SE535982C2 - Ett nytt vaccin som angriper tumörkärl som ett effektivt redskap i tumörterapi - Google Patents

Abstract

Sammanfattning Uppfinningen relaterar till en formulering for behandlingen av olika cancerformer.Formuleringen är ett vaccin innehållande sekvensema av EDB, EDA, annexin A1,endosialin, C domänen av tenascin C eller magic roundabout (MR) eller fragment däravsom enskilda eller i kombination kopplade till en eller flera heterologa bärarmolekyler.Vaccinet administreras företrädesvis tillsammans med ett adjuvans.

Description

00535982 första delen av 2004. När den ges i kombination med kemoterapi förlänger den överlevnaden för patienter med metastaserande koloncancer, lung och bröstcancer. Den andra antiangiogena drog som blev godkänd av FDA är anti-VEGF aptameren Pegaptanib/Mecugen som används i behandlingen av åldersrelaterad degeneration i maculan i ögat (AMD). Dessutom godkändes receptortyrosinkinashämmaren Sunitinib (Sutent) och Sorafinib (Nexavar), som binder VEGFR2 (och även PDGF-receptor ß, Flt3 och cKit) i januari 2006 respektive december 2005 för behandling av njur- och gastrointestinal cancer. Den femte drog som riktas mot VEGF inducerad signalering är den VEGF-neutraliserande antikroppsfragmentet Ranibizumab (Lucentis) vilken godkändes i juni 2006 av FDA för behandling av åldersrelaterad maculadegenerering, den viktigaste orsaken till blindhet i väst.

Tidigare var uppfattningen att antiangiogen behandling inte skulle vara förknippad med problem med resistens, vilket ofta är fallet med kemoterapi. Detta då den ger sig på icke transformerade celler i tumören. Denna teori har dock visa sig inte vara helt korrekt. Data har ackumulerats som visar att andra angiogena vägar kan ersätta VEGF under det att sjukdomen fortskrider [5]. Det är därför viktigt att utveckla en bred panel av antiangiogena behandlingsmetoder för klinisk användning, som riktas mot olika funktioner hos angiogena kärl, motsvarande den panel av cytotoxiska medel som används av onkologer idag.

Flera av de ovan beskrivna antiangiogena behandlingsmetoderna är mycket kostnadskrävande och de aktiva substansema behöver injiceras intravenöst eller intramuskulärt flera gånger i veckan, varje dag eller flera gånger per dag för att ge maximal effekt, och visar ofta endast effekt på ett begränsat antal cancerformer. Behovet av nya behandlingsmetoder som är lättare att administrera, mera kostnadseffektiva och med ett bredare spektrum av cancerformer är därför stort.

Vaccination är attraktiv metod för behandling av många typer av sjukdomar.

Breda vaccinationsprogram har i det närmaste utrotat flera livshotande sjukdomar såsom polio, difieri och smittkoppor. Möjligheten att använda vaccination som behandlingsmetod även för cancer har under en tid varit fokus för intensiv forskning. Än så länge finns det dock inget vaccin för kliniskt bruk. Det finns flera orsaker till varför utvecklingen av vaccin för cancerbehandling är svårare än för flera andra sjukdomar. För det första så är målmolekylen ofta ett självprotein kanske också uttryckt i normal vävnad men då med lägre nivåer eller under embryogenesen. I kontrast till vaccination mot främmande virala och bakteriella antigen måste därför immunsystemets självtolerans mot antigenet brytas. För det andra så. har tumörceller utvecklat mekanismer för att undvika igenkänning av immunsystemet, vilket ytterligare försvårar vaccination mot tumörcellsantigener. För det tredje så är det mycket viktigt att använda sig av en sjukdomsspecifik målmolekyl när man vaccinerar mot ett sj älvprotein.

Vi presenterar här en ny strategi för att öka effektiviteten av tumörvacciner genom att koppla självantigenet, den tumörvaskulära målmolekylen, till ett kroppsfrärrnnande antigen som är av en tillräcklig storlek för att innehålla en ansenlig mängd T- cellsepitoper. Denna metod gör att igenkärmingen av T-celler sker i nästa alla MHC- bakgrunder och att vaccinet därför kan användas i utavlade populationer som i människa.

Genom att rikta behandlingen mot kärlen minskar också risken att tumörcellema blir resistenta mot behandlingen. 00535982 Antiangiogen behandling har också möjligheten att bli ett kostnadseffektivt alternativ till upprepad och långvarig administration av en drog. För individer med hög risk att utveckla nedärva former av cancer kan antiangiogen vaccination möjligen även användas som förebyggande behandling.

De antigen vi har valt för utveckling av ett cancervaccin är sex olika antigen som huvudsakligen är uttryckta i tumörkärl i vuxna individer, extradomän B av fibronektin (EDB)[6], extradomän A av ñbronektin (EDA) [6], extradomän C av tenascin-C [7], annexin Al [8], endosialin [9, 10] och magic roundabout (MR) [l 1]. EDB är en 91 aminosyror lång domän som är insatt i fibronektin genom differentiell splitsning. EDB är uttryckt under embryogenes men inte i vuxen vävnad under normala omständigheter.

Däremot är EDB uttryckt i höga nivåer i ett antal solida tumörer [6]. Administration av antikroppar riktade mot EDB, som har kopplats radioaktiva eller cytotoxiska ämnen, har resulterat i mycket lovande resultat i musmodeller för cancer och även i en fas II klinisk prövning (för aktuell information se httpz/lwvvwphilogencomj). EDA är en annan extradomän som också sätts in i fibronektin genom differentiell splitsning. Denna domän är uttryckt i viss tumörvävnad men generellt inte i annan vävnad hos vuxna individer [6].

C-domänen av tenascin C är överuttryckt i olika tumörtyper, t.ex. i höggradiga astrocytom, men under detektionsnívå i normal vävnad hos vuxna [7]. Magic roundabout (MR) är också uttryckt i områden av aktiv angiogenes, som i tumörer, men inte i nomial vävnad förutom under embryogenes [7]. Även endosialin och annexin Al är båda nästan uteslutande uttryckt i tumörvävnad.

Vad som tidigare var känt inom fältet "Prior Art".

Vaccinationsstrategier för att behandla cancer har varit ett aktivt forskningsfält både inom den farmaceutiska industrin och bland akademiska forskare. Framgången har dock varit mycket begränsad. En mycket viktig faktor för denna bristande framgång har varit att de flesta kliniska och prekliniska försök har gjort med icke modifierade självprotein. Detta har även gjort att nära nog all grupper inom det tumörbiologiska fältet har kommit till slutsatsen att det inte är möjligt att göra aktiva tumörvacciner. Många grupper har därför valt att fokusera på monoklonala antikroppar. Ännu svårare har det varit med EDB där sekvensen är så extremt väl konserverad att det har varit näst intill omöjligt att göra monoklonala antikroppar i mus eller råtta mot det humana proteinet att de har varit tvungna att använda "phage display" teknologi för att erhålla EDB bindande strukturer för terapi (se http://wvvw.philogen.com/). Det är dock ett företag som har gjort studier med cancervacciner och det är Pharmexa i Danmark. De har använt immunodominata epitoper från olika kroppsfränunande proteiner. Dessa korta immunodominata epitoper har satts in i mâlmolekylen (wwwpharmexacom). idén bakom att sätta in immunodominanta epitoper är dock att det är en epitop som binder mycket starkt till en specifik MHC klass l eller Klass ll molekyl. Detta gör att vaccinet beroende av en mycket kraftigt varierande parameter, peptidspecificiteten hos en MHC molekyl. Genom att använda att fusionsprotein med ett större antal peptider löser vi problemet med enskilda immunodominanta epitoper och kan erhålla ett vaccin som har mer generella användningsområden. Alla tidigare testade vacciner har också riktats mot tumören och inte mot kärlassocierade antigen. Tumörantigen har visats lätt kunna nedregleras och att tumören därmed undviker attack från dessa behandlingsmetoder relativt lätt. Detta beror på tumörcellernas stora plasticitet. Alla tumörer behöver kärl för att överleva och att 00535982 växa, och strategin att angripa kärlen med nya mer kraflñilla terapeutiska vacciner bestående av enstaka eller en blandning av upp emot sex olika tumörspecifika vaskulära målmolekyler är därför en ny och mer kraftfullt sätt att angripa även aggressiva snabbväxande tumörer.

Upgfinningens mål Uppfinningens mål är att ta fram en lättanvändbar, krafifull och kostnadseffektiv metod för behandling av olika typer av cancerfonner genom att angripa tumörkärlen, en essentiell del av en växande tumör. Behandling med hjälp av vacciner bestående av fusionsproteiner mellan extra domän B (EDB) från ñbronektin, EDA, annexin A1, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) och ett kroppsfrämrnande bärarprotein av icke själv ursprung, antingen en i taget eller en kombination av två till sex av dessa fusionsproteiner för behandling av olika cancerfonner.

Sammanfattning av uppfinningen.

