NO175312B - Fremgangsmåte for rensing av et polypeptid med en del av den strukturelle oppbygning til blodplate-avledet vekstfaktor, samt monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for rensing av et polypeptid som har en tilstrekkelig del av den strukturelle oppbygning til PDGF B til å gi minst én epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF B. Foreliggende oppfinnelse vedrører nærmere bestemt affinitets-kromatografisk rensing av rPDGF under anvendelse av monoklonale antistoffer, og slike monoklonale antistoffer.

Ross et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 11: 1207-1210 (1974 beskrev blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) som en faktor funnet i helblodserum, men ikke i blodplatefattig serum, en faktor som var i stand til å understøtte vekst av fibroblastere i kultur.

Ikke-redusert PDGF er et protein med molekylvekt 27-35kd. Den variasjon i antallet bånd observert på noen sepa-rasjonsgeler kan skyldes glycosyleringsforskjeller,, proteasevirkning under rensing eller tilstedeværelse av mer enn én molekylart. Reduksjon av PDGF gir to eller flere mindre bånd på geler, i et molekylvektområde på 10 - 18kd. Den modell som er foretrukket av de fleste innen området, er at de naturlig forekommende arter med molekylvekt 27-35kd består av to mindre, forskjellige underenheter med molekylvekter på omtrent 18kd og 16kd, kalt henholdsvis "A"- og '^"-underenhetene (eller alternativt PDGF A-kjede og PDGF B-kjede). Doolittle et al., Science, 221: 275-76 (1983); og Waterfield et al., Nature, 304: 2810-14 (1983) beskrev de partielle aminosyresekvenser til de to underenhetene av PDGF, som indikerte at aminosyresekvensen til PDGF-kjeden var mer enn 90% homolog med det forutsagte proteinprodukt av v- sis, onkogenet inneholdt i det onkogene apesarkomvirus (SSV). A-kjeden ble funnet å være omtrent 60% homolog med B-kjeden.

Apesarkomvirus ble isolert fra fibrosarkomet til en ullape. Dette virus forårsaker onkogen transformasjon av celler og forårsaker sarkomer i noen dyr. Det fullstendige SSV-genom er blitt klonet og sekvensert, og onkogenområdet ( v- sis) ble identifisert og funnet å være potensielt i stand til å kode for et fusjonsprotein med molekylvekt 28-33kd. Antisera frembragt mot peptider basert på denne sekvens immunoutfelte et protein på 28kd fra SSV-infiserte celler. Dette protein ble kalt p28sis (Robbins et al., Nature, 305; 605-608 (1983)?. Ved å bruke v- sis som en søker, ble kromo-somkloner svarende til c- sis isolert fra et humanleverbiblio-tek av Gallo et al., (Nature, 292: 31 (1981); Josephs et al., Science, 219: 503-505 (1983)) og Aaronsen et al., (Cell, 37: 123 (1983)). I tillegg ble en del humane tumorcelle-linjer undersøkt med hensyn på ekspresjon av c- sis-RNA av Gallo et al., (Nature, 295: 116-119 (1982)) under anvendelse av v- sis som en søker, og en høy prosentandel av tumorer av mesenkymal opprinnelse ble funnet å inneholde et 4,2 kb c-sis-RNA-transkript .

Gallo et al. (Science, 223: 487-490 (1984)) beskrev sekvensen til alle seks eksonene til det humane lever- c- sis-kromosomale gen som er homologt med v- sis. Denne beskrevne DNA-sekvens forutsa at proteinprodukt nesten identisk med den publiserte aminoendesekvens i PDGF-kjeden. I tillegg forutsa denne DNA-sekvens det gjenværende av PDGF-B-kjedene-aminosyresekvensen som ikke var blitt utledet ved hjelp av proteinsekvensering.

Videre beskrev Josephs et al., Science, 225: 636-639

(1984) en 2,7 kb cDNA-klon fra HUT102 tumorceller. Selv om den ikke er en fullstendig klon av den 4,2 kb RNA, inneholdt den tilsynelatende hele den sekvens som er nødvendig for å kode for en aktiv PDGF B-kjede. Når den ble plassert i en vektor nedstrøms fra en SV4 0 tidlig-promoter, var vektoren i stand til å transformere 3T3-celler.

