JPH01502669A - 精製された血小板由来の成長因子及びその精製方法 - Google Patents
精製された血小板由来の成長因子及びその精製方法Info
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- JPH01502669A JPH01502669A JP63503959A JP50395988A JPH01502669A JP H01502669 A JPH01502669 A JP H01502669A JP 63503959 A JP63503959 A JP 63503959A JP 50395988 A JP50395988 A JP 50395988A JP H01502669 A JPH01502669 A JP H01502669A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
26、^TCCNo、67352で寄託された請求項25に記載の細胞。
27、0.4μg/10’細胞724時を上回る量でrPDGF Bを産生する
ことを特徴どするCI’IO細胞系。
28、 rPDGF B遺伝子を含むCOO細胞系がらrPDcF Bポリペプ
チドを発現させることを特徴とするrPDcF Bの産生方法。
29、非グリコジル化rPDGF B。
明細書
本発明は一般的に、高度に精製された組換え血小板由来成長因子(rPDGF)
及びかかる物質の産生方法に係る。より特定的には本発明は、モノクローナル抗
体を使用したrPDGFのアフィニティクロマトグラフィー精製、及びかがるモ
ノクローナル抗体、及び粗rPDGFを十分な有用量で産生する方法に係る。
Ross等はProe、Natl、Aead、 Sci、USA 71:120
7〜1210(1974)において、全血血清中で検出されるが血小板欠乏血清
中では検出されない因子として血小板由来成長因子(PDGF)を開示している
。かかる因子は培養線維芽細胞の成長を助ける。
非還元RDGFは分子量27〜35kdのタンパクである。いくつかの分離ゲル
で観察されるバンド数の違いは、グリコシレージョンの違い、精製中のプロテア
ーゼ作用、または1種類以上の分子種の存在に起因する。 PDGFの還元によ
って、10〜18kdの範囲の分子量をもつ2つ以上の小さいゲルバンドが生じ
る。この分野の最も好ましいモデルによれば、分子量27〜35kdをもつ天然
種が、分子量約18kd及び16kdをもつ異なる2つの小さいサブユニットか
ら成る。これらは夫々「^」サブユニット及びrB、サブユニット(またはPD
GF Aji[またはPDGF BM)と推移される。Doolittle等、
5cience 22L:257〜76(1983)及びNaterfield
等、Nature 304:2810〜14(1983)は、PDにFの2つの
サブユニットの部分的アミノ酸配列を開示し、PD(:F BMのアミノ酸配列
が、腫瘍性サル肉腫ウィルス(SSV)に含まれた腫瘍遺伝子であるv−sis
の予想タンパク産物と90%以上相同であることを指摘した。^鎖はB鎖にほぼ
60%相同であることが知見された。
サル肉腫ウィルスをウーリーモンキーの線維芽肉腫がら単離した。このウィルス
は細胞の腫瘍性形質転換を生起し、いくつかの動物で肉腫を発症させる。完全s
svゲノムがクローニング及び配列決定されており、腫瘍遺伝子領域(v−si
s)が同定され、これが分子量28〜33kdの融合タンパクを有効にコードし
得ることが知見されている。この配列に基くペプチドに対する抗血清は、ssv
感染細胞から28kdのタンパクを免疫沈降させた。このタンパクをp28si
sと命名した(Roggins等、Nature 305:6G5〜608(1
983))、v−sisをプローブとして使用し、c−xisに対応する染色体
クローンをヒト肝臓ライブラリィがら単離した。 Ca1lo等、Nature
292:31(1981)及びJoseph等、5cience 219:50
3〜505(1983)及び^aroason等、虹■37:123(1983
))、更に、v−sisをプローブとして、多数のヒト腫瘍細胞系をe−sis
RN八へ現に基づいてスクリーニングした。 に1110等、Nature
295:116〜119(1982))、また、高い割合の開光組織由来の腫瘍
が、4.2kbのe−sis RN^転写物を含むことを知見した。
Ga1lo等(Science 223:487〜490(1984))は、v
−sisに相同のヒト肝11e−sis染色体遺伝子の6つのエキソン全部の配
列を開示した。この開示されたDNA配列はPD(:F Bgの既知のアミノ末
端配列とほぼ等しいタンパク産物を予想させた。
更に、このDNA配列は、タンパク配列決定によって推定されていなかったPD
にF BMのアミノ酸配列の残りを予想させた。
またJoseph等、5cience 225:636〜639(1984)は
、HUT102腫瘍細胞に由来の2.7kbのeDN^DNAンを開示した。こ
のクローンは、4.2kb RNAの完全クローンではないが、活性PD(:F
BMをコードするために必要な配列をすべて含むと考えられる。 SV40初
期プロモータの下流でベクターに挿入すると、このベクターによる3T3細胞の
形質転換が可能であった。
PD(:F及びその類似体は、外来遺伝子を含むベクターで形質転換された原核
細胞及び真核細胞の双方で発現した。
Hurray等、欧州特許出願第177.957号、Hannick等、Mol
。
Ce11.Biol 、 6:1304〜1314(1986)、l1anni
ek等、Ho1.Ce1l。
Biol、 6:134:(−1348(1986)、King等、Proc、
Int” I^ead。
ムj工q互υ−82: 5295〜5299 (1985) 、K e l l
y等、EMBOJ、 L:3399〜3405(1985)、Josepbs
等、5cience 225:636(1984)、C1arke等、Natu
re 308:464(1984)、Gazit等、Ce1l 39:89〜9
7(1984)、 Hang、J、Biol、Che−、259:10645〜
10648(1984)。
しかしながらこれらの参考文献のいずれにおいても、培地中で50ny/i+f
を上回る活性PDGFの発現は開示されていない。
血小板PDにFの精製手順は、例えばTleldin等、Nature 319
:511(1986)、^ntoniades、米国特許第4479896号及
びRa1nes等、1」上ods Enz mol、 109ニア49(198
5)、Denuel等(1981)、J、Biol 、Chem、256:88
96〜99、 ^ntoniades(1981)、 Proe 。
Natl、^cad、sci、υS^78ニア314〜17に記載されているが
、これらの手順は分裂誘発活性(mitogenically active)
のPD(:F^ホモダイマーまたはPDにF Bホモダイマーを分離することが
できない。
本発明は、rPDcF Bの構造的コンホーメーションの十分な部分をもち、P
D(:F Bgのエピトープに特異的なモノクローナル抗体に結合するエピトー
プをもち、天然PDGFの生物学的特性を1つ以上有し、還元5OS−PAにE
によって測定すると95%を上回る純度をもつことを特徴とする精製及び単離さ
れたポリペプチドを提供する0本文中でrrPDGF BJなる用語は、特に注
釈がない限り、組換えPDにF BHの生物学的に活性のホモダイマーを意味す
る0本発明のポリペプチドは好ましくは、自律的に複製するDNAプラスミドま
たはウィルスベクターに担持された外来DNA配列の原核細胞または真核細胞中
の発現産物である。特に、ポリペプチドは、第1図に示すrPDGF Bv−s
isまたはその任意の天然変種の構造的コンホーメーションを有するか、あるい
は第2図に示すrPDGF Bc−sisまたはその任意の天然変種の構造的コ
ンホーメーションを有する。
本発明は更に、PDGF B鎖中で検出されるエピトープに特異的に結合するア
フィニテイをもつ一群のモノクローナル抗体に係る。
本発明は更に、本発明のポリペプチドの精製方法を提供する。該方法は、rPD
GF B中に検出されるエピトープに特異的に結合し得るアフィニテイをもつ基
質結合モノクローナル抗体を、rPD(:F B中で検出されるエピトープを少
なくとも1つ有するポリペプチドを含む溶液と接触させ、基質結合モノクローナ
ル抗体からポリペプチドを溶出する段階を含む。
本発明はまた、有意量のrPDGF Bを発現させる方法を提供する。該方法は
、適当なベクター中のrPDGF B遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣(C
IO)細胞に導入し、遺伝子増幅を誘発して多量(>0.4μg710″細胞7
24時;5日目の培地中の濃度〉1μy/y1)の粗rPD(:F Bを産生さ
せ、後述の手順で精製処理する段階を含む0本発明はまた、かかる発現系で有用
な細胞系に係る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを有効量で投与する創傷治癒の促進方法に
係る。
’ niow*rqa
第1図はrPDGF Bv−sisの一次アミノ酸配列、第2図はrPDcF
Bc−sisの一次アミノ酸配列、第3図はrPDGF Be−5isクローン
U2−OS56.1の概略図、第4図はrPDにF Bをコードする第3図のク
ローンに由来のエキソン2〜6の完全配列、
第5図はプラスミドpDsVEの概略図、第6図はプラスミドpDsVE/e−
sisの概略図、第7図はプラスミドpDsVE/v−sisの概略図、第8図
は推定rPDGF Be−5is前駆体のアミノ末端領域をコードするDNA配
列、
第9図はプラスミドpDSVE/cv−sisの概略図、第1O図はcv−si
s遺伝子の予想初期翻訳産物のアミノ酸配列、
第11図はCGH/PDCF融合タンパクCにアンのアミノ酸配列、第12図は
本発明のモノクローナル抗体を使用したELIS^アッセイの結果を示すグラフ
、及び
第13図はウサギ耳の打抜き標本の概略図である。
1r11
本発明方法によって、活性rPDGF Hの構造的コンホーメーションの少なく
とも一部を有する単離精製ポリペプチドが得られた0本発明のポリペプチドは、
rPDcF Bの一部のみまたは全部を含み、その他のPDGF関連分子、即ち
PDGF A鎖、 PDGF^ホモダイマー及びPDtl:F^、Bヘテロダイ
マーを実質的に含まない0本発明の精製ポリペプチドは、rPDcF B中で検
出されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体に結合するエピトープを含む
ことを特徴とし、5OS−PAGEで定量すると95%を上回る純度をもつ。
本発明ポリペプチドの精製方法は、rPDGF B中で検出されるエピトープに
特異的なモノクローナル抗体を結合させたクロマトグラフカラムに粗ポリペプチ
ド含有溶液を通し、結合したrPDGF Bをカラムから溶出する段階を含む。
本文中で使用される「生物学的に活性のrPDcF BJまたは「活性rPDG
F BJなる用語は、in vitro分裂誘発アッセイにおいて活性のrPD
GF Bを意味する。
本発明方法で有用なモノクローナル抗体の代表例は、1987年3月18日に^
merican Type Cu1ture Co11ection、1230
1 Farklawn Drive、 Rockville、 Marylan
d 20852に受託番号^TCCNo、9366で寄託されたハイプリドーマ
によって発現されたモノクローナル抗体[30]、1987年3月13日に^−
erican 丁ype Cu1ture Co11ection、12301
Parkla@nDrive、 Rockville%Maryland 2
0852に受託番号^TCCNo、IIB9357で寄託されたハイブリドーマ
によって発現されたモノクローナル抗体[133]、1987年3月13日に^
merican TypeCulture Co11ection、 1230
1 Parklawn Drive、 Rockville、Maryland
20852に受託番号^TCCNo、l]B9354で寄託されたハイブリド
ーマによって発現されたモノクローナル抗体[155]、1987年3月18日
に^merican Type Cu1ture Co11ection、12
301 Parklawn Drive、 Rockville、 Maryl
and 20852に受託番号^TCCHo、9372で寄託されたバイプリド
ーマによって発現されたモノクローナル抗体[232]、1987年3月13日
に^merican Type Cu1ture Co11ection、 1
2301 ParklawnDrive、 Rockville、 Maryl
and 20852に受託番号^TCCNo、BB9361で寄託されたハイブ
リドーマによって発現されたモノクローナル抗体[52]、1987年3月18
日に^−erican丁ypeCulture Co11ection、123
01 Parklawn Drive、Rockville、Maryland
20852に受託番号^TCCNo、9368で寄託されたハイブリドーマに
よって発現されたモノクローナル抗体[1913,1987年3月13日に^m
erican Type Cu1ture Co11ection、12301
Parklawn Drive、 Rockville%Maryland
20852に受託番号^TCCNo、BB9355で寄託されたハイブリドーマ
によって発現されたモノクローナル抗体[20]、1987年3月18日に^−
ericin Type Cu1ture Co11eetion−12301
ParklawnDrive、 Rockville、 Maryland 2
0852に受託番号^TCCNo。
9367で寄託されたハイブリドーマによって発現されたモノクローナル抗体[
116]、1987年3月18日にA+*erican TypeCultur
e Co11ection、12301 Parklawn Drive% R
ockville。
Maryland 20852に受託番号^TCCNo、9369で寄託された
バイプリドーマによって発現されたモノクローナル抗体[19B]、1987年
3月13日に^−erican 丁ype Cu1ture Co11ecti
on、12301 Parklawn Drive、Rockville%Ma
ryland 20852に受託番号ATCCNo、BB9356で寄託された
ハイブリドーマによって発現されたモノクローナル抗体[162]、1987年
3月18日に^merican Type Cu1ture Co11ecti
on、12301 ParklawnDrive%Rockville、 Ma
ryland 20852に受託番号^TCCNo。
9370で寄託されたハイブリドーマによって発現されたモノクローナlし抗体
[298]、1987年3月18日に^−erican TypeCultur
e Co11ection、12301 Parklawn Drive、 R
ockville。
Maryland 20852に受託番号^TCCNo、9371で寄託されな
ハイブリドーマによって発現されたモノクローナル抗体[219]である。
使用されるクロマトグラフシステムに適した特定カラム及び特定処理条件は当業
者に明らがであろう、好ましくは抗体アフィニティ力ラムを使用する0本発明の
ポリペプチドの溶出に使用される溶媒も当業者に明らかであろう、好ましくは弱
