JP2003530088A - 新規化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 CASB7439ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、これらを含む免疫原性組成物ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを製造する方法が開示される。また、CASB7439ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを診断に利用する方法、さらに癌（特に結腸直腸癌）、自己免疫疾患、および関連病態の予防的ならびに治療的処置のためのワクチンも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物および
その誘導のための方法に関する。より具体的には、本発明は、本明細書中でCASB
7439ポリヌクレオチドと呼ぶポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペ
プチド（本明細書中でCASB7439ポリペプチドと呼ぶ）、組換え物質、ならびにそ
の生産方法に関する。別の態様において、本発明は、癌、特に結腸直腸癌、およ
び自己免疫疾患ならびに他の関連病態の治療をはじめとする、前記ポリペプチド
およびポリヌクレオチドの使用方法に関する。別の態様では、本発明はCASB7439
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む医薬組成物、このような組成物の製
造方法および医療におけるその使用に関する。更なる態様では、本発明は、本発
明により提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニスト／インヒビタ
ーを同定する方法、ならびに同定された化合物を用いてCASB7439ポリペプチド平
衡異常と関連した症状を治療することに関する。さらに他の態様において、本発
明は不適当なCASB7439ポリペプチド活性またはCASB7439ポリペプチドレベルと関
連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。

【０００２】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍に対する特定の予防ま
たは治療のための免疫用の重要な免疫原であると考えられている。何故なら、前
記ポリヌクレオチドおよび前記ポリペプチドは、正常細胞と比較して腫瘍におい
て特異的に発現されるかまたはかなり過剰に発現され、抗原特異的免疫機構の標
的となって前記腫瘍細胞の破壊をもたらしうるからである。また、それらを使用
して腫瘍細胞の発生を診断することもできる。さらに、特定の環境における不適
切な発現により、自己免疫性の不適切な免疫応答の誘導を引き起こし得るが、該
応答は前記と同様のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いる適切なワクチ
ン接種により矯正することができる。この点において、本発明の目的として最も
重要な生物学的活性は、本発明のポリペプチドの抗原性活性および免疫原性活性
である。また、本発明のポリペプチドは、CASB7439ポリペプチドの少なくとも１
つの他の生物学的活性を示すものであってもよく、該活性により本発明のポリペ
プチドを免疫応答に関連したものとは異なる治療的または予防的介入の標的とみ
なすことができる。

【０００３】 最初の態様において、本発明はCASB7439ポリペプチドに関する。この種のペプ
チドには、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号11、配列
番号12または配列番号14の全長にわたってそれぞれ配列番号2、配列番号3、配列
番号7、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号14のアミノ酸配列
に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好
ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、
最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる
単離されたポリペプチドが含まれるが、ただし、該単離されたポリペプチドは配
列番号2、配列番号12または配列番号14ではない。こうしたポリペプチドには、
配列番号3、配列番号7、配列番号10または配列番号11のアミノ酸を含んでなるポ
リペプチドが含まれる。

【０００４】 本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号2、配列番号3、配列
番号7、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号14の全長にわたっ
てそれぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号11、配列
番号12または配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性、好ま
しくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さら
に好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99％の同
一性を有する単離されたポリペプチドが含まれるが、ただし、該単離されたポリ
ペプチドは配列番号2、配列番号12または配列番号14ではない。こうしたポリペ
プチドとしては、配列番号3、配列番号7、配列番号10および配列番号11のポリペ
プチドがある。好ましくは、上記ポリペプチドは組換え法により生産される。本
発明の最も好ましいポリペプチドは、精製されたものであり、他の何らかのタン
パク質または宿主に由来する混入物質を実質的に含まないものである。

【０００５】 本発明の更なるペプチドには、配列番号1に含まれる配列を含んでなるポリヌ
クレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。

【０００６】 また本発明は、CASB7439ポリペプチドの免疫原性断片、すなわち配列番号2、
配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号14
のアミノ酸配列を含むCASB7439ポリペプチドと同様のまたは類似した免疫原特性
を有する前記ポリペプチドの連続した部分、を提供する。すなわち、前記断片（
必要であれば、担体に結合されているかまたはより大きな融合タンパク質の一部
である）は、CASB7439ポリペプチドを認識する免疫応答を引き起こすことができ
る。こうした免疫原性断片には、例えば、Ｎ末端のリーダー配列、膜貫通ドメイ
ンまたはＣ末端のアンカードメインを欠くCASB7439ポリペプチドが含まれる。好
ましい態様において、本発明のCASB7439の免疫原性断片は、配列番号2、配列番
号3、配列番号7、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号14の全長
にわたってそれぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号1
1、配列番号12または配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも70％の同一
性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一
性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜
99％の同一性を有するポリペプチドの実質的に全ての細胞外ドメインを含む。好
ましくは、本発明の免疫原性断片は少なくとも１個のエピトープを含む。

【０００７】 CASB7439のエピトープを含むペプチド断片は、典型的に、配列番号2に由来す
る少なくとも７個、好ましくは９または10個の連続したアミノ酸を含んでなる。
好ましいエピトープを配列番号16〜配列番号33に示している。

【０００８】 これらのエピトープを含むペプチドは、本発明の好ましい態様である。また、
これらのエピトープと同じ特性を有するミモトープ（mimotope）、およびそのよ
うなミモトープを含む免疫原であって、免疫応答を引き起こし、CASB7439分子に
関するエピトープと交差反応するものは、本発明の一部を構成するものである。

【０００９】 したがって本発明は、それらのエピトープ自体およびそれらの任意のミモトー
プを包含する単離されたペプチドを含む。ミモトープの意味は、天然CASB7439エ
ピトープと十分に類似しているために、該天然分子を認識する抗体により認識さ
れ得るもの（Gheysen, H.M.ら, 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley
, Chichester, Ciba foundation symposium 119, p130-149; Gheysen, H.M., 19
86, Molecular Immunology, 23,7, 709-715）であるか、あるいは適切な担体に
結合した場合に該天然分子と交差反応する抗体を生じさせ得るものとして、定義
される。

【００１０】 前記のエピトープのペプチドミモトープは、特定の目的のために、選択された
アミノ酸の付加、欠失または置換によって設計することができる。したがって、
本発明のペプチドは、タンパク質担体への結合を容易にするために改変しても良
い。例えば、ある種の化学結合法では、エピトープの末端にシステインを含有さ
せることが好ましい。更に、タンパク質担体に結合させたペプチドについては、
該ペプチドの結合末端から遠い位置に疎水性末端を含有させて、該ペプチドの非
結合遊離末端が担体タンパク質の表面に結合されないままにすることが好ましい
。それにより該ペプチドのコンホメーション上の自由度が低減するため、完全な
分子の場合にみられるようなペプチドコンホメーションと最も近似しているコン
ホメーションで該ペプチドが提示される可能性が高まる。例えば、該ペプチドは
、N末端システインおよびC末端疎水性アミド化テールを含有するように改変しう
る。あるいは、1以上のアミノ酸のD-立体異性体の付加または置換を行うことに
より、例えば該ペプチドの安定性を向上させるなど、有益な誘導体を作製しうる
。そのような改変ペプチドまたはミモトープは、その構成残基が20種の天然アミ
ノ酸に限定される必要はなく、全体としてもしくは部分的に非ペプチド性ミモト
ープであってもよいことは、当業者であれば理解できるであろう。さらにそれら
は、当技術分野で公知の技術により環化して、該ペプチド配列が分子全体である
場合の形状によく似たコンホメーションとすることができる。ペプチドを環化す
る好適な方法には、ジスルフィド架橋形成を生じうる一対のシステイン残基を付
加することが含まれる。

【００１１】 さらに、当業者であれば、本発明のミモトープまたは免疫原が上記のエピトー
プより大きいものであって本明細書に開示した配列を含むものでありうることは
理解されるだろう。したがって、本発明のミモトープは、一方または両方の末端
においていくつかのさらなる天然残基をNおよび／またはC末端伸長部に付加した
ものからなっていてもよい。該ペプチドミモトープはまた、天然配列の逆配列、
すなわち配列の方向が逆であるものか、あるいは該配列が全体としてまたは少な
くとも一部がD-立体異性体のアミノ酸で構成されている（インベルソ（inverso
）配列）ものであってよい。また、該ペプチド配列は特徴として逆−インベルソ
（retro-inverso）、すなわち配列の方向が逆でありかつアミノ酸がD-立体異性
体であるものであってもよい。そのような逆ペプチドまたは逆−インベルソペプ
チドは非自己であるという利点を有し、それにより免疫系における自己免疫寛容
の問題が克服されうる。

【００１２】 あるいはペプチドミモトープは、本発明のエピトープに結合可能な抗体を用い
て、ファージディスプレイ技法（EP 0 552 267 B1）等の技術によって同定する
ことができる。この技術は、天然ペプチドの構造を模倣しておりそのため抗天然
ペプチド抗体に結合可能であるペプチド配列を多数生成するが、それらの配列自
体は天然ペプチドに対し有意に相同な配列を必ずしも共有していなくてもよい。
この方法は増強された免疫原特性を有するペプチドを同定することができるよう
にすることにより大きな利点を有しうるものであり、すなわち天然ペプチド配列
の使用に伴ういかなる潜在的な自己抗原免疫寛容の問題も克服することができる
。さらに、この技術により、各天然ペプチドに対する認識パターンを、認識され
たミモトープ配列の間で共有される化学的特性によって同定することができるよ
うになる。

【００１３】 免疫原性担体へのペプチドの共有結合は当技術分野で周知の方法で行うことが
できる。したがって、例えば直接的な共有結合には、一般的な市販されているヘ
テロ二機能性リンカー、例えばCDAPおよびSPDPを（製造業者の説明書にしたがっ
て）利用して、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、またはN-[γ-マレイミド
ブチリルオキシ]スクシンイミドエステルを使用することができる。結合反応の
後、免疫原は、透析法、ゲルろ過法、分画法等により容易に単離および精製する
ことができる。

【００１４】 本発明の免疫原に用いる担体の種類は、当業者であれば容易に認識できるであ
ろう。担体の機能は、ペプチドに対する免疫反応を誘導させるようにサイトカイ
ンを促進することである。本発明で用いられうる担体を非網羅的に列挙すると、
キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）等の血
清アルブミン、破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（TTおよびDT）等の不活性化
細菌性毒素、またはそれらの組換え断片（例えば、TTのフラグメントCのドメイ
ン１、もしくはDTの転座ドメイン）、あるいはツベルクリンの精製タンパク質誘
導体（PPD）が挙げられる。あるいは、ミモトープまたはエピトープは、T細胞を
促進する免疫原をさらに含みうるリポソーム担体に直接結合させてもよい。好ま
しくはミモトープと担体の割合は1:1〜20:1であり、好ましくは各担体が３〜15
個のペプチドを保持すべきである。

【００１５】 本発明の実施形態において、好適な担体はインフルエンザ菌（Haemophilus in
fluenzae）由来のプロテインD（EP 0 594 610 B1）である。プロテインDは、イ
ンフルエンザ菌由来のIgD結合タンパク質であり、Forsgrenに特許が与えられて
いる（WO 91/18926、特許付与番号EP 0 594 610 B1）。ある種の状況では、例え
ば組換え免疫原発現系においては、プロテインDの断片、例えばプロテインDの1/
3（プロテインDのN末端の100〜110個のアミノ酸を含むもの（GB 9717953.5））
を用いることが望ましい。

【００１６】 本発明のペプチドを提示するための別の好適な方法は、組換え融合分子に関連
するものである。例えば、EP 0 421 635 Bは、ウイルス様粒子において外来ペプ
チド配列を提示するためのキメラヘパドナウイルスコア抗原粒子の使用について
記載している。同様に本発明の免疫原は、B型肝炎コア抗原からなるキメラ粒子
において提示されるペプチドを含んでもよい。さらに、組換え融合タンパク質は
本発明のミモトープと担体タンパク質（例えばインフルエンザウイルスのNS1等
）を含むものでありうる。本発明の一部を構成する組換え法により発現された任
意のタンパク質に関して、前記免疫原をコードしている核酸もまた本発明の一態
様を構成する。

【００１７】 本発明において用いられるペプチドは、当技術分野で周知の固相法により容易
に合成できる。適切な合成は、「T-boc」法または「F-moc」法を用いることによ
り行うことができる。環状ペプチドは、よく知られた「F-moc」法およびポリア
ミド樹脂を用い、完全に自動化した装置にて、固相法で合成することができる。
あるいは、当業者であればその過程を手作業で行うために必要な実験室的手法を
認知しているであろう。固相合成のための技術および手法は、E. Athertonおよ
びR.C. Sheppardによる「固相ペプチド合成：実用的方法（Solid Phase Peptide
Synthesis: A Practical Approach）」（IRL（Oxford University Press）発行
（1989））に記載されている。あるいはペプチドは、細菌株または哺乳動物細胞
系においてミモトープをコードする核酸分子を発現させ、その後発現されたミモ
トープを精製することを含む、組換え法により生成することができる。ペプチド
およびタンパク質の組換え発現のための技術は当技術分野で公知であり、Maniat
is, T., Fritsch, E.F.およびSambrookらのMolecular cloning, a laboratory m
anual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York （1989）に記載されている。

【００１８】 本発明の更なる態様において、本明細書に記載のポリペプチドを生産する方法
を提供する。本発明の方法は、Maniatis et al., Molecular Cloning-A Laborat
ory Manual ; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載されるような従来の組換え
法によって実施することができる。したがって、本発明のポリペプチドの生産方
法であって、該ポリペプチドを産生するために十分な条件下において宿主細胞を
培養し、培養培地から該ポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。特
に、本発明の方法は、好ましくは、以下の工程を含みうる： i） 該タンパク質またはその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含
むDNAポリマーを、宿主細胞中で発現することができる複製能を有する発現ベク
ターまたは組込み発現ベクターを調製し、 ii） 該ベクターで宿主細胞を形質転換し、 iii） 該DNAポリマーが発現して該タンパク質を産生できる条件下で該形質転換
宿主細胞を培養し、そして、 iv） 該タンパク質を回収する。

【００１９】 本発明のポリペプチドまたは免疫原性断片は「成熟」タンパク質の形であって
も、前駆体または融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であっ
てもよい。しばしば、追加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このよう
なアミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジ
ン残基のような精製に役立つ配列、または組換え体産生の間の安定性を確保する
付加的配列などがある。さらに、外来ポリペプチドまたは脂質テイル（lipid ta
il）またはポリヌクレオチド配列の追加により最終的な分子の免疫原としての可
能性を高めることも考慮される。

【００２０】 １つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片と、各
種サブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の定常
領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製された可溶性融合タンパ
ク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトIgG、特にIgG1のＨ鎖の定常部が好
ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特定例では、血液凝固因子Ｘａ
で開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Ｆｃ部分を簡単に除去できる。さら
に、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学的作製方法、ならびに薬物ス
クリーニング、診断および治療におけるそれらの使用に関する。本発明の特に好
ましい態様は、癌（特に大腸癌）またはその他の大腸に関連する腫瘍または疾患
に罹患しているまたはこれらに罹患しやすい患者を、免疫治療によって処置する
ためのワクチンの製造における、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用に
関する。また、本発明の更なる態様はこのような融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドに関する。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/29458
およびWO94/22914に見いだせる。

【００２１】 前記タンパク質を化学的に結合するかまたは組換え融合タンパク質として発現
させることにより、発現系において該タンパク質が非融合タンパク質に比べて増
大されたレベルで産生される。融合パートナーはＴへルパーエピトープ、好まし
くはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープの提供を助ける（免疫学的融合
パートナー）か、または前記タンパク質の、元の組換えタンパク質より高い産生
量での発現を助ける（発現エンハンサー）ことができる。好ましくは、前記融合
パートナーは免疫学的融合パートナーおよび発現エンハンサーパートナーの両方
である。

【００２２】 融合パートナーには、ヘモフィルス・インフルエンザＢ（Haemophilus influe
nza B）由来のプロテインＤおよびインフルエンザウイルス由来の非構造タンパ
ク質NS1（赤血球凝集素）が含まれる。別の免疫学的融合パートナーはLYTAとし
て知られるタンパク質である。好ましくは、該分子のＣ末端部分を使用する。Ly
taは、N-アセチル-L-アラニンアミダーゼであるアミダーゼLYTA（lytA遺伝子に
よりコードされる[Gene. 43（1986） page 265-272]）、すなわちペプチドグリ
カン骨格内の特定の結合を特異的に分解する自己分解酵素を合成するストレプト
コッカス・ニューモーニア（Streptococcus pneumoniae）から得られる。前記LY
TAタンパク質のＣ末端ドメインは、コリン、またはDEAE等の数種のコリン類似体
に対する親和性に関与している。この性質を融合タンパク質の発現に有用な大腸
菌（E.coli）C-LYTA発現プラスミドの開発に利用した。そのアミノ末端に前記C-
LYTA断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製については、Biotechnology:
10. （1992） page 795-798に記載されている。前記Lyta分子のＣ末端に見出さ
れ、残基178から始まる反復部分（例えば残基188〜305）を使用することができ
る。