PDGF og analoger derav er blitt uttrykt i prokaryote og eukaryote celler transformert med vektorer, inkludert eksogene gener. Murray et al., europeisk patentsøknad nr. 177 957, Hannick et al., Mol. Cell. Biol., 6_ : 1304-

1314 (1986); Hannick et al., Mol. Cell. Biol., 6: 1343-

1348 (1986); King et al., Proe. Int'l Acad. Sei. USA, 82_ : 5295-5299 (1985): Kelly et al., EMBO J. 4: 3399-3405 (1985); Josephs et al., Science, 225: 636 (1984); Clarke et al., Nature, 308: 464 (1984); Gazit et al., Cell, _39: 89-97

(1984); og Wang, J. Biol. Chem., 259: 10546-10648 (1984).

Ingen av disse referansene beskriver imidlertid ekspresjon

av mer enn 50 ng/ml aktiv PDGF i kulturmedier. Fremgangsmåter for rensing av blodplate-PDGF omfatter de som er beskrevet i Heldin et al., Nature, 319: 511 (1986); Antoniades, US patentskrift nr. 4 479 896 og Raines et al., Methods Enzymol., 109; 749' (1985): Deuel et al., (1981), J. Biol. Chem., 256: 8896-99; Antoniades, (1981), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7_8_: 7314-17, disse fremgangsmåter sørget imidlertid ikke for separasjon av mitogent aktive PDGF A-homodimerer av PDGF-homodimerer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Slik det her er brukt skal uttrykket "rPDGF B" bety biologisk aktive homodimerer av rekombinant PDGF-B-kjede med mindre annet er angitt. Fortrinnsvis er polypeptidet som renses produktet av prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens båret på et autonomt replikerende DNA-plasmid eller virusvektor. Særlig har polypeptidet den strukturelle oppbygning til r PDGF Bv.sls slik den er angitt i figur 1, eller hvilken som helst naturlig forekommende variant derav, eller polypeptidet har den strukturelle oppbygning til r PDGF Bc_sis slik den er angitt i figur 2r eller hvilken som helst naturlig forekommende variant derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for rensing av et polypeptid som har en tilstrekkelig del av den strukturelle oppbygning til PDGF B til å gi minst én epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF B, som er kjennetegnet ved at: (a) en oppløsning som inneholder polypeptidet, sendes gjennom en kromatografikolonne, hvor det til kolonnen er bundet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF, eller et antistoff frembrakt mot PDGF B/CGH-fusjonspoly-peptidet, som har aminosyresekvensen vist i figur 11, og (b) polypeptidet elueres fra kolonnen, idet polypeptidet har en renhet som er høyere enn 95 % renhet bestemt ved hjelp av SDS-PAGE.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for rensing av et polypeptid som har en tilstrekkelig del av den strukturelle oppbygning til PDGF B til å gi minst én epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF B, som er kjennetegnet ved at: (a) en oppløsning som inneholder polypeptidet, sendes gjennom en kromatografikolonne, hvor det til kolonnen er bundet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF, og (b) polypeptidet elueres fra kolonnen, idet polypeptidet har en renhet som er høyere enn 99 % renhet bestemt ved hjelp av SDS-PAGE.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre et monoklonalt antistoff som er kjennetegnet ved at det er spesifikt for en epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til

PDGF.

Kort beskrivelse av tegninger

Figur 1 er den primære aminosyresekvens til rPDGF

B . ;

v-sis

Figur 2 er den primære aminosyresekvens til rPDGF

c-sis

Figur 3 er en skjematisk fremstilling av rPDGF B

3 J 3 c-sis klon U2-OS56.1;

Figur 4 er den fullstendige sekvens til eksonene 2 -

6 fra klonen ifølge figur 3 som koder for rPDGF B; Figur 5 er en skjematisk fremstilling av plasmid pDSVE; Figur 6 er en skjematisk fremstilling av plasmidet pDSVE/ c- sis; Figur 7 er en skjematisk av plasmidet pDSVE/ v- sis; Figur 8 er en DNA-sekvens som koder for et antatt, rPDGF B c-si. s forlø*peraminoendeområde; Figur 9 er en skjematisk fremstilling av plasmidet pDSVE/ c- sis; Figur 10 er aminosyresekvensen til det forutsagte starttranslasjonsprodukt av c- sis-genet. Figur 11 er en aminosyresekvens for CGH/PDGF-fusjons-

