PT1913954E

PT1913954E - Utilização do domínio eda da fibronectina

Info

Publication number: PT1913954E
Application number: PT06794018T
Authority: PT
Inventors: Claude Leclerc; Jesus Prieto Valtuena; Juan Jose Lasarte Sagastibelza; Marta Gorraiz Ayala
Original assignee: Proyecto Biomedicina Cima Sl
Priority date: 2005-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2012-11-19
Also published as: CN101287487B; JP4970435B2; WO2006134190A8; CA2612151C; US9155783B2; ES2291071A1; ES2291071B1; EP1913954B1; RU2430738C2; MX2007015935A; RU2008100242A; AU2006259041A1; WO2006134190A3; EP1913954A4; ES2392659T3; EP1913954B8; WO2006134190A2; DK1913954T3; PL1913954T3; EP1913954A2

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DO DOMÍNIO EDA DA FIBRONECTINA"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um vetor proteico para 0 transporte molecular até às células que expressam o recetor TLR4 (recetor do tipo Toll 4) e à preparação do referido vetor proteico e respetivas aplicações, com uma particular incidência na preparação e utilização de composições farmacêuticas, especialmente composições imunoterapêuticas, para o tratamento e a prevenção da doença tumoral e infeciosa.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

Os agentes patogénicos e o cancro continuam a ser as principais causas de morte no mundo inteiro. 0 desenvolvimento de vacinas para prevenir doenças para as quais não existe atualmente nenhuma vacina, tais como SIDA ou malária, ou para tratar infeções crónicas ou cancros, bem como o melhoramento da eficácia e segurança das vacinas existentes, continua a ser uma grande prioridade. Na maioria dos casos, o desenvolvimento dessas vacinas necessita de estratégias capazes de estimular especificamente linfócitos T citotóxicos (CTLs) CD8+.

Os CTLs são ativados pela apresentação aos recetores de células T (TCRs) de pequenos péptidos associados a moléculas de MHC de classe I. Estes complexos MHC de classe 1 - péptido estão presentes na superfície das células apresentadoras de antigénios (APCs), que também são capazes de fornecer sinais coestimuladores necessários para uma ativação de CTL ótima.

As células dendríticas (DC) são as APCs mais potentes, com uma capacidade única de interagir com linfócitos T naive e iniciar respostas imunitárias primárias, ativando linfócitos T citotóxicos CD8+ e CD4+ auxiliares. A 2 apresentação de antigénios e a estimulação de células T através de DC é revista por Guermonprez et al. ("Antigen presentation and T cell stimulation by DC". Annu. Rev. Immunol. 2002, 20:621-627), que é aqui incluído por de referência.

Na ausência de respostas imunitárias e inflamatórias em curso, as células dendríticas circulam pelo sangue, pelos tecidos periféricos, pela linfa e pelos órgãos linfoides secundários. Nos tecidos periféricos, as células dendríticas captam antigénios próprios (self) e não próprios (non-self). Os antigénios internalizados são depois processados para péptidos proteolíticos, e estes péptidos são carregados em moléculas de MHC de classe I e II (para a ativação de linfócitos T CD8+ ou CD4+, respetivamente). Este processo de captação, degradação e carregamento de antigénios é designado por apresentação de antigénios. Contudo, na ausência de estimulação, as células dendríticas periféricas apresentam os antigénios de um modo bastante ineficaz. Os sinais exógenos dos agentes patogénicos ou os sinais endógenos induzem as células dendríticas a entrar num programa de desenvolvimento, denominado maturação, que transforma as células dendríticas em APCs e ativadores de linfócitos T. Os produtos virais e bacterianos, bem como as citocinas inflamatórias e outras moléculas próprias, induzem a maturação das células dendríticas através de interação direta com recetores inatos de superfície de células dendríticas. Os linfócitos T, através de vias dependentes e independentes de CD40, e as células endoteliais contribuem para a maturação final das células dendríticas através do contacto célula a célula direto e da secreção de citocinas. Pouco depois de ser encontrado um sinal de perigo, a eficácia da captação de antigénios, a degradação e o transporte intracelular, e o tráfego intracelular de moléculas de MHC são modificados. O carregamento de péptidos, a semi-vida e o transporte até à 3 superfície celular de moléculas de MHC aumentam. A expressão na superfície celular de moléculas coestimuladoras de células T aumenta igualmente. Deste modo, as células dendríticas tornam-se as APCs mais potentes, bem como as únicas capazes de ativar linfócitos T naive e iniciar respostas imunitárias adaptáveis. Concomitante com as modificações das respetivas capacidades de apresentação de antigénios, a maturação também induz a migração em massa de células dendríticas para fora dos tecidos periféricos. As modificações na expressão de recetores de quimocinas e moléculas de aderência, bem como alterações profundas da organização do citoesqueleto, contribuem para a migração das células dendríticas, através da linfa, em direção aos órgãos linfoides secundários.

Indução da maturação de células dendríticas.

As células dendríticas respondem a dois tipos de sinais: reconhecimento direto de agentes patogénicos (através de recetores de reconhecimento de padrões específicos) e sensação indireta de infeção (através de citocinas inflamatórias, compostos celulares internos, e respostas imunitárias específicas em curso). Em resposta a estes sinais, as células dendríticas são ativadas e entram no programa de maturação, o que transforma as células dendríticas em estimuladores de células T eficazes. Pelo menos, existem cinco tipos de recetores de superfície que acionam a maturação de células dendríticas: (i) recetores do tipo Toll (TLR), (ii) recetores de citocina, (iii) moléculas da família de recetores TNF (TNF-R), (iv) FcR, e (v) sensores para morte celular. Alguns dos estímulos de maturação mais eficazes são mediados através da interação TLR (TLR1-9) com os respetivos ligandos. Kaisho e Akira reviram os conhecimentos sobre os recetores do tipo Toll ("Toll-like receptors as adjuvant receptors". Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1589: 1-13). Os TLRs são expressados 4 nos macrófagos e nas células dendríticas, bem como noutras células, tais como linfócitos B. Os ligandos para muitos dos TLRs também foram identificados. A maioria destes ligandos deriva de agentes patogénicos, mas não se encontra no hospedeiro, o que sugere que os TLRs são cruciais para detetar micro-organismos invasores. 0 reconhecimento de ligandos por intermédio de TLR provoca a ativação rápida de imunidade inata através da indução da produção de citocinas pró-inflamatórias e do aumento de moléculas coestimuladoras. A imunidade inata ativada origina subsequentemente uma imunidade adaptável eficaz. Relativamente a TLR4, os padrões moleculares especificamente reconhecidos são LPS (bactérias Gram-), ácidos lipoteicoicos (bactérias Gram+), taxol, proteina F (Virus Sincicial Respiratório), proteina de choque térmico 60 e domínio EDA da fibronectina.

Por conseguinte, uma vacina candidata capaz de induzir ótimas respostas de células T tem de satisfazer diversas condições. Primeiro, tem de definir como alvo a APC para ministrar os epítopos de células T derivadas de antigénios às moléculas de MHC de classe I e/ou II. Deste modo, a definição como alvo de DC pode representar o principal objetivo na conceção de novos sistemas de ministração para o desenvolvimento de vacinas. Além do mais, o vetor tem de ministrar sinais apropriados a DC para induzir a respetiva ativação. A ministração de antigénios a DC sem um sinal de maturação pode induzir tolerância em vez da ativação das células T auxiliares e citotóxicas. Além disso, a respetiva eficácia não pode ser afetada pela imunidade preexistente contra o próprio vetor.

Uma primeira abordagem para ministrar péptidos antigénicos às moléculas de MHC de classe I e/ou II baseia-se nas vacinas de péptido sintético, com epítopos selecionados capazes de ligar diretamente a estas moléculas na superfície da APC. Em alguns casos, estes péptidos 5 conduziram a uma proteção contra o tumor ou remoção do vírus nos modelos murinos, ao passo que noutros provocaram uma indução de tolerância. As experiências humanas realizadas com tipos diferentes de péptidos originaram respostas clínicas modestas ao cancro.

Atualmente, estão a ser desenvolvidas diversas estratégias diferentes. Basicamente, podem ser divididas em duas categorias. 0 primeiro tipo baseia-se na síntese do antigénio através de APC ou na respetiva ministração ativa no citoplasma destas células e explora a via de processamento de antigénios de MHC I "clássica". 0 segundo tipo tira partido da capacidade de apresentação cruzada de APC e baseia-se nos antigénios exógenos livres ou associados a células. A ministração do antigénio no citoplasma de APC foi efetuada por meio de toxinas bacterianas (Morón et ai. "New tools for antigen delivery to the MHC class I pathway". TRENDS in Immunology, 2004; 25: 92-97). Por exemplo, o documento EP1188446A1 refere-se a um vetor proteico baseado na toxina adenilato ciclase de Bordetella pertussis, para ministração de moléculas nas células de expressão de CDllb.

A presente invenção refere-se ao Domínio Extra A (EDA) da fibronectina, um possível ligando natural para TLR4, como um meio teórico para ministração de antigénios nas células de expressão de TLR4 que podem induzir uma seleção e maturação apropriadas de APC, e originar finalmente uma resposta CTL específica eficaz. As moléculas de fibronectina são os produtos de um único gene, e a proteína resultante pode existir em múltiplas formas que surgem do splicing alternativo de um único pré-ARNm (Pankov R e Kenneth MY, "Fibronectin at a glance". Journal of Cell Science, 2002; 115:3861-3863). Um tipo maior de splicing ocorre no conjunto central de repetições de tipo III. A omissão ou utilização de exões conduz à inclusão ou exclusão das duas repetições de tipo III: domínio extra B 6 (igualmente denominado EDB, EIIIB ou EDII) e domínio extra A (igualmente denominado EDA, EIIIA ou EDI). As fibronectinas celulares, que contêm em alternativa EDA e EDB spliced, são produzidas em resposta a lesões no tecido. Entre outras funções biológicas, EDA mostrou induzir a libertação de proteoglicanos e a expressão de metaloproteinases (MMP 1, 3 e 9) e de citocinas pró-inflamatórias (para rever, consulte Saito S et al. "The Fibronectin Extradomain A activates matrix metalloproteinase gene expression by an interleukin-1-dependent mechanism", J. Biol. Chem. 1999; 161:3071-3076). Igualmente, foi descrito que EDA é capaz de ativar TLR4, induzindo assim respostas tipo LPS (Okamura Y et ai., "The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4", J. Biol. Chem. 2001; 276: 10229-10233).

Conforme indicado anteriormente, o desenvolvimento de estratégias para o reforço da resposta imunitária a um antigénio abre a porta ao desenvolvimento de vacinas para o tratamento de cancro ou doenças infeciosas. Especificamente, na infeção por vírus da hepatite C foi descrito que a resposta imunitária desempenha um papel essencial na remoção da infeção e, portanto, a utilização de estratégias de reforço imunitário constitui uma alternativa para o tratamento e a prevenção desta infeção. O vírus da hepatite C (HCV) é um vírus de ARN de filamento único que pertence à família Flaviviridae (Miller RH. e Purcell RH. 1990. PNAS. 87:2057). Este vírus foi reconhecido como um dos principais agentes causais de hepatite crónica e doenças do fígado, e estima-se que afeta 170 milhões de pessoas no mundo inteiro (World-Health-Organisation. Hepatitis C. Wkly Epidemiol Rec 1997; 72:65). Uma das principais características da infeção por HCV é a sua grande tendência para cronicidade (70% das infeções) e o desenvolvimento de cirrose hepática (20%) com um elevado risco de desenvolvimento de hepatocarcinomas (Dienstag et 7 al. Gastroenterology 1983; 85:439). 0 tratamento com iFN-a é a terapia mais comum nas infeções por HCV, mas só é eficaz em 20 a 30% dos pacientes tratados (Camps et al. J Hepatol 1993; 17:390). A combinação de IFN-α e ribavirina melhorou estes resultados (30 a 40% dos pacientes eliminaram o vírus de um modo prolongado), mas continua a existir uma elevada percentagem de pacientes resistentes à terapia (Poynard et al. Lancet 1998; 352:1426). Deste modo, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de hepatite C crónica é de vital importância. O genoma de HCV tem 9,6 quilobases, contém regiões não codificadoras altamente conservadas nas extremidades 5' e 3' que ladeiam uma ampla grelha de leitura que codifica 3 proteínas estruturais (núcleo, El e E2) e, pelo menos, 6 proteínas não estruturais (NS2, NS3, NS4a, NS5a e NS5b) (Major, ME e Feinstone SM. (1997) Hepatology 25, 1527). A remoção virai após uma infeção aguda por HCV ou após o tratamento com IFN-α está associada à presença de uma forte resposta imunitária celular CD4 e CD8 às proteínas virais. Em particular, a resposta CD4 à proteína NS3 não estrutural HCV foi associada à remoção virai após a infeção aguda, ao passo que a ausência desta resposta de células T envolve uma persistência virai e o estabelecimento de uma infeção crónica (Diepolder et al. Lancet 1995; 346:1006, Pape et al. J Virai Hepat 1999; Suplemento 6 1:26-40). Igualmente, vários estudos identificaram vários epítopos citotóxicos na proteína NS3 em pacientes infetados por HCV. Estes dados sugerem que a proteína NS3 pode ser um bom alvo para a indução da resposta celular anti-HCV.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num aspeto, a presente invenção refere-se à utilização de um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos selecionada entre: a) domínio EDA da fibronectina (EDA), ou b) um fragmento do referido domínio EDA capaz de ligar a TLR4, no fabrico de uma composição farmacêutica estimuladora de uma resposta imunitária celular contra um antigénio, em que a referida composição farmacêutica é uma composição adjuvante imunoestimuladora ou uma vacina.

Atualmente, a composição farmacêutica pode incluir o domínio EDA da fibronectina e o antigénio para o qual é pretendido gerar a resposta imunitária, em que estes componentes estão presentes como entidades separadas ou ligadas de forma covalente. A presente invenção refere-se igualmente a um vetor proteico caracterizado por compreender um polipéptido cuja sequência de aminoácidos é selecionada a partir de: a) domínio EDA da fibronectina (EDA), ou b) um fragmento do referido domínio EDA capaz de ligar a TLR4, ligado a uma molécula de interesse selecionada a partir de: um antigénio virai, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico, um antigénio parasitário, um antigénio tumoral e um determinante antigénico tumoral.

De acordo com a invenção, numa realização específica, a sequência de aminoácidos do domínio EDA da fibronectina corresponde a uma de qualquer forma natural de EDA capaz de ligar a TLR4. Este domínio EDA pode ser selecionado entre as formas naturais do domínio em qualquer espécie animal, particularmente mamíferos, ou seja, roedores (ratinhos, ratos, etc.), ou primatas (particularmente seres humanos).

Noutra realização específica, os agentes imunoestimuladores compreendem uma sequência de aminoácidos parcial de um domínio EDA que é caracterizado por ser capaz de ligar a TLR4.