【００２３】 本発明はまた、上記ポリペプチドの異種形態（オーソログ体ともいう）を含み
、異種形態とは、ヒト抗原（自己由来抗原ともいう）と実質的な配列同一性を有
する抗原であって、参照抗原として役立つがヒト以外の異種に由来するものをい
う。ここで、実質的な同一性とは、当技術分野で公知の多くのタンパク質配列ア
ライメントのうち最も適合するアライメントで配列をアライメントさせたときの
、あるアミノ酸配列と別のアミノ酸配列との一致度、または、あるポリヌクレオ
チド配列と別のポリヌクレオチド配列との一致度をいう。ここで、実質的な同一
性とは、比較した配列間における、少なくとも70〜95％、好ましくは少なくとも
85〜95％、最も好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性を意味する。したが
って、本発明において、異種CASB7439ポリペプチドは、ヒトCASB7439に関して異
種性であるCASB7439ポリペプチド、すなわち、ヒト以外の種から単離されたCASB
7439ポリペプチドである。好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、マウ
ス、ラット、ブタまたはアカゲザル、最も好ましくはマウスまたはラットから単
離される。したがって、本発明はまた、ヒトにおいて、配列番号2、配列番号3、
配列番号7、配列番号10または配列番号11で表されるいずれかのアミノ酸配列を
有するヒトCASB7439に対する免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載
のヒトCASB7439の異種形態を含む組成物の有効量を被験体に投与することを含む
方法を提供する。好ましい実施形態は、マウス、ラット、ブタまたはアカゲザル
から単離された異種CASB7439を用いて、ヒトCASB7439に対する免疫応答を誘導す
る方法である。本発明による免疫応答を誘導するための別の好ましい方法は、該
異種抗原を発現する生ウィルス発現系を含む抗原組成物を用いるものである。好
ましい異種CASB7439ポリペプチドは、配列番号12（マウス）または配列番号14（
ラット）に表される配列を有する。

【００２４】 単離された異種CASB7439ポリペプチドは、通常、実質的な配列類似性を共有し
ており、これらには配列番号12または配列番号14の全長にわたって、配列番号12
または配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは
少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらにより
好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一
性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドが含まれる。した
がって、異種ポリペプチドには、配列番号12または配列番号14のポリペプチドの
免疫原性断片であって、該免疫原性断片の免疫原性活性は、配列番号12または配
列番号14のポリペプチドのものと実質的に同一であるものが含まれる。さらに、
異種CASB7439ポリペプチドは、配列番号12または配列番号14で表されるアミノ酸
配列から選択される、少なくとも約20の連続アミノ酸、好ましくは約30、より好
ましくは約50、さらにより好ましくは約100、最も好ましくは約150の連続アミノ
酸の断片でありうる。特に、異種CASB7439断片は、配列番号12または配列番号14
で表されるより大きい分子の何らかの機能的特性、好ましくは免疫学的活性を保
持し、本明細書に記載の方法において有用である（例えば、医薬組成物およびワ
クチン組成物、診断薬などにおいて）。特に、該断片は、ヒト対応物に対する免
疫応答、例えば、配列番号2で表されるCASB7439の自己由来ヒト形態と反応する
交差反応性抗体の産生をもたらすことができる。特定の実施形態においては、本
発明の異種ポリペプチドは、より大きな融合タンパク質の一部であってもよく、
該融合タンパク質は、上記のように、異種CASB7439ポリペプチドまたはその断片
と、融合パートナーとして作用する非相同タンパク質またはタンパク質の一部と
を含む。

【００２５】 また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換（ある残基が
性質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違して
いるポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Le
u および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間
；塩基性残基 LysとArgの間；または芳香族残基PheとTyr の間で起こる。特に、
数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が任意
の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が好適である。

【００２６】 本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポ
リペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せに
より製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するため
の手段は当業界でよく理解されている。

【００２７】 更なる態様において、本発明は、CASB7439ポリヌクレオチドに関する。このよ
うなポリヌクレオチドには、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10ま
たは、配列番号11の全長にわたってそれぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号7
、配列番号10または、配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一
性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一
性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これ
に関して、少なくとも97％の同一性を有するコード化ポリペプチドが一層好まし
いが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより一層好ましく、少なくと
も99％の同一性を有するポリペプチドが最も好ましいものである。

【００２８】 本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号2、配列番号3、配列番号7、
配列番号10または、配列番号11のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に
対して、その全コード領域にわたって、少なくとも70％の同一性、好ましくは少
なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好まし
くは少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された
ポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性を有する
ポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するもの
がより一層好ましく、少なくとも99％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も
好ましいものである。

【００２９】 本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号1、配列番号4、配列番号5、
配列番号6、配列番号8または配列番号9の全長にわたってこれらの配列に対して
、または配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8または、配
列番号9のコード配列の全長にわたって配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列
番号6、配列番号8または配列番号9のコード配列に対して、少なくとも70％の同
一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同
一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含
んでなる単離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも97
％の同一性を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも98〜99％の
同一性を有するものがより一層好ましく、少なくとも99％の同一性を有するポリ
ヌクレオチドが最も好ましいものである。かかるポリヌクレオチドとして、配列
番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8または配列番号9のポリヌ
クレオチドを含んでなるポリヌクレオチドおよび配列番号1、配列番号4、配列番
号5、配列番号6、配列番号8または、配列番号9のポリヌクレオチドまたは配列番
号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8または配列番号9のコード領
域が挙げられる。

【００３０】 本発明はまた、本発明の上記の異種タンパク質をコードする核酸および医療に
おけるその使用を提供する。好ましい実施例においては、医薬組成物において使
用するための異種CASB7439ポリヌクレオチドは、配列番号13（マウス）または配
列番号15（ラット）で表される配列を有する。本発明の単離された異種CASB7439
ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）または二本鎖で
あり、またDNA（ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA）またはRNA分子でありうる。さ
らなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し
てもよいが、必ずしもその必要はない。その他の関連する実施形態において、本
発明は、本明細書で配列番号13または配列番号15として開示される配列と実質的
な同一性を有するポリヌクレオチド変異体を提供する。例えば、本明細書に記載
の方法（例えば、標準的なパラメーターを使用したBLAST分析）を使用して本発
明のポリヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも70％の配列同一性、好ま
しくは少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％もしくは99
％またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド変異体である。関連す
る実施形態においては、本発明の単離された異種ポリヌクレオチドには、配列番
号12または配列番号14の全長にわたって、配列番号12または配列番号14のアミノ
酸配列に対して少なくとも90％、好ましくは95％、およびそれ以上の同一性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または上記の単離されたポリ
ヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列が含まれる。

【００３１】 本発明はまた、上記のポリヌクレオチドのすべてに対する相補的ポリヌクレオ
チドを提供する。

【００３２】 該ポリヌクレオチドは、好適なプラスミド、組換え微生物ベクターまたは組換
え生存微生物に挿入して、免疫に使用することができる（例えば、Wolff et. al
., Science 247 : 1465-1468 （1990） ; Corr et. al., J. Exp. Med. 184 : 1
555-1560 （1996） ; Doe et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 : 8578-8583
（1996）を参照されたい）。したがって、本発明では、本明細書で上記のように
定義したポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたは組換え生存微生物を提供す
る。

【００３３】 また本発明は、被験体に投与された際に配列番号1、配列番号4、配列番号5、
配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号13または配列番号15のポリヌクレ
オチドと同様の免疫原特性を有する、CASB7439ポリヌクレオチドの断片も提供す
る。

【００３４】 また本発明は、前記で定義したCASB7439ポリペプチドの免疫学的断片をコード
するポリヌクレオチドも提供する。

【００３５】 該断片は、配列番号2、配列番号3、配列番号 7、配列番号10、配列番号11、配
列番号12もしくは配列番号14で表されるポリペプチド配列、または配列番号1、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号13もしく
は配列番号15で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド
配列の免疫原性活性のレベルの少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約70％
、より好ましくは少なくとも約90％の免疫原性活性レベルを有する。

【００３６】 本発明のポリペプチド断片には、好ましくは、本明細書に示すポリペプチド組
成物の、少なくとも約5、10、15、20、25、50もしくは100個、またはそれ以上（
すべての中間的長さを含む）の連続したアミノ酸を含む。本明細書に示すポリペ
プチド組成物としては、例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号1
0、配列番号11、配列番号12もしくは配列番号14で表されるもの、または、配列
番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号13
もしくは配列番号15で表されるポリヌクレオチド配列によってコードされるもの
が含まれる。

【００３７】 配列番号1のヌクレオチド配列は、193個のアミノ酸からなる配列番号2のポリ
ペプチドをコードするポリペプチドコード配列（ヌクレオチド545〜1126）を含
むcDNA配列である。配列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は
、配列番号1に含まれるポリペプチドコード配列と同一でもよく、または、配列
番号1に含まれるものとは別の配列であって、遺伝コードの重複（縮重）の結果
として配列番号2のポリペプチドをコードするものでもよい。配列番号2のポリペ
プチドは、achaete scuteファミリーに属する別のタンパク質と構造的に関連が
あり、「ヒトAchaete Scute相同体２(HASH2)」（登録番号NP_005161およびAAB86
993）とも称される。

【００３８】 ヒトAchaete Scute 相同体2（HASH2）遺伝子は、公式にはヒトASCL2（Achaete
Scute複合体様2）と称され、Drosophila AchaeteおよびScute遺伝子の相同体で
ある。ヒトASCL2は、発達中の胎盤の絨毛外栄養膜においてのみ発現し、IGF2お
よびH19に近接した11番染色体上の11p15に位置する。マウスachaete-scute相同
体2遺伝子（MASH2）は、栄養膜の発達にはたらく転写因子をコードする。Mash2
遺伝子はマウスにおいて父親由来としてインプリンティングされ、および良性の
胞状奇胎（雄性発生）においてヒトASCL2の発現が欠失していることは、ヒトAsc
l2もまた男性においてインプリンティングされることを示している。

【００３９】 Ascl2遺伝子は、転写因子の標準的なへリックス-ループ-へリックス（BHLH）
ファミリーのメンバーである。これらはEボックス（5'-CANNTG-3'）に結合する
ことによって転写を活性化する。DNAへの効率的な結合のためには、その他のBHL
Hタンパク質との二量体化が必要とされる。これらはキイロショウジョウバエの
末梢神経系および中枢神経系において神経前駆体の決定に関与するが、これはお
そらく、哺乳動物においても同様である。

【００４０】 配列番号1のヌクレオチド配列の相補鎖は、配列番号6のポリヌクレオチド配列
である。この鎖もまた、他の二つのポリペプチドコード配列を含む。第１のポリ
ペプチドコード配列（配列番号1のヌクレオチド1184〜399、配列番号6のヌクレ
オチド608〜1393）は、262アミノ酸からなる配列番号3のポリペプチドをコード
する。第２のポリペプチドコード配列（配列番号1のヌクレオチド840〜262、配
列番号6のヌクレオチド952〜1530）は、193アミノ酸からなる配列番号11のポリ
ペプチドをコードする。配列番号3および配列番号11のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列は、配列番号6に含まれるポリペプチドコード配列と同一で
あってもよく、配列番号6に含まれるのとは別の配列であるが遺伝コードの重複
（縮重）の結果として配列番号3および11のポリペプチドをコードするものでも
よい。配列番号3のポリペプチドは、スプライシングコアクチベータータンパク
質ファミリーに属するその他のタンパク質と構造的に関連しており、ホモサピエ
ンス・スプライシングコアクチベーターサブユニットsrm300（genbank accessio
n AAF21439）との間で相同性および/または構造的類似性を有する。配列番号11
のポリペプチドは、公知タンパク質のいずれとも関連していない。配列番号3お
よび配列番号11に表されるポリペプチド配列、ならびに配列番号6に表されるポ
リヌクレオチド配列は、新規な配列であり、本発明の一部を構成する。

【００４１】 本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチド、免疫学的断片および
ポリヌクレオチドは配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号11のいず
れかの少なくとも１つの適当な活性を適宜有する。

【００４２】 また、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号11の全長
配列の決定に先立って最初に同定された部分的またはそれ以外の不完全なそれら
に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関する。

【００４３】 したがって、更なる態様において、本発明は以下： （ａ）配列番号４および５の全長にわたって配列番号４および５のヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、
より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同
一性、最も好ましくは97〜99％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる
単離されたポリヌクレオチド、 （ｂ）配列番号4および５の全長にわたってそれぞれ配列番号1または６のヌク
レオチド配列に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同
一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95
％の同一性、最も好ましくは97〜99％の同一性を有するヌクレオチド配列を有す
る単離されたポリヌクレオチド、 （ｃ）配列番号4および５の単離されたポリヌクレオチド、または （ｄ）配列番号２および７の全長にわたってそれぞれ配列番号２および７のア
ミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一
性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％
の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有するポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド、 ならびに配列番号4および５のポリヌクレオチド、を提供する。

【００４４】 本発明は、さらに以下のポリペプチドを提供する： （ａ）配列番号2または７の全長にわたって配列番号2または７のアミノ酸配列
に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好
ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、
最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペ
プチド、 （ｂ）配列番号2または７の全長にわたって配列番号2または７のアミノ酸配列
に対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好
ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、
最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、 （ｃ）配列番号2または７のアミノ酸を含むポリペプチド、および （ｄ）配列番号7のポリペプチド、 ならびに、配列番号4および５の配列に含まれる配列を含むポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチド。

【００４５】 本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技
術により、ヒト大腸癌の細胞中のmRNAから誘導されたcDNAライブラリーから得る
ことができる(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory ManuaL 2
nd Ed． Cold Spring harbor Laboratory Press. Cold Spring harbor, N.Y.(19
89)を参照されたい)。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムDNAライブラリ
ーのような天然源から得ることができ、市販されている周知の技術を用いて合成
することもできる。

【００４６】 本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ−またはプロ−ま
たはプレプロ−タンパク質配列、もしくは他の融合ペプチド部分をコードする配
列）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含ま
れる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ
得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、pQEベクタ
ー（Qiagen, Inc.）により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
（1989） 86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、また
はＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例
えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シ
グナル、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化配列を含んでいてもよい。

【００４７】 本発明の更なる具体例としては、数個、例えば５〜１０個、１〜５個、１〜３
個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付
加されている、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号11、配列番号13ま
たは配列番号15のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコードするポ
リヌクレオチドがある。

【００４８】 配列番号1または配列番号6に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に
同一であるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする全長cDNAお
よびゲノムクローンを単離するために、また、配列番号1または配列番号6に対し
て高い配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト起源のパラログ体（paralog）なら
びにヒト以外の種に由来するオーソログ体（ortholog）およびパラログ体をコー
ドする遺伝子を含む）のcDNAおよびゲノムクローンを単離するために、cDNAおよ
びゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（PCR
）反応用のプライマーとして用いることができる。一般的に、これらのヌクレオ
チド配列は基準のヌクレオチド配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90
％、最も好ましくは95％同一である。プローブまたはプライマーはたいてい１５
個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌク
レオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌ
クレオチドを有するものである。特に好ましいプライマーは２０〜２５個の範囲
のヌクレオチドを有するものである。特に、近縁な動物起源からの配列に由来す
るポリペプチドまたはポリヌクレオチドを免疫原として使用して、ヒトの遺伝子
に対する交差反応性免疫応答を得ることができる。

【００４９】 本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体を含む）をコードする
ポリヌクレオチドは、配列番号1または配列番号6の配列またはその断片を有する
標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適
当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を含む全長cDNA
およびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる方法により得られる。この
ようなハイブリダイゼーション技法は当業者に周知である。好ましいストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件は、50％ ホルムアミド、５×SSC （150mM
NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム） 、50mMリン酸ナトリウム （pH7.6）、５
×Denhardt溶液、10％ デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサケ
精子DNAを含有する溶液中４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを
0.1×SSC 中約６５℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列番号1ま
たは配列番号6の配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニン
グすることにより得られるポリヌクレオチドをも包含する。

【００５０】 当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域が
そのcDNAの5'末端で短く切断されることから、単離されたcDNA配列は不完全であ
るだろう。