proteinet CGP1; og

Figur 12 er en grafisk fremstilling av ELISA-analyse-resultater under anvendelse av monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 13 er en skjematisk fremstilling av kaninøre-perforeringsmodellen.

Nærmere beskrivelse

I henhold til fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse ble det erholdt et isolert og renset polypeptid med minst en del av den strukturelle oppbygning til aktiv rPDGF B. Polypeptidene anvendt ifølge oppfinnelsen omfatter bare en del av eller hele rPDGF B og er i det vesentlige fri for andre PDGF-beslektede molekyler, dvs. PDGF A-kjede, PDGF A-homodimer og PDGF A,B-heterodimerer. Polypeptidene renset ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at de har en epitop for binding til et monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop som finnes i rPDGF B, og har en renhet som er høyere enn 95 % bestemt ved hjelp av SDS-PAGE.

Fremgangsmåten for rensing av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter å sende en oppløsning som inneholder det urene polypeptid over en kromatografikolonne hvortil det er bundet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop som finnes i rPDGF B, og så eluere den bundne rPDGF B fra kolonnen.

Slik det her er brukt, henviser uttrykkene "biologisk aktiv rPDGF B" eller "aktiv rPDGF B" til rPDGF B som er aktiv i en in vitro mitogenanalyse.

Representanter for de monoklonale antistoffer som kan anvendes i fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et monoklonalt antistoff [30] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. 9366 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. mars 1987; et monoklonalt antistoff [133] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9357 ved .American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987; et monoklonalt antistoff [155] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC HB 93 54 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987; et monoklonalt antistoff

[232] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. 9372 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18 mars 1987; et monoklonalt antistoff [52] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9361 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987; er monoklonalt antistoff [191] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. 9368 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. mars 1987; et monoklonalt antistoff [20] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9355 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 19 87; et monoklonalt antistoff [116] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. 9367 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. mars 1987; et monoklonalt antistoff [198] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. 9369 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. mars 1987; et monoklonalt antistoff [162] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9356 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987; et monoklonalt antistoff [296] uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. 9 370 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. mars 1987 og et monoklonalt antistoff

[219] av et hybridom deponert som ATCC nr. 9371 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. mars 1987.

Den bestemte kolonne og de bestemte betingelser for

det kromatografiske system som anvendes, fastlegges lett av en person med alminnelig dyktighet innen teknikken. Fortrinnsvis anvendes det en antistoffaffinitetskolonne. Oppløsnings-midler som kan anvendes ved eluering av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, bestemmes lett av en person med alminnelig dyktighet innen teknikken, og omfatter fortrinns-

vis svake syrer, dvs. eddiksyre. En foretrukket fremgangsmåte omfatter utførelse av rensingen ved en temperatur på

ca. 4°C.

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "struktu-rell oppbygning" til strukturen til et mitogent aktivt polypeptid som har hele eller en del av aminosyresekvensen til rPDGF B.

Ekspresjonssystemet som kan anvendes til fremstillingen av polypeptidene som renses ifølge oppfinnelsen, omfatter cellekultursystemer, fortrinnsvis CHO-celler. I tillegg til ekspresjonssystemene som her er beskrevet, er det også tenkt på andre systemer, og omfatter f.eks. ett eller flere av de følgende: modifikasjon av stedene for proteasespalting, anvendelse av en alternativ ledersekvens for å øke sekresjons-nivå fra vertceller av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det er tilveiebrakt cellelinjer som produserer rPDGF B, inkludert en CHO-cellelinje som produserer en rPDGF Bv.sls deponert som ATCC nr. CRL 9359 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987 og en CHO-cellelinje som produserer en rPDGF Bc-sis deponert som ATCC nr. CRL 9358 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987.