Den ovan beskrivna målet uppnås i enlighet med uppfinningen genom ett vaccin eller en kombination av vacciner, som karaktäriseras av att det består av en eller en kombination av två till sex proteiner som har hela aminosyrasekvensen eller delar större än 5 aminosyror av EDB, EDA, annexin A1, endosialin, extradomän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) från den art som skall vaccineras i dess ursprungliga eller multimeriserade form kopplad till en eller flera heterologa bärarproteiner och kan även innehålla ett adjuvans.

Kortfattad beskrivning av figurerna Figurema 1 A, B, C, D, E, och F visar aminosyrasekvensema av humant EDB, EDA, armexin Al , endosialin, extradomän C av tenascin C och magic roundabout (MR).

Figur 2 visar en schematisk bild av thioredoxin-EDB och GST-EDB konstruk- tionema som används fór immunisering, som antigen fór ELISA "coatning" och fór koncept-studier i musmodeller, och det rena proteinet från dessa konstruktioner.

Figur 3 visar effekten på tumörvikt efter vaccination. Antikroppstitrarna i en panel av vaccinerade och kontrolldjur visas också.

Figur 4 visar vaccinets tydliga effekt på tumörstorlek i en musmodell.

Beskrivning av uppfinningen.

Anti-EDB, anti-EDA, anti-armexin Al, anti-endosialin, anti-extradomän C av tenascin C eller anti magic roundabour (MR) antikroppar produceras av värden genom aktiv immunisering, så kallad vaccination. Genom injektion av modifierad EDB, EDA, armexin A1, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) i en värd så producerar värdens immunsystem ett polyklonalt antikroppssvar mot kroppens eget EDB, EDA, annexin A1, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR), och därigenom angrips de tumörspecifika kärlen av immunsystemet. Det är av största vikt att modifiera antigenet så att värdens immunsystem uppfattar det modifierade självproteinet som ett kroppsfrärnmande protein. Detta kan uppnås genom kovalent koppling av en kroppsfrämrnande aminosyraregion till EDB, EDA, armexin Al, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) eller en vald 00535982 region av någon av dessa molekyler från den art som skall behandlas. Peptidema inom den kroppsfrännnande delen attraherar och aktiverar då icke-toleriserade T-celler, som kan ge hjälp till potentiellt autoreaktiva B-celler.

Det finns minst tre olika strategier att göra dessa modifieringar av ett självprotein. En metod är att producera ett fusionsprotein mellan ett kroppsfrärnmande protein och hela eller ett utvalt fragment större en 5 aminosyraor av själv-EDB, EDA, armexin A1, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) i ett prokaryot eller eukaryot expressionssystem. Den öppna läsramen för EDB, EDA, annexin Al, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR), som exemplifieras av humant EDB, EDA, annexin Al, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) i figur 1 klonas då först in i en bakteriell, fiingiell eller eukaryot expressionsvektor. Detta fusionsproteikonstrukt transfekteras sedan in i en mammalie eller prokaryot värd för produktion av det önskade proteinet. Fusionspartnem kan här vara vilket kroppsfräinmande protein som helst av vilken storlek som helst från 10 aminosyror till flera hundra kDa. Med fördel kan dock ett protein av ungefär samma storlek som målmolekylen användas.

Altemativt kan icke modifierad EDB, EDA, annexin Al , endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) produceras i en marnmalie eller prokaryot värd eller värdcell och sedan kovalent kopplas till ett bäraiprotein genom kemisk koppling.

Ett tredje alternativ, vilket i vår mening är mindre fördelaktigt är att producera utvalda regioner av EDB, EDA, armexin Al, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR) som syntetiska peptider och sedan fasta dessa peptider till ett kroppsfrämrnande bärarprotein genom kemisk koppling. Det tredje altemativet resulterar ofta, efter injektion i patienten, i ett antikroppssvar som uppvisar låg bindningsaktivitet mot nativt rätt veckat protein och därmed i sämre klinisk effekt.

Eñer produktion av vaccinantigenet renas och testas detta för pyrogeninnehåll och möjliga andra föroreningar. För att erhålla ett tillräckligt starkt svar mot själv epitopema så kan vaccinantigenet blandas med ett adjuvans före injektion i patienten. Efter administrering i patienten inducerar vaccinet ett immunsvar mot antigenet. På grund av närvaron av kroppsfrämrnande epitoper i vaccinantigenet indiccrar detta protein också ett antikroppsavar mot målmolekylen i detta fall EDB, EDA, armexin Al, endosialin, extra domän C av tenascin C eller magic roundabout (MR), och därmed angriper immunsystemet tnmörkärlen, vilket leder till minskad tumörtillväxt eller till att tumören helt försvinner.

Exemgel.

För att studera uppfinningens effektivitet så producerades ett fusionsprotein mellan den 91 aminosyror långa extradomän B (EDB) av humant fibronektin och ett bakteriellt antigen av en storlek på 10 kDa. E.coli thioredoxin användes här som vaccinantigen för att studera effekten i en djurmodell. EDB domänen är mycket väl konserverad och i det närmaste identisk mellan nära nog alla placentala däggdjur som studerats. Detta fusionsprotein producerades i en prokaryot värd till näst intill homogenitet (helt rent) (Figur 2). Thioredoxin-EDB fiisionsproteinet injicerades sedan i möss tillsammans med adjuvans. Efter tre veckor fick mössen en boosterdos och efter fem veckors behandling analyserades serum från djuren för mängden anti-EDB antikroppar som producerats. Som OÜ535982 kan ses från figur 3 så uppvisade alla djuren höga titrar av anti-EDB antikroppar i motsats till kontrolldjuren som var negativa. Detta visar att vaccinet har kapaciteten att indicera produktion av rejäla mängder av anti-EDB antikroppar i försöksdjuren.

In vivo effekten av dessa antikroppar testades sedan i en mus tumömiodell.

Vaccinationen och de antikroppar som producerades efter stimuleringen av vårdens immunsystem visade sig effektivt kunna reducera tumörstorleken i dessa djur (Figur 4).

Anti-EDB antikroppanta också i en påtaglig förändring i tumörvävnaden som kunde ses efter examination med hjälp av elektronmikroskopi (icke visade resultat). Bindningen av anti-EDB antikroppar till tumörkärlen leder till en kraftig infiltration av immunceller och en attack av immunsystemet på dessa kärl. Det är mycket troligt att det är denna effekt på kärlen som orsakar den kraftiga reduktionen i tumörstorlek som observerades i vaccinerade djur.

F örvarandet att göra vacciner mot de andra antigen som nämns i denna ansökan är i praktiken identiskt till det som beskrivs för EDB bara att ett självprotein byts ut mot ett annat i vaccinantigenet.

Sammanfattningsvis så har vi nu visat att i kontrast till tidigare studier av cancervacciner att vi kan erhålla både höga titrar och biologiskt aktiva antikroppar genom vaccination och att dessa har god terapeutisk effekt på tumörtillväxt.

Referenser [1] Olsson AK, Dimberg A, Kreuger J, Claesson-Welsh L. VEGF receptor signalling - in control of vascular function. Nat Rev Mol Cell Biol 2006;7(5):359-7l. [2] Folkman J. Endogenous angiogenesis inhibitors. Apmis 2004;l l2(7-8):496-507. [3] Hawighorst T, Velaseo P, Streit M, Hong YK, Kyriakides TR, Brown LF, et al.

Thrombospondin-Z plays a protective role in multistep carcinogenesis: a novel host anti- tumor defense mechanism. Embo J 2001 ;20(l l):2631-40. [4] Sund M, Harnano Y, Sugimoto H, Sudhakar A, Soubasakos M, Yerrarnalla U, et al. Function of endogenous inhibitors of angiogenesis as endothelium-speciñc tumor suppressors. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;lO2(8)z2934-9. [5] Ferrara N, Kerbel RS. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 2005;438(7070):967-74. [6] Scarpino S, Stoppacciaro A, Pellegrini C, Marzullo A, Zardi L, Tartaglia F, et al.

Expression of EDA/EDB isoforrns of fibronectin in papillary carcinoma of the thyroid. J Pathol l999;l88(2): 163-7. [7] Silacci M, Brack SS, Spath N, Buck A, Hillinger S, Ami S, et al. Human monoclonal antibodies to domain C of tenascin-C selectively target solid tumors in vivo.

Protein Eng Des Sel 2006;l9( l0):47l-8. [8] Oh P, Li Y, Yu J, Durr E, Krasinska KM, Can/er LA, et al. Subtractive proteomic mapping of the endothelial surface in lung and solid tumours for tissue-specific therapy.

Nature 2004;429(6992):629-35. [9] Teicher BA. Newer vascular targets: endosialin (review). Int J Oncol 2007;30(2):305-12. 00535982

[10] Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su SL, Jaffe EA, Old LJ. Identification of endosialin, a cell surface glycoprotein of vascular endothelial cells in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A l992;89(22): 10832-6. [ll] Huminiecki L, Gorn M, Suchting S, Poulsom R, Bicknell R. Magic roundabout is a new member of the roundabout receptor family that is endothelial specific and expressed at sites of active angiogenesis. Genomics 2002;79(4):547-52.

Claims (20)

00535982 Patentkrav

1. Vaccin innehållande av en av dem eller en kombination av aminosyrasekvensema för extradomän B av fibronektin (EDB), extradomän A av fibronektin (EDA), annexin Al, endosialin, extradomän C av tenascin C, magic roundabout (MR) eller ett fragment därav i dess ursprungliga eller multimeriserade form, som är kopplad till ett kroppsfrämmande bärarprotein och med ett farmakologiskt accepterbart adj uvans.

2. Vaccin enligt patentkrav 1 där hela eller en del av EDB i dess ursprungliga eller multimeriserade form är kopplad till ett kroppsfrämmande bärarprotein.

3. Vaccin enligt patentkrav l eller 2 där EDB är av humant, canint (hund), felint (katt) eller equint (häst) ursprung.

4. Ett EDB vaccin enligt patentkrav 1 eller 2 for medicinskt bruk.

5. S. Användningen av ett fusionsprotein bestående av hela eller delar av EDB från den art som skall vaccineras och ett kroppsfrämmande bärarprotcin för produktion av ett vaccin för medicinskt bruk.

6. Vaccin enligt patentkrav l där hela eller en del av EDA i dess ursprungliga eller multimeriserade form är kopplad till ett kroppsfrämmande bärarprotein.

7. Vaccin enligt patentkrav 1 eller 7 där EDA är av humant, canint (hund), felint (katt) eller equint (häst) ursprung.

8. Ett EDA vaccin enligt patentkrav 1 eller 7 för medicinskt bruk.

9. Användningen av ett fusionsprotein bestående av hela eller delar av EDA från den art som skall vaccineras och ett kroppsfrärnmande bärarprotein för produktion av ett vaccin fór medicinskt bruk.

10. lO. Vaccin enligt patentkrav 1 där hela eller en del av armexin Al i dess ursprungliga eller multimeriserade form är kopplad till ett kroppsfrämrnande bärarprotein.

11. Vaccin enligt krav 1 eller 10 där armexin A1 är av humant, canint (hund), felint (katt) eller equint (häst) ursprung.

12. Ett armexin Al vaccin enligt patentkrav 1 eller 10 fór medicinskt bruk.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20. Zl. 22. 23. 24. 25. 00535982 Användningen av ett fusionsprotein bestående av hela eller delar av annexin Al från den art som skall vaccineras och ett kroppsfrämrnande bärarprotein för produktion av ett vaccin för medicinskt bruk. Vaccin enligt patentkrav l där hela eller en del av endosialin i dess ursprungliga eller multimeriserade form är kopplad till ett kroppsfrämmande bärarprotein. Vaccin enligt krav l eller 14 där endosialin är av humant, canint (hund), felint (katt) eller equint (häst) ursprung. Ett endosialin vaccin enligt patentkrav l eller 14 för medicinskt bruk. Användningen av ett fusionsprotein bestående av hela eller delar av endosialin från den art som skall vaccineras och ett kroppsfrärnmande bärarprotein för produktion av ett vaccin för medicinskt bruk. Vaccin enligt patentkrav 1 där hela eller en del av extradomän C av tenascin C i dess ursprungliga eller multimeriserade form är kopplad till ett kroppsfrärrnnande bärarprotein. Vaccin enligt krav l eller 18 där extradomän C av tenascin C är av humant, canint (hund), felint (katt) eller equint (häst) ursprung. Ett extradomän C av tenascin C vaccin enligt patentkrav 1 eller 18 för medicinskt bruk. Användningen av ett fusionsprotein bestående av hela eller delar av extradomän C av tenascin C från den art som skall vaccineras och ett kroppsfrämmande bärarprotein för produktion av ett vaccin för medicinskt bruk. Vaccin enligt patentkrav I där hela eller en del av magic roundabout (MR) i dess ursprungliga eller multimeriserade fonn är kopplad till ett kroppsfrärrirnande bärarprotein. Vaccin enligt krav l eller 22 där magic roundabout (MR) är av humant, canint (hund), felint (katt) eller equint (häst) ursprung. Ett magic roundabout (MR) vaccin enligt patentkrav l eller 22 för medicinskt bruk. Användningen av ett fusionsprotein bestående av hela eller delar av magic roundabout (MR) från den art som skall vaccineras och ett kroppsfrämmande bärarprotein för produktion av ett vaccin för medicinskt bruk.