ES2291071A1 - Agentes y metodos basados en el uso del dominio eda de la fibronectina. - Google Patents
Agentes y metodos basados en el uso del dominio eda de la fibronectina. Download PDFInfo
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Abstract
Agentes y métodos basados en el uso del dominio EDA de la fibronectina. La presente invención se refiere al empleo de un polipéptido que comprende una secuencia correspondiente al dominio EDA de la fibronectina, un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a TLR4, o una variante de dicho dominio EDA o fragmento que es capaz de unirse a TLR4 y presenta una homología mayor del 70% con cualquier forma o fragmento natural del dominio EDA, en la elaboración de un agente inmunoestimulador. La presente invención se refiere también a los métodos de producción y las aplicaciones del citado agente.
Description
Agentes y métodos basados en el uso del dominio
EDA de la fibronectina.
Esta invención se refiere a un vector proteínico
para el transporte molecular a células que expresan el receptor
TLR4 (Toll-like receptor 4), la preparación
de dicho vector proteínico y sus aplicaciones, con una particular
incidencia en la preparación y utilización de composiciones
farmacéuticas, particularmente composiciones inmunoterapéuticas,
para la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas y
tumorales.
Los patógenos y el cáncer siguen siendo las
principales causas de muerte en el mundo. El desarrollo de vacunas
para prevenir enfermedades para las que no existe vacunación -como
SIDA o paludismo- o para tratar enfermedades crónicas o cánceres,
así como la mejora de la eficacia y seguridad de las vacunas ya
existentes, sigue siendo una prioridad. En la mayoría de los casos,
el desarrollo de tales vacunas requiere estrategias capaces de
estimular de modo específico a los linfocitos T citotóxicos CD8+
(CTL).
Los CTL se activan mediante la presentación a
receptores de células T (TCR) de péptidos pequeños asociados a
moléculas MHC de clase I. Estos complejos
péptido-MHC de clase I están presentes en la
superficie de células presentadoras de antígenos (APC), que son
también capaces de proporcionar señales de estímulo para la
activación óptima de los CTL.
Las células dendríticas (DC) son las APC más
potentes y tienen una capacidad única para interactuar con los
linfocitos T no activados (naive T lymphocytes) e iniciar la
respuesta inmune primaria, activando a los linfocitos T ayudadores
CD4+ (helper) y a los linfocitos T citotóxicos CD8+. La
presentación antigénica y la estimulación de células T por las DC
ha sido estudiada por Guermonprez y cols. ("Antigen presentation
and T cell stimulation by DC". Annu. Rev. Immunol. 2002,
20:621-627), cuyo contenido se incluye aquí como
referencia.
En ausencia de inflamación y de respuesta
inmunológica, las células dendríticas patrullan a través de la
sangre, tejidos periféricos, linfa y órganos linfoides secundarios.
En los tejidos periféricos, las células dendríticas capturan
antígenos propios y ajenos. Los antígenos captados son procesados
hasta péptidos proteolíticos y pasan a las moléculas MHC de clase I
y II (para la activación de linfocitos T CD8+ o CD4+,
respectivamente). Este proceso de captación de antígeno,
degradación y carga, se denomina presentación antigénica. Sin
embargo, en ausencia de estimulación, las células dendríticas
periféricas presentan los antígenos de modo ineficaz. La(s)
señales) exógena(s) provenientes de los patógenos o
la(s) señal(es) endógena(s), induce(n) a
las células dendríticas para que inicien un proceso de desarrollo
denominado maduración, que transforma a las células dendríticas en
APC y en activadores de linfocitos T. Los productos bacterianos y
virales, así como las citoquinas inflamatorias y otras moléculas
propias, inducen la maduración de las células dendríticas mediante
interacción directa con los receptores de superficie de las células
dendríticas innatas. Los linfocitos T, a través de vías
dependientes e independientes de CD40, y las células endoteliales,
contribuyen a la maduración final de las células dendríticas
mediante contacto directo célula a célula y mediante secreción de
citoquinas. Poco tiempo después de que surja una señal de peligro,
se modifica la eficacia de la captación de antígenos, el transporte
intracelular y la degradación, y el tráfico intracelular de
moléculas MHC. Se incrementa la carga de péptidos, así como la vida
media y el traslado a la superficie celular de las moléculas MHC.
También aumenta la expresión en superficie de las moléculas
co-estimuladoras de células T. De este modo, las
células dendríticas se convierten en las APC más potentes, y las
únicas capaces de activar a los linfocitos T no activados e iniciar
la respuesta inmunológica. Junto a la modificación de sus
capacidades en la presentación de antígenos, la maduración induce
también la migración masiva de células dendríticas fuera de los
tejidos periféricos. Las modificaciones en la expresión de
receptores de quimioquinas y moléculas de adhesión, así como los
importantes cambios en la organización del citoesqueleto,
contribuyen a la migración de las células dendríticas a través de la linfa hasta los órganos linfáticos secundarios.
contribuyen a la migración de las células dendríticas a través de la linfa hasta los órganos linfáticos secundarios.
Las células dendríticas responden a dos tipos de
señales: al reconocimiento directo de patógenos (mediante
receptores con patrón de reconocimiento específico), y al
reconocimiento indirecto de la infección (mediante citoquinas
inflamatorias, compuestos celulares internos, y respuestas
inmunológicas específicas). En respuesta a estas señales, las
células dendríticas se activan e inician su proceso de maduración,
que las transforma en estimuladores eficaces de células T. Se han
observado al menos cinco tipos de receptores de superficie capaces
de desencadenar la maduración de células dendríticas: (i) los
receptores tipo peaje "toll-like
receptors" (TLR), (ii) los receptores de citoquinas, (iii)
moléculas de la familia de receptores TNF (TNF-R),
(iv) FcR, y (v) sensores de muerte celular. Algunos de los
estímulos más eficaces de maduración están mediados por
interacciones de TLR (TLR1-9) con sus respectivos
ligandos. Kaisho y Akira han realizado una revisión de los
receptores tipo peaje ("Toll-like receptors as
adjuvant receptors". Biochimica et Biophysica Acta, 2002,
1589: 1-13). Los TLR se expresan en los macrófagos
y en las células dendríticas, y en otras células como los
linfocitos B. También se han identificado ligandos para diversos
TLR. La mayoría de estos ligandos proceden de patógenos pero no se
encuentran en el huésped, lo que sugiere que los TLR son
fundamentales para detectar a los microorganismos invasores. El
reconocimiento de ligandos por los TLR da lugar a una rápida
activación de la inmunidad innata al inducir la producción de
citoquinas proinflamatorias y a la sobreregulación de moléculas
co-estimuladoras. La inmunidad innata activada da
lugar a una inmunidad adaptativa eficaz. Respecto a los TLR4, los
patrones moleculares específicamente reconocidos son
lipopolisacáridos LPS (bacterias gramnegativas), ácidos
lipoteicoicos (bacterias grampositivas), taxol, proteína F (virus
respiratorio sincitial), proteína 60 del shock térmico, y el
dominio EDA de la fibronectina.
Por tanto, una vacuna que sea capaz de inducir
respuestas óptimas de células T deberá cumplir diversas
condiciones. Lo primero, deberá ser capaz de transportar hasta las
APC (o DC) los epítopos de linfocitos T derivados de antígenos para
que sean cargados en las moléculas MHC de clase I y/o II. Así, la
vectorización hasta las DC representaría el objetivo principal en
el diseño de nuevos sistemas transporte para el desarrollo de
vacunas. Además, el vector deberá transmitir las señales apropiadas
a la DC para inducir su activación. La llegada del antígeno a la DC
sin que haya señal de maduración podría causar tolerancia en lugar
de activación de linfocitos T ayudadores y citotóxicos. Además, su
eficacia no deberá verse afectada por la inmunidad previa frente al
propio vector.
Una primera aproximación para dirigir los
péptidos antigénicos a las moléculas MHC de clase I y/o II, está
basada en vacunas peptídicas sintéticas que contienen epítopos
seleccionados capaces de unirse directamente a estas moléculas en
la superficie de las APC. En algunos casos estos péptidos han
logrado protección tumoral o eliminación de virus en modelos
murinos, mientras que en otros han inducido tolerancia. Los
estudios con diferentes tipos de péptidos en humanos han conseguido
tímidas respuestas clínicas en pacientes con cáncer.
Se están desarrollando también un número
importante de estrategias que, básicamente, pueden dividirse en dos
categorías. El primer tipo se basa en la síntesis del antígeno por
las APC, o su traslado activo al citoplasma de la célula para que
acceda a la vía clásica de procesamiento del antígeno en
MHC-I. El segundo tipo se aprovecha de la capacidad
de presentación cruzada de las APC y se basa en antígenos exógenos
libres o asociados a células. El traslado de antígenos al
citoplasma de las APC se ha logrado mediante toxinas bacterianas
(Morón y cols. "New tools for antigen delivery to the MHC class I
pathway". TRENDS in Immunology, 2004; 25:
92-97). A modo de ejemplo, EP1188446A1 se refiere a
un vector proteínico, basado en la toxina adenilciclasa de
Bordetella, para el traslado de moléculas a células que expresan
CD11b.
La presente invención se refiere al dominio
extra A (EDA) de la fibronectina, un posible ligando natural de
TLR4, como medio teórico para el transporte de antígenos a células
que expresan TLR4 y que podría inducir la selección apropiada y la
maduración de las APC, y dar lugar finalmente a una respuesta CTL
específica eficaz. Las moléculas de fibronectina son producto de un
único gen, cuya proteína resultante puede existir en múltiples
formas generadas del corte y empalme alternativo de un único
pre-ARNm (Pankov R y Kenneth MY, "Fibronectin at a
glance". Journal of Cell Science, 2002;
115:3861-3863). El corte y empalme más importante
se produce en el grupo central de repeticiones tipo III. La
utilización de exones o de saltos da lugar a la inclusión o
exclusión de una de las dos repeticiones tipo III: el dominio extra
B (también llamado EDB, EIIIB o EDII), y el dominio extra A
(también llamado EDA, EIIIA o EDI). Las fibronectinas celulares,
que contienen alternativamente EDA y EDB, se producen en respuesta
a daño tisular. Entre otras funciones biológicas, se ha observado
que EDA induce la liberación de proteoglicanos y la expresión de
metaloproteinasas (MMP 1, 3, y 9) y de citoquinas
pro-inflamatorias (ver Saito S y cols. "The
Fibronectin Extradomain A activates matrix metalloproteinase gene
expression by an
interleukin-1-dependent
mechanism", J. Biol. Chem. 1999;
161:3071-3076). También se ha comprobado que EDA es
capaz de activar TLR4 e inducir por tanto respuestas tipo LPS
(Okamura Y y cols., "The extra domain A of fibronectin activates
Toll-like receptor 4", J. Biol. Chem.
2001; 276:10229-10233).
Por una parte, la presente invención se refiere
al uso de un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que corresponde a:
- a)
- el dominio EDA de la fibronectina (EDA),
- b)
- un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a TLR4, o
- c)
- una variante de dicho dominio EDA o fragmento capaz de unirse a TLR4 y que tenga una homología mayor del 70% con cualquier forma natural de dicho dominio EDA o fragmento,
en la preparación de un agente
inmunoestimulador.
Según la invención, en una realización
específica la secuencia de aminoácidos del dominio EDA de
fibronectina será la de una forma natural de EDA que sea capaz de
unirse a TLR4. Este dominio EDA puede seleccionarse entre las
formas naturales del dominio en cualquier especie animal,
particularmente en mamíferos, por ejemplo roedores (ratones, ratas,
etc.) o primates (particularmente humanos).
En otra realización particular, el agente
inmunoestimulador comprende una secuencia de aminoácidos parcial de
un dominio EDA que se caracteriza por su capacidad de unión a
TLR4.
En otra realización particular de la invención,
el dominio EDA es una variante modificada de alguna de las formas
naturales del dominio EDA o sus fragmentos, y se caracteriza
también por tener la propiedad de unirse a TLR4. En un caso
concreto, una variante del dominio EDA presenta una homología mayor
del 70% con cualquier forma natural del dominio EDA. Una variante
modificada adecuada puede seleccionarse comparando la secuencia de
un dominio EDA de fibronectina, o un fragmento del mismo, con otras
secuencias polipeptídicas candidatas. Para el análisis de
homología podrá emplearse cualquier algoritmo de alineamiento (por
ejemplo, FASTA, Lipman DJ, Pearson WR. Rapid and sensitive protein
similarity searches, Science. 1985 Mar 22;
227(4693):1435-41), o software informático
(p.ej. Jellifish de Labvelocity Inc., o Blast software de NCBI). De
este modo, las secuencias polipeptídicas candidatas que tengan una
homología mayor del 70% se evalúan para determinar su capacidad de
unión a TLR4. Las propiedades de unión a TLR4 pueden valorarse
mediante cualquier ensayo de unión convencional, por ejemplo
utilizando citometría de flujo tal y como se describe en The
Current Protocols in Immunology y en The Current Protocols in
Protein Science publicados por John Wiley & Sons (Editado por:
John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M.
Shevach, Warren Strober) (actualizado periódicamente. Última
actualización 1 de mayo de 2005).
En una realización de la invención el dominio
EDA comprende una secuencia que se selecciona entre:
- a)
- la secuencia de aminoácidos completa de un dominio EDA de ratón (Entrez Protein: NM_010233, aminoácidos 1721 a 1810; SEQ. ID. NO: 2, aminoácidos 2-91);
- b)
- la secuencia de aminoácidos completa de un dominio EDA humano (Entrez Protein NM_002026, aminoácido 1631 a 1716; SEQ. ID. NO: 4); y
- c)
- un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a células que expresen TLR4.
En otra realización particular, el dominio EDA
incluye una secuencia que se selecciona entre:
- a)
- aminoácidos 2-57 de SEQ. ID. NO: 6, que corresponde a una forma de corte y empalme alternativo del dominio EDA de fibronectina de ratón;
- b)
- la secuencia SEQ. ID. NO: 8, que corresponde a una forma de corte y empalme alternativo del dominio EDA de humanos; y
- c)
- un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a células que expresen TLR4.
En algunas realizaciones el agente
inmunoestimulador puede incluir también una o más moléculas de
interés. Cuando está presente en el agente inmunoestimulador, la
molécula de interés puede administrarse en una cantidad que, en
combinación con los otros componentes del agente, genera una
respuesta inmunitaria eficaz frente a la molécula.
En una realización preferida, el dominio EDA (o
un fragmento o variante de esta) y la molécula de interés se
encuentran unidos en la misma molécula híbrida o vector
proteínico.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un vector proteínico como el descrito anteriormente, en
el que la molécula de interés se selecciona entre los siguientes
tipos o grupos: polipéptidos, lipopéptidos, oligosacáridos,
polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos, y fármacos.
En una realización particular del vector
proteínico, la molécula de interés es un antígeno o un epítopo. En
una realización de la invención, el antígeno acoplado al vector es
un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, o
un antígeno parasitario. En otra realización, el antígeno es un
antígeno tumoral o un determinante antigénico tumoral. En el
presente texto el término "epítopo" se refiere a una secuencia
peptídica que se une a las moléculas MHC de clase I o clase II, y
que puede ser reconocida por el receptor de células T de linfocitos
T CD8+ o CD4+, respectivamente, e inducir una respuesta
inmunológica.
En una realización específica, la molécula de
interés es el determinante antigénico T citotóxico de la
ovoalbúmina (OVA 257-264) o SIINFEKL (SEQ. ID. NO:
2, aminoácidos 95-102, que presenta 3 aminoácidos
adicionales en el extremo C-terminal y en el
N-terminal del epítopo).
El antígeno puede ser cualquier material capaz
de producir una respuesta inmunológica Th, una respuesta de
linfocitos T CD8+, una respuesta de células NK, una respuesta de
linfocitos T [gamma]/[delta], o una respuesta de anticuerpos.
Aunque sin limitarse a ellos, los antígenos apropiados incluyen
péptidos; polipéptidos; lípidos; glucolípidos, polisacáridos;
hidratos de carbono; polinucleótidos; priones; bacterias, virus u
hongos vivos o inactivados; y antígenos derivados de bacterias,
virus, hongos, protozoos, tumores o microorganismos, toxinas o
toxoides.
En otra realización particular del vector
proteínico el antígeno es un alergeno.
En otra realización especialmente interesante de
la invención, la molécula de interés es un compuesto químico o un
fármaco enlazado química o genéticamente con el vector proteínico.
De este modo, el vector proteínico es útil para la vectorización de
fármacos específica hacia células que expresan TLR4.
En una realización particular, el vector
proteínico se caracteriza por incluir una secuencia Tag, por
ejemplo una cola de histidinas N-terminal. Esto
simplificará el proceso de purificación cuando el vector proteínico
se obtenga mediante ingeniería genética. Como ejemplo, las
secuencias SEQ. ID. NO: 2 y SEQ. ID. NO: 6 representan modalidades
específicas del vector proteínico de la invención.
El dominio EDA incorporado al vector proteínico
se caracteriza porque se une a TLR4 y facilita la translocación de
la molécula de interés al citosol de las células que expresan
TLR4.
Así, la invención también se refiere al uso del
vector proteínico para dirigir y translocar una molécula de interés
a las células que expresan TLR4. En una realización particular, las
células que expresan TLR4 son cualquier tipo de células
presentadoras de antígeno (APC). En una realización preferida,
dichas APC son células dendríticas.
En otra realización particular, el vector
proteínico se caracteriza por facilitar la translocación del
antígeno o epítopo de interés, favoreciendo su posterior
procesamiento y carga en las moléculas MHC para la presentación del
antígeno a los linfocitos T.
En otra realización, el vector proteínico es
capaz de estimular la maduración de la APC, aumentando la
expresión de moléculas MHC y de señales
co-estimuladoras. En una realización particular
ventajosa, el vector proteínico se caracteriza por ser capaz de
inducir simultáneamente la presentación del antígeno y facilitar
la maduración de las APC, induciendo así una respuesta inmunológica
antígeno-específica eficaz. En una realización aún
más preferida, esta respuesta inmunológica
antígeno-específica es una respuesta CTL.
El vector proteínico puede obtenerse mediante
tecnología de recombinación de ADN. Así, en otro aspecto, la
invención se refiere a un ácido nucleico modificado que codifica
para el vector proteínico de la invención. Este ácido nucleico
puede deducirse fácilmente a partir de la secuencia de aminoácidos
del vector proteínico.
Este ácido nucleico modificado puede estar
contenido en una construcción o constructo de ADN. Así, la
invención proporciona un constructo de ADN que comprende un ácido
nucleico que codifica para el vector proteínico de la invención.
Este constructo de ADN puede incorporar una secuencia de control
que esté operativamente unida al ácido nucleico que codifica al
vector proteínico. "Operativamente unido", referido a ácidos
nucleicos, significa que un ácido nucleico se sitúa en relación
funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Las "secuencias
de control" son señales de expresión reconocidas por una célula
hospedadora específica, y que regulan funciones como la
transcripción y la traducción de una secuencia codificadora
concreta (son ejemplos de secuencias de control los promotores,
aumentadores, finalizadores de transcripción, puntos de unión a
ribosomas, péptidos señal para secreción proteica o para otras
localizaciones subcelulares). La unión de las secuencias deseadas
se realiza mediante unión en puntos de restricción específicos. En
caso de que éstos no existan, se emplean ligadores o adaptadores de
oligonucleótidos sintéticos, siguiendo métodos convencionales. Una
ventaja en este sentido es que el constructo de ADN también incluya
un marcador o gen que codifica un motivo o fenotipo que permite la
selección de la célula hospedadora transformada con el constructo
de ADN. El ácido nucleico modificado y el constructo de ADN
referidos, pueden obtenerse mediante métodos convencionales
recogidos en cualquier manual de laboratorio (por ejemplo,
"Molecular Cloning: a Laboratory manual." Joseph Sambrook,
David W. Russel Eds. 2001, 3ª ed. Cold Spring Harbor, Nueva
York).
En una realización particular, el ácido nucleico
modificado o el constructo de ADN de la invención comprenden la
SEQ. ID. NO: 1, o SEQ ID. NO: 5.
El ácido nucleico modificado o el constructo de
ADN de la invención pueden insertarse en un vector adecuado. Así,
en otro aspecto, la invención se refiere a un vector, como un
vector de expresión, que comprende el mencionado ácido nucleico
modificado o constructo de ADN. La elección del vector dependerá de
la célula hospedadora en la que se vaya a insertar. A modo de
ejemplo, el vector en el que se inserta el ácido nucleico puede ser
un plásmido o un virus que al insertarse en la célula podrá o no
incluirse en el genoma celular. El vector puede obtenerse mediante
métodos convencionales (Sambrook y cols., 2001, citado
supra).
En otro aspecto, la invención se refiere a una
célula hospedadora, como una célula hospedadora transformada, que
comprende un ácido nucleico modificado o una construcción de ADN
según la invención. Según la invención, la célula hospedadora de
expresión es un procariota, p.ej. Escherichia coli, o un
hospedadora eucariota, p.ej. levaduras (por ejemplo
Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris), células de
insecto, o células de mamíferos.
En otra realización particular de la invención,
el vector de expresión que comprende el ácido nucleico modificado
o constructo de ADN que codifica para el vector proteínico de la
invención está destinado para terapia o transferencia génica in
vivo. En una realización más específica, el vector de expresión
es un vector viral. Los vectores virales apropiados incluyen,
entre otros a: adenovirus, adenoasociados, retrovirus, lentivirus,
alfavirus, herpesvirus, vectores derivados de coronavirus, etc.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir el vector proteínico de la invención que
incluye cultivar una célula hospedadora de expresión que contenga
un ácido nucleico modificado o un constructo de ADN según la
invención, en condiciones que permitan la expresión del vector
proteínico. Las condiciones para optimizar el cultivo de la célula
hospedadora dependerán del tipo de célula hospedadora empleado. Si
se desea, el método para producir el vector proteínico de la
invención incluirá el aislamiento y purificación del mismo.
Alternativamente, el vector proteínico de la
invención podrá obtenerse por otros métodos convencionales. Estos
métodos incluyen, por ejemplo, la síntesis química en fase sólida;
la purificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento
(HPLC); y, si se prefiere, el análisis mediante técnicas
convencionales como la secuenciación o la espectrometría de masas,
el análisis de aminoácidos, las técnicas de resonancia magnética,
etc.
En otra realización, el vector proteínico de la
invención podrá obtenerse mediante enlace covalente del polipéptido
con la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio EDA de
la fibronectina (EDA) (o un fragmento de dicho dominio capaz de
unirse a TLR4, o una variante del mismo), con la molécula de interés
(p.ej. polipéptidos, lipopéptidos, oligosacáridos, polisacáridos,
ácidos nucleicos, lípidos, u otros compuestos químicos). Esto puede
realizarse con métodos convencionales incluidos en los manuales de
laboratorio por ejemplo, "The current protocols in protein
chemistry", publicado por John Wiley & Sons (actualizado
periódicamente. Última actualización 1 de mayo de 2005), o
"Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK
Mallia and PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992.
De acuerdo con la invención, el vector
proteínico, o el ácido nucleico modificado y constructos de ADN que
lo codifican, o los vectores de expresión y las células
hospedadoras de expresión que incorporan los citados ácido nucleico
modificado o constructos de ADN, pueden emplearse para preparar una
composición farmacéutica.
En otra realización, la invención se refiere al
uso del polipéptido con la secuencia de aminoácidos
correspondiente al dominio EDA de la fibronectina (EDA), o un
fragmento o una variante de este, tal y como se ha descrito
anteriormente, en la preparación de un agente inmunoestimulador que
se caracteriza por ser una composición farmacéutica.
En ciertas realizaciones, la composición
farmacéutica de la invención puede emplearse para estimular la
maduración de células presentadoras de antígeno, o para inducir una
respuesta inmune específica frente a la molécula de interés. En una
realización particular, la composición farmacéutica puede emplearse
para inducir una respuesta inmunológica Th1 en un sujeto al que se
le administra la composición farmacéutica. Tal y como se utiliza
aquí, "inducir una respuesta inmunológica Th1" incluye casos en
los que la composición inmunoestimuladora induce una respuesta
mixta Th1/Th2. En otros casos, no obstante, la composición
inmunoestimuladora induce una respuesta inmunológica Th1 con poca o
prácticamente ninguna inducción de respuesta inmunológica Th2. En
una realización concreta, la composición farmacéutica puede
emplearse para inducir una respuesta CTL.
En ciertas realizaciones, la composición
farmacéutica puede emplearse como adyuvante inmunoestimulador,
p.ej. en combinación con uno o más antígenos, con o sin adyuvantes
adicionales. Así, en algunos casos, la composición farmacéutica
puede formar una vacuna. En otros, la composición
inmunoestimuladora puede servir de adyuvante para emplearlo junto a
una vacuna.
La composición inmunoestimuladora que incluye al
polipéptido con el dominio EDA de la fibronectina (o un fragmento
o una variante de este) puede aumentar la expansión de linfocitos T
CD8+ activados, la generación de linfocitos T CD8+ de memoria, o
ambos. De este modo, la composición inmunoestimuladora puede
incrementar la inmunidad mediada por células específicas de antígeno
en un sujeto que la reciba.
En una realización concreta, la composición
inmunoestimuladora que incluye el dominio EDA de fibronectina (o un
fragmento o una variante) es útil para el tratamiento y profilaxis
de una enfermedad infecciosa, tumoral o alérgica.
La composición inmunoestimuladora que incluye el
dominio EDA de la fibronectina (o un fragmento o una variante)
puede contener adicionalmente vehiculizantes, excipientes, y otros
ingredientes farmacéuticamente aceptables conocidos.
La composición inmunoestimuladora de la
invención puede aplicarse a animales, p.ej. mamíferos (humanos o
no), aves y similares, de acuerdo con los métodos convencionales
conocidos de la técnica común (p.ej. por vía oral, subcutánea,
nasal, tópica).
La invención proporciona también un método
terapéutico y/o profiláctico que incluye administrar a un sujeto
una composición inmunoestimuladora que incluye el dominio EDA de la
fibronectina (o un fragmento o una variante de esta).
Las vías de administración incluyen, entre
otras, absorción transdérmica o transmucosa, inyección (p.ej.
subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, etc.),
ingestión, inhalación, y similares.
Todavía en otro aspecto, la invención se refiere
a un composición farmacéutica que incluye al menos un vehículo
farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz del vector
proteínico en al menos una de sus formas de expresión:
- a)
- el vector proteínico en forma polipeptídica;
- b)
- un ácido nucleico modificado que codifica dicho vector proteínico;
- c)
- un vector de expresión que incluye al ácido nucleico modificado; o
- d)
- células hospedadoras de expresión que también incluyan el ácido nucleico modificado.
En otra realización concreta, la composición
farmacéutica se caracteriza por incluir una cantidad eficaz de
células dendríticas que han sido incubadas in vitro con el
vector proteínico en al menos una de sus formas de expresión.
En otra realización más concreta, el compuesto
farmacológico es una vacuna o una composición
inmunoterapéutico.
Adicionalmente, en la invención se proporcionan
usos adicionales del vector proteínico. En una realización de la
invención, el vector proteínico en alguna de sus formas de
expresión se utiliza para preparar una composición farmacéutica
eficaz para la inducción de la maduración dendrítica in
vitro o in vivo.
En otra realización, el vector proteínico se
utiliza para preparar una composición farmacéutica que induzca una
respuesta inmunitaria específica frente a la molécula de interés
(antígeno o epítopo) acoplada al vector proteínico. Esta respuesta
inmune es una respuesta inmune humoral (producción de anticuerpos
frente a la molécula de interés), una respuesta T colaboradora, o
una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL). En una
realización preferida, dicha respuesta inmunitaria es de tipo
CTL.
En una realización más concreta, la invención se
refiere al empleo del vector proteínico en la preparación de una
composición farmacéutica útil para el tratamiento y profilaxis de
una enfermedad infecciosa. Dicha enfermedad podrá ser bacteriana,
viral, fúngica, o parasitaria.
En otra realización concreta, la invención se
refiere al empleo del vector proteínico en la preparación de una
composición farmacéutica útil para el tratamiento y profilaxis de
una enfermedad tumoral.
Todavía en otra realización particular, la
invención se refiere al empleo del vector proteínico en la
preparación de una composición farmacéutica útil para el
tratamiento y profilaxis de una enfermedad alérgica. Diversas
enfermedades alérgicas están relacionadas con la activación de una
respuesta inmune Th2. De este modo, un desvío o un cambio de
respuesta Th2 a Th1 empleando el vector proteínico con un alergeno
específico, puede tener un efecto protector o terapéutico frente a
la enfermedad alérgica.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, la composición farmacéutica propuesta se emplea para su
administración a un huésped animal o humano. Puede emplearse
cualquier vía de administración adecuada. En una realización
concreta, la composición farmacéutica se administra por vía
parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular),
transdérmica, o mucosa.
Figura 1. Análisis mediante
SDS-PAGE (A) y Western blot (B) empleando
anticuerpos anti-His. Se cargó una alícuota de
la proteína de fusión en un gel de poliacrilamida al 15% y se
sometió a electroforesis y a Western blot. Los marcadores de peso
molecular (MWM) se miden en KDa. Se observa una banda
correspondiente al peso molecular putativo de la proteína
EDA-SIINFEKL-6xHis (13 KDa).
También se aprecia una segunda banda de unos 26 Kda, que podría
corresponder a un dímero de la proteína de fusión.
Figura 2. Unión del vector proteínico
EDA-SIINFEKL a TLR4. 2A: las células
HEK293-LacZ (HEK293-LacZ) y las
células HEK293-TLR4/MD2/CD14
(HEK293-TLR4) fueron pulsadas con
EDA-SIINFEKL 1 \muM, fijadas con
paraformaldehido, marcadas con anticuerpos anti-His
y anti-EDA, reveladas con anticuerpos
anti-ratón IgG-FITC y analizadas
mediante citometría de flujo. 2B: Análisis citométrico de flujo de
células de bazo pulsadas con EDA-SIINFEKL
(EDA-SIINFEKL) frente a células de bazo no pulsadas
(Control). FL1H representa unidades arbitrarias de fluorescencia y
cuenta el número de células para cada intensidad de
fluorescencia.
Figura 3. EDA-SIINFEKL activa
la vía de señalización de TLR4. Medición colorimétrica del gen
de la fosfatasa alcalina embrionaria humana secretada al
sobrenadante del cultivo de
HEK293/TLR4-MD2-CD14 o HEK293/LacZ
que expresan este gen reportero cuya expresión está controlada por
un promotor ELAM-1 inducible por
NF-\kappaB. 24 horas después de la transfección,
se incubaron las células en presencia o en ausencia de diferentes
concentraciones de LPS, 100 nM de la proteína
EDA-SIINFEKL (EDA), o 100 nM de la proteína
EDA-SIINFEKL previamente digerida mediante
proteinasa K (EDAdig). Las barras representan la inducción de
NF-\kappaB (OD obtenido con sobrenadantes de
HEK293/TLR4-MD2-CD14 dividido por OD
obtenido con sobrenadantes de HEK293/LacZ).
Figura 4. EDA-SIINFEKL induce
in vitro la secreción de citocinas proinflamatorias por las
DC. Las DC derivadas de médula ósea se cultivaron en presencia
de LPS (1 \mug/ml), EDA-SIINFEKL (500 nM), LPS
diluido (15 ng/ml, que representa más de 50 veces la cantidad de
endotoxina contaminante presentada en la preparación de proteína
EDA-SIINFEKL purificada, péptido sintético SIINFEKL
(10 \muM), o salino. Tras 24 h, se midió mediante ELISA la
presencia de IL-12 y TNF-\alpha en
el sobrenadante del cultivo.
Figura 5. EDA-SIINFEKL induce
la maduración in vivo de las células dendríticas CD11c.
La maduración de células dendríticas es un requisito para la
estimulación óptima de una respuesta de linfocitos T. Cuando se
produce la maduración, las APC aumentan la expresión de moléculas
de superficie como las MHC de clase I (H2K^{b} en nuestro modelo)
y clase II (IA^{b} en nuestro modelo), y las moléculas CD40, CD80
y CD86. Por lo tanto, se analizó si EDA-SIINFEKL
podía inducir la maduración in vivo de células que expresan
CD11c. Ratones C57BL/6 wt fueron inmunizados por vía i.v. con 25
\mug EDA-SIINFEKL, 25 \mug
EDA-SIINFEKL digeridos con proteinasa K, 25 \mug
de LPS o sólo con PBS. También se inmunizaron ratones C57BL/6 TLR4
KO con 25 \mug EDA-SIINFEKL o sólo con PBS. 15
horas después los ratones fueron sacrificados y las células CD11c
purificadas mediante el uso de un autoMACS. Las células fueron
marcadas y analizadas mediante citometría de flujo para determinar
la expresión de las moléculas H-2Kb,
I-Ab, CD40, CD80 y CD86.
Figura 6: EDA-SIINFEKL es
presentado eficazmente por células dendríticas a linfocitos T
específicos para el epítopo SIINFEKL. Caracterizamos la
capacidad de EDA-SIINFEKL de ser capturado por APC
para la presentación del epítopo CTL SIINFEKL procesado a
linfocitos T obtenidos a partir de ratones transgénicos
OT-1 específicos de este epítopo. Las DC derivadas
de médula ósea se cultivaron en presencia de medio de cultivo,
péptido sintético SIINFEKL (10 \muM), LPS (1 \mug/ml) o
EDA-SIINFEKL-6xHis (500 nM). 48
horas después se recogieron las DC y se emplearon como APC en
presencia de diferentes cantidades de células no adherentes de
OT-1. Se midió el IFN-gamma
producido por células no adherentes de ratón OT-1 y
su respuesta proliferativa (Figura 6A y 6B respectivamente).
También estudiamos el efecto de diferentes fármacos, tales como
cloroquina, monensina, brefeldina o cicloheximida en la
presentación antigénica de la proteína de fusión
EDA-SIINFEKL (Figura 6C) o el péptido sintético
SIINFEKL (Figura 6D) a los linfocitos T específicos para SIINFEKL.
A fin de estudiar si la expresión TLR4 en APC pudiera favorecer el
proceso de presentación, cultivamos células de hibridoma B3Z
(específicas para el epítopo SIINFEKL) en presencia de células de
bazo de ratones C57BL/6 wt o TLR4 KO, y con diferentes
concentraciones de EDA-SIINFEKL (nM). La cantidad
de IL-2 liberado al sobrenadante del cultivo se
midió mediante bioensayo basado en la línea CTLL (Figura 6E).
Figura 7. La inmunización de ratones con
EDA-SIINFEKL induce respuesta CTL específica para
el epítopo SIINFEKL. Los resultados precedentes demuestran que
la proteína recombinante EDA-SIINFEKL es bioactiva
y activa específicamente a las APC. La inducción de respuestas
inmunitarias específicas de linfocitos T in vivo es
fundamental para el desarrollo de una vacuna. Por tanto,
comprobamos si los ratones inmunizados con la proteína de fusión
EDA-SIINFEKL desarrollaban respuestas CTL
específicas frente a células diana pulsadas con el epítopo
SIINFEKL. Ratones C57BL6 fueron inmunizados por vía i.v. con 50
\mug de EDA-SIINFEKL (A) o con SIINFEKL (B) en
PBS en los días 0 y 10. En el día 20, se sacrificaron los ratones
para analizar la respuesta CTL frente a SIINFEKL (Figura 7).
Figura 8. EDA-SIINFEKL
protege frente al desarrollo de tumores tras la inoculación de
células tumorales EG7 que expresan OVA. Para estudiar la
capacidad de la proteína de fusión EDA-SIINFEKL
para proteger a los ratones frente a la inyección de células
tumorales EG7OVA, se inmunizó s.c. a los ratones en los días 0 y 10
con 3 nmol de EDA-SIINFEKL, SIINFEKL o con suero
salino. A los 20 días de la segunda inmunización se administraron
s.c. 10^{5} células EG7OVA. El crecimiento tumoral se controló
con un calibre y se expresó en mm^{3} con la fórmula V = (L x
w^{2})/2, donde L, es la longitud; w, anchura. Se sacrificó a los
ratones cuando el tumor alcanzó un volumen mayor de 8 cm^{3}.
Figura 9. EDA actúa como adyuvante en la
inducción de respuestas citotóxicas tras la inmunización con la
proteína OVA. Existe la posibilidad de que si EDA es capaz de
promover la maduración de las células dendríticas in vivo,
puede actuar como agente adyuvante tras la inmunización con una
proteína que contenga un epítopo citotóxico pero que por sí sola no
sea capaz de activar una respuesta citotóxica. Para probar esta
posibilidad, inmunizamos un grupo de ratones con 50 microgramos de
EDA junto con 500 microgramos de la proteína ova (A) y otro grupo de
ratones con 500 microgramos de OVA (B), sin utilizar ningún otro
tipo de adyuvante. Una semana después de la inmunización, los
ratones fueron sacrificados y los esplenocitos fueron cultivados en
presencia del péptido sintético SIINFEKL. Tras 5 días de cultivo,
se midió en ambos grupos la respuesta citotóxica frente a células
diana EL-4 previamente pulsadas con o sin el
péptido SIINFEKL en un experimento convencional de liberación de
51-Cr.
Se amplificó el dominio extra de fibronectina
(EDA) con RT-PCR utilizando primers específicos y
ARN de hepatocitos de ratones tratados con
concanavalina-A para inducir daño hepático [Lasarte
y cols, Hepatology. 2003; 37(2):461-70.].
Las partes de tejido hepático se homogeneizaron y lisaron en
Ultraspec (Biotecx, Houston, TX, USA) utilizando un Ultraturrax
Driver T.25 (Janke & Kunkel, Ika-Labortechnik,
Alemania). El ARN se aisló según los métodos de Chomczynski y
Sacchi (Chomczynski P y Sacchi N. Single-step
method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform
extraction. Anal Biochem 1987; 162: 156-159).
Se realizó la transcripción inversa del ARN (60 min a 37ºC) con
200U de transcriptasa inversa M-MuLV
(Gibco-BRL) en 20 \muL de volumen de tampón 5xRT
(250 mM Tris-HCl Ph 8.3, 375 mM KCl, 15 mM
MgCl_{2}) suplementado con ditiotreitol 5 mM (DDT), trifosfato
desoxinucleósido 0.5 mM (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania),
25U de inhibidor de ribonucleasa (Promega Corporation, Madison, WI,
EE.UU.) y 200 ng de hexámeros aleatorios (Boehringer Mannheim).
Después de calentar (95ºC, 1 min) y enfriar en hielo rápidamente,
se utilizaron 0.3 \mug de ADNc para su amplificación por PCR en 20
\mul de una solución de tampón 10x (100 mM
Tris-HCl pH9.3, 500 mM KCl, 1% Triton
X-100) que contenía 0.08 mM dNTP, primers corriente
arriba y corriente abajo(40 ng cada), 1.5 mM MgCl_{2} y 2U
de polimerasa ADN Taq (Promega Corporation). El primer
corriente arriba fue (SEQ. ID. NO: 9)
- 5' C CATATG AACATTGATCGCCCTAAAGGACT 3'
(las bases subrayadas se añadieron a los primers
a fin de introducir una secuencia reconocible por la enzima de
restricción NdeI, mientras que la secuencia en cursiva corresponde
al comienzo de EDA)
y el primer corriente abajo (SEQ. ID. NO:
10)
- 5' AGCGGCCGC CCATTCAGTCAGTTTTTCAAAGTTGATTATACTCTCAAGCTG TGTGGACT GGATTCCAATCAGGGG 3'
(las bases subrayadas se añadieron a los primers
a fin de introducir una secuencia reconocible por la enzima de
restricción NotI, la secuencia en negrita corresponde a la
secuencia que codifica para el epítopo OVA CTL (SIINFEKL)
flanqueado por 3 aminoácidos en ambos extremos
QLESIINFEKLTEV, mientras que la secuencia en cursiva
corresponde al final de EDA).
El fragmento PCR amplificado se clonó en
pCR2.1-TOPO utilizando un equipo de clonación TOPO
TA Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Este plásmido se digirió con
NdeI y NotI y el fragmento de ADN obtenido fue subclonado en el
plásmido digerido NdeI/NotI pET20b (Novagen), que posibilita la
expresión de proteínas de fusión con 6 residuos de histidina (6xHis
tags) en el extremo carboxilo.
El plásmido resultante
pET20b2-26 que expresa la proteína de fusión
EDA-SIINFEKL-6xHis fue transfectado
a células BL21(DE3) para la expresión del vector proteínico
recombinante. Las células transfectadas crecieron en 1l de LB a
37ºC hasta que la OD600 alcanzó 0.5-1 unidades. Se
añadió IPTG al cultivo final, hasta una concentración final de 0.4
mM y se incubaron con agitación a temperatura ambiente durante la
noche. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación,
resuspendidas en 0.1M Tris-HCl pH=7,2, tratadas con
lisozima, fragmentadas empleando una prensa de French (dos pases a
20.000 pst), aclarados por centrifugación y filtradas. La proteína
de fusión presente en la fracción soluble fue purificada mediante
cromatografía de afinidad (Histrap, Pharmacia) empleando una
plataforma FPLC (AKTA, Pharmacia). La proteína se desaló mediante
columnas de desalado Hitrap (Pharmacia), y se concentró con el
dispositivo de filtro con centrifugación Amicon Ultra
4-5000 MWCO (Millipore Carrighwahill, Irlanda). El
vector proteínico recombinante se purificó de endotoxinas
utilizando columnas Endotrap (Profos Ag, Regensburg, Alemania),
hasta que los niveles de endotoxina estuvieron por debajo de
0.2EU/\mug de proteína (evaluado con el ensayo LAL, Cambrex).
Se colocaron 20 \mug de proteína de cada
muestra en gel de SDS-acrilamida al 15%, seguido de
transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa. Las
membranas se bloquearon durante la noche con PBS que contenía 0,5%
de Tween 20 y 2% de BSA (tampón bloqueador). La detección de
proteína EDA-SIINFEKL recombinante se realizó
mediante la incubación de la membrana con una disolución 1/500 de
anticuerpo monoclonal penta-His purificado en un
tampón bloqueador durante 1 hora, seguida de incubación con
anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con
peroxidasa. Las bandas de proteína se detectaron mediante
quimioluminiscencia ECL (Amersham). Se observó una banda
correspondiente al peso molecular putativo (13 kDa).
Para determinar si la proteína
EDA-SIINFEKL recombinante era capaz de unirse a las
células que expresan TLR-4, empleamos HEK293 que
expresan TLR4humano-MD2-CD14 (de
Invivogen). También empleamos células HEK293 transfectadas con LacZ
(Invivogen) a modo de control negativo. Se pulsaron las células con
1 mM EDA-SIINFEKL durante 1 h a 4ºC, se lavaron con
PBS y se fijaron con paraformaldehido al 4% en PBS durante 10 min.
Tras 3 lavados, las células fueron marcadas con anticuerpos
anti-His al 1/100 (Qiagen) y
anti-CD16 al 1/200 (FcBlock, de Becton Dickinson)
durante 1 hora y 30 min. Tras 3 lavados, las células fueron
incubadas durante 30 min con una disolución 1/100 de anticuerpo
anti-IgG ratón marcado con fluoresceína y se
analizó mediante citometría de flujo. Este experimento también se
realizó con células de bazo obtenidas de ratones C57BL/6 incubadas
en presencia o ausencia de proteína recombinante
EDA-SIINFEKL.
De acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Invivogen), se transfectaron células de expresión
HEK293/hTLR4-MD2-CD14 o HEK293/LacZ
con un plásmido que transportaba el gen de fosfatasa alcalina
embrionaria humana secretable (SEAP). La expresión de SEAP se
controla mediante un promotor
NF-\kappaB-inducible
ELAM-1 (pNiFty-SEAP (Invivogen)). 24
h después de la transfección, se incubaron las células en presencia
o ausencia de diferentes concentraciones de LPS, proteína
EDA-SIINFEKL 100 nM o proteína
EDA-SIINFEKL previamente digerida con proteinasa K
100 nM (ver más adelante). Después de 24 h se midió la expresión
del gen reportero en el sobrenadante de cultivo mediante un ensayo
colorimétrico (Invivogen). En la Figura 3 las barras representan el
factor de inducción de NF-\kappaB (OD obtenido en
los sobrenadantes a partir de
HEK293/TLR4-MD2-CD14 dividido por
OD obtenido en los sobrenadantes a partir de HEK293/LacZ). La
cantidad de contaminantes de endotoxina en las preparaciones EDA de
este estudio estuvo por debajo de 0,0003 \mug/ml.
La proteína recombinante
EDA-SIINFEKL se expresó en E.coli como una
proteína de fusión 6xHis (SEQ. ID. NO: 2), purificada mediante
cromatografía de afinidad, desalada y liberada de endotoxinas tal y
como se describió en el apartado de métodos. La proteína
resultante se analizó mediante SDS-PAGE y Western
blot empleando anticuerpos anti-His (Figura 1). Se
observó una banda correspondiente al peso molecular putativo (13
kDa) junto a una segunda banda (26 kDa) que podría corresponder a
un dímero de la proteína.
Se ha descrito que el dominio extra A de
fibronectina activa al receptor TLR4 (Okamura y cols, JBC, 2001;
276:10229-10233). No obstante, no hay evidencias
directas de unión física entre EDA y TLR4. En primer lugar
analizamos si la proteína EDA-SIINFEKL tenía la
capacidad de unirse a células que expresen TLR4. Las células HEK293
que expresan hTLR4-MD2-CD14 o las
HEK293 transfectadas con LacZ (Invivogen) fueron pulsadas con
proteína EDA-SIINFEKL 1 \muM, marcadas con
anticuerpos anti-His y un anti-IgG
de ratón marcado con fluoresceína (ver métodos) y se analizó
mediante citometría de flujo. Se observó que las células HEK293 que
expresan hTLR4-MD2-CD14 humano
presentaban una intensidad de fluorescencia ligeramente mayor que
las HEK 293 que expresaban LacZ (Figura 2A). También se observó
este resultado al analizar la intensidad de la fluorescencia de las
células de bazo de los ratones C57BL/pulsados en presencia o
ausencia de EDA-SIINFEKL (Figura 2B), lo que parece
indicar que EDA-SIINFEKL es capaz de unirse a
TLR4.
La señalización TLR4 lleva a la translocación de
NF-\kappaB, un factor de transcripción que se une
a secuencias consenso en los promotores de diversos genes. Para
determinar si la proteína recombinante EDA-SIINFEKL
puede activar TLR4, empleamos células
HEK293/hTLR4-MD2-CD14 o HEK293/LacZ
transfectadas con un plásmido que transporta el gen de la fosfatasa
alcalina embrionaria humana secretable (SEAP) bajo el control de un
promotor ELAM-1
NF-\kappaB-inducible
(pNiFty-SEAP (Invivogen)). Se observó que la
proteína EDA-SIINFEKL sólo podía estimular la
expresión de SEAP en células transfectadas
HEK293/hTLR4-MD2-CD14, alcanzando
un factor de inducción NF-\kappaB de 7, similar al
que aparece al incubar las células con 0.01 \mug de LPS (Figura
3). Esta capacidad para estimular la translocación nuclear de
NF-\kappaB desaparecía por completo si la
proteína EDA-SIINFEKL era previamente digerida con
proteinasa K (Figura 3), lo que indica que la activación de la vía
TLR4 por EDA no puede ser debida a una potencial contaminación por
LPS en la preparación de proteína recombinante.
Creamos el plásmido recombinante
pET20b2-26 que nos permitía expresar la proteína de
fusión recombinante EDA-SIINFEKL 6xHis en E.
coli. La presencia de 6 histidinas facilita la detección y
purificación de la proteína de fusión. Así, pudimos purificar
importantes cantidades de la proteína de fusión a partir de la
fracción citoplásmica de los cultivos de E. coli. Los
estudios de unión realizados con células que expresan TLR4 sugieren
que la proteína EDA-SIINFEKL es capaz de unirse a
TLR4 de modo específico. Además, mostramos aquí que
EDA-SIINFEKL puede activar la vía de señalización
TLR4. Esta activación no está relacionada con la potencial
contaminación LPS de la proteína, ya que la digestión previa con
proteinasa K elimina la capacidad de estimular la translocación
nuclear de NF-\kappaB. Además, la cantidad de
contaminantes de endotoxina en la preparación de EDA de este estudio
estaba por debajo de 0.0003 \mug/ml (tal y como se determinó por
el ensayo LAL), que no puede activar la vía de señalización TLR4 en
este estudio in vitro. Estos resultados sugieren que la
proteína EDA puede utilizarse como vehículo proteínico para
seleccionar antígenos a células que expresen TLR4. Se sabe que las
células dendríticas expresan receptores tipo peaje TLR, y
especialmente TLR4. También se sabe que algunos de los estímulos de
maduración más potentes para las DC proceden de la interacción de
los receptores TLR con sus respectivos ligandos. Por tanto, la
interacción de una proteína de fusión que contenga EDA y un
antígeno determinado, podría favorecer la activación rápida de la
inmunidad congénita mediante la inducción de la producción de
citocinas proinflamatorias, y la sobreexpresión de moléculas
coestimuladoras. Además, la capacidad de esta proteína de fusión de
dirigirse y unirse a la superficie de la DC podría aumentar la
captura y la endocitosis del antígeno por la DC, incrementando así
la respuesta inmunológica frente a este antígeno.
Las células dendríticas se crecieron a partir de
células de médula ósea. Tras lisar los eritrocitos con tampón de
lisis ACK, las células fueron lavadas y se retiraron linfocitos y
granulocitos mediante incubación con una mezcla de anticuerpos
frente a CD4 (GK1; ATCC, Manassas, VA), CD8 (53.6.72; ATCC),
Ly-6G/Grl (BD-Pharmingen; San Diego
CA) y CD45R/B220 (BD-Pharmingen), seguido de
complemento de conejo. Las células restantes crecieron en 12 placas
de cultivo en medio completo con 10^{6} células/ml suplementadas
con 20 ng/ml de mGM-CSF y 20 ng/ml de
mIL-4 (ambos de Peprotech; Londres, GB). Cada 2
días el medio se sustituía con medio fresco que contenía citocinas.
Se recogieron células dendríticas no adherentes el día 7, y se
cultivaron en presencia o ausencia de 1 \mug/ml o 15 ng/ml de LPS
(Sigma), EDA-SIINFEKL (500 nM) o SIINFEKL (10
\muM) a 37ºC y 5% Col. En algunos experimentos se añadió
polimixina (10 \mug/ml) a los cultivos, a fin de inhibir el
efecto de los contaminantes de endotoxina. A las 24 h de cultivo se
recogieron los sobrenadantes y se midió IL-12 y
TNF-\alpha mediante ELISA
(BD-Pharmingen), de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
La maduración de las DC se evaluó in
vitro mediante citometría de flujo, midiendo la expresión de
varios marcadores de superficie. Se inyectó i.v. a ratones C57BL6
con 25 \mug EDA-SIINFEKL, 25 \mug
EDA-SIINFEKL digeridos con
proteinasa-K, 25 \mug LPS o sólo con PBS. La
digestión de EDA-SIINFEKL con proteinasa K se
realizó con agarosa-proteinasa K (Sigma, St Louis).
Brevemente, se utilizaron 5 mg/ml de bolas de
agarosa-proteinasa lavados en tampón de lavado
(Tris-HCl 20 mM, pH 7.2, EDTA 1 mM, ClCa_{2} 1
mM) para digerir la proteína EDA-SIINFEKL o LPS
durante 20 min a 30ºC. Las bolas de
agarosa-proteinasa K se retiraron por
centrifugación. A las 15 horas de la inmunización los ratones
fueron sacrificados y las células CD11c purificadas mediante
autoMACS. Las células fueron marcadas y analizadas mediante
citometría de flujo.
Caracterizamos la capacidad de
EDA-SIINFEKL para ser capturado por APC para
presentar el epítopo CTL SIINFEKL procesado a los linfocitos T de
los ratones transgénicos OT-1 o al hibridoma T B3Z,
ambos específicos de este epítopo. Las DC derivadas de médula ósea
se cultivaron en presencia de
EDA-SIINFEKL-6xHis 500 nM (C) o de
SIINFEKL 500 nM (D), en presencia o ausencia de cloroquina (3
\muM), Monensina (1 \mul Golgystop, Pharmingen), Brefeldina (1
\mul Golgyplug, Pharmingen), cicloheximida (4 \mug/ml). Tras 24
h de cultivo, se recogió el sobrenadante y se midió la producción
de IFN-\gamma mediante ELISA. De modo alternativo,
a las 12 h de haberse iniciado el cultivo se recogieron las DC, se
fijaron con glutaraldehído al 0,05% y se utilizaron como APC en
presencia de diferentes cantidades de células no adherentes de
OT-1 o de la línea celular hibridoma T B3Z.
La activación de las células B3Z en presencia de
APC tratadas se realizó midiendo la producción
IL-2. Las células de hibridoma B3Z (10^{5}
células/pocillo) se cultivaron en medio completo (RPMI 1640
suplementado con FCS al 10%, glutamina 2 mM, 100 U/ml de
penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 5x10^{-5}M
2-mercaptoethanol) durante 18 horas en presencia de
células de bazo (10^{5} células/pocillo) de ratones C57BL/6 wt o
de ratones TLR4 KO, y diferentes concentraciones de
EDA-SIINFEKL. La cantidad de IL-2
liberada al sobrenadante del cultivo se midió, tal y como se
describió previamente, mediante un bioensayo basado en la línea
CTLL.
Los ratones C57BL6 fueron inmunizados i.v. con
50 \mug de EDA-SIINFEKL o con SIINFEKL en los
días 0 y 10. El día 20 se sacrificó a los ratones para determinar
la respuesta CTL frente a SIINFEKL. Se cultivaron los esplenocitos
de los animales inmunizados en presencia de 0.1 \mug/ml de
SIINFEKL a 5 x 10^{6} células/ml (10 ml) durante 5 días en medio
completo. El día 5 se recogieron las células para realizar estudios
de liberación de cromo. Se midió la actividad lítica incubando
durante 4 h diferentes cantidades de células efectoras con 1 x
10^{4} células EL-4 diana, cargadas previamente
con ^{51}Cr y con o sin SIINFEKL. El porcentaje específico de
lisis se calculó según la fórmula: (cpm experimental - cpm
espontánea)/(cpm máxima - cpm espontánea) x 100, donde la lisis
espontánea corresponde a células diana incubadas en ausencia de
células efectoras, y la lisis máxima se obtiene incubando células
diana con 5% Triton x100.
Para medir la producción de
IFN-\gamma en respuesta a SIINFEKL, se colocaron
esplenocitos de ratones inmunizados en 96 placas, a 8x10^{5}
células/pocillo, sólo con medio completo, o con péptido 30 \muM en
un volumen final de 0.25 ml. El sobrenadante (50 \mul) se retiró
a las 48 h y se midió el IFN-\gamma mediante ELISA
(Pharmingen, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
En otro grupo de experimentos se probó la
capacidad de la proteína EDA para actuar como adyuvante en una
mezcla de proteínas. En este caso, los ratones C57BL/6 fueron
inmunizados por vía i.v. con 50 \mug de
EDA-SIINFEKL en presencia de 500 \mug de la
proteína OVA en PBS o con 500 \mug de proteína OVA en PBS. Una
semana después los ratones fueron sacrificados para determinar la
respuesta CTL frente a SIINFEKL en ambos grupos como se indica más
arriba.
Los ratones fueron inmunizados s.c. en los días
0 y 10 con 3 nmol de EDA-SIINFEKL o de SIINFEKL. A
los 20 días de la segunda inmunización se inyectó por vía s.c. a
los ratones con 10^{5} células EG7OVA. El crecimiento tumoral se
controló con un calibre y se expresó en mm^{3} con la fórmula V =
(L x w^{2})/2, donde L, es la longitud; w, anchura. Se sacrificó
a los ratones cuando el tumor alcanzó un volumen mayor de 8
cm^{3}.
Examinamos si la proteína recombinante
EDA-SIINFEKL era capaz de estimular a las BMDC para
producir citoquinas proinflamatorias como IL-12 o
TNF-\alpha. Se cultivó BMDC con SIINFEKL (10
\muM), LPS (1 \mug/ml y 15 ng/ml) o
EDA-SIINFEKL-6xHis (500 nM). A las
24 h, se midió mediante ELISA la cantidad de IL-12 o
TNF-\alpha existente en el sobrenadante del
cultivo. Se observó que EDA-SIINFEKL era capaz de
estimular la producción de niveles elevados de IL-12
o de TNF-\alpha mediante BMDC (Figura 4). En ambos
casos, los niveles de citoquina inducida por
EDA-SIINFEKL fueron mayores que los inducidos por
15 ng/ml de LPS, lo que supone más de 50 veces la contaminación
residual de endotoxina hallada en nuestra proteína. También se
evaluó el efecto de 1 \mug/ml de LPS sobre la inducción de la
producción de citoquina por las BMDC. Se observó que la capacidad
de EDA-SIINFEKL para estimular la producción de
citoquina por las BMDC es aún mayor que la que ocurre con esta
concentración elevada de LPS, lo que sugiere que este efecto no
está relacionado con la contaminación LPS en la preparación de
proteína.
Las células dendríticas (DC) son las células
presentadoras de antígenos más potentes con una capacidad única
para estimular linfocitos T no activados y respuestas secundarias a
los antígenos. Las DC tienen la capacidad de capturar antígenos,
procesarlos hasta péptidos, y presentar los péptidos en asociación
con moléculas MHC de clase I o de clase II a linfocitos T
citotóxicos (CTL) o a linfocitos T colaboradores, respectivamente.
Las DC inmaduras pueden capturar antígenos, pero deben
diferenciarse o madurar para ser capaces de estimular a los
linfocitos T no activados. Por tanto, la maduración de células
dendríticas es un requisito para la estimulación óptima de una
respuesta de linfocitos T. Cuando se produce la maduración, las APC
aumentan la expresión de moléculas de superficie, como las MHC de
clase I y de clase II, y las CD40, CD80 y CD86. Se procedió a
analizar si EDA-SIINFEKL podría inducir la
maduración in vivo de células con expresión de CD11c.
Ratones C57BL6 fueron inmunizados por vía i.v. con 25 \mug de
EDA-SIINFEKL, 25 \mug de
EDA-SIINFEKL digerido con proteinasa K, 25 \mug de
LPS o sólo con PBS. 15 horas más tarde los ratones fueron
sacrificados y las células CD11c fueron purificadas con autoMACS,
marcadas con anticuerpos, y analizadas con citometría de flujo. Se
observó que la inmunización con EDA-SIINFEKL era
capaz de inducir la expresión de moléculas MHC de clase I y de
clase II, y de CD40 y CD86. Esta capacidad de
EDA-SIINFEKL desaparece por completo cuando la
proteína es digerida por proteinasa K antes de la inmunización
(Figura 5). La digestión de LPS por proteinasa K no tiene efecto
inhibidor sobre la capacidad de LPS para inducir la expresión de
estos marcadores de maduración (no mostrado). Se comprobó la
capacidad de EDA-SIINFEKL para inducir la
maduración de células CD11c de ratones C57BL/6 TLR4 KO, y se
observó que EDA-SIINFEKL era incapaz de inducir la
sobreexpresión de los marcadores de maduración hallados en los
ratones C57BL/6 wt. (Figura 5).
Describimos la capacidad de
EDA-SIINFEKL para ser capturado por APC, y de
presentar el epítopo SIINFEKL CTL procesado a los linfocitos T de
ratones transgénicos OT-1 específicos para este
epítopo. Las DC derivadas de médula ósea se cultivaron en presencia
de SIINFEKL (10 \muM), LPS (1 \mug/ml) o
EDA-SIINFEKL-6xHis (500 nM). 48 h
después, se recogieron las DC y se utilizaron como APC en presencia
de diferentes cantidades de células no adherentes de
OT-1. Se midió la producción de
IFN-\gamma por células no adherentes de
OT-1 y su respuesta proliferativa (Figura 6A y 6B,
respectivamente). Se observó que EDA-SIINFEKL es
capturado eficazmente y presentado a linfocitos T específicos.
También se estudió el efecto de diferentes
fármacos en el proceso de presentación de la proteína de fusión
EDA-SIINFEKL y se observó que esta presentación se
inhibía con monensina, brefeldina o cicloheximida, pero no con
cloroquina, que inhibe la proteolisis endolisosómica (Figura 6C).
Como cabía esperar, la presentación antigénica del péptido
sintético SIINFEKL no se veía afectada por estos fármacos (Figura
6D). Estos datos sugieren que la internalización de
EDA-SIINFEKL no está mediada por macropinocitosis,
y demuestra que el EDA-SIINFEKL recombinante se
procesa como un antígeno citosólico, implicando que la proteína de
fusión deberá llegar al citosol a través de la membrana plasmática
de APC.
Para determinar si la expresión de TLR4 de APC
podría favorecer el proceso de presentación, cultivamos células de
hibridoma B3Z (específicas del epítopo SIINFEKL) en presencia de
células del bazo de ratones C57BL/6 wt o TLR4 KO y diferentes
concentraciones de EDA-SIINFEKL. La cantidad de
IL-2 liberada al sobrenadante del cultivo se midió
mediante un bioensayo basado en la línea CTLL. Se observó que la
presentación del epítopo CTL era más eficaz por las APC de ratones
wt que expresan TLR4 (Figura 6E), lo que parece indicar que TLR4
está implicado en el proceso de captación de
EDA-SIINFEKL
Los datos anteriores demuestran que la proteína
recombinante EDA-SIINFEKL es bioactiva y activa a
las APC de modo específico. La inducción de repuestas
inmunológicas de linfocitos T específicas in vivo es
fundamental para el desarrollo de una vacuna. Por lo tanto,
comprobamos si los ratones inmunizados con proteína de fusión
EDA-SIINFEKL desarrollaban respuestas CTL
específicas frente a células seleccionadas pulsadas con el epítopo
SIINFEKL. Ratones C57BL6 fueron inmunizados por vía i.v. con 50
\mug de EDA-SIINFEKL o con SIINFEKL en PBS en los
días 0 y 10. El día 20 se sacrificó a los ratones y se analizó la
respuesta CTL frente a SIINFEKL. Pudo observarse que
EDA-SIINFEKL era capaz de inducir CTL frente a
células diana EL-4 pulsadas con SIINFEKL. Por el
contrario, no se encontró actividad CTL cuando los ratones fueron
inmunizados sólo con SIINFEKL (Figura 7). Debido a la capacidad de
EDA para inducir la maduración in vivo de células
dendríticas, también se evaluó la capacidad de EDA de actuar como
adyuvante cuando es inmunizado conjuntamente con la proteína OVA.
En este experimento pudimos observar que la presencia de EDA en la
mezcla de inmunización tiene un efecto inmunoestimulador y es capaz
de potenciar la inducción de una respuesta CTL frente a SIINFEKL
inducida por la proteína OVA (comparar actividad lítica en panel A
y B de la figura 9).
Para estudiar la capacidad de la proteína de
fusión EDA-SIINFEKL de proteger a los ratones de la
inyección de células tumorales EG7OVA, se inmunizaron ratones por
vía s.c. con 3 nmol de EDA-SIINFEKL, SIINFEKL, o
con suero salino. A los 20 días de la segunda inmunización se
inyectaron s.c. 10^{5} células EG7OVA. Se observó que la
inmunización EDA-SIINFEKL protegía a los ratones del
crecimiento temporal. Todos los ratones inmunizados con SIINFEKL o
con suero salino desarrollaron tumores, mientras que el 40% de los
ratones inmunizados con EDA-SIINFEKL no lo
hicieron, y el 60% restante tuvieron retraso en el crecimiento
tumoral (Figura 8).
En el presente estudio, utilizando la proteína
EDA recombinante como un vector de transporte de epítopos,
establecemos la estrategia de inmunización que origina respuestas
CTL in vivo, evitando la necesidad de un adyuvante. Hemos
identificado los mecanismos que contribuyen a la eficacia de las
proteínas de fusión que contienen EDA, como un vector que traslada
antígenos a células que expresan TLR-4 e induce
respuestas inmunológicas celulares frente a un antígeno.
Observamos en primer lugar que la estimulación
in vitro de BMDC con EDA era capaz de estimular la
producción de citoquinas proinflamatorias tales como
IL-12 y TNF-\alpha. Se sabe que
estas citoquinas son fundamentales para iniciar una respuesta
inmunitaria consistente frente a un antígeno. Además, se observó
que la inmunización in vivo con EDA podía inducir la
maduración de las DC e incrementar la expresión de moléculas
coestimuladoras en la superficie de las DC. La expresión de estas
moléculas coestimuladoras es de gran importancia para la inducción
eficaz de respuestas inmunitarias frente a un antígeno. Se vio que
este efecto dependía de la presencia de TLR4, ya que las células
CD11c aisladas in vivo a partir de los ratones C57BL/6 TLR4
KO previamente inmunizados con EDA, no mostraron ninguna mejoría en
su estado de maduración en comparación con el que tenían los
animales no inmunizados.
La presencia de la molécula TLR4 en APC mejora
la presentación del antígeno tras la incubación con la proteína de
fusión EDA-SIINFEKL, y esta presentación no se ve
afectada por la cloroquina, que inhibe la proteolisis
endolisosómica. Estos datos sugieren que la interiorización de
EDA-SIINFEKL no está mediada por macropinocitosis y
demuestra que la proteína EDA-SIINFEKL recombinante
se procesa como un antígeno citosólico, lo que implica que la
proteína de fusión deberá llegar al citosol a través de la membrana
plasmática de APC.
Y, sobre todo, hemos demostrado que la
inmunización de ratones con la proteína de fusión
EDA-SIINFEKL recombinante es capaz de inducir una
respuesta CTL específica in vivo frente al epítopo SIINFEKL.
Además, la inmunización con EDA-SIINFEKL protege a
los ratones frente al desafío con células tumorales EG7OVA. Todos
estos datos muestran que este vector proteínico que contiene EDA es
capaz de: (i) seleccionar antígenos para células que expresan TLR4
y en particular APC profesionales; (ii) trasladar el antígeno
vectorizado a la vía de procesado de antígeno clase I clásica (iii)
inducir in vivo e in vitro la maduración de las
células dendríticas y (iv) originar CTL in vivo frente al
antígeno vectorizado en ausencia de adyuvante, con lo que puede
emplearse en estrategias de vacunación frente a agentes infecciosos
o cáncer. Estas proteínas de fusión con EDA también pueden servir
para el transporte de moléculas con importancia farmacológica al
citosol de células que expresen TLR4.
Además, la capacidad de EDA de inducir in
vivo la maduración de las células dendríticas permite su
utilización como adyuvante en formulaciones que contengan un
antígeno frente al que se quiere inducir una respuesta
inmunogénica, abriendo el abanico de posibilidades de la
utilización de EDA en el desarrollo de vacunas.
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA
S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> AGENTES Y MÉTODOS BASADOS EN EL USO
DEL DOMINIO EDA DE LA FIBRONECTINA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FIMA04018
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector proteináceo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)_(348)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector proteináceo
mEDA-SIINFEKL-6xHis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(273)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de fibronectina EDA de
ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (274)..(315)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuos 254-267 de
OVA que portan el epítopo CTL SIINFEKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (331)..(348)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cola de Histidinas 6xHis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector proteináceo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(273)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de fibronectina EDA de
ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (274)..(315)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> residuos 254-267 de
OVA que portan el epítopo CTL SIINFEKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (331)..(348)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cola de histidinas 6xHis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(255)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de fibronectina EDA
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector proteináceo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(246)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector proteináceo
mEDAalt-SIINFEKL-6xHis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mist feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(171)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de fibronectina EDA
alternativo de ratón; generado por corte y empalme alternativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (172)..(213)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuos 254-267 que
portan el epítopo CTL SIINFEKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (229)..(246)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cola de histidinas 6xHis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vector proteináceo recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) .. (171)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Dominio de fibronectina EDA
alternativo de ratón; generado por corte y empalme alternativo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (172)..(213)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuos 254-267 de
OVA que portan el epítopo CTL SIINFEKL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mist feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (229)..(246)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cola de histidinas 6xHis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(168)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatatgaac attgatcgcc ctaaaggact
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (35)
1. Uso de un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
- a)
- el dominio EDA de la fibronectina (EDA),
- b)
- un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a TLR4, o
- c)
- una variante de dicho dominio EDA o fragmento capaz de unirse a TLR4 y que tenga una homología mayor del 70% con cualquier forma natural de dicho dominio EDA o fragmento,
en la preparación de un agente
inmunoestimulador.
2. Uso de un polipéptido según la reivindicación
1, caracterizado porque el fragmento correspondiente al
dominio EDA comprende una secuencia seleccionada entre:
- a)
- los aminoácidos 2-91 de la secuencia SEQ. ID. NO: 2;
- b)
- la secuencia SEQ. ID. NO: 4; y
- c)
- un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a células que expresen TLR4.
3. Uso de un polipéptido según la reivindicación
1, caracterizado porque el fragmento correspondiente al
dominio EDA comprende una secuencia seleccionada entre:
- a)
- los aminoácidos 2-57 de la secuencia SEQ. ID. NO: 6;
- b)
- la secuencia SEQ. ID. NO: 8; y
- c)
- un fragmento de las secuencias a) y b) capaz de unirse a células que expresen TLR4.
4. Uso de un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque dicho agente inmunoestimulador comprende además una o más
moléculas de interés.
5. Uso de un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque dicho agente inmunoestimulador es un vector proteínico en el
que el polipéptido está unido a la molécula de interés.
6. Un vector proteínico caracterizado
porque comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos está
seleccionada entre:
- a)
- el dominio EDA de la fibronectina (EDA),
- b)
- un fragmento de dicho dominio EDA capaz de unirse a TLR4, o
- c)
- una variante de dicho dominio EDA o fragmento capaz de unirse a TLR4 y que tenga una homología mayor del 70% con cualquier forma natural de dicho dominio EDA o fragmento,
unido a una molécula de interés
seleccionada entre: un polipéptido, un lipopéptido, un
oligosacárido, un polisacárido, un ácido nucleico, un lípido, y un
fármaco.
7. Un vector proteínico según la reivindicación
6, caracterizado porque la molécula de interés se ha
seleccionado entre un antígeno y un epítopo.
8. Un vector proteínico según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque la molécula
de interés se ha seleccionado entre un antígeno tumoral y un
determinante antigénico tumoral.
9. Un vector proteínico según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la molécula
de interés es el determinante antigénico T citotóxico de
ovoalbúmina (OVA 257-264) o SIINFEKL,
correspondiente a los aminoácidos 95 a 102 de SEC ID NO: 2.
10. Un vector proteínico según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque la molécula
de interés se ha seleccionado entre un antígeno viral, un antígeno
bacteriano, y un antígeno parasitario.
11. Un vector proteínico según la reivindicación
6, caracterizado porque la molécula de interés es un
alergeno.
12. Un vector proteínico según la reivindicación
6, caracterizado porque la molécula de interés es además un
fármaco química o genéticamente unido al dominio EDA.
13. Un vector proteínico según la reivindicación
6 cuya secuencia de aminoácidos es SEQ. ID. NO: 2, o SEQ. ID. NO:
6.
14. Uso de un vector proteínico según una
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, para dirigir y
translocar de modo específico la molécula de interés al citosol de
células que expresan TLR4.
15. Uso de un vector proteínico según la
reivindicación 14, caracterizado porque las células que
expresan TLR4 son células presentadoras de antígeno.
16. Uso de un vector proteínico según una de las
reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque las células
presentadoras de antígeno son células dendríticas.
17. Un ácido nucleico modificado
caracterizado porque codifica a un vector proteínico
definido en cualquiera de las reivindicaciones
6-13.
18. Un ácido nucleico modificado según la
reivindicación 17, caracterizado porque además comprende una
secuencia de control operativamente unida que regula la expresión
del vector proteínico.
19. Un ácido nucleico modificado según las
reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque comprende las
secuencias SEQ. ID. NO: 1 o SEQ ID. NO: 5.
20. Un vector de expresión para la expresión
génica de un vector proteínico definido en cualquiera de las
reivindicaciones 6-13, caracterizado porque
el vector de expresión comprende un ácido nucleico modificado
definido en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.
21. Un vector de expresión según la
reivindicación 20, caracterizado porque dicho vector es un
vector viral.
22. Una célula hospedadora de expresión
caracterizada porque comprende un ácido nucleico modificado
definido en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, o un vector
de expresión definido en las reivindicaciones 20 ó
21.
21.
23. Una célula hospedadora de expresión según la
reivindicación 22, caracterizada porque dicha célula
hospedadora de expresión es Escherichia coli.
24. Un método para producir un vector proteínico
definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13,
caracterizado porque comprende cultivar una célula
hospedadora de expresión definida en las reivindicaciones 22 ó 23
en condiciones que permitan la producción de dicho vector
proteínico y la recuperación del mismo.
25. Uso de un ácido nucleico modificado definido
en una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, un vector de
expresión definido en las reivindicaciones 20 ó 21, o una célula
hospedadora definida en las reivindicaciones 22 ó 23, en la
preparación de una composición farmacéutica.
26. Uso de un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho
agente inmunoestimulador es una composición farmacéutica.
27. Uso de un polipéptido definido en una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición
farmacéutica según la reivindicación 26 para estimular la
maduración de células presentadoras de antígeno.
28. Uso de un polipéptido definido en una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición
farmacéutica según la reivindicación 26 para inducir una respuesta
inmunológica eficaz frente a la molécula de
interés.
interés.
29. Uso de un polipéptido definido en una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición
farmacéutica según la reivindicación 28 para inducir una respuesta
inmunológica CTL.
30. Uso de un polipéptido definido en una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición
farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29,
para el tratamiento y profilaxis de una enfermedad infecciosa.
31. Uso de un polipéptido definido en una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición
farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29,
para el tratamiento y profilaxis de una enfermedad tumoral.
32. Uso de un polipéptido definido en una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de una composición
farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29,
para el tratamiento y profilaxis de una enfermedad alérgica.
\newpage
33. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende al menos un vehículo
farmacéuticamente aceptable, y al menos uno de los siguientes
componentes:
- a)
- un vector proteínico definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13;
- b)
- un ácido nucleico modificado definido en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19;
- c)
- un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico modificado definido en las reivindicaciones 20 ó 21; o
- d)
- una célula hospedadora de expresión que también comprende dicho ácido nucleico modificado definido en las reivindicaciones 22 ó 23.
34. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende una cantidad de células
dendríticas, donde dichas células dendríticas se han incubado in
vitro con al menos uno de los siguientes componentes:
- a)
- un vector proteínico definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13;
- b)
- un ácido nucleico definido en cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19; o
- c)
- un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico definido en las reivindicaciones 20 ó 21.
35. Una composición farmacéutica según las
reivindicaciones 33 ó 34, caracterizada porque la composición
es una vacuna o una composición inmunoterapéutica.
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