Det er også tilveiebrakt r PDGF Bc.sis/v.Eis og rPDGF Bv,sis/kyllingveksthormon (CGH)-fusjonspolypeptider, DNA-segmenter som koder for dem, og transformasjonsvektorer som inneholder slike DNA-segmenter. Det er særlig tilveiebrakt en cv-sis-cellelinje deponert som ATCC nr. CRL 9360 og en CGH-vektor deponert i E. coli AM7 som ATCC nr. 67352 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 13. mars 1987.

Den biologisk aktive rPDGF B produsert ved hjelp av den prokaryote eller eukaryote ekspresjon av de klonede rPDGF B-gener kan anvendes til in vivo behandling av pattedyrarter av leger og/eller veterinærer. Mengden av aktiv bestanddel vil selvfølgelig avhenge av alvorligheten av tilstanden som behandles, den valgte administrasjonsmåte og den spesifikke virkninn av rPDGF B. on vil bli bestemt av den behandlende lege eller veterinær. Mengden av rPDGF B bestemt til å gi en terapeutisk respons i ét pattedyr er referert til som "PDGF B terapeutisk effektiv" mengde. Slike terapeutiske effektive mengder fastlegges lett av en person med alminnelig dyktighet innen teknikken.

rPDGF B kan administreres på hvilken som helst måte som er passende for den tilstand som behandles. Fortrinnsvis anbringes rPDGF B topisk på et sår. Preparater for topisk anbringelse av rPDGF B bestemmes lett av en person med alminnelig dyktighet innen teknikken. Det vil lett forståes av de som er øvet innen teknikken at den foretrukne måte vil variere med tilstanden som behandles.

Selv om det er mulig for rPDGF B å bli administrert

som den rene eller hovedsakelig rene forbindelse, er det foretrukket å gi den som en farmasøytisk blanding eller et farmasøytisk preparat.

Preparatene som kan fremstilles, både for veterinær-og humanbruk, omfatter en terapeutisk effektiv mengde av rPDGF B som beskrevet ovenfor, sammen med en eller flere farmasøyt-isk akseptable bærere for denne, og eventuelt andre terapeutiske bestanddeler. Bæreren eller bærerne må være "akseptable" i den betydning at de er forenlige med de øvrige bestanddeler i preparatet, og ikke skadelige for mottakerne. Det er ønskelig at preparatet ikke bør omfatte oxyderende eller reduserende midler, og andre stoffer som peptider er kjent for å være uforenelige med. Preparatene kan passende presenteres i en doseform, og kan fremstilles ved hvilken som helst av de fremgangsmåtene som er godt kjent innen teknikken. Alle fremgangsmåtene omfatter trinnet med å bringe den aktive bestanddel i forbindelse med bærerne som utgjør én eller flere hjelpe-bestanddeler. Generelt fremstilles preparatene ved å bringe den aktive bestanddel jevnt og intimt i forbindelse med flyt-ende bærere eller fint oppdelte faste bærere, eller begge deler, og så om nødvendig forme produktet til det ønskede preparat.

Preparater egnet for parenteral administrering omfatter passende sterile vandige oppløsninger av den aktive bestanddel med oppløsninger som fortrinnsvis er isotone med blodet til mottakeren. Slike preparater kan passende fremstilles ved å oppløse fast aktiv bestanddel i vann, hvorved det fåes en vandig oppløsning, og gjøre oppløsningen steril, hvoretter den kan plasseres i én- eller flerdosebeholdere, f.eks. for-seglede ampuller eller småflasker. Preparater egnet for topisk anbringelse omfatter en terapeutisk effektiv mengde av rPDGF sammen med farmasøytisk akseptable topiske adju-vantia.

Eksemplene nedenunder er gitt for å hjelpe på forstå-elsen av foreliggende oppfinnelse, hvis egentlige omfang er angitt i kravene.

Alle temperaturer er uttrykt i °C og er ukorrigerte. Symbolet for micron eller micro, f.eks. microliter, micro-mol, etc, er "u", f.eks. yl, ym, etc.

Eksempel 1

Subkloning og sekvensanalyse av c- sis og v- sis- gener

l(a) v- sis: v- sis-genet benyttet i foreliggende eksempel ble utvunnet fra plasmidet pC60, en klon av retro-virusgenomet fra apesarkomvirus (Wong-Staal et al., Science, 213: 226-8 (1981)), erholdt fra R. Gallo (National Insti-tute s of Health, Bethesda, Md.). Et restriksjonsfragment fra pC60, som spenner over området mellom Kpnl-stedet ved nukleotid 3505 (idet nummereringssystemet til Devare et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, j30: 731-5 (1983)), anvendes), og Xbal-stedet ved nukleotid 4817, ble subklonet inn i bakteriofag Ml3mpl8. Fem mikrogram pC60-DNA ble oppløst med Kpnl og

Xbal og fragmentet med 1312 basebar ble renset ved elektroforetisk separasjon i, og ekstraksjon fra, en agarosegel med lav smeltetemperatur, i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Ett mikrogram M13mpl8-DNA ble også oppløst med Kpnl og Xbal, etterfulgt av ekstraksjon med fenol/kloroform og ethanolutfelling.

30 nanogram av v- sis- Kpnl- til Xbal-fragmentet pluss 50 ng

av den Kpnl- og Xbal-kuttede M13mpl8-DNA ble ligert med

T4 DNA-ligase i 20 ul i 16 timer ved 14°C. Den ligerte DNA ble anvendt til å transformere E. coli K12 stamme JM103 (Messing et al., Nucl. Acids Res., 9_ : 309 (1981)) i nærvær av 5-brom, 4-klor, 3-indol-B-D-galactosid (x-gal) og iso-propyl-B-D-thiogalactosid (IPTG). Klare plakker ble valgt ut og dyrket i væskekultur. DNA isolert fra flere av disse fagene ble sekvensbestemt ved hjelp av dideoxykjedetermineringsmetoden for å bekrefte identitetet til det klonede fragment. En av disse fagklonene ble betegnet M13mpl8/ v- sis-(Kpn-Xba).

l(b) c- sis: c- sis-genet som koder for B-kjeden i human PDGF, betegnet U2-OS56.1, inneholder 3 0,4 kb human DNA og ble isolert fra et bibliotek oppbygd med DNA fra den humane osteosarkom-cellelinje U2-0S (ATCC nr. HTB 96). Biblioteket ble generert ved å anvende kosmidvektoren pTL5 (Lund et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 29_: 520-524 (1982)) og fremgangsmåtene beskrevet av Steinmetz et al., Cell, 2_8: 489-

498 (1982). Biblioteket ble gjennomsøkt med en v- sis-søker som var blitt subklonet fra en klon av apesarkomvirus erholdt fra Devare et al., J. Virol., £2: 1108 (1982) ifølge fremgangsmåten som er angitt i l(a).

Et kart over klon U2-OS56.1 er vist i figur 3. De inn-rammede områder i figur 3 utgjør eksonsekvenser (Josephs et al., Science, 223; 487 (1984 og Gazit et al., Cell, 39: 89

(1984)). Eksonene 2 - 7 er homologe med v- sis, og sammen-knytningspunktene med ikke-homologe områder utgjør grensene til eksonene. Selv om ekson 1 åpenbart er nødvendig for initiering av translasjon av den RNA som transkriberes fra dette gen (Gazit et al., Cell, _39: 89 (1984)), koder det ikke for peptidsekvenser som fremkommer i det endelige be-arbeidede protein (Johnson et al., Embo, 3_: 921 (1984).

Restriksjonsfragmenter som inneholder eksoner 2-6

ble subklonet inn i bakteriofag Ml3mpl9 og sekvensert ved hjelp av dideoxykjedetermineringsmetoden ifølge fremgangs-

måten til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74: 5463 (1977). Disse eksonsekvensene som inneholder hele området som koder for det fullt ferdige rPDGF B-protein (Johnsson et al., Embo J. , _3: 921 (1984)), var nøyaktig de samme som de som tidