nebo kontaminujícího materiálu pocházejícího z hostitele.

Další peptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují izolované polypeptidy kódované polynukleotidem obsahujícím sekvenci obsaženou v SEQ ID No. 1.

Vynález také poskytuje imunogenní fragment polypeptidu CASB7439, který je souvislou částí polypeptidu CASB7439, a který má stejné nebo podobné imunologické vlastnosti jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14. Jinak řečeno, fragment (v případě potřeby navázaný na nosič nebo část většího fúzního proteinu) je schopen vyvolat imunitní odpověď rozpoznávající polypeptid CASB7439. Takový imunogenní fragment může například zahrnovat polypeptid CASB7439 postrádající N-koncovou vedoucí sekvenci, transmembránovou doménu nebo C-koncovou ukotvovací doménu. Ve výhodném provedení obsahuje imunogenní fragment polypeptidu CASB7439 v podstatě veškerou extracelulární doménu polypeptidu, který má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14 po celé délce sekvence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo

-4 ·· · · • · · ··· ··· ···

SEQ ID No. 14. Imunogenní fragment podle vynálezu obsahuje s výhodou alespoň jeden epitop.

Peptidové fragmenty obsahující epitop CASB7439 budou typicky obsahovat alespoň 7, s výhodou 9 nebo 10 za sebou následujících aminokyselin ze SEQ ID No. 2. Výhodné epitopy jsou ukázány v SEQ ID No. 16 až SEQ ID No. 33.

Peptidy obsahující tyto epitopy tvoří výhodné provedení předkládaného vynálezu. Součástí předkládaného vynálezu jsou tyké mimotopy, které mají stejné vlastnosti jako tyto epitopy, a imunogeny obsahující tyto mimotopy, jestliže vyvolávají imunitní odpověď křížově reagující s epitopem v kontextu molekuly CASB7439.

Předkládaný vynález proto zahrnuje izolované peptidy zahrnující tyto epitopy jako takové, a jakýkoli jejich mimotop. Význam mimotopu je definován jako jednotka, která je dostatečně podobná nativnímu epitopu CASB7439, aby mohla být rozpoznána protilátkami, které rozpoznávají nativní molekulu; (Gheysen, Η. M., a další, 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, str. 130 - 149; Gheysen, Η. M., 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709 - 715); nebo jsou schopné vyvolávat tvorbu protilátek při navázání na vhodný nosič, kde tyto protilátky křížově reagují s nativní molekulou.

Peptidové mimotopy výše uvedených epitopů mohou být navrženy pro konkrétní účel adicí, delecí nebo substitucí zvolených aminokyselin. Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být tedy modivfikovány pro účely snadné konjugace k proteinovému nosiči. U některých metod chemické konjugace může být například výhodné, aby byl do epitopu zahrnut koncový cystein. Pro peptidy konjugované k proteinovému nosiči může být žádoucí, aby na konci vzdálenějším od konjugovaného konce peptidu obsahovaly hydrofobní zakončení, takže volný nekonjugovaný konec peptidu zůstává asociován s povrchem nosného proteinu. To omezuje konformační stupeň volnosti peptidu, a tak zvyšuje pravděpodobnost, že peptid bude předkládán v konformaci, která nejblíže napodobuje konformaci peptidu, tak jak se nalézá v kontextu úplné molekuly. Peptidy mohou být například změněny tak, aby obsahovaly N-koncový cystein a C-koncový hydrofóbní amidovaný konec. Alternativně se může provést adice nebo substituce D-stereoisomerní formy jedné nebo více aminokyselin, aby se vytvořil výhodný derivát, který má například zvýšenou stabilitu peptidu. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že tyto modifikované peptidy nebo mimotopy by mohly být zcela nebo zčásti nepeptidové mimotopy, jestliže jsou složeny aminokyselinových zbytků nespadajících mezi 20 v přírodě se vyskytujících aminokyselin. Polypeptidy mohou být navíc cyklizovány v oboru známými způsoby, aby došlo k omezení peptidu na konformaci, která úzce napodobuje tvar peptidové sekvence v kontextu úplné molekuly. Výhodný způsob cyklizace peptidu zahrnuje přidání páru cysteinových zbytků umožňujících vytvoření disulfidického můstku.

Odborníkům v oboru bude dále zřejmé, že mimotopy nebo imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou mít větší velikost než výše uvedené epitopy, a jako takové mohou obsahovat popisované sekvence. Mimotopy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat přídavek N- a/nebo C-koncových prodloužení tvořených řadou jiných v přírodě se vyskytujících zbytků na jednom nebo obou koncích. Peptidové mimotopy mohou být také retrosekvence přírodních sekvencí v tom, že je obrácená orientace sekvence; nebo mohou být sekvence úplně nebo alespoň z části tvořeny D-stereoisomerními aminokyselinami (sekvence inverso). Peptidové sekvence mohou mít také charakter retro-inverso tím, že mají obrácenou orientaci sekvence a obsahují aminokyseliny ve formě D-stereoisomerů. Tyto retro nebo retro-inverso peptidy mají výhodu v tom, že nejsou vlastními peptidy organismu, a nedochází tedy u nich k problémům tolerance s vlastním imunitním systémem.

Peptidové mimotopy mohou být alternativně identifikovány s použitím protilátek, které jsou samy schopné vázat se na epitopy podle předkládaného vynálezu, použitím technik jako je exprese na povrchu fága (phage display technology, EP 0 552 267 B1). Tato technika poskytne velký počet peptidových sekvencí s podobnou strukturou jako mají nativní peptidy, které jsou proto schopné vázat se na protilátky proti nativnímu peptidu, ale nemusí nezbytně sdílet významnou sekvenční homologii s nativním peptidem. Tento přístup může mít významné výhody v tom, že umožní identifikaci peptidu se zlepšenými imunogenními vlastnostmi, nebo je možno předejít možným problémům s tolerancí vlastních antigenů, které mohou být spojeny s použitím nativní peptidové sekvence. Navíc tato technika umožňuje identifikaci souboru rozpoznávacích vlastností pro každý nativní peptid z hlediska sdílených chemických vlastností mezi rozpoznávanými sekvencemi mimotopů.

Kovalentní vazba peptidu na imunogenní nosič může být provedena způsobem známým v oboru. Tak např. pro přímou kovalentní vazbu je možno používat karbodiimid, glutaraldehyd nebo (N-[y-maleimidobutyryloxy]sukcinimidester, s použitím běžně komerčně dostupných heterobifunkčních propojovacích skupin jako je CDAP a SPDP (podle doporučení výrobců). Po provedení vazebných reakcí může být imunogen snadno izolován a čištěn pomocí dialýzy, gelové filtrace, frakcionace atd. Typy nosičů používaných u imunogenů podle předkládaného vynálezu budou odborníkovi v oboru zřejmé. Funkcí nosiče je poskytnutí cytokinové pomoci pro zvýšení indukce imunitní odpovědi proti peptidu. Nevyčerpávající seznam nosičů, které mohou být v rámci předkládaného vynálezu použity, zahrnuje: hemocyanin z měkkýše Megathura crenulata (Keyhole limpet Haemocyanin, KLH), sérové albuminy jako je bovinní sérový albumin (BSA), inaktivované bakteriální toxiny jako jsou toxiny tetanu nebo záškrtu (TT a DT) nebo jejich rekombinantní fragmenty (např. doména 1 fragmentu C TT nebo translokační doména DT), nebo čištěný proteinový derivát tuberkulinu

-7• · · • · · (PPD). Mimotopy nebo epitopy mohou být alternativně přímo konjugovány k liposomovým nosičům, které mohou navíc obsahovat imunogeny schopné poskytnout pomoc T-buněk. Poměr mimotopů k nosiči je s výhodou řádově 1 : 1 až 20 : 1, a s výhodou by každý nosič mohl nést mezi 3 až 15 peptidy.

V jednom provedení vynálezu je výhodným nosičem protein D z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1). Protein D je protein vázající IgD z Haemophilus influenzae, který byl patentován Forsgrenem (WO 91/18926, udělený EP 0 594 610 B1). Za určitých io okolností, například v rekombinantních imunogenních expresních systémech, může být vhodné používat fragmentů proteinu D, např. protein D 1/3^rd (obsahující N-koncových 100 až 110 aminokyselin proteinu D (GB 9717953.5)),

Další výhodný způsob předkládání peptidů podle předkládaného 15 vynálezu je ve formě rekombinantní fúzní molekuly. Například EP 0 421 635 B popisuje použití chimérních antigenních částic jádra hepadnaviru pro předkládání cizích peptidových sekvencí ve formě částic podobných viru. Imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou v této formě obsahovat peptidy předkládané ve formě chimérních částic složených z antigenu jádra hepatitidy B. Navíc mohou rekombinantní fúzní proteiny obsahovat mimotopy podle předkládaného vynálezu a nosný protein, jako je NS1 viru chřipky. Pro každý rekombinantně exprimovaný protein, který tvoří součást předkládaného vynálezu, je součástí předkládaného vynálezu také nukleové kyselina kódující uvedený imunogen.

Peptidy používané v předkládaném vynálezu mohou být snadno syntetizovány postupy syntézy na pevné fázi, které jsou dobře známé v oboru. Vhodná syntéza se může provádět s využitím postupů „T-boc“ nebo „F-moc“. Cyklické peptidy mohou být syntetizovány syntézou na pevné fází s použitím dobře známého postupu „F-moc“ a polyamidové pryskyřice na zcela automatizovaném zařízení. Odborníkům v oboru _o · · · · · · ·

- o - ··· ··· ··· ··· ·Φ* ···· jsou alternativně známé nezbytné laboratorní postupy pro ruční provádění syntézy. Způsoby a postupy pro syntézu na pevné fázi se popisují v publikaci Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, E. Atherton a R. C. Sheppard, publ. IRL, Oxford University

Press (1989). Peptidy mohou být alternativně produkovány rekombinantními metodami včetně exprese molekul nukleové kyseliny kódujících mimotopy v bakteriální nebo savčí buněčné linii, s následnou pufirikací exprimovaného mimotopu. Způsoby rekombinantní exprese peptidů a proteinů jsou v oboru známé a popisují se v publikaci Maniatis, T., Fritsch, E. F. á Sambrook á další, Molecular cloning, a laboratory manual, 2. ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

V dalším provedení vynálezu se poskytuje způsob výroby zde popisovaného polypeptidu. Způsob podle vynálezu se může provádět běžnými rekombinantními technikami, které se popisují v publikaci Maniatis a další, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 - 1989. Poskytuje se tedy způsob výroby polypeptidu podle vynálezu, který zahrnuje kultivaci hostitelské buňky za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu, a izolaci polypeptidu z kultivačního média. Způsob podle vynálezu může s výhodou zahrnovat následující kroky:

i) připraví se replikační nebo integrační expresní vektor, který je schopen v hostitelské buňce exprimovat polymer DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo jeho imunogenní derivát;

ii) provede se transformace hostitelské buňky tímto vektorem;

iii) tato transformovaná hostitelská buňky se kultivuje za podmínek umožňujících expresi uvedeného polymeru DNA za získání proteinu; a

- w V w V * _ Q _ ··· ··· ··· ·· · ··' · · · · iv) získaný protein se izoluje.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle vynálezu mohou být ve formě „zralého“proteinu nebo mohou být součástí většího proteinu jako je prekurzor nebo fúzní protein. Často je výhodné přidat další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční nebo vedoucí sekvence, prosekvence, sekvence napomáhající čištění jako jsou vícečetné histidinové zbytky, nebo další sekvenci zvyšující stabilitu v průběhu rekombinantního způsobu výroby. Navíc je také možné přidávat exogenní polypeptid nebo lipidové zakončení nebo polynukleotidové sekvence pro zvýšení imunogenní schopnosti hotové molekuly.

V jednom provedení se vynález týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu, nebo jeho fragment, a is různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště lgG1, kde fúze probíhá v pantové oblasti. V jednom konkrétním provedení může být část Fc jednoduše odstraněna zavedením štěpící sekvence, která může být rozštěpena faktorem srážlivosti krve Xa. Vynález se dále týká způsobů přípravy těchto fúzních proteinů metodami genetického inženýrství á jejich použití pro screening léčiv, diagnózu a terapii. Zvláště výhodné provedení vynálezu se týká použití polypeptidu nebo polynukleotidu při výrobě vakciny pro imunologickou terapii pacienta trpícího karcinomem nebo vnímavého ke karcinomu, zvláště rakovinou tlustého střeva nebo jinými tumory nebo onemocněními souvisejícími s tlustým střevem. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů je možné nalézt v

3o mezinárodních patentových přihláškách No. WO 94/29458 a WO 94/22914.

- 10 * 4 · · · · ·· ·· · ff « • · · | • · '· · · ··· ··· ·* · ·· ·

Proteiny mohou být chemicky konjugovány nebo exprimovány ve formě rekombinantních fúzních proteinů umožňujících produkci zvýšených hladin proteinů v daném expresním systému ve srovnání s nefúzovaným proteinem. Fúzní partner může napomáhat při poskytování T-pomocných epitopů (imunologický fúzní partner), s výhodou T-pomocných epitopů rozpoznávaných člověkem, nebo napomáhat při expresi proteinu (složka zesilující expresi) ve vyšších výtěžcích než u nativního rekombinantního proteinu. Fúzní partner bude s výhodou jak imunologický fúzní partner, tak i partner zesilující io expresi.

Mezi fúzní partnery je možno zahrnout protein D z Haemophilus influenzae B a nestrukturní protein chřipkového viru NS1 (hemaglutinin). Dalším imunologickým fúzním partnerem je protein známý jako LYTA. S výhodou se používá C-koncová část molekuly.

Protein Lyta je odvozen z bakterie Streptococcus pneumoniae, která syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu, amidázu LYTA (kódovanou genem lytA) (Gene, 43 (1986) str. 265 - 272}, což je autolysin specificky degradující některé vazby v peptidoglykanové kostře. Ckoncová doména proteinu LYTA je odpovědný za afinitu k cholinu nebo některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost byla využívána pro vývoj plasmidů E. coli exprimujících C-LYTA použitelných pro expresi fúzních proteinů. Byla také popsána purifikace hybridních proteinů obsahujících fragment C-LYTA na aminovém konci {Biotechnology: 10 (1992) str. 795 - 798}. Je možné používat opakující se část molekuly Lyta, která se nachází na C-konci počínaje zbytkem 178, např. zbytky 188 až 305.

Předkládaný vynález také zahrnuje xenogenní formy (označované také orthologní formy) výše uvedených polypeptidů, kde tyto xenogenní formy označují antigen s podstatnou sekvenční identitou s lidským antigenem (označovaný také jako autologní antigen), který slouží jako referenční antigen, ale který je odvozený z různých druhů odlišných od člověka. V této souvislosti se podstatná

	«	4 ·· 0·
»' ·	• ·	• *	0 0
*	«	*	0	• ’· *
	0 ·	0	•	• 0 0 ·
•	•	0	0	· · ·
• · ·	• · »	• 0 0	• 0 ·	• ' 0 00

identita týká souhlasu aminokyselinové sekvence s jinou aminokyselinovou sekvencí nebo souhlasu polynukleotidové sekvence s jinou polynukleotidovou sekvencí, jestliže jsou tyto sekvence uspořádány pro dosažení nejlepší shody s kterýmkoli z řady proteinů použitých pro uspořádání sekvence známých v oboru. Podstatnou identitou se míní alespoň 70 až 95%, s výhodou alespoň 85 až 95%, nejvýhodněji alespoň 90% - 95% sekvenční identita mezi porovnávanými sekvencemi. Podle vynálezu bude tedy xenogenním polypeptidem CASB7439 polypeptid CASB7439, který je xenogenní vzhledem k lidskému CASB7439, tedy jinými slovy polypeptid izolovaný z jiného druhu než je člověk. Ve výhodném provedení je tento polypeptid izolován z myši, krysy, vepře nebo opice rhesus, nejvýhodněji z myši nebo krysy. Předkládaný vynález tedy také poskytuje způsob indukce imunitní odpovědi proti lidskému CASB7439 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10 nebo SEQ ID No. 11 u člověka, který zahrnuje podávání účinné dávky prostředku obsahujícího popsanou xenogenní formu CASB7439 pacientovi. Ve výhodném provedení zahrnuje způsob indukci imunitní odpovědi proti lidskému CASB7439 použitím xenogenního CASB7439 izolovaného z myši, krysy, vepře nebo opice rhesus. Další výhodný způsob indukce imunitní odpovědi podle předkládaného vynálezu používá antigenní prostředek obsahující živý virový expresní systém, který exprimuje uvedený xenogenní antigen. Výhodný xenogenní polypeptid CASB7439 má sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 12 (myš) nebo v SEQ ID No. 14 (krysa).

Izolovaný xenogenní polypeptid CASB7439 bude obecně sdílet podstatnou podobnost sekvence, a zahrnuje izolované polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 70% identitou, s výhodou alespoň 80% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitou se SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14 po celé délce

SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14. Xenogenní polypeptid bude tedy obsahovat imunogenní fragment polypeptidu SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14, ve kterém je imunogenní aktivita imunogenního fragmentu v podstatě stejná jako v případě polypeptidu SEQ ID No. 12 nebo SEQ

ID No. 14. Navíc může být xenogenní polypeptid CASB7439 fragment o délce alespoň přibližně 20 za sebou následujících aminokyselin, s výhodou přibližně 30, výhodněji přibližně 50, ještě výhodněji přibližně 100, nejvýhodněji přibližně 150 za sebou následujících aminokyselin zvolených z aminokyselinových sekvencí ukázaných v SEQ ID No. 12 io nebo v SEQ ID No. 14. Xenogenní fragmenty CASB7439 si budou zvláště zachovávat určité funkční vlastnosti, s výhodou imunologickou aktivitu, větší molekuly uvedené v SEQ ID No. 12 nebo v SEQ ID No. 14, a budou použitelné ve zde popisovaných způsobech (např. ve farmaceutických prostředcích a vakcinách, při diagnóze atd.).

Fragmenty budou zvláště schopné vyvolávat imunitní reakci vůči lidskému protějšku, jako je tvorba zkříženě reagujících protilátek, které budou reagovat s autologní lidskou formou CASB7439 uvedenou v kterékoli ze SEQ ID No. 2. V konkrétním provedení může být xenogenní polypeptid podle vynálezu součástí většího fúzního proteinu obsahujícího xenogenní polypeptid CASB7439 nebo jeho fragment a heterologní protein nebo část proteinu působící jako výše popsaný fúzní partner.

Předkládaný vynález také zahrnuje varianty výše uvedených polypeptidů, tj. polypeptidy, které se od referenčních polypeptidů odlišují konzervativními substitucemi aminokyselin, při kterých je zbytek substituován jiným zbytkem s podobnými vlastnostmi. Typicky jsou takovými substitucemi vzájemné substituce mezi Ala, Val, Leu a Ile; mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi bazickými zbytky Lys a Arg; nebo aromatickými zbytky Phe a

Tyr. Zvláště výhodné jsou varianty, ve kterých byly provedeny substituce, delece nebo adice 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 1 až 2 nebo 1 aminokyseliny v jakékoli kombinaci.

- 13 • · · · · ·

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu se mohou připravovat jakýmkoli vhodným způsobem. Mezi takové polypeptidy patří izolované v přírodě se vyskytující polypeptidy, rekombinantně vyráběné polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací těchto způsobů. Způsoby výroby těchto polypeptidů jsou v oboru dobře známé.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká polynukleotidů CASB7439. Mezi tyto polynukleotidy patří izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s alespoň 70% io identitou, s výhodou alespoň 80% identitou, výhodněji s alespoň 90% identitou, ještě výhodněji s alespoň 95% identitou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10 nebo SEQ ID No. 11, po celé délce SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10 nebo SEQ ID No. 11. V této souvislosti jsou velmi výhodné kódované polypeptidy s identitou alespoň 97 %, přičemž ještě výhodnější jsou polypeptidy s 98 až 99% identitou a nejvýhodnější jsou polypeptidy s alespoň 99% identitou.

Další polynukleotidy podle předkládaného vynálezu zahrnují izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, nebo SEQ ID No. 11 po celé délce kódující oblasti. V této souvislosti jsou výhodné polynukleotidy s alespoň 97% identitou, přičemž výhodnější jsou polypeptidy s alespoň 98 až 99% identitou a nejvýhodnější jsou polypeptidy s alespoň 99% identitou.

Mezi další polynukleotidy podle předkládaného vynálezu patří izolované polynukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu se SEQ ID • · '·

- 14 •» ···<

No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8 nebo SEQ ID No. 9, po celé délce uvedených sekvencí, nebo s kódující sekvencí SEQ ID No. 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9 po celé délce uvedené kódující sekvence SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9. V této souvislosti jsou velmi výhodné polynukleotidy s alespoň 97% identitou, přičemž ještě výhodnější jsou polynukleotidy s alespoň 98 až 99% identitou a nejvýhodnější jsou polynukleotidy s alespoň 99% identitou. Tyto polynukleotidy zahrnují polynukleotid obsahující polynukleotid se SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9, stejně jako polynukleotid se SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, nebo kódující oblast SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8 nebo SEQ ID No: 9.

Předkládaný vynález také poskytuje nukleovou kyselinu kódující výše uvedené xenogenní proteiny podle předkládaného vynálezu a jejich použití v lékařství. Ve výhodném provedení má xenogenní polynukleotid CASB7439 pro použití ve farmaceutických prostředcích sekvenci uvedenou v SEQ ID No: 13 (myš) nebo v SEQ ID No: 15 (krysa). Izolované xenogenní polynukleotidy CASB7439 podle vynálezu mohou být jednořetězcové (kódující nebo nekódující řetězce) nebo dvojřetězcové, a může jít o molekuly DNA (genomové, cDNA nebo syntetické) nebo molekuly RNA. V polynukleotidu podle předkládaného vynálezu mohou, ale nemusí být přítomny další kódující nebo nekódující sekvence. V jiných souvisejících provedeních poskytuje předkládaný vynález varianty polynukleotidu, které mají podstatnou identitu se sekvencemi popisovanými v SEQ ID No: 13 nebo v SEQ ID No: 15, např. sekvence obsahující alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99 % nebo vyšší sekvenční identitu ve srovnání s polynukleotidovou sekvencí podíe předkládaného vynálezu ·· s použitím zde popisovaných metod (např. analýza BLAST s použitím standardních parametrů). V příbuzném provedení bude izolovaný xenogenní polynukleotid podle vynálezu obsahovat nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s alespoň 90%, s výhodou 95% a vyšší identitou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14, po celé délce SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14; nebo nukleotidovou sekvenci komplementární s uvedeným izolovaným polynukleotidem.

Vynález také poskytuje polynukleotidy, které jsou io komplementární ke všem výše popsaným polynukleotidům.

Uvedené polynukleotidy mohou být vloženy do vhodného plasmidu, rekombinantního vektoru založeného na mikroorganismu nebo rekombinantního živého mikroorganismu a použity pro imunizaci (viz např. Wolff a další, Science 247: 1465 - 1468 (1990); Corr a další,

J. Exp. Med. 184: 1555 - 1560 (1996); Doe a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 8578 - 8583 (1996)). Předkládaný vynález tedy poskytuje expresní vektor nebo rekombinantní živý mikroorganismus obsahující uvedené polynukleotidy, jak bylo definováno výše.

Vynález také poskytuje fragment polynukleotidu CASB7439, který má při podání pacientovi stejné imunogenní vlastnosti jako polynukleotid SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 13 nebo SEQ ID No: 15.

Vynález také poskytuje polynukleotid kódující imunologický fragment polypeptidu CASB7439 jak bylo definováno výše.

Tyto fragmenty mají míru imunogenní aktivity alespoň 50 % s výhodou alespoň přibližně 70 % a výhodněji alespoň přibližně 90 % ve srovnání s mírou imunogenní aktivity polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 10 nebo SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14 nebo

3o polypeptidové sekvence kódované polynukleotidovou sekvencí SEQ ID

- 16 • · ·

• · · · · .· ··· ··· ···

9 9

9t <

- 9 9 9·

9' 9 9 9

No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 13 nebo SEQ ID No: 15.

Plypeptidové fragmenty podle vynálezu obsahují s výhodou alespoň přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 50 nebo 100 za sebou následujících aminokyselin nebo více, včetně všech mezilehlých délek uvedené polypeptidové kompozice, jako jsou sekvence v SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12 nebo SEQ ID No: 14, nebo kódovaného polynukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 13 nebo SEQ ID No: 15.

Nukleotidová sekvence SEQ ID No: 1 je sekvence cDNA, která obsahuje sekvenci kódující polypeptid (nukleotidy 45 až 1126), která kóduje polypeptid o délce 193 aminokyselin, tj. polypeptid SEQ ID No: 2. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid SEQ ID No: 2 může být identická s kódující sekvenci polypeptidu obsaženou v SEQ ID No: 1, nebo může jít o jinou sekvenci než je sekvence obsažená v SEQ ID No: 1, která rovněž kóduje, v důsledku degenerace genetického kódu, polypeptid SEQ ID No: 2. Polypeptid SEQ ID No: 2 je strukturně příbuzný s jinými proteiny ze skupiny označované „human Achaete Scute homologue 2“ (HASH2) (přístupové číslo NP-005161 a AAB86993).

Gen „Human Achaete Scute homologue 2“ (HASH2), oficiálně nazývaný lidský ASCL2 (Achaete Scute complex like 2) je homolog genů Drosophila Achaete a Scute. Lidský ASCL2 je exprimován pouze v extravilózních trofoblastech vyvíjející se placenty, a je mapován na óhromosomu 11p15 v blízkosti IGF2 a H19. Myší gen „achaete-scute homolog-2“ (MASH2) kóduje transkripční faktor, který má úlohu při vývoji trofoblastu. Gen Mash2 přechází na myš z otce, a nedostatečná exprese ASCL2 při nemaligní hydatidiformní (androgenetické) mole u člověka ukazuje, že lidský Ascl2 přechází také u člověka.

• · to · ·· ·· • · toto to · ·· · · · • to · to · to · • · · · to to to · · . _ ·· · to to · ·

- 17 - ...... ♦*· ♦·· ·· ····

Geny ASCL2 patří do základní třídy transkripčních faktorů s motivem „helix-smyčka-helix“ („helix-loop-helix“, BHLH). Aktivují transkripci vazbou na E box (5’-CANNTG-3’). Pro účinnou vazbu na DNA je nutná dimerizace s jinými proteiny BHLH. Účastní se determinace nervových prekurzorů v periferním nervovém systému a centrálním nervovém systému u drosophila melanogaster, a pravděpodobně také u savců.

Komplementární řetězec nukleotidové sekvence SEQ ID No; 1 je polynukleotidová sekvence SEQ ID No: 6. Tento řetězec také obsahuje io dvě další sekvence kódující polypeptidy. První sekvence kódující polypeptid (nukleotid 1184 až 399 SEQ ID No: 1, nukleotid 608 až 1393 SEQ ID No: 6) kóduje polypeptid o délce 262 aminokyselin, tedy polypeptid SEQ ID No: 3. Druhá sekvence kódující polypeptid (nukleotid 840 až 262 SEQ ID No: 1, nukleotid 952 až 1530 SEQ ID

No: 6) kóduje polypeptid o délce 193 aminokyselin, tedy polypeptid SEQ ID No: 11. Nukleotidová sekvence kódující polypeptidy SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 11 může být identická se sekvencí kódující polypeptidy ze SEQ ID No: 6, nebo může jít o jinou sekvenci než obsaženou v SEQ ID No: 6, která v důsledku degenerace genetického kódu kóduje také polypeptidy SEQ ID No: 3 a 11. Polypeptid SEQ ID No: 3 je strukturně příbuzný jiným proteinům skupiny koaktivátorů sestřihu „splicing coactivator protein family“, která má homologní a/nebo strukturní příbuznost s podjednotkou splicing coactivator subunit srm300 Homo sapiens (přístupové číslo genbank AAF21439).

Polypeptid SEQ ID No: 11 není příbuzný jakémukoli jinému známému proteinu. Polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 11, a polynukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 6 jsou nové a tvoří rovněž součást vynálezu.

Výhodné polypeptidy a polynukleotidy podle předkládaného vynálezu budou mít podle očekávání mj. podobné biologické funkce/vlastnosti jako s nimi homologní polypeptidy a polynukleotidy. Navíc mají výhodné polypeptidy, imunologické fragmenty a

- 18 • ·

·· ·· polynukleotidy podle předkládaného vynálezu podle potřeby alespoň jednu aktivitu kterékoli ze sekvencí SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3 nebo SEQ ID No: 11.

Předkládaný vynález se také týká částečných nebo jinak 5 neúplných polynukleotidových a polypeptidových sekvencí, které byly _ř identifikovány jako první před zjištěním odpovídajících úplných sekvencí SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3 a SEQ ID No:

p 11.

»

Podle dalšího provedení poskytuje předkládaný vynález io izolovaný polynukleotid, který:

(a) obsahuje nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě výhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No: 4a 5 po celé délce SEQ ID

No: 4 a 5;

(b) má nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě výhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No: 1 nebo SEQ ID No: 6 po celé délce SEQ ID No:

4 a SEQ ID No: 5;

(c) obsahuje polynukleotid SEQ ID No: 4 a SEQ ID No: 5; nebo (d) obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který , má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě 25 výhodněji alespoň 97 až 99% identitu s aminokyselinovou sekvencí

SEQ ID No: 2 a SEQ ID No: 7, po celé délce SEQ ID No: 2 a 7, stejně jako s polynukleotidy SEQ ID No: 4 a 5.

Předkládaný vynález dále poskytuje polypeptid, který:

(a) obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% 30 identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90%

• ·

- 19 identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě výhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No: 2 a 7 po celé délce SEQ ID No: 2 nebo 7;

(b) má aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 70% identitu, s výhodou alespoň 80% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu a ještě výhodněji alespoň 97 až 99% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 2 nebo 7 po celé délce SEQ ID No: 2 nebo 7;

(c) obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo 7; a (d) je polypeptid SEQ ID No. 7;

stejně jako polypeptidy kódované polynukleotidem obsahujícím sekvenci obsaženou v SEQ ID No. 4 a 5.

, Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou být získány s použitím standardních metod klonování a screeningu, z knihovny cDNA odvozené z mRNA v buňkách lidské rakoviny tlustého střeva (např. Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NÝ (1989)). Polynukleotidy podle vynálezu mohou být také získány z přirozených zdrojů jako jsou knihovny genomové DNA, nebo mohou být syntetizovány s použitím dobře známých a komerčně dostupných metod.

Jestliže se polynukleotidy podle předkládaného vynálezu používají pro rekombinantní produkci polypeptidu podle předkládaného vynálezu, polynukleotid může obsahovat kódující sekvenci zralého polypeptidu jako taklovou; nebo kódující sekvenci zralého polypeptidu ve čtecím rámci s jinými kódujícími sekvencemi, jako sekvencemi kódujícími úrovní nebo sekreční sekvence, sekvenci pre-, nebo pronebo prepro-proteinu, nebo jiné části fúzního peptidu. Může být kódována například markerová sekvence, která umožní vyčištění fúzovaného proteinu. V některých výhodných provedeních tohoto r

- 20 ·« » · · • · · • « · ·

9 9

9999 aspektu vynálezu je markerovou sekvencí hexahistidinový peptid, jak je poskytován ve vektoru pQE (Qiagen, lne.) a popisován v Gentz a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1989)86: 821 - 824, nebo sekvence HA tágu. Polynukleotid může také obsahovat nekódující 5’- a 3’5 sekvence, jaké jsou přepisované, nepřekládané sekvence, sestřihové a polyadenylační signály, vazebná místa ribosomů a sekvence stabilizující mRNA.

Další provedení předkládaného vynálezu poskytuje polynukleotidy kódující polypeptidové varianty, které obsahují io aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13 nebo SEQ ID No. 15, a ve kterých byla provedena substituce, delece nebo adice několika, například 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 1 až 2 nebo jednoho aminokyselinového zbytku v jakékoli kombinaci.

Polynukleotidy, které jsou identické nebo jsou dostatečně identické s nukleotidovou sekvencí obsaženou v SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 6, mohou být použity jako hybridizační sondy pro cDNA a genomovou DNA nebo jako primery pro amplifikační reakce (PCR) nukleových kyselin, pro izolaci úplných cDNA a genomových klonů kódujících polypeptidy podle předkládaného vynálezu, a pro izolaci cDNA a genomových klonů jiných genů (včetně genů kódujících paralogy z lidských zdrojů a orthology a paralogy z jiných než lidských zdrojů), které mají vysokou sekvenční podobnost se SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 6. Tyto nukleotidové sekvence jsou s výhodou ze

70 % identické, s výhodou z 80 % identické, výhodněji z 90 % identické, nejvýhodněji z 95 % identické s referenční sekvencí. Sondy nebo primery budou obecně obsahovat alespoň 15 nukleotidů, s výhodou alespoň 30 nukleotidů, a mohou obsahovat alespoň 50 nukleotidů. Zvláště výhodné sondy budou obsahovat mezi 30 a 50 nukleotidy. Zvláště výhodné primery budou obsahovat mezi 20 a 25 nukleotidy. Polypeptidy nebo polynukleotidy odvozené ze sekvencí z homologních zvířecích zdrojů by mohly být konkrétně použity jako

- ?1 *r »9 • · · • « Λ • · · • · · ·· 99*9 imunogeny pro získání zkřížené imunitní odpovědi proti lidskému genu.

Polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu, včetně homologů z druhů jiných než člověk, mohou být získány způsobem zahrnujícím kroky screeningu vhodné knihovny za stringentních podmínek hybridizace, pomocí značené sondy se sekvencí SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 6 nebo fragmentem této sekvence; a izolaci úplné cDNA a genomových klonů obsahujících tuto polynukleotidovou sekvenci. Tyto způsoby hybridizace jsou dobře io známé odborníkům v oboru. Mezi výhodné podmínky stringentní hybridizace patří inkubace přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5 x SSC (150mM NaCl, 15mM citrát trojsodný), 50mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10% síran dextranu a 20 pg/ml denaturované, střižnými silami zpracované DNA lososího spermatu; s následným promytím filtrů v 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Předkládaný vynález tedy také zahrnuje polynukleotidy získatelné screeningem vhodné knihovny za stringentních podmínek hybridizace, značenou sondou se sekvencí SEQ ID No. 1 nebo SEQ ID No. 6 nebo jejího fragmentu.

Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že v mnoha případech bude izolovaná sekvence cDNA neúplná v tom, že kódující oblast polypeptidu je zkrácena na 5’-konci cDNA.

Existuje několik způsobů, které jsou odborníkům v oboru dobře známé, pro získání cDNA s úplnou délkou, nebo pro prodloužení zkrácených cDNA, jako jsou například způsoby založené na metodě Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) (viz např. Frohman a další, PNAS, USA 85, 8998 - 9002, 1988). Nedávno provedené modifikace tohoto způsobu, jejichž příkladem je např. technologie Marathon™ (Clontech Laboratories lne.), poskytují podstatně zjednodušené vyhledávání delších cDNA. Při postupu podle technologie Marathon™ se z mRNA extrahované ze zvolené tkáně připravily cDNA a na oba

- 22 •φ ·Φ <· · · · • · · · φφφφ · φ φφφ φφφ φφ φφφφ konce byla ligována „adaptorová“ sekvence. Potom se provede amplifikace nukleové kyseliny (PCR) pro amplifikaci „chybějícího“ 5’konce cDNA s použitím kombinace oligonukleotidových primerů specifických pro gen a specifických pro adaptor. Reakce PCR se potom opakuje s použitím vnitřních primerů („nested“ primers), tj. primerů navržených tak, aby teplotně hybridizovaly s amplifikovaným produktem (typicky primer specifický pro adaptor, který teplotně hybridizuje dále ve směru 3’ v adaptorové sekvenci a primer specifický pro gen, který ve známé genové sekvenci teplotně hybridizuje dále ve io směru 5’. Produkt této reakce může být potom analyzován sekvenováním DNA a cDNA s úplnou délkou může být zkonstruována buď navázáním produktu přímo na existující cDNA za získání úplné sekvence, nebo provedením oddělené PCR s úplnou délkou s použitím nové sekvenční informace pro návrh 5’-primeru.

Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsoby dobře známými v oboru z hostitelských buněk získaných metodami genetického inženýrství obsahujících expresní systémy. Podle dalšího provedení se předkládaný vynález týká expresního systému, který obsahuje polynukleotid podle předkládaného vynálezu, hostitelských buněk získaných metodami genetického inženýrství a obsahujících tyto expresní systémy, a produkce polypeptidů podle vynálezu rekombinantními technikami. Pro výrobu takových proteinů mohou být také použity bezbuněčné translační systémy využívající RNA odvozené z konstruktů DNA podle předkládaného vynálezu.

Pro rekombinantní produkci mohou být buňky modifikovány metodou genetického inženýrství tak, aby obsahovaly expresní systémy nebo jejich části pro polynukleotidy podle předkládaného vynálezu. Zavedení polynukleotidů do hostitelských budek může být uskutečněno způsoby popisovanými v mnoha standardních laboratorních příručkách, jako je Davis a další, Basic Methods in Molecular Biology (1986) a Sambrook a další, Molecular Cloning: A

- 23 -·^:·

Laboratory Manual, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Takové výhodné metody jsou například transfekce pomocí fosforečnanu vápenatého, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem, transvekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovými lipidy, elektroporace, transdukce, vnášení škrabáním, balistické vnášení nebo infekce.

Proteiny podle vynálezu se s výhodou exprimují společně s thioredoxinem in trans (TIT). Koexprese thioredoxinu in trans proti in cis je výhodná tím, že umožní přípravu antigenu prostého thioredoxinu io bez nutnosti použití proteázy. Společná exprese s thioredoxinem usnadňuje solubilizaci proteinů podle vynálezu. Společná exprese s thioredoxinem má také významný vliv na výtěžky, čištění proteinu, na rozpustnost vyčištěného proteinu a jeho jakost.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální 15 buňky, jako jsou streptokoky, stafylokoky, kmeny E. coli, streptomycety a buňky Bacillus subtilis; houbové buňky, jako jsou kvasinkové buňky a buňky Aspergillus; hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 a Bowesova melanomu;

a rostlinné buňky.

Je možno použít celé řady expresních systémů, například chromosomální, episomální a od virů odvozené systémy, například vektory odvozené z bakteriálních plasmidů, z bakteriofágů, z transpozonů, z kvasinkových epizomů, z inzerčních elementů, z kvasinkových chromosomálních elementů, z virů jako jsou bakuloviry, papovaviry, jako SV40, viry vakcinie, adenoviry, viry drůbežích neštovic, viry pseudorabies a retroviry, a vektory odvozené z jejich kombinací, jako jsou vektory odvozené z genetických prvků plasmidů a bakteriofágů, jako jsou kosmidy a fágmidy. Expresní systémy mohou obsahovat řídící oblasti, které regulují stejně jako poskytují expresi. Může být obecně použit jakýkoli systém nebo vektor, • ·

- 24 *

který může udržovat, pomnožovat nebo exprimovat polynukleotid pro produkci polypeptidu v hostiteli. Vhodná nukleotidové sekvence může být vložena do některého expresního systému pomocí řady známých a rutinních technik, které se například uvádějí v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (výše). Do požadovaného polypeptidu mohou být vloženy vhodné sekreční signály pro umožnění sekrece překládaného proteinu do lumen endoplasmatického retikula, periplasmatického prostoru nebo extracelulárního prostředí. Tyto signály mohou být vzhledem k polypeptidu endogenní, nebo může jít o heterologní signály.

Expresní systém může také být rekombinantní živý mikroorganismus, jako je virus nebo bakterie. Sledovaný gen může být vložen do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Zaočkování a infekce in vivo tímto živým vektorem povede k expresi antigenu in vivo a indukci imunitních odpovědí.

V některých provedeních se tedy polynukleotidy kódující imunogenní polypeptidy podle předkládaného vynálezu zavádějí do vhodných savčích hostitelských buněk pro expresi s použitím kteréhokoli z řady známých systémů založených na virech. V jednom ilustrativním provedení poskytují retroviry pohodlnou a účinnou platformu pro systémy dodávání genů. Zvolená nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu může být vložena do vektoru a do retrovirálních částic použitím způsobů známých v oboru. Rekombinantní virus může být potom izolován a vložen do pacienta. Byla popsána řada ilustrativních retrovirových systémů (např. US patent No. 5,219,740; Miller a Rosman (1989) BioTechniques 7: 980 - 990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5 - 14; Scarpa a další (1991) Virology 180: 849 8 2; Burns a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 8033 8037; a Boris-Lawrie a Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102 - 109).

- 25 —

Bylo dále popsáno velké množství ilustrativních systémů založených na adenovirech. Na rozdíl od retrovirů, které se integrují do genomu hostitele, zůstávají adenoviry přítomné extrachromosomálně, takže je minimalizováno riziko spojené s inzerční mutagenezí (Haj-Ahmad a Graham (1986), J. Virol. 57: 267 274; Bett a další (1993), J. Virol. 67: 5911 - 5921; Mittereder a další (1994), Human Gene Therapy 5: 717 - 729; Seth a další (1994), J. Virol. 68: 933 - 940; Barr a další (1994), Gene Therapy 1: 51 - 58; Berkner, K. L. (1988), BioTechniques 6: 616 - 629; a Rich a další io (1993), Human Gene Therapy 4: 461 - 476).

Pro dodávání polynukleotidů byly také vyvinuty vektorové systémy na bázi viru asociovaného s adenovirem (AAV). Vektory AAV mohou být snadno konstruovány s použitím v oboru známých způsobů, viz např. US patenty No. 5,173,414 a 5,139,941; mezinárodní přihlášky Nó. WO 92/01070 a WO 93/03769; Lebkowski a'další (1988), Molec. Cell Biol. 8: 3988 - 3996; Vincent a další (1990), Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992), Current Opinion in Biofechnology 3: 533 - 539; Muzyczka, N. (1992), Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97 - 129; Kotin, R. M. (1994),

Human Gene Therapy 5: 793 - 801; Shelling a Smith (1994), Gene Therapy 1: 165 - 169; a Zhou a další (1994), J. Exp. Med. 179: 1867 1875.

Mezi další virové vektory použitelné pro dodávání molekul nukleových kyselin kódujících polypeptidy podle předkládaného vynálezu přenosem genů patří vektory odvozené ze skupiny poxvirů, jako je virus vakcinie a ptačí poxviry. Rekombinanty viru vakcinie exprimující nové molekuly mohou být například zkonstruovány následovně. Do vhodného vektoru se nejprve vloží DNA kódující polypeptid tak, že sousedí s promotorem vakcinie a obklopujícími sekvencemi DNA vakcinie, jako je sekvence kódující thymidinkinázu (TK). Tento vektor se potom použije pro transfekci buněk, které jsou současně infikovány vakcinií. Homologní rekombinace slouží pro

- 26 ·^* · · · · * vložení promotoru vakcinie plus genu kódujícího sledovaný polypeptid do virového genomu. Selekce výsledného rekombinantu TK.sup.(-) může být provedena kultivací buněk v přítomnosti 5-bromdeoxyuridinu a odpíchnutím virových plaků, které jsou na něj rezistentní.

Infekční/transfekční systém založený na vakcinii může být pohodlně použit pro získání inducibilní, přechodné exprese nebo koexprese jednoho nebo více zde popisovaných polypeptidů v hostitelských buňkách organismu. V tomto konkrétním systému jsou buňky nejprve infikovány in vitro rekombinantou viru vakcinie, která kóduje RNA polymerázu bakteriofága T7. Tato polymeráza má výlučnou specificitu v tom, že přepisuje pouze templáty nesoucí promotory T7. Po infekci se buňky transfekují sledovaným polynukleotidem nebo polynukleotidy pod řízením T7 promotoru. Polymeráza exprimovaná v cytoplasmě z rekombinanty viru vakcinie přepisuje transfekovanou DNA do RNA, která je potom překládacími mechanismy hostitele překládána do polypeptidu. Tento způsob poskytuje vysokou, přechodnou produkci velkých množství RNA a jejích translačních produktů v cytoplasmě, viz např. Elroy-Stein a Moss, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743 - 6747; Fuerst a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83; 8122 - 8126.

Pro dodávání sledovaných kódujících sekvencí mohou být také alternativně použity ptačí poxviry, jako jsou viry drůbežích neštovic a kanárčích neštovic. Je známo, že rekombinantní ptačí poxviry, které exprimují imunogeny ze savčích patogenů, propůjčují ochrannou imunitu při podání druhům odlišným od ptáků. Použití vektoru ptačích neštovic je zvláště vhodné u lidí a jiných savčích druhů, protože rod virů ptačích neštovic se může produktivně replikovat pouze ve vnímavých druzích ptáků, a proto není infekční v savčích buňkách. Způsob produkce rekombinantních virů ptačích neštovic je v oboru znám a zahrnuje genetickou rekombinaci, jak se popisuje výše pro produkci virů vakcinie, viz např. WO 91/12882; WO 89/03429; a WO 92/03545.

- 27 • · 0 ·

Pro dodání polynukleotidových prostředků podle předkládaného vynálezu může být také použit kterýkoli z řady alfavirových vektorů, jako jsou vektory popisované v US patentech No. 5,843,723; 6,015,686; 6,008,035 a 6,015,694. Mohou být také použity určité vektory založené na venezuelské encefalitidě koní (VEE), přičemž ilustrativní příklady těchto vektorů je možno nalézt v US patentech No. 5,505,947 a 5,643,576.

Pro dodávání genů podle vynálezu mohou být navíc použity vektory založené na molekulárních konjugátech, jako jsou adenovirové w chimérní vektory popsané v Michael a další, J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866 - 6869 a Wagner a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:

6099 - 6103.

Další ilustrativní informace o těchto a dalších známých dodávacích systémech na bázi virů je možno nalézt například ve

Fisher-Hoch a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 317 - 321, 1989; Flexner a další, Ann. NY, Acad. Sci. 569: 86 - 103, 1989; Flexner a další, Vaccine 8: 17 - 21, 1990; US patent No. 4,603,112, 4,769,330 a 5,017,487; WO 89/01973; US patent No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616 - 627, 1988;

Rosenfeld a další, Science 252: 431 - 434, 1991; Kolls a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 215 - 219, 1994; Kass-Eisler a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 11498 - 11502, 1993; Guzman a daší, Circulation 88: 2838 - 2848, 1993; a Guzman a další, Cir. Res. 73: 1202 - 1207,1993.

Výše popisované rekombinantní živé organismy mohou být virulentní nebo různými způsoby oslabené, aby byly získány živé vakciny. Takové živé vakciny tvoří také součást vynálezu.

V některých provedeních může být polynukíeotid integrován do genomu cílové buňky. Tato integrace může probíhat ve specifickém umístění a orientaci prostřednictvím homologní rekombinace (náhrada genu) nebo může integrace probíhat v náhodném, nespecifickém

- 28 umístění (zesílení genu). V ještě dalším provedení může být polynukleotid stabilně udržován v buňce ve formě odděleného episomálního segmentu DNA. Tyto polynukleotidové segmenty nebo „episomy“ kódují sekvence dostačující pro umožnění udržení a replikace nezávisle nebo v synchronizaci s cyklem hostitelské buňky. Způsob, jakým se expresní konstrukt dodá do buňky, a kde v buňce polynukleotid zůstane závisí na typu použitého expresního konstruktu.

V dalším provedení podle vynálezu se polynukleotid podává/dodává jako čistá, „naked“ DNA, např. jak se popisuje v Ulmer a další, Science 259, 1745 - 1749, 1993 a v souhrnném článku Cohen, Science 259: 1691 - 1692, 1993. Příjem čisté DNA může být zvýšen potažením DNA na biodegradovatelné kuličky, které jsou účinně transportovány do buněk.

V ještě dalším provedení může být prostředek podle předkládaného vynálezu dodáván prostřednictvím bombardování částice, přičemž dosud byla popsána řada takových způsobů. V jednom ilustrativním příkladu je možno dosáhnout urychlení částic hnaných plynem v zařízeních, která jsou vyráběna firmou Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) a Powderject Vaccines lne. (Madison, WI), přičemž některé případy těchto zařízení se popisují v US patentech No. 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; a EP patentu No. 0500 799. Tento přístup nabízí dodávání bez použití jehly, kdy se prostředky ve formě suchého prášku mikroskopických částic, jako jsou částice polynukleotidu nebo polypeptidu, urychlují na vysokou rychlost proudem plynného helia vytvářeného v ručním zařízení, který žene částice na cílovou tkáň.

V dalším provedení jsou zahrnuta jiná zařízení a způsoby, které mohou být použitelné pro bezjehlové vstřikování prostředků podle předkládaného vynálezu proudem plynu, například zařízení poskytovaná firmou Bioject, lne. (Portland, OR), přičemž některé další

příklady se popisují v US patentech No. 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 a 5,993,412.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány a čištěny z rekombinantních buněčných kultur dobře známými způsoby včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakcí kyselinami, aniontové nebo kationtové iontoměničové chromatografie, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie založené na hydrofobních interakcích, afinitní chromatografie, chromatografie na hydroxylapatitu a lektinové chromatografie. Nejvýhodněji se pro čištění io používá afinitní chromatografie s kovovými ionty (IMAC). Známé způsoby pro skládání proteinů do aktivní konformace (refolding) mohou být použity pro regeneraci aktivní konformace v případě, kdy je polypeptid v průběhu intracelulární syntézy, izolace a/nebo čištění denaturován.

Další důležité provedení vynálezu se týká způsobu indukce, zesílení nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje zaočkování savce fragmentem polypeptidů nebo úplným . polypeptidem nebo polynukleotidem podle vynálezu, dostatečným pro produkci protilátky a/nebo pro vyvolání T-buněčné imunitní odpovědi pro imunoprofylaxi nebo pro léčení rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, a autoimunitního onemocnění a souvisejících stavů. V ještě dalším provedení se vynález týká způsobu indukce, zesílení nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje dodání polypeptidů podle předkládaného vynálezu prostřednictvím vektoru nebo buněčně směrované exprese polynukleotidu kódujícího polypeptid in vivo s cílem indukovat takovou imunologickou odpověď, která poskytne imunitní reakce pro prevenci nebo léčení uvedeného savce.

Další provedení vynálezu se týká imunologického/vakcinačního prostředku a jeho použití v lékařství. Tyto prostředky, jestliže se zavedou do savčího hostitele, indukují, zesilují nebo modulují ·· ·· • · • ·' • · • · • · · · · · imunologickou odpověď v tomto savci na polypeptid podle předkládaného vynálezu, přičemž prostředek obsahuje polypeptid nebo polynukleotid podle vynálezu, nebo jeho imunologický fragment, jak bylo definováno výše. Imunogenní prostředek podle předkládaného vynálezu obsahuje zvláště bezpečné a účinné množství polypeptidů CASB7439 nebo jeho imunogenního fragmentu, přičemž polypeptid CASB7439 je zvolen ze skupiny zahrnující SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 nebo SEQ ID No. 14. V dalším provedení obsahuje imunogenní prostředek io bezpečné a účinné množství polynukleotidu kódujícího CASB7439 nebo jeho fragment, přičemž polynukleotid kódující CASB7439 je zvolen ze skupiny SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 13 nebo SEQ ID No.

15.

Prostředek pro vakcinaci podle vynálezu může dále obsahovat vhodný, tj. farmaceuticky přijatelný nosič. Protože polypeptid se může v žaludku rozkládat, s výhodou se podává parenterálně (např. subkutánní, intramuskúlární, intravenózní nebo intradermální injekcí). Mezi formulace vhodné pro parenterální podávání patří vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické látky a rozpuštěné látky, které umožňují dosažení isotonického stavu vzhledem ke krvi příjemce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující prostředky nebo zahušťující prostředky. Tyto formulace mohou být předkládány v zásobnících pro jednotkovou dávku nebo pro větší počet dávek, například v uzavřených ampulích a lahvičkách, a mohou být uchovávány v lyofilizovaném stavu, který vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Další provedení vynálezu se týká indukce in vitro imunitních odpovědí na fragment nebo celý polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu, nebo molekulu obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s použitím buněk

- 31 -··· · ··· ··· * ···· imunitního systému savce, a reinfuze těchto aktivovaných imunitních buněk savce pro léčení onemocnění, aktivace buněk imunitního systému se dosahuje inkubací in vitro s celým polypeptidem nebo polynukleotidem podle předkládaného vynálezu nebo molekulou obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých imunomodulačních molekul. Další provedení vynálezu se týká imunizace savce podáváním buněk prezentujících antigen modifikovaných vnesením části úplného polypeptidů podle předkládaného vynálezu nebo molekuly obsahující polypeptid podle předkládaného vynálezu in vitro, a imunogenní podání in vivo. Buňky předkládající antigen mohou být alternativně transfekovány in vitro vektorem obsahujícím fragment nebo úplný polynukleotid podle předkládaného vynálezu, nebo molekulu obsahující polynukleotid podle předkládaného vynálezu, např. pro dosažení exprese odpovídajícího polypeptidů, a mohou být podány imunogenním způsobem in vivo. Farmaceutické prostředky podle vynálezu budou tedy obsahovat účinné množství buněk prezentujících antigen, modifikovaných vnesením polypeptidů CASB7439 in vitro, nebo geneticky modifikovaných in vitro pro expresi polypeptidů CASB7439, a farmaceuticky přijatelný nosič.

Podle dalšího provedení budou obsahovat zde popisované farmaceutické/imunogenní prostředky jednu nebo více imunostimulačních látek navíc k imunogennímu polynukleotidu, polypeptidů, protilátce, T-buňce a/nebo buňce předkládající antigen (APC) podle vynálezu. Poskytuje se tedy způsob produkce uvedeného imunogenního prostředku, který zahrnuje míšení polypeptidů CASB7439 nebo polynukleotidu kódujícího CASB7439 s vhodnou adjuvantní/imunostimulační látkou, ředivem nebo jiným farmaceuticky přijatelným nosičem. Imunostimulační látka označuje v podstatě jakoukoli látku, která zvyšuje nebo zesiluje imunitní odpověď (zprostředkovanou protilátkami a/nebo buňkami) na vnější antigen. Jedním výhodným typem imunostimulační látky je adjuvans. Mnohá

• ·	•	•		··
• ·	•	•	•	• ·
» · ·	•	•	• ·	• 9
• ·	•	•	•	• ·
• · · · · ·	···	···	• ♦	····

er adjuvans obsahují látku navrženou pro ochranu antigenu před rychlým odbouráváním, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej, a stimulátor imunitních odpovědí jako je lipid A a proteiny odvozené od Bortadella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Některá adjuvans jsou komerčně dostupná, například Freundovo nekompletní adjuvans a kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merckovo adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); soli hliníku jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý; soli vápníku, io železa nebo zinku; nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu; acylované cukry; kationtově nebo aniontově derivatizované polysacharidy; polyfosfazeny; biodegradovatelné mikrokuličky;

monofosforyl lipid A a quil A. Jako adjuvans mohou být také použity cytokiny, jako je GM-CSF, interleukin-2, -7, -12 a jiné podobné růstové faktory.

V rámci některých provedení vynálezu je adjuvantní prostředek s výhodou takový, který indukuje imunitní odpověď převážně typu Th1. Vysoké hladiny cytokinů typu Th1 (např. IFN-γ, TNF-α, IL-2 a IL-12) zvyšují indukci buňkami zprostředkovaných imunitních odpovědí na podávaný antigen. Naopak vysoké hladiny cytokinů typu Th2 (např. IL4, IL-5, IL-6 a IL-10) podporují indukci humorálních imunitních odpovědí. Po aplikaci vakcíny podle vynálezu bude u pacienta podporována imunitní odpověď, která zahrnuje odpovědi typu Th1 a Th2. Ve výhodném provedení, ve kterém je odpově’d převážně typu

Th1, bude stoupat hladina cytokinů typu Th1 ve větší míře, než hladina cytokinů typu Th2. Hladiny těchto cytokinů mohou být snadno zjišťovány použitím standardních testů. Přehled skupin cytokinů lze nalézt v článku Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145 - 173, 1989.

Některá výhodná adjuvans pro vyvolání odpovědi převážně typu

Th1 zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, s výhodou 3de-O-acylovaného monofosforyllipidu A, se solí hliníku. Adjuvans

- 33 -··· ··· * » * ·· ·♦ • · 4 4 · · • 4 4 4 ·· • · · « 4 ··· ··« ·« ····

MPL® jsou dostupná od firmy Corixa Corporation (Seattle, WA; viz např. US patenty No. 4, 436, 727; 4,877,611; 4,866,034 a 4,912,094). Také oligonukleotidy obsahující CpG (ve kterých je dinukleotid CpG nemethylovaný) indukují převážně odpověď typu Th1. Tyto oligonukleotidy jsou dobře známé a popisují se například ve WO 96/02555, WO 99/33488 a US patentech No. 6,008,200 a 5,856,462. Jsou také popsány imunostimulační sekvence DNA, například autory Sáto a další, Science 273: 352, 1996. Další výhodné adjuvans zahrnuje saponin jako je Quil A nebo jeho deriváty včetně QS21 a QS7 io (Aquila Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA); Escin; Digitonin; nebo saponiny Gypsophila nebo Chenopodium quinoa. Další výhodné formulace obsahují v adjuvantních kombinacích podle předkládaného vynálezu více než jeden saponin, například kombinace alespoň dvou látek z následující skupiny QS21, QS7, Quil A, β-escin nebo digitonin.

Saponinové formulace mohou být alternativně kombinovány s vakcinačními vehikuly složenými z chitosanu nebo jiných polykationtových polymerů, polylaktidu a kopoiymerních polylaktid/glykblidových částic, polymerních matric na bázi poly-Nacetylglucosaminu, částic složených z polysacharidů nebo chemicky modifikovaných polysacharidů, liposomů a lipidických částic, částic složených z glycerolových monoesterů apod. Saponiny mohou být také formulovány v přítomnosti cholesterolu za vytvoření částicových struktur jako jsou liposomy ISCOM. Saponiny mohou být dále formulovány spolu s polyoxyethylenovým etherem nebo esterem, buď v roztoku neobsahujícím částice nebo suspenzi, nebo v částicové struktuře jako je paucilamelární liposom nebo ISCOM. Saponiny mohou být také formulovány s pomocnými látkami jako je Carbopol® pro zvýšení viskozity, nebo mohou být formulovány jako suchý prášek s práškovou pomocnou látkou jako je laktóza.

V jednom výhodném provedení obsahuje adjuvantní systém kombinaci monofosforyllipidu A a derivátu saponinu, jako je kombinace adjuvans QS21 a 3D-MPL®, jak se popisuje ve WO 94/00153, nebo • «

- 34 • φ *· • · • φ • · • · *

9999

Ig.

ί’ méně reaktogenní prostředek, kde je QS21 ve směsi s cholesterolem, jak se popisuje ve WO 96/33739. Jiné výhodné formulace obsahují emulzi typu olej ve vodě a tokoferol. Další zvláště výhodná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL® a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě se popisuje ve WO 95/17210.

Další adjuvantní systém se zvýšenou účinností obsahuje kombinaci oligonukleotidu obsahujícího CpG a saponinový derivát, zvláště kombinaci CpG a QS21, jak se popisuje ve WO 00/09159. Formulace s výhodou dále obsahuje emulzi typu olej ve vodě io a tokoferol.

Další ilustrativní adjuvans pro použití ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu zahrnují Montanide ISA 720 (Seppic, Francie), SAF (Chiron, California, Spojené Státy), ISCOMS (CSL), MF59 (Chiron), a řadu adjuvans SBAS (např. SBAS-2 nebo SBAS-4, firmy

SmithKline Beecham, Rixensart, Belgie), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) a jiné aminoalkylglukosaminid-4-fosfáty (AGP), jako jsou látky popisované v US patentových přihláškách No. 08/853,826 a 09/074,720, jejichž obsah se zařazuje odkazem, a polyoxyethylenetherová adjuvans popisovaná ve WO 99/52549A1.

Další výhodná adjuvans zahrnují adjuvantní molekuly obecného vzorce (I) :

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R kde, n je 1 až 50, A je vazba nebo -C(O)-, R je Cvso-alkyl nebo fenyl-Ci-50-alkyl.

Jedno provedení předkládaného vynálezu zahrnuje vakcinační prostředek obsahující polyoxyethylenether obecného vzorce (l), kde malé n je mezi 1 a 50, s výhodou 4 až 24, nejvýhodněji 9; složka R je Cvso-, s výhodou C₄-C₂o-alkyl a nejvýhodněji Ci₂-alkyl, a A je vazba.

Koncentrace polyoxyethylenetherů by měla být v rozmezí 0,1 - 20 %, s výhodou 0,1 - 10 %, a nejvýhodněji v rozmezí 0,1 - 1 %. Výhodné polyoxyethylenethery jsou zvoleny z následující skupiny: polyoxyethylen-9-laurylether, polyoxyethylen-9-steorylether, polyoxy-ethylen-8-steorylether, polyoxyethylen-4-laurylether, polyoxyethylen5 -35-laurylether, a polyoxyethylen-23-laurylether. Polyoxyethylenethery jako je polyoxyethylenlaurylether se popisují v Merckově indexu (12. vydání: položka 7717). Tyto adjuvantní molekuly se popisují ve WO 99/52549.

Polyoxyethylenether obecného vzorce (I) výše může být v io případě potřeby kombinován s jiným adjuvans. Výhodná adjuvantní kombinace obsahuje například navíc CpG, jak se popisuje v patentové přihlášce GB 9820956.2.

Ve vakcině podle vynálezu je také s výhodou přítomen nosič. Nosič může být emulze typu olej ve vodě, nebo sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze typu olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Ve zvláště výhodném provedení jsou antigeny ve vakcině podle vynálezu kombinovány s QS21 a 3D-MPL v emulzi podobného typu. Emulze typu olej ve vodě může navíc obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprylin.

Pro podání člověku budou QS21 a 3D-MPL ve vakcině typicky přítomny v množství v rozmezí od 1 pg do 200 pg, jako je 10 až 100 pg, s výhodou 10 pg až 50 pg na dávku. Emulze typu olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % alfa25 tokoferolu a od 0,3 do 3 % tweenu 80. Poměr skvalen : alfa-tokoferol je s výhodou menší nebo roven než 1, čímž se dosáhne stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v množství 1 %. V některých případech může být výhodné, jestliže vakciny podle předkládaného vynálezu dále obsahují stabilizátor.

Netoxické emulze typu olej ve vodě obsahují s výhodou netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například

- 36 Tween 80, ve vodném nosiči. Vodný nosič může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.

Zvláště účinná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě se popisuje ve WO 95/17210.

Předkládaný vynález také poskytuje polyvalentní vakcinu obsahující vakcinační formulaci podle vynálezu v kombinaci s jinými antigeny, zvláště antigeny použitelnými pro léčení rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, autoimunitnich onemocnění a souvisejících stavů. Taková polyvalentní vakcina může obsahovat adjuvans io indukující odpověď TH-1, jak bylo popsáno výše.

Podle dalšího provedení vynálezu je zde popisovaný imunogenní prostředek hostiteli dodáván prostřednictvím buněk předkládajících antigen (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B-buňky, monocyty a jiné buňky, které mohou být získány metodami genetického inženýrství pro dosažení jejich účinnosti jako APC. Tyto buňky mohou nebo nemusí být geneticky modifikovány pro zvýšení kapacity pro předkládání antigenu, pro zvýšení aktivace a/nebo udržení T-buněčné odpovědi, pro dosažení antitumorových účinků jako takových, a/nebo pro dosažení imunologické kompatibility s příjemcem (například souhlasný haplotyp HLA). APC se mohou obecně izolovat z celé řady biologických kapalin a orgánů, včetně tumorových a peritumorových tkání, a může jít o autologní, alogenní, syngenní nebo xenogenní buňky.

Některá výhodná provedení podle předkládaného vynálezu používají jako buňky předkládající antigen dendritické buňky nebo jejich prekurzory. Dendritické buňky jsou vysoce účinné APC (Banchereau a Steinman, Nátuře 392: 245 - 251, 1998) a bylo ukázáno, že jsou účinné jako fyziologické adjuvans pro vyvolání preventivní nebo léčebné antitumorové imunity (viz Timmerman a

Levý, Ann. Rev. Med. 50: 507 - 529, 1999). Dendritické buňky mohou být obecně izolovány na základě jejich typického tvaru (hvězdicový • ·

tvar in šitu s vyznačenými cytoplasmatickými výběžky (dendrity) viditelnými in vitro), jejich schopnosti přijímat, zpracovávat a předkládat antigeny s vysokou účinností a jejich schopnosti aktivovat odpovědi naivních T-buněk. Dendritické buňky mohou být samozřejmě genetickým inženýrstvím upraveny pro expresi specifických receptorů nebo ligandů buněčného povrchu, které se normálně na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo nenacházejí, přičemž takové modifikované dendritické buňky rovněž spadají do rámce předkládaného vynálezu. Jako alternativa k dendritickým buňkám mohou být v rámci vakciny použity sekrenované váčky dendritických buněk obsahující antigen (nazávané exosomy) (viz Zitvogel a další, Nátuře Med. 4: 594 - 600, 1998).

Dendritické buňky a jejich prekurzory mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, buněk infiltrujících tumor, buněk infiltrujících tkáně v okolí tumorů, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, krve nebo jakékoli jiné vhodné tkáně nebo kapaliny. Dendritické buňky se mohou například diferencovat ex vivo přidáním kombinace cytokinů jako je GM-CSF, IL- 4, IL-13 a/nebo TNFa ke kulturám monocytů sklizených z periferní krve. Alternativně lze CD34-pozitivní buňky sklizené z periferní krve, pupečníkové krve nebo kostní dřeni diferencovat na dendritické buňky přidáním kombinací GM-CSF, IL-3, TNFa, ligandu CD40, LPS, ligandu flt3 a/nebo jiných složek indukujících diferenciaci, zrání a proliferaci dendritických buněk, do média.

Dendritické buňky se obvykle kategorizují jako „nezralé“ a „zralé“ buňky, což poskytuje jednoduchý způsob rozlišení mezi těmito dvěma dobře charakterizovanými fenotypy. Toto zařazení by však nemělo vylučovat všechny možné mezistupně diferenciace. Nezralé dendritické buňky jsou charakterizovány jako APC s vysokou schopností přijímat a zpracovat antigen, což koreluje s vysokou expresí receptoru Fcy a mannózového receptoru. Zralý fenotyp je

- 38 - ··· · typicky charakterizován nižší expresí těchto markérů, ale vysokou expresí molekul buněčného povrchu odpovědných za aktivaci T-buněk, jako jsou MHC třídy I a II, adhezní molekuly (např. CD54 a CD11) a kostimulační molekuly (např. CD40, CD80, CD86 a 4-IBB).

APC mohou obecně transfekovány polynukleotidem podle vynálezu (nebo jeho částí nebo jinou variantou), takže je kódovaný polypeptid nebo jeho imunogenní část exprimován na buněčném povrchu. Taková transfekce může probíhat ex vivo, a farmaceutický prostředek s obsahem takových transfekovaných buněk může být potom použit k léčebným účelům, jak se popisuje v této přihlášce. Alternativně může být pacientovi podáno vehikulum dodávající gen, jehož cílem je dendritická nebo jiná buňka předkládající antigen, což vede k transfekci probíhající in vivo. Transfekce například dendritických buněk in vivo a ex vivo může být například prováděna použitím jakýchkoli v oboru známých metod, jako jsou metody popisované ve WO 97/24447, nebo způsobem „gene gun“ popisovaným v článku Mahvi a další, Immunology and cell Biology 75: 456 - 460, 1997. Vnášení antigenu do dendritických buněk se dá dosáhnout inkubací dendritických buněk nebo jejich prekurzorových buněk s tumorovým polypeptidem, DNA (samostatně nebo v rámci plasmidového vektoru) nebo RNA; nebo rekombinantní bakterií nebo virem exprimujícími antigen (například vektory na bázi vakcinie, drůbežích neštovic, adenoviru nebo lentiviru). Před vložením může být polypeptid kovalentně navázán na imunologického partnera poskytujícího pomoc T-buněk (například nosná molekula). Alternativně může být k dendritické buňce pulsně přidán nekonjugovaný imunologický partner, odděleně nebo v přítomnosti polypeptidu.

Zatímco ve farmaceutických prostředcích podle vynálezu může být použit jakýkoli vhodný nosič známý odborníkům v oboru, typ nosiče se bude typicky lišit v závislosti na způsobu podávání. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány pro jakýkoli vhodný způsob podávání, včetně například místního, orálního,

-39-.

nazálního, slizničního, intravenózního, intrakraniálního, intraperitoneálního, subkutánního a intramuskulárního podání.

Nosiče pro použití s těmito farmaceutickými prostředky jsou biologicky kompatibilní a mohou být také biologicky degradovatelné.

V některých provedeních poskytuje prostředek s výhodou relativně konstantní hladinu uvolňování účinné složky. V jiných provedeích však může být žádoucí vysoká rychlost uvolňování bezprostředně po podání. Formulace takových prostředků spadá do znalostí odborníka v oboru při použití známých technologií. Ilustrativní nosiče použitelné v této souvislosti zahrnují mikročástice poly(laktid-ko-glykolid), polyakrylát, latex, škrob, celulóza, dextran apod. Mezi jiné ilustrativní nosiče se zpožděným uvolňováním patří supramolekulární biologické vektory, které obsahují jiné než kapalné hydrofilní jádro (například zesítěný polysacharid nebo oligosacharid) a popřípadě vnější vrstvu obsahující amfifilní sloučeninu jako je fosfolipid (viz např. US patent No. 5,151,254 a PCT přihlášky WO 94/20078, WO/94/23701 a WO 96/06638). Množství účinné sloučeniny obsažené v prostředcích s prodlouženým uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a očekávaném trvání uvolňování a povaze stavu, který se léčí, nebo proti němuž se provádí prevence.

V dalším ilustrativním provedení se jako nosiče pro prostředky podle vynálezu používají biologicky degradovatelné mikrokuličky (např. polylaktát polyglykolát). Vhodné biologicky degradovatelné mikrokuličky se popisují např. v US patentech No. 4,897,268;

5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344,

5,407,609 a 5,942,252. V mnoha použitích budou také použitelné nosné systémy založené na modifikovaném jaderném proteinu hepatitidy B, jako se popisuje ve WO/99 40934 a tam uvedených odkazech. Další ilustrativní nosný/dodávací systém využívá nosič obsahující proteinové komplexy ve formě částic, které se například popisují v US patentu No. 5,928,647, které jsou schopné indukovat odpovědi cytotoxických T-lymfocytů omezené na třídu I u hostitele.

-40 Farmaceutické prostředky podle vynálezu budou často dále obsahovat jeden nebo více pufrů (například neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fyziologický roztok s fosfátovým pufrem), sacharidy (např. glukóza, mannóza, sacharóza nebo dextrany), mannitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycin, antioxidanty, bakteriostatické látky, chelatační látky jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (např. hydroxid hlinitý), rozpuštěné látky pro dosažení isotonicity prostředku, jeho hypotonicity nebo slabé hypertonicity vzhledem ke krvi příjemce, suspendující látky, zahušťovadla a/nebo ochranné látky. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být alternativně formulovány jako lyofilizát.

Popisované farmaceutické prostředky mohou být ve formě jednotkové dávky nebo zásobníků pro více dávek, jako jsou uzavřené ampule nebo lahvičky. Tyto zásobníky jsou typicky uzavřeny tak, aby byla uchována sterilita a stabilita prostředku až do použití. Obecně mohou být formulace uchovávány ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejových nebo vodných vehikulech. Farmaceutický prostředek může být alternativně uchováván v lyofilizovaném stavu vyžadujícím pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Vytváření vhodných dávkovačích a léčebných režimů pro použití konkrétních popisovaných prostředků včetně například orálního, parenterálního, intravenózního, intranazálního a intramuskulárního podávání, je dobře známé v oboru, přičemž některé z těchto forem budou pro ilustraci stručně diskutovány dále.

V některých aplikacích mohou být farmaceutické prostředky popisované v tomto vynálezu podávány živočichovi orálně. Tyto prostředky mohou být proto formulovány s inertním ředivem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem, nebo mohou být uzavřeny v tvrdých nebo měkkých želatinových kapslích, nebo mohou být lisovány do tablet, nebo mohou být přidávány přímo do potravy nebo diety.

-41 Účinné sloučeniny mohou být přidány k pomocným látkám a použity ve formě tablet pro polykání, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek apod. (viz např. Mathiowitz a další, Nátuře 1997, 27. března; 386 (6623): 410 - 4; Hwang a další,

Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1998; 15 (3): 243 - 84; US patent 5,641,515; US patent 5,580,579 a US patent 5,792,451). Tablety, pastilky, pilulky, kapsle apod. mohou také obsahovat kteroukoli z řady dalších složek, například pojivo jako je tragakantová guma, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina; pomocné látky jako je fosforečnan io vápenatý; rozvolňovadlo jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselina alginová apod.; kluznou látku jako je stearan hořečnatý; a sladidlo jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin, nebo ochucovací prostředek jako je máta, libavka nebo třešňová příchuť. Jestliže je dávkovou jednotkou kapsle, může obsahovat navíc k materiálům výše uvedeného typu kapalný nosič. Různé další materiály mohou být přítomny jako povlaky nebo pro jinou modifikaci fyzikální formy dávkové jednotky. Například tablety, pilulky nebo kapsle mohou být potaženy šelakem, cukrem nebo oběma. Kterýkoli materiál použitý při přípravě jakékoli jednotkové dávkové formy by měl být samozřejmě farmaceuticky čistý a v použitých množstvích v podstatě netoxický. Účinné sloučeniny mohou být navíc přidány do prostředku s prodlouženým uvolňováním.

Tyto formulace budou typicky obsahovat alespoň přibližně 0,1 % účinné sloučeniny nebo více, i když procento účinné látky nebo látek se může samozřejmě měnit a může být mezi přibližně 1 nebo 2 % a přibližně 60 % nebo 70 % nebo více, vztaženo na hmotnost nebo objem celkového prostředku. Množství účinné složky nebo účinných složek v každém terapeuticky použitelném prostředku se může přirozeně připravit tak, aby jakákoli daná jednotková dávka sloučeniny poskytla vhodné dávkování. Odborník v oboru přípravy takových prostředků bude brát v úvahu faktory jako je rozpustnost, biologická

- 42 dostupnost, biologický poločas, způsob podávání, skladovatelnost, stejně jako další farmakologické předpoklady.

Pro orální podávání mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu alternativně přítomny spolu s jednou nebo více pomocnými látkami ve formě ústní vody, prostředku na čištění zubů, bukální tablety, ústního spreje nebo sublingválního prostředku podávaného ústy. Účinná složka může být alternativně přidána do ústního roztoku jako je roztok obsahující boritan sodný, glycerol a hydrogenuhličitan draselný, nebo dispergována v prostředku na čištění zubů, nebo přidána v terapeuticky účinném množství do prostředku, který může obsahovat vodu, pojivá, abraziva, příchuti, prostředky udržující pěnivost a vlhkost. Prostředky mohou být alternativně ve formě tablety nebo roztoku, které mohou být vloženy pod jazyk nebo jinak rozpuštěny v ústech.

Za některých okolností bude žádoucí dodávat zde popisované farmaceutické prostředky parenterálně, intravenózně, intramuškulárně nebo i intraperitoneálně. Tyto přístupy jsou odborníkům v oboru dobře známy, a některé z nich se dále popisují například v US patentu 5,543,158; US patentech 5,641,515 a US patentu 5,399,363.

V některých provedeních mohou být účinné sloučeniny ve formě volné báze nebo farmakologicky přijatelných solí připraveny ve vodném roztoku vhodně smíšeném s povrchově aktivní látkou, jako je hydroxypropylcelulóza. Mohou být také připraveny disperze v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech a jejich směsích a v olejích. Za obvyklých podmínek skladování a použití budou tyto prostředky obecně obsahovat ochrannou látku, aby se zabránilo růstu mikroorganismů.

Mezi ilustrativní farmaceutické formy vhodné pro injekce patří sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro přípravu

3o sterilních injekčních roztoků nebo disperzí před použitím (např. viz US patent 5,466,468). Ve všech případech musí být forma sterilní a musí ·'

• · · · být do té míry kapalná, aby ji bylo možno snadno podávat stříkačkou. Musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněna proti kontaminujícímu působení mikroorganismů, jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní médium obsahující např. vodu, ethanol, polyol (např. glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol apod.), vhodné směsi těchto látek a/nebo rostlinné oleje. Vhodná tekutost může být udržena například použitím povlaku jako je lecitin, dodržením požadovaně velikosti částic v případě disperze a/nebo použitím povrchově aktivních látek. Působení mikroorganismů je možno zabránit různými antibakteriálními a antifungálními prostředky, jako jsou např. parabeny, chlorbutanol, fenol, kyselina sorbová, thimerosal, apod. V mnoha případech bude výhodné přidat isotonické prostředky, např. ’ cukry nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injekčních prostředků může být získána použitím směsí nebo činidel zpožďujících absorpci, jako je například monostearan hlinitý a želatina.

V jednom provedení pro parenterální ve formě vodného roztoku by měl být roztok v případě potřeby vhodně pufrován a kapalné ředivo by mělo být nejprve přivedeno do isotonického stavu přidáním dostatečného množství fyziologického roztoku nebo glukózy. Tyto vodné roztoky jsou zvláště vhodné pro intravenózní, intramuskulární, subkutánní a intraperitoneální podávání. V této souvislosti bude odborníkovi v oboru na základě předkládaného popisu zřejmé, jaké sterilní vodné rozpouštědlo má být použito. Například jedna dávka může být rozpuštěna v 1 ml isotonického roztoku NaCl a buď přidána k 1000 ml kapaliny pro podkožní ifuze nebo vstříknuta na navrženém místě infuze (viz např. „Remingtoďs Pharmaceutical Sciences“, 15. vyd., str. 1035 - 1038 a 1570 - 1580). Některé variace v dávkování budou nezbytné na základě stavu léčeného pacienta. Pro podávání člověku budou prostředky samozřejmě splňovat standardy na sterilitu, pyrogenicitu, obecnou bezpečnost a čistotu, jak je například požadováno organizací FDA Office of Biologics standards.

V dalším provedení vynálezu mohou být popisované prostředky formulovány v neutrální formě nebo ve formě soli. Jako příklady farmaceuticky přijatelných solí je možno uvést například adiční soli s kyselinami (vytvořené s volnými aminovými skupinami proteinu), které jsou vytvořeny s anorganickými kyselinami jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo organickými kyselinami jako je kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová apod. Soli vytvořené s volnými karboxylovými skupinami mohou být odvozeny od anorganických bází, jako jsou například hydroxidy sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý, a organických bází jako isopropylamin, trimethylamin, histidin, prokain apod. Po přípravě budou roztoky podávány způsobem kompatibilním s druhem dávkové formy a v množství, které je terapeuticky účinné.

Nosiče mohou dále zahrnovat kterákoli rozpouštědla, disperzní média, vehikula, povlaky, řediva, antibakteriální a antifungální prostředky, látky upravující isotonický stav a látky zpožďující absorpci, pufry, nosné roztoky, suspenze, koloidy apod. Použití těchto médií a prostředků pro farmaceuticky účinné látky je v oboru dobře známé. V léčebných prostředcích může být použito jakékoli běžné médium nebo prostředek, pokud není nekompatibilní s účinnou složkou. Do prostředků mohou být také přidány další účinné látky. Výraz „farmaceuticky přijatelný“ se týká molekul a směsí, které nevytvářejí alergickou nebo podobnou nežádoucí reakci při podání člověku.

V některých provedeních mohou být farmaceutické prostředky dodány ve formě intranazálních sprejů, inhalací a/nebo jiných vehikul pro aerosolové podávání. Způsoby dodávání genů, nukleových kyselin a peptidových prostředků přímo do plic pomocí nosních aerosolových sprejů byly popsány například v US patentu 5,756,353 a US patentu 5,804,212. Podobně dodávání léčiv s použitím intranazálních pryskyřičných mikročástic (Takenaga a další, J. Controlled Release 1998, 2. března; 52 (1 - 2): 81 - 7) a lysofosfatidyl-glycerolových směsí (US patent 5,725,871) jsou rovněž dobře známé v oboru farmacie.

·· ··

-45 Podobně dodávání léčiv přes sliznice ve formě matrice na polytetrafluoretheylenovém nosiči se popisuje v US patentu 5,780,045.

V některých provedeních se pro zavádění prostředků podle předkládaného vynálezu do vhodných hostitelských buněk/organismů používají liposomy, nanokapsle, mikročástice, lipidové částice, měchýřky apod. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány zvláště pro dodávání buď zapouzdřené v lipidické částici, liposomu, měchýřku, nanosféře nebo nanočástici, nebo v jiné formě. Alternativně mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu io navázány kovalentně nebo nekovalentně na povrch těchto nosných vehikul.

Tvorba a použití liposomových a liposomům podobných preparátů jako možných nosičů léčiv je odborníkům v oboru obecně známá (viz např. Lasic, Trends Biotechnol. 1998 červenec; 16(7): 307

- 21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 březen; 56 (3): 691 - 5; Chandran a další, Indián J. Exp. Biol. 1997 srpen; 35 (8): 801 - 9; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1995; 12 (2-3): 233 - 61; US patent 5,567,434; US patent 5,552,157; US patent 5,565,213; US patent 5,738,868 a US patent 5,795,587, kde každý z těchto dokumentů se zařazuje ve svém celku odkazem.

Liposomy se úspěšně používaly s řadou typů buněk, které jsou obtížně transfekovatelné jinými postupy, včetně suspenzí T-buněk, primárních hepatocytových kultur a buněk PC 12 (Renneisen a další, J. Biol. Chem. 1990 září 25; 265 (27): 16337 - 42; Muller a další, DNA

Cell Biol. 1990 duben; 9 (3): 221 - 9). Navíc se v případě liposomů nevyskytují omezení v souvislosti s délkou DNA, která jsou typická pro dodávací systémy založené na virech. Liposomy se úspěšně používaly pro zavádění genů, různých léčiv, radioterapeutických prostředků, enzymů, virů, transkripčních faktorů, alosterických efektorů apod., do řady kultivovaných buněčných linií a živočichů. Navíc se zdá, že použití liposomů není spojeno s autoimunitními reakcemi nebo

- 46 nepřijatelnou toxicitou po systémovém podání. V některých provedeních jsou liposomy vytvořeny z fosfolipidů, které jsou dispergovány ve vodném médiu a spontánně tvoří multilamelární soustředné dvojvrstevné váčky (nazývané také multilamelární váčky nebo vezikula, MLV).

V dalších provedeních poskytuje vynález alternativně farmaceuticky přijatelné formulace prostředků podle předkládaného vynálezu ve formě nanokapslí. Nanokapsle mohou obecně stabilním a reprodukovatelným způsobem zachytit sloučeniny (viz např.

Quintanar-Guerrero a další, Drug Dev. Ind. Pharm. 1998, prosinec; 24(12): 1113 - 28). Aby bylo zabráněno nežádoucím účinkům intracelulárního přesycení polymerem, mohou být tyto ultrajemné částice (o velikosti okolo 0,1 pm) navrženy s použitím polymerů schopných degradace in vivo. Tyto částice mohou být vyráběny například jak se popisuje v Couvreur a další, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1988; 5 (1): 1 - 20; Muhlen a další, Eur. J. Pharm. Biopharm. 1998, březen; 45 (2): 149 - 55; Zambaux a další, J. Controlled Release. 1998, 2. ledna; 50 (1-3): 31 - 40; a US patent 5,145,684.

Vynález se také týká použití polynukleotidů ve formě primerů odvozených od polynukleotidů podle předkládaného vynálezu, a polypeptidů ve formě protilátek nebo činidel specifických pro polypeptid podle předkládaného vynálezu, jako diagnostických činidel.

Identifikace genetických nebo biochemických markérů v krvi nebo tkáních, která umožní detekci velmi časných změn v biochemických reakcích spojených s karcinogenezí, bude pomáhat při zjištění nejlepšího způsobu léčení pacienta. Pro diagnózu různých forem a stavů rakoviny mohou být použity náhražkové tumorové markéry, jako je exprese polynukleotidů. Identifikace míry exprese polynukleotidů podle vynálezu bude použitelná jak při určení stadia rakovinného onemocnění (staging), tak i pro určení povahy rakovinné

·♦ ·· • · · · · · · • 9 · 4 · • · · · · · · • · · · Φ · • ··· «·· ·· ···· tkáně z hlediska zhoubnosti (grading). Určení stadia onemocnění monitoruje vývoj onemocnění a určuje přítomnost nebo nepřítomnost maligní tkáně v oblastech vyšetřovaných biopsií. Polynukleotidy podle vynálezu mohou napomáhat přesnému určení stadia identifikací markérů pro agresivitu rakoviny, například přítomnost v různých částech těla. Zjištění povahy rakoviny z hlediska zhoubnosti popisuje, jak blízce napodobuje tumor normální tkáň stejného typu, a zjišťuje se na základě morfologie buněk a jiných markérů diferenciace. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být použitelné při zjišťování io povahy tumoru z hlediska zhoubnosti, protože mohou napomáhat při zjišťování diferenciace buněk tumoru.

Diagnostické testy poskytují způsob pro diagnózu nebo zjištění vnímavosti k rakovině, autoimunitnímu onemocnění a souvisejícím , stavům prostřednictvím diagnózy metodami zahrnujícími zjištění 15 abnormálního poklesu nebo zvýšení množství polypeptidů nebo mRNA ve vzorku odvozeném od pacienta. Tento způsob diagnózy je znám jako diferenciální exprese. Exprese určitého genu se porovnává mezi nemocnou tkání a normální tkání. Rozdíl mezi genem souvisejícím s polynukleotidem, mRNA nebo proteinem v těchto dvou tkáních se porovná například na základě molekulové hmotnosti, aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence nebo relativního nadbytku, což ukazuje na změnu tohoto genu nebo jej regulujícího genu ve tkáni člověka, u něhož existuje podezření na onemocnění.

Snížená nebo zvýšená exprese může být měřena jako hladina

RNA. Ze dvou tkání se nejprve izoluje polyA RNA a detekce mRNA kódované genem odpovídajícím odlišně exprimovanému polynukleotidu podle vynálezu může být provedena například hybridizací tkáňových řezů in šitu, PGR s reverzní transkriptázou, Northernovým přenosem s použitím póly A + mRNA nebo jakýmkoli jiným přímým nebo nepřímým způsobem detekce RNA. Zvýšená nebo snížená exprese určité RNA v postižené tkáni ve srovnání s normální tkání ukazuje, že transkript a/nebo exprimovaný protein hraje při

- 48 onemocnění nějakou úlohu. Detekce vyšší nebo nižší hladiny mRNA odpovídající SEQ ID No: 1 proti normální hladině ukazuje na přítomnost rakoviny u pacienta.

Míra exprese mRNA ve vzorku může být zjištěna vytvořením knihovny sekvencí s expresní adresou (EST) ze vzorku. Relativní zastoupení EST v knihovně je možno použít pro zjištění relativního zastoupení genového transkriptu ve výchozím vzorku. Analýza EST může být potom porovnána s analýzou EST referenčního vzorku, aby bylo možno zjistit relativní míry exprese sledovaného polynukleotidu.

io Jiné analýzy mRNA mohou být prováděny použitím metody sériové analýzy genové exprese (SAGE) (Velculescu a další, Science (1995) 270: 484), metodou differential display (např. US 5,776,683) nebo hybridizační analýzou založenou na specificitě nukleotidových interakcí.

Porovnávání může být alternativně prováděno na úrovni proteinů. Velikosti proteinů ve dvou tkáních mohou být porovnávány použitím protilátek pro detekci polypeptidů ve westernových přenosech proteinových extraktů z těchto dvou tkání. Hladiny exprese a subcelulární lokalizace mohou být také detekovány imunologicky s použitím protilátek proti odpovídajícímu proteinu. Další testovací techniky, které mohou být použity pro určení hladin proteinu jako je například polypeptid podle předkládaného vynálezu ve vzorku odvozeném od hostitele, jsou odborníkům v oboru dobře známé. Zvýšená nebo snížená hladina exprese polypeptidu v nemocné tkáni ve srovnání s hladinou exprese stejného proteinu v normální tkáni ukazuje, že exprimovaný protein se může účastnit průběhu onemocnění.

Při testech podle předkládaného vynálezu může být diagnóza určena detekcí hladin exprese genového produktu kódovaného alespoň jednou sekvencí uvedenou v SEQ ID No: 1. Porovnání hladin mRNA nebo proteinu v nemocné tkáni proti normální tkáni může být také použito pro sledování postupu nebo zmírnění onemocnění.

Velký počet polynukleotidových sekvencí ve vzorku může být testován použitím polynukleotidových souborů. Ty mohou být použity pro zjištění odlišné exprese genů a pro zjištění funkce genu. Například soubory polynukleotidových sekvencí SEQ ID No: 1 mohou být použity pro zjištění, zda dochází k odlišné expresi některých polynukleotidů v normální a v rakovinné buňce. V jednom provedení vynálezu může být zkonstruován soubor oligonukleotidových sond obsahujících nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 1 nebo její fragmenty pro provedení účinného screeningu např. genetických mutací. Metody využívající soubory jsou velmi dobře známé, mají obecnou použitelnost a mohou být použity pro řešení řady otázek v oboru molekulární genetiky včetně genové exprese, propojení genů a genetické variability (viz např M. Chee a další, Science, díl 274, str. 610 - 613 (1996)).

„Diagnóza“, jak se zde používá, zahrnuje zjištění vnímavosti pacienta na onemocnění, zjištění, zda pacient v současnosti trpí onemocněním a také prognózy pacienta postiženého onemocněním.

Předkládaný vynález se dále týká diagnostického kitu pro provádění diagnostického testu, který obsahuje:

(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s výhodou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 1, nebo její fragment;

(b) nukleotidovou sekvenci komplementární se sekvencí podle (a), s výhodou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 6;

(c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, s výhodou polypeptid se SEQ ID No: 2 nebo 3, nebo jeho fragment; nebo (d) protilátku proti polypeptidů podle předkládaného vynálezu, s výhodou proti polypeptidů se SEQ ID No: 2 nebo 3.

•	•				99
9	•	•	9	9 9	9
• 9 · 9	• 9« 9	• .9 9 9	9 • 9»	t 9 99	9 9 9 9 9

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu mají také význam pro lokalizaci chromosomu. Sekvence je specificky zaměřena na určité umístění jednotlivého lidského chromosomu, se kterým může hybridizovat. Mapování příslušných sekvencí na chromosomy podle předkládaného vynálezu je důležitým prvním krokem při zjištění korelace těchto sekvencí s genovými onemocněními. Jakmile byla sekvence mapována do přesného místa chromosomu, může být porovnáno fyzické umístění sekvence na chromosomu s údaji genetické mapy. Tyto údaje se nalézají například v databázi

V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostupná on line prostřednictvím Johns Hopkins University Welch Medical Library). Vztah mezi geny a onemocněními, která byla mapována do stejné oblasti chromosomu, se potom identifikuje prostřednictvím analýzy vazeb (přítomnost fyzicky sousedících genů). Mohou být také zjištěny rozdíly v cDNA nebo genomové sekvenci mezi postiženými a nepostiženými jedinci.

Polypeptidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty nebo analogy, nebo buňky, které je exprimují, mohou být také použity jako imunogeny pro produkci protilátek imunospecifických pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu. Termín „imunospecifický“ znamená, že protilátky mají podstatně vyšší afinitu k polypeptidům podle vynálezu, než k jiným příbužným polypeptidům podle stavu techniky.

V dalším provedení poskytuje vynález protilátku imunologicky specifickou pro polypeptid podle vynálezu, nebo její imunologický fragment, jak bylo definováno výše. Protilátkou je s výhodou monoklonální protilátka.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům podle předkládaného vynálezu mohou být získány podáváním polypeptidů nebo fragmentů nesoucích epitopy, analogů nebo buněk živočichovi, s výhodou živočichovi odlišnému od člověka, s použitím rutinních protokolů. Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoli • 0

- 51 0 · • * • · • · 0 0 0 0 · • V0 ··· ·*?« 0·0 ·· ·0«0 technologie, která poskytne protilátky vytvořené kontinuálními kulturami buněčných linií. Mezi příklady patří hybridomové technologie (Kohler, G. a Milstein, C., Nátuře (1975) 256: 495 - 497), triomová technologie, technologie hybridomů lidských B-buněk (Kozbor a další,

Immunology Today (1983) 4: 72) a technologie EBV-hybridomů (Cole a další, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77 - 96, Alan R. Liss, lne., 1985).

Způsoby produkce jednořetězcových protilátek, jako jsou postupy popisované v US patentu No. 4,946,778, mohou být také io upraveny pro poskytnutí jednořetězcových protilátek proti polypeptidům podle předkládaného vynálezu. Pro expresi humanizovaných protilátek mohou být také použity transgenní myši nebo jiné organismy, včetně jiných savců.

Výše popisované protilátky mohou být použity pro izolaci nebo 15 identifikaci klonů exprimujících polypeptid nebo pro čištění polypeptidů afinitní chromatografii. Protilátka podle vynálezu může být také použita pro prevenci nebo léčení rakoviny, zvláště kolorektální rakoviny, autoimunitnich onemocnění a souvisejících stavů.

Další provedení vynálezu se týká způsobu indukce nebo 20 modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje zaočkování savce polypeptidem podle předkládaného vynálezu, vhodným pro produkci protilátky, a/nebo vyvolání T-buněčné odpovědi, pro ochranu nebo pro zmírnění příznaků nebo zastavení postupu onemocnění. Ještě další provedení vynálezu se týká způsobu indukce nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje dodání polypeptidu podle předkládaného vynálezu pomocí exprese polynukleotidu kódujícího polypeptid prostřednictvím vektoru in vivo s cílem indukovat takovou imunologickou odpověď, která poskytne protilátku pro ochranu uvedeného živočicha před onemocněním.

Bude zřejmé, že předkládaný vynález poskytuje způsob léčení abnormálních stavů, jako je například rakovina a autoimunitní

onemocnění, zvláště kolorektální rakovina, souvisejících buď s přítomností nebo nadměrným množstvím nebo nesprávnou expresí polypeptidu CASB7439 nebo jeho aktivity. Další abnormální stavy týkající se exprese CASB7439, jejichž léčba je cílem vynálezu, se týkají chronické lymfocytické leukemie a tumorů zárodečných buněk.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob screeningu sloučenin pro identifikaci látek, které stimulují nebo inhibují funkci polypeptidu CASB7439. Obecně mohou být pro léčebné účely v souvislosti s těmito onemocněními uvedenými výše látky s agonistickým nebo antagonistickým účinkem. Sloučeniny mohou být identifikovány z řady zdrojů, například buněk, bezbuněčných preparátů, chemických knihoven a směsí přírodních produktů. Takto identifikované látky s agonistickým, antagonistickým nebo inhibičním účinkem mohou být přírodní nebo modifikované substráty, ligandy, receptory, enzymy atd. uvedeného polypeptidu; nebo může jít o látky napodobující jeho strukturu nebo funkci (viz Coligan a další, Current Protocols in Immunology 1 (2): kapitola 5 (1991)). Metody screeningu budou odborníkovi v oboru známé. Další metody screeningu je možno nalézt například v článku D. Bennett a další, J. Mol. Recognition, 8: 52 - 58 (1995); a K. Johanson a další, J. Biol. Chem., 270 (16): 9459 9471 (1995) a tam uvedených odkazech.

Vynález tedy poskytuje způsob screeningu pro identifikaci sloučenin, které stimulují nebo které inhibují funkci polypeptidu podle vynálezu, který zahrnuje způsob zvolený ze skupiny:

(a) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid, nebo jejího fúzního proteinu pomocí značky, která je přímo nebo nepřímo asociována s testovanou sloučeninou;

(b) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid), nebo jejího fúzního proteinu v přítomnosti značené látky schopné kompetitivní interakce;

(c) testování, zda sloučenina poskytne signál vytvořený aktivací nebo inhibicí polypeptidu s použitím detekčních systémů vhodných pro buňky nebo buněčné membrány nesoucí polypeptid;

(d) smísení testované sloučeniny s roztokem obsahujícím polypeptid podle nároku 1 za vytvoření směsi, měření aktivity tohoto polypeptidu ve směsi a porovnání aktivity směsi se standardem; nebo (e) detekce účinku testované sloučeniny na produkci mRNA kódující uvedený polypeptid a produkci polypeptidu v buňkách s použitím například testu ELISA.

Polypeptid podle vynálezu může být použit pro identifikaci receptorů navázaných na membránu nebo rozpustných receptorů, pokud jsou přítomny, standardními technikami vazby receptorů známými v oboru. Známé metody screeningu mohou být také použity pro identifikaci látek s agonistickými a antagonistickými účinky na polypeptid podle vynálezu, které soutěží o vazbu polypeptidu podle vynálezu na jeho receptory, pokud jsou přítomny.

V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká screeningového kitu pro identifikaci agonistů, antagonistů, ligandů, receptorů, substrátů, enzymů atd. polypeptidů podle předkládaného vynálezu; nebo sloučenin, které snižují nebo zvyšují produkci těchto polypeptidů, který obsahuje:

(a) polypeptid podle předkládaného vynálezu;

(b) rekombinantní buňku exprimující polypeptid podle předkládaného vynálezu;

(c) buněčnou membránu exprimující polypeptid podle předkládaného vynálezu; nebo (d) protilátku proti polypeptidu podle předkládaného vynálezu;

kde polypeptidem je s výhodou polypeptid se SEQ ID No: 2 nebo 3.

- 54 Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že polypeptid podle předkládaného vynálezu může být také použit při způsobu návrhu agonisty, antagonisty nebo inhibitoru polypeptidu na základě struktury, přičemž se používá následujících kroků:

(a) Nejprve zjištění trojrozměrné struktury polypeptidu;

(b) odvození trojrozměrné struktury pro pravděpodobná reaktivní nebo vazebná místa agonisty, antagonisty nebo inhibitoru;

(c) syntézu vhodných sloučenin, o kterých se předpokládá, že se vážou na nebo reagují s odvozeným vazebným nebo reaktivním místem; a (d) testování, zda jsou sledované sloučeniny skutečně agonisté, antagonisté nebo inhibitory.

Genová terapie může být také použita pro uskutečnění endogenní produkce polypeptidu CASB7439 v příslušných buňkách jedince. Přehled týkající se genové terapie lze nalézt v kapitole 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (a tam uvedených odkazech), v publikaci Human Molecular Genetics, T. Strachan a A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996).

Příprava vakcin se obecně popisuje v publikaci Pharmaceutical

Biotechnology, díl 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, edited by Powell a Newman, Plenům Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomů se popisuje např. v patentu Fullerton, US patent 4,235,877. Konjugace proteinů k makromolekulám se popisuje např. v Likhite, US patent 4,372,945 a Armor a další, US patent 4,474,757.

Množství proteinu v každé dávce vakciny se volí jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď v typických vakcinách bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude

lišit v závislosti na konkrétním použitém imunogenu. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 2 až 100 pg, nejvýhodněji 4 až 40 pg. Optimální množství pro určitou vakcinu je možno zjistit na základě standardních studií zahrnujících sledování titrů protilátek a jiných reakcí pacienta. Po počáteční vakcinaci mohou pacienti dostat zesilovací dávku po přibližně čtyřech týdnech.

Termín „izolovaný“ znamená změněný „zásahem člověka“ ve srovnání s přírodním stavem. Jestliže se „izolovaná“ směs nebo látka io vyskytuje v přírodě, musí být změněna a/nebo vyjmuta z původního prostředí. Například polynukleotid nebo polypeptid přirozeně přítomný v živém zvířeti není „izolovaný“, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený od okolních materiálů přítomných v místě jeho přirozeného výskytu je „izolovaný“ v používaném smyslu tohoto termínu.

Termín polynukleotid obecně označuje jakýkoli polyribonukleotid nebo polydeoxribonukleotid, kterým může být nemodifikovaná RNA nebo DNA nebo modifikovaná RNA nebo DNA, včetně jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí.

Termín „varianta“ se týká polynukleotidu nebo polypeptidu, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si podstatné vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu se od jiného, referenčního polynukleotidu liší nukleotidovou sekvencí. Změny nukleotidové sekvence varianty mohou nebo nemusí změnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím a delecím aminokselin a zkrácením a fúzím v polypeptidu kódovaném referenční sekvencí, jak bude diskutováno dále. Typická varianta polypeptidu se odlišuje od jiného, referenčního polypeptidu

3o aminokyselinovou sekvencí. Obecně jsou rozdíly limitované, takže sekvence referenčního polypeptidu a varianty jsou celkově blízce

- 56 ·· ·· příbuzné, a v mnoha oblastech identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci o jednu nebo více substitucí, adicí a delecí v jakékoli kombinaci. Substituované nebo vložené aminokyselinové zbytky mohou nebo nemusí být zbytky kódované genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidu se může vyskytovat v přírodě, jako například alelická varianta, nebo se v přírodě vyskytovat nemusí. Varianty polynukleotidů a polypeptidů, které se v přírodě nevyskytují, se mohou připravit technikami mutageneze nebo přímé syntézy.

„Identita“ ve smyslu známém v oboru je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi zjištěný porovnáním sekvencí. Termín „identita“ také v oboru znamená stupeň příbuznosti sekvence mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi, zjištěný porovnáním řetězců těchto sekvencí. „Identita“ a „podobnost“ může být snadno vypočítána známými způsoby, včetně bez omezení způsobů popisovaných v Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academie Press, New York,

1993; Computer Analysis of Sequence Data, část I, Griffin, A. M., a

Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. a Devereux, J., ed., M. Stockton Press, New York, 1991; a Carillo, H., a Lipman, D., SIAM J.

Applied Math., 48: 1073 (1988). Výhodné způsoby pro zjištění identity jsou navrženy tak, aby poskytly nejvyšší souhlas mezi testovanými sekvencemi. Způsoby zjištění identity a podobnosti jsou stanoveny ve veřejně dostupných počítačových programech. Výhodné počítačové metody pro zjištění identity a podobnosti mezi dvěma sekvencemi

3o zahrnují bez omezení programový balík GCG (Devereux, J., a další, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, a FASTA (Atschul, S. F. a další, J. Molec. Biol. 215: 403 - 410 (1990).

- 57 Program BLAST X je veřejně dostupný v organizaci NCBI a u jiných zdrojů (BLAST Manual, Altschul, S., a další NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., a další, J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Pro zjištění identity může být také použit známý Smith-Waterman algoritmus.

Výhodný použitý algoritmus je FASTA. Výhodné parametry pro porovnání polypeptidové nebo polynukleotidové sekvence s použitím tohoto algoritmu jsou následující:

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 12 io Trestné body za prodloužení mezery (Gap Extension Penalty): 4

Velikost slova: 2, max 6

Výhodné parametry pro porovnání polypeptidové sekvence s jinými metodami jsou následující:

1) Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 (1970)

Srovnávací matrice: BLOSSUM 62 podle Hentikoff a Hentikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10915 - 10919 (1992)

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 12 Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 4

Program je dostupný jako program gap u firmy Genetics

Computer Group, Madison Wl. Uvedené parametry jsou nastavené jako výchozí pro porovnávání polypeptidů (také bez trestných bodů za koncové mezery).

Výhodné parametry pro porovnání polynukleotidové sekvence jsou následující:

1) Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 (1970)

Srovnávací matrice: souhlas = +10, nesouhlas = 0

- 58 • ·

Trestné body za mezeru (Gap Penalty): 50

Trestné body za délku mezery (Gap Length Penalty): 3

Program je dostupný jako program gap u firmy Genetics Computer Group, Madison WI. Uvedené parametry jsou nastavené jako výchozí pro porovnávání polynukleotidů.

Uvedená polynukleotidová sekvence může být například identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 1 , tj 100% identická, nebo může obsahovat při porovnání s referenční sekvencí až do určitého celočíselného počtu nukleotidových změn, přičemž tyto změny jsou io zvoleny ze skupiny alespoň jedné delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce nukleotidů, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v 5’ nebo 3’ koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo v kterémkoli místě mezi těmito koncovými polohami, rozprostřeny buď individuálně mezi nukleotidy v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více souvislých skupinách v rámci referenční sekvence. Počet nukleotidových změn je určen vynásobením celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1, neboli:

n_n < Xn - (Xn · y), kde n_n je počet nukleotidových změn, x_n je celkový počet nukleotidů v SEQ ID No. 1, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 %, atd., kde jakýkoli neceločíselný výsledek pro x_n a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_n. Změny polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID No. 2 mohou v této kódující sekvenci vytvořit mutace typu nonsense, missense nebo frameshift a tím změnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po těchto změnách.

Polypeptidová sekvence podle vynálezu může být podobně identická s referenční polypeptidovou sekvencí SEQ ID No. 2, tj. může

	• • · •	• ·	• • · •	·· ·· * Φ * • ·
• ·	• • · ·	• · ·	• • · ·	• · · • · · · ·

být 100% identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí, takže identita je nižší než 100 %. Uvedené změny jsou zvoleny ze skupin alespoň jedné delece, substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerce aminokyselin, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v amino- nebo karboxykoncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozptýlené buď jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci nebo ve formě jedné nebo více souvislých skupin v rámci referenční sekvence. Uvedený počet aminokyselinových změn se určí vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2 celým číslem definujícím procento identity vyděleným 100 a potom odečtením výsledku od celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2, neboli:

n_a < x_a - (Xa · y).

kde n_a je počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No. 2, y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, atd., a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před jeho odečtením od x_a.

„Homolog“ je obecný termín, který se v oboru použitá pro označení polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence s vysokým stupněm sekvenční příbuznosti ke sledované sekvenci. Tato příbuznost může být kvantifikována stanovením stupně identity a/nebo podobnosti mezi porovnávanými sekvencemi, jak bylo popsáno výše. Do tohoto obecného termínu spadají termíny „ortholog“, což je polynukleotid nebo polypeptid, který je funkčním ekvivalentem polynukleotidů nebo polypeptidu v jiném druhu, a „paralog“, což je funkčně podobná sekvence uvažovaná v rámci stejného druhu.

- 60 Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje údaje z PCR v reálném čase s použitím sondy Taqman. Legenda je následující: Ad_GI: nadledvina; BI: měchýř; Bo__Ma: kostní dřeň; Ce: čípek; Co: tlusté střevo; Fa_Tu: vejcovod; II: ileum; Sk: kůže;

Li: játra; Lu: plíce; Ly_No: lymfatická uzlina; Oe: jícen; Pa_Thy: příštítná žláza; Pl: placenta; Pr: prostata; Re: rektum; Sk: kůže; Sk_Mu: kosterní sval; Sm_ln: tenké střevo; Sp: slezina; Te: testis; Thy: štítná žláza; Tr: trachea.

Obr. 2 ukazuje expresi PCR v reálném čase použitím protokolu Sybr. io Legenda je následující: Ad_GI: nadledvina; BI: měchýř; Bo_Ma: kostní dřeň; Ce: čípek; Co: tlusté střevo; Fa_Tu: vejcovod; II: ileum; Sk: kůže;

Li: játra; Lu: plíce; Ly_No: lymfatická uzlina; Oe: jícen; Pa_Thy: příštítná žláza; Pl: placenta; Pr: prostata; Re: rektum; Sk: kůže; Sk_Mu: kosterní sval; Sm_ln: tenké střevo; Sp: slezina; Te: testis;

Thy: štítná žláza; Tr: trachea; He: srdce.

Obr. 3 ukazuje SDS-PAGE buněčného extraktu z kmene exprimujícího CASB7439 s použitím barvení Coomassie blue. Dráha 1 ukazuje markéry molekulové hmotnosti, dráha 2 je buněčný extrakt indukovaný 5 hod při 39 °C, dráha 3 ukazuje supernatant extraktu indukovaných buněk, a dráha 4 ukazuje centrifugát extraktu indukovaných buněk.

Obr. 4 ukazuje analýzu westernovým přenosem exprimovaného proteinu NS1-CASB7439. Na gel je nanesen buněčný extrakt z kmene exprimujícího CASB7439 aa vyvíjení se provádí monoklonální protilátkou proti NS1.

Obr, 5 ukazuje SDS-PAGE proteinu CASB7439 po vyčištění s použitím barvení Coomassie blue. Dráhy 1 a 5 jsou markéry molekulové hmotnosti; dráhy 2, 3, 4 obsahují 2 pl, 4 pl a 6 μΙ vyčištěného proteinu.

, ·· ·· • · · • « *

Obr. 6 ukazuje analýzu westernovým přenosem proteinu CASB7439 po vyčištění s vyvoláním monoklonální protilátkou proti polyhistidinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Analýza RT-PCR v reálném čase

Analýza RT-PCR v reálném čase (U. Gibson, 1996, Genome Research: 6, 996) se používá pro porovnání množství transkriptu mRNA testovaného antigenu v odpovídajících tumorových a normálních tkáních tlustého střeva od většího počtu pacientů. Navíc je možno tímto způsobem vyhodnotit hladiny mRNA testovaného genu v souboru normálních tkání.

Celková RNA z normální tkáně a tumorové tkáně tlustého střeva se extrahuje z rychle zmrazených biopsií s použitím činidla TriPure (Boehringer). Celková RNA z normálních tkání může být získána od firmy InVitrogen nebo se extrahuje z rychle zmrazených biopsií použitím činidla TriPure. Poly-A+ mRNA se vyčistí z celkové RNA po štěpení DNAázou s použitím oligo-dT magnetických kuliček (Dynal). Kvantifikace mRNA se provede spektrofluorimetricky (VersaFluor, BioRad) s použitím barviva Sybrll (Molecular Probes). Primery pro amplifikaci PCR v reálném čase jsou navrhovány pomocí softwaru Perkin-Elmer Primer Express s použitím přednastavených podmínek pro podmínky amplifikace TaqMan.

Reakce v reálném čase se provádějí podle standardních protokolů PCR s použitím 2 ng čištěné mRNA pro každou reakci. Pro detekci v reálném čase se přidá barvivo Sybrl (Molecular Probes) s konečným ředěním 1/75000. Amplifikace (40 cyklů) a detekce v reálném čase se provádí na systému Perkin-Elmer Biosystems PE7700 s obvyklým nastavením přístroje. Hodnoty Ct se vypočtou s použitím softwaru PE7700 Sequence Detector software. Pro každý

- 62 vzorek pacienta se získá několik hodnot Ct: pro vzorek pacienta se získají hodnoty tumoru Ct(CtT) a odpovídající hodnoty normálního tlustého střeva Ct(CtN) pro sledovaný TAA, a pro skupinu vzorků normální tkáně se získá CtXY pro každou normální tkáň XY. Další hodnota Ct(CtA) se vypočte pro všechny vzorky také pro aktinový gen jako vnitřní standard. Alternativně je možno monitorovat amplifikaci PCR v reálném čase použitím sondy Taqman. Amplifikace (40 cyklů) se provádí na systému Perkin-Elmer Biosystems PE7700 s obvyklým nastavením přístroje. Hodnoty Ct se vypočtou s použitím softwaru ίο PE7700 Sequence Detector software. Z každé tkáně se získají hodnoty Ct pro cílovou mRNA (CtX) a pro aktinovou mRNA (CtA).

Protože účinnost amplifikace PCR za převládajících podmínek experimentu je blízká teoretické účinnosti amplifikace, 2^(CtN/XY'^CíA) je odhadem relativních hladin transkriptu TAA ve vzorku standardizovaných na hladinu aktinového transkriptu. Hodnota 1 tedy udává, že sledovaný antigen a aktin mají stejnou hladinu exprese.

Reakce PCR v reálném čase byly nejprve prováděny na tumoru tlustého střeva a odpovídajícím normálním tlustém střevu ze vzorků 12 pacientů získaných biopsií. Reakce byly potom prováděny na úplnějším souboru dat pro celkem 18 pacientů (v tomto souboru jsou zahrnuta data prvních 12 pacientů). V tomto souboru dat byla provedena duplikovaná stanovení pro 6 z těchto 18 pacientů. Bylo testováno šest dalších pacientů a výsledky byly přidány k původním osmnácti. Statistiky konečného souboru jsou ukázány v tabulce 3, a ilustrovány na obr. 1.

Stejným postupem byla také testována řada 48 vzorků normálních tkání reprezentujících 29 odlišných tkání (analyzované normální tkáně jsou uvedeny v tabulce 3). Hladiny transkriptu TAA jsou vypočteny postupem popsaným výše. Z tohoto souboru dat byl také vypočten podíl pacientů s nadměrnou expresí sledovaného

- 63 »· ···· antigenů stejně jako průměrná nadměrná exprese transkriptu ve srovnání s normálními tkáněmi. Výsledky jsou ilustrovány v obr. 1.

Tabulka 1

Výsledky testu exprese PCR v reálném čase pro CASB7439: soubor údajů pro 12 pacientů

% pacientů s vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva (pozitivní pacienti)	92 %
% pacientů s alespoň trojnásobně vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	92 %
% pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	92 %
% pacientů s alespoň trojnásobně nižší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	8 %
průměrná hladina mRNA odpovídajícího normálního tlustého střeva (vztaženo na aktin)	0,0026
průměrná hladina mRNA odpovídajícího tumoru tlustého střeva u pozitivních pacientů (vztaženo na aktin)	0,265
průměrný násobek nadměrné exprese mRNA	' 2028
medián násobku nadměrné exprese mRNA	115
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,0079
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0016
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,0064
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0017
% pacientů s hladinou mRNA vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	92 %
% pacientů s hladinou mRNA více než desetinásobně vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	75 %
normální tkáně s vyšší hladinou mRNA než je medián hladiny mRNA pro normální tkáně	žádné

Taulka 2

Výsledky testu exprese PCR v reálném čase pro CASB7439: soubor údajů pro 18 pacientů

% pacientů s vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva (pozitivní pacienti)	89 %
% pacientů s alespoň trojnásobně vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	89 %
% pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	⁷⁸ %
% pacientů s alespoň trojnásobně nižší hladinou mRNA v odpovídajícím tumoru tlustého střeva	5 %
průměrná hladina mRNA odpovídajícího normálního tlustého střeva (vztaženo na aktin)	0,005
průměrná hladina mRNA odpovídajícího tumoru tlustého střeva u pozitivních pacientů (vztaženo na aktin)	0,152
průměrný násobek nadměrné exprese mRNA	1100
medián násobku nadměrné exprese mRNA	60
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,0065
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0015
průměrná hladina mRNA v normálních tkáních	0,005
medián hladiny mRNA v normálních tkáních	0,0015
% pacientů s hladinou mRNA vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	94 %
% pacientů s hladinou mRNA více než desetinásobně vyšší než průměrná hladina v normálních tkáních	94 %
normální tkáně s vyšší hladinou mRNA než je medián hladiny mRNA pro normální tkáně	žádné

^r*^**í*v·· íí

Ϊ,.

·,

- 65 Tabulka 3

Výsledky testu exprese PCR v reálném čase pro CASB7439: soubor údajů pro 24 pacientů

% pacientů s hladinou transkriptu CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než sousední normální tkáni tlustého střeva (pozitivní pacienti)	92 %
% pozitivních pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou transkriptu CASB7439 v tumoru tlustého střeva než v okolní normální tkáni tlustého střeva	75 %
průměrný násobek nadměrné exprese transkriptu v tumorech pozitivních pacientů	1289
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	96 %
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 alespoň desetinásobně vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	62,5 % -
normální tkáně, ve kterých je exprese transkriptu CASB7439 stejná jako hladina tumorového transkriptu v tumorech	žádné

Reakce PCR v reálném čase byly také prováděny použitím protokolu Taqman (jak je popsáno výše) na tumoru tlustého střeva a sousední normální tkáni tlustého střeva na bioptických vzorcích šesti pacientů. Pro každý vzorek byla provedena třikrát opakovaná měření a pro další výpočty byl použit jejich průměr. Výsledky jsou uvedeny io v obr. 1. Navíc bylo stejným způsobem testováno také 36 vzorků normální tkáně reprezentujících 28 různých tkání (viz tabulka 5).

Výsledky jsou ukázány v obr. 2.

• ·

- 66 • · ·

Tabulka 4

Výsledky exprese CASB7439 PCR v reálném čase s použitím sondy

Taqman

Počet vzorků tumorů od různých pacientů	6
% pacientů s hladinou transkriptu CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než sousední normální tkáni tlustého střeva (pozitivní pacienti)	100 %
% pozitivních pacientů s alespoň desetinásobně vyšší hladinou transkriptu CASB7439 v tumoru tlustého střeva než v okolní normální tkáni tlustého střeva	83 %
průměrný násobek nadměrné exprese transkriptu v tumorech pozitivních pacientů	109.
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	100 %
% pacientů s hladinou transkripce CASB7439 alespoň desetinásobně vyšší v tumorové tkáni tlustého střeva než v průměrné normální tkáni	100 %
normální tkáně, ve kterých je exprese transkriptu CASB7439 stejná jako hladina tumorového transkriptu v tumorech	žádné

Tyto výsledky jasně ukazují, že transkript CASB7439 je nadměrně exprimován v kolorektálních tumorech ve srovnání se sousední normální tkání tlustého střeva a všemi výše uvedenými normálními tkáněmi. U více než 90 % pacientů dochází k silně zvýšené expresi transkriptu CASB7439 v tumoru v porovnání se sousední io normální tkání tlustého střeva. Průměrný násobek zvýšení exprese transkriptu CASB7439 v kolorektálních tumorech ve srovnání s jinými normálními tkáněmi je alespoň 100. Navíc více než 90 % pacientů má zvýšenou expresi transkriptu CASB7439 v kolorektálních tumorech v porovnání s jinými normálními tkáněmi, přičemž u 60 % z nich je zvýšení exprese alespoň desetinásobné.

• ·

- 67 ΐ·

Tabulka 5

Seznam normálních tkání použitých pro analýzu exprese transkriptu

CASB7439

Tkáň	Zkratka
Nadledvina	Ad_GI
Aorta	Ao
Močový měchýř	Bl
Kostní dřeň	Bo_Ma
Mozek	Bra
Čípek	Ce
Tlusté střevo	Co
Vejcovod	Fa_Tu
Srdce	He
lleum	II
Ledvina	Kj
Játra	Li
Plíce	Lu
Lymfatické uzlina	Ly_No
Jícen	Oe
Příštítná žláza	Pa_Thy
Rektum	Re
Kůže	Sk
Kosterní sval	Sk_Mu
Tenké střevo	Sm_ln
Slezina	Sp
Žaludek	St
Štítná žláza	Thy

- 68 • * ·· ·· * · · · τ» · · « · * · « « · 4 · 9 9

9 9 9 9

999 «4« ·« ··»·

Průdušnice	Tra
Vaječník	Ov
Placenta	Pl
Prostata	Pr
Varle	Te

Příklad 2

Testování souborů cDNA metodou diferenciálního screeningu

Identifikace genů asociovaných s tumory v knihovně cDNA se provádí metodou diferenciálního screeningu.

Ze 100 μΙ kultur pěstovaných přes noc se extrahuje celková bakteriální DNA. Bakterie se lyžují guanidiumisothiokyanátem a bakteriální DNA se čistí afinitní metodou s použitím magnetického skla (Boehringer). Plasmidové inzerty se izolují z. bakteriální DNA to amplifikační metodou Advantage PCR amplification (Clontech). Produkty PCR se natečkují na dvě nylonové membrány za vytvoření souborů cDNA s vysokou hustotou pomocí zařízení Biomek 96 HDRT tool (Beekman). Natečkovaná cDNA se ponechá kovalentně navázat na membránu působením UV záření. První membrána se hybridizuje se směsnou sondou cDNA připravenou z tumoru jediného pacienta. Druhá membrána se hybridizuje s ekvivalentním množstvím smíšené sondy cDNA připravené z normálního tlustého střeva stejného pacienta. Sonda cDNA se připraví amplifikací PCR jak bylo popsáno výše a označí se pomocí systému AlkPhos Direct System (Amersham).

Podmínky hybridizace a stringentní promytí se provádí s použitím AlkPhos Direct kit. Hybridizovaná sonda se detekuje chemiluminiscencí. Intenzity hybridizace pro každý fragment cDNA na obou přenosech se měří filmovou densitometrií nebo přímým měřením (BioRad Fluor-S Max). Poměr hybridizačních intenzit tumorové a normální tkáně (T/N) se vypočte pro každý gen pro zjištění stupně

- 69 • · ·· ···· zvýšení exprese v tumoru. Sledují se geny, které mají podstatně zvýšenou expresi v tumorech tlustého střeva. Signifikance je definována arbitrárně jako jedna standardní odchylka distribuce frekvence T/N. Experimenty metodou diferenciálního screeningu se opakují s použitím RNA z většího počtu pacientů (>18) pro odhadnutí četnosti tumorů se zvýšenou expresí v populaci pacientů. Soubory DNA se navíc hybridizují se smíšenými sondami cDNA z normálních tkání jiných než tlusté střevo (viz seznam výše) pro určení hladiny exprese sledovaného genu v těchto tkáních.

Příklad 3

Mikrosoubory DNA

Mikrosoubory DNA (DNA micro-arrays) se používají pro zjišťování profilů exprese mRNA ve velkých souborech genů ve velkém počtu vzorků. Tato informace se používá pro doplnění údajů získaných PCR v reálném čase a poskytuje nezávislé měřítko hladin genové exprese v tumorech a normálních tkáních.

Příklady běžných technologií pro produkci mikrosouborů DNA zahrnují 1) soubory Affymetrix „GeneChip“, ve kterých se oligonukleotidy syntetizují na povrchu čipu chemickou syntézou na pevné fázi použitím fotolitografického procesu, 2) technologii tečkování DNA, při které se pomocí robotu ukládají malé objemy roztoku DNA a potom se imobilizují na povrchu pevné fáze (například skla). V obou případech se čipy hybridizují s cDNA nebo cRNA, které byly extrahovány z tkáně, o kterou jde (například normální tkáň, tumor atd.) a značeny radioaktivně nebo pomocí fluorescenční reportérové molekuly. Značený materiál se hybridizuje k čipu a množství sondy navázané ke každé sekvenci na čipu se určí pomocí speciálního skeneru. Tento experiment může být konfigurován s jediným fluorescenčním reportérem (nebo radioaktivitou), nebo může být alternativně prováděn použitím dvou fluorescenčních reportérů.

• ·

V tomto druhém případě se každý ze dvou vzorků značí jednou z reportérových molekul. Dva označené vzorky se potom kompetitivně hybridizují k sekvencím na čipu DNA. Pro každou sekvenci na čipu se stanoví poměr fluorescenčních signálů. Poměr se použije pro výpočet relativního množství transkriptu ve dvou vzorcích. Podrobné protokoly jsou dostupné z řady zdrojů včetně „DNA Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1999“ a internetu (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) a specializovaných distributorů (např. Affymetrix).

Příklad 5

Analýzy northern-Southernovým přenosem

Omezená množství cDNA směsné tumorové tkáně a odpovídající normální tkáně tlustého střeva se amplifikují PCR Advantage (viz výše). Mediátorová RNA z většího počtu normálních ' tkání se rovněž amplifikuje použitím stejného postupu. Amplifikovaná cDNA (1 pg) se čistí elektroforézou na 1,2 % agarózovém gelu a převede se na nylonovou membránu. Tato membrána se hybridizuje (AlkPhos Direct System) se sondou připravenou použitím fragmentu testované TAA cDNA. Northern-Southernova analýza poskytne informace o velikosti transkriptu přítomnosti rozštěpených variant a zastoupení transkriptu v tumorové a normální tkáni.

Příklad 6

Analýza northernovým přenosem

Northernové přenosy se připravují podle standardních protokolů s použitím 1 pg póly A+ mRNA. Radioaktivní sondy se připravují s použitím systému Ready-to-Go (Pharmacia).

- 71 • · · · • · ·

Příklad 7

Experimentální identifikace úplné sekvence cDNA

Byly zkonstruovány knihovny cDNA tumoru tlustého střeva použitím systému Lambda Zap II systém (Stratagene) z 5 pg polyA+ mRNA. Použije se protokolu doporučeného výrobcem s tím rozdílem, že při kroku reverzní transkripce se použije Superscriptll (Life Technologies). Zkonstruují se knihovny s primery oligo dT a náhodnými primery. Pro každý screenin knihovny se vyseje přibližně io 1,5 x 10⁶ nezávislých fágů. Fágové plaky se převedou na nylonové filtry a hybridizují se s použitím sondy cDNA označené systémem AlkPhos Direct. Pozitivní fágy se detekují chemiluminiscencí. Pozitivní fágy se vyříznou z agarové plotny, eluují se v 500 pl SM pufru a přiřazení se potvrdí PCR pro specifický gen. Eluované fágy se převedou do jednořetězcového bakteriofága M13 vyříznutím in vivo. Bakteriofág se potom převede do dvojřetězcové plasmidové DNA infekcí E. coli. Infikované bakterie se vysejí a provede se druhé kolo screeningu s použitím sondy cDNA. Plasmidová DNA se vyčistí z pozitivních bakteriálních klonů a provede se sekvenace obou řetězců.

Jestliže se gen s úplnou délkou nemůže získat přímo z knihovny cDNA, chybějící sekvence se izoluje použitím technologie RACE (Marathon Kit, ClonTech.). Tento přístup se zakládá na reverzní transkripci mRNA do dvojřetězcové cDNA, navázáním linkerú na konce cDNA a amplifikaci požadovaného konce cDNA s použitím primerů specifického pro gen a jednoho z linkerových oligonukleotidů. Produkty získané metodou Marathon PCR se klonují do plasmidu (pCRII-TOPO, InVitrogen) a sekvenují.

Použitím tohoto postupu byl získán polynukleotid SEQ ID No: 1.

'· ·

- 72 Příklad 8

Profily EST

Komplementární přístup k charakterizaci experimentálního antigenu z hlediska exprese je použití databáze lidských sekvencí s expresní adresou „Expressed Sequence Tags“ (EST). EST jsou malé fragmenty cDNA připravené ze souboru mRNA extrahovaných z příslušné tkáně nebo buněčné linie. Tato databáze v současnosti poskytuje velké množství EST (10⁶) z několika set knihoven tkáňové cDNA, včetně tumorových tkání z různých typů a stavů onemocnění. io Pomocí nástrojů pro zpracování informací (BLAST) se provádí srovnávací průzkum sekvence CASB7439 s cílem získat další pohled na expresi ve tkáních.

Distribuce EST CASB7439

Přístupové číslo EST v GenBank	EST z knihovny tkáňové cDNA
C00634	Dospělý člověk (K.Okubo)
AA468668	NCI_CGAP_Co3
AA565752	NCI_CGAP_Co11
AA565766	NCI_CGAP_Co11
AA565767	NCI CGAP_Co11
AI337239	NCI_CGAP_Co16
AI337448	NCI_CGAP_Co16
AI393930	NCI_CGAP_CLL1
AI473673	NCI_CGAP_Co14
AI632444	NCI_CGAP_GC6
AI861937	NCI_CGAP_Co16
AI825214	NCI_CGAP_GC6
AW080652	NCI_CGAP_Co19

AW083899	NCI_CGAP_Co19
AW206058	NCI_CGAP_Sub3
AW237006	NCI_CGAP_GC6
AW364626	DT0036
AW449612	NCI_CGAP_Sub5

Tyto sekvence EST mají vynikající shodu s CASB7439. Seznam obsahuje devět sekvencí EST ze čtyř knihoven odlišných tumorů tlustého střeva, jednu sekvenci EST z jedné knihovny normální tkáně tlustého střeva, tři sekvence EST z jedné knihovny tumoru zárodečných buněk, jednu sekvenci EST z jedné knihovny buněk s chronickou lymfocytární leukémií, dvě sekvence EST ze dvou knihoven smíšených tumorů, dvě sekvence EST z knihoven neznámého typu. Tak je jasně ukázáno podle očekávání, že

CASB7439 má v tumorových tkáních, zejména tkáních kolorektálních tumorů, zvýšenou expresi ve srovnání s normálními tkáněmi.

Příklad 9

9.1 Exprese a čištění antigenů specifických pro tumor

Exprese v mikrobiálních hostitelích nebo alternativně transkripce/translace in vitro se používají pro produkci antigenu podle vynálezu pro vakcinační účely a pro získání proteinových fragmentů nebo úplného proteinu pro rychlé čištění a vytváření protilátek nezbytných pro imunohistochemickou charakterizaci přirozeně exprimovaného proteinu nebo pro sledování postupu čištění.

Rekombinantní proteiny mohou být exprimovány ve dvou mikrobiálních hostitelích, E. coli a v kvasince ((jako je Saccharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris). To umožňuje volbu expresního systému, který má pro produkci příslušného antigenu nejlepší

- 74 vlastnosti. Obecně bude rekombinantní antigen exprimován v E. coli a reagenční protein v kvasinkách.

Strategie exprese zahrnuje nejprve návrh primární struktury rekombinantního antigenu. Obecně se expresní fúzní partner (EFP) umístí na N-konec pro zvýšení hladin exprese, která by také mohla zahrnovat oblast využitelnou pro modulaci imunogenních vlastností antigenu, imunitního fúzního partnera (IFP). Navíc je na C-konci zahrnut afinitní fúzní partner (AFP) využitelný pro umožnění dalšího čištění.

Jak je uvedeno výše, je možno porovnávat několik konstruktů:

pro rychlou expresi a čištění stejně jako pro tvorbu protilátek proti CASB7439 se navrhuje vytvářet v buňkách E. coli úplný protein CASB7439 s NS1 jako EFP a histidinovým zakončením jako AFP.

K tomuto účelu se navrhují dva konstrukty.

Konstrukt 1: Úplná sekvence cDNA CASB7439 standardního typu fúzovaná s NS1 cDNA a EFP a s cDNA kódující histidinové zakončení jako AFP (SEQ ID No: 8). Zakódovaná sekvence fúzního proteinu je označena jako SEQ ID No: 10.

Konstrukt 2: Úplná cDNA mutovaného proteinu CASB7439

2o fúzovaná s NS1 cDNA jako EFP a s cDNA kódující histidinový konec jako AFP (SEQ ID No: 9). Navrhuje se, aby bylo prvních padesát kodonů cDNA nativního CASB7439 nahrazeno kodony specifickými pro E. coli, aby bylo možno zvýšit schopnost exprese CASB7439 v hostitelské E. coli. Zakódovaná sekvence fúzního proteinu je označena SEQ ID No: 10.

Schéma proteinu CASB7439 je ukázáno dále:

N-konec | NS1 ~| - l CASB7439 l HIS C-konec

194 • to

- 75 „NS1“ je N-koncový fragment (80 aminokyselin) chřipkového proteinu NS1. „HIS“ je polyhistidinové zakončení.

Jako rekombinantní kmen se použije AR58: Kryptický λ lysogen odvozený z N99 s fenotypem gal E::Tn₇o,4-8(c/7/D-pg/),Á-H1(cro-cWA),N⁺, a CI857 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA díl 82, str. 88 - 92, leden 1985, Biochemistry) .

Jakmile jsou dostupné rekombinantní kmeny, rekombinantní produkt se charakterizuje vyhodnocením míry exprese a předpovědí další rozpustnosti proteinu analýzou chování surového extraktu.

io Po růstu na vhodném kultivačním médiu a indukci exprese rekombinantního proteinu se úplné extrakty analyzují SDS-PAGE. Rekombinantní proteiny se zviditelní na obarvených gelech a identifikují analýzou westernovým přenosem s použitím specifických protilátek.

Plasmid název: TCM 281 pRIT..15143 replikon: pMBI selekční markér: Kan promotor: PL long insert: NS1-C74-39-His

Exprese rekombinantního proteinu z konstruktu 1

Bakterie byly pěstovány v médiu LB + 50 pg/ml Kan při 30 °C. Při dosažení OD kultury 0,5 (620 nm) byla kultura zahřáta na 39 °C a po 5 hod indukce byly buňky sklizeny.

Extract preparation

Zakoncentrování buněk: 50 x v pufru PBS + kompletní...

Rozbití: press french 3 x

Centrifugace: 30 min při 14 000 g • ·· · _ yg _ ··· ··· ··· ♦··

Komentář: >90% v supernatantu buněčného extraktu

Analýza buněčného extraktu byla provedena na 12,5% gelu SDS PAGE, který byl barven Coomassie blue. Byla také provedena analýza westernovým přenosem použitím komerční monoklonální protilátky proti polyhistidinovému konci (Quiagen). Získané gely (obr. 3 a 4) ukazují, že protein je exprimován a je viditelný v supernatantu buněčného extraktu. _s

Schéma purifikace je založeno na klasickém přístupu s využitím io histidinového afinitního zakončení přítomného v rekombinantním proteinu. Při typickém uspořádání experimentu se rozbité buňky zfiltrují a bezbuněčné extrakty se nanesou na afinitní kolonu Ion Metal Affinity Chromatography (IMAC; Ni⁺⁺NTA, Qiagen), která specificky zachytí rekombinantní protein. Zachycené proteiny se eluují 0 až

500mM imidazolovým gradientem (v případě potřeby v přítomnosti detergentu) ve fosfátovém pufru. Supernatant ze sklizené kultury byl denaturován v 6M močovině, 100mM NaH₂PO₄, 10mM Tris, pH 8, a nanesen na chromatografickou kolonu IMAC Qiagen NTA Ni⁺⁺ za následujících podmínek:

Ekvilibrační pufr:	NaH₂PO₄	100mM	pH 8
	Tris	10 mM
	močovina	6M
Vzorek: supernatant v	močovině 6M	, 100mM NaH₂PO₄
	lOmMTris
Promývací pufry: 1)	NaH₂PO₄	100 mM	pH 8
	Tris	10 mM
	močovina	6M
	imidazol	25 mM

2) NaH₂PO₄ 100 mM pH 8

-77 10 mM 6 mM 50 mM

100 mM 10 mM 6M

500 mM pH 5,5

Tris močovina imidazol

Eluční pufr: NaH₂PO₄

Tris močovina imidazol

Eluovaný protein v pufru 500mM dialyzuje za následujících podmínek:

- PBS pH 7,2 + sarkosyl 0,5% + 4M močovina idem při koncentraci močoviny 2M 2 hod idem při koncentraci močoviny 0M 2 hod

Získaný materiál se zmrazí a uloží. Zjištění množství proteinu bylo prováděno pomocí Lowryho testu (0,9 mg/1,2 ml). Čistota byla zjišťována na 12,5% gelu SDS-PAGE s barvením Coomassie blue (obr. 5) a přítomnost rekombinantního proteinu byla ověřena westernovým přenosem s použitím monoklonální protilátky proti polyhistidinu (obr. 6).

Srovnávací vyhodnocení různých verzí exprimovaného antigenu umožní selekci nejvhodnějšího kandidáta, který je vhodný pro další čištění a imunologické hodnocení.

9.2 Produkce protilátek a imunohistochemické testy

Malá množství relativně vyčištěného proteinu mohou být použita pro vytvoření imunologických nástrojů pro dosažení

a) imunohistochemické detekce exprese v řezech normální nebo rakovinné tkáně;

b) detekce exprese a sledování proteinu v průběhu čištění (ELISA/westernový přenos); nebo imidazol + 6M močovina se _ - ··· ··· ··· ···

c) charakterizace/kvantifikace vyčištěného proteinu (ELISA).

9.2.1 Polyklonální protilátky

Imunizace

Králíci se intramuskulárně (i.m.) 3 x imunizují v intervalech tří týdnů 100 pg proteinu formulovaného v adjuvans 3D-MPL/QS21. O tři týdny po každé imunizaci se odebere vzorek krve a zjistí se titr protilátky v séru metodou ELISA s použitím proteinu jako potahovacího antigenu a standardního protokolu.

io ELISA

96-jamkové mikrodestičky (maxisorb Nunc) se potahují 5 pg proteinu přes noc při 4 °C. Po 1 hod saturace při 37 °C PBS NCS 1% se přidávají sériová ředění králičího séra a inkubuje se 1 hod 30 min při 37 °C (počáteční ředění 1/10). Po třech promytích v pufru PBS

Tween se přidá biotinylovaná protilátka proti králičímu séru (Amersham) (1/5000). Destičky se promyjí a přidá se streptavidin s navázanou peroxidázou (1/5000) na 30 min při 37 °C. Po promytí se přidá 50 pl TMB (BioRad) na 7 min a reakce se potom zastaví 0,2M H2SO. OD se může měřit při 450 nm a střední ředění se počítají softwarem SoftmaxPro.

9.2.2 Monoklonální protilátky

Imunizace

Pět myší BALB/c se imunizuje 3 x v intervalu tří týdnů 5 pg čištěného proteinu. Krev se odebírá 14 dnů po druhé imunizaci a jeden týden po třetí imunizaci. Séra se testují metodou ELISA na čištěném proteinu použitém jako potahovací antigen. Na základě těchto výsledků (střední ředění >10 000) se pro fúzi vybere jedna myš.

- 79 Fúze/selekce HAT

Provede se fúze ledvinových buněk s myelomem SP2/0 podle standardního protokolu použitím PEG 40% a DMSO 5%. Buňky se potom naočkují do 96-jamkových destiček v koncentraci 2,5 χ 10⁴ až

10⁵ buněk/jamku a provede se selekce rezistentních klonů v médiu

HAT. Supernatant z těchto hybridomů se testuje na obsah specifických protilátek a v případě pozitivního výsledku se provedou dva cykly limitovaného ředění. Po dvou cyklech screeningu se tři hybridomy zvolí pro produkci v ascitu.

9.2,3 Imunohistochemické testy

Když jsou k dispozici protilátky, provede se imunologické barvení na řezech normální a rakovinné tkáně, aby bylo možno zjistit:

⁰ míru exprese antigenu podle vynálezu v rakovinné tkáni ve srovnání s normální tkání, nebo ⁰ podíl určitých typů rakoviny, které exprimují antigen, ° zda jiné typy rakoviny rovněž exprimují antigen ⁰ podíl buněk v rakovinné tkáni, které exprimují antigen.

Příprava vzorku tkáně

Po vyříznutí se vzorek tkáně upevní na korkový disk ve sloučenině OCT a rychle se zmrazí v isopentanu, který se předtím podchladí v kapalném dusíku (-160 °C). Blok se potom konzervuje až do použití při -70 °C. V kryostatické komoře se provedou řezy o tloušťce 7 až 10 pm (-20, -30 °C).

Barvení

Řezy tkání se suší 5 min při teplotě laboratoře, fixují v acetonu 10 min při teplotě laboratoře, znovu suší a nasytí pufrem PBS s 0,5 % BSA a 5% sérem. Po 30 min při teplotě laboratoře se provede buď přímé nebo nepřímé barvení s použitím protilátek specifických pro • ·

- 80 ·· φφ φ φ antigen. Přímé barvení vede k lepší specificitě, ale nižší intenzitě barvení, zatímco nepřímé barvení poskytne intenzivnější, ale méně specifické barvení.

9.3 Analýza lidských buněčných imunistních odpovědí na antigen podle vynálezu

Imunologické vlastnosti antigenu podle vynálezu mohou být testovány in vitro primingem na lidských T-buňkách. Všechny linie Tbuněčných lymfocytů a dendritické buňky se odvozují od buněk PBMC io (mononukleární buňky periferní krve) zdravých dárců (s výhodou subtypu HLA-A2). Pro screening peptidů HLA-A2.1 se také používá model transgenní myši HLA-A2.1/Kb.

Vytvoří se nově objevené linie pro antigen specifických CD8+ Tbuněk, které se udržují týdenní stimulací in vitro. Lytická aktivita a produkce γ-IFN CD8+ buněčných linií jako odpověď na antigen nebo peptidy odvozené od antigenu se testují s použitím standardních postupů.

Používají se dvě stragtegie pro vytvoření linií CD8+ T-buněk: přístup založený na peptidech a přístup založený na úplném genu.

Oba přístupy vyžadují úplnou cDNA nově objeveného antigenu buď klonovanou ve správném čtecím rámci do vhodného dodávacího systému, nebo použitou pro předpovězení sekvence peptidů vázajících HLA.

Přístup založený na peptidech

Transgenní myši se imunizují adjuvantními peptidy HLA-A2, přičemž peptidy neschopné indukovat odpověď CD8+ (definovanou jako účinný lyže autologních slezinných buněk po krátkodobém přidání peptidů) se budou dále analyzovat v lidském systému.

K lidským dendritickým buňkám (kultivovaným metodou podle

3o Romani a další) se krátkodobě přidají peptidy a použijí se pro stimulaci

- 81 00 . 0 · ·

• 0

CD8+ T-buněk (podle Facse). Po několika týdenních stimulacích se nejprve linie CD8+ testují na autologních BLCL (buněčné linie transformované EBV-B) po krátkodobém přidání peptidu. Pro ověření správného zpracování peptidu in vivo se buněčné linie CD8+ testují na tumorových buňkách transfekovaných cDNA (tumorové buňky LnCaP, Skov3 nebo CAMA transfekované HLA-A2).

Přístup založený na úplném genu

Linie CD8+ T-buněk se budou stimulovat buď dendritickými buňkami transfekovanými metodou gene-gun, retrovirálně io transdukovanými B7.1-transfekovanými fibroblasty, rekombinantními poxviry nebo dendritickými buňkami infikovanými adenovirem. Buňky infikované virem mají vysokou účinnost pro předkládání antigenních peptidů, protože antigen je exprimován ve velkém množství, ale mohou být použity pouze jednou, aby je nepřerostly linie virových T15 buněk.

Po střídavých stimulacích se linie CD8+ testují na tumorových buňkách transfekovaných cDNA, jak bylo uvedeno výše. Zjistí se specificita a identita peptidu pro potvrzení imunologických vlastností. Odpověď CD4+ T-buněk

Podobným způsobem může být také testována imunitní odpověď

CD4+ T-buněk. CD4+ T-buňky se vytvářejí použitím dendritických buněk, do kterých byl vložen rekombinantní vyčištěný protein nebo s použitím peptidů pro stimulaci T-buněk.

Přepovězené epitopy (nonamery a dekamery) vázající se na alely HLA

Peptidové sekvence vázající se na HLA třídy I se předpovídají buď s použitím Parkerova algoritmu (Parker, K. C., M. A. Bednarek, a J. E. Coligan, 1994, Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide sidechains, J. Immunol. 152: 163, a http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) nebo metodou podle • ·

- 82 ·· »· • ·

Rammensee (Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC ligands and peptide motifs: 1 st listing, Immunogenetics 41, 178 - 228, 1995; Rammensee, Bachmann, Stevanovic: MHC ligands and peptide motifs. Landes Bioscience 1997, a http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm). Potom se provede screening peptidu v modelu transgenních myší HLA-A2.1/Kb (Vitiello a další). Peptidové sekvence vázající se na HLA třídy II se předpovídají použitím algoritmu Tepitope, s parametrem score cut-off nastaveným na 6 (Sturniolo, Hammer a další, Nátuře Biotechnology, 1999, 17; 555 io -561).

Následující tabulky shrnují předpovězené epitopové sekvence třídy I a II:

HLA-A 0201: dekamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera⁰	SEQ ID:
1	64	KLVNLGFQAL	142,060	SEQ ID No: 16

° Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou 15 subsekvenci

HLA-A 0201: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera⁰	SEQ ID:
1	182	ELLDFSSWL	507,976	SEQ ID No: 17
2	104	RLLAEHDAV	126,098	SEQ ID No: 18
3	64	KLVNLGFQA	100,850	SEQ ID No: 19

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-A 24: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera“	SEQ ID:
1	97	EYIRALQRL	360,000	SEQ ID No: 20

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-A 24: dekamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera⁰	SEQ ID:
1	97	EYIRALQRLL	360,000	SEQ ID No: 21

° Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou 5 subsekvenci

HLA-B 7: dekamery ,
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera⁰	SEQ ID:
1	111	AVRNALAGGL	600.000	SEQ ID No: 22

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

HLA-B 4403: dekamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení podle Parkera“	SEQ ID:
1	156	SEPGSPRSAY	360,00	SEQ ID No: 23
2	89	VETLRSAVEY	180,00	SEQ ID No: 24

o

Odhad poločasu disociace molekuly obsahující uvedenou subsekvenci

- 84 ··· ···

HLA-DRBV1501: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,6	SEQ ID No: 25

HLA-DRB1*1501: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,6	SEQ ID No: 25

HLA-DRB1*0402: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	5,4	SEQ ID No: 26

HLA-DRB1*1101: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,8.	SEQ ID No: 25

HLA-DRB1M102: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,2	SEQ ID No: 26

HLA-DRBV1501: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,8	SEQ ID No: 25

• ·

- 85 • ··· »·« · • · ·*··

HLA-DRBV1106: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	5,8	SEQ ID No: 25

HLA-DRB1*1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,6	SEQ ID No: 26
2	73	LRQHVPHGG	4,9	SEQ ID No: 27
3	31	LLRCSRRRR	4,4	SEQ ID No: 33

HLA-DRB1*1302: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	5,6	SEQ ID No: 26

HLA-DRB1*1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	120	LRPQAVRPS	6,2	SEQ ID No: 26
2	73	LRQHVPHGG	4,8	SEQ ID No: 27
3	31	LGFQALRQH	4,6	SEQ ID No: 28

HLA-DRB1*1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	99	IRALQRLLA	4,8	SEQ ID No: 25

- 86 999 ·» ·* * · · • · · 9 9 9 • 9 ·

9999

HLA-DRBV1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	112	VRNALAGGL	5,1	SEQ ID No: 29
2	98	YIRALQRLL	4,8	SEQ ID No: 30
3	65	LVNLGFQAL	4,5	SEQ ID No: 31

HLA-DRB1*1301: nonamery
Pořadí	Poloha počátku	Výpis zbytku subsekvence	Hodnocení Tepitope	SEQ ID:
1	96	VEYIRALQR	4,3	SEQ ID No: 32

ý'

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Imunogenní prostředek vyznačující se tím, ž e obsahuje bezpečné a účinné množství polypeptidů, který

2. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačující io se tím, že aminokyselinová sekvence má alespoň

95% identitu se SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 10.

3. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že aminokyselinová sekvence je SEQ ID No. 2

15 nebo SEQ ID No. 10.

4. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje bezpečné a účinné množství imunogenního fragmentu polypeptidů podle některého z nároků 1 až 3,

20 a farmaceuticky přijatelný nosič, přičemž imunogenní fragment, v případě potřeby navázaný na nosič nebo ve formě součásti •5 většího fúzního proteinu, je schopen vyvolat imunitní odpověď, která rozpozná polypeptid se SEQ ID No. 2.

λ

25 5. Imunogenní prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že imunogenní fragment obsahuje sekvenci jedné nebo více sekvencí SEQ ID No. 16 až ŠEQ ID No. 33.

5 vnímavosti na kolorektální rakovinu u pacienta, kde tato onemocnění souvisejí s expresí nebo aktivitou polypeptidu podle některého z nároků 1 až 3 u pacienta, vyznačující se tím, že se provede analýza přítomnosti nebo množství uvedeného polypeptidu ve vzorku iq odvozeném z pacienta.

27. Způsob diagnózy přítomnosti kolorektální rakoviny nebo vnímavosti na kolorektální rakovinu u pacienta, kde tato onemocnění souvisejí s expresí nebo aktivitou polynukleotidu

5 imunologické léčení pacienta trpícího karcinomem nebo vnímavého na karcinom.

18. Použití polypeptidu podle některého z nároků 1 až 3 nebo 11, nebo jeho imunogenního fragmentu definovaného v nároku 4 io nebo 5, nebo polynukleotidu kódujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 3 nebo 11, při výrobě vakciny pro imunologické léčení pacienta trpícího karcinomem tlustého střeva nebo jinými tumory nebo onemocněními asociovanými s tlustým střevem, nebo vnímavého na karcinom tlustého

15 střeva, nebo jiné tumory nebo onemocnění asociované s tlustým střevem.

19. Způsob léčení pacienta imunoprofylaxí nebo imunoterapií, který zahrnuje indukci in vitro imunitních odpovědí na molekulu podle

20 některého z nároků 1 až 3 nebo 11, s použitím inkubace in vitro polypeptidu definovaného v některém z nároků 1 až 3, nebo polynukleotidu kódujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 3, s buňkami imunitního systému savce, a reinfuzi těchto aktivovaných imunitních buněk savci pro léčení onemocnění.

20. Způsob podle nároku 19, při kterém se léčí kolorektální rakovina.

- 98 -*··

• • • ·· • · • • • • • • · • • · • • • · • · • • • • • • · • · · • · · • · · • ·· • * ····

21. Protilátka imunospecifická pro polypeptid definovaný v některém z nároků 1 až 3, nebo její imunologický fragment definovaný v nároku 4 nebo 5.

5

22. Agonista nebo antagonista polypeptidu definovaného v některém z nároků 1 až 3.

23. Sloučenina, kterou je:

(a) agonista nebo antagonista polypeptidu definovaného io v některém z nároků 1 až 3;

(b) izolovaný polynukleotid kódující polypeptid definovaný v některém z nároků 1 až 3; nebo (c) molekula nukleové kyseliny, která moduluje expresi nukleotidové sekvence kódující polypeptid definovaný

15 v některém z nároků 1 až 3;

pro použití v lékařství.

24. Způsob diagnózy onemocnění nebo vnímavosti na onemocnění u pacienta, kde tato onemocnění souvisejí s expresí nebo

20 aktivitou polypeptidu podle některého z nároků 1 až 3 u pacienta, vyznačující se tím, že se provede analýza přítomnosti nebo množství uvedeného polypeptidu ve vzorku odvozeném z pacienta.

25 25. Způsob diagnózy onemocnění nebo vnímavosti na onemocnění u pacienta, kde tato onemocnění souvisejí s expresí nebo aktivitou polynukleotidu kódujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 3 u pacienta, vyznačující se tím, • · »· ·· že se analyzuje přítomnost nebo množství uvedeného polynukleotidu ve vzorku odvozeném z pacienta.

26. Způsob diagnózy přítomnosti kolorektální rakoviny nebo

5 některého z nároků 1 až 3 nebo 11, nebo jeho imunogenní fragment definovaný v nároku 4 nebo 5.

5 a farmaceuticky přijatelný nosič.

5 má alespoň 70% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID

No. 2 nebo SEQ ID No. 10 po celé délce SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 10; a farmaceuticky přijatelný nosič.

6. Imunogenní prostředek vyznačující se tím, ž e obsahuje bezpečné a účinné množství polynukleotidu kódujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 3, nebo jeho imunogenní fragment podle nároku 4 nebo 5;

7. Imunogenní prostředek podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že navíc obsahuje adjuvans indukující odpověď typu TH-1.

8. Imunogenní prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že adjuvans indukující odpověď typu TH-1 je zvoleno ze skupiny 3D-MPL, QS21 a směs QS21 a cholesterolu a oligonukleotidu CpG, nebo směsi dvou nebo

15 více uvedených adjuvans.

• • 9 9 9 9 • 9 9« 99 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · 9 9 9 999 9 9 9 9 9

9. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje účinné množství buněk předkládajících antigen modifikovaných vnesením polypeptidů definovaného

20 v některém z nároků 1 až 3 in vitro, nebo geneticky modifikovaných in vitro pro expresi uvedeného polypeptidů, a farmaceuticky přijatelný nosič.

10. Imunogenní prostředek podle některého z nároků 1 až 9 pro

25 použití v lékařství.

11. Izolovaný polypeptid se SEQ ID No. 10.

12. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid se SEQ ID No. 10.

13. Expresní vektor nebo rekombinantní živý organismus obsahující izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle

14. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 13 nebo izolovaný polynukleotid podle nároku 12 nebo izolovaný io polynukleotid kódující polypeptid definovaný v některém z nároků 1 až 3 nebo 11, nebo jeho imunogenní fragment definovaný v nároku 4 nebo 5.

15. Způsob výroby imunogenního prostředku podle některého

15 z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se smísí polypeptid definovaný v některém z nároků 1 až 3 nebo 11, nebo jeho imunogenní fragment definovaný v nároku 4 nebo 5, nebo polynukleotid kódující polypeptid definovaný v některém z nároků 1 až 3 nebo 11, s vhodným adjuvans,

20 ředivem nebo jiným farmaceuticky přijatelným nosičem.

16. Způsob výroby polypeptidu definovaného v některém z nároků 1 až 3 nebo 11, nebo jeho imunogenního fragmentu definovaného v nároku 4 nebo 5, vyznačující se

25 t i m , ž e se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 14 za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu, a polypeptid se izoluje z kultivačního média.

- 97 ► · ··♦·

17. Použití polypeptidu podle některého z nároků 1 až 3 nebo 11, nebo Jeho imunogenního fragmentu definovaného v nároku 4 nebo 5, nebo polynukleotidu kódujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 3 nebo 11, při výrobě vakciny pro

15 kódujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 3 u pacienta, vyznačující se tím, že se analyzuje přítomnost nebo množství uvedeného polynukleotidu ve vzorku odvozeném z pacienta.