【００５１】 完全長cDNAを得るための、または短鎖cDNAを伸長させるための、当業者に周知
で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、cDNA末端高速増幅法（RACE）に基づ
いた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988を参照の
こと）。例えばMarathon^TM技術（Clontech Laboratories Inc.）により示される
ような、上記技法の最近の改良により、より長いcDNAの検索が大いに簡便化され
た。Marathon^TM技術では、所定の組織より抽出されたmRNAからcDNAを作製し、各
末端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝子特異的およびアダプター
特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて核酸増幅（PCR）を行
い、cDNAの「欠失」5'末端を増幅する。次に、「ネステッド（nested）」プライ
マー、すなわち増幅産物の内部にアニールするように設計されたプライマー（典
型的には、アダプター配列のさらに3'側にアニールするアダプター特異的プライ
マーおよび既知遺伝子配列のさらに5'側にアニールする遺伝子特異的プライマー
）を用いてPCR反応を繰り返す。その後、この反応の産物をDNA塩基配列決定によ
り解析し、この産物を既存のcDNAに直接結合して完全な配列とするか、または5'
プライマー設計用の新たな配列情報を用いて別の全長PCRを行うことにより、全
長cDNAを構築することができる。

【００５２】 本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で周知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現系、該発現系に
より遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの
生産に関する。本発明のDNA構築物から誘導されたRNAを用いてこの種のタンパク
質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。

【００５３】 組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作する。宿主細胞へのポリヌクレオチドの
導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology （1986） および Samb
rookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Har
bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （1989） などの多くの標準
的な実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適なこうし
た方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、
マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレク
トロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾
丸導入（ballistic introduction）または感染などがある。

【００５４】 好ましくは、本発明のタンパク質をトランス型チオレドキシン（thioredoxin
in trans：TIT）と共発現させる。プロテアーゼを必要とすること無しに、抗原
をチオレドキシンの無い状態に維持するためには、シス型よりもトランス型のチ
オレドキシンを共発現させることが好ましい。チオレドキシンの共発現は本発明
のタンパク質の可溶化を容易にする。また、チオレドキシンの共発現はタンパク
質の精製収率、精製されたタンパク質の溶解性および品質に重大な影響を与える
。

【００５５】 適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス）、昆虫細胞（例：ショウジョウバエＳ２、スポドプテラＳｆ９）
、動物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ
293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。

【００５６】 多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、例えば、
染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バ
クテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由
来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４０の
ようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバ
クテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を
起こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。一般的に、
宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発
現することができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual （前掲） に記載されるような、日常的に用
いられる周知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入
することができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、ま
たは細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチ
ドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内
因性であっても、異種シグナルであってもよい。

【００５７】 また、前記発現系はウイルスまたは細菌等の組換え生存微生物であってもよい
。目的とする遺伝子を組換え生ウイルスまたは細菌のゲノム内に挿入することが
できる。この生ベクターを用いての接種またはin vivo感染により、抗原のin vi
vo発現および免疫応答の誘導がもたらされる。

【００５８】 したがって、ある実施形態においては、本発明の免疫原性ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを、多くの公知のウィルスに基づく系のうちのいずれか
を利用して、発現のための好適な哺乳動物宿主細胞に導入する。ある例示的な実
施形態においては、レトロウィルスが、遺伝子送達系のための便宜かつ効果的な
プラットフォームを提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌ
クレオチド配列を、当技術分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入し、レ
トロウィルス粒子にパッケージできる。続いて、組換えウィルスを単離して被験
体に送達することができる。レトロウィルス系の多くの例が記載されている（例
えば、米国特許第5,219,740号 ; Miller and Rosman （1989） BioTechniques 7
: 980-990 ; Miller, A. D. （1990） Human Gene Therapy 1 : 5-14 ; Scarpa
et al. （1991） Virology 180 : 849-852 ; Burns et al. （1993） Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 90 : 8033-8037 ;およびBoris-Lawrie and Temin （1993）
Cur. Opin Genet. Develop. 3 : 102-109）。

【００５９】 さらに、アデノウィルスに基づく系の多くの例もまた記載されている。宿主ゲ
ノムに組み込むレトロウィルスと異なり、アデノウィルスは染色体外に保持され
る。そのため挿入による突然変異誘発に伴うリスクは最小化される（Haj-Ahmad
and Graham （1986） J. Virol. 57 : 267-274 ; Bett et al. （1993） J. Vir
ol. 67 : 5911-5921 ; Mittereder et al. （1994） Human Gene Therapy 5 : 7
17-729 ; Seth et al. （1994） J. Virol. 68 : 933-940 ; Barr et al. （199
4） Gene Therapy 1 : 51-58 ; Berkner, K. L.（1988） BioTechniques 6 : 61
6-629 ; and Rich et al. （1993） Human Gene Therapy 4 : 461-476）。

【００６０】 種々のアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達
のために開発された。AAVベクターは、当技術分野で周知の技術を用いて容易に
構築することができる。例えば、米国特許第5,173,414号および第5,139,941号;
国際公開WO 92/01070およびWO 93/03769 ; Lebkowski et al. （1988） Molec.
Cell. Biol. 8 : 3988-3996 ; Vincent et al. （1990） Vaccines 90 （Cold S
pring Harbor Laboratory Press） ; Carter,B. J. （1992） Current Opinion
in Biotechnology 3 : 533-539 ; Muzyczka, N. （1992） Current Topics in M
icrobiol. and Immunol. 158 : 97-129 ; Kotin, R. M. （1994） Human Gene T
herapy 5 : 793-801 ; Shelling and Smith （1994） Gene Therapy 1 : 165-16
9 ;およびZhou et al. （1994） J. Exp. Med. 179 : 1867-1875を参照されたい
。

【００６１】 遺伝子導入によって本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を送達するた
めに有用な更なるウィルスベクターには、ポックスファミリーのウィルス、例え
ば、ワクシニアウィルスおよび鳥類ポックスウィルスに由来するものが含まれる
。例えば、新規分子を発現するワクシニアウィルス組換え体は、以下のように構
築することができる。まず、ポリペプチドをコードするDNAを、ワクシニアプロ
モーターに隣接し、かつワクシニアDNA配列（例えば、チミジンキナーゼ（TK）
をコードする配列）に近接するように、好適なベクターに挿入する。続いてこの
ベクターを使用して、ワクシニアに同時に感染させた細胞をトランスフェクトす
る。相同組換えは、ワクシニアプロモーターと目的のポリペプチドをコードする
遺伝子とをウィルスゲノムに挿入するのに役立つ。得られたTK.sup.（-）組換え
体は、該細胞を5-ブロモデオキシウリジンの存在下で培養し、これに耐性のウィ
ルスプラークを採取することによって選択できる。

【００６２】 ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系を使用して、本明細書に記
載した一種以上のポリペプチドの、生物宿主細胞における誘導可能な、一過性の
発現または共発現をうまく実施できる。この特定の系においては、まず細胞を、
in vitroで、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウ
ィルス組換え体に感染させる。このポリメラーゼは、T7プロモーターを担持する
鋳型のみを転写するという点において、高度の特異性を有する。感染に続き、細
胞をT7プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェ
クトする。細胞質内でワクシニアウィルス組換え体から発現したポリメラーゼは
、トランスフェクトされたDNAをRNAに転写し、該RNAは続いて宿主の翻訳機構に
よってポリペプチドに翻訳される。この方法によって、大量のRNAおよびその翻
訳産生物が高レベルで、一過性でかつ細胞質内において産生される。例えば、El
roy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1990） 87 : 6743-6747 ;
Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1986） 83 : 8122-8126を参照
されたい。

【００６３】 あるいは、アビポックスウイルス、例えば、鶏痘ウィルスおよびカナリアポッ
クスウィルスを使用して、目的のコード配列を送達することもできる。哺乳動物
病原体に由来する免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、鶏以外の種
に投与すると、防御免疫をもたらすことが知られている。アビポックスベクター
の使用は、ヒトおよびその他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、ア
ビポックス属のメンバーは感受性の鶏種においてのみ増殖的に複製でき、したが
って、哺乳動物細胞においては感染性ではないからである。組換えアビポックス
ウィルスを生産する方法は、当技術分野で公知であり、ワクシニアウィルスの生
産に関してすでに述べたように、遺伝子組換えを使用する。WO 91/12882 ; WO 8
9/03429 ; およびWO 92/03545を参照されたい。

【００６４】 多くのαウィルスベクターのうちの任意のものを、本発明のポリヌクレオチド
組成物の送達のために使用できる。例えば、米国特許第5,843,723号;第6,015，6
86 号; 第6,008,035号および第6,015,694号に記載されたベクターなどである。V
enezuelan Equine Encephalitis （VEE）に基づく特定のベクターを使用するこ
ともでき、その例は、米国特許第5,505,947号および第5,643,576号に見ることが
できる。

【００６５】 さらに、分子結合ベクター、例えば、アデノウィルスキメラベクター（Michae
l et al. J. Biol. Chem. （1993） 268 : 6866-6869およびWagner et al. Proc
. Natl. Acad. Sci. USA （1992） 89 : 6099-6103に記載）を本発明における遺
伝子送達に使用することもできる。

【００６６】 これらのおよびその他の公知のウィルスに基づく送達系についての情報の更な
る例は、例えば、Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 317-
321, 1989 ; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989 ; Fle
xner et al., Vaccine 8 : 17-21, 1990 ;米国特許第4,603,112号、第4,769,330
号および第5,017,487号; WO 89/01973 ;米国特許第4,777,127号; GB 2,200,651
; EP 0,345,242 ; WO 91/02805 ; Berkner, Biotechniques 6 : 616-627, 1988
; Rosenfeld et al., Science 252 : 431-434, 1991 ; Kolls et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91 : 215-2l9, 1994 ; Kass-Eisler et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90 : 11498-11502, 1993 ; Guzman et al., Circulation 88 :
2838-2848, 1993 ;およびGuzman et al., Cir. Res. 73 : 1202-1207, 1993に見
ることができる。

【００６７】 上記の組換え生存微生物は、有毒であってもよく、または生ワクチンを得るた
めの種々の方法によって弱毒化されていてもよい。このような生ワクチンもまた
本発明の一部を構成する。

【００６８】 ある実施形態においては、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込んで
もよい。この組込みは、相同組換えによって特定の位置および配向となるように
行ってもよく（遺伝子の置換）、またはランダムに非特異的な位置に対して行っ
てもよい（遺伝子の増加）。更に別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは
、分離したエピソームDNAセグメントとして、細胞中に安定に維持することがで
きる。このようなポリヌクレオチドセグメントまたは「エピソーム」は、宿主細
胞周期から独立したまたはこれと同期した維持および複製を可能にするのに十分
な配列をコードする。発現構築物を細胞に送達する方法および細胞中でポリヌク
レオチドが維持される場所は、使用する発現構築物のタイプに依存する。

【００６９】 本発明の別の実施形態においては、ポリヌクレオチドを「裸の」DNAとして投
与／送達する。これについては、例えば、Ulmer et al., Science 259 1745-174
9, 1993およびCohenによるレビュー, Science 259:1691-1692, 1993に記載され
ている。裸のDNAの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズにDNA
をコーティングすることにより増加させることができる。

【００７０】 また別の実施形態においては、本発明の組成物を粒子衝撃法によって送達する
ことができ、このような方法の多くが記載されている。１つの例示的実施例にお
いては、ガスによる粒子加速は、Powderject Pharmaceuticals PLC （Oxford, U
K）およびPowderject Vaccines Inc. （Madison, WI）によって製造された装置
などによって実施できる。これらのいくつかの例が、米国特許第5,846,796号;第
6,010,478号;第5,865,796号;第5,584,807号;およびEP特許第0500 799号に記載さ
れている。このような方法は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド粒子などの
微細粒子の乾燥粉末製剤を、手で持てる大きさの装置によって生成されるヘリウ
ムガスジェット内で高速に加速し、該粒子を目的の標的組織内に推進させること
を特徴とする、針を用いない送達法を提供する。

【００７１】 関連する実施形態において、本発明の組成物の針を使わないガスによる注入に
有用でありうるその他の装置および方法には、Bioject, Inc. （Portland, OR）
によって提供されるものが含まれる。そのいくつかの例が、米国特許第4,790,82
4号;第5,064,413号;第5,312,335号;第5,383,851号;第5,399,163号;第5,520,639
号および第5,993,412号に記載されている。

【００７２】 組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、イオン金属アフィニティークロマトグラフィー（
ion metal affinity chromatography:IMAC）が精製に用いられる。ポリペプチド
が細胞内合成、単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を再
生させるための周知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元する
ことが可能である。

【００７３】 本発明の別の重要な態様は哺乳動物において免疫学的応答を誘導、増強または
モジュレートする方法に関するものであり、この方法は、癌、特に結腸直腸癌お
よび自己免疫疾患および関連病態の予防または治療的処置のための抗体および／
またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明の断片または全長ポリヌクレオ
チドもしくはポリヌクレオチドを、哺乳動物に接種することを含んでなる。本発
明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患からの予防または治療のための免疫
応答を生じさせるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo で本発明のポ
リペプチドをコードし、該ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターまたは細
胞を介して、本発明のポリペプチドを送達することを含んでなる、哺乳動物にお
いて免疫学的応答を誘導、増強またはモジュレートする方法に関する。

【００７４】 本発明の更なる態様は、免疫学的／ワクチン製剤（組成物）および医療におけ
るその使用に関する。この組成物は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動
物において本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を誘導、増強またはモジ
ュレートし、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは上記で定義
したその免疫原性断片を含有する。特に、本発明の免疫原性組成物は、安全かつ
有効な量のCASB7439ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含み、ここでCASB74
39ポリペプチドは、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号1
1、配列番号12または配列番号14からなる群から選択される。別の実施形態にお
いては、免疫原性組成物は、安全かつ有効な量のCASB7439コードポリヌクレオチ
ドまたはその断片を含み、ここで、CASB7439コードポリヌクレオチドは、配列番
号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号13ま
たは配列番号15からなる群から選択される。

【００７５】 本発明のワクチン製剤は適当な（すなわち、薬学上許容しうる）担体をさらに
含んでいてもよい。ポリペプチドは胃の中で分解される可能性があるので、非経
口的に（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射により）投与することが
好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およ
びこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌
注射液、ならびに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁
液がある。こうした製剤は１回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプル
およびバイアル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添
加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもできる。

【００７６】 本発明の更なる態様は、本発明の断片または完全なポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、あるいは本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含む
分子に対する免疫応答を、哺乳動物の免疫系からの細胞を使用してin vitroで誘
導し、前記哺乳動物のこれらの活性化された免疫細胞を疾病の治療のために再注
入することに関する。免疫系からの細胞の活性化は、本発明の完全なポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチドを含む分子と共に種々の免疫モジュレーター分子の存在下または不在下で
in vitroにてインキュベートすることにより達成される。本発明の更なる態様は
、本発明の部分もしくは完全なポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含む
分子をin vitroで供給することにより改変した抗原提示細胞の投与による哺乳動
物の免疫化、ならびに免疫原性による方法にてin vivo投与することによる前記
免疫化に関する。あるいは、抗原提示細胞を本発明の断片もしくは完全なポリヌ
クレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む分子を含有するベクターでin
vitroでトランスフェクトして、対応するポリペプチドを発現させることができ
、さらに免疫原性的方法でin vivoにて投与することができる。したがって、本
発明の医薬組成物は、CASB7439ポリペプチドをin vitroで負荷することによって
改変した、またはCASB7439ポリペプチドを発現するようにin vitroで改変した抗
原提示細胞の有効量、および薬学的に有効な担体を含有することになる。

【００７７】 別の実施形態によると、本明細書に記載の薬学的／免疫原性組成物は、本発明
の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、T細胞および/または抗原提
示細胞（APC）組成物に加えて、１種以上の免疫賦活剤を含む。したがって、本
発明においては、前記免疫原性組成物を製造するための方法であって、CASB7439
ポリペプチドまたはCASB7439コードポリヌクレオチドと好適なアジュバント／免
疫賦活剤、希釈剤又その他の薬学的に許容される担体とを混合することを含む方
法を提供する。免疫賦活剤とは、外因性抗原に対する免疫応答（抗体および/ま
たは細胞が媒介するもの）を増強するかまたは強化する本質的に任意の物質をい
う。好ましいタイプの免疫賦活剤の１つには、アジュバントが含まれる。多くの
アジュバントが、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、例
えば、水酸化アルミニウムまたはミネラルオイル、ならびに免疫応答刺激物質、
例えば、リピドA、百日咳菌または、結核菌に由来するタンパク質を含む。特定
のアジュバントは、例えば、Freundの不完全アジュバントおよび完全アジュバン
ト（Difco Laboratories, Detroit, MI） ; Merck Adjuvant 65 （Merck and Co
mpany, Inc., Rahway, NJ） ; AS-2 （SmithKline Beecham, Philadelphia, PA
）;水酸化アルミニウムゲル（alum）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニ
ウム塩; カルシウム、鉄または亜鉛の塩;アシル化チロシンの不溶性懸濁液;アシ
ル化糖;カチオン化またはアニオン化するように誘導体化した多糖;ポリホスファ
ゼン;生分解性微小球;モノホスホリルリピドAおよびquil Aなどとして、市販の
ものが入手可能である。GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12などのサイトカ
インおよびその他同様の増殖因子もまた、アジュバントとして使用できる。