Igualmente aqui descrita é uma variante modificada de qualquer um dos referidos fragmentos ou formas naturais de domínio EDA, também caracterizado por manter a propriedade de ligação a TLR4. Numa forma de realização particular aqui 9 descrita, um domínio EDA variante desse tipo tem mais de 70% de homologia com qualquer uma das formas naturais de domínio EDA. Uma variante modificada apropriada pode ser selecionada comparando primeiro a sequência de uma forma natural de domínio EDA da fibronectina, ou fragmento do mesmo, com outras sequências polipeptídicas candidatas. Qualquer algoritmo de alinhamento (por exemplo FASTA, Lipman DJ, Pearson WR. "Rapid and sensitive protein similarity searches", Science. 22 de março de 1985; 227 (4693):1435-41) ou software informático (ou seja, Jellifish de Labvelocity Inc., ou software Blast de NCBI) pode ser utilizado para análise de homologia. Subsequentemente, as sequências polipeptídicas candidatas com mais de 70% de homologia são testadas relativamente à respetiva capacidade de ligação a TLR4. As propriedades de ligação a TLR4 podem ser avaliadas por meio de qualquer ensaio de ligação convencional, por exemplo através da utilização de citometria de fluxo conforme descrito em "The current protocols in Protein Science" publicado por John Wiley & Sons (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober) (atualizado periodicamente. Atualizado até 1 de maio de 2005).

Numa forma de realização da invenção, o domínio EDA compreende uma sequência selecionada a partir: a) da sequência de aminoácidos completa de domínio EDA de ratinho (Entrez Protein: NM_010233, aminoácidos 1721 a 1810; SEQ. ID N.° 2, aminoácidos 2 a 91); b) da sequência de aminoácidos completa de domínio EDA humano (Entrez Protein NM_002026, aminoácidos 1631 a 1716; SEQ. ID N.0 4); e c) de um fragmento de sequências a) e b) capaz de ligar a células de expressão de TLR4.

Noutra realização particular, o referido domínio EDA compreende uma sequência selecionada a partir: 10 a) dos aminoácidos 2 a 57 da SEQ. ID N.° 6, que corresponde a uma forma alternativamente spliced de domínio EDA da fibronectina de ratinho; b) da SEQ. ID N.° 8, que é uma forma alternativamente spliced de domínio EDA humano; e c) de um fragmento de sequências a) e b) capaz de ligar a células de expressão de TLR4.

Em algumas formas de realização, o agente imunoestimulador pode ainda incluir uma ou mais moléculas de interesse. Quando presente no agente imunoestimulador, a molécula de interesse pode ser administrada numa quantidade que, em conjunto com os outros componentes do agente, é eficaz para gerar uma resposta imunitária contra a molécula.

Numa realização preferida, o domínio EDA (ou variante de fragmento do mesmo) e a molécula de interesse estão ligados um ao outro na mesma molécula híbrida ou vetor proteico.

Igualmente aqui descrito é um vetor proteico conforme descrito acima, em que a referida molécula de interesse é selecionada a partir do grupo que consiste em polipéptidos, lipopéptidos, oligossacáridos, polissacáridos, ácidos nucleicos, lípidos e produtos químicos.

Numa realização particular do vetor proteico, a referida molécula de interesse é um antigénio ou um epítopo. Numa forma de realização da invenção, o antigénio unido ao vetor é um antigénio virai, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico ou um antigénio parasitário. Numa realização concreta, o referido antigénio virai é um antigénio virai do vírus da hepatite C, e numa realização preferida, o referido antigénio do vírus da hepatite C é a proteína NS3 ou um fragmento antigénico da mesma. A proteína NS3 refere-se à proteína NS3 não estrutural do vírus da hepatite C, uma proteína 67kDa que inclui dois domínios, uma protease de serina que compreende 11 os 189 aminoácidos da extremidade N-terminal, e uma trifosfatase de nucleosídeo-helicase que compreende os 442 aminoácidos da extremidade C-terminal. A sequência de proteínas NS3 incluída no vetor proteico da invenção pode corresponder a qualquer estirpe ou isolado do vírus da hepatite C humano.

Noutra forma de realização, o referido antigénio é um antigénio tumoral ou um determinante antigénico tumoral. Conforme aqui utilizado, "epítopo" refere-se a uma sequência de péptidos que liga a moléculas de MHC de classe I ou classe II e pode ser reconhecida pela molécula recetora de células T das células T CD8+ ou CD4 + respetivamente, e induzir uma resposta imunitária.

Numa realização específica, a referida molécula de interesse é o determinante antigénico T citotóxico da ovalbumina (OVA 257-264) ou SIINFEKL (SEQ. ID N.° 2, aminoácidos 95 a 102, que foram ladeados por 3 aminoácidos adicionais no C-terminal e no N-terminal do epítopo, QLE-SIINFEKL-TEW). O antigénio pode ser qualquer material capaz de produzir uma resposta imunitária Th, uma resposta de linfócitos T CD8, uma resposta celular NK, uma resposta de linfócitos T γ/δ ou uma resposta de anticorpo. Sem se limitarem a estes, os antigénios apropriados incluem péptidos, polipéptidos, lípidos, glicolípidos, polissacáridos, hidratos de carbono, polinucleótidos, priões, bactérias, vírus ou fungos vivos ou inativados; e antigénios derivados de bactérias, vírus, fungos, protozoários, tumores ou microrganismos, toxinas ou toxoides.

Noutra realização particular do vetor proteico aqui descrito, a referida molécula de interesse é um alergénio.

Desta forma, o domínio EDA também funciona como um vetor para a ministração de antigénios às células de expressão de TLR4. 12

Noutra realização particularmente interessante aqui descrita, a referida molécula de interesse é um produto quimico ou um fármaco unido de forma química ou genética ao vetor proteico. Desta forma, o referido vetor proteico é útil para a definição como alvo de um fármaco específico para células de expressão de TLR4.

Numa realização particular, o vetor proteico também pode compreender uma sequência de caudas (Tag), por exemplo uma cauda de histidina N-terminal. Isto irá simplificar o processo de purificação quando o vetor proteico for fabricado por meio de métodos de engenharia genética. Por exemplo, as sequências SEQ. ID N.° 2 e SEQ. ID N.° 6 representam realizações específicas do vetor proteico da invenção. Numa realização concreta não limitativa da presente invenção, o vetor proteico compreende a sequência SEQ ID N.° 10, que compreende um fragmento da proteína NS3. 0 domínio EDA incorporado no vetor proteico é caracterizado por ligar a TLR4 e, além disso, facilita a translocação da molécula de interesse para o citosol das células de expressão de TLR4.

Igualmente descrita é a utilização do vetor proteico para definir como alvo e efetuar a translocação de uma molécula de interesse para células de expressão de TLR4. Numa realização particular, as células de expressão de TLR4 são qualquer tipo de células de apresentação de antigénios (APCs). Numa forma de realização preferida, essas APCs são células dendríticas.

Numa realização particular da invenção, o vetor proteico é caracterizado por facilitar a translocação do antigénio ou epítopo de interesse, favorecendo ainda o processamento e carregando as moléculas de MHC para a apresentação de antigénios aos linfócitos T.

Noutra realização, o vetor proteico é caracterizado por ser capaz de estimular a maturação da APC definida como alvo, aumentando assim a expressão de moléculas de MHC e 13 dos sinais coestimuladores. Numa forma de realização vantajosa particular, o vetor proteico é caracterizado por ser capaz de induzir simultaneamente a apresentação de antigénios e provocar a maturação de APC, induzindo assim uma resposta imunitária especifica do antigénio eficaz. Numa forma de realização mais preferida, esta resposta imunitária especifica do antigénio é uma resposta CTL. 0 vetor proteico pode ser obtido através de tecnologia de ADN recombinante. Deste modo, noutro aspeto, a invenção refere-se a um ácido nucleico modificado que codifica um vetor proteico da invenção. Este ácido nucleico pode ser facilmente deduzido a partir da sequência de aminoácidos do vetor proteico.

Este ácido nucleico modificado pode estar contido numa construção de ADN. Por conseguinte, a invenção fornece uma construção de ADN que compreende um ácido nucleico que codifica o vetor proteico da invenção. Esta construção de ADN pode incorporar uma sequência de controlo ligada eficazmente ao ácido nucleico que codifica o vetor proteico da invenção. 0 termo "ligado eficazmente" no que diz respeito a ácidos nucleicos significa que os ácidos nucleicos são colocados numa relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. As "sequências de controlo" são sinais de expressão reconhecidos por uma célula hospedeira específica, que regulam funções, tais como a transcrição e a tradução de determinadas sequências de codificação (exemplos de sequências de controlo são promotores, intensificadores, terminadores de transcrição, locais de ligação do ribossoma, péptidos de sinal para secreção de proteínas ou para outras localizações subcelulares). A ligação das sequências desejadas é realizada através de laqueação em locais de restrição convenientes. Se esses locais não existirem, são utilizados ligantes ou adaptadores de oligonucleótidos sintéticos de acordo com os métodos convencionais. Uma vantagem neste 14 sentido é representada pelo facto de esta construção de ADN também compreender um marcador ou gene que codifica um motivo ou fenótipo que permite a seleção da célula hospedeira transformada por meio da construção de ADN. 0 ácido nucleico modificado e a construção de ADN fornecidos por esta invenção podem ser obtidos através de métodos convencionais bem conhecidos que são resumidos em muitos guias de laboratório (por exemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory manual". Joseph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001, 3a ed. Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

Numa realização particular, o ácido nucleico modificado ou a construção de ADN aqui fornecidos compreendem a SEQ. ID N.° 1, SEQ. ID N.° 5, SEQ. ID N.° 9 (EDA-NS3) OU SEQ. ID N.° 11 (EDA-OVA). O ácido nucleico modificado ou a construção de ADN aqui fornecidos podem ser inseridos num vetor apropriado. Deste modo, noutro aspeto, é fornecido um vetor, tal como um vetor de expressão, que compreende a construção de ADN ou o ácido nucleico modificado mencionado. A escolha do vetor dependerá da célula hospedeira na qual o mesmo será inserido. Por exemplo, o vetor no qual o ácido nucleico é inserido pode ser um plasmideo ou virus que, na inserção na célula, pode ou não integrar-se no genoma da célula. O vetor pode ser obtido através de métodos convencionais (Sambrook et al., 2001, indicado acima).

Noutro aspeto, é fornecida uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira transformada, que compreende um ácido nucleico modificado ou uma construção de ADN fornecidos por esta invenção. De acordo com a invenção, a célula hospedeira de expressão é uma procariota, ou seja, Escherichia coli, ou um hospedeiro eucariótico, ou seja, levedura (por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris), células de inseto ou células de mamifero.

Noutra realização particular, o vetor de expressão que compreende o ácido nucleico modificado ou a construção de 15 ADN que codifica o vetor proteico da invenção destina-se à terapia ou transferência de genes in vivo. Numa forma de realização mais particular, o referido vetor de expressão é um vetor virai. Os vetores virais apropriados para este efeito incluem: vetores derivados de adenovirus, virus adeno-associado, retrovirus, lentivírus, alfavirus, vírus herpes, coronavírus, etc.

Noutro aspeto, a invenção refere-se a um método de produção de um vetor proteico da invenção, que compreende a cultura de uma célula hospedeira com um ácido nucleico modificado ou uma construção de ADN da invenção, em condições que permitem a expressão do vetor proteico. As condições para otimizar a cultura da célula hospedeira dependerão do tipo de célula hospedeira utilizada. Se desejado, o procedimento para produzir o vetor proteico da invenção inclui o isolamento e a purificação do mesmo.

Em alternativa, o vetor proteico pode ser obtido através de outros métodos convencionais. Esses métodos incluem, por exemplo, síntese química em fase sólida; purificação com uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC); e, se preferido, análise através de técnicas convencionais, tais como sequenciação ou espetrometria de massa, análise de aminoácidos, técnicas de ressonância magnética, etc.

Noutra realização, o vetor proteico pode ser obtido através da ligação covalente do polipéptido com a sequência de aminoácidos correspondente ao domínio EDA da fibronectina (EDA), ou um fragmento do referido domínio EDA capaz de ligar a TLR4, ou uma variante do referido domínio EDA), à molécula de interesse (por ex.: polipéptidos, lipopéptidos, oligossacáridos, polissacáridos, ácidos nucleicos, lípidos ou outros produtos químicos). Isto pode ser efetuado através da utilização de métodos convencionais resumidos em guias de laboratório, por exemplo, "The current protocols in protein chemistry", publicado por John 16

Wiley & Sons (atualizado periodicamente. Atualizado até 1 de maio de 2005), ou "Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia e PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992.

Subsequentemente, de acordo com a invenção, o vetor proteico, ou ácido nucleico modificado e construções de ADN que codificam o mesmo, ou os vetores de expressão e as células hospedeiras de expressão que incorporam os referidos ácidos nucleicos ou construções de ADN podem ser utilizados na preparação de uma composição farmacêutica.

Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se à utilização do polipéptido com a sequência de aminoácidos correspondente ao dominio EDA da fibronectina (EDA), ou um fragmento ou variante do mesmo, conforme descrito anteriormente, na preparação de um agente imunoestimulador, caracterizado por o referido agente ser uma composição farmacêutica.

Em certas formas de realização, a composição farmacêutica pode ser utilizada para estimular a maturação das células de apresentação de antigénios, ou induzir uma resposta imunitária eficaz especifica da molécula de interesse. Numa forma de realização particular, a referida composição farmacêutica pode ser utilizada para induzir uma resposta imunitária Thl numa pessoa à qual a composição imunoestimuladora é administrada. Conforme aqui utilizado, "induzir uma resposta imunitária Thl" pode incluir casos em que a composição imunoestimuladora induz uma resposta Thl/Th2 misturada. Noutros casos, contudo, a composição imunoestimuladora pode induzir uma resposta imunitária Thl com pouca ou substancialmente nenhuma indução de uma resposta imunitária Th2. Numa realização particular, a referida composição farmacêutica pode ser utilizada para induzir uma resposta CTL.

Em algumas formas de realização, a composição imunoestimuladora pode ser utilizada como um adjuvante 17 imunoestimulador, por ex. combinado com um ou mais antigénios, com ou sem adjuvantes adicionais. Deste modo, em alguns casos, a composição imunoestimuladora pode formar uma vacina. Noutros casos, a composição imunoestimuladora pode servir como um adjuvante que pode ser utilizado em conjunto com uma vacina. A composição imunoestimuladora que inclui o polipéptido que compreende o dominio EDA da fibronectina (ou fragmento do mesmo) pode melhorar a expansão de linfócitos T CD8+ ativados, a geração de linfócitos T CD8+ de memória, ou ambos. Deste modo, a composição imunoestimuladora da invenção pode melhorar a imunidade mediada por células específica do antigénio numa pessoa que recebe a composição imunoestimuladora.

Numa realização particular, a composição imunoestimuladora que compreende o dominio EDA da fibronectina (ou fragmento ou variante do mesmo) é útil para o tratamento e a profilaxia de uma doença infeciosa, uma doença tumoral ou uma doença alérgica. Numa forma de realização concreta da presente invenção, a referida composição é utilizada para o tratamento e a profilaxia da hepatite C. A composição imunoestimuladora que compreende o domínio EDA da fibronectina (ou fragmento ou variante do mesmo) pode conter ainda mais portadores, excipientes e outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis conhecidos. A composição imunoestimuladora pode ser administrada em animais, por ex. mamíferos (humanos ou não humanos), aves e afins, de acordo com métodos convencionais bem conhecidos dos peritos na técnica (por ex. de forma oral, subcutânea, nasal, tópica).

Igualmente aqui descrito é um método terapêutico e/ou profilático que inclui a administração de uma composição imunoestimuladora que compreende o dominio EDA da 18 fibronectina (ou fragmento ou variante do mesmo) a uma pessoa.

As vias de administração adequadas incluem absorção transdérmica ou transmucosal, injeção (por ex. subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, etc.), ingestão, inalação e afins.

Noutro aspeto ainda, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que inclui, pelo menos, um portador farmacêutico aceitável e uma quantidade eficaz do vetor proteico em, pelo menos, uma das respetivas formas de expressão ou formas de realização: a) o vetor proteico na forma polipeptídica; b) um ácido nucleico modificado que codifica o referido vetor proteico; c) um vetor de expressão que compreende o referido ácido nucleico modificado; ou d) células hospedeiras de expressão que também compreendem o referido ácido nucleico modificado.

Noutra realização particular, a composição farmacêutica é caracterizada por compreender uma quantidade eficaz de células dendríticas, em que as referidas células dendríticas foram incubadas in vitro com o vetor proteico em, pelo menos, uma das respetivas formas de expressão ou formas de realização. Numa forma de realização mais particular, a referida composição farmacêutica é uma vacina ou composição imunoterapêutica.

Além disso, algumas utilizações adicionais do vetor proteico são aqui fornecidas. Numa forma de realização da invenção, o vetor proteico em qualquer uma das respetivas formas de expressão é utilizado para a preparação de uma composição farmacêutica eficaz para induzir a maturação de células dendríticas in vitro ou in vivo.

Noutra forma de realização, o referido vetor proteico é utilizado para a preparação de uma composição farmacêutica para induzir uma resposta imunitária 19 específica contra a molécula de interesse (antigénio ou epítopo) associada ao vetor proteico. Esta resposta imunitária é uma resposta imunitária humoral (produção de anticorpos contra a molécula de interesse), uma resposta auxiliar T ou uma resposta de células T citotóxica. Numa forma de realização preferida, a referida resposta imunitária é uma resposta CTL.

Uma realização mais particular refere-se à utilização do vetor proteico na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, e é fornecida a profilaxia de uma doença infeciosa. A referida doença infeciosa pode ser uma doença infeciosa bacteriana, virai, fúngica ou parasitária.

Outra realização particular refere-se à utilização do vetor proteico da invenção na preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento, e é fornecida a profilaxia de uma doença tumoral.

Ainda noutra realização particular, a invenção refere-se à utilização do vetor proteico na preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento, e é fornecida a profilaxia de uma doença alérgica. Diversas doenças alérgicas estão relacionadas com a ativação de uma resposta imunitária Th2. Deste modo, um afastamento ou um desvio da resposta Th2 para uma Thl utilizando o vetor proteico gue transporta um alergénio específico pode ter um efeito protetor ou terapêutico na doença alérgica.

De acordo com uma forma de realização particular aqui descrita, a composição farmacêutica proposta é utilizada para a administração num hospedeiro animal ou humano. Qualquer via de administração adequada pode ser utilizada. Numa realização particular, a composição farmacêutica é administrada através de uma via parentérica (ou seja, intravenosa, subcutânea, intramuscular), uma via transdérmica ou uma via mucosal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 20

Figura 1. Análise SDS-PAGE de proteínas EDA e EDA-SIINFEKL produzidas e purificadas. Uma alíquota das proteínas EDA e EDA-SIINFEKL foi carregada com 15% de gel de poliacrilamida e submetida a eletroforese. Os marcadores de peso molecular (MWM) são indicados em KDa. É observada uma banda correspondente ao peso molecular putativo das proteínas EDA e EDA-SIINFEKL (13-14 KDa).

Figura 2. Ligação do vetor proteico EDA-SIINFEKL a TLR4. 2A. Ensaios de ligação direta. As células HEK293-LacZ (HEK293-LacZ) e as células HEK293-TLR4/MD2/CD14 (HEK293-TLR4) foram pulsadas com 1 pm de EDA-SIINFEKL, fixas com paraformaldeído, rotuladas com anticorpos anti-His e anti-EDA, desenvolvidas com IgG-FITC antirratinho e analisadas através de citometria de fluxo. 2B. Capacidade EDA para inibir a ligação de anticorpos anti-TLR4 a células de expressão de TLR4. As células HEK-TLR4 foram incubadas durante 2 horas a 4 °C na presença ou ausência de 500 nM de proteína EDA-SIINFEKL. As células foram lavadas e incubadas com anticorpos anti-TLR4 coloridos com FITC e analisados através de citometria de fluxo. 2C. Percentagem de inibição da ligação de anticorpo anti-TLR4 a células de expressão de TLR4 através da utilização de concentrações diferentes de proteína EDA-SIINFEKL. 2D. Ensaios de aderência de células. As células HEK-hTLR4 ou HEK-LacZ coloridas com timidina tritiada foram distribuídas no poço de uma microplaca de 96 poços previamente revestida com proteína EDA e incubadas durante 2 horas a 37 °C. As células não aderentes foram eliminadas, ao passo que as células aderentes foram colhidas, e a radioatividade incorporada foi medida num contador de cintilação Topcount. Os números de células aderentes por poço foram calculados com a ajuda de curvas padrão.

Figura 3. EDA-SIINFEKL ativa a via de sinalização de TLR4. A medição colorimétrica do gene humano de fosfatase alcalina embrionária segregada nos sobrenadantes de cultura 21 de células de expressão de HEK293/TLR4-MD2-CD14 ou HEK2 93/LacZ transfetadas com este gene repórter cuja expressão é controlada por um promotor ELAM-1 induzido por NF-kB. 24 horas após a transfeção, as células foram incubadas na presença ou ausência de concentrações diferentes de LPS, 100 nM de proteína EDA-SIINFEKL (EDA), ou 100 nM de proteína EDA-SIINFEKL anteriormente digerida com proteinase K. As barras representam a indução de dobra NF-κΒ (OD obtido com sobrenadantes de HEK293/TLR4-MD2-CD14 dividido pelo OD obtido com sobrenadantes de HEK293/LacZ).

Figura 4. EDA-SIINFEKL induz a secreção de citocinas pró-inflamatórias através de DC in vitro. As DCs derivadas da medula óssea foram cultivadas na presença de LPS (1 pg/ml), EDA-SIINFEKL (500 nM), EDA-SIINFEKL (500 nM) digerida com proteinase K, ou solução salina. Após 24 h, a presença de IL-12 (A) e TNF-α (B) foi medida no sobrenadante da cultura através de ELISA.

Figura 5. EDA-SIINFEKL induz a maturação de DC CDllc in vivo. A maturação de células dendríticas é um requisito para a estimulação ideal de uma resposta de células T. Quando a maturação ocorre, as APCs aumentam a expressão de moléculas de superfície, tais como moléculas CD40, CD80 e CD86 de MHC de classe I (H2Kb no nosso modelo) e de classe II (IAb no nosso modelo) . Por conseguinte, foi analisado se EDA-SIINFEKL iria induzir a maturação de células de expressão de CDllc in vivo. Os ratinhos C57BL/6 wt foram imunizados i.v. com 25 pg de EDA-SIINFEKL, 25 pg de EDA-SIINFEKL digerida com proteinase K, 25 pg de LPS ou com PBS sozinho. Igualmente, os ratinhos C57BL/6 TLR4 KO foram imunizados com 25 pg de EDA-SIINFEKL ou com PBS sozinho. Quinze horas depois, os ratinhos foram sacrificados e as células CDllc purificadas através de autoMACS. As células foram rotuladas e analisadas através de citometria de fluxo para expressão de moléculas H-2Kb, 1-Ab, CD40, CD80 e CD86. 22

Figura 6: EDA-SIXNFEKL é apresentado eficazmente através das células dendriticas às células T especificas do epitopo SIINFEKL. Foi caracterizada a aptidão de EDA-SIINFEKL para ser capturada por APC para a apresentação do epitopo SIINFEKL de CTL processado às células T de ratinhos transgénicos OT-1, especificas deste epitopo. (A) Produção de IFN-γ através de células não aderentes de ratinhos transgénicos OT-1. As DCs derivadas da medula óssea foram cultivadas na presença do meio sozinho, concentrações diferentes de péptido SIINFEKL sintético, SIINFEKL e EDA, EDA-SIINFEKL (proteína de fusão) ou EDA sozinha. Vinte e quatro horas depois, as DCs foram cultivadas e utilizadas como APC na presença de 105 de células OT-1 não aderentes. Após mais 24 horas, o sobrenadante foi recuperado e o IFN-γ segregado foi medido. (B) Dependência de moléculas TLR4. As células de hibridoma B3Z (105 de células/poço) foram incubadas na presença de células do baço de ratinhos C57BL/6 wt ou com esplenocitos de ratinhos knock out para a molécula TLR4 (105 de células/poço) e proteína EDA-SIINFEKL (100 nM) . (C) As células do baço de ratinhos C57BL76wt foram cocultivadas com células de hibridoma B3Z e proteína EDA-SIINFEKL na presença ou ausência de um anticorpo anti-TLR4. (B e C) A quantidade de IL-2 segregada para o sobrenadante de cultura foi medida através de um bioensaio baseado na utilização da linha celular CTLL. (D) Efeito da cloroquina, monensina, brefeldina ou cicloheximida na apresentação de antigénios da proteína de fusão EDA-SIINFEKL. As células dendriticas derivadas da medula óssea foram incubadas durante 1 hora na ausência ou presença de 30 mM de cloroquina, brefeldina, monensina ou 4 pg/ml de cicloheximida, antes da adição de EDA-SIINFEKL ou do péptido sintético SIINFEKL (barras brancas). Após 10 horas na cultura, as referidas DCs foram fixas em glutaraldeído e utilizadas como células de apresentação de antigénios (APC) (104 de células/poço) em coculturas com células de ratinho 23 OT-1 não aderentes (105 de células/poço). 24 horas depois, a quantidade de IFN-γ segregado foi medida através de um ELISA comercial. Para estudar se a expressão de TLR4 na APC pode favorecer o processo de apresentação, foram cultivadas células de hibridoma B3Z (especificas do epítopo SIINFEKL) na presença de células do baço de ratinhos C57BL/6 wt ou de ratinhos TLR4 KO, e concentrações diferentes de EDA-SIINFEKL (nM). A quantidade de IL-2 libertada para o sobrenadante de cultura foi medida através de um bioensaio baseado em CTLL (Figura 6E).

Figura 7. A imunização de ratinhos com EDA-SIINFEKL induz uma resposta celular especifica do epitopo SIINFEKL. Os resultados anteriores demonstram que a proteína recombinante EDA-SIINFEKL é bioativa e ativa especificamente APCs. A indução de respostas imunitárias de células T específicas in vivo é crucial para o desenvolvimento de uma vacina. Deste modo, foi testado se os ratinhos imunizados com a proteína de fusão EDA-SIINFEKL desenvolveram respostas celulares específicas contra este epítopo. (A) Indução de células de produção de IFN-γ. Nos dias 0 e 10, os ratinhos C57BL/6 foram imunizados com 1,5 nmol de EDA-SIINFEKL ou com 1,5 nmol de péptido SIINFEKL. No dia 20, as células do baço foram incubadas durante 48 horas na presença ou ausência de SIINFEKL, e a quantidade de IFN-γ segregado foi medida através de ELISA. (B) Indução da análise da resposta CTL especifica de SIINFEXL. Os esplenocitos dos ratinhos imunizados com EDA-SIINFEKL ou com SIINFEKL foram reestimulados durante 5 dias na presença do péptido SIINFEKL. Após esta incubação, a atividade CTL contra as células-alvo EL-4 foi medida na ausência ou presença do péptido SIINFEKL através de um ensaio de libertação de crómio51 convencional. Os dados representam as percentagens médias dos valores da lise específica da rede (% de lise de uma célula-alvo pulsada com SIINFEKL menos a % de lise de um célula-alvo não pulsada) de amostras triplicadas.

Figura 8. EDA-SIINFEKL protege contra a indução do tumor com células de expressão de EG7 OVA. Para estudar a capacidade da proteína de fusão EDA-SIINFEKL para proteger os ratinhos contra a injeção de células tumorais EG70VA, os ratinhos foram imunizados s.c. nos dias 0 e 10 com 3 nmol de EDA-SIINFEKL, SIINFEKL ou com solução salina. Vinte dias após a segunda imunização, os ratinhos foram induzidos s.c. com 105 de células EG70VA. O crescimento do tumor foi monitorizado através da utilização de um calibrador e expressado em milímetros cúbicos utilizando a fórmula V = (L x vi2)/2, em que L corresponde a comprimento (length); e w corresponde a largura (width). Os ratinhos foram sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu um volume superior a 8 cm3.

Figura 9. EDA funciona como um adjuvante na indução de respostas citotóxicas após a imunização com proteína OVA.

Se EDA for capaz de provocar a maturação de células dendríticas in vivo, existe a possibilidade de o mesmo poder funcionar como um agente adjuvante após a imunização com uma proteína que contém o epítopo citotóxico, mas ser incapaz de ativar uma resposta citotóxica por si mesmo. Para testar esta possibilidade, foi imunizado um grupo de ratinhos com 50 pg de EDA com 500 pg de proteína OVA (A) e outro grupo de ratinhos com 500 pg de OVA (B), sem utilizar qualquer outro tipo de adjuvante. Uma semana após a imunização, os ratinhos foram sacrificados e os esplenocitos foram cultivados na presença do péptido sintético SIINFEKL. Após 5 dias na cultura, a resposta citotóxica às células-alvo EL-4 pulsadas com o péptido SIINFEKL foi medida num ensaio de libertação de Cr51 convencional.

Figura 10. EDA pode funcionar como um veículo para antigénios maiores. Nas experiências anteriores, foi 25 provado que a proteína EDA pode funcionar como um veículo para transportar um epítopo citotóxico e favorecer a indução de uma resposta CTL contra o referido epítopo. Numa etapa posterior, foi feito um estudo sobre se EDA era capaz de transportar um antigénio maior e facilitar a indução de uma resposta celular contra o referido antigénio. Com este objetivo, foi construída a proteína de fusão EDA-OVA e efetuadas as seguintes experiências in vitro e in vivo. (A) Análise SDS-PAGE da proteína recombinante EDA-OVA. A proteína recombinante EDA-OVA foi expressada em E. coli, purificada através de cromatografia de afinidade, dessalinizada, desintoxicada, concentrada e analisada através de SDS-PAGE. Uma banda de aproximadamente 55 kDa foi observada, correspondente ao peso molecular putativo da referida proteína. (B) Experiências de apresentação de antigénios. As DCs derivadas da medula óssea foram cultivadas na presença ou ausência de OVA, EDA-OVA (proteína de fusão), EDA mais OVA, ou EDA sozinha. 24 horas depois, as DCs foram utilizadas como células de apresentação de antigénios na presença de 105 de células não aderentes de ratinhos OT-1. A produção de IFN-γ através de células não aderentes de ratinhos OT-1 na presença de DC foi quantificada por intermédio de um ELISA comercial. (C) A proteína BDA-OVA induz CTLs específicos de OVA in vivo. Os ratinhos C57BL/6 foram imunizados com 1 nmol de EDA-OVA ou com 1 nmol de OVA. Sete dias após a imunização, os esplenocitos de ratinhos imunizados foram reestimulados in vitro durante 5 dias na presença do péptido SIINFEKL. Mais tarde, a atividade CTL específica contra as células EL-4 incubadas na ausência ou presença de SIINFEKL foi medida num ensaio de libertação de Cr51 convencional. Os dados representam as percentagens médias dos valores da lise específica da rede (% de lise de uma célula-alvo pulsada com SIINFEKL menos a % de lise de um célula-alvo não pulsada) de amostras triplicadas. 26

Figura 11. A proteína EDA-NS3 produz uma resposta CTL específica contra a proteína NS3 do vírus da hepatite C.

Depois de observar que a proteína EDA podia funcionar como um veículo para antigénios grandes, a capacidade de EDA para induzir uma resposta antiviral à proteína NS3 virai da hepatite C (aminoácidos 1 a 196 da região da protease da proteína NS3) foi analisada, como uma estratégia de vacinação contra a infeção pelo referido vírus. (A) Análise SDS-PAGE da proteína recombinante EDA-NS3 (1 a 196). A proteína de fusão recombinante EDA-NS3 foi construída e expressada em E. coli, e analisada através de SDS-PAGE. (B) A proteína EDA-OVA induz CTL específico de OVA in vivo. Os ratinhos HHD (transgénicos para a proteína HLA-A2.1) foram imunizados por via i.v. com 100 pg/ratinho de proteína EDA-NS3 dissolvida em solução salina. Uma semana após a imunização, os esplenocitos foram reestimulados in vitro com péptido NS3 1073 (que contém um determinante T citotóxico imunodominante da proteína NS3 para a restrição HLA-A2). Após 5 dias na cultura, a atividade citotóxica foi medida contra as células-alvo T2 incubadas com o péptido 1073 (V) (SEQ. ID N.° 20, CVNGVCWTV) , ou com a variante 1073(L) do referido péptido (SEQ. ID N.° 21, CLNGVCWTV) ou na ausência do péptido, utilizando um ensaio de libertação de Cr51 convencional. (C) A proteína EDA-NS3 induz uma resposta multiepitópica contra epítopos diferentes da proteína NS3. Os esplenocitos obtidos a partir de ratinhos imunizados com EDA-NS3 foram reestimulados in vitro durante 48 horas na presença dos péptidos 1038 a 1046, NS3 1073 a 1081 ou NS3 1169 a 1177 (que contêm três determinantes citotóxicos para a restrição HLA-A2 no fragmento 1 a 196 da proteína NS3) ou com a proteína NS3 recombinante (Mikrogen). A quantidade de IFN-γ secretado para o sobrenadante foi medida através de um ELISA comercial. (D) A proteína EDA-NS3 induz uma resposta citotóxica de longa duração. Os ratinhos HHD foram imunizados por via i.v. com 27 100 pg/ratinho de proteína EDA-NS3 em solução salina. Sessenta dias após a imunização, os ratinhos foram sacrificados, e a presença de CTLs específicos do péptido NS3 1073 foi medida num ensaio de libertação de crómio51 convencional, utilizando células-alvo T2 incubadas na ausência ou presença do péptido NS3 1073. (E) A imunização de ratinhos C57BL/6 com DC incubada com EDA-NS3 protege os ratinhos da infeção por vírus vaccinia recombinante vHCV(l-3011) que expressa proteínas do vírus da hepatite C. Os ratinhos foram imunizados com 106 de DC previamente incubada com proteína EDA-NS3, e 7 dias depois receberam uma indução de 5xl06 de virus vaccinia vHCV (1-3011) por via i.p. Três dias após a infeção, os ratinhos foram sacrificados e a carga viral/mg de tecido ovariano foi quantificada, por meio de um ensaio de infeção de células BSC-1 .

EXEMPLOS

Exemplo 1. O Domínio Extra A da fibronectina interage com TLR4 e ativa a via de sinalização TLR4. 1.1 Materiais e Métodos

1.1.1 Expressão de proteínas recombinantes de vetor proteico EDA e EDA—SIINFEKL

Preparação do vetor proteico recombinante O domínio Extra A (EDA) da fibronectina foi amplificado através de RT-PCR utilizando primers específicos e ARN dos hepatócitos obtidos a partir de ratinhos tratados com concanavalina A para induzir lesões do fígado [Lasarte et ai., Hepatology. 2003; 37(2):461- 70.]. As secções de tecido do fígado foram homogeneizadas e submetidas a lise em Ultraspec (Biotecx, Houston, TX, E.U.A.) através da utilização de um Ultraturrax Driver T.25 (Janke & Kunkel, Ika-Labortechnik, Alemanha). 0 ARN foi isolado de acordo com os métodos de Chomczynski e Sacchi (Chomczynski P e Sacchi N. "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform 28 extraction." Anal Biochem 1987; 162: 156-159). 0 ARN foi transcrito de forma reversa (60 min a 37 °C) com 200 U de transcriptase reversa M-MuLV (Gibco-BRL) em 20 pL de volume de tampão 5xRT (250 mM de Tris-HCl Ph 8,3, 3 75 mM de KC1, 15 mM de MgC12) completado com 5 mM de ditiotreitol (DTT), 0,5 mM de desoxinucleósido trifosfato (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha), 25 U de inibidor de ribonuclease (Promega Corporation, Madison, WI, E.U.A) e 200 ng de hexâmeros aleatórios (Boehringer Mannheim). Depois do aquecimento (95 °C, 1 min) e do rápido arrefecimento com gelo, foram utilizados 0,3 pg do pool de ADNc para a amplificação de PCR em 20 pl de lOx solução tampão (100 mM de Tris-HCl pH 9,3, 500 mM de KC1, 1% de Triton X-100) com 0,08 mM de dNTP, primers a montante e a jusante (40 ng cada), 1,5 mM de MgC12 e 2U de polimerase de ADN Taq (Promega Corporation). O primer a montante era (SEQ. ID N.° 13) 5' CCATATGAACArrGArCGCCCrAAAGGACr 3' (as bases sublinhadas foram adicionadas aos primers para introduzir uma sequência reconhecida pela enzima de restrição Ndel, ao passo que a sequência em itálico corresponde ao inicio de EDA) e o primer a jusante (SEQ. ID N.° 14) 5' AGCGGCCGCCCATTCAGTCAGTTTTTCAAAGTTGATTATACTCTCAAGCTGTGTGGACT GGATTCCAATCAGGGG 3' (As bases sublinhadas foram adicionadas aos primers para introduzir a sequência reconhecida pela enzima de restrição Notl, a sequência a negrito corresponde à sequência que codifica o epitopo CTL OVA (SIINFEKL) ladeado por três aminoácidos em ambas as extremidades QLESIINFBRLTEV, ao passo que a sequência em itálico corresponde ao fim de EDA) . O fragmento amplificado PCR foi clonado em pCR2.1-TOPO utilizando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, 29 CA, E.U.A). Este plasmídeo foi digerido com Ndel e Notl e o fragmento de ADN resultante foi subclonado no plasmídeo pET20b digerido por Ndel/Notl (Novagen), gue permite a expressão de proteínas de fusão que transportam resíduos de seis histidinas (caudas de 6 histidinas (6xHis)) no carboxi-terminal. 0 plasmídeo pET20b2-26 resultante que expressa a proteína de fusão EDA-SIINFEKL-6xHis foi transfetado para células BL21(DE3) para a expressão do vetor proteico recombinante. As células transfetadas cresceram em 11 de LB a 37 °C até OD600 atingir 0,5 a 1. IPTG foi adicionado à cultura para uma concentração final de 0,4 mM e incubado com vibração à temperatura ambiente durante a noite. As células foram colhidas através de centrifugação, ressuspensas em 0,1 M de Tris-HCl pH=7,2, tratadas com lisozima, desfeitas através da utilização de uma prensa francesa (duas passagens a 20.000 pst), clarificadas através de centrifugação e filtradas. A proteína de fusão presente na fração solúvel foi purificada através de cromatografia de afinidade (Histrap, Pharmacia) utilizando uma plataforma FPLC (AKTA, Pharmacia). A proteína eluída foi dessalinizada mediante a utilização de colunas de dessalinização Hitrap (Pharmacia), e concentrada utilizando o dispositivo de filtragem centrífugo Amicon Ultra 4-5000 MWCO (Millipore Carrighwahill, Irlanda). O vetor proteico recombinante foi purificado a partir de endotoxinas através da utilização de colunas Endotrap (Profos Ag, Regensburg, Alemanha) até os níveis de endotoxina estarem abaixo de 0,2 EU/pg de proteína (avaliado pelo ensaio LAL, Cambrex).

Para obter um plasmídeo de expressão para a proteína EDA, foi efetuado um PCR mediante a utilização de primers CCATATGAACATTGATCGCCCTAAAGGACT (SEQ. ID N.° 13) e AGCGGCCGCTGTGGACTGGATTCCAATCAGGGG (SEQ. ID N.° 15) e de estratégias de clonagem semelhantes às descritas para o plasmídeo EDA-SIINFEKL, resultando no plasmídeo 30 pET20bEDAl.2. Foram adicionados 20 pg de proteína a cada amostra num gel de 15% de SDS-poliacrilamida, seguido da coloração com azul Coomassie. Uma banda correspondente ao peso molecular putativo (13 kDa) foi observada. 1.1.2. Ligação de EDA-SIINFEKL a TLR4. Ensaios de aderência e citometria de fluxo.

Para testar se a proteína recombinante EDA-SIINFEKL era capaz de ligar a células de expressão de TLR-4, foi utilizada TLR4-MD2-CD14 293 humana de expressão de HEK293 (de Invivogen) . Também foram utilizadas células HEK293 transfetadas com LacZ (Invivogen) como um controlo negativo. As células foram pulsadas com 1 mM de EDA-SIINFEKL durante 1 h a 4 °C, lavadas com PBS e fixas com 4% de paraformaldeído em PBS durante 10 min. Após 3 lavagens, as células foram rotuladas com 1/100 de anticorpos anti-His (Qiagen) e 1/200 de anti-CDlô (FcBlock, de Becton Dickinson) durante 1 hora e 30 min. Após três lavagens, as células foram incubadas durante 30 min com 1/100 de diluição de um IgG antirratinho rotulado com fluoresceína e analisadas através de citometria de fluxo.

Em alternativa, foi medida a capacidade da proteína EDA-SIINFEKL para inibir a ligação de anticorpo TLR4 anti-humano colorido por FITC às células HEK-hTLR4. Para tal, as células HEK TLR4 foram incubadas durante 2 h a 4 °C na presença ou ausência de doses diferentes de EDA-SIINFEKL. Mais tarde, as células foram lavadas e incubadas com anticorpos anti-TLR4 e analisadas através de citometria de fluxo. A percentagem de inibição foi calculada para concentrações ensaiadas diferentes de EDA-SIINFEKL. Os ensaios de aderência de células também foram efetuados. As células HEK LacZ ou HEK hTLR4 foram previamente coloridas com timidina tritiada e distribuídas em placas de 96 poços anteriormente revestidas com proteína EDA. Após uma incubação de 2 horas a 37 °C, as células não aderentes foram removidas, enquanto as células aderentes foram 31 colhidas, e a radioatividade incorporada foi medida num contador de cintilação Topcount. 0 número de células aderentes por poço foi calculado com a ajuda de curvas padrão obtidas mediante a utilização de concentrações diferentes de células coloridas. 1.1.3. Ativação da via de sinalização TLR4

As células de expressão de HEK293/hTLR4-MD2-CDl4 ou HEK293/LacZ foram transfetadas com um plasmídeo que transporta o gene humano de fosfatase alcalina embrionária segregada (SEAP) de acordo com as instruções do fabricante (Invivogen). A expressão de SEAP é controlada por um promotor ELAM-1 induzido por NF-κΒ (pNiFty-SEAP (Invivogen)). Vinte e quatro horas após a transfeção, as células foram incubadas na presença ou ausência de concentrações diferentes de LPS, 100 nM de proteína EDASIINFEKL ou 100 nM de proteína EDA-SIINFEKL anteriormente digerida com proteinase K. Após 24 horas, a expressão do gene repórter foi medida nos sobrenadantes de cultura através de um ensaio colorimétrico (Invivogen). Na figura 3, a barras representam o fator de indução NF-κΒ de dobra (OD obtido nos sobrenadantes de HEK293/TLR4-MD2-CD14 dividido pelo OD obtido nos sobrenadantes de HEK293/LacZ) . A quantidade de contaminantes de endotoxina nos preparados de EDA neste ensaio era inferior a 0,0003 yg/ml. 1.2 Resultados

1.2.1. Expressão de proteínas de fusão recombinantes EDA e EDA-SIINFEKL A proteína recombinante EDA-SIINFEKL foi expressada em E. coli como uma proteína de fusão 6xHis (SEQ. ID N.° 2), purificada através de cromatografia de afinidade, dessalinizada e purificada a partir de endotoxinas, conforme descrito na secção de métodos. As proteínas resultantes foram analisadas através de SDS-PAGE e Western Blot mediante a utilização de anticorpos anti-his (Figura 32 1). Uma banda correspondente ao peso molecular putativo (13 kDa) foi observada para cada proteína. 1.2.2. A proteína de fusão RDA-SIINFEKL liga a TLR4

Foi descrito que o domínio extra A da fibronectina ativa o recetor do tipo Toll 4 (Okamura et al., JBC, 2001; 276:10229-10233). Contudo, não existe nenhum indício direto da ligação física de EDA a TLR4. Primeiro, foi analisado se a proteína EDA-SIINFEKL tem a capacidade de ligar a células que expressam TLR4. As células TLR4-MD2-CD14 ou HEK293 humanas de expressão de HEK293 transfetadas com LacZ (Invivogen) foram pulsadas com 1 μΜ de proteína EDA-SIINFEKL, rotuladas com anticorpos anti-His e um IgG antirratinho rotulado com fluoresceína (consulte os métodos) e analisadas através de citometria de fluxo. Foi descoberto que as células HEK 293 que expressam TLR4-MD2-CD14 humana apresentam uma intensidade de fluorescência ligeiramente superior às células HEK 293 que expressam LacZ (Figura 2A) . A capacidade da proteína EDA-SIINFEKL para inibir a ligação de anticorpo colorido com fluoresceína à TLR4 humana também foi medida. Os resultados mostraram que a incubação prévia de células HEK-hTLR4 com 500 mM de proteína EDA-SIINFEKL inibiu aproximadamente 50% da referida ligação de anticorpo (Figura 2B) . A Figura 2C ilustra o efeito inibitório de doses diferentes de EDA-SIINFEKL na referida ligação de anticorpo. Por outro lado, foi medida a capacidade das células de controlo HEK hTLR4 e de controlo HEK LacZ para ligar num ensaio de aderência a poços de plástico anteriormente revestidos com proteína EDA. Foi ilustrado que as células HEK hTLR4 são capazes de ligar especificamente a poços que contêm EDA. Todas estas experiências indicam que as proteínas EDA e EDA-SIINFEKL são capazes de ligar a TLR4. 1.2.3. A proteína de fusão BDA-SIINFEKL ativa a via de sinalização TLR4 33 A sinalização TLR4 conduz a uma translocação de NF-kB, um fator de transcrição que liga a elementos de consenso nos promotores de uma variedade de genes. Para determinar se a proteína recombinante EDA-SIINFEKL pode ativar TLR4, foram utilizadas células HEK293/hTLR4-MD2-CD14 ou HEK293/LacZ transfetadas com um plasmídeo que transporta o gene humano de fosfatase alcalina embrionária segregada (SEAP) sob o controlo de um promotor ELAM-1 induzido por NF-κΒ (pNiFty-SEAP (Invivogen)). Foi descoberto que a proteína EDA-SIINFEKL era capaz de estimular a expressão de SEAP apenas nas células transfetadas HEK293/hTLR4-MD2-CDl4, atingindo um fator de indução NF-κΒ de dobra de 7, semelhante ao encontrado quando as células foram incubadas com 0,01 pg de LPS (Figura 3). Esta capacidade para estimular a translocação nuclear NF-κΒ era completamente revogada se a proteína EDA-SIINFEKL tivesse sido previamente digerida com proteinase K (Figura 3), sugerindo que a ativação EDA de TLR4 não pode ser representada pela possível contaminação de LPS na preparação da proteína recombinante. 1.3 Discussão.

Foi construído o plasmídeo recombinante pET20b2-26 que permitiu a expressão da proteína de fusão recombinante EDA-SIINFEKL 6xHis em E. coli. A presença de 6 histidinas facilita a deteção e purificação da proteína de fusão. Deste modo, foi possível purificar, a partir da fração citoplásmica de culturas E. coli, quantidades consideráveis da proteína de fusão. Os ensaios de ligação realizados nas células de expressão de TLR4 sugeriram que a proteína EDA-SIINFEKL é capaz de ligar a TLR4 especificamente. Além disso, é aqui ilustrado que EDA-SIINFEKL é capaz de ativar a via de sinalização TLR4. Esta ativação não está relacionada com a possível contaminação de LPS da proteína, uma vez que a digestão prévia com proteinase K revoga completamente a capacidade de estimular a translocação 34 nuclear NF-κΒ. De qualquer forma, a quantidade de contaminantes de endotoxina no preparado de EDA neste ensaio era inferior a 0,0003 pg/ml (conforme avaliado através do ensaio LAL) , o que não permite ativar a via de sinalização TLR-4 neste ensaio in vitro. Estes resultados sugerem que a proteína EDA pode ser utilizada como um veículo proteico para definir como alvo antigénios para as células de expressão de TLR4. As células dendríticas são conhecidas por expressar recetores do tipo Toll e, particularmente, TLR4. É igualmente sabido que alguns dos estímulos de maturação mais potentes para DC provêm da interação dos recetores TLR com os respetivos ligandos. Deste modo, a interação de uma proteína de fusão que contém EDA e um determinado antigénio pode favorecer a ativação rápida de imunidade inata através da indução da produção de citocinas pró-inflamatórias e do aumento de moléculas coestimuladoras. Além disso, a definição como alvo desta proteína de fusão para a superfície da DC pode aumentar a captura e endocitose do antigénio pela DC e consequentemente aumentar a resposta imunitária contra este antigénio.

Exemplo 2. O EDA que contém proteínas de fusão induz a maturação de células dendríticas in vitro e in vivo e permite a indução de linfócitos T citotóxicos 2.1 Materiais e Métodos. 2.1.1. Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea.

As células dendríticas cresceram a partir de células da medula óssea. Depois de submeter os eritrócitos a lise com tampão de lise ACK, as células foram lavadas e subsequentemente esvaziadas de linfócitos e granulócitos através de incubação com uma mistura de anticorpos contra CD4 (GK1; ATCC, Manassas, VA), CD8 (53.6.72; ATCC), Ly-6G/Grl (BD-Pharmingen; San Diego CA) e CD45R/B220 (BD-Pharmingen) seguido de complemento de coelho. As células 35 restantes cresceram em 106 de células/ml em placas de 12 poços no meio completo completado com 20 ng/ml de mGM-CSF e 20 ng/ml de mIL-4 (ambos de Peprotech; Londres, Reino Unido). O meio era substituído por meio fresco com citocinas de dois em dois dias. As células dendríticas não aderentes foram colhidas no dia 7 e cultivadas na presença ou ausência de 1 yg/ml ou 15 ng/ml de LPS (Sigma), EDA-SIINFEKL (500 nM) ou SIINFEKL (10 μΜ) a 37 °C e 5% de C02. Em algumas experiências, foi adicionada polimixina (10 yg/ml) às culturas para inibir o efeito dos contaminantes de endotoxina. Após 24 h na cultura, os sobrenadantes foram colhidos e IL-12 e TNF-oí foram medidos através de ELISA (BD-Pharmingen), de acordo com as instruções do fabricante. 2.1.2 Medição da maturação in vivo das células CDllc após a imunização com EDA-SIINFEKL. Efeito da digestão com proteinase K. A maturação de DC foi avaliada in vitro através da medição por citometria de fluxo da expressão de vários marcadores de superfície. Os ratinhos C57BL6 foram injetados i.v. com 25 yg de EDA-SIINFEKL, 25 yg de EDA-SIINFEKL digerida com proteinase K, 25 yg de LPS ou com PBS sozinho. A digestão de EDA-SIINFEKL com proteinase K foi realizada mediante a utilização de agarose-proteinase K (Sigma, St Louis). Resumidamente, foram utilizados 5 mg/ml de esferas de proteinase-agarose lavadas no tampão de lavagem (20 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 1 mM de EDTA, 1 mM de

ClCa2) para digerir a proteína EDA-SIINFEKL ou LPS durante 20 min a 30 °C. As esferas de agarose-proteinase K foram removidas através de centrifugação. Quinze horas após a imunização, os ratinhos foram sacrificados e as células CDllc purificadas através de autoMACS. As células foram rotuladas e analisadas através de citometria de fluxo. 2.1.3. Estudos in vitro para analisar a capacidade de apresentação de antigénios. 36

Foi caracterizada a aptidão de EDA-SIINFEKL para ser capturada por APC de modo a apresentar o epítopo SIINFEKL de CTL processado às células T de ratinhos transgénicos ΟΤΙ, ou ao hibridoma B3Z T, ambos específicos deste epítopo. As DCs derivadas da medula óssea foram cultivadas na presença de concentrações diferentes de EDA-SIINFEKL, EDA e SIINFEKL (não ligadas de forma covalente) ou SIINFEKL. Após vinte e quatro horas de cultura, os sobrenadantes foram colhidos e a produção de IFN-γ foi medida através de ELISA. Em alternativa, 12 horas após a iniciação da cultura, as DCs foram colhidas, fixas com 0,05% de glutaraldeído e utilizadas como APC na presença de quantidades diferentes de células não aderentes de OT-1 ou na presença da linha de células T de hibridoma B3Z. Em algumas experiências, as DCs foram incubadas na presença ou ausência de cloroquina (3 μΜ) , monensina (1 μΐ Golgystop, Pharmingen), brefeldina (1 μΐ Golgyplug, Pharmingen), cicloheximida (4 μg/ml), e depois incubadas na presença do péptido SIINFEKL ou EDA-SIINFEKL. Em alguns casos, foi adicionado anticorpo anti-TLR4 às culturas. A ativação de células B3Z na presença de APC tratada foi realizada através da medição da produção de IL-2. As células de hibridoma B3Z (105 de células/poço) foram cultivadas no meio completo (RPMI 1640 completado com 10% de FCS, 2 mM de glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e 5x10 ~5M de 2-mercaptoetanol) durante 18 horas na presença de células do baço (105 de células/poço) de ratinhos C57BL/6 wt ou de ratinhos TLR4 KO, e concentrações diferentes de EDA-SIINFEKL. A quantidade de IL-2 libertada para o sobrenadante de cultura foi medida através de um bioensaio baseado em CTLL, conforme anteriormente descrito. 2.1.4. Medição da indução in vivo dos linfócitos T citotóxicos (CTL) e das células de produção de IFN-γ após a imunização. 37

Os ratinhos C57BL6 foram imunizados i.v. com 50 pg de EDA-SIINFEKL ou com SIINFEKL nos dias 0 e 10. No dia 20, os ratinhos foram sacrificados para a análise da resposta CTL contra SIINFEKL. Os esplenocitos de animais imunizados foram cultivados na presença de 0,1 pg/ml de SIINFEKL em 5 x 106 de células/ml (10 ml) durante 5 dias no meio completo. No dia 5, as células foram colhidas para ensaios de libertação de crómio. A atividade litica foi medida através de incubação durante 4 h de números diferentes de células efetoras com 1 x 104 de células-alvo EL-4

previamente carregadas com 51Cr e com ou sem SIINFEKL. A percentagem de lise especifica foi calculada de acordo com a fórmula: (cpm experimental - cpm espontânea)/(cpm máxima cpm espontânea) x 100, em que a lise espontânea corresponde a células-alvo incubadas na ausência de células efetoras, e a lise máxima é obtida através da incubação de células-alvo com 5% de Triton x 100.

Para medir a produção de IFN-γ em resposta a SIINFEKL, os esplenocitos de ratinhos imunizados foram colocados em placas de 96 poços em 8xl05 de células/poço com meio completo sozinho, ou com 30 μΜ de péptido num volume final de 0,25 ml. Os sobrenadantes (50 μΐ) foram removidos 48 horas depois e o IFN-γ foi medido através de ELISA (Pharmingen, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Noutro grupo de experiências, foi provada a capacidade da proteína EDA para funcionar como um adjuvante numa mistura de proteínas. Neste caso, um grupo de ratinhos C57BL/6 foi imunizado por via i.v. com 50 pg de EDA-SIINFEKL na presença de 500 pg de proteína OVA no PBS, ao passo que outro grupo foi imunizado com 500 pg de proteína OVA sozinha no PBS. Uma semana depois, os ratinhos foram sacrificados para determinar a resposta CTL contra SIINFEKL em ambos os grupos, conforme indicado acima.

2.1.5. Proteção contra a indução de células tumorais EG70VA 38

Os ratinhos foram imunizados s.c. nos dias 0 e 10 com 3 nmol de EDA-SIINFEKL ou SIINFEKL. Vinte dias após a segunda imunização, os ratinhos foram induzidos s.c. com 105 de células EG70VA. O crescimento do tumor foi controlado com um calibrador e expressado em mm3 utilizando a fórmula V = (L x w2)/2, em que L corresponde a comprimento (length); e w corresponde a largura (width). Os ratinhos foram sacrificados quando o tamanho do tumor atingiu um volume superior a 8 cm3. 2.2. Resultados 2.2.1. A proteína de fusão EDA-SIINFEKL estimula a produção de IL-12 e TNF-α através de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC).

Foi examinado se a proteína recombinante EDA-SIINFEKL era capaz de estimular BMDC para produzir citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-12 ou TNF-α. Deste modo, as BMDC foram cultivadas com SIINFEKL (10 μΜ) , LPS (1 pg/ml e 15 ng/ml) ou EDA-SIINFEKL-6xHis (500 nM) . Vinte e quatro horas depois, IL-12 ou TNF-α no sobrenadante de cultura foi medido através de ELISA. Foi descoberto que EDA-SIINFEKL era capaz de estimular a produção de níveis muito elevados de IL-12 ou TNF-α através de BMDC (Figura 4). Esta capacidade imunoestimuladora desapareceu quando a proteína foi previamente tratada com proteinase K, indicando que esta atividade não se devia a possíveis vestígios de endotoxina nas amostras de proteína. 2.2.2. EDA-SIINFEKL induz a maturação in vivo dependente de TLR4 das DC de expressão de CDllc.

As células dendríticas (DC) são as células de apresentação de antigénios mais potentes com uma capacidade única para estimular células T nativas e respostas secundárias a antigénios. As DC têm a capacidade de capturar antigénios, processá-los em péptidos e apresentar os péptidos em conjunto com as moléculas de MHC de classe I ou II às células T citotóxicas (CTL) ou células auxiliares 39 T respetivamente. As DC imaturas podem capturar antigénios, mas têm de diferenciar-se ou amadurecer para se tornarem capazes de estimular células T nativas. Deste modo, a maturação de células dendríticas é um requisito para a estimulação ideal de uma resposta de células T. Quando a maturação ocorre, as APCs aumentam a expressão das moléculas de superfície, tais como moléculas de MHC de classe I e classe II, CD40, CD80 e CD86. Por conseguinte, foi analisado se EDA-SIINFEKL podia induzir a maturação de células de expressão de CDllc in vivo. Os ratinhos C57BL6 foram imunizados i.v. com 25 pg de EDA-SIINFEKL, 25 pg de EDA-SIINFEKL digerida com proteinase K, 25 pg de LPS ou com PBS sozinho. Quinze horas depois, os ratinhos foram sacrificados e as células CDllc purificadas através de autoMACS, e o anticorpo foi rotulado e analisado através de citometria de fluxo. Foi descoberto que a imunização com EDA-SIINFEKL era capaz de induzir a expressão de moléculas de MHC de classe I e classe II, CD40 e CD86. Esta capacidade de EDA-SIINFEKL foi completamente revogada quando a proteína foi digerida com proteinase K antes da imunização (Figura 5) . A digestão de LPS com proteinase K não teve qualquer efeito inibitório na capacidade de LPS para induzir a expressão destes marcadores de maturação (não ilustrado). Foi testada a capacidade de EDA-SIINFEKL para induzir a maturação de células CDllc de ratinhos C57BL/6 TLR4 KO e foi descoberto que EDA-SIINFEKL era incapaz de induzir a sobre-expressão de marcadores de maturação encontrados nos ratinhos C57BL/6 wt (Figura 5). 2.2.3 BDA—SIINFEKL é apresentado eficazmente através das células dendríticas às células T específicas do epítopo SIINFEKL.

Foi caracterizada a aptidão de EDA-SIINFEKL para ser capturada por APC de modo a apresentar o epítopo SIINFEKL de CTL processado às células T de ratinhos transgénicos ΟΤΙ, específicas deste epítopo. As DC derivadas da medula 40 óssea (105 de células/poço) foram cultivadas na presença de concentrações diferentes de EDA-SIINFEKL, EDA+SIINFEKL, EDA ou péptido SIINFEKL. Quarenta e oito horas depois, 105 de células OT-1 não aderentes foram adicionadas. A produção de IFN-γ através de células não aderentes OT-1 foi medida (Figura 6A). O péptido SIINFEKL foi apresentado eficazmente às células T de ratinhos OT-1, conforme provado pela produção de IFN-γ. EDA-SIINFEKL também induz níveis elevados de IFN-γ, embora sejam necessárias doses elevadas da proteína para obter níveis semelhantes ou até superiores de IFN-γ, indicando claramente que a proteína EDA transporta este epítopo SIINFEKL para as moléculas de MHC de classe I. A adição da proteína EDA à DC incubada com o péptido SIINFEKL não aumentou a produção de IFN-γ através das células T de ratinhos OT-1. Conforme esperado, a DC incubada com EDA sozinha não ativou as células T de ratinhos OT-1. Para analisar se a expressão de moléculas TLR4 na DC pode melhorar a apresentação de EDA-SIINFEKL, as células B3Z específicas de SIINFEKL foram incubadas com concentrações diferentes de EDA-SIINFEKL na presença de células do baço de ratinhos C57BL/6 wt ou TLR4KO. A apresentação de EDA-SIINFEKL às células B3Z foi mais eficaz na presença de células de apresentação de antigénios que expressaram TLR4 (Figura 6B). Igualmente, a apresentação de EDA-SIINFEKL às células B3Z foi completamente bloqueada através da adição de anticorpos anti-TLR4 (Figura 6C) , sugerindo que TLR4 está envolvido na captura de EDA-SIINFEKL. Mais tarde, foi estudado o efeito de fármacos diferentes no processamento de EDA-SIINFEKL e descoberto que esta apresentação foi totalmente inibida pela monensina, brefeldina ou cicloheximida, mas não pela cloroquina, um inibidor conhecido de acidificação nos endossomas e lisossomas tardios (Figura 6D). Conforme esperado, a apresentação do péptido sintético SIINFEKL não foi afetada por estes fármacos. Estes dados sugerem que a 41 interiorização de EDA-SIINFEKL não é mediada por macropinocitose e demonstram que EDA-SIINFEKL é processada através da via de processamento citosólico de classe I. 2.2.4. EDA-SIIFKL induz CTL específico de SIINFEKL in vivo.

Os resultados anteriores demonstram que a proteína recombinante EDA-SIINFEKL é bioativa e ativa especificamente APCs. A indução de respostas imunitárias de linfócitos T específicos in vivo é crucial para o desenvolvimento de uma vacina. Deste modo, foi testado se os ratinhos imunizados com a proteína de fusão EDA-SIINFEKL desenvolveram respostas CTL específicas contra células-alvo pulsadas com o epítopo SIINFEKL. Os ratinhos C57BL6 foram imunizados i.v. com 50 pg de EDA-SIINFEKL ou com SIINFEKL no PBS nos dias 0 e 10. No dia 20, os ratinhos foram sacrificados para a análise da resposta CTL contra SIINFEKL. Foi descoberto que EDA-SIINFEKL era capaz de induzir CTL contra células-alvo EL-4 pulsadas com SIINFEKL. Por outro lado, não foi descoberta nenhuma atividade CTL quando os ratinhos foram imunizados com SIINFEKL sozinho (Figura 7). Devido à aptidão de EDA para induzir a maturação in vivo de células dendríticas, a aptidão de EDA para funcionar como um adjuvante também foi analisada quando imunizada com proteína OVA. Nesta experiência, foi observado que a presença de EDA na mistura de imunização tem um efeito imunoestimulador e é capaz de melhorar a indução da resposta CTL contra SIINFEKL induzido pela proteína OVA (comparar a atividade lítica entre os painéis A e B da figura 9). 2.2.5. EDA-SIINFEKL protege os ratinhos contra a indução com células tumorais que expressam a proteína OVA.

Para estudar a capacidade da proteína de fusão EDA-SIINFEKL para proteger os ratinhos contra a injeção de células tumorais EG70VA, os ratinhos foram imunizados s.c. com 3 nmol de EDA-SIINFEKL, SIINFEKL ou com salina. Vinte dias após a segunda imunização, os ratinhos foram induzidos 42 s.c. com 105 de células EG70VA. Foi descoberto que a imunização de EDA-SIINFEKL protege os ratinhos contra o crescimento do tumor. Todos os ratinhos imunizados com SIINFEKL ou com salina desenvolveram tumores, ao passo que 40% dos ratinhos imunizados com EDA-SIINFEKL permaneceram livres de tumores e os restantes 60% experimentaram o retardamento do crescimento do tumor (Figura 8). 2.3. Discussão.

No presente estudo, mediante a utilização da proteína EDA recombinante como um vetor de ministração de epítopos, foi estabelecida uma estratégia de imunização que prepara respostas CTL in vivo, evitando a necessidade de um adjuvante. Foram identificados os mecanismos que contribuem para a eficácia de EDA que contém proteínas de fusão como um vetor para ministrar antigénios às células de expressão de TLR-4 e para induzir respostas imunitárias contra um antigénio.

Primeiro, foi descoberto que a estimulação in vitro de BMDC com EDA era capaz de estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-12 e TNF-α. Estas citocinas são conhecidas por serem cruciais para a iniciação de uma resposta imunitária forte contra um antigénio. Além disso, foi descoberto que a imunização in vivo com EDA era capaz de induzir a maturação de DC e aumentar a expressão de moléculas coestimuladoras na superfície de DC. A expressão destas moléculas coestimuladoras é da mais alta importância para a indução eficaz de respostas imunitárias contra um antigénio. Foi descoberto que este efeito depende da presença de TLR4, uma vez que as células CDllc isoladas in vivo de ratinhos C57BL/6 TLR4 KO anteriormente imunizadas com EDA não mostraram qualquer melhoria no respetivo estado de maturação em comparação com o encontrado nos animais não imunizados.

Foi descoberto que a presença da molécula TLR4 na APC melhora a apresentação de antigénios após a incubação com a 43 proteína de fusão EDA-SIINFEKL e que esta apresentação não foi afetada por cloroquina, o que inibe a proteólise endolisossomal. Estes dados sugerem que a interiorização de EDA-SIINFEKL não é mediada por macropinocitose e demonstram que a proteína recombinante EDA-SIINFEKL é processada como um antigénio citosólico, e significam que a proteína de fusão tem de ser ministrada ao citosol através da membrana de plasma de APC.

Ainda mais importante, foi descoberto que a imunização de ratinhos com a proteína de fusão recombinante EDA-SIINFEKL é capaz de induzir in vivo uma resposta CTL específica contra o epítopo SIINFEKL. Além disso, a imunização com EDA-SIINFEKL é capaz de proteger os ratinhos contra a indução com células tumorais EG70VA. Todos estes dados mostram que este vetor proteico que contém EDA é capaz de: (i) definir como alvo antigénios para células de expressão de TLR4 e, em particular, APC profissional; (ii) ministrar o antigénio vetorizado à via de processamento de antigénios de Classe I clássica; (iii) induzir a maturação de células dendríticas in vivo e in vitro; e (iv) preparar CTL in vivo contra o antigénio vetorizado na ausência de adjuvante e, deste modo, poder ser utilizado nas estratégias de vacinação contra os agentes infeciosos ou contra o cancro. Igualmente, estas proteínas de fusão que contêm EDA podem servir para a ministração citosólica de moléculas farmaceuticamente relevantes nas células de expressão de TLR4. Além do mais, a aptidão de EDA para induzir a maturação in vivo de células dendríticas permite a respetiva utilização como um adjuvante nas formulações que contêm um antigénio contra o qual é necessário produzir uma resposta imunitária, abrindo o espetro de possibilidades para a utilização de EDA no desenvolvimento da vacina. 44

Exemplo 3. A proteína EDA pode ser utilizada como um veículo para transportar antigénios de, pelo menos, 390 aminoácidos. 3.1 Materiais e métodos. 3.1.1 Expressão de proteínas recombinantes EDA-OVA e EDA-NS3.

Para a construção de um plasmídeo de expressão EDA-OVA, ARNm foi extraído das células tumorais EG70VA que expressam a proteína OVA. Após a transcrição reversa e amplificação por PCR com primers GCGGCCGCAATGGGCTCCATCGGCGCA (SEQ. ID N.° 16) e GCGGCCGCAGGGGAAACACATCT (SEQ. ID N.° 17) (as bases sublinhadas foram adicionadas para introduzir a sequência reconhecida pela enzima de restrição Notl, ao passo que a sequência em itálico pertence ao início e fim da ovalbumina). 0 produto PCR foi clonado em pCR2.1-T0P0 mediante a utilização do kit TOPO TA (Invitrogen), digerido com Notl e subclonado no plasmídeo pET20EDA 1.2 (que expressa a proteína EDA) previamente digerido com Notl. A orientação correta da construção foi verificada através de sequenciação. Após a indução de E. coli transformado com as culturas de plasmídeo, a proteína de fusão presente na fração solúvel foi purificada através de cromatografia de afinidade (Histrap, Pharmacia) utilizando uma plataforma FPLC (AKTA, Pharmacia). A proteína foi dessalinizada com colunas de dessalinização Hitrap (Pharmacia), e foi concentrada com o dispositivo de filtragem por centrifugação Amicon Ultra 4-5000 MWCO (Millipore Carrighwahill, Irlanda). O vetor de proteína recombinante foi purificado através da utilização de colunas de endotoxina Endotrap (Profos Ag, Regensburg, Alemanha), até os níveis de endotoxina estarem abaixo de 0,2 EU/pg de proteína (medido por ensaio LAL, Cambrex). Para a construção da proteína EDA-NS3, foi seguida uma estratégia semelhante utilizando primers 45 AGCGGCCGCAGCCACCATGGCGCCTATCACGGCCTATTC (SEQ. ID N.° 18) e AGCGGCCGCTTGCGGTACGGCCGGAGGGGATGAGTT (SEQ. ID N.° 19) que permitem a expressão do fragmento amino-terminal da proteína NS3 (aminoácidos 1026 a 1221). Em oposição à proteína EDA-OVA que foi extraída da fração solúvel de frações E. coli, no caso da proteína EDA-NS3, a proteína foi purificada a partir dos corpos de inclusão anteriormente dissolvidos em 8 M de ureia. Após uma cromatografia de afinidade mediante a utilização de colunas Histrap, foi efetuada uma cromatografia de troca iónica (DEAE-sefarose). A fração purificada desta segunda cromatografia foi redobrada a seguir ao protocolo de redobramento (refolding) numa coluna G25. Depois de redobrada, a coluna EDA-NS3 foi dessalinizada e purificada de endotoxinas mediante a utilização de colunas Endotrap (Profos, Alemanha).

As proteínas assim purificadas foram analisadas através de SDS-PAGE. 3.1.2 Estudos in vitro para avaliar a aptidão de apresentação de antigénios.

Foi avaliada a aptidão de EDA-OVA para ser capturada por APC e subsequente apresentação do epítopo SIINFEKL de CTL processado aos linfócitos T de ratinhos transgénicos OT-1. As células dendríticas derivadas da medula óssea (105 de células/poço) foram cultivadas na presença de concentrações diferentes de EDA-OVA, EDA + OVA (não ligadas de forma covalente), OVA ou EDA. 12 h depois, foram adicionadas 105 de células/poço de células não aderentes de ratinhos transgénicos OT-1. 24 horas depois do início da cultura, o sobrenadante foi extraído para a quantificação de IFN-γ segregado através de um ensaio ELISA comercial. 3.1.3 Medição da indução in vivo dos linfócitos T citotóxicos (CTL) e das células de produção de IFN-γ após a imunização. 46

Os ratinhos C57BL6 ou HHD (transgénicos para a molécula HLA-A2.1) foram imunizados i.v. com 50 pg de EDA-OVA ou EDA-NS3 respetivamente, nos dias 0 e 10. No dia 20, os ratinhos foram sacrificados para determinar a resposta CTL contra SIINFEKL ou contra o péptido NS3 1073. Os esplenocitos de animais imunizados foram cultivados na presença de 0,1 pg/ml de SIINFEKL ou de 1 pg/ml de NS3 1073 em 5 x 106 de células/ml (10 ml) durante 5 dias no meio completo. No dia 5, as células foram colhidas para análises de libertação de crómio. A atividade litica foi medida através de incubação durante 4 h de quantidades diferentes de células efetoras com 1 x 104 de células-alvo EL-4 previamente carregadas com 51Cr com ou sem péptido. A percentagem de lise especifica foi calculada de acordo com a fórmula (cpm experimental - cpm espontânea)/(cpm máxima -cpm espontânea) x 100, em que a lise espontânea corresponde a células-alvo incubadas na ausência de células efetoras, e a lise máxima é obtida através da incubação de células-alvo com 5% de Triton x 100.

Para medir a produção de IFN-γ em resposta aos péptidos diferentes, os esplenocitos de ratinhos imunizados foram distribuídos em placas de 96 poços, 8 x 105 de células/poço, apenas com meio completo, ou com 30 μΜ de péptidos NS3 1038 a 1046 (SEQ. ID N.° 23), 1073 a 1081 (SEQ. ID N.° 20, CVNGVCWTV) , 1169 a 1177 (SEQ. ID N.° 22), ou com 1 pg/ml de NS3 recombinante num volume final de 0,25 ml. Os sobrenadantes (50 μΐ) foram recuperados após 48 h e o IFN-γ foi medido através de ELISA (Pharmingen, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 3.1.4 Proteção contra infeção através do vírus vaccinia vHCV 1-1031 que expressa a poliproteína do vírus da hepatite C. C57BL/6 foram imunizados nos dias 1 e 10 com 1 x 106 de células dendríticas derivadas da medula óssea pulsadas com proteína EDA-NS3. Dez dias após a segunda imunização, 47 os ratinhos foram infetados via i.p. com 5 x 106 de pfu de vírus vaccinia recombinante vHCV 1-1031. Três dias após a infeção, os animais foram sacrificados e a carga viral/mg de tecido ovariano foi quantificada através de um ensaio de quantificação de unidade formadora de placa (pfu) baseado na utilização da linha celular BSC-1. 3.2 Resultados. 3.2.1 Expressão e purificação de proteínas EDA-OVA e BDA-NS3.

Conforme indicado na secção Materiais e métodos, EDA-OVA ou EDA-NS3 foram purificadas a partir de extratos de E. coli transformados utilizando a fração solúvel no caso de EDA-OVA, e a partir de corpos de inclusão no caso de EDA-NS3. Nas figuras 10A e 11A, é ilustrado o resultado de SDS-PAGE de ambas as proteínas. Foram obtidas bandas simples correspondentes às proteínas de tamanhos 55 kDa e 32 kDa correspondentes respetivamente aos tamanhos esperados de cada uma destas proteínas. 3.2.2 A ligação de EDA à proteína OVA melhora a apresentação de antigénios de IVA aos linfócitos T de ratinhos transgénicos OT-1.

Foi analisada a capacidade de ligação de EDA à proteína OVA para melhorar a apresentação de antigénios do epítopo SIINFEKL às células T específicas deste epítopo. Foi observado que as células dendríticas derivadas da medula óssea cultivadas na presença de EDA-OVA estimularam uma produção de IFN-γ mais forte através das células de ratinhos OT-1 não aderentes do que a induzida pelas quantidades equimoleculares da proteína OVA sozinha (Figura 9B) . Foi observado que a produção de IFN-γ também foi melhorada nas coculturas que continham a proteína EDA e a proteína OVA, quando comparado com a proteína OVA sozinha, sugerindo que a maturação de DC induzida por EDA pode melhorar a ativação de células T. 48 3.2.3. A ligação de EDA à proteína OVA ou à proteína NS3 melhora a indução in vivo específica dos linfócitos T citotóxicos. A aptidão de EDA-OVA e EDA-NS3 para induzir uma resposta CTL contra o epítopo SIINFEKL ou contra o epítopo NS3 1073, respetivamente, foi analisada. Foi observado, para a proteína EDA-OVA, que a imunização com esta proteína dissolvida em solução salina foi capaz de induzir uma resposta citotóxica contra células-alvo incubadas com o péptido SIINFEKL, e que a imunização com a proteína OVA sozinha não é capaz de induzir (Figura 9C). Do mesmo modo, a imunização de ratinhos HHD (transgénicos para HLA-A2.1) com a proteína EDA-NS3 induz uma resposta citóxica eficaz contra células-alvo anteriormente incubadas com o péptido NS3 1073 (V) (SEQ. ID N.° 20, CVNGNCWTV), ou com a variante 1073 (L) deste péptido (SEQ. ID N.° 21, CLNGVCWTV) Figura 11B. Foi igualmente observado que a imunização de ratinhos HHD com a proteína EDA-NS3 induz a ativação de células de produção de IFN-γ específicas dos péptidos NS3 1038 (SEQ. ID N. 0 23), 1073 (SEQ. ID N.° 20, CVNGVCWTV) e 1169 (SEQ. ID N.° 22) (Figura 11C). Além disso, a imunização de ratinhos com a proteína EDA-NS3 induz uma resposta celular citotóxica de longa duração específica contra o péptido NS3 1073. Efetivamente, quando os ratinhos imunizados com a proteína EDA-NS3 foram sacrificados 60 dias após a imunização, foi detetada a presença de CTL específica deste péptido (Figura 11D). 3.2.4 A imunização de ratinhos C57BL/6 com células dendríticas incubadas com a proteína EDA-NS3 protege os ratinhos contra a infeção por um vírus vaccinia que expressa proteínas do vírus da hepatite C. O pretendido era estudar se a imunização com células dendríticas incubadas in vitro com a proteína EDA-NS3 era capaz de induzir uma resposta celular capaz de proteger os ratinhos contra a indução com um vírus recombinante que 49 expressa proteínas do vírus da hepatite C. Por este motivo, foram imunizados ratinhos C57/BL6 com células dendríticas derivadas da medula óssea incubadas com a proteína EDA-NS3 ou com células dendríticas que não foram incubadas anteriormente com nenhum antigénio. Dez dias após a segunda imunização, os ratinhos foram infetados com 5 x 106 de pfu de vírus vaccinia recombinante vHCV 1-3011 (uma espécie de doação do Dr. Rice, Washington University School of Medicine, St Louis, MO e descrito por Grakoui A, et al. J Virol. 1993; 67:1385). Três dias depois, a carga virai foi medida em ambos os grupos de ratinhos. Nesta experiência, foi observado que a imunização com DC incubadas com a proteína EDA-NS3 foi capaz de proteger 6% de ratinhos contra infeções por vírus vaccinia recombinante. 3.3. Discussão.

Tal como foi ilustrado nos anteriores resultados, a proteína EDA pode servir como um vetor útil para definir como alvo o epítopo SIINFEKL da proteína OVA para as células de expressão de moléculas TLR4 e melhorar a respetiva imunogenicidade. Para avaliar a capacidade de EDA para aumentar a imunogenicidade de proteínas maiores, foram construídas proteínas recombinantes de fusão EDA-OVA que continham a proteína EDA-NS3 e OVA completa (397 aminoácidos) que contém o fragmento com a atividade de protease da proteína NS3 do vírus da hepatite C.

Estes resultados demonstram que a proteína EDA pode funcionar como um vetor muito eficaz para definir como alvo antigénios maiores. Deste modo, foi descoberto que, nos ensaios de apresentação de antigénios, a ligação de OVA a EDA melhora a captura de antigénios através de células de apresentação de antigénios, aumentando a ativação de células T específica. Igualmente, foi observado que a imunização com estas proteínas de fusão (EDA-OVA e EDA-NS3) permite a indução de respostas citotóxicas específicas contra estes antigénios. Estas respostas induzidas foram de 50 longa duração. Finalmente, foi observado que a administração da proteína EDA-NS3 com células dendríticas permite a indução de uma resposta celular protetora contra a infeção por vírus vaccinia que expressa proteínas do vírus da hepatite C.

Estes dados indicam que a proteína EDA pode ser um vetor de proteínas bastante adequado para a indução de respostas celulares contra um antigénio de interesse. A construção de proteínas de fusão com base na proteína EDA é uma estratégia apropriada nos protocolos de vacinação contra as doenças tumorais ou doenças causadas por agentes infeciosos. 51

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA S.L.

<120> AGENTES E MÉTODOS BASEADOS NA UTILIZAÇÃO DO DOMÍNIO EDA DA FIBRONECTINA <13 0> 1.2006.0176/ZAR <150> ES200501412 <151> 2005-06-13 <160> 23 <17 0> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 348 <212> ADN <213> Vetor proteico recombinante <400> 1 ttccatcaaa 60 ctcgagccct 120 cgcagagctg 1BO cgatgatatg 240 caactttgaa 300 348 atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga atcgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta gaggatggaa tccgggagct tttccctgca cctgatggtg aagacgacac cagggcctca ggccggggtc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca gagagccagc ccctgattgg aatccagtcc acacagcttg agagtataat aaactgactg aatgggcggc cgcactcgag caccaccacc accaccac

<210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Vetor proteico recombinante <220> 52 <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1)..(116) <223> Vetor proteico recombinante mEDA-SIINFEKL-6xHis (EDA-SIINFEKL), codificado pela sequência SEQ. ID N.° 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(91) <223> domínio EDA da fibronectina de ratinho (mEDA) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(105)

<223> Péptido QLE-SIINFEKL-TEW <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(116) <223> Cauda de histidina 6xHis <400> 2 53

Met 1 Asn ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala 10 phe Thr Asp vai ASp 15 val Asp Ser ile «* Ile Ala Trp Glu Ser 25 Pro Gin Gly Gin vai 30 ser Arg Tyr Arg vai Thr Tyr Ser Ser Pro Glu ASp Gly Ile GlU Leu phe 35 40 45 Pro Ala Pro ASP Gly Glu Asp ASp Thr Ala Glu Leu Gin Gly Leu Arg 50 55 60 ΡΓΟ Gly Ser Glu Tyr Thr vai Ser vai vai Ala Leu HIS Asp Asp Met 65 70 75 80 Glu Ser Gin Pro Leu Ile Gly Ile Gin Ser Thr Gin Leu GlU ser ile 85 90 9S lie Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Ala Ala Ala Leu GlU HiS His 100 105 110 Hl S Hi s Hl s His 115 <2 10> 3 <2 11> 255 <2 12> ADN <2 13> Homo sapiens <4Ο0> 3 aacattgatc gccctaaagg actggcattc actgatgtgg atgtcgattc catcaaaatt 60 gcttgggaaa gcccacaggg gcaagtttcc aggtacaggg tgacctactc gagccctgag 120 gatggaatcc atgagctatt ccctgcacct gatggtgaag aagacactgc agagctgcaa 180 ggcctcagac cgggttctga gtacacagtc agtgtggttg ccttgcacga tgatatggag 240

agccagcccc tgatt 25S <210> 4 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 54 aso 1 lie Asp Arg Pro 5 Lys Gly Leu Ala phe 10 Thr Asp val Asp val 15 ASP Ser lie Lys lie 20 Ala Trp Glu Ser pro 25 Gin Gly Gin val Ser 30 Arg Tyr Arg vai Thr 3S Tyr Ser Ser pro Glu 40 Asp Gly lie His GlU 45 Leu phe pro Ala pro 50 Asp Gly Glu Glu ASP 55 Thr Ala Glu Leu Gin 60 Gly Leu Arg pro Gly 65 ser Glu Tyr Thr val 70 Ser vai val Ala Leu 75 His ASp Asp Met Glu 80 Ser Gin pro Leu lie 85 <210> 5 <211> 246

<212> ADN <213> Vetor proteico recombinante <400> 5 atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60 attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggcctcagg ccggggtctg 120 agaacacagt cagtgtggtt gccttgcacg atgatatgga gagccagccc ccagcttgag 180 agtataatca actttgaaaa actgactgaa tgggcggtcg cactcgagca ccaccaccac 240 caccac 246

<210> 6 <211> 82 <212> PRT <213> Vetor proteico recombinante <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (82) <223> Vetor proteico recombinante mEDAalt-SIINFEKL-ôxHis, codificado pela sequência SEQ. ID N.° 5 55 <220> <221> misc_feature <222> (2) .. (57) . . . <223> Domínio EDA da fibronectma alternativo de (mEDAalt), gerado por splicing alternativo <220> <221> misc_feature <222> (58)..(71)

<223> Péptido QLE-SUNFEKL-TEW <220> <221> misc_feature <222> (77) .. (82) <223> Cauda de histidina <400> 6 *

\iék. I

Met Asn He Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp vai a|P 15 10 ASP ser xle tjrs lie Ala Trp Glu S|r Pro Gin Gly Gin vai ser Arg

Tyr Arg Ala ser Gly Arg Gly teu Arg Thr Gin ser vai Trp teu Pro cys Thr «et Ile Trp Arg Ala Ser Pro Gin teu Glu ser Ile lie Asn SO 55

Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Ala vai Ala Leu Glu His His «1s His 65 70

HÍS HIS

<210> 7 <211> 168 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 56 56 60 120 168 aacattgatc gccctaaagg accggcarcc actgatgtgg atgtcgattc catcaaaatc gcttgggaaa gcccacaggg gcaagtttcc aggtacaggg cctcagaccg ggttctgagt acacagtcag tgtggttgcc ttgcacgatg atatggagag ccagcccc

<210> 8 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Asn Ile ASP Arg Pro Lys 61 y Leu Ala Phe Thr ASp vai ASP val ASp 1 5 10 15 ser Ile *-ys ile Ala Trp 6lu Ser Pro Gin Gly Gin vai Ser Arg Tyr 20 2S 30 Arg Ala Ser 35 ASp Arg vai Leu Ser 40 Thr Gin Ser Vai Trp 45 Leu pro cys Thr Met He Trp Arg Ala ser Pro 50 55 <210> 9 <211> 90 9 <212> ADN <213> Vetor proteico recombinante <400> 9 57 atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60 attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta ctcgagccct 120 gaggatggaa tccgggagct tttccctgca cctgatggtg aagacgacac cgcagagctg 180 cagggcctca ggccggggtc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca cgatgatatg 240 gagagccagc ccctgattgg aatccagtcc acagcggccg cagccaccat ggcgcctatc 300 acggcctatt cccaacaaac gcggggcctg cttggctgta tcatcactag cctcacaggt 360 cgggacaaga accaggtcga tggggaggtt caggtgctct ccaccgcaac gcaatctttc 420 ctggcgaccc gcgtcaatgg cgtgtgttgg accgtctacc atggtgccgg ctcgaagacc 480 ctggccggcc cgaagggtcc aatcacccaa atgtacacca atgtagacca ggacctcgtc 540 ggctggccgg cgccccccgg ggcgcgctcc atgacaccgt gcacctgcgg cagctcggac 600 ctttacttgg tcacgaggca tgccgatgtc attccggtgc gccggcgagg cgacagcagg 660 gggagtctac cctcccctag gcccgtctcc tacctgaagg gctcctcggg tggaccactg 720 ctttgccctt cggggcacgt tgtaggcatc ttccgggctg ctgtgtgcac ccggggggtt 780 gcgaaggcgg tggacttcat acccgttgag tctatggaaa ctaccatgcg gtctccggtc 840 ttcacagaca actcatccec cccggccgta ccgcaagcgg ccgcactcga gcaccaccac 900 caccaccac 909

<210> 10 <211> 303 <212> PRT <213> Vetor proteico recombinante <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(303) <223> Vetor proteico recombinante mEDA-NS3-6xHis (EDA-NS3), codificado pela sequência SEQ. ID N.° 9 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(91) <223> Dominio EDA da fibronectina de ratinho (mEDA) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(292)

<223> Proteina NS3 do vírus da hepatite C 58 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (298)..(303) <223> Cauda de histidina <400> 10

Met Asn ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp vai asp vai 15 10 15

Asp Ser ile Lys lie Ala Trp Glu Ser Pro Gin Gly Gin vai Ser Arg 20 25 30

Tyr Arg vai Thr Tyr ser Ser Pro Glu Asp Gly ile Arg Glu Leu Phe 35 40 *5

Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gin Gly Leu Arg 50 55 60 pro Gly Ser Glu Tyr Thr vai ser vai vai Ala Leu His Asp Asp Met 65 70 75

Glu Ser Gin Pro Leu tle Gly lie Gin Ser Thr Ala Ala Ala Ala Thr 85 ^

Met Ala pro ile Thr Ala Tyr ser Gin «1» Thr Ar* 6ly )ÍS Leu 6ly

Cys Ile IU Thr ser Leu Thr Gl? Arg Asp Lys Asn Gin vai Asp Gly «I. vai Gin vai L«u ser Thr Ala Thr Gin Ser rhe Leu Ala Thr Cys 130 135 1 rur Uic GlV Al3 Gly SCI* vai Asn Gly vai Cys Trp Thr vai τ* 160 145

Leu 165 ,lu Tle Thr Gin Met Tyr Thr Asn vai Asp Ala Gly Pro LVS Gly Pro Ile 170 175 59

Gin ASp Leu vai Gly Trp Pro Ala ΡΓΟ pro Gly Ala Arg Ser Met Thr 180 185 190 pro cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu val Thr Arg HÍS Ala 195 200 20S Asp vai 210 ile Pro vai Arg ní Arg Gly Asp Ser Arg 220 Gly Ser Leu Leu Ser pro Arg pro vai Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 22S 230 235 240 Leu Cys pro Ser Gly 245 HÍS Vai vai Gly ile 250 Phe Arg Ala Ala val 255 Cys Thr Arg Gly vai 260 Ala Lys Ala Val ASp 265 Phe lie pro Val Glu 270 ser Met Glu Thr Thr 275 Met Arg ser Pro Vai 280 Phe Thr ASP Asn Ser 285 Ser Pro pro Ala vai 290 pro Gin Ala Ala Ala 295 Leu Glu HÍS HÍS HÍS 300 Hls HÍS HÍS

<210> 11 <211> 1473 <212> ADN <213> Vetor proteico recombinante <4 0 0> 11 60 atgaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga ttccatcaaa 60 attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta ctcgagccct 120 gaggatggaa tccgggagct tttccctgca cctgatggtg aagacgacac tgcagagctg 180 cagggcctca ggccggggtc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca cgatgatatg 240 gagagccagc ccctgattgg aatccagtcc acagcggccg caatgggctc catcggcgca 300 gcaagcatgg aattttgttt tgatgcattc aaggagctca aagtccacca tgccaatgag 360 aacatcttct actgccccat tgccatcatg tcagctctag ccatggtata cctgggtgca 420 aaagacagca ccaggacaca gàtaaataag gttgttcgct ttgataaact tccaggattc 480 ggagacagra ttgaagctca gtgtggcaca tctgtaaacg ttcactcttc acttagagac 540 atcctcaacc aaatcaccaa accaaatgat gtttattcgt tcagccttgc cagtagactt 600 tatgctgaag agagataccc aatcctgcca gaatacttgc agtgtgtgaa ggaactgtat 660 agaggaggct tggaacctat caactttcaa acagctgcag atcaagccag agagctcatc 720 aactcctggg tagaaagtca gacaaatgga attatcagaa atgtccttca gccaagctcc 780 gtggattctc aaaccgcaat ggttctggtt aatgccactg tcttcaaagg actgtgggag 840 aaaacattta aggatgaaga cacacaagca atgcctttca gagtgaccga gcaagaaagc 900 aaacctgtgc agatgatgta ccagattggt ttatttagag tggcatcaat ggcttctgag 960 aaaatgaaga tcctggagct tccatttgcc agtgggacaa tgagcatgtt ggtgctgttg 1020 cctgatgaag tctcaggcct tgagcagctt gagagtataa tcaactttga aaaactgact 1080 gaatggacca gttctaatgt tatggaagag aggaagatca aagtgtactt acctcgcatg 1140 aagatggagg aaaaatacaa cctcacatct gtcttaatgg ctatgggcat tactgacgtg 1200 tttagctctt cagccaatct gtctggeatc tcctcagcag agagcctgaa gatatctcaa 1260 gctgtccatg cagcacatgc agaaatcaat gaagcaggca gagaggtggt agggtcagca 1320 gaggctggag tggatgctgc aagcgtctct gaagaattta gggctgacca tccattcctc 1380 ttctgtatca agcacatcgc aaccaacgcc gttctcttct ttggcagatg tgtttcccct 1440 gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cac 1473

<210> 12 <211> 491 <212> PRT <213> Vetor proteico recombinante <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(491) <223> Vetor proteico recombinante mEDA-0VA-6xHis (EDA-OVA), codificado pela sequência SEQ. ID N.° 11 61 <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (2)..(91) <223> Domínio EDA da fibronectina de ratinho (mEDA) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(480)

<223> Proteína OVA <220> <221> MISC_FEATURE <222> (486)..(491) <223> Cauda de histidina <400> 12 62

Met 1 Asn Xle ASp Arg 5 Pro Lys Gly Leu Ala 10 Phe Thr Asp val Asp 15 val ASp Ser lie 8* ile Ala Trp Glu ser 25 pro Gin Gly Gin val 30 Ser Arg Tyr Arg vai Thr Tyr ser Ser Pro Glu ASp Gly ile Arg Glu Leu phe 35 40 45 Pro Ala Pro ASp Gly Glu ASp ASp Thr Ala Glu Leu Gin Gly Leu Arg 50 55 60 ΡΓΟ 65 Gly ser Glu Tyr Thr 70 vai ser vai val Ala 75 teu HÍS Asp Asp Met 80 Glu ser Gin Pro Leu Ile ciy ile Gin ser Thr Ala Ala Ala Met Gly 85 90 95 Ser lie Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe Lys Glu 100 10S 110 Leu Lys vai 115 His His Ala Asn Glu 120 Asn ile Phe Tyr SI pro ile Ala lie Met Ser Ala Leu Ala Met Vai Tyr Leu Gly Ala Lys ASp Ser Thr 130 135 140 Arg Thr Gin ile Asn >.ys vai vai Arg Phe ASP Lys Leu pro Gly phe 145 150 155 160 Gly ASp Ser Ile Glu Ala Gin Cys Gly Thr Ser Val Asn val His Ser 165 170 175 ser Leu Arg ASp Ile Leu Asn Gin Ile Thr Lys Pro Asn ASp val Tyr 180 185 190 ser Phe Ser 195 Leu Ala Ser Arg Leu 200 Tyr Ala Glu Glu Arg 205 Tyr Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gl n Cys val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly Gly Leu 210 215 220 Glu Pro lie Asn Phe Gin Thr Ala Ala ASp Gin Ala Arg Glu Leu He 225 230 235 240 63 >sn Ser Trp val Glu 245 Ser Gin Thr Asn Gly 250 Ile Ile Arg Asn val 255 Leu Gin pro. Ser Ser 260 Val Asp Ser Gin Thr 265 Ala Met val Leu Val 270 Asn Ala lie val Phe 275 Lys Gly Leu Trp Glu 280 Lys Thr Phe Lys ASp 285 Glu Asp Thr Gin Ala Met 290 Pro phe Arg val 295 Thr Glu Gin Glu ser 300 Lys Pro val Gin Met 305 Met Tyr Gin ile !lS Leu Phe Arg val Ala 315 Ser Met Ala ser Glu 320 Lys Met Lys lie Leu 325 Glu Leu pro Phe Ala 330 ser Gly Thr Met Ser 335 Met Leu vaT Leu Leu 340 pro ASp Glu val Ser 345 Gly Leu Glu Gin Leu 350 Glu ser ile ile Asn 355 Phe Glu Lys Leu Thr 360 Glu Trp Thr Ser Ser 365 Asn val Met Glu Glu Arg 370 Lys lie Lys val 375 Tyr Leu pro Arg Met 380 Lys Met Glu Glu Lys 385 Tyr Asn Leu Thr ser 390 val Leu Met Ala Met 395 Gly Ile Thr ASp val 400 phe Ser Ser Ser Ala 405 Asn Leu Ser Gly lie 410 Ser ser Ala Glu ser 415 Leu Lys ile Ser Gin 420 Ala val HiS Ala Ala 42S HiS Ala Glu Ile Asn 430 Glu Ala Gly Arg Glu 435 Val val Gly Ser Ala 440 Glu Ala Gly val Asp 445 Ala Ala Ser vai Ser Glu 450 Glu Phe Arg Ala 455 ASP HÍS Pro phe Leu 460 Phe Cys lie Lys HÍS 465 lie Ala Thr Asn Ala 470 val Leu Phe Phe Arg cys val ser pro 480

Ala Ala Ala Leu Glu hís h1s His h1s his hís 48S 490 64 <210> 13 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 13 ccatatgaac attgatcgcc ctaaaggact 30 <210> 14 <211> 75 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 14 agcggccgcc cattcagtca gtttttcaaa gttgattata ctctcaagct gtgtggactg 60 gattccaatc agggg 75 <210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 15 agcggccgct gtggactgga ttccaatcag ggg 33

<210> 16 <211> 27 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 16 27 gcggccgcaa tgggctccat cggcgca 65

<210> 17 <211> 23 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 17 gcggccgcag gggaaacaca tct 23

<210> 18 <211> 39 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 18 agcggccgca gccaccatgg cgcctatcac ggcctattc 39

<210> 19 <211> 36 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 19 agcggccgct tgcggtacgg ccggagggga tgagtt 36

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Péptido sintético <400> 20

Cys Vai Asn Gly vai Cys Trp Thr vai 1 5

<210> 21 <211> 9 <212> PRT 66 <213> Péptido sintético <400> 21

Cys Leu Asn Gly vai cys Trp Thr vai

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Péptido sintético <400> 22

Leu Leu cys Pro Ala Gly His Ala vai 1 5

<210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Péptido sintético <400> 23

Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr ser 67

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 1188446 AI [0009] • ES 200501412 [0107]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos selecionada entre: a) domínio EDA da fibronectina (EDA), ou b) um fragmento do referido domínio EDA capaz de se ligar a TLR4, no fabrico de uma composição farmacêutica estimuladora de uma resposta imunitária celular contra um antigénio, em que a referida composição farmacêutica é uma composição adjuvante imunoestimuladora ou uma vacina.

2. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o fragmento correspondente ao domínio EDA compreender uma sequência selecionada a partir: a) dos aminoácidos 2 a 91 da SEQ. ID N.° 2; b) da SEQ. ID N.° 4; e c) de um fragmento das sequências a) e b) capaz de se ligar a células que expressam TLR4.

3. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o fragmento correspondente ao domínio EDA compreender uma sequência selecionada a partir: a) dos aminoácidos 2 a 57 da SEQ. ID N.° 6; b) da SEQ. ID N.0 8; e c) de um fragmento das sequências a) e b) capaz se ligar a células que expressam TLR4.

4. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a referida composição farmacêutica compreender ainda uma ou mais moléculas de interesse. 2

5. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o polipéptido e a molécula de interesse estarem ligados um ao outro no mesmo vetor proteico; e em que a referida molécula de interesse é selecionada a partir de um antigénio virai, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico, um antigénio parasitário, um antigénio tumoral, um determinante antigénico tumoral e um alergénio.

6. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido antigénio ser um antigénio virai.

7. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido antigénio ser um antigénio virai do vírus da hepatite C.

8. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido antigénio ser um antigénio tumoral ou um determinante antigénico tumoral.

9. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a referida composição farmacêutica se destinar ao tratamento e à profilaxia de uma doença infeciosa, tumoral ou alérgica.

10. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a referida composição farmacêutica se destinar ao tratamento e à profilaxia de uma doença infeciosa.

11. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por a referida composição farmacêutica se destinar ao tratamento e à profilaxia da hepatite C. 3

12. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a referida composição farmacêutica se destinar ao tratamento e à profilaxia de uma doença tumoral.

13. Um vetor proteico caracterizado por compreender um polipéptido cuja sequência de aminoácidos é selecionada a partir: a) do domínio EDA da fibronectina (EDA), ou b) de um fragmento do referido domínio EDA capaz de ligar a TLR4, ligado a uma molécula de interesse selecionada a partir de: um antigénio virai, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico, um antigénio parasitário, um antigénio tumoral e um determinante antigénico tumoral.

14. Vetor proteico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido domínio EDA compreender uma sequência selecionada a partir: a) dos aminoácidos 2 a 91 da sequência SEQ. ID N. 0 2; b) da sequência SEQ. ID N.° 4; e c) de um fragmento das sequências a) e b) capaz se ligar a células que expressam TLR4.

15. Vetor proteico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido domínio EDA compreender uma sequência selecionada a partir: a) dos aminoácidos 2 a 57 da SEQ. ID N.° 6; b) da SEQ. ID N.0 8; e c) de um fragmento das sequências a) e b) capaz de se ligar a células que expressam TLR4. 4

16. Um vetor proteico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado por a referida molécula de interesse ser um antiqénio virai.

17. Um vetor proteico de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida molécula de interesse ser um antigénio virai do virus da hepatite C.

18. Um vetor proteico de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido antigénio virai da hepatite C ser uma proteina NS3 ou um fragmento antigénico da referida proteína.

19. Um vetor proteico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a referida sequência de aminoácidos ser SEQ. ID N.0 10.

20. Um vetor proteico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida molécula de interesse ser selecionada a partir de um antigénio tumoral e um determinante antigénico tumoral.

21. Um ácido nucleico modificado caracterizado por codificar um vetor proteico definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20.

22. Um ácido nucleico modificado de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender igualmente uma sequência de controlo ligada eficazmente que regula a expressão do vetor proteico.

23. Um ácido nucleico modificado de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por compreender a SEQ. ID N.° 1 ou a SEQ. ID N.° 5. 5

24. Um ácido nucleico modificado de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado por compreender a SEQ. ID N.° 9.

25. Um vetor de expressão para a expressão génica de um vetor proteico definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado por o referido vetor de expressão compreender um ácido nucleico modificado definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24.

26. Um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido vetor ser um vetor virai.

27. Uma célula hospedeira de expressão caracterizada por compreender um ácido nucleico modificado definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24, ou um vetor de expressão definido na reivindicação 25 ou 26.

28. Uma célula hospedeira de expressão de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por a referida célula hospedeira de expressão ser Escherichia coli.

29. Um método de produção de um vetor proteico definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira de expressão definida na reivindicação 27 ou 28 em condições que permitem a produção do referido vetor proteico e a recuperação do mesmo.

30. Utilização de um ácido nucleico modificado definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24, um vetor de expressão definido na reivindicação 25 ou 26, ou uma célula hospedeira definida na reivindicação 27 ou 28, na preparação de uma composição farmacêutica. 6

31. Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender, pelo menos, um veiculo farmacêutico aceitável e, pelo menos, um dos seguintes componentes: i) um vetor proteico definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20; ii) um ácido nucleico modificado definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24; iii) um vetor de expressão compreendendo o referido ácido nucleico modificado definido na reivindicação 25 ou 26; ou iv) uma célula hospedeira de expressão compreendendo igualmente o referido ácido nucleico modificado definida na reivindicação 27 ou 28.

32. Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade de células dendríticas, em que as referidas células dendríticas foram incubadas in vitro com, pelo menos, um dos seguintes componentes: i) um vetor proteico definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20; ii) um ácido nucleico definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24; ou iii) um vetor de expressão compreendendo o referido ácido nucleico modificado definido na reivindicação 25 ou 26.

33. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada por a composição ser uma vacina ou uma composição imunoterapêutica.