酸例えば酢酸を使用する。また好ましくは、温度約4℃で精製処理を行なう。
本文中で使用される「構造的コンホーメーション」なる用語は、rPDcF B
のアミノ酸配列の全部または一部を含む分裂誘発活性ポリペプチドの構造を意味
する。
本発明のポリペプチドの産生に有用な発現系は、細胞培養系、好ましくはCOO
細胞である0本文中の発現系以外に別の発現系を本発明で使用することも可能で
あり、例えば。
プロテアーゼ開裂部位の変性、本発明のポリペプチドの宿主細胞からの分泌レベ
ルを高める別のリーグ配列の使用等が考えられる。
本発明はまた、1987年3月13日にAmerican Type Cu1t
ureCollection、12301 Parklawn Drive%
Rockville、Maryland20852に受託番号^TCCNo、C
RL9359で寄託されたrPDGF Bv−sisを産生するCll0細胞系
及び1987年3月13日に^5ericanType Cu1ture Co
11ection、 12301 Parklawn Drive%Rock−
ville、 Maryland 20852に受託番号^TCCNo、CRL
9358で寄託されたrPDGF Be−5isを産生するCIO細胞系のごと
きrPDGF Bを産生する細胞系を提供する。
本発明はまた、rPDGF Be−5is/v−sis及びrPD(:F Bv
−sis/ニワトリ成長ホルモン(ccn)2合ポリペプチド、これらをコード
するDNAセグメント及びかかるDNAセグメントを含む形質転換ベクターを提
供する0本発明は特に、1987年3月13日にAmerican Type
Cu1ture Co11ection、12301 Pirk−Iawn D
rive、 Rockville%Maryland 20852に受託番号^
TCCNo 、CRL9360で寄託されたcv−sis細胞系及び^TCCN
o、67352として大腸菌AM7中で寄託されたCGHベクターを提供する。
本発明のクローンrPDGF B遺伝子の原核細胞または真核細胞発現によって
産生された生物学的に活性のrPDGF Bは医者及び/または獣医によって補
乳顕のin viν0治療に使用され得る。活性成分の量は勿論、治療される病
気の容態、選択される投与経路及びrPDcF Bの特異的活性に基づいて、担
当医または獣医が決定する。+1乳動物で治療反応を生じるように決定されたr
PDGF Bの量を、rPDGF B治療有効」量と推移する。かかる治療有効
量は当業者によって容易に決定できる。
rPDcF Bは治療すべき病気に適した任意の経路で投与され得る。好ましく
は、rPDにF Bを創傷に局所適用する0本発明のrPDGF Bの局所適用
組成物は当業者が容易に製造できる。治療される病気次第で好ましい投与経路が
異なることも当業者には容易に理解されよう。
rPDcF Bは純粋または実質的に純粋な化合物として投与されてもよいが、
この化合物を含む調剤または製剤の形態で投与されるのが好ましい。
ヒト及びを椎動物に使用される本発明の製剤は、前記に定義の治療有効量のrP
DcF Bを1種想以上の薬剤上許容される担体及び任意に別の治療成分と共に
含有する。(1種類以上の)「許容される」担体なる用語は、製剤のその他の成
分と適合性であり且つ製剤の賦形剤に有害でない担体を意味する。好ましくは製
剤が酸化剤または還元剤を含有しない、製剤はまた、ペプチドとの不適合性が判
明しているその他の物質を含有しない、製剤が単位剤形として調製されるのが好
ましく、この調製のために当業界で公知の任意の方法を使用し得る。すべての調
製方法が、1種類以上の付加成分を含む担体と活性成分とを会合させる段階を含
む。
一般的な製剤調製方法では、液体担体または微粉固体担体またはその双方と活性
成分とを均−且つ均質に会合させ、必要に応じて所望の剤形に成形する。
非経口投与に適した製剤は、活性成分の無菌水溶液を好ましくは被投与体の血液
と等張の溶液と共に含む、かかる製剤の好ましい調製方法では、固体活性成分を
水に溶解して水溶液を形成し、密封アンプルまたはバイアルのごとき単位用量ま
たは複数用量の容器に充填して該溶液を滅菌する0局所適用に適した製剤は治療
有効量のrPDGFを薬剤上許容される局所アジュバントと共に含む。
本発明を更に十分に理解するために本発明を実施例に基づいて以下に説明する0
本発明の範囲は請求の範囲の記載によって限定され、本発明の範囲内で実施例に
記載の手順の変更が可能であることは理解されよう、温度はすべて、補正しない
℃で示す0ミクロンまたはマイクロの記号はrμ」で示し、例えばマイクロリッ
トル、マイクロモル等はμl、μl等で示す。
本発明で使用したv−sis遺伝子は、サル肉腫ウィルスのレトロウィルスゲノ
ムのクローンたるプラスミドpc60(Ilong−Staal等、5cien
ce 213:22f5−8(1981))に由来した(R。
Ca1lo、 National In5titutes of Health
、 Bethesda、 MD、)。
ヌクレオチド3505の’JuI部位(Devare等、Proc、Natl、
^cad。
Sci、USA 80ニア31〜5(1983)の番号系を使用)とヌクレオチ
ド4817のXba 1部位との間の領域にわたるpc60の制限フラグメント
を、バクテリオファージM13mp18にサブクローニングした。5μりのpc
60 DNAを’JAI及び砂土■で消化し、1312塩基対のフラグメントを
Naoiatis等の手順(MolecularCloning:^Labor
atory Manual、 Co1d Spring HarborLabo
ratory、1982)に従って低融点アガロースゲル中で電気泳動分離後、
ゲルから抽出することによって精製した。
また1μiのM13mp18 DNAを石I及びXba lで消化し、フェノー
ル/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。 30ngのv−sis Ki
!LIから独11までのフラグメントと50n3の石I及びXbtで切断したH
13mp18 DNAフラグメントとをT4 DNAリガーゼで20μ!中で1
4℃で16時間結合した。結合したDNAを使用し、5−ブロモ、4−クロロ、
3−インドール−β−D−ガラクトシダーゼ(x−gal)及びイソプロピルβ
−D−チオガラクトシダーゼ(IPTf;)の存在下に大腸菌に12株JM10
3(Messing等、Huel、八cids Res、 9:309(198
1)>を形質転換した。透明なプラークを選択し、液体培地中で増殖させた。複
数のファージから単離されたDNAをジブオキチェーンターミネーション法によ
って配列決定し、クローンフラグメントの同一性を確認した。これらのファージ
クローンの1つを813鋤p18/v−sis(Kpn−Xba)と命名した。
1(b) c−11:
U2−OS56.1と命名されヒトPDGF Bgをコードするc−sis遺伝
子は、30.4kbのヒトDNAを含み、ヒト骨肉腫細胞系[2−OS(^TC
CNo、BTB96)に由来のDNAによって構築されたライブラリィから単離
された。このライブラリィは、コスミドベクターpTL5(Lund等−Pro
e、Natl、Acad、Sci、(USA 29:520〜524(1982
))を使用し、 Steinmetz等、Ce1l 28:489〜49B(1
982)に記載の手順で作成された。 Devare等、J、virol、 4
2:1108(1982)から得られたサル肉腫ウィルスのクローンから1(a
)の手順を用いてサブクローニングしたv−sisプローブによってライブラリ
ィをスクリーニングした。
クローンt12−OS56.1の地図を第3図に示す、第3図の矩形の部分は、
エキソン配列(Josephs等、5cience 223:487(1984
)及びGazit等、Ce1l 39:89(1984))を示す、エキソン2
〜7はv−sisに相同であり、非相同領域との接合部がエキソンの境界を示す
、エキソン1は、この遺伝子(Gazit等、Ce1l 39:89(1984
)から転写されたRNAの翻訳開始に必要であるかにみえるが、最終処理された
タンパク(Johnsson等、Embo J、 3:921(1984))中
に存在するペプチド配列をコードしない。
エキソン2〜6を含む制限フラグメントをバクテリオファージM13mp18に
サブクローニングし、Sanget等、Proe、Natl。
^ead、sci、(ISA 74:5463(197〕)の手順に従ってジデ
オキシチェーンターミネーション法によって配列決定した。成熟rPDGFBタ
ンパク(Johnsson等、Embo J、 i:921(1984))をコ
ードする全領域を含むこれらのエキソン配列は、ヒト胎児肝臓染色体ライブラリ
ィから単離されたc−sis遺伝子としてこれまでに発表された配列と正確に同
じであった(Josephs等、5cience 223:487(1984)
)、エキソン2〜6の完全配列を第4図に示す。
え4匠1
rPDGF B む ベクターの
2(a) ISlへ1呈上
チャイニーズハムスター卵巣DHFR−細胞中のrPDcF B遺伝子の発現に
選択されたベクターをpDSVEと命名した。このベクターは、4つのベーシッ
クDNA配列エレメントを使用して構築された。これらのエレメントの1つは、
細菌細胞中での選択及び自律複製に必要なりNA配列を提供した。これらの特徴
は、複製起点、及び、プラスミドpBR322のヌクレオチド2448から43
62 (標準番号系)にわたる領域のアンピシリン耐性遺伝子DNA配列によっ
て与えられる。 pBR322誘導psVO8(Dr、R,Tjian、Uni
versity of Ca1ifornia、Berkeley)に由来のこ
の1918塩基対のDNAフラグメントを構造的に変性するために、ヌクレオチ
ド2448の直後に配列5゛−^^GCTTG−3′
をもつHindllリンカ−を付加した。
第2のエレメントは、哺乳類及びその他のを椎動物細胞−□ 中で機能するウィ
ルスプロモーターを構成するDNA配列を提供した。サルウィルス40(SV4
0)初期プロモーターを含むDNAフラグメントを作成するために、SV40
DNAをまず制限エンドヌクレアーゼ酵素Pvu 11で消化し、異なるサイズ
の3つのPvu II /Pvu IIlフラグメント作成した。これらのフラ
グメントの1つは、左回りの「初期遺伝子」プロモーターをコードする配列(5
171位のBindlllから270位のPvu Ifまで)とSV40ウィル
スの複製起点とを含んでいた。3つのフラグメントの各々の5°末端及び3°末
端にEeoR■リンカーを付加し、異なるサイズの3つのEeoRI /Eco
Rlフラグメントを作成した。これらのフラグメントをHindI[[で消化し
、得られた340bpのBindl[[/EcoRlフラグメントをポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で単離した。
第3のエレメントは、ベクターに挿入された遺伝子の転写終了シグナルを提供し
た。初期SV40遺伝子のターミネータ−配列を含むDNAフラグメントを得る
ために、まず完全SV40ゲノムを制限エンドヌクレアーゼ”flIで消化し、
次に5alIリンカ−を付着させるプラント末端を陸土1認識部位に変換した0
次にこの非結合む工1 /Sa上1 SV40配列をEcoRlで消化し、20
30bpのSal I /EcoRIフラグメントをアガロースゲル電気泳動に
よって単離した。
pDSVEに含まれる第4のエレメントは、ベクターを含む哺乳類細胞の選択手
段を提供した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子は、チミジン及び
ヒポキサンチンの欠失した培地中で細胞を増殖させまたある程度のレベルの薬剤
メトトレキセートを含む培地中で細胞を増殖させ得る酵素をコードする。この遺
伝子は、Ga55er等、Proe、Natl、^cad。
むj工匹盈υ−υ−:6522〜652B(1982)に記載の手順でプラスミ
ドpMG−1から単離されたEcoRl及びHindll制限エンドヌクレアー
ゼ付着末端をもつ約2.500bpのマウスDIIFRミニ遺伝子を含んでいた
。
これらのエレメントを含む4つのDNAフラグメントをT4DN^リガーゼで結
合し、ベクターpDSVEを産生じた。第5図はこのベクターの概略図である。
2(b) DSVE c−sisの :Nlト3T3細胞の形質転換に必要な配
列全部を含むc−sisコスミドクローンU2−OS56.1の領域を、プラス
ミドpDSVLd(Lin等、Proc、Natl、^ead、sei、UsA
82ニア580(1985))のむ土1部位にサブクローニングした。この領
域は、第3図のU2−OS56.1地図の3.9kb及び26.85kbのEc
oR1部位にわたる領域である。
c−sisフラグメントをpDSVLdにクローニングする前に、c−sisフ
ラグメントの旺oRI末端をむ土■末端に変換した。
3μiのコスミドU2−OS56.1 DNAをEcoRIで制限し、フェノー
ル/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。Nan1atis等、IL、に
記載の手順を用い、大腸菌DNAポリメラーゼ■のKlenowフラグメントと
4つのデオキシヌクレオシド三リン酸全部とを含む15μ!中で単鎖領域を埋め
戻すことによって、二重鎖DNAのフラグメント末端を形成した0反応混合物を
70℃で5分間加熱することによって反応を終了させた。制限エンドヌクレアー
ビジ1工■の認識部位を含む合成りNAリンカ−を、1μgのキナーゼ化リンカ
−とT4 DN^Ni−ゼとを含む21μIの反応中で平滑末端をもつe−si
sフラグメントに付加した。14℃で1晩インキユベートし、フェノール/クロ
ロホルム抽出とエタノール沈殿とを行なって、リンカ−で結合したDNAを26
単位の5al(と共に100μlの反応中で3時間制限した。制限したDNAを
エタノール沈殿させ、少量のバッファに溶解し、1%の低融点アガロースゲルで
電気泳動にかけた。ゲルから23kbのバンドを切り出し、Maniatis等
、【雌、に記載の手順で精製した。 T4 DN^Ni−ゼを含む20μlの反
応中で23kbのバンドとガ土■で直線化したposvtdDN^とを結合した
。結合したIIN八で大腸菌に12株Doll (^TCC133849)を形
質転換した。 Nin1atis等、【雌、に記載の手順を用い、!!p−標識
v−sisプローブとのハイブリダイゼーションによってアンピシリン耐性コロ
ニーをスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンを選択し、クローンか
らプラスミドDNAを調製した。5illで制限することによってこのクローン
pDSVLd/c−sisからインサートを切除することが可能であった。制限
地図の作成によって、このクローンが、予想された23kbのe−sis DN
Aフラグメントを含むことを確認した。
意外にも、pDSVLd/e−sisはNIB−3T3細胞を容易に形質転換し
なかった。 pDSVLd/e−sisはまた、CO5−1細胞またはチャイニ
ーズハムスター卵巣(CIO)細胞に導入後に、検出可能レベルのFDCF活性
をもつ産物を産生じなかった。 Cazit等(前出)によって構築された関連
プラスミドはNlト3T3細胞を形質転換し得ることが判明した。 pDsVL
d/c−sisが推定エキジン1領域とエキジン2領域との間にGazit等の
構築において存在しなかった6、7kbのDNA領域を含むので、この領域があ
る種の哺乳類細胞型においてe−sisの発現を阻害する配列を含むという可能
性が推測される。従って新しい呻乳顕e−sis発現ベクターを構築した。この
ベクターにおいてはc−sis地図の5.2kb及び11.9kbのHindl
1部位間の6.7kbのDNAフラグメントを欠失させた。この新しいベクター
の構築には、前項2(a)で記載した哺乳類発現ベクターpDSVEを使用した
。 pDSVEは、CBO細胞中の挿入遺伝子を通常はpDsVLdよりも高い
発現レベルで発現させることが知見された。1μsのpDSVEを5allで制
限し、フェノール/クロロホルム抽出しエタノール沈殿し後述する結合で使用し
た。
c−sisの推定エキジン1領域を含むフラグメントを作成スルタメニ、3μg
t7) pDSVLd/e−sisをBawl l及び1リエIによって制限し
た。0.7%低融点アガロースゲル電気泳動でDNAフラグメントを分離した。
第3図のc−sis地図の4.6kbのBamH1部位と5.85kbの石1部
位との間の領域を示す1.25kbのフラグメントをゲルから切り出し、Man
iatis等、1此、に記載の方法で抽出した。75Bのこのフラグメントを、
20μlの反応中で、KL!LI及びム見IIIで予め制限しておいた75Bの
813霞plB DNAにT4 DNAリガーゼで結合した。結合したDNAで
大腸菌に12株JM103を前記のごとく形質転換した。複数の透明プラークを
選択し、液体培養で増殖させた。複製型分子(RF)の二重鎖DNAを感染細胞
から単離し、Bawl I 、 LLL I及びHiad I[[を用いた制限
地図作成によって観察した。正しいパターンを示す1つのクローンを選択し、こ
れを使用してc−sislQ @フラグメントを単離した。
4μgのM13mp18/c−sis(Big−Kp’n)RF DNAをガ土
■及びU二1nd−■で制限した。鉤±1制限の結果、c−sis(Bag−K
pn)フラグメントが挿入されたBimH1部位から13塩基対を隔てる813
B18のポリリンカー領域の部位で切断が生じた。 Bind[[制限の結果、
813w+p1BのBindm部位で切断が生じた0重要なことは、Lη■で制
限した結果、第3図のUZ−0556,1地図のc−sis(Basi−Kpn
)フラグメント内部の5.2kbに対応する位置でBindlf1部位が切断さ
れることである。従って、この手順の効果は、第3図の02−0556.1の地
区の3.9kbのBamH■部位の近傍に5ill部位が付加されることである
。1.0%低融点アガロースゲルで電気泳動にかけ抽出することによって反応混
合物から0.6kbのガ土1−Hindi[フラグメントを単離した。このフラ
グメントを以後エキラン1フラグメントと推移する。
適当な制限部位付着末端をもつc−sisエキソン2〜7を含むDNAフラグメ
ントを得るために、4μ2のpDsVLd/c−sisをBindN及びガ±1
で制限した。制御!DNAを0.7%低融点ゲルの電気泳動にかけ、第3図の0
2−OS56.1地図の11.9kbと26.85kbとの間の領域を示す14
.75kbのフラグメントを単離した。
最終20μl中の結合において、50ngのむ土I制限pDSVEを5ngのエ
キソン1のフラグメント及び80nfIのエキソン2〜7のフラグメントと混合
した。 T4 DNAリガーゼの存在下に14℃で1晩反応させ、この反応混合
物を用いて大腸菌に12株D)11を形質転換した。アンピシリン耐性コロニー
から2つのレプリカフィルターを作成した。1つのフィルターは、エキソン2〜
7の存在を検出するためにv−sisプローブにハイブリダイズさせ、もう1つ
のフィルターはc−sis DNAクローン(Josephs等、5cienc
e 225:636(1984))の上流領域に含まれる配列に相補的な合成オ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。このオリゴヌクレオチドは、前記エ
キジン1フラグメントにハイブリダイズすることが予め判明していた。双方のプ
ローブにハイブリダイズしたクローンを選択し増殖させてプラスミドを単離した
。制限分析の結果、pDsVE/c−sisと命名されたこのプラスミドが第6
図に示すような配置のエレメントを含むことが判明した。
2(c) DSVE v−sisの :サル肉腫ウィルスによって使用される翻
訳開始シグナルを利用するv−sis遺伝子を含む哺乳類の発現ベクターを構築
するために、v−sis遺伝子を含むDNAフラグメントとその上流の178b
pのSSV DNAとをpDsIEに挿入した。このベクターの転写によって得
られた初期翻訳産物は、SSvエンベロープ糖タンパクとrPDcF Bv−s
itとの融合産物である(Rob−bins等、Nature 305:605
(1983))、融合産物のアミノ末端部分を処理すると、SSVエンベロー1
タンパク配列が欠失した成熟rPDにF Bタンパクが産生ずる。実施例1に記
載の2μeのRF型分子のM13mp18/v−sis(Kpn−Xba)のサ
ブクローンを5illで制限した。この結果、ssyの3633位(Devar
e等、iLL、の番号系)のむ土!部位と1413論p1Bのポリリンカーの5
μ11部位との間の領域にわたる1191塩基対のフラグメントが遊離した。後
者の部位は、v−sis遺伝子が挿入されたXba 1部位からフ塩基対を隔て
る。このフラグメントを0.7%低融点アガロースゲル電気泳動にかけ、バンド
を切り出し、抽出することによって精製した。2Ottl中14℃で16時間の
反応で35nfのフラグメントと50nyの5all切断pDsVEDN^とを
T4 DNAリガーゼで結合した0反応産物で大腸菌に12株DHIを形質転換
した。 NtniiLis等、旺、に記載の手順で’ ” P If 識v −
s i sプローブとのハイブリダイゼーションを行なうことによってアンピシ
リン耐性コロニーをスクリーニングした。ハイブリダイズした複数のクローンを
選択し、液体培養で増殖させ、標準法でプラスミドを単離した。制限酵素Bin
dl[[、Xb見■及びPstlでプラスミドの地図を作成し、ptlsVE中
のSV40早期プロモーターによって転写される正しい配向のインサートを含む
クローンを同定した。ががるクローンの1つをpDsVE/v−sisと命名し
、以後の実施例で使用した。このクローンの構造を第7図に示す。
2(d) DSVE ev−sisの :成熟rPDf:F Bタンパク領域が
v−sis遺伝子によってコードされており翻訳開始シグナル及びrPDcF
Bのプレタンパクのアミノ末端領域がc−sis遺伝子によってコードされてい
る哺乳頂発現ベクターを構築するために以下の手順を使用し得る。
1μfノpDsVEをガ土■で直線化し、フェノール/クロロホルム抽出し、エ
タノール沈殿した。実施例1に記載の3μmのRF型分子の813e+p18/
v−sis(Kpn−Xba)サブクローンを達11及びシhllで制限した。
この結果、SSVの3833位(Devare等、賎、の番号系)のむ11部位
と813mp18のポリリンカーの鉢土■部位との間の領域にわたる991bp
のフラグメントが遊離しな、後者の部位は、v−sis遺伝子が挿入された独1
1部位から7b、を隔てる。0.5%低融点アガロースゲル電気泳動にかけて精
製し、以下の手順でフラグメントを結合した。
推定rPDGF Be−5isタンパク前駆体のアミノ末端領域に対応するDN
Aフラグメントを、公知の手Ji[(McBride and Caru−th
ers、Tetrahedron Lett、 24:245(1983))に
従って合成した。第8図に示す配列をもつこのフラグメントは、Josephs
等、5cience 225:636(1984)に記載のrPDcF Bタン
パクcDN^クローンのヌクレオチド111からヌク、レオチド203にわたる
領域に対応する。 pDsVEベクターに結合できるように上流末端に5a11
部位を付加した。 c−sis及びv−sisの双方において下流末端のSst
1部位がこの位置に自然発生した。
100nyのむ土I切断、DSVEと、2.6Bの合成Sal I /Sst
Ic−5isフラグメントと、25BのSst I /Sa上1 v−sisフ
ラグメントとを含む3方向結合反応で最終発現ベクターを結合した。 T4 D
N^リガーゼの存在下に14℃で1晩インキユベート後、反応産物で大腸菌に1
2株DHIを形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから重複レプリカフィル
ターを作成した。
フィルターの1つを前記のごとく放射性標11v−sisプローブにハイブリダ
イズさせた。別のフィルターを放射性標識した合成む土1 /Sst I c−
sisフラグメントにハイブリダイズさせた。双方のプローブにハイブリダイズ
したクローンを液体培養で増殖させ、該クローンを保有するプラスミドを標準法
で単離した。独工I;駐針■、旺11及びPstlによって制限地図を作成する
と、pDsVE/cv−sisと命名されたこの1ラスミドが第9図に示すごと
く配置されたエレメントを含むことが確認された。この遺伝子の初期翻訳産物と
推定されるタンパクのアミノ酸配列を第10図に示す。
え4九り
多 ローン
生物学的に活性のrPDGF Bを高レベル産生ずるために、実施例2に記載の
発現プラスミドを哺乳頚細胞系に導入した。使用した手順は実質的に、PCT特
許出NNo 、US84102021.5863に記載の手順である。該文献の
記載内容は本明細書に含まれるものとする。
Urlaub等、Proc、Natl、^ead、sci、 USA 77:4
461(1980)に記載のCFIODHFR−(Dux−811)細胞は、構
造遺伝子の突然変異によって酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)が欠失
しており、従ってその培養培地中にはグリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを
存在させる必要がある。プラスミドpDSVE/e−sis、 pDsVE/v
−sisまたはpDsVE/cv−sisをキャリヤーDNAと共に、60mm
培養プレートでヒポキサンチン、チミジン及びグリシンを含む培地で増殖するC
HODHFR−細胞にトランスフェクトした。プラスミド及びキャリヤーDNA
の混合物がCHODHFR−細胞にトランスフェクトした。
3日後、ヒポキサンチン及びチミジンの欠失した培地中で100mmの培養プレ
ートにtypsinizationによって細胞を分散させた。D肝R遺伝子、
従ってrPDにF B遺伝子によって確実に形質転換された細胞だけがこの培地
で生存する。
7〜21日後に生存細胞コロニーが明らかになった。これらの形質転換コロニー
はtypsinizationによる分散後、ヒポキサンチン及びチミジンの欠
失した培地中で混合集団として連続的に増殖し、新しい細胞株(例えばC0O−
pDSVE/v−sisまたはCl0−pDSVE/cv−sis)を形成する
。または、各コロニーをトリプシン処理(tripsinize) シ、マイク
ロタイタープレートのウェルに転移して、新しいクローン細胞系(例えばCl0
−pDsVE/c−sis)を形成させる。細胞系CtlO−pDSVE/v−
sis、 Cl0−pDSVE/cv−sis及びC11O−pDSVE/e−
sisは夫々、1987年3月13日に^meriean Type Cu1t
ure Co11ection、12301Parklawn Drive、R
ockville、 Maryland 20852に^TCCNo 。
CRL9359、CRL9360及びCRL9358で寄託された。
マイクロタイターウェルにおけるCl0−pDSVE/c−sisクローンの増
殖によって得られた前記細胞株から培養流体を採取し、実施例4に記載のごとき
バイオアッセイ及びラジオイムノアッセイ(R1^)でrPDGF Bの存在を
検定した。 Cll0−pDSVE/v−sis及びCRO−pDSVE/ev
−sisの代表的な5日間培養流体は、双方のアッセイで定量した結果、約10
0〜200ng/xj!のrPDCF Bを含有していた。 CHO−pDsV
E/c−sisクローンの1つから得られた培養流体は約20Or+9/z1の
rPDGF Bを含有していた。このクローンを以後の試験で使用した。 pD
sVEだけで形質転換された細胞の培養流体は検出可能量のrPDGFBを含有
していなかった。
前記細胞系で産生される組換えrPDGF Bの量は、遺伝子増幅によって増加
し、より大きい産生能をもつ新しい細胞系を形成する。 DBFR遺伝子によっ
てコードされる産物たる酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼは、薬剤メトトレキセー
ト(NTX)によって阻害され得る。より特定的には、ヒボキサンチン及びチミ
ジンの欠失した培地中で増殖する細胞は、MTXによって阻害または殺害される
。適当な条件(例えばMTX最小濃度)下にMTXに耐性でMTX中で増殖し得
る細胞が得られる。 DIIFR遺伝子の数が増幅することから、これらの細胞
は通常はMTX耐性でありその結果としてDHFR酵素の産生が促進されること
が知見されている0次に漸増濃度のMTXで生存細胞を処理すると、より多数の
DnFR3を分子を含む細胞株が得られる。 DIIFR遺伝子と共に発現ベク
ターに担持された「パラセンジャー遺伝子」(例えばrPDGF B)も遺伝子
コピー数の増加をしばしば示すことが知見された。
この増幅系の代表、細胞株Cl0−pDsVE/c−sis、 CHO−pDS
VE/v−sis及びCf1O−pDSVE/cv−sisを漸増濃度のMTX
(OnM、30nM及び100nN)で処理した。CHO−pDsVE/c−s
isの各増幅段階から代表的な5日間培養培地標本をR1^アッセイで検定し、
夫々0.2.2.0及びZ、Ou 5lN1のrPDGF Bが定量された。
CBO−pDSVE/v−sis及びCBO−pDSVE/cv−sisの各増
幅段階の代表的5日間培養培地標本は夫tz 、0.15.1.0及び1.0μ
g7mlのrPDGFBを含有していた。これらの手順ではlXl0’細胞を6
0−一培養皿の5z1培地にプレートした。24時間後に培地を除去し、5zf
の無血清培地(0,1mMの非必須アミノ酸と2mMのし一グルタミンとを添加
した高ブドウ糖DMEM)で交換した。 rPDcF Bを無血清培地中で5日
間蓄積させた。培地を収集してRI^アッセイで検定し、細胞をトリプシン化し
て計数した。 30nMのMTX中で増殖したCHO−pDsVE/c−sis
及びCHO−pDSVE/v−sis(またはCFlo−pDSVE/v−si
s)細胞のR1^平均値は夫々、2,0μfI1111及び1.0.g 27m
Mであり、実際の収量は10μg/プレート及び5μg/プレートであった。プ
レート当たりの細胞数は2.5×101であった。従ってこれらの培養条件下の
有効産生率は0.8及び0.4μ#/10’細胞724時間であった。
上記のCHO−pDSVE/v−sis及びCl0−pDSVE/cv−sis
培養物中の細胞は、遺伝的に不均一な気団であった。これらの細胞及びpDSV
E/v−sis細胞を標準スクリーニング手順で処理し、最大産生能をもつ遺伝
的に均一なりローンを単離した。
’Po1nts to Con5icler in the Characte
rization of Ce1lLinesυsea to Produce
Biologics」の5ectionl、Part2.1984.6.1.
0ffice of Biologies Re5earch Review、
Centerfor Drugs and Biologies U、S、Fo
od Drag and Administ−ration参照。
上記のrPDGF B産生Cl0細胞系の産生効率は適当な細胞培養技術によっ
て改良され得る。一般に培養哺乳類mmの増殖では、増殖培地中に血清を存在さ
せる必要がある。血清を含まない培地中でCBO細胞からrPDGF Bを産生
する方法が開発されれば、標準タンパク精製技術を使用して培地からrPDGF
Bを精製する処理が極めて容易になるであろうと予想される。後述の本発明の
方法によれば、十分に多い量の無血清培地中でrPDcF Bを経済的に産生ず
ることが可能である。
標準細胞培養条件で増殖したrPDGF B産生COO細胞を使用し、これを細
胞攪拌培養フラスコに接種する。m胞は、5%のウシ胎児血清と2aHのし一グ
ルタミンと0.05mMの非必須アミノ酸と適当濃度のメトトレキセートとを添
加した高ブドウ糖DMES及びHam F12(Gibco)の50−5O混合
物から成る培地中で細胞攪拌培養フラスコ内の浮遊細胞系として増殖する。浮遊
細胞培養物はrPDGF B産生CI+0III胞を容易に大容量まで膨張させ
る。
浮遊液中で増殖したCll0細胞を使用し、これを200i1の培地中で850
cm”の回転瓶当たり生存細患数1.5X 10’の初期接種密度で回転瓶に接
種する。3日間にわたり付着性単層の形態の気密的細胞単層が形成されるまで即
ちコンフルエンシイまで細胞を増殖させる。この増殖期に使用した培地は浮遊液
増殖に使用した培地と同じである。3日間の増殖期間の経過後、血清含有培地を
除去し、 100z1の無血清培地で交換する。この培地は、0.05mMの非
必須アミノ酸と21のし一グルタミンとを添加した高ブドウ糖D)IEM及びH
as+ F12の50−5O混合物である0回転瓶を回転瓶インキュベータに戻
して1〜3時間維持し、培地を再度除去して100zfの新しい無血清培地と交
換する。無血清培地を1〜3時間インキュベートすると、血清の夾雑タンパクの
濃度が減少する。
回転瓶をインキュベータに戻して7日間維持する。この期間にrPDにF Bが
無血清培地に蓄積される。7日間の産生期間の終了後、ならし培地を除去し、新
しい無血清培地で交換して第2の産生サイクルを開始する。この産生システムの
代表例では、R1^及び分裂誘発アッセイで定量すると、7日間血清培地標本が
1 、u 67mMのrPDGF Be−5isを含んでいた。
0.9〜1.8x 10’細胞/c−2の推定細胞密度に基づくと、850cm
”の回転瓶の各々が0.75〜1.5X10”細胞を含み、従って7日間培養物
100zfのrPDにF Be−5is産生効率は0.10〜0.19μy/1
0’細胞724時間であった。
アフィニティクロマトグラフィーのごとき好ましいrPDGF B精製方法(実
施例6及び10で記載)を使用すると、ならし培地中の低レベル血清の存在は精
製を難しくしないことが知見された。これらの低レベル血清は、Cl0−pDS
VE/c−sisまたはCHO−pDsVE/v−sis細胞によって培地中に
分泌されるrPDGF Be−5isのレベルを向上させる。従って、大規模組
織培養のために上記手順のいずれかを修正して使用し得る。
細胞を攪拌フラスコで増殖させ前記と全く同様に回転瓶に接種する。3日間でコ
ンフルエンシイまで増殖させ、培地を除去して1%の血清を含む100i1の同
じ培地で交換する。
瓶をインキュベータに戻し、7日後に培地を除去する。細胞に更に100i1を
添加し、培地中で更に7日間のrPDGF B蓄積サイクルを続行する。産生レ
ベルが有意に低下するまでこのサイクルを複数回反復してもよい0代表的な7日
間標本は3μyhlのrPDGF Be−5isを含有していた。
外来rPDll:F B遺伝・字を含むCIO細胞による活性rPDcF Bの
高レベル産生は予想外であった。この産生レベルは、rPDGFB遺伝子を予め
導入した別の種々の細胞型(Huang等、Ce1139ニア9(1984)、
Johnsson等、Proc、Natl、^ctd、sci、UsA 82:
1721 (1985)、Kelly等、 EMBOJ、 4:3399(19
85))、または内因性遺伝子を発現させる細胞(Nilsson等、Proc
、Natl、^cad。
Sci、USA 82:4418、Martinet等、Nature 319
:15B(1986)、Goustin等、Ce1l 41:301(1985
)、Rizzino等、Dev、Bio!。
110:15(1985)、Westermark等、Proe、Natl、^
cad、sci、υS^:83ニア197(1986)、Fox and Di
Corleto、Proc、Natl、^cad、Us^:眩:4774(19
86)、He1din等、Nature 319:511(1986))で報告
された産生レベルの20〜10倍であった。従来報告された結果と対照的に本発
明によって産生されるPDGFのレベルは実用化するに十分なレベルである。
Cll0及びその他のを椎動物細胞によって培養培地中に分泌される活性rPD
cF Bのレベルは、°成熟分泌形タンパクの「上流」即ちアミノ末端に存在す
る前駆体タンパクのアミノ酸配列を変性することによって増加する0例えば、第
2図のアミノ酸番号82の上流のrPDll:F Be−5isの領域をコード
するrPDGF B[遺伝子の部分を欠失させ、別のタンパクのアミノ末端領域
をコードするDNA配列で置換してもよい、このタンパクはCHOまたはその他
のを椎動物細胞によって多量に分泌されることが知られている。より特定的には
、上流DNA配列をエリトロポエチンタンパクのアミノ末端領域をコードするD
NA配列によって置換し得る。該タンパクはCHO細胞から多量に分泌され得る
。
えI1先
CI’lOびt し声 のRD[;F 連タンパクの4(a) オシ稗 の ・
アッセイ:rPDGF B標本の生物学的活性を分裂誘発アッセイで試験した
。24ウエルのプレート(面積的2cm’)にN1tl 3T3細胞をウェル当
たり3X10’細胞の密度でプレートし、ペニシリン(100単位/11)及び
ストレプトマイシン(100μtt#1’)を添加し、10%の熱不活性化子ウ
シ血清を含むダルベツコの最小必須培地(DMEM)から成る最小増殖培地で3
7℃でコンフルエンシイまで増殖させた。コンフルエンシイに達すると、培地を
5%のヒト血小板欠乏血漿(Rutherford and Ross、ム販旦
」b士!JLL 69:196(1976))を含み上記と同じ抗生物質を添加
したDMENに交換した。培地交換の48時間後、PDにFの標準及びアッセイ
標本をウェルに添加し、37℃で18時間インキュベートした。培地を除去し、
細胞を5%の熱不活性化子ウシ血清と2μCニアmlのMe−3H−チミジン(
New EnglandNuclear、20Ci/mモル)とを含み抗生物質
を添加した1mlの新しいDMEM中で37℃で正確に1時間標識した。1時間
後、細胞を冷却し、培地を除去し、細胞シートを冷たいリン酸バッファ生理食塩
水(PBS)及び5分間水中に維持した5%トリクロロ酢M (TC^)で順次
洗浄した。 TC^を除去し、細胞を新しい冷5%TC^で再度洗浄し、洗浄液
を吸引除去して細胞シートを乾燥した。各ウェルの内容物を1.Oil’の0.
25M水酸化ナトリウムに溶解し、1011の^quasol n (登録商標
)シンチレーションカクテル(New England Nuclear Bo
ston、M^)を入れたガラスバイアルに移し、Beckman液体シンチレ
ーションカウンタで計数した。2〜120n1F/i1の濃度範囲にわたるPD
にF標準曲線を作成し、標準曲線からアッセイ標本のPD(:F活性を計算した
。
rPDGF Bの検出及び定量を行なうために、ヒト血小板から精製したPDに
Fと該PDにFに対して誘発されたウサギポリクローナル抗体とを使用して特異
的ラジオイムノアッセイを行なった。 Franker and 5peck、
Bioehem、Bi幻7Co+mwiun、 80:489(19)8)の
手順を使用し、[lt%l]la及びlod。
−Cen(登録商標)(Pierce Chemical Co、、Rockf
ord、IIl、)を使用してヒト血小板PDにF(0,5μg)をヨード化し
た [12il]−PDCF(30、OOOepm)をある量の抗血清とインキ
ュベートした結果、R1^バ=t 7 y (10mHTris−BCl、pu
s、150mM NaC1,0,4%Non1det(登録商標)P−40(S
igma、 SL、Louis、 No)及び0.1%BS^)を含む60μ!
中で4℃で16時間反応後、標識PDGFの沈降最大値の半値が得られた。 ”
’I−PD(:を添加する前に、抗血清を種々の量の非標識ヒト血小板PDGF
と室温で1時間ブレインキュベートして標準曲線を作成した0反応期闇が終了す
ると、Sta且むユ幻四!す1−リエ犯+s(S、aureus)死菌の洗浄1
0%懸濁液50μlを添加し、混合物を室温で45分間インキュベートした。
Beekman Mierofugeで2分間遠心してS、aureusを結合
抗体及び抗体−抗原複合体と共にペレット化した。ペレットをRI^バッファで
3回洗浄し、沈降した放射能をガンマ放射線カウンタで定量した。血小板PDG
F競合物質の添加量に対する抗体の”’I−PDCF反応阻害の量をプロットし
た。未知の標本中のPDにF免疫反応物質の量を標準曲線に対する競合活性との
比較によって検定した。
4(c) f細 内 ゛PDGF関連タンパクのsisベクターを含むCHO細
胞中で合成され分泌されたrPDGF Bタンパクのサイズを決定するために、
細胞をまず5s5−システィンと共に20時間インキュベートしてシスティン含
有タンパクを標識した。タンパクに取り込まれたラベルは、この期間の定常状態
分布に近いと考えられる。標識PDGF関連タンパクをヒト血小板PDにFに対
する抗血清と共に免疫沈降させ特異的に検出し、5OS−PA(:E及びフルオ
ログラフィーによって分析した。Cl0−pDsVE/c−sis、Cl0−p
DSVE/v−sis、 Cl0−pDsVE/ay−sisまたはCl0−p
DsVE(対照)細胞を、10c−培養プレートで約80%コンフルエンシイま
で増殖させた。細胞をシスティン欠失培地で20洗浄した。 0.625mC1
の5s5−システィンを含有する4M1のシスティン欠失培地を各プレートに添
加した。37℃で20時間インキュベーション後、培地を収集し、プロテアーゼ
作用及び細菌増殖を阻害するために1mM PMSF及び0.025%ナトリウ
ムアジドとした。
1.4m1(1)破壊バッフ 7 (0,025M Tris−11CI!、p
ns、o、0.05MNaC1’、0.5%デオキシコリン酸ナトリウム、0.
5%Non1detP−40及びIJ PMSF)を添加して各プレートの細胞
を溶解した。Beckman Hieすfugeで1分間遠心して不溶物質を除
去した0等量のTC^不溶標識物質を含む培地または細胞抽出物のアリコートを
ウサギ非免疫血清と共にプレインキュベートした。 Protein^−5ep
barose(BioRad、 Richmond、 Ca1i−fornia
)を添加し、上記のごとく遠心し、非特異的に反応したタンパクを除去した。各
上清に抗PDにF血清を添加した。
4℃で16時間インキュベーション後、Protein^−5ephirose
を室温で1時間添加し上記のごとく遠心して特異的に反応したタンパクを除去し
た。 Protein^−5epharose(登録商標)/免疫複合体をR1
^バッファで6回洗浄した。結合した免疫複合体を破壊し、1%SOS中で5分
間沸騰させることによってProtein^−5epharoseから分離した
。各上清を等量の2つの部分に分け、遷元剤(3%の2−メルカプトエタノール
)を任意に添加したゲルローディングバッファ(1%SOS、20%グリセロー
ル、0.1%ブロモフェノールブルー)を各アリコートに添加した。標本を再度
沸騰させ、18%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをE
a’Hance(登録商標>(New England Nuclear、 B
oston、 M^)で処理し、乾燥し、χ!フィルムに2〜10日間露光した
。
sis含有ベクターによって形質転換された細胞中の細胞びフkdの3つの種に
変換された。
これらの細胞によって分泌された細胞外rPD(:F Bの主要種は不均一であ
った。オートラジオグラムに最も鮮明に現れる2つの種は2)、5kd及び25
kdに対応する移動度を有していた。 30.5kdの種は上記の2つの種より
やや不鮮明である。
更に不鮮明な第4の種は細胞内主要安定種と同様のサイズ即ち23kdであった
。細胞外rPDGF Bの還元種も不均一であった。最も鮮明なバンドは13.
5kdに対応する移動度を有していた。 17kd、16kd及び12kdにも
やや不鮮明なバンドが存在する。細胞内rPDGF B還元種のレーンで観察さ
れたバンドと同様のサイズの8.5kd、7.5kd及び7kdに更に不鮮明な
バンドが存在する。注目すべきは、これらのオートラジオグラムのバンドの鮮明
度が、異なる分子種間の実際の質量(mass)分布を必ずしも反映せず、各々
の種のシスティン含量に左右されることである。
上記のどの種も、対照Cl0−pVsDE細胞抽出物または培地中では観察され
ない、また、対照非免疫血清との反応後にも観察されなかった。sisベクター
によって形質転換されたCHO細胞の細胞産物から免疫沈降後に観察されたrP
DGF Bタンパクのサイズ及び不均一性は、ヒト血小板がち精製されたPDf
:Fに関する従来の観察結果とほぼ一致する。
え11Σ
二ワト1 ホルモンPDGFムタンパクに る rPDcF Bの分析及び精製
を容易にするようにrPDGF Bと反応する抗血清の大量供給源を得るために
、大腸菌に導入される発現プラスミドを構築した。プラスミドは、ニワトリ成長
ホルモン(C(H)のアミノ末端の120個のアミノ酸(Souza等、J、E
x、Zoolo 232:465(1984))とv−sis遺伝子によってコ
ードされタンパクのカルボキシ末端の136個のアミノ酸とから成る融合タンパ
クをコードするように設計された。
得られたタンパクをCにPiと命名しその完全配列を第11図に示す。
2μ2のM13mp18/v−sis(Kpn−Xba) RF DNAをむ土
■及びBawl■で制限した。 ssvの4061位(Devare等、麟、の
番号系)の1■部位とM13g+p18のポリリンカー領域のBamH1部位と
の間の領域にわたる760塩基対のフラグメントを低融点アガロースゲルで精製
した。 75r+gのフラグメントを、CGII遺伝子のアミノ酸120の後方
を切断するBimHIで制限した9゜ayのl)CにBTI/CFM414 D
NA(Souza等、肢)に結合した。結合DNAで大腸菌に12株JM103
を形質転換した。
v−sisを含有するアンピシリン耐性コロニーをv−sisプローブとのハイ
ブリダイゼーションによって同定した。複数の該コロニーからプラスミドDNA
を単離し、Xba I 、hmHI及びEcoRlで制限地図を作成することに
よって分析した。
pcGPlと推移される1つのクローンにおいては発現に適した正確な配向でv
−sisDN^が挿入されていた。このクローンを以後の使用のために選択した
。
5(b) CにPi ムアンパ の :大腸菌に12株の形質転換に用いること
によってpC(:Pi DNAを発現させた。 pcGPlで形質転換された大
腸菌に12株八へ7の細胞は、1987年3月13日に^−erican Ty
pe Cu1ture Co11ec−tion、12301 Parklaw
n Drive、Rockville、Maryland 20852に受託番
号67352で寄託された。 20xlの培養物をLuriaブイヨン中で28
℃で1晩増殖させた。111のこの培養物を11のLuriaブイヨンに接種し
、この11培養物を回転プラットフォームで28℃でインキュベートした。培養
物の吸光度をモ二りし、Boonsの吸光度が0.5になると培養物を37℃に
シフトして13.5時間維持し、融合タンパクの発現を誘発した。細胞を遠心に
よってペレット化し、1211の10aN Tris−HCl(pH7,5)及
び1mM EDTA中に再度浮遊させた。i!II胞をFrench圧力室で破
壊し不溶物質を低速遠心によってペレット化した。
5O5−PAGEによって分析すると、ペレット化分画から約28kdのタンパ
クが検出された。このタンパクは非誘発細胞またはベクター単独によって形質転
換された。細胞中には存在しなかった。この段階のタンパクは純度的60%であ
った。
この不溶ペレットを2011の20+eM Tris−HCl(pH7,5)、
5tMEDT^及び0.2zg7mlのリゾチームに懸濁させ、室温で30分間
インキュベートした。 Non1det(登録商標)P−40を濃度0.5%ま
で添加し、インキュベーションを更に30分間続行した。
不溶物質を遠心(5公開、10.OOOxg)によってペレット化し、ペレット
を1011の水で洗浄した。遠心後、ペレットを4mlの50mM Tris−
HCf(pl’18.5)、5%エタノ−1し及び1%のラウリン酸ナトリウム
と共に室温で30分間攪拌した。上記の遠心後、ラウリン酸ナトリウムによる洗
浄を反復した。最終ペレットを4wlの1%SDS及び50mM Tris−H
Cl(pH7,4)中で室温で1晩攪拌することによって溶解した。 5DS−
PAGE分析によればこの調製物は純度的80%であった。
以下の日程でウサギにCGPIを注射し採血した。プレ免疫種を選び、08目に
、PBS中にDIFCOlDetroit、 Miehigan製の50%乳化
BACTO−フロイント完全アジュバントH37Ra(DIFCO3113−6
0)を含む混合物1.Oxl中のCGPIを各ウサギの背中の複数部位に合計2
50μg皮内注射した。2週間後に50%フロインド不完全アジュバント(DI
FCO1BAC700639−60−6)と前記のごとく混合した250μ2の
CにPiをウサギに皮肉注射した。
30日目に第2注射と同じブースターを与え、42日目にウサギから試験採血し
た。得られた血清の抗CGPI抗体の産生を試験した。
次に、CGPI抗体陽性のウサギに対し、50%フロインド不完全アジュバント
中の250A1.のCにPiタンパクを30日毎に注射した。投与量の172を
皮肉注射し1/2を腹腔的注射した。
注射f&14日目及び21日目にウサギから採血した。得られた血清の抗CGP
I活性をELIS^−プレート結合アッセイで試験した。炭酸−炭酸水素バッフ
−r (0,015M Na、CO3及び0.035MNaJC03、pH9,
5)中に5μg/mlのCGPIタンパクを含む混合物各50μlと共に室温で
16時間インキュベートすることによって、96ウエルのImmulonl[(
登録商標)(Dynatech Laborato−ries、 Inc、)ウ
ェルをCにPl@合タンパクで被覆した。混合物を除去し、ウェルを200μl
のPBS中の5%子ウシ血清アルブミン(BS^)で室温で1時間ブロックした
。プレ免疫ウサギ血清及び免疫ウサギ血清をPBS及び1%BS^中で種々の希
釈度に希釈し各ウェルに50μlずつ使用した。
室温で3時間インキュベーション後、溶液を除去しPBSで3回洗浄した。各ウ
ェルをlx 10’ep−の”’I−Protein^(NewEngland
Nuelear、カタログNo、NEX 146L)を含む50μmのPBS
70.1%BS^と共に1時間インキュベートすることによって結合ウサギ抗体
を検出した。放射性溶液を除去し、各ウェルをPBSで5回洗浄した0個々のウ
ェルを分離し、Beekman5000ガンマカウンタで計数した。
結合”’I−Protein−^の毎分カウント数に対するウサギ血清希釈倍数
(10−1〜10ツ)をプロットすることによって活性曲線を作成した。各血清
の力価は、最大カウント数の50%が結合した希釈倍数の逆数で示される。3つ
のウサギのうちの2つがCにPiタンパク(1304及び11305)に強陽性
で、5.6X10コ及び1.5X10’の初期値から2.6X 10’及び4X
103までの範囲の力価を生じた。
え克匠L
CGP1ア ロースアフィニーイ −ムの び′ら tlozlのウサギ血清#
304(抗CGPI力価> 10’)を40,0OOXyで20分間遠心した。
透明上清を、0.02Mリン酸ナトリウム(pH7,4)、0.14M塩化ナト
リウム及び0.02%ナトリウムアジド(PBS)で予め平衡させたProte
in^−アガロースの1.5X6cs+カラムの上部に入れた。血清をカラムに
流し、280n−の溶出液のU、V、吸光度が0.02単位未満になるまでカラ
ムをPBSで洗浄した。
カラムに吸収された免疫グロブリンを0.15Mの塩化ナトリウム中の0.58
%の酢酸で溶出し、得られた分画の所在をU、V、吸光度によって検出した。免
疫グロブリンを含む分画を1.ONのTrisバッフy (pH8,0)で中和
した。4℃で41の0.1M炭酸水素ナトリウム及び0.5M塩化ナトリウム(
pH8,5)を3回交換して透析し、消衰係数1.46を使用し280nNのU
、V、吸光度によって免疫グロブリン濃度を測定した。ウサギ免疫グロブリンの
収量は42.9mgであった。
3gのシアノゲンプロミド活性化5epharose(登録商標>4B(Pba
rmacia Fine Cbes+1eals、 υppsala、Swed
en)をO,OOIMHCf中で膨潤させ、ガラス漏斗を用い600xNの同じ
溶液で洗浄した。湿潤ゲルを5011の遠心管に移し、20m1の結合バッファ
(0,IN炭酸水素ナトリウム及び0.5Mの塩化ナトリウム、pH8,5)で
洗浄した。600Xyで4分間遠心後、上清流体を除去し、9.7mlの結合バ
ッファ中の42.9tyのウサギ免疫グロブリンを5epharose(登録商
標)4Bに添加した。混合物を4℃で1晩十分にひっくり返して撹拌し、上記の
ごとく遠心し上滑の残留免疫グロブリンの存在を試験した。上清中の残存量は出
発免疫グロブリンの0.3%未満であった。従って、結合効率は99.7%を上
回った。
免疫グロブリン結合5epbarose(登録商標)4Bに対し、0.1Hの酢
酸ナトリウム(pH4,0)、0.5M塩化ナトリウム及び結合バッファを順次
用いた洗浄サイクルを4回繰り返した。ゲルを1.5X10e−のガラスカラム
番二注いだバッファE(0,0026MKCt、 0.1369M NaCf
O,0014M KBaPO<及び0.008M NaJPO4)で平衡させ、
4℃の100i+ZのバッファEで洗浄した。
6(b)ti”−れt−rPDGF Bの フィニーイCl0−pDsVE/c
−sis、Cl0−pDSVE/v−sisまたはCl0−pDSVE/ev−
sisの回転瓶培養物から4〜7日後に収集した培養流体を10.0OOXyで
20分間遠心し、上清流体を0.45μフイルターに通した。100〜400x
lのヂ過培地を流速30〜40m17時で4℃の10zi’の抗CGPI−Se
pharoseアフィニティ力ラムに吸着させた。カラムを、カラムの200倍
容バッファF(0,58NaCf、0.025M Tris−BCl、pH7,
5及び0.1%Non1det(登録商標)P−40)、及び、カラムの5倍容
以上のバッフyG(0,15N NaC4,0,01%Non1det P−4
0)で順次洗浄した。結合rPDGF Bを流速30m1/時のバッファ H(
0,2M酢酸、0.15N NaCl及び0.01%NP40)で溶出した。1
11の分画を収集し、50μlのアリコートをBio−Radタンパクアッセイ
(Bio−Rad、 Richmond、 C^)で試験し、前記のごときウサ
ギ抗CGPI抗血清を使用するドツト結合イムノアッセイで免疫学的アッセイを
行なうことによってrPDcF B含有分画の所在を検出した。タンパク含有分
画をプールし、4℃の0.1M酢酸及び0.01%Non1det P−40に
透析し、凍結乾燥した。
6(c) ウ ロブ1ンアフイニーイカームにのrPDGF Bのドツトトムイ
ムノアッセイによる。
1凡L:
抗C(1;PIアガロースアフィニティ力ラムから回収した分画のrPDGF
Bを、(Towbind等、J、Tmmunol、Metbods 72:31
3(1984))に記載の手順のドツト結合イムノアッセイによって検定した。
96ウエルのマニホルド装置(SRC−96,5chlei−eher and
5chuell)で25〜100μZの試験分画をニトロセルロース紙(0,
2μ、#B^−83,5ehleicher and 5chuell、Kee
ne、N、H,)に吸着させた。別に、1(1−400nyのrPDcF Bv
−sisを含む種々の量のCll0−pDSVE/シーsisを吸着させて標準
を作成した。 PSB(pH7,4)(0,158NaC1,10mM N12
11PO4(p)17.4))中の10%の乾燥脱脂粉乳(Carnation
、Los Angeles、 C^)溶液中で震盪させることによってニトロセ
ルロース紙を「ブロック」し、PBS−1%乾燥粉乳中の1:50希釈のウサギ
抗CにPi血清と共にインキュベートし、0.025%Tween(登録商標)
20含有のPBSで3回洗浄した。VeetaStiin(登録商標>(Vec
tor Labo−ratories、 Burlingame、C^)を使用
説明書道りに使用して、結合抗体の検出を行なった。カラム分画中のrPDcF
Bの濃度の概数を、カラム分画の「ドツト」の色の鮮明度を標準「ドツト」と
比較することによって推定した。
6(d) 5DS−PAにE クーマシーブルー 染 びイムノブロッーイング
によるウ ギ グロブリンアフイニーイ −ムに のrPDcF Bの、゛:ウ
サギ免疫グロブリンアフィニティカラムから得られた凍結乾燥rPDCF B分
画を10M1の酢酸中で液体に戻した。アリコート(0,2〜2μI?)を、(
任意に5%の2−メルカプトエタノールで還元し)、1.5nm厚さの15%ま
たは18%のポリアクリルアミドゲルのウェルに充填した。0.1%のSDSを
含むTris−グリシンバッファ (0,0258Tris、0.192Mグリ
シン)申で80〜90Vで10〜12時間の電気泳動を行なった3ク一マシーブ
ルー染色または銀染色(RAPID−^y−STAIN、 rcs Radio
−ehemieals、Irvine C^)で発色させてタンパクバンドを可
視化するか、または、分解された(resolved)バンドをゲルから紙の表
面に駆動する電流を使用する電気泳動トランスファー技術(BioRad Tr
ans−Blot Ce1l、カタログNo、170〜3910)によって現像
ゲルからニトロセルロース紙にタンパクを転移させた。転移は、0.15Mグリ
シン、0.02M Tris塩基及び20%メタノール(容積/容積%)を含む
バッファ中で室温で60Vで6時間行なった。クーマシーブルー及び銀染色ゲル
は、非還元標本では25,400+*wのマーカーの領域に生じる2つの主要タ
ンパクバンドを示し、還元標本では14,400−のマーカーの近傍の2つのバ
ンドを示した。銀染色ゲルからrPDGF Bが95%以上の純度をもつことが
推定された。
ニトロセルロースプロットをPBS中の10%ヤギ血清及び2%BS^で1時間
ブロックし、−次抗体と共に2〜3時間インキュベートし、KP(Kirkeg
aard and Pery、 Gaithersburg%Mary−1an
d)洗浄溶液で洗浄し、PBS中の二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ血清と共に1.
5時間インキュベートし、VectaStain(登録商標)キットで上記(実
施例6(c))のごとく抗体検出を行なった。イムノプロットに使用した一次抗
体は1:50に希釈したウサギ抗CにPl (1305)血清であった。
非還元rPDGF Bv−sisからのプロットでは、同じゲルに流しニトロセ
ルロースに移した予染色分子量マーカーに基づいて約26,000mm及び30
.OOOm−に2つの主要バンドが観察された。やや高い分子量に上記バンドは
ど鮮明でないrPDGFB特異的バンドが観察された。還元ゲルからのプロット
では、主要な2つのrPDGF B特異的バンドが14,400m−マーカーと
18,300m−マーカーとの間に検出された。更に、14,400をやや下回
る分子量及び約ts、oooにさらに不鮮明なバンドが観察された。
叉1」1L
rPDGF Bv−sisに・ るボ1クローナル びモノ ロー実施例5(c
)に記載のCGPIタンパク融合とほぼ同じ手順で、(実施例6に記載のごとく
精製した)rPDGF Bv−sisでウサギを免疫した。マイクロタイタープ
レートウェルに結合したrPDGF Bv−sisを使用し、実施例5(C)に
記載の手順で血清の力価を測定した。一般に力価は)1xlO’であった。
これらの抗血清は、(実施例6(C)に記載のごとき)ドツト結合イムノアッセ
イで、1:100の希釈度のヒト血小板から精製したrPDにF BまたはPD
にFを夫々1ng及びSngという少量でも特異的に検出することが可能であっ
た。抗血清は更に、実施例4(b)に記載のごとく行なったラジオイムノアッセ
イにおいて、実施例4(b)に記載のごとく放射性ヨウ素標識したヒト血小板P
DGF、またはBolton−11unter技術(Bolton等、Bioc
bem、J、 133:529(1973)によって放射性ヨウ素標識したrP
DGF Bと特異的に反応した。
フ(b) モノクローナル の マウスの び血潰!口:ム曳A−:
超f 波処理ニJ、 ッテ乳濁すせりo、15xlf)PBS[0,15HNa
C1及び0.0INのNaJP04(p117.4)]と0.15z/の70イ
ンド不完全アジユバント(Calbiochem−Behring modif
ication、 Ca1bi。
chew−Behring Corporation、La Jolla、Ca
1ifornia)とから成る約0.3xlの溶液中の実施例6に記載のごとく
精製した10HgのrPDGF Bv−sisを、5匹のBa1b/c株の雌マ
ウス(Jackson Laboratories、^nn Arbor+Ma
ine)に夫々注射した。マウスの背中の複数箇所に皮下注射した。10日後、
MPL/TDM特殊エマルジョンR−700(RIBI Immunoehem
iealResearch、 Inc、、Hamilton、 Montana
)中に乳濁させた0、3zlPBs中の10μyのrPDGF Bv−sisが
ら成るブースター免疫を各マウスの腹腔内に注射した。前記と同様にマウスの背
中の複数部位に0.15zj!を注射し腹腔内に0.15z1を注射した。
20日後、マウスから採血し、血清中の抗rPD(:F Bv−sis抗体を検
定した。
プレート結合イムノアッセイを使用してマウス血清を試験した。50μlの抗原
溶液を室温で1晩インキユベートするコトニヨッテ、0.035N NaHCO
sト0.015N Na2CO1中)rPDGFBy−sis(700μg/z
l)を、血清学的96ウエルプレートのウェルに結合させた。非結合抗原を除去
し、5%子ウシ血清アルブミンを含むウェル当たり250μlのPBSで非結合
部位を室温で1時間ブロックした。
希釈度10−I〜10−5でPBSに希釈した50μlのマウス血清を、ブロッ
クした抗原含有ウェルに添加し、室温で3時間インキュベートして除去した0次
にウェルをKP洗浄液で3回洗浄した。 IX 10’ep論の+ 25■−ウ
サギ抗マウス免疫グロブリンC(IgC)(NEχ1610、New Engl
and Nuclear)を0.1%の子ウシ血清アルブミンと共に含む50μ
lのPBSを各ウェルに添加した。ウェルを90分間インキュベートし、KP洗
浄溶液で5回洗浄し、Beckman5500ガンマカウンタで計数した。3匹
のマウスは抗体価103以上の抗rPDGF Bv−sis抗体を産生じた。
これらの3匹のマウスに対し、第一ブースターと同様のブースター免疫を採血の
1週後及び採血の10日後に各1回ずつ注射した。
7(c) モノクローナル 体の産生:ハイブリドーマの産びスクリーニング:
rPDll:F Bによる最終ブースター免疫の3日後に頴管脱臼によって3匹
のマウスを殺し、70%エタノールで洗浄した。
膵臓を無菌的に摘出し、200単位7mlのペニシリンGと200μ27xiの
ストレプトマイシンとを添加したダルベツコ改質イーグル培地(tl:1beo
)を入れた(氷上の)へトリ皿に入れた。
IX臓から脂肪及び結合組織を除去し、新しい(前記の)培地で2回洗い、10
M1の同じ培地と共に無菌sto■acherバッグに入れた。stomaeh
er装置(Stmatcher Lab−Blender 80、Seward
Laboratories、London、 England)でIIl!!m
を90秒間粉砕し、4層滅菌ガーゼで沢過し、得られた膵臓細胞をlEC−11
N−SII遠心機で1000rp−で10分間遠心してペレット化した。ペニシ
リン−ストレプトマイシンを含む(前記の)培地で細胞ベレットを2回洗浄し、
抗生物質を含まない培地で1回洗浄した。細胞ベレットを新しい培地に再度浮遊
させ、0.2%トリバンプルーの存在下に血球計数器で計数して細胞濃度を測定
した。
Balbh株に由来のマウス骨髄腫細胞5P210を、1%の熱不活性化ウシ胎
児血清(FBS)を含むHBIOI培地(NC−200、NewEngland
Nuclear Re5earch Products)中で増殖させた。I
ff!臓細胞と同様に、11000rpで10分間遠心して細胞をペレット化し
、抗生物質を含まないダルベツコ改質イーグル培地(DMEM)で洗浄した。同
じ培地に再度浮遊させた後に、0.2%トリバンブルーを含む血球計数器で計数
して細胞濃度を測定した。
膵臓細胞と5P210細胞とを3:1の比で混合し、1000rp−で10分間
前記のごとく遠心した。上清流体を吸引除去し、分子量500〜600のポリエ
チレングリコール(PEG)1500を使用して37℃で細胞融合を生起した。
この処理中に穏やがな撹拌を不断に維持しつつ、以下の物質を以下に指定した時
間で添加した。 DMEM中の1.owlの50%PEGを1分間にわたって添
加し1分間攪拌、10%のウシ胎児血清(FBS)を含む1.0z1のDMEM
を1分間にわたって添加、10%のFBSを含む1.0xlのDMEMを1分間
にわたって添加、10%のFBSを含む811のFBSを1分間にわたって添加
。
得られた融合細胞を前記のごと(11000rpで10分間遠心し、10%)F
BSト100単位hlノ’< ニジ’) :/ G及ヒ100μg/x1のスト
レプトマイシンとを含む約4511のDMEMに再度浮遊させた。細胞を9%の
CO□で、予め平衡させた96ウエルプレートに0.1wl/ウェルの割合で接
種し、プレートを9%のCO2中で37℃でインキュベートした。
2日目に10%のFBSを含むDMEM中のO,b+lのHAT培地(13,6
μg/xiのヒボキサンチン、0.176μm7xlのアミノプテリン及び3.
88μg7mlのチミジン)を各ウェルに添加した。この培地は膵臓細胞−5P
210ハイブリッドを選択的に生存させ、非融合SP210m 胞まli別ノ5
P21011 m ニ敵合した5P210細胞をスクリーニングによって除去す
る。成熟マウスに由来の非融合−次牌臓細胞は培養中に数日以上は生存しない。
3.4.6.9及び12日目に各ウェルから0.1zlの培地を除去し、10%
EBSを含tr DMEM中の新しイHA70.1mlを補充した。15.1
9.23及び27日目に各ウェルがら0.1zlの培地を除去し、10%のFB
Sと上記と同じ濃度のしホキサンチンとチミジンとだけを含む0.1zlのDM
ENを補充した。18日目に、rPDGF B特異的抗体を検出するELIS^
アッセイを行なって、全部のウェルの培養上清をスクリーニングした。
酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELTS^)を使用して抗rPDにF B
v−sis抗体を産生ずるハイブリドーマを検出した。
96ウエルプレートのウェルを、実施例5(c)のごと(,0,7tt y/x
iのrPDGF Bv−sisを含む50μlの炭酸−炭酸水素溶液で室温で1
晩被覆した。抗原を除去しFBS中の5%B5A200μlでウェルを室温で1
時間ブロックした。各ハイブリドーマウェルから得られた50μlの培養流体の
アリコートを、rPDGFBv−sis被覆ウェル中で室温で3時間インキュベ
ートして取り出し、0.025%のTween (登録商標)20を含むPBS
(洗浄液)で1回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIg
ll:(Boehringer−Minnbeim Bioehmicils、
Indiana−polis、Indiana)をPBSで1:300に希釈
し、各ウェルで50ALNを室温で2時間インキュベートした。ウェルを洗浄溶
液で5回洗浄し、脱水乾燥し、100μlのへBTS呈色試薬(Kirkega
irdand Perry Laboratories%Gaithersbu
rg+Maryland)で呈色反応を行なわせた。 Titertek Nu
ltiscan(Flow Labora−tories Springfie
ld、 Virginia)を使用し、414n−でウェルを走査した。
スクリーニングされた432個のマスタープレートウェル中の173個のウェル
が、rPDtl;F Bv−sis反応で有意な陽性を示した。陽性ウェルから
22個のウェルの細胞を選択し、更に増殖させクローニングした8選択された各
ウェルに由来の細胞を夫々、3X96ウエルに希釈し、ウェル当たり1種のクロ
ーンまたはいくつかの場合にはウェル当たり少数種のクローンを産生させた。1
0%のFBSを含むDMEM培地中で更に17日間培養後、1つ以上の細胞クロ
ーンを含む全部のウェルから得られた培養流体を前記のごときELISAアッセ
イで試験した。22個の出発マスタープレートウェルのうちの15個のウェルに
相当するプレートウェルにおいて抗rPDGFBv−sis抗体が検出され、対
応する細胞を更にクローニングした。これらの15個のウェルのうちで最大力価
をもつウェルに対応する細胞を選択し、単個細胞クローンを得るために再クロー
ニングした。
単個細胞クローンを更にELISAアッセイで試験し、出発マスタープレートの
異なる12個のウェルに対応する培養物を最大力価をもつ産生培養物として選択
した0選択された水中で産生させた。
7(d) モノ ローナル の産生 び :選択された陽性単個細胞ハイブリド
ーマクローンを培養で増殖させ、細胞を回収し、lEC−1!N5II遠心機で
700rp鵬で5分間遠心し、DMEM(無血清)で1回洗浄し、PBSで1回
洗浄した。洗浄したハイブリドーマ細胞を、2x 10’lB胞/wlの割合で
PBSに浮遊させ、5X10@細胞を6〜8週齢の雌Ba1b/eマウス(Ja
ckson Laboratories、 Bar Harbor%Maine
)または同じ種の雌CDFIハイブリッドマウスに腹腔的注射した。
注射マウスの腹水を8〜14日増殖させた。腹水を採取し、2000rpm(I
EC−UN−Sll)で10分間遠心し、透明上清流体をモノクローナル抗体の
ソースとして利用した。
実質的に実施例5(c)の記載と同様のプレート結合アッセイによって腹水中の
抗rPDGF Bv−sisモノクローナル抗体の反応性及び力価を検定した。
このアッセイでは0.7μgoalのrPD(:F Bv−sisでプレートを
被覆し、1%BS^を含むPBSで腹水を10倍系列希釈した。この場合、l2
sIウサギ抗マウスIgC抗体(NEX 161、New England N
uelear、 Boston、 N^)を用いてウェル当たり約10’cpm
(Beckman5500ガンマカウンタ)のマウスモノクローナル抗体を検出
した0個々の腹水の力価を、最大結合の50%が生じた希釈倍数の逆数で示す、
異なる12のモノクローナル抗体産生クローンに由来の腹水の力価は1.5x
10’〜7.5X 10’の範囲であった。結果を表■に示す。
ハイブリドーマ腹水から得られた免疫グロブリンを2段階精製手順で精製した。
即ち、まず透明腹水を、主としてアルブミン及びプロテアーゼと結合するが免疫
グロブリンを通過させるCm−^ff1−Gel Blueカラム(Bio−R
ad)に通す。
この段階ではPBSを洗浄バッファとして使用した。実施例フ(b)に記載のご
とく、非吸着物質を等容の結合バッファ(M^PSI[、Bio−Rad)で希
釈し、1.5X6emの^ff1−(:el Protein^カラム(M^P
SII 、Bio−Rid)に吸着させた。得られた精製免疫グロブリン分画を
PBSに透析し、消衰係数1.46を用いて280n−の吸光度から免疫グロブ
リン濃度を計算した。
7(e) rPDGF Bv−sisモノクローナル の、性ゝヒト ハ 由
PDII:Fとの 応:(実施例6(c)に記載のごとき)ドツト結合イムノア
ッセイの修正方法を使用し、個々のモノクローナル抗体の天然ヒト血小板PDG
F認識能を検定した。矩形ニトロセルロース紙片(2,5am”)を5つの区分
に分割した。各区分に以下の物質1種類を含む1μlのPBS溶液を所定のパタ
ーンでドツトした。
10ngのrPDGF By−sis、50nl?のrPDcF Bv−sis
、10ngの血小板PDGF、50ngの血小板PD(:Fまたは50nyの非
関連成長因子(E[;F)。
PBS中の10%のウマ血清、2%のBS八と共に1時間震盪してニトロセルロ
ースプロットをブロックした。ブロック溶液を除去し、プロットを9個の一次抗
体(8個のrPDcF Bモノクローナル抗体及び1つのウサギ抗血小板P[l
CF血清)の1つと共に3時間反応させ、KP洗浄液で洗浄した。結合した一次
抗体を二次ビオチン化つマ抗マウスIgC抗体、アビジン−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体、及び、4−クロロ−1−ナフトールを含む基質呈色試薬HRP
(BioRad 1.7O−6534)と反応させた。最後の試薬は、60腫y
を20zlのエタノールに溶解し、60μmの30%過酸化水素を含む100i
fのTBS<0.2M NaCf、0.05M Tris、pH7,4)に希釈
して用いた。
試験した8つのモノクローナル抗体全部が10及び50ngのrPD(:F B
v−sisの双方と顕著に反応した。8つの内の6つのモノクローナル抗体(1
62,30,20,219,191及び52)が50nyの血小板PDCFと反
応し、これらの6つの内の1つのモノクローナル抗体が10ngの血小板PDG
Fと反応した。ウサギ抗血小板PDGF血清は10nyの血小板由来物質を容易
に検出した。抗体と非関連タンパク成長因子との間の反応は検出されなかった。
また、還元及び非還元rPDGF Bv−sisの双方を試験した実施例6(c
)に記載のごときウェスターンイムノプロットフォーマットでモノクローナル抗
体の反応性及び特異性を検定した。12のモノクローナル抗体の全部が、15%
の非還元ポリアクリルアミドゲル中で25,000及び2フ、500m−のタン
パクとして泳動する非還元rPDcF Bv−sisの主要な2つのバンドを容
易に検出したが、同じゲルを用い同じ条件下にニトロセルロースに移した還元r
PDcF Bとの反応は観察されなかった。
7(f) rPDにF By−sisモノ ローナル の、 S 、iプLIL
ス」IL:
マウス免疫グロブリンサブタイプ同定キット(カタログno、100036、B
oehringer−Minnheim、Indianapolis、IN)を
使用し、選択された12のモノクローナル抗体クローンを免疫グロブリンサブタ
イプに基づいてスクリーニングした。
被検抗体の各々毎に、96ウエルトレーの9個のウェルを(実施例5に記載のご
とく)炭酸−炭酸水素バッファ中0.7μg/lpのrPDGF Bシーsis
を含む溶液50μlで1晩被覆した。ウェル当たり200μlのPBS中の2%
BSAと共に室温で2時間インキュベートし、残存するタンパク結合部位をブロ
ックした。各ウェルに、50μlのモノクローナル抗体1種(約0.5μgの免
疫グロブリン)を添加し、室温でインキュベーションを3時間続行した。200
μmの洗浄バッファ (10mHのTris−11C1、pH7,0,0,05
%のTween 20.0.01%のチメリゾル(thimerisol))で
ウェルを4回洗浄した。使用説明書道りに液体に戻した50μpのウサギ抗マウ
スサブクラス特異的免疫グロブリンの各々を、モノクローナル抗体当たり各8個
のウェルに夫々添加した。9番目のウェルには対照として正常ウサギ血清を添加
した。室温で2時間インキュベート後、前記と同様にして4回洗浄した。50μ
pのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgGを各ウェルに添加し、室温で1時
間インキュベートした。更に4回洗浄し、100μlの新しく調製した八BTS
−u20.(0,03%のH2O2中に1mMの八BTS)を各ウェルに添加し
て発色反応を行なわせた。20〜30分間インキュベーション後、(2,5%の
SDSで)発色反応を停止させ、この色に基づいてTitertek Mult
isean中のプレートを414nmで読み取って定量した。その結果を表Iに
示す、6つのハイブリドーマがIgG1サブタイプの抗体を産生じたが、3つは
Igll:2aと分類され2つは1gC2bと分類された0表1における抗体価
は、最大epH結合の50%が得られた希釈倍数の逆数で示す。
7(g) rPDGF Bv−sis −’ の アッセイよ(実施例4に記載
のごとき)マウスN1tl細胞の3トチミジン取り込みに基づく分裂誘発アッセ
イを用い、rPDCF Bv−sisで感作したモノクローナル抗体がrPDl
;F Bv−sisの生物学的活性を中和する能力を試験した。プロティン^−
アガロースゲルカラムクロマトグラフィーを用い、異なる6つのバイプリドーマ
から得られた6つの腹水の各々から免疫グロブリン分画を単離した。使用した特
殊技術は、Bio−Radの^ff1−Gel Protein A M^PS
l[モノクローナル抗体精製システムである。結合バッファで1=1に希釈した
2〜5x1の清澄化した腹水を、交差結合アガロースピーズに結合し、同じ会社
の結合バッファで予め平衡させた精製プロティン^の5mlのカラムに吸着させ
た。約10倍容の結合バッファで非結合タンパクをカラムから洗い落とし、結合
した免疫グロブリンをpH3で溶出し、280naの吸光度を読み取ることによ
って免疫グロブリン分画の所在を検出した。プールした分画を3、ONのTri
sバッフy (pH9,5)で中和し、PBSに透析した。免疫グロブリン濃度
を測定した。
精製したモノクローナル免疫グロブリンの系列希釈液を8日gのrPDGF B
v−sisと共に4℃で12時間インキュベートし、各混合物を実施例4に記載
のごとき標準分裂誘発アッセイのバイオアッセイウェルの各々で使用した。クロ
ーン#162に由来の抗体は3日−チミジン取り込みに対するrPDGF Bの
作用を最も有効に中和し、100ny未満で活性を示した。クローン155.1
33.52及び30に由来の抗体は中程度の活性を示1 したが中和効果は維持
していた。クローン232は活性を全く示さなかった。
7(h) モノ ローナル の5DS−PAGE :モノクローナル抗体腹水の
免疫グロブリン分画を12.5%ゲルの5OS−PAGEで分析した。約2μg
の各免疫グロブリンを非分別腹水に由来の同量の免疫グロブリンと比較した。ゲ
ルで使用する前に、5%の2−メルカプトエタノール中で100℃で5分間処理
することによって標本全部を還元した。実施例6(d)に記載のごとくゲルの電
気泳動及び銀染色を行なった。染色されたゲルは、全部の免疫グロブリン分画が
高純度であることを証明し、また充填された量から予想された量のH鎖及びLH
のIgGが存在していた。検定した免疫グロブリン標本の各々は、ゲル上で夫々
so、ooo及び25,000の予想分子量の位置に泳動したH鎖成分及びLM
酸成分含んでいた。
夾1」Lも
rPDGF Bv−sisモノ ローナル ポ1 ローナルたPDGFイムノア
ッセイの
本発明のrPDcF Bモノクローナル及びポリクローナル抗体を種々の組み合
わせ及び変形で使用しまた種々の検出手順を使用することによって、感度が高く
特異性に優れたイムノアッセイを行なうことが可能である0本発明は、本文中に
記載の特定実施例に限定されることなく、本発明の天然非還元二量体PDGFに
対するモノクローナルの°可能な組み合わせ及び変形による使用をすべて包含す
る。かかるアッセイはいくつかの病理状態、例えばある種の形態の癌の診断及び
予後の予想に使用され得る。
Nunc 96ウエルマイクロタイタープレートのウェルで0.05Mの炭酸ナ
トリウム(pH9,2)中に5μglllの精製モノクローナル抗体162(5
0μりを室温で1晩インキユベートすることによって吸着させた。溶液を吸引し
、残りのタンパク吸着部位を150μlの2%ゼラチンで室温で45分間ブロッ
クした。溶液を吸引し、ウェルを0.025%Tween 80(登録商標)含
有のPBSで1回洗浄した。 0.025%のTween 80と0.2%のゼ
ラチンとを含むPBS中の50μlの抗原を各ウェルに添加し、室温で1.5〜
2時間インキュベートした。
抗原溶液を除去し、ウェルを0.025%丁ween 80含有のPBSで1回
洗浄した。 rPDGF Bで感作したウサギポリクローナル抗血清を、0.0
25%丁ween 80と0.2%ゼラチンとを含むPBS中で1:1000に
希釈し、各ウェルに50μlずっ添加した。室温で1〜1.5時間インキュベー
ション後、溶液を除去した。
ウェルを0.025%丁ween 80含有のPBSで1回洗浄した。西洋ワサ
ビペルオキシダーゼに結合した市販のヤギ抗ウサギ免疫グロブリン製剤を、0.
025%丁ween 80と0.2%のゼラチンとを含有するPBSで1:40
00に希釈し、各ウェルに5oμlずっ添加した。1〜1.5時間インキュ−ベ
ーション後、溶液を除去し、0.025%丁−een 80含有のPBSでウェ
ルを4回洗浄した。
^BTS Peroxidase 5ubstrate 5olutions^
及びB(Kirkegaardand Perry Laboratories
、 Gaithersburg%Maryland)を新しく1:1比で混合し
、100μlを各プレートに添加した。基質添加の5〜20分後にTitert
eck Multisean ELIS^プレートリーダーで4141−の各ウ
ェルの吸光度を測定した。このアッセイで作成された代表的標準曲線を第12図
に示す。
えLAL
モノクローナル −ア ロースアフィニーイ力ラムの構築 びtらし がらrP
IH:F By−sisを るための・精製したモノクローナル抗体免疫グロブ
リン52及び162を、CnBr活性化5epbarose(登録商標)4Bに
結合してアフィニティカラムを作成した。実施例6(d)に記載の手順で結合を
行なわせる。 5epharose 4Bに対する免疫グロブリンの比は、モノ
クローナル抗体52ではIMlの5epharose当たり3.5H、モノクロ
ーナル抗体162では3.Owg/mlであった。
rPDGF B産生細胞(例えばCl0−pDSVE/c−sis、 Cl0−
pDSVE/v−sisまたはCl0−pDSVE/cv−sis)培養培地か
らrPDGF Bをアフィニティ精製するために、モノクローナル抗体52及び
162のカラム(rseJ)h52J及びrseph162」)を使用するとよ
い、2つのモノクローナルアフィニティ力ラムの操作は、実施例6のウサギ抗C
GPI免疫グロブリンアフィニティカラムと実質的に同じである。0.1〜3゜
01のCIOrPDGF B培養流体をアフィニティ力ラム(10zffi)に
吸着させ、流速30〜40xl/時のバッフyF及びGで洗浄し、1.ONの酢
酸、0.15HのMaclで溶出した。
Bio−Radのタンパクアッセイ、2トチミジン取り込みに基づく分裂誘発ア
ッセイ、またはいくつかの場合にはドツト結合イムノアッセイによってタンパク
含有(PDにF)分画の所在を検出した。 rPDcF B含有分画をプールし
保存して、後述するごとき分析に使用した。
え1燵徨
rPD(:F Bの、 ′
10(A) −び −rPDGF Bの5flS−PAGE :5eph52ま
たは5epb162アフイニテイ力ラムでクロマトグラフ精製したrPDcF
Bの純度を評価するために、これを5DS−FAにEで分析した。少量のタンパ
クを検出できる技術である銀染色、またはクーマシーブリリアントプルー染色に
よって非標11rPDGF Bはを検出した。一般には銀染色のほうが感受性が
高いが、ある種のタンパクはクーマシー染色のほうがよく検出できる。典型的な
結果によれば、rPDGF Bポリペプチドのみの存在が判明した。これらのペ
プチドのサイズは、in vivol[mタンパクをCl0−pDSVE/e−
sis培地(実施例4)に由来の抗PDにF血清によって免疫沈降させたときに
検出されるペプチドのサイズと同じであった。かがる高純度調製物中でその他の
タンパクは全く観察されなかった。
2μgのタンパクをこのゲルに充填したので、これらの条件下の感度は20〜5
0ngであり、rPDcF Bの純度は95%を上回ると評価できる。 CにP
Iニワトリ成長ホルモン/PD[;FB合タンパク(実施例5)に対するウサギ
ポリクローナル抗血清を使用してこのrPDll:F B調製物のイムノプロッ
ト分析(実施例6c参照)を行なった結果、銀染色によって観察された全部のタ
ンパク種がPDCF関連であることが判明した。
アフイニティ力ラム精製rPDGF BをBolton and Hunter
の方法、1雌、によってヨウ素標識した。標識rPDcF B(2x10’ep
m)を5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、乾燥し、X線フィルム
に16時間露光した。オートラジオグラムで検出されたバンドだけがrPD(:
F Bポリペプチドに対応した。これらの条件下でバンド内の50epmまで検
出可能であったので、この分析は、これらの方法で精製されたこの特定のrPD
GF Bバッチの純度が99%を上回ることを証明ウサギ免疫グロブリンアフィ
ニティ力ラムから回収したrPDcF B分画とプールされた分画標本とに対し
、実施例4&に記載のごとき分裂誘発アッセイによって生物学的活性を試験した
。 rPDtl:F B含有アフィニティ力ラム分画の全部が分裂誘発アッセイ
に活性であり、バイオアッセイ標準曲線から計算した濃度は、BioRidタン
パクアッセイ及びドツト結合イムノアッセイによって測定された濃度と十分な相
関間係を示した。rPDGF Bの特異的活性は、ヒト血小板がら精製されたい
くつかのPDGFバッチと同様であった。
10(c) N−アミノ ” :
実施例10に記載のごとく精製したrPDGF BをN−末端配列解析し、rP
DGF Be−5isの最初の14個のアミノ酸を5er−Leu−Gly−S
er−Leu−Thr−11e−^1a−Glu−Pro−^1t−Net−1
1e−^1aと同定した。これらはヒト血小板がら精製されたPD[:F Bj
IのN−末端の14個のアミノ酸(Johnsson等、1雌)と同じである。
少ない割合ではあるがある程度のアミノ末端がアミノ酸33(Thr−Asn−
^!a−^5n−Phe)及びアミノ酸80(Lys−Lys−Pro−11e
−Phe)で開始する。これも血小板がら精製したPDGFにおいて観察された
結果(Johnsson等、前出)と同じであった。rPDGFBv−sisの
アミノ末端配列解析の結果も同様であったが、アミノ酸6及び7はTbr−11
eでなく 5er−Valであり、これはこれまでに発表された結果(Deva
re等、前出)と一致した。これらの結果は、rPDGF BがCOO細胞中で
はヒト血小板中と同様にアミノ末端でプロセスされることを示す。
アミノa33及び80で開始する少量のアミノ末端は、CIO細胞及び血小板の
内部で検出された特異的タンパク分解酵素の作用の結果生じたと推定される。あ
る種の目的のためには、これらの内部開裂を含まないrPDGF B産物を得る
ことが望ましい、そのためには、関与する特異的タンパク分解酵素による認識を
阻止するようにアミノ酸配列を開裂部位で変性するとよい、従って、特定アミノ
酸残基32.33.79及び/または80とこれらに直ぐ隣接の残基に関しては
、該残基をコードするDNA配列を変更することによって変性し別のアミノ酸に
してもよい。
10(d) ・ 量の 。
タンパクのグリコシレージョンには2つのタイプがある。
一般的なタイプはN−結合型であり、糖残基が配列asn−X−thr/ser
をもつ部位でアスパラギンに結合している。いま1つのタイプは〇−−合型であ
り、糖残基がセリンまたはトレオニンに結合している。このタイプのグリコシレ
ージョンにはその他のコンセンサス配列は全く同定されなかった。
ヒト血小板から精製されたPDGFは約7重量%の炭水化物を含有する(Deu
el等、J、Biol、Chem、 256:8896(1981))、へ鎖と
BMとの間の糖残基の分布は未だ解明されていない。
しかしながら、配列asn−X−thr/serがB[の内部で発生しないので
B鎖がト結合炭水化物を含まないことは推定できる。
従って、血小板PD(:Fの8M中の〇−結結合グリコリレーション有無を判断
するだけでよい。
Cll0細胞によって産生されたrPDGF By−sisが炭水化物を含有す
るか否かを判定するために、2つのタイプの分析を実施した。第1タイプの分析
では、グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、エンドグリコシダーゼFまたは0−
グリカナーゼと共にインキュベートした後に5OS−PAGE中のタンパクの電
気泳動移動度の変化をモニタした。これらの実験の結果は、タンパクの微量成分
だけがこれらの酵素処理によって変性されることを示した。
タンパク中の炭水化物を分析する第2タイプの方法では、酸メタノール分解によ
って糖残基を遊離させ、Zanetta等、J、C上ユ、41え、工69:29
1(1972)の手順でガスクロマトグラフ分析することによって定量する。こ
の分析の結果は、フコース0.025%、ガラクトース0.125%wt/wt
、マンノース0.075%、N−7セチルグルコサミン0.038%、シアル酸
O,0S25%であった。
これらのデータから、CHO細胞によって産生されたrPDl:FBy−sis
が1重量%未満の炭水化物を含有するという結論が得られた。
1o(e) L仁1:
ヒト血小板から精製されたPDGFは線維芽細胞、平滑筋細胞、顆粒球及び単球
に対して走化性であることが証明されている(Deuel等、J、Cl1n、I
nvest、 69:1046(1982)、Seppm等、J、Ce1l B
iol、 92:584(1982)、にrotendorst等、Proe
。
Natl、^cad、sci、UsA″78:3669(1981))、 rP
DGF Bがこの特性を共有するか否かを判断するために、Deuel等、旺、
に記載の走化性アッセイで試験した。 rPDにF Bは上記のすべての細胞型
に対して、ヒト血小板から精製されたPDGFと等しい程度の走化性をもつこと
が判明した。
10(f) rPDGF Bの1nvivo′3、QX3.5cmのステンレス
スチーlレワイヤクロス片(40メツシユ、メツシュワイヤ0.010)によっ
て開腔を作成した。このワイヤクロスを棒の周囲に巻き付けて長さ3.5c−及
び直径0.95cmの円筒を形成した0円筒の一端を圧縮してとがっていない末
端を形成し、開放末端にシリコーンゴム隔膜を取り付けた。完成した開腔を熱殺
菌(120℃で30分間)した後に埋め込んだ。
雄スプリーグ・ドーリーネズミ(350〜400g)の背中の皮下の筋肉層のレ
ベルまで2cmナイフで切開し鈍的!IIWによって形成したポケットに開腔を
埋め込んだ、開腔の埋め込み後にステンレススチールクリップで創傷を閉鎖した
。このようにして各試験動物毎に、肩に2つ、後房に2つの開腔を埋め込んだ。
開腔埋め込み後3日目から毎日0.1zlの対照ベヒクルまたは0.1z1の試
験製品を、シリコーンゴムプラグを貫通する皮下注射針によって開腔に注入した
。開腔の解剖学的位置が結果に影響を与えることを避けるために注射パターンを
動物毎に系統的に変更した。9回目の注射の24時間後に開腔を取り出し、風袋
計測した計量ボートに開腔の中味を掻き出して正味重量を計量した。更に、Bi
oRadタンパクアッセイによって総タンパク、 Vytasek、^na1.
Bioehem、 120:243(1982)によって総DNA及びBerg
、Methods Enz mol、 82:372(1982)の方法によっ
て総ヒドロキシプロリンを定量した。
表■は、毎日5.0.g 、のrPDCF Be−5isの投与が開腔内部の肉
芽組織の蓄積に与える効果を示す、これらのデータは、蓄積組織の総正味重量が
対照ベヒクルを注射した開腔から得られた重量の約3倍になることを示す、開腔
内部に蓄積したタンパク、DNA及びヒドロキシプロリンの総量についても同様
の増加が観察された。
」L
の −組 の−に るrPDGF Be−5isの 果lLmタンパク 公人
ヒドロ シブロリン(zy) (zy) (y) Cxy’)ベヒクル 92±
23 4.2±0.8 125±31 254±87rPDにF B 244f
30 8.7+0.8 444±56 6971250(5,0μFI)
本平均上S、E、M。
300〜350.の若い雄スプリーグ・ドーリーネズミ(Sasco、Inc、
、Omaha、 NE)をペンタバルビトール(161fI)で麻酔し、中央線
の両側で皮Ji1.5cmの深さまで6cm切開した。 rPDにFB添加また
は不添加の10xg/x1のウシコラーゲン懸濁液(χ1dereiI[(登録
商標)、ColCo11a Corporation、 Pa1o^lto、C
^)を傷口の縁端に塗布した(0.1wl/創傷)、3つの外科クリップで創傷
を癒合した。採取のときにラットの青中の皮膚全部を切開した。平行外科ナイフ
を備えた型板を使用し。
各切開毎にクリップ間で8鵬醜の細片標本を2つ採取した。
創傷皮膚によって許容される最大負荷をTensometerlOによって測定
した。a片標本を毎分10m−ずつ伸ばしながら測定値を得、最大負荷をグラフ
に記録した。感染、過度の出血または癒合不良(全部の創傷の5%未満)を示し
た創傷では破壊強さを測定しなかった。
この試験の結果を表■に要約する0表■は、rPDtl、F Bが記載の方法で
≧5μy/n傷の投与量で投与されたときに治癒創傷皮膚の引張強さの増加を有
意に促進することを証明する。
宍」L
rPDGF Bに る5 a ’ f) ’成長乱L LdLnlIiL札皿1
μm 区QL]0−−ん0−−
rPDll:FBv−sis 20 8 228±81 192 0.0051
19+61
rPDcFBc−sis 10 13 249±90 193 0.02512
9±33
5 10 221±72 143 0.0251 15 166±50 108
N5153±61
犬光」11
創傷治癒の遅れは多くの疾患においてその病気に関連する特徴として現れる。従
来の例として、インシュリン依存性糖尿病では循環障害と単球/マクロファージ
機能が創傷治癒の遅れと関連する。これらの疾患では創傷部位に対する成長因子
の配給量が減る0組換えヒトPDGFb−sisを直接配給することによって上
記状態が改善できるか否かを確認することが重要である。このために、ラットを
計量し、開腔の皮下埋め込みと同時にストレプトシトシン(70mg7Kf1体
重)を−回靜注して糖尿病にする。開腔は実施例10(f)と同様に形成する。
埋め込みの3日後から開腔に0.1alの対照ベヒクルまたは1.0μgの組換
えPDII:Fb−sisを含むベヒクルを毎日注射する。この処置を連続9日
間継続し、ここでラットを再度計量し、血液標本を採取し、血漿ブドウ糖を分析
し、開腔を取り出して肉芽組織形成を観察する0次に、これらの観察によって得
られた結果を開腔に対照ベヒクルを注射した非糖尿病ラット群で得られた結果と
比較する。
表■に示すごとく、ストレプトシトシンで予め処置したラットでは謬著な体重減
と開腔肉芽組織の有意な減少とを伴う重症の高血糖症が観察された。従って、糖
尿病ラットの血漿ブドウ糖は非糖尿病群に比較して約4倍に上昇していた。更に
、糖尿病動物は試験中に30〜40gの体重減を示したが、非糖尿病群は同量の
体重増加を示した。開腔にPDGFb−sisを注射してもこれらの糖尿病的結
果は変化しなかった。対照的に、組換えPDGFv−sisの局部投与は、糖尿
病に起因する総タンパク、DNA及びヒドロキシプロリンの開腔内蓄積量の減少
を完全に覆した。これらの結果は、この組換え成長因子の局部投与によって、関
連疾患の全身性病理生理を変化させずに疾患例えば糖尿病に伴う創傷治癒の遅れ
を改善できることを示す。
え11■
ウ ち 、 の 療にお番 るrPDcF Bの予備実験でrPDGF Bがウ
サギ耳打ち抜き標本の創傷の治癒を促進することが証明された。この実験では、
軟骨まで達する直径61のM1mプラグを摘出した0組織の再成長は肉芽組織及
び上皮の双方を含んだ、第13図に示すごとく、創傷形成後の種々の時点で各創
傷の中央断面の3箇所で測定を行なった。2つの測定値、即ち、八−の 庁及び
八−組 の〒進 日の は肉芽組織の成長と関連する。 3 ヤップを示す第3
の測定値は、創傷の上皮の再生と関連する。
これらの実験の予備結果は、創傷形成直後にコラーゲンベヒクルに入れたrPD
GF Bを1回適用することによって3つのパラメータ全部に効果が生じること
を示す、7日後に対照創傷の肉芽組織の最大深度は0.76±0.31であった
が、rPDGF B処置創傷では深度が1.02±0.06mm(P< 0.0
001)であつた、対照の肉芽組織では前進端間の間隔が4.68±0.12m
−であり、rPDGF B処置創傷ではこの間隔は4.05±0.17mm(P
<0.004)であった、対照創傷の上皮再生ギャップの平均間隔は1゜78±
0.21m−であり、rPDGF B処置創傷では平均間隔は1.10±22■
であった。処置創傷の多くが7日目に完全に上皮再生したので同種の統計学的分
析は無用であった。測定の変形例として、完全に上皮再生した創傷の数(n=
18)を測定した。対照では24%が完全に上皮再生し、rPDGF B処置創
傷では56%が完全に上皮再生した。これらの結果は、肉芽組織及び上皮組織の
双方の再生が望まれる非治癒腫瘍のごとき創傷の治療にrPDGF Bが有用で
あることを示唆する。
本発明を特定実施例に基づいて上記に説明した0本文の開示に基づいてその修正
及び改良が可能であることは当業者に明らかであろう。
例えば、(v−sis、 c−sisまたはその他の変種及び類似体を問わず)
PDにFの^及び/またはBfiに存在するエピトープを認識するモノクローナ
ル抗体をPDCFの精製に使用することも可能である。更に、PDにFは結合組
繊細胞に対する主要マイトジェンであるから、本発明の高度に精製されたFDC
Fを創傷治癒の刺激に使用することも可能である。 PDGFは創傷の部位での
み血小板から遊離され、結合組繊細胞に対する分裂誘発性及び走化性を示す、1
つの試験では、複数の別のホルモンの1種を使用したときよりもPDGF処置し
たほうが創傷におけるコラーゲン合成が進行することが証明された。
従って本発明は、請求の範囲で規定された本発明の範囲に包含されるすべての変
更及び改良を包含すると理解されたい。
:CCAAGGGC
コroLysG1y
:’!TGGAGCC
−@uGlyAla
FIG、4
FIG、5
国際調査報告
PCT/(JSl=181007L)11PCContznued
US、 CL: 3tJ/413; 435/68; 435/91; 435
/172.i、 435八72.3゜435/240.上、4357320
I工、 FleLds 5earch cont。
935/22. 23. 24. 32. 47. 59. 60. 70.
102. 106−−畷w−a+、waeas□a−w、f’cT/lJs88
10o701
Claims (29)
- 1.PDGFのB鎖に検出されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体に結 合するエピトープを与えるためのrPDGFBの構造的コンホーメーションの十 分な部分を有し、天然PDCFの生物学的特性を1つ以上有し、還元SDS−P AGFによる測定において95%を上回る純度をもつことを特徴とする精製単離 ポリペプチド。
- 2.ポリペプチドが、自律複製DNAプラスミドまたはウイルスベクターに担持 された外来DHA配列が原核細胞または真核細胞によって発現された産物である ことを特徴とする請求項1に記載のポリペプチド。
- 3.ポリペプチドが、第1図に示すrPDGF Bv−sisまたはその任意の 変種の構造的コンホーメーションをもつことを特徴とする請求項1に記載のポリ ペプチド。
- 4.ポリペプチドが、第2図に示すrPDGF Bc−sisまたはその任意の 変種の構造的コンホーメーションをもつことを特徴とする請求項1に記載のポリ ペプチド。
- 5.有効量の請求項3のポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促 進方法。
- 6.有効量の請求項4のポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促 進方法。
- 7.ATCC No.HB9357として寄託されたハイブリドーマによって発 現されるモノクローナル抗体。
- 8.ATCC No.HB9354として寄託されたハイブリドーマによって発 現されるモノクローナル抗体。
- 9.ATCC No.HB9361として寄託されたハイブリドーマによって発 現されるモノクローナル抗体。
- 10.ATCC No.HB9355として寄託されたハイブリドーマによって 発現されるモノクローナル抗体。
- 11.ATCC No.HB9356として寄託されたハイブリドーマによって 発現されるモノクローナル抗体。
- 12.PDGFのB鎖に検出されるエピトープに特異的なモノクローナル抗体に 結合するエピトープを与えるためのrPDGFBの構造的コンホーメーションの 十分な部分を有するポリペプチドをSDS−PAGE測定において95%を上回 る純度まで精製するために、−rPDGF Bc−sisまたはrPDGF B v−sis中で検出されるエピトープを少なくとも1つ有するポリペプチドの合 有溶液と基質結合モノクローナル抗体とを接触させ、一基質結合モノクローナル 抗体からポリペプチドを溶出する段階を含むことを特徴とする前記ポリペプチド 精製方法。
- 13.前記接触段階が、請求項7〜18のいずれか一つの抗体を結合したカラム にポリペプチド含有溶液を通す段階から成ることを特徴とする請求項19に記載 の方法。
- 14.ATCC No.9359として寄託されたrPDGF Bv−sis産 生細胞系[CHO−pDSVE/v−sis]。
- 15.ATCC No.9358として寄託されたrPDGF Bc−sis産 生細胞系[CHO−pDsVE/c−Sis]。
- 16.ATCC No.9360として寄託されたrPDGF Bcv−sis 産生細胞系[CHO−pDSVE/c−sis]。
- 17.第10図のアミノ酸配列を有するrPDGF Bc−sis/rPDGF Bv−sis融合ポリペプチド。
- 18.請求項17の融合ポリペプチドをコードするDNAセグメント。
- 19.請求項17のDNAセグメントを含む形質転換ベクター。
- 20.請求項19のベクターによって形質転換された細胞系。
- 21.細胞がATCC No.9360として寄託されていることを特徴とする 請求項20に記載の細胞系。
- 22.第11図のアミノ酸配列をもつrPDGF B/CgH融合ポリペプチド 。
- 23.請求項22に記載の融合ポリペプチドをコードするDNAセグメント。
- 24.請求項23のDNAセグメントを含む形質転換ベクター。
- 25.請求項24のベクターによって形質転換された原核または真核細胞。
- 26.ATCC No.67352で寄託された請求項25に記載の細胞。
- 27.0.4μg/106細胞/24時を上回る量でrPDGF Bを産生する ことを特徴とするCHO細胞系。
- 28.rPDGF B遺伝子を含むCHO細胞系からrPDGF Bポリペプチ ドを発現させることを特徴とするrPDGFBの産生方法。
- 29.非グリコシル化rPDGF B。
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