【００７８】 本発明のある実施形態においては、アジュバント組成物は、好ましくは、主に
Th1型の免疫応答を誘導するものである。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば
IFN-γ、TNFα、IL-2およびIL-12）は、投与された抗原に対して細胞介在性の免
役応答を誘導しやすい傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン（
例えば、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-10）は、体液性免疫応答を誘導しやすい傾
向がある。本発明において提供されるようなワクチンを適用した後、患者は、Th
l-およびTh2-型の応答を含む免役応答を示すことになる。応答が主にTh1型であ
るような好ましい実施形態においては、Th1型サイトカインのレベルが、Th2型サ
イトカインよりも大幅に増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的な
アッセイを用いて容易に評価できる。サイトカインのファミリーを調べるために
は、Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7 : 145-173, 1989を参照され
たい。

【００７９】 Th1型応答を優先的に誘導するための特定の好ましいアジュバントには、例え
ば、モノホスホリルリピドA、好ましくは3-de-O-アシル化モノホスホリルリピド
Aとアルミニウム塩との組合せが含まれる。MPL（登録商標）アジュバントはCori
xa Corporationから入手できる（Seattle, WA ;例えば、米国特許第4,436,727号
;第4,877,611号;第4,866,034号および第4,912,094号を参照されたい）。CpG含有
オリゴヌクレオチド（CpGジヌクレオチドが脱メチル化されている）もまた、Th1
応答を優先的に誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば
、WO 96/02555、WO 99/33488および米国特許第6,008,200号および第5,856,462号
に記載されている。免役賦活DNA配列もまた、例えば、Sato et al., Science 27
3 : 352, 1996に記載されている。別の好ましいアジュバントには、サポニン、
例えばQuil Aまたはその誘導体、例えば、QS21およびQS7（Aquila Biopharmaceu
ticals Inc., Framingham, MA） ;Escin;Digitonin ;またはカスミソウ（Gypsop
hila）もしくはアカザ（Chenopodium quinoa）サポニンが含まれる。その他の好
ましい製剤においては、本発明のアジュバントの組み合わせに、１種以上のサポ
ニン、例えば、QS21、QS7、Quil A、β-エスシンまたはジギトニンを含む群の少
なくとも２種の組合せが含まれる。

【００８０】 あるいは、サポニン製剤は、キトサンまたはその他のポリカチオン性ポリマー
、ポリラクチドおよびポリラクチド-グリコリドコポリマー粒子、ポリ-N-アセチ
ルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖もしくは化学修飾された多
糖からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステ
ルからなる粒子などから構成されるワクチンビヒクルと組み合わせてもよい。サ
ポニンはまた、コレステロールの存在下で製剤化して、リポソームまたはISCOM
などの粒子構造を形成することができる。さらに、サポニンはポリオキシエチレ
ンエーテルまたはエステルとともに、非粒子性溶液もしくは懸濁液中、または少
量膜(paucilamelar)リポソームもしくはISCOMのような粒子構造中に、製剤化す
ることができる。サポニンはまた、Carbopol（登録商標）などの賦形剤とともに
製剤化して、粘度を高めてもよく、また、ラクトースなどの粉末賦形剤とともに
乾燥粉末形態で製剤化してもよい。

【００８１】 ある好ましい実施形態では、アジュバント系には、モノホスホリルリピドAと
サポニン誘導体の組合せ、例えば、WO 94/00153に記載されたようなQS21と3D-MP
L（登録商標）アジュバントの組合せまたはWO 96/33739に記載されたようなQS21
がコレステロールでクエンチされた反応性の低い組成物が含まれる。その他の好
ましい製剤には、水中油型乳剤およびトコフェロールが含まれる。水中油型乳剤
中でQS21、3D-MPL（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する別
の特に好ましいアジュバント製剤がWO 95/17210に記載されている。

【００８２】 別の増強されたアジュバント系には、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン
誘導体の組合せ、特にWO 00/09159に開示されたCpGとQS21の組合せが含まれる。 好ましくは、該製剤はさらに水中油型乳剤およびトコフェロールを含む。

【００８３】 本発明の医薬組成物において使用するための更なるアジュバント例には、Mont
anide ISA 720 （Seppic, France）、SAF （Chiron, California, United State
s）、ISCOMS （CSL）、MF-59 （Chiron）、アジュバントのSBASシリーズ（例え
ば、SBAS-2またはSBAS-4、SmithKline Beecham, Rixensart, Belgiumから入手可
能）、Detox （Enhanzyn（登録商標）） （Corixa, Hamilton, MT）、RC-529 （
Corixa, Hamilton, MT）およびその他のアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフ
ェート （AGP）、係属中の米国特許出願第08/853, 826号および第09/074,720号
に記載されたもの（これらの開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる
ものとする）、およびポリオキシエチレンエーテルアジュバント（例えば、WO 9
9/52549A1に記載されたもの）が含まれる。

【００８４】 その他の好ましいアジュバントには、一般式（I）： HO（CH₂CH₂O）_n-A-R ［式中nは1〜50であり、Aは結合または-C(O)-であり、RはC_1-50アルキルまたは
フェニルC_1-50アルキルである］ で表されるアジュバント分子が含まれる。

【００８５】 本発明の一実施形態は、一般式（I）のポリオキシエチレンエーテルを含むワ
クチン製剤からなり、但し、式中ｎは1〜50、好ましくは4〜24、最も好ましくは
９であり、R成分はC_1-50、好ましくはC₄-C₂₀アルキルであり、最も好ましくはC_{1 2} アルキルであり、Aは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、0.1
〜20％、好ましくは0.1〜10％、最も好ましくは0.1〜1％の範囲にあるべきであ
る。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオ
キシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-9-ステオリルエーテル
、ポリオキシエチレン-8-ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン-4-ラウリル
エーテル、ポリオキシエチレン-35-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレ
ン-23-ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキ
シエチレンエーテル類は、Merck index （第12版: entry 7717）に記載されてい
る。これらのアジュバント分子は、WO 99/52549に記載されている。

【００８６】 上記の一般式（I）のポリオキシエチレンエーテルは、所望により、別のアジ
ュバントと組み合わせてもよい。例えば、好ましいアジュバントの組合せは、好
ましくは、係属中の英国特許出願GB 9820956.2.に記載されているCpGとの組合せ
である。

【００８７】 好ましくは、本発明のワクチン組成物中に担体も存在する。前記担体は水中油
型エマルジョンであっても、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム等の
アルミニウム塩であってもよい。

【００８８】 好ましい水中油型エマルジョンは代謝可能な油、例えばスクアレン、α-トコ
フェロールおよびTween80を含む。特に好ましい態様では本発明のワクチン組成
物中の抗原をそのようなエマルジョン中でQS21および3D-MPLと組み合わせる。更
に、前記水中油型エマルジョンはスパン85および／またはレシチンおよび／また
はトリカプリリンを含んでいてもよい。

【００８９】 通常、ヒトへの投与の場合は、QS21および3D-MPLは投与量あたり1〜200μgの
範囲内、例えば10〜100μg、好ましくは10〜50μgの範囲内でワクチン中に存在
する。通常、水中油型エマルジョンは、2〜10％のスクアレン、2〜10％のα-ト
コフェロールおよび0.3〜3％のTween80を含む。好ましくは、スクアレン：α-ト
コフェロール比は１以下であり、これによってより安定なエマルジョンが提供さ
れる。また、スパン85は１％という濃度で存在しうる。幾つかの場合、本発明の
ワクチンが更に安定化剤を含むことが有益であろう。

【００９０】 毒性の無い水中油型エマルジョンは、好ましくは、毒性の無い油（例えばスク
アランもしくはスクアレン）、または乳化剤（例えばTween80）を水性担体中に
含む。前記水性担体は、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水でありうる。

【００９１】 水中油型エマルジョン中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に有効
なアジュバント製剤はWO95/17210に記載されている。

【００９２】 また本発明は、本発明のワクチン製剤を他の抗原、特に癌、より詳細には、結
腸直腸癌、自己免疫疾患および関連病態の治療に有用な抗原と組み合わせて含む
多価ワクチン組成物を提供する。そのような多価ワクチン組成物は前記のTH1誘
導性アジュバントを含みうる。

【００９３】 本発明のまた別の実施形態によると、本明細書に記載の免疫原性組成物は、抗
原提示細胞(APC)、例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球および効果
的なAPCとすべく遺伝子操作することができるその他の細胞を介して宿主に送達
される。このような細胞は、遺伝子改変を行って、抗原提示能を増加させたり、
T細胞応答の活性化および/または維持性を改良したり、それ自体に抗腫瘍活性を
担持させたり、および/または受容者と免疫学的に適合（すなわち、HLAハプロタ
イプを一致）させたりすることができるが、これらは必ずしも必要ではない。AP
Cは、通常、様々な体液および臓器（腫瘍組織および腫瘍周辺組織を含む）のう
ちの任意のものから単離でき、自己由来、同種異系、同系または異種の細胞であ
ってよい。

【００９４】 本発明のある好ましい実施形態では、抗原提示細胞として、樹状細胞またはそ
の前駆細胞を使用する。樹状細胞は、かなり強力なAPCであり（Banchereau and
Steinman, Nature 392 : 245-251, 1998）、 予防的または治療的な抗腫瘍免疫
を引き起こすための生理的アジュバントとして有効であることが示されている（
Timmerman and Levy, Ann Rev. Med. 50 : 507-529, 1999を参照されたい）。一
般に、樹状細胞はその典型的な形状（in situで星形であり、in vitroで認識可
能な目立った細胞質突起（樹状突起）を有する）、非常に効率的に抗原を取り込
み、処理し、そして提示するその能力、およびナイーブなT細胞の応答を活性化
するその能力、に基づいて同定することができる。樹状細胞は当然、遺伝子操作
することにより、通常in vivoまたはex vivoで樹状細胞上には見られない特定の
細胞表面受容体またはリガンドを発現させることができ、このように改変された
樹状細胞は本発明に包含される。樹状細胞のかわりに、分泌小胞抗原負荷樹状細
胞（エキソソームと称される）をワクチン中に使用してもよい（Zitvogel et al
., Nature Med. 4 : 594-600, 1998を参照されたい）。

【００９５】 樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、浸潤性腫瘍細胞、腫瘍周辺組織浸
潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または、任意のその他の好適な組織また
は体液から得ることができる。例えば、樹状細胞は、GM-CSF、IL-4、IL-13およ
び/またはTNFαなどのサイトカインの組合せを、末梢血から採取した単球の培養
物に添加することによってex vivoで分化させることができる。あるいは、末梢
血、臍帯血または骨髄から採取したCD34陽性細胞は、その培養培地に、GM-CSF、
IL-3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンドおよび/または樹状細胞の分化
、成熟および増殖を引き起こすその他の化合物の組合せを添加することによって
、樹状細胞に分化させることができる。

【００９６】 樹状細胞は、便宜に、「未成熟」細胞と「成熟」細胞とに分類され、これによ
って２種の十分に特徴づけられる表現型を簡単に区別することができる。しかし
、この用語は、分化における可能性あるすべての中間的段階を排除するように解
釈すべきでない。未成熟樹状細胞は抗原の取り込みおよび処理についての高い能
力を有するAPCとして特徴づけられ、その能力はFcγ受容体およびマンノース受
容体の高度な発現と関連する。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーの
発現は低いが、T細胞活性化の原因となる細胞表面分子、例えば、クラスIおよび
クラスII MHC、接着分子（CD54およびCD11など）および同時刺激分子（CD40、CD
80、CD86および4-1BBなど）の発現は高いことによって特徴づけられる。

【００９７】 APCは、通常は、本発明のポリヌクレオチド（またはその一部もしくはその変
異体）によってトランスフェクトして、コードされたポリペプチドまたはその免
疫原性部分を細胞表面上に発現させることができる。このようなトランスフェク
ションはex vivoで実施でき、このようなトランスフェクト細胞を含む医薬組成
物は、本明細書に記載するように、治療目的で使用できる。あるいは、樹状細胞
またはその他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを患者に投与する
ことができ、これによってin vivoでトランスフェクションが起こる。In vivoお
よびex vivoにおける樹状細胞のトランスフェクションは、例えば、一般的には
、WO 97/24447に記載されているもの、またはMahvi et al., Immunology and ce
ll Biology 75 : 456-460, 1997に記載の遺伝子銃法など、当技術分野で公知の
任意の方法を使用して実施することができる。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞
または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、DNA（裸のまたはプラスミドベクター中
の）もしくはRNAとともに、または抗原を発現する組換え細菌もしくはウィルス
（例えば、ワクシニアウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルスまたはレンチウ
ィルスベクター）とともに、インキュベートすることによって、達成できる。負
荷の前に、該ポリペプチドは、T細胞の寄与をもたらす免疫学的パートナー（例
えば、担体分子）に共有結合させてもよい。あるいは、樹状細胞を、該ポリペプ
チドとは別にまたは該ポリペプチドの存在下で、結合されていない免疫学的パー
トナーとともに間欠的に投与してもよい。

【００９８】 当技術分野の当業者に公知の好適な担体のうち任意のものを、本発明の医薬組
成物に使用することができ、担体の種類は典型的には投与方法に依存して異なる
。本発明の組成物は任意の好適な投与方法、例えば、局所投与、経口投与、経鼻
投与、粘膜投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与および筋内投与
用に、製剤化することができる。

【００９９】 このような医薬組成物において使用するための担体は生体適合性であり、生分
解性であってもよい。特定の実施形態においては、上記製剤は、好ましくは、比
較的一定レベルの活性成分の放出をもたらす。しかし、別の実施形態では、投与
後すぐのより急速な放出が望まれる場合もある。このような組成物の製剤化は、
公知の技術を用いる当業者のレベルの範囲に十分入る。ここで有用な担体の例に
は、ラクチド-グリコリドコポリマー、ポリアクリレート、ラテックス、デンプ
ン、セルロース、デキストラン、などの微小粒子が含まれる。その他の遅延放出
担体の例としては、非液状親水性コア（例えば、架橋多糖またはオリゴ糖）およ
び、場合により、リン脂質などの両親媒性化合物を含む外層（米国特許第5,151,
254号およびPCT出願WO 94/20078、WO/94/23701およびWO 96/06638を参照された
い）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。持続放出製剤に含まれる活性化
合物の量は、移植する部位、放出速度および期待される放出持続時間ならびに治
療または予防すべき症状の性質に依存する。

【０１００】 別の例示的実施形態では、生分解性微小球（例えば、ポリラクテート ポリグ
リコレート）を、本発明の組成物のための担体として使用する。好適な生分解性
微小球は、例えば、米国特許第4,897,268号；第5,075,109号；第5,928,647号；
第5,811,128号；第5,820,883号；第5,853,763号；第5,814,344号；第5,407,609
号および第5,942,252号に開示されている。改変型B型肝炎コアタンパク質担体系
、例えば、WO/99 40934およびそこで引用される文献に記載されるようなものも
また、多くの適用に対して有用である。別の例示的な担体／送達系は、宿主にお
いてクラスI拘束型細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導することができる、粒子状タ
ンパク質複合体を含む担体（例えば、米国特許第5,928,647号に記載されるよう
なもの）を使用する。

【０１０１】 本発明の医薬組成物は、１種以上のバッファー（例えば、中性緩衝生理食塩水
またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、
スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドま
たはアミノ酸（グリシンなど）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（EDTAなど）ま
たはグルタチオン、アジュバント（水酸化アルミニウムなど）、また、製剤を受
容者の血液に対して等張、低張またはわずかに高張にする溶質、そして、懸濁化
剤、増粘剤および/または保存剤をさらに含むことが多い。あるいは、本発明の
組成物は凍結乾燥物として製剤化してもよい。

【０１０２】 本明細書に記載の医薬組成物は、単位用量でまたは複数用量容器、例えば、密
封されたアンプルもしくはバイアルで提供してもよい。このような容器は、通常
、使用するまで製剤の無菌性および安定性を維持するような方法で密封する。一
般に製剤は、懸濁剤、溶液剤または油性もしくは水性ビヒクル中の乳剤として保
存できる。あるいは、医薬組成物は、使用する直前に無菌液体担体を添加するだ
けでよい凍結乾燥状態で保存してもよい。

【０１０３】 種々の治療計画における、本明細書に記載された特定の組成物を使用するため
の好適な投薬および治療計画（例えば、経口、非経口、静脈内、経鼻および筋内
投与およびそのための製剤）の開発は、当技術分野で周知であり、それらのうち
のいくつかを、一般的な説明のために、以下に簡単に記載する。

【０１０４】 特定の適用においては、本明細書に開示された医薬組成物は、経口投与で動物
に送達できる。そのために、これらの組成物は、不活性希釈剤もしくは吸収可能
な食用担体とともに製剤化してもよく、硬質もしくは軟質外殻ゼラチンカプセル
に封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または食物に直接組み入れてもよい
。

【０１０５】 活性化合物はまた、賦形剤とともに組み込み、消化可能な錠剤、バッカル錠剤
、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェファー剤
など（例えば、Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27 ; 386 （6623） : 410
-4 ; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998 ; 15 （3） : 243
-84 ; 米国特許第5,641,515号;米国特許第5,580,579号および米国特許第5,792,4
51号を参照されたい）の形態で使用できる。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル
剤などはまた、様々な任意の追加成分を含んでいてもよい。例えば、結合剤（ト
ラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなど）、賦形剤
（リン酸二カルシウムなど）、崩壊剤（トウモロコシデンプン、ジャガイモデン
プン、アルギン酸など）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、および甘
味剤（スクロース、ラクトースまたはサッカリンなど）を添加してもよく、また
は香料（ペパーミント、冬緑油またはサクランボ香料など）を添加してもよい。
単位剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に加えて、液体担体を含み
うる。種々のその他の材料が、コーティング剤として、または単位剤形の物理的
形態を異なったものに改変するために、存在していてもよい。例えば、錠剤、丸
剤またはカプセル剤を、セラック、糖またはその両方でコーティングしてもよい
。当然のことながら、任意の単位剤形を製造するために使用される材料はいずれ
も、薬学的に純粋であり、使用する量において実質的に無毒でなければならない
。さらに、活性化合物を、持続放出調製物および製剤に組み込んでもよい。

【０１０６】 典型的には、これらの製剤は、少なくとも約0.1％またはそれ以上の活性化合
物を含むが、活性成分のパーセントは、当然変動するものであり、好適には製剤
全体の重量または体積の約１もしくは２％〜約60％もしくは70％であってよく、
またはそれ以上でもよい。本来、治療上有用な各組成物における活性化合物の量
は、化合物の所定の単位剤形において、好適な一定用量で得られるように調製さ
れる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵
寿命などの要因、ならびにその他の薬理学的考察が、このような医薬製剤の製造
の分野における当業者によって考慮され、様々な投薬計画および治療計画が所望
されうる。

【０１０７】 経口投与のためには、代替法として、本発明の組成物は、うがい薬、歯磨き剤
、バッカル錠剤、口用スプレー、または舌下経口投与製剤の形態で、一種以上の
賦形剤とともに組み込むことができる。あるいは、活性成分を経口用溶液、例え
ばホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含むものなどに組み
込んでもよく、または歯磨き剤中に分散させてもよく、または水、結合剤、研磨
剤、香料、気泡剤および湿潤剤を含みうる組成物に治療上有効な量で添加しても
よい。あるいは、前記組成物は、舌下に配置できるかそうでなければ口中で溶解
しうる錠剤または液剤形態に形成してもよい。

【０１０８】 ある状況では、本明細書に開示した医薬組成物を、非経口、静脈内、筋内、ま
たは腹腔内に送達するのが望ましい。このような方法は、当業者に周知であり、
そのうちのいくつかは、例えば、米国特許第5,543,158号; 米国特許第5,641,515
号および米国特許第5,399,363号に、より詳細に記載されている。ある実施形態
では、遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、
ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水中に調製す
ることができる。また、分散剤を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール
およびこれらの混合物中、ならびに油中に調製することもできる。通常の保存お
よび使用条件下では、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を阻止するため
の保存剤を含む。

【０１０９】 注射用に適した医薬形態の例には、無菌の水溶液または分散液、および無菌の
注射用溶液もしくは分散液を即時調製するための無菌粉末（例えば、米国特許第
5,466,468を参照されたい）が含まれる。全ての場合において、該剤形は、無菌
でなければならず、そして容易に注入できる程度に流動的でなければならない。
製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物
による汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノー
ル、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリ
エチレングリコールなど）、これらの好適な混合物および/または植物油を含む
溶媒または分散媒でありうる。適度な流動性は、例えば、レシチンなどのコーテ
ィング剤の使用によって、分散剤の場合は必要な粒子サイズの維持によって、お
よび/または界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の活動
の阻止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノー
ル、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進することができる
。多くの場合、等張剤、例えば、ショ糖または塩化ナトリウムを含むのが好まし
い。注射可能な組成物の持続的吸収は、該組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例
えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって達成
できる。

【０１１０】 一実施形態においては、水溶液での非経口投与のために、必要に応じて該溶液
を好適に緩衝化するが、液状希釈剤は、まず十分な生理食塩水またはグルコース
で等張にすべきである。このような特定の水溶液は、静脈内、筋内、皮下および
腹腔内投与に特に好適である。ここで、当業者であれば、使用できる無菌の水性
媒質は、本明細書の開示を考慮することにより理解できる。例えば、ある用量を
1mlの等張NaCl溶液に溶かし、そして、1000mlの皮下注入用液に添加するかまた
は注入する所定部位に注射することができる（例えば、"Remington's Pharmaceu
tical Sciences" l5th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照された
い）。用量におけるいくらかの変動が、治療される被験体の病状に依存して必然
的に生じることになる。さらに、ヒトへの投与については、製剤は、当然、無菌
性、発熱原性、およびFDA局生物製剤基準によって必要とされる全身の安全性お
よび純度標準を満たすことが好ましい。

【０１１１】 本発明の別の実施形態では、本明細書に開示した組成物を、中性形態または塩
形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩の例には、酸付加塩（タ
ンパク質の遊離のアミノ基とともに形成されるもの）が含まれ、これは、例えば
、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル
酸などの有機酸とともに形成される。また、遊離のカルボキシル基とともに形成
される塩は、無機塩基に由来するもの（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄など）、および有
機塩基に由来するもの（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒス
チジン、プロカインなど）であってもよい。製剤化の後、溶液は、投与製剤に適
合する方法で、かつ治療上有効な量で投与する。

【０１１２】 担体はさらに、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング
剤、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体
溶液、懸濁剤、コロイド剤などを含みうる。このような薬学的に活性な物質のた
めの媒質および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒質また
は薬剤が活性成分と非適合性である場合を除き、治療用組成物におけるそれらの
使用が意図される。また、補助的な活性成分を該組成物中に組み込むこともでき
る。用語「薬学的に許容される」とは、ヒトに投与されたときに、アレルギー反
応または同様の不適切な反応をもたらさない分子成分および組成物を意味する。

【０１１３】 ある実施形態では、医薬組成物は、鼻内スプレー剤、吸入剤および/またはそ
の他のエアゾール送達ビヒクルによって送達できる。遺伝子、核酸およびペプチ
ド組成物を鼻内エアゾールスプレー剤によって肺に直接送達する方法が、例えば
、米国特許第5,756,353号および米国特許第5,804,212号に記載されている。同様
に、鼻腔内微小粒子樹脂を使用した薬物送達（Takenaga et al., J Controlled
Release 1998 Mar 2 ; 52 （1-2） : 81-7）およびリソホスファチジル-グリセ
ロール化合物を使用した薬物送達（米国特許第5,725,871号）もまた、製薬の分
野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックス形態の
経粘膜薬物送達の例が、米国特許第5,780,045号に記載されている。

【０１１４】 ある実施形態では、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞など
を使用して、本発明の組成物を好適な宿主細胞／生物に導入する。特に、本発明
の組成物は、送達のために、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたは
ナノ粒子などのいずれかに封入することにより製剤化できる。あるいは、本発明
の組成物は、このような担体ビヒクルの表面に、共有結合または非共有結合で結
合させることもできる。

【０１１５】 潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様製剤の形成および使
用は、当技術分野の当業者に一般に知られている（例えば、Lasic, Trends Biot
echnol 1998 Jul ; 16 （7） : 307-21 ; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar ;
56 （3） : 691-5 ; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug ; 35 （
8） : 801-9 ; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995 ; 12 （2-3
） : 233-61 ; 米国特許第5,567,434号;米国特許第5,552,157号;米国特許第5,56
5,213号;米国特許第5,738,868号および米国特許第5,795,587号を参照されたい。
これらはそれぞれ、その全体を参照により本明細書に組み入れるものとする）。

【０１１６】 リポソームは、その他の方法ではトランスフェクトするのが通常困難な多くの
細胞種において、成功裡に使用されてきた。このような細胞種としては、T細胞
懸濁液、肝細胞一次培養物およびPC 12細胞が含まれる（Renneisen et al., J B
iol Chem. 1990 Sep 25 ; 265 （27） : 16337-42 ; Muller et al, DNA Cell B
iol. 1990 Apr ; 9 （3） : 221-9）。さらに、リポソームは、ウィルスに基づ
く送達系に典型的であるDNA長による制約を受けない。リポソームは、遺伝子、
種々の薬物、放射性治療剤、酵素、ウィルス、転写因子、アロステリックエフェ
クターなどを様々な培養細胞系および動物に導入するために効果的に使用されて
きた。さらに、リポソームの使用は、自己免疫応答または全身送達後の許容でき
ない毒性を引き起こすとは考えられていない。

【０１１７】 ある実施形態では、リポソームを、水性媒質に分散し、同時に多重膜同心２分
子層小胞（多重膜小胞（MLV）とも称される）を形成するリン脂質から形成され
る。

【０１１８】 あるいは、その他の実施形態では、本発明は、本発明の組成物の薬学的に許容
されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可
能な方法で化合物を捕獲することができる（例えば、Quintanar-Guerrero et al
., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec ; 24 （12） : 1113-28を参照されたい）。
細胞内に高分子が高負荷となることによる副作用を避けるため、in vivoで分解
可能なポリマーを使用して、このような超微細粒子（周囲サイズ0.1μm）を設計
することができる。このような粒子は、例えば、Couvreur et al., Crit Rev Th
er Drug Carrier Syst. 1988 ; 5 （1） : 1-20 ; zur Muhlen et al., Eur J P
harm Biopharm. 1998 Mar ; 45 （2） : 149-55 ; Zambaux et al. J Controlle
d Release. 1998 Jan 2 ; 50 （1-3） : 31-40 ;および米国特許第5,145,684号
によって記載されたような方法によって作製できる。

【０１１９】 本発明はまた、診断薬として、本発明のポリヌクレオチドに由来するプライマ
ーとしてのポリヌクレオチドの使用、および本発明のポリペプチドに特異的な抗
体または試薬としてのポリペプチドの使用に関する。

【０１２０】 発癌経路に伴うごく初期の変化の検出が可能になると思われる、血液もしくは
組織中の遺伝学的または生化学的マーカーを同定することは、患者にとって最良
の治療を決定する上で役立つ。ポリヌクレオチド発現等の代理腫瘍マーカーは、
癌の各種形態および状態を診断するために用いることができる。本発明のポリヌ
クレオチドの発現レベルを同定することは、癌疾患のステージ決定および癌組織
の性質の等級付けの両方において有用であろう。ステージ決定過程は、癌の進行
度を観察し、生検部位に悪性組織が存在するか存在しないかで判定する。本発明
のポリヌクレオチドは癌の侵襲性に関するマーカーを同定することにより、例え
ば身体の種々の部位におけるその存在を同定することにより、ステージ決定過程
を実施するのに役立たせることができる。癌の等級付けは、腫瘍が同じ種類の正
常組織にどれだけ近似しているかを示すものであり、それはその細胞の形態およ
び他の分化マーカーによって評価される。本発明のポリヌクレオチドは、それら
が腫瘍細胞の分化の状態を判別する上で役立つことから、腫瘍の等級を決定する
上で有用である。

【０１２１】 診断アッセイは、被験体から得られたサンプルからポリペプチドまたはmRNAの
レベルの異常な低下または増加を測定することを含む方法による診断を行うこと
で、癌、自己免疫疾患および関連病態への罹りやすさを診断または判定する方法
を提供する。この診断方法は示差的発現として知られる。特定の遺伝子の発現を
罹患組織と正常組織との間で比較するものである。２つの組織における該ポリヌ
クレオチドに関連する遺伝子、mRNA、またはタンパク質の差異、例えば分子量、
アミノ酸もしくはヌクレオチド配列、または相対的存在量の差異は、罹患が疑わ
れるヒトの組織における、該遺伝子またはそれを調節する遺伝子の変化を示して
いる。

【０１２２】 発現の低下または増加は、RNAレベルで測定することができる。まずポリA RNA
を２つの組織から単離し、さらに本発明の示差的に発現されるポリヌクレオチド
に対応する遺伝子がコードするmRNAを、例えば、組織切片におけるin situハイ
ブリダイゼーション、逆転写酵素PCR、ポリA+ mRNAを含むノーザンブロット、ま
たは他の任意の直接的もしくは間接的なRNA検出法によって検出することができ
る。正常組織と比較した場合の罹患組織における所定のRNAの発現の増大または
低減は、転写産物および／または発現されたタンパク質がその疾患に関与してい
ることを示唆する。したがって、正常レベルと比較した場合に、より高いレベル
またはより低いレベルの配列番号1または３に対応するmRNAが検出されることは
、患者における癌の存在を示唆するものである。

【０１２３】 サンプル中のmRNA発現レベルは、該サンプルに由来するエクスプレスド・シー
ケンス・タグ（EST）のライブラリーを作製することにより決定される。該ライ
ブラリー中のESTの相対的提示量を、出発サンプルにおける遺伝子転写産物の相
対的提示量を評価するために用いることができる。そしてその試験のEST分析を
基準サンプルのEST分析と比較して、目的とするポリヌクレオチドの相対的発現
レベルを決定することができる。

【０１２４】 その他のmRNA解析としては、遺伝子発現の連続的解析（SAGE）法（Velculescu
ら Science （1995） 270:484）、ディファレンシャルディスプレイ法（例えば
、米国特許第5,776,683号）、またはヌクレオチドの相互作用の特異性に依存し
たハイブリダイゼーション分析を用いて行うことができる。

【０１２５】 あるいは、タンパク質レベルで比較を行ってもよい。２つの組織におけるタン
パク質のサイズを、２つの組織からのタンパク質抽出物のウェスタンブロットに
おいて、ポリペプチドを検出するための抗体を用い、比較する。また発現レベル
および細胞小器官局在化を、対応するタンパク質に対する抗体を用いて免疫学的
に検出することもできる。宿主に由来するサンプル中の、本発明のポリペプチド
等のタンパク質のレベルを測定するために用いることができる他のアッセイ技術
は、当業者には周知である。罹患組織におけるポリペプチドの発現レベルが、正
常組織における同タンパク質の発現レベルと比較した場合に増加または低減して
いることは、その発現されるタンパク質が該疾患に関与している可能性があるこ
とを示す。

【０１２６】 本発明のアッセイにおいて、配列番号1に記載の少なくとも片方の配列にコー
ドされた遺伝子の遺伝子産物発現レベルを検出することにより、上記の診断を下
すことができる。また、正常組織に対する罹患組織のmRNAまたはタンパク質レベ
ルの比較は、疾患の進行または寛解を追跡観察するためにも用いる。

【０１２７】 サンプル中の多量のポリヌクレチド配列は、ポリヌクレオチドアレイを用いて
アッセイすることができる。これらは遺伝子の示差的発現を調べ、遺伝子機能を
特定するために用いることができる。例えば、配列番号1のポリヌクレオチド配
列のアレイは、該ポリヌクレオチドが正常細胞と癌細胞との間で示差的に発現す
ることがある場合には、それを判別するのに用いることができる。本発明の１つ
の実施形態においては、配列番号1のヌクレオチド配列またはそれらの断片を含
むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば遺伝子突然変異体の
効率的なスクローニングを行うことができる。アレイ技法は周知であり、一般的
な適用可能性があり、さらに、遺伝子発現、遺伝的連鎖、および遺伝的多様性を
含む分子遺伝学における様々な問題に取り組む上で用いることができる（例えば
M.Cheeら, Science, 274巻、pp610-613（1996））。

【０１２８】 本発明で用いる「診断」とは、被験体の疾患への罹りやすさの判定、被験体が
現在該疾患を罹っているかどうかの判定、および該疾患を罹っている被験体の予
後判定を含む。

【０１２９】 本発明はさらに、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号1のヌクレオチド配
列）もしくはその断片、 （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列（好ましくは配
列番号6のヌクレオチド配列）、 （ｃ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号2もしくは3のポリペプチ
ド）もしくはその断片、または （ｄ）本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号2もしくは3のポリペプチ
ド）に対する抗体、 を含んでなる、診断アッセイを実施するための診断用キットに関する。

【０１３０】 また、本発明のヌクレオチド配列は染色体位置決定にも有用である。この配列
は個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的にターゲッティングし、その特定位
置とハイブリダイズすることができる。本発明にしたがって関連配列をマッピン
グすることは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一
段階である。ひとたび配列が正確な染色体位置にマップされたら、その染色体上
のその配列の物理的位置を遺伝的地図データと相関させることができる。この種
のデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man （Johns Ho
pkins University Welch Medical Library からオンラインで入手可能） 中に見
いだせる。その後、同一の染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との関係を連
鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。罹患個体と非罹患
個体とのcDNAまたはゲノム配列の差異も調べることができる。

【０１３１】 本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。

【０１３２】 さらなる態様において、本発明は本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断
片（本明細書中上記にて定義したとおりである）に対して免疫特異的な抗体を提
供する。好ましくは、該抗体はモノクローナル抗体である。

【０１３３】 本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（
好ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製に
は、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる
。例を挙げると、ハイブリドーマ法 （Kohler, G.およびMilstein, C., Nature
（1975） 256:495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 （Kozbo
rら, Immunology Today （1983） 4:72） およびEBV−ハイブリドーマ法 （Cole
ら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc.,
1985） などがある。

【０１３４】 本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するために、米国特許第4,94
6,778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法も適応することができる。また
、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。

【０１３５】 前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。本発明の抗体はまた、癌（特に結腸直腸癌）、自己免疫疾患および関連病
態を予防または治療するためにも用いられ得る。

【０１３６】 本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を誘導またはモジュレー
トする方法に関するものであり、この方法は、特に前記疾患の症状もしくは進行
を防ぐかまたは改善するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに
十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明の
さらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗体を産生させるような免
疫学的応答を誘導するために、in vivo で本発明のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポリペプチドを送達するこ
とを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を誘導またはモジュレートする
方法に関する。

【０１３７】 それゆえ、本発明によって、CASB7439ポリペプチド活性の存在、該活性の過剰
、または該活性の過少発現のいずれかと関連した、例えば癌および自己免疫疾患
、特に卵巣癌および大腸癌などの異常な状態を治療する方法が提供されることが
理解されるであろう。本発明が治療を試みるCASB7439の発現に関連するその他の
異常な状態は、慢性リンパ球性白血病および生殖細胞腫瘍である。

【０１３８】 さらに本発明は、CASB7439ポリペプチドの機能を刺激または抑制する化合物を
同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的には、前記疾患の
治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニストが使用される。種
々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産
物の混合物から化合物を同定することができる。このように同定されたアゴニス
ト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポリペプチドの天然
のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであってよく、また、そ
の構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coliganら, Current Pro
tocols in Immunology 1（2）: Chapter 5 （1991）を参照のこと）。スクリー
ニング法は当業者には公知であろう。さらなるスクリーニング法は、例えば D.
Bennettら, J. Mol. Recognition, 8:52-58 （1995） およびK. Johansonら, J.
Biol. Chem., 270（16）:9459-9471 （1995）ならびに本明細書中の引用文献に
みられる。

【０１３９】 したがって本発明は、本発明のポリペプチドの機能を刺激または抑制する化合
物を同定するためのスクリーニング法であって、以下： （ａ）候補化合物と、上記ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持してい
る細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に
直接または間接的に結合させた標識により測定すること、 （ｂ）候補化合物と、上記ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持してい
る細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、標識競合物質の
存在下で測定すること、 （ｃ）候補化合物が上記ポリペプチドの活性化または抑制により生ずるシグナ
ルをもたらすか否かを、該ポリペプチドを担持している細胞または細胞膜に適し
た検出系を用いて調べること、 （ｄ）候補化合物と、請求項１に記載のポリペプチドを含有する溶液とを一緒
にして混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定して、該混合
物の活性をスタンダードと比較すること、または （ｅ）候補化合物が細胞における上記ポリペプチドをコードするmRNAおよび該
ポリペプチドの産生に及ぼす効果を例えばELISAアッセイを用いて検出すること
、 よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法を提供する。

【０１４０】 膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。また周知のスクリーニング法を用いて、その受
容体への本発明のポリペプチドの結合に関して競合する、本発明のポリペプチド
のアゴニストまたはアンタゴニストを（もし存在するのであれば）同定すること
もできる。

【０１４１】 かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドに対するアゴ
ニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種の
ポリペプチドの産生を低減または増加させる化合物を同定するためのスクリーニ
ングキットに関し、このキットは、 （ａ）本発明のポリペプチド、 （ｂ）本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、 （ｃ）本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、 を含んでなり、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号2または3のポリペプチド
である。 当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、 （ａ）最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、 （ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの確実と思われる反応
部位または結合部位の三次元構造を想定し、 （ｃ）想定された反応部位または結合部位と結合または反応すると予想される
候補化合物を合成し、そして （ｄ）その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビタ
ーであるか否かを調べる、 ことを含んでなる。

【０１４２】 また、遺伝子治療を利用して、被験体の適切な細胞によりCASB7439ポリペプチ
ドを内生的に産生させることもできる。遺伝子治療の概要については、Human Mo
lecular Genetics, T StrachanおよびA P Read, BIOS Scientific Publishers L
td（1996）中、20章 Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therap
eutic Approaches（および本明細書で引用した引用文献）を参照のこと。

【０１４３】 ワクチン調製については、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine D
esign-the subunit and adjuvant approach（PowellおよびNewmanによる編集）,
Plenurn Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines（Vollerら
による編集）, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に
一般的に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、例えばFullerton,
米国特許第4,235,877号に記載されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュ
ゲート化は、例えばLikhite,米国特許第4,372,945号、およびArmorら,米国特許
第4,474,757号により開示されている。

【０１４４】 各ワクチン用量中のタンパク質量は、典型的なワクチンにおいては、重大かつ
不利益な副作用を引き起こすことなく免疫防御応答を誘導する量として選択され
る。そのような量は、用いた特定の免疫原によって異なるであろう。一般的には
、各用量はタンパク質を１〜1000μg、好ましくは２〜100μg、最も好ましくは
４〜40μg含むことが期待される。特定のワクチンについての最適な量は、被験
体における抗体力価およびその他の応答の測定を伴う標準的研究により確定する
ことができる。最初のワクチン接種に引き続いて、被験体は約４週間の間に１回
の追加免疫を受けることもある。

【０１４５】 「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。

【０１４６】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを指し、これは一本鎖および二本鎖の領域を含む、修飾
されていないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAもしくはDNAであり得る。

【０１４７】 本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、
基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更
しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配
列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および
末端切断（トランケーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体
は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプ
チドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一とな
るような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以
上の置換、欠失、付加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または付加
されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくて
もよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子変異体のよ
うに天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であ
ってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は
、突然変異誘発法または直接合成により作製することができる。

【０１４８】 当技術分野で知られる「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の類縁性のことである
。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の鎖間の一致度（match）により決定された、このような配列間の配列類縁
性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難なく算
出することができ、こうした方法として、例えば Computational Molecular Bio
logy, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputin
g: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Press, New
York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. an
d Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analy
sis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New York
, 1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 10
73 （1988） に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定する
ための好ましい方法は、検討する配列間で最大級のマッチングが得られるように
設計される。同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュー
タプログラムに編集されている。２配列間の同一性および類似性を決定するため
の好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ
（Devereux, J.ら, Nucleic Acids Research 12（1）:387 （1984））、ＢＬＡ
ＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ （Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol.
215:403-410 （1990）） があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラ
ムはＮＣＢＩおよび他のソースから一般に入手可能である （BLAST Manual, Alt
schul, S.ら, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Bi
ol. 215: 403-410 （1990））。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の
決定に使用することができる。

【０１４９】 使用した好適なアルゴリズムはＦＡＳＴＡである。このアルゴリズムを用いた
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列比較のための好適なパラメーターは
、以下のものを含む： ギャップペナルティー：12 ギャップ伸長ペナルティー：４ ワードサイズ：２、最大６ ポリペプチド配列をその他の方法で比較するための好ましいパラメーターは次
のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 （1970） 比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 （1992） ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターを用いて有効なプログラムは Genetics Computer Group
（Madison WI）から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記の
パラメーターはポリペプチド比較のためのデフォルトパラメーター（default pa
rameter） である（末端ギャップのペナルティーは無し）。

【０１５０】 ポリヌクレオチド配列を比較するための好ましいパラメーターは次のものを含
む： １）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 （1970）
； 比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターを用いて有用であるプログラムは Genetics Computer G
roup（Madison WI）から「ｇａｐ」プログラムとして公に入手可能である。前記
パラメーターはポリヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメーターである。

【０１５１】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号1の基準配列と同一で
ある、すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または該基準配列
に対して、一定の整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。そのよう
な変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびト
ランスバージョンを含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は
基準ヌクレオチド配列の 5'もしくは 3'末端位置、またはこれらの末端位置の間
のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準
配列内に１以上の連続するグループとして散在する。ヌクレオチド変異の数は、
配列番号1のヌクレオチドの総数に、それぞれの同一性％値の絶対比率（100で割
った値）を掛け、その積を配列番号1のヌクレオチドの総数から差し引くことに
より、すなわち、次式： ｎ_ｎ ≦ｘ_ｎ −（ｘ_ｎ・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_ｎはヌクレオチド変異の数であり、ｘ_ｎは
配列番号1のヌクレオチドの総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％
については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.
95などであり、さらにｘ_ｎとｙの非整数の積は、その積をｘ_ｎから引く前に、最
も近似する整数に切り下げる。配列番号2のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列の改変は、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレー
ムシフト突然変異を生じさせ、それにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチ
ドによりコードされたポリペプチドを改変させることができる。

【０１５２】 同様に、本発明のポリペプチド配列は、配列番号2の基準配列と同一である、
すなわち基準配列に対して100％の同一性を有するか、または同一性％が100％未
満であるように基準配列に対して一定の整数個までのアミノ酸変異を含むことが
できる。このような変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的およ
び非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、これらの
変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれ
らの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々に
、または基準配列内に１以上の連続したグループとして散在する。アミノ酸変異
の数は、配列番号2中のアミノ酸の総数にそれぞれの（100で割った）同一性％の
絶対比率を掛け、その積を配列番号2中のアミノ酸の総数から引くことにより、
すなわち次式により求められる。

【０１５３】 ｎ_a ≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番号2中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85
等であり、さらにｘ_aとｙの非整数の積は、その積をｘ_aから引く前に、最も近似
する整数に切り下げる。

【０１５４】 「相同体」とは、当技術分野において用いられる、被験配列に対し高度な配列
近縁性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す総称用語である
。この類縁性は前述のように比較した配列間の同一性および／または類似性の程
度を決定することにより定量化することができる。別々の種における機能的に等
価なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する「オーソログ体」、同じ種
内で考える場合に機能的に類似した配列を意味する「パラログ体」という用語は
、この総称用語の範囲に含まれるものである。

【０１５５】実施例 実施例１ リアルタイムRT-PCR分析 リアルタイムRT-PCR(U.Gibson, 1996, Genome Research:6, 996)を用いて複数
の患者由来の対応する腫瘍および正常大腸組織における候補抗原のmRNA転写産物
存在度を比較する。さらに、正常組織のパネルにおける候補遺伝子のmRNAレベル
を、この手法により評価する。

【０１５６】 正常大腸および腫瘍大腸由来の総RNAをTriPure試薬(Boehringer)を用いて急速
凍結生検材料から抽出する。正常組織由来の総RNAは、InVitrogen社から購入す
るか、またはTriPure試薬(Boehringer)を用いて急速凍結生検材料から抽出する
。ポリ-A⁺ mRNAをオリゴ-dT磁気ビーズ(Dynal)を用いてDNAse処理後に総RNAから
精製する。mRNAの定量化は、分光蛍光分析(VersaFluor, BioRad)によってSybrII
染料(Molecular Probes)を用いて行う。リアルタイムPCR増幅用のプライマーは
、TaqMan増幅条件用のデフォルトオプションを用いてPerkin-Elmer Primer Expr
essソフトウェアで設計する。

【０１５７】 リアルタイム反応は、標準PCRプロトコルにより組み立て、それぞれの反応に2
ngの精製mRNAを使用する。リアルタイム検出用のSybrI染料（Molecular Probes
）は最終的に1/75000に希釈して加える。増幅（40サイクル）とリアルタイム検
出は、Perkin-Elmer Biosystems PE7700システムで、通常の計器構成を利用して
実施する。Ct値は、PE7700配列検出用ソフトウエアを使用して計算する。それぞ
れのサンプルに対する複数のCt値：すなわち、患者サンプルに対しては候補TAA
の腫瘍Ct（CtT）および対合した正常結腸Ct（CtN）値、ならびに正常組織サンプ
ルのパネルに対してはそれぞれの正常組織XYのCtXYを得る。内部参照として、さ
らにアクチン遺伝子のCt（CtA）も、全サンプルに対して計算する。あるいは、
リアルタイムPCR増幅は、Taqmanプローブを用いてモニターしてもよい。増幅（4
0サイクル）とリアルタイム検出を、Perkin-Elmer Biosystems PE7700システム
で、通常の計器構成を利用して実施する。Ct値は、PE7700配列検出用ソフトウエ
アを使用して計算する。それぞれの組織サンプルから、標的mRNAのCt値（CtX）
およびアクチンmRNAのCt値（CtA）を得る。

【０１５８】 主な実験条件下でのPCR増幅の効率は理論的増幅効率に近いので、2^{(CtN/T/XY- CtA)} 値は、アクチン転写物レベルに対して標準化された、サンプルの相対的TAA
転写物レベルの予測値である。従って、1の値は候補抗原とアクチンが同じ発現
レベルを有することを示唆する。

【０１５９】 リアルタイムPCR反応は、最初に、12患者のバイオプシーからの腫瘍結腸およ
び対合する正常結腸について実施した。次いで反応を、合計18患者（このデータ
セットには最初の12患者が含まれる）から成るさらに完全なデータセットについ
て実施した。18患者のうちの6患者については重複をこのデータセット中に作っ
た。さらに6患者を試験し、その結果を先の18患者とともにプールした。最終プ
ールの統計を表３に示し、図１に図解した。

【０１６０】 また、29種の組織に対応する全部で48個の正常組織サンプル系列を、同じ手法
で試験した（分析した正常組織は表３に示す）。TAA転写レベルは上記のように
して算出した。候補抗原を過剰発現する患者の比率および正常組織対平均転写過
剰発現の比率もこのデータセットから算出した。結果を図１に示す。

【０１６１】

【表１】表１：CASB7439リアルタイムPCR発現結果:12患者のデータセット

【表２】表２：CASB7439リアルタイムPCR発現結果:18患者のデータセット

【表３】表３：CASB7439リアルタイムPCR発現結果:24患者のデータセット また、リアルタイムPCR反応を、Taqmanプロトコル（上記の通り）を用いて、6
患者のバイオプシーから得た腫瘍結腸および隣接正常結腸についても実施した。
それぞれについて3つの重複測定を行い、さらなる計算には平均を使った。結果
を図１に示す。さらに、異なる28組織（表５）を代表する36組織サンプルも同じ
手順により試験した。結果を図２に示す。

【０１６２】

【表４】表４：Taqmanプローブを用いたCASB7439リアルタイムPCR発現結果 結果は、CASB7439転写物が、隣接正常結腸および上記の正常組織の全てと比較
して、結腸腫瘍に過剰発現することを明らかに示唆する。90%を超える患者が、
隣接正常結腸と比較して、腫瘍においてCASB7439転写物を強く過剰発現する。腫
瘍の平均過剰発現倍数は100以上である。さらに、90%を超える患者が、他の正常
組織と比較して、結腸腫瘍にCASB7439転写物を過剰発現し、そしてそれらの60%
超は10倍以上過剰発現する。

【０１６３】

【表５】表５：CASB7439転写物発現分析に使用した正常組織の表 実施例２ cDNAアレイの示差スクリーニング 差引かれたcDNAライブラリー中の腫瘍関連遺伝子の同定を、示差スクリーニン
グにより実施する。

【０１６４】 全細菌DNAを100μl一夜培養物から抽出する。細菌をグアニジウムイソチオシ
アネートを用いて溶解し、細菌DNAを磁気ガラス（Boehringer）を用いてアフィ
ニティ精製する。プラスミドインサートを細菌DNAからAdvantage PCR増幅（Clon
tech）により回収する。PCR産物を2枚のナイロン膜上にドットし、Biomek 96 HD
RTツール（Beekman）を用いて高密度cDNAアレイを作る。スポットしたcDNAをUV
照射によりメンブランと共有結合させる。第1のメンブランは、単一患者の腫瘍
から調製した混合cDNAプローブとハイブリダイズさせる。第2のメンブランは、
同じ患者の正常結腸から調製した等量の混合cDNAプローブとハイブリダイズさせ
る。プローブcDNAはPCR増幅により、上記のように調製し、AlkPhos Directシス
テム（Amersham）を用いて標識する。ハイブリダイゼーション条件とストリンジ
ェンシー洗浄はAlkPhos Direct キットに記載の通りである。ハイブリダイズし
たプローブは化学発光により検出する。両方のブロットのそれぞれのcDNA断片の
ハイブリダイゼーション強度をフィルムデンシトメトリーまたは直接測定（BioR
ad Fluor-S Max）によって測定する。腫瘍対正常ハイブリダイゼーション強度の
比（T/N）をそれぞれの遺伝子に対して計算し、腫瘍における過剰発現の程度を
評価する。結腸腫瘍において有意に過剰発現する遺伝子を追跡する。有意性はT/
N頻度分布の標準偏差として任意に定義する。示差スクリーニング実験を複数患
者ドナー（>18）から得たRNAを用いて繰り返し、患者集団中の過剰発現腫瘍の頻
度を評価する。さらに、DNAアレイを、結腸以外の正常組織（前掲の表を参照）
から得た混合プローブとハイブリダイズさせて、これらの組織中の候補遺伝子の
発現レベルを決定する。

【０１６５】実施例３ DNAマイクロアレイ DNAマイクロアレイを用いて、複数サンプル中の遺伝子の大規模コレクション
のmRNA発現プロファイルを調べる。この情報をリアルタイムPCRによって得られ
るデータを補完するために用いて、腫瘍と正常組織における遺伝子発現レベルの
独立した測定を行う。

【０１６６】 DNAマイクロアレイを製造する現在の技術の例としては、1)フォトリソグラフ
ィー法を用いた固相化学合成法によりオリゴヌクレオチドをチップ表面上で合成
する、Affymetrix社の「GeneChip」アレイ、2)少量のDNA溶液を自動機械で注出
して、固相（例えばガラス）表面上に固定化する、DNAスポッティング技術、が
挙げられる。どちらの場合でも、チップは、目的とする組織（例えば正常組織、
腫瘍等）から抽出して放射活性によりまたは蛍光リポーター分子により標識した
cDNAまたはcRNAとハイブリダイズさせる。標識された物質を該チップとハイブリ
ダイズさせ、チップ上のそれぞれの配列に結合したプローブの量を特殊なスキャ
ナーを使用して測定する。該実験は１種類の蛍光リポーター（または放射活性）
を用いて設定することができるが、その代わりに２種類の蛍光リポーターを用い
て実施することもできる。その後者の場合、２つのサンプルのそれぞれをリポー
ター分子のうちの一方で標識する。次いで２つの標識されたサンプルをDNAチッ
プ上の配列に競合的にハイブリダイズさせる。２種類の蛍光シグナルの比率をチ
ップ上の各配列について決定する。この比率を用いて２つのサンプル中の転写産
物の相対的存在量を算出する。詳細なプロトコルは、「DNAマイクロアレイ：実
用的アプローチ（DNA Microarrays: A practical approach.）Schena M. Oxford
University Press 1999」およびワールドワイドウェブ(World Wide Web)（http
://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html、http://arrayit.com/DNA
-Microarray-Protocols/）ならびに専門の販売業者（例えばAffymetrix社）を含
む数多くの情報源から入手可能である。

【０１６７】実施例５ ノーザン−サザンブロット分析 限られた量の混合した腫瘍cDNAおよび対応する正常大腸cDNAをAdvantage PCR
によって増幅する（上記参照）。また、複数の正常組織からのメッセンジャーRN
Aを、同じ手法を用いて増幅する。増幅したcDNA（1μg）を1.2％アガロースゲル
で電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファーする。該メンブレンは、候
補TAA cDNAの断片を用いて調製したプローブとハイブリダイズさせる（AlkPhos
Direct System）。ノーザン−サザン分析は、腫瘍組織および正常組織における
転写物の大きさ、スプライス変異体の存在および転写物量についての情報を提供
する。

【０１６８】実施例６ ノーザンブロット分析 ノーザンブロットはポリA＋mRNAを1μg用いて標準的プロトコールにしたがっ
て行う。放射性プローブはReady-to-Goシステム（Pharmacia）を用いて調製する
。

【０１６９】実施例７ 全長cDNA配列の実験による同定 結腸腫瘍cDNAライブラリーを、λZapIIシステム（Stratagene）を使って、5μ
gのpolyA+ mRNAから構築する。逆転写工程にSuperscriptII（Life Technologies
）を用いることを除いて、供給されたプロトコルに従う。オリゴdTプライマーお
よび無作為プライマーを用いたライブラリーを構築する。ライブラリーのそれぞ
れのスクリーニングのために、約1.5x10⁶の独立したファージをプレーティング
する。ファージプラークをナイロンフィルター上に移し、AlkPhos Directにより
標識したcDNAプローブを用いてハイブリダイズする。化学発光によりポジティブ
ファージを検出する。寒天プレートからポジティブファージを切取り、500μl S
Mバッファー中に溶出し、遺伝子特異的PCRにより確認する。溶出したファージを
、in vivo切除によって一本鎖M13バクテリオファージに変換する。次にバクテリ
オファージを、大腸菌(E.coli)の感染によって二本鎖プラスミドDNAに変換する
。感染した細菌をプレーティングし、cDNAプローブを用いて第２ラウンドのスク
リーニングにかける。ポジティブ細菌クローンからプラスミドDNAを精製し、両
方の鎖の配列を決定する。

【０１７０】 全長遺伝子がcDNAライブラリーから直接得られないときは、見つからない配列
はRACE技術（Marathonキット、ClonTech）を用いて単離する。この手法は、mRNA
を逆転写して二本鎖cDNAとし、cDNAの末端にリンカーをライゲートし、そしてcD
NAの所望の末端部を、遺伝子特異的プライマーとリンカーオリゴヌクレオチドの
1つを用いて増幅する。マラソン（Mararthon）PCR産物をプラスミド（pCRII-TOP
O、InVitrogen）中にクローニングし、配列決定する。

【０１７１】 この操作を利用して、配列番号１のポリヌクレオチドを得た。

【０１７２】実施例８ ESTプロフィール 実験による抗原組織発現特性決定を補完するアプローチの1つは、ヒトESTデー
タベースを探索することである。EST（Expressed Sequence Tag）は、特定の組
織または細胞系から抽出したmRNAのコレクションから作ったcDNAの小断片である
。そのようなデータベースは現在、数千のcDNA組織ライブラリーからの大量のヒ
トEST（2 10⁶）を提供し、疾患の様々なタイプと状態に由来する腫瘍組織が挙げ
られる。情報学ツール（Blast）を使って、組織発現についてさらなる知見を得
るために、CASB7439配列の比較検索を実施する。

【０１７３】CASB7439のEST分布： これらのESTはCASB7439と完全に対合する。表は4つの異なる腫瘍結腸ライブラ
リー由来の9つのEST、1つの正常結腸ライブラリー由来の1つのEST、1つの腫瘍生
殖細胞ライブラリー由来の3つのEST、1つの慢性リンパ球白血病細胞ライブラリ
ー由来の1つのEST、2つの混合腫瘍ライブラリー由来の2つのEST、未知のタイプ
のライブラリー由来の2つのESTを含有する。これは予想通り、CASB7439が、正常
組織と比較して、腫瘍組織において、特に大腸腫瘍組織において過剰発現するこ
とを明らかに示す。

【０１７４】実施例９： 9.1 腫瘍特異的抗原の発現および精製 ワクチン用途のために本発明の抗原を産生させるため、そして天然発現のタン
パク質の免疫組織化学による特性評価に必要な抗体の迅速な精製および作製、ま
たは精製の追跡用のタンパク質断片またはタンパク質全体を産生させるために、
微生物宿主における発現、またはその代わりにin vitroでの転写／翻訳を用いる
。

【０１７５】 組換えタンパク質が２つの微生物宿主、大腸菌および酵母(Saccharomyces cer
evisiaeまたはPichia pastorisなど)において発現され得る。このことによって
、この特定の抗原産生にとって最良の特性を有する発現系の選択が可能である。
一般的に、組換え抗原は大腸菌で発現され、試薬タンパク質は酵母で発現される
。

【０１７６】 発現の戦略は、まず、組換え抗原の一次構造の設計を含む。一般に、抗原の免
疫原性特性をモジュレートするのに有用な領域、免疫融合パートナー(IFP)をも
含み得る発現融合パートナー(EFP)が、発現レベルを向上させるためにN末端に配
置される。加えて、さらに精製を促進するのに有用なアフィニティ融合パートナ
ー(AFP)がC-末端に含まれる。

【０１７７】 上記の通り、複数の構築物を比較評価しうる。CASB7439に対する抗体の迅速な
発現と精製ならびに作製のために、大腸菌(E.coli)に、EFPとしてNS1をかつAFP
としてヒスチジン尾部をもつ、全長CASB7439タンパク質を作製することを検討す
る。

【０１７８】 従って、2つの構築物を検討する：構築物１： EFPとしてNS1 cDNAおよびAFPとしてヒスチジン尾部をコードするcDNA
と融合した全長野生型CASB7439 cDNA（配列番号８）。コードされる融合タンパ
ク質は配列番号10である。

【０１７９】構築物２： EFPとしてNS1 cDNAおよびAFPとしてヒスチジン尾部をコードするcDNA
と融合した全長突然変異型CASB7439 cDNA（配列番号９）。この構築物において
は、自然CASB7439 cDNAの最初の50コドンを大腸菌(E.coli)コドンに使われる特
異的コドンによって置換え、大腸菌(E.coli)宿主におけるCASB7439の発現力を向
上することを提案する。コードされる融合タンパク質配列は配列番号10である。

【０１８０】 CASB7439タンパク質設計は次の通り示される： 「NS1」はインフルエンザタンパク質NS1のN末端断片（80アミノ酸）である。「H
IS」はポリヒスチジン尾部である。

【０１８１】 使用する組換え株はN99から誘導されたAR58：潜在λ溶原、すなわち、gal E::
Tn10、Δ-8(chlD-pgl)、Δ-H1(cro-chlA)、N⁺およびcI857である(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA vol82, pp.88-92, January 1985 Biochemistry)。

【０１８２】 組換え株を利用できるときは、組換え産物を、発現レベルの評価および粗抽出
物の挙動分析によるタンパク質のさらなる溶解度の予測によって特徴づける。

【０１８３】 適当な培地での増殖および組換えタンパク質発現の誘導後に、全抽出物をSDS-
PAGEにより分析する。組換えタンパク質を染色ゲルで可視化し、ウェスタンブロ
ット分析により特異的抗体を用いて同定する。

【０１８４】 プラスミド： 名前：TCM 281 pRIT..15143 レプリコン：pMB1 選択：Kan プロモーター：PLロング インサート：NS1-C74-39-His 構築物1からの組換えタンパク質の発現： 細菌をLB培地+50μg/ml Kan中で30℃にて増殖した。培養がOD=0.5(620nm)に到
達したとき、培養を39℃まで加熱し、5時間の誘導後、細胞を収穫した。

【０１８５】 抽出物調製： 細胞濃度： PBSバッファー+完全培地中で、50X 破砕： フレンチプレスで、3X 遠心分離： 14000tにて、30分間 備考： 細胞抽出物の上清の>90% 細胞抽出物を12.5% SDS PAGEで泳動し、次いでクーマシーブルーを用いて染色
した。また市販のポリヒスチジン尾部に対するモノクローナル抗体（Quiagen）
によって、ウェスタンブロットも実施した。得られたゲル（図3および4）は、タ
ンパク質が発現されかつ細胞抽出上清中に認識できることを示す。

【０１８６】 精製スキームは、組換えタンパク質中のHisアフィニティ尾部の存在に基づく
古典的アプローチに従う。典型的な実験では、破砕した細胞を濾過し、無細胞抽
出物を、組換えタンパク質を特異的に保持しうるイオン金属アフィニティクロマ
トグラフィ（IMAC；Ni⁺⁺NTA、Qiagen）にかける。保持されたタンパク質を、リ
ン酸バッファー中で0-500mMイミダゾール勾配（できれば界面活性剤の存在のも
とで）により溶出する。

【０１８７】 収穫した培養からの上清は、6M尿素、100mM NaH₂PO₄、10mM Tris、PH 8中で変
性し、次の条件下でクロマトグラフィカラムIMAC Qiagen NTA Ni⁺⁺にかけた： 平衡バッファー：NaH₂PO₄ 100mM PH 8 Tris lOmM Urea 6M サンプル：尿素6M、100mM NaH₂PO₄、10mM Tris中の上清 洗浄バッファー：l)NaH₂PO₄ l00mM、PH 8 Tris 10mM 尿素 6M イミダゾール 25mM ：2)NaH₂PO₄ l00mM、PH 8 Tris 10mM 尿素 6mM イミダゾール 50mM 溶出バッファー： NaH₂PO₄ l00mM、PH 5.5 Tris 10mM 尿素 6M イミダゾール 500mM 500mMイミダゾール+6M尿素中の溶出タンパク質を、次の条件下で透析する： - PBS PH 7.2 + サルコシル0.5% + 4M尿素 - 同上、2M尿素にて2時間 - 同上、0M尿素にて2時間 最終物質は凍結して保存する。タンパク質含量をローリー（Lowry）タンパク
質アッセイを用いて定量した（0.9mg/1.2ml）。純度をクーマシーブルーを用い
て染色した12.5% PAGE SDSにより評価し（図５）、そして組換えタンパク質の存
在をウェスタンブロットにより抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いて確
認した（図６）。

【０１８８】 発現した抗原の様々なバージョンの比較評価により、さらなる精製および免疫
学的評価に利用するのに最も期待できる候補の選択が可能になるであろう。

【０１８９】9.2 抗体産生および免疫組織化学 少量の比較的精製されたタンパク質を用いて、 a) 正常または癌組織切片における免疫組織化学による発現を検出するため、 b) 発現を検出し、精製プロセス中のタンパク質を追跡するため(ELISA/ウェスタ
ンブロット)、または c) 精製タンパク質を特性評価/定量するため(ELISA) に、免疫学的ツールを作成することができる。

【０１９０】9.2.1 ポリクローナル抗体： 免疫感作 2〜3羽のウサギを、アジュバント3D-MPL/QS21中で処方した100μgのタンパク
質にて、3週間間隔で3回筋内投与(I.M.)により免疫感作する。各免疫感作の3週
間後、血液サンプルを採取し、抗体力価を、標準プロトコルにしたがってコーテ
ィング抗原としてタンパク質を用いて血清中でELISAによって評価する。

【０１９１】ELISA 96ウェルマイクロプレート(maxisorb Nunc)を5μgのタンパク質で4℃にて一晩
かけて被覆する。PBS NCS1%で37℃にて1時間飽和させた後、ウサギ血清の連続希
釈液を37℃で1時間30分かけて加える(1/10から出発)。PBS Tween中で3回洗浄し
た後、抗ウサギビオチニル化抗血清(Amersham)を加える(1//5000)。プレートを
洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(1/5000)を37℃で30分かけて
加える。洗浄後、50μlのTMB(BioRad)を7分かけて加え、次いで反応を0.2MのH₂S
O₄で停止させる。ODを450nmで測定し、SoftmaxProで中点希釈度を計算し得る。

【０１９２】9.2.2 モノクローナル抗体 免疫感作 5匹のBALB/cマウスを5μgの精製タンパク質にて3週間間隔で3回免疫感作する
。II後14日目、3後1週間目にブリージングを行う。この血清を、被覆抗原として
用いられる精製タンパク質についてElisaによって試験する。これらの結果(中点
希釈度＞10000)に基づいて、融合のために1匹のマウスを選別する。

【０１９３】融合/HAT選別 標準プロトコルにしたがってPEG40%およびDMSO5%を用いて、脾臓細胞をSP2/0
骨髄腫と融合する。次いで、細胞を96ウェルプレートに2.5×10⁴〜10⁵細胞/ウェ
ルで接種して、耐性クローンをHAT培地中で選択する。これらのハイブリドーマ
の上清を特異的抗体のその含量について試験し、陽性の場合、限界希釈法を2サ
イクル行う。スクリーニングを2ラウンド行った後、3種のハイブリドーマを腹水
(ascitis)産生用に選択する。

【０１９４】9.2.3 免疫組織化学 抗体が入手可能な場合、 ・正常組織に対する癌における本発明の抗原の発現のレベル、または ・その抗原を発現している一定のタイプの癌の割合、 ・その他の癌のタイプもその抗原を発現するかどうか、 ・癌組織においてその抗原を発現している細胞の割合、 を測定するために、免疫染色を正常または癌組織切片で行う。

【０１９５】組織サンプル調製 切開後、組織サンプルをOCT化合物中でコルクディスク上にのせ、液体窒素(-1
60℃)中で予め過冷却したイソペンタン中で急速に凍結させる。次いで、ブロッ
クを使用するまで-70℃で保存する。7〜10μmの切片はクライオスタットチャン
バー(-20、-30℃)中で作製される。

【０１９６】染色 組織切片を室温(RT)で5分間乾燥し、アセトン中にRTにて10分間固定し、再び
乾燥し、PBS0.5%BSA5%血清で飽和する。RTで30分間置いた後、直接または間接染
色を抗原特異的抗体を用いて行う。直接染色は良好な特異性をもたらすが、染色
の強さは小さく、一方間接染色は染色の強さは大きいが染色の特異性が低い。

【０１９７】9.3 本発明の抗原に対するヒト細胞性免疫反応の分析 本発明の抗原の免疫学的な適切性はヒトT細胞のin vitro初回抗原刺激によっ
て評価することができる。全てのT細胞リンパ球系および樹状細胞を健康なドナ
ーのPBMC(末梢血単核細胞)(好ましくはHLA-A2サブタイプ)から誘導する。またHL
A-A2.1/K^bトランスジェニックマウスをHLA-A2.1ペプチドのスクリーニングに用
いる。

【０１９８】 新たに発見された抗原特異的CD8+ T細胞系を週1回のin vitro刺激により生じ
させ、維持する。抗原または抗原由来のペプチドに応答したCD8系のγ-IFN産生
および溶菌活性を標準方法で試験する。

【０１９９】 CD8+ T細胞系を生じさせるために２つのストラテジー、すなわちペプチドに基
づく手法と全遺伝子に基づく手法が用いられる。両手法には、適当な送達システ
ム中にクローニングするか、またはHLA結合ペプチドの配列を予測するのに用い
られる、正確なリーディングフレームでの新たに発見された抗原の全長cDNAが必
要である。

【０２００】ペプチドに基づく手法 簡単に述べると、トランスジェニックマウスをアジュバントを加えたHLA-A2ペ
プチドで免疫感作し、CD8応答(ペプチドでパルスした自己脾臓細胞の効率的な溶
解により定義される)を誘導できないものをヒト系においてさらに分析する。

【０２０１】 ヒト樹状細胞(Romaniらにしたがって培養したもの)をペプチドでパルスし、(F
acsにより)CD8で選別したT細胞を刺激するのに用いる。週１回の刺激を数回行っ
た後、CD8系をまずペプチドパルス化自己BLCL(EBV-B形質転換細胞系)にて試験す
る。ペプチドの適正なin vivoプロセシングを確認するために、CD8系をcDNAトラ
ンスフェクト腫瘍細胞(HLA-A2トランスフェクトLnCaP、Skov3またはCAMA腫瘍細
胞)にて試験する。

【０２０２】全遺伝子に基づく手法 CD8+ T細胞系を、遺伝子銃でトランスフェクトした樹状細胞、レトロウイルス
により形質導入されたB7.1-トランスフェクト線維芽細胞、組換えポックスウイ
ルス(Kimら)またはアデノウイルス(Butterfieldら)を感染させた樹状細胞のいず
れかで抗原刺激する。ウイルス感染細胞は、抗原が高レベルで発現されるので抗
原ペプチドを提示するのに非常に効率的であるが、ウイルスT細胞系の過剰増殖
を回避するために1回使用できるにすぎない。

【０２０３】 交互に刺激した後、CD8+系を上記のようなcDNAトランスフェクト腫瘍細胞にて
試験する。ペプチドの特異性および同一性を決定して免疫学的な有効性を確認す
る。

【０２０４】CD4 ⁺ T-細胞応答 同様に、CD4⁺ T細胞免疫も評価することができる。特異的CD4⁺ T細胞の作製は
、T細胞を刺激する組換え精製タンパク質またはペプチドを加えた樹状細胞を利
用して行う。

【０２０５】HLA対立遺伝子と結合するエピトープ（ノナマーおよびデカマー）の予測 HLAクラスI結合ペプチド配列は、パーカー（Parker）のアルゴリズム(Parker,
K.C., M.A.Bednarek,およびJ.E.Coligan. 1994. 「個々のペプチド側鎖の独立結
合に基づく、HLA-A2結合ペプチドの能力格付けスキーム（Scheme for ranking p
otential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individ
ual peptide side-chains）」 J. Immunol. 152:163、およびhttp://bimas.dcrt
.nih.gov/molbio/hla_bind/)、またはラメンジー（Rammensee）の方法(Rammense
e,Friede,Stevanovic,「MHCリガンドとペプチドモチーフ：第１リスティング（M
HC ligands and peptide motifs: 1st listing）」, Immunogenetics 41, 178-2
28, 1995；Rammensee,Bachmann,Stevanovic,「MHCリガンドとペプチドモチーフ
（MHC ligands and peptide motifs）」. Landes Bioscience 1997、およびhttp
://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm)により予測する。次に、ペ
プチドをHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスモデルでスクリーニングする（V
itielloら）。

【０２０６】 HLAクラスII結合ペプチド配列は、Tエピトープ（T epitope）アルゴリズムを
使い、スコアーカット-オフを6にセットして予測する（Sturniolo,Hammerら, Na
ture Biotechnology. 1999. 17;555-561）。

【０２０７】 次の表は、クラスIおよびIIの予測されたエピトープ配列を集める： 配列情報 配列番号１ 配列番号２ 配列番号３ 配列番号４ 配列番号５ 配列番号６ 配列番号７ 配列番号８ 配列番号９ 配列番号１０ 配列番号１１ 配列番号１２ 配列番号１３ 配列番号１４ 配列番号１５ 配列番号１６ 配列番号１７ 配列番号１８ 配列番号１９ 配列番号２０ 配列番号２１ 配列番号２２ 配列番号２３ 配列番号２４ 配列番号２５ 配列番号２６ 配列番号２７ 配列番号２８ 配列番号２９ 配列番号３０ 配列番号３１ 配列番号３２ 配列番号３３

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、Taqmanプローブを用いるリアルタイムPCRデータを示す。記号は次の
通りである：副腎：Ad_Gl；膀胱：Bl；骨髄：Bo_Ma；頚部：Ce；結腸：Co；ファ
ローピウス管：Fa_Tu；回腸：Il；肝：Li；肺：Lu；リンパ節：Ly_No；食道：Oe
；副甲状腺：Pa_Thy；胎盤：Pl；前立腺：Pr；直腸：Re；皮膚：Sk；骨格筋：Sk
_Mu；小腸：Sm_In；脾臓：Sp；精巣：Te；甲状腺：Thy；気管：Tr。

【図２】 図２は、Sybrプロトコルを用いるリアルタイムPCR発現を示す。記号は次の通
りである：副腎：Ad_Gl；膀胱：Bl；骨髄：Bo_Ma；頚部：Ce；結腸：Co；リンパ
節：Ly_No；食道：Oe；副甲状腺：Pa_Thy；胎盤：Pl；前立腺：Pr；直腸：Re；
皮膚：Sk；骨格筋：Sk_Mu；小腸：Sm_In；脾臓：Sp；精巣：Te；甲状腺：Thy；
気管：Tr；心臓：He。

【図３】 図３は、CASB7439を発現する株からの細胞抽出物のクーマシーブルー染色SDS
PAGEを示す。レーン1は分子量マーカーを示し、レーン2は5時間39℃にて誘導し
た細胞抽出物を示し；レーン3は誘導した細胞抽出物の上清を示し；そしてレー
ン4は誘導した細胞抽出物のペレットを示す。

【図４】 図４は、NS1-CASB7439発現タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。ゲル
には、CASB7439を発現する株からの細胞抽出物を載せて、抗NS1モノクローナル
抗体を用いて現わした。

【図５】 図５は、精製後のCASB7439のクーマシーブルー染色SDS PAGEを示す。レーン１
とレーン５は分子量マーカーを示し；レーン２、３、４にはそれぞれ2μl、4μl
および6μlの精製タンパク質を載せた。

【図６】 図６は、精製後のCASB7439のウェスタンブロットを示し、抗ポリヒスチジンモ
ノクローナル抗体によって現わした。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８４ 48/00 35/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 1/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８７ 35/00 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ００２１０８０．７ (32)優先日 平成12年８月25日(2000．8．25) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 キャサルト，ジーン−ポール ベルギー国 リキセンザール ビー 1330 ルー デ ランスティテュート 89 ス ミスクライン ビーチャム バイオロジカ ルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 コーヘ，ティエリー ベルギー国 リキセンザール ビー 1330 ルー デ ランスティテュート 89 ス ミスクライン ビーチャム バイオロジカ ルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 ガウリス，スワン，ローマン，ジーン−ト ーマス ベルギー国 リキセンザール ビー 1330 ルー デ ランスティテュート 89 ス ミスクライン ビーチャム バイオロジカ ルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 ヴィナルス ワイ デ バソルス，カルロ タ ベルギー国 リキセンザール ビー 1330 ルー デ ランスティテュート 89 ス ミスクライン ビーチャム バイオロジカ ルズ ソシエテ アノニム Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA37 DA77 FB03 FB04 FB07 4B024 AA01 AA12 BA31 BA41 CA01 GA11 HA12 HA15 HA20 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS33 QS34 QX02 4B064 AG27 AG31 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA18 CA23 CA27 CA53 DA01 NA14 ZA662 ZB262 4C085 AA03 BB01 BB11 CC32 EE01 EE06 FF11 FF14 4C087 AA02 BB63 NA14 ZA66 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 安全かつ有効な量のCASB7439ポリペプチドまたはその免疫原
   性断片および薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物であって、CASB7439
   ポリペプチドが、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号11
   、配列番号12および配列番号14からなる群より選択される該組成物。
2. 【請求項２】 安全かつ有効な量のCASB7439コードポリヌクレオチドまたは
   その断片および薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物であって、CASB74
   39コードポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、
   配列番号8、配列番号9、配列番号13および配列番号15からなる群より選択される
   該組成物。
3. 【請求項３】 さらにTH-1誘導性アジュバントを含む、請求項１または２に
   記載の免疫原性組成物。
4. 【請求項４】 TH-1誘導性アジュバントが3D-MPL、QS21、QS21とコレステロ
   ールとの混合物およびCpGオリゴヌクレオチドからなるアジュバントの群より選
   択されるか、または該アジュバントのうちの２種以上の混合物である、請求項３
   に記載の免疫原性組成物。
5. 【請求項５】 CASB7439ポリペプチドをin vitroで負荷することにより改変
   するか、またはCASB7439ポリペプチドを発現するようにin vitroで遺伝学的に改
   変した抗原提示細胞の有効量と、薬学的に有効な担体とを含む免疫原性組成物。
6. 【請求項６】 医療において使用するための、請求項１〜５のいずれか１項
   に記載の免疫原性組成物。
7. 【請求項７】 配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10または配列
   番号11の全長にわたって、それぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番
   号10または配列番号11で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性
   を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 アミノ酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列
   番号10または配列番号11に対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項７に
   記載の単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10または配列
   番号11のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号3、配列番号7、配列番号10または配列番号11の単
    離されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの免
    疫原性断片を含むポリペプチドであって、該免疫原性断片の免疫原性活性が配列
    番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10または配列番号11のポリペプチドと
    実質的に同一である該ポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号16〜配列番号33の１つ以上の配列を含む、配列番
    号2の免疫原性断片。
13. 【請求項１３】 より大きな融合タンパク質の一部である、請求項７〜１２
    のいずれか１項に記載のポリペプチド。
14. 【請求項１４】 担体タンパク質に化学的に結合した請求項７〜１２のいず
    れか１項に記載のポリペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項７〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコ
    ードする単離されたポリヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号
    8または配列番号9の配列を含む、請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチ
    ド。
17. 【請求項１７】 配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10または配
    列番号11の全長にわたって、それぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列
    番号10または配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性を有す
    るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチ
    ド。
18. 【請求項１８】 同一性が少なくとも95％である、請求項１５〜１７のいず
    れか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
19. 【請求項１９】 以下の（ａ）〜（ｃ）： （ａ）配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号11のポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号1、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8または配列
    番号9のポリヌクレオチドのコード領域;および （ｃ）配列番号1または配列番号6の配列を有する標識プローブを用いて、スト
    リンジェントなハイブリダイゼーション条件において好適なライブラリーをスク
    リ−ニングすることによって得られ、配列番号2、配列番号3、配列番号7または
    配列番号11のタンパク質と同様の免疫原特性を有するタンパク質をコードするポ
    リヌクレオチドまたはその断片、 から選択される単離されたポリヌクレオチド。
20. 【請求項２０】 請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離されたポリ
    ヌクレオチドを含む、発現ベクターまたは組換え生存微生物。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の発現ベクターまたは請求項１５〜１９
    のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
22. 【請求項２２】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を生
    産する方法であって、CASB7439ポリペプチドまたはCASB7439コードポリヌクレオ
    チドと、好適なアジュバント、希釈剤またはその他の薬学的に許容される担体と
    を混合することを含む該方法。
23. 【請求項２３】 請求項７〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生
    産する方法であって、該ポリペプチドの生産に十分な条件において請求項２１に
    記載の宿主細胞を培養し、該培養培地から該ポリペプチドを回収することを含む
    該方法。
24. 【請求項２４】 癌に罹患した患者または癌に罹りやすい患者を免疫治療に
    より処置するためのワクチンの製造における、請求項７〜１２および請求項１５
    〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用。
25. 【請求項２５】 大腸癌またはその他の大腸に関連した腫瘍もしくは疾患に
    罹患した患者またはこれらに罹りやすい患者を免疫治療により処置するためのワ
    クチンの製造における、請求項７〜１３および請求項１５〜１７のいずれか１項
    に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用。
26. 【請求項２６】 請求項７〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドまた
    は請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを哺乳動物の免疫
    系に由来する細胞と共にin vitroでインキュベートすることにより、請求項７〜
    １４のいずれか１項に記載の分子に対する免疫応答をin vitroで誘導すること、
    およびそれらの活性化免疫細胞を疾病の治療のために該哺乳動物に再注入するこ
    とを含む、免疫学的予防または治療による被験体の処置方法。
27. 【請求項２７】 前記処置が結腸直腸癌に対するものである、請求項２６に
    記載の方法。
28. 【請求項２８】 ヒトにおいて配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番
    号10または配列番号11で表されるアミノ酸配列を有するヒトCASB7439ポリペプチ
    ドに対する免疫応答を誘導する方法であって、該ヒトCASB7439ポリペプチドまた
    はCASB7439コードポリヌクレオチドの異種形態を含む組成物の有効用量を被験体
    に投与することを含む該方法。
29. 【請求項２９】 前記異種CASB7439ポリペプチドまたはCASB7439コードポリ
    ヌクレオチドがマウスまたはラットから単離される、請求項２８に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記異種マウスおよびラットCASB7439ポリペプチドが、そ
    れぞれ配列番号12および配列番号14のアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配
    列番号13および配列番号15の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる
    、請求項２９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 請求項７〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドまた
    は免疫原性断片に対して免疫特異的な抗体。
32. 【請求項３２】 請求項７〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの機
    能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法であって、 （ａ）候補化合物と、上記ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持してい
    る細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に
    直接または間接的に結合させた標識により測定すること、 （ｂ）候補化合物と、上記ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持してい
    る細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質と、の結合を、標識競合物質
    の存在下で測定すること、 （ｃ）候補化合物が上記ポリペプチドの活性化または抑制により生ずるシグナ
    ルをもたらすか否かを、該ポリペプチドを担持している細胞または細胞膜に適し
    た検出系を用いて調べること、 （ｄ）候補化合物と、請求項７〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを
    含有する溶液とを一緒にして混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活
    性を測定して、該混合物の活性をスタンダードと比較すること、または （ｅ）候補化合物が細胞における上記ポリペプチドをコードするmRNAおよび該
    ポリペプチドの産生に及ぼす効果を例えばELISAアッセイを用いて検出すること
    、 よりなる群から選択される方法を含んでなるスクリーニング法。
33. 【請求項３３】 請求項７〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドに対
    するアゴニストまたはアンタゴニスト。
34. 【請求項３４】 治療上使用するための、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか
    である化合物： （ａ）請求項７〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドに対するアゴニス
    トまたはアンタゴニスト； （ｂ）請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド
    ；または （ｃ）請求項７〜１２のいずれか１項に記載のポリぺプチドをコードするヌク
    レオチド配列の発現をモジュレートする核酸分子。
35. 【請求項３５】 被験体から得られたサンプル中の請求項７〜１２のいずれ
    か１項に記載のポリペプチドの存在または量を分析することを含む、該被験体に
    おける該ポリペプチドの発現または活性に関連した該被験体の疾病または該疾病
    への罹りやすさを診断する方法。
36. 【請求項３６】 被験体から得られたサンプル中の請求項１５〜１９のいず
    れか１項に記載のポリヌクレオチドの存在または量を分析することを含む、該被
    験体における該ポリヌクレオチドの発現または活性に関連した該被験体の疾病ま
    たは該疾病への罹りやすさを診断する方法。
37. 【請求項３７】 被験体から得られたサンプル中の請求項７〜１２のいずれ
    か１項に記載のポリペプチドの存在または量を分析することを含む、該被験体に
    おける該ポリペプチドの発現または活性に関連した該被験体の大腸癌の存在また
    は大腸癌への罹りやすさを診断する方法。
38. 【請求項３８】 被験体から得られたサンプル中の請求項１５〜１９のいず
    れか１項に記載のポリヌクレオチドの存在または量を分析することを含む、該被
    験体における該ポリヌクレオチドの発現または活性に関連した該被験体の結腸直
    腸癌の存在または結腸直腸癌への罹りやすさを診断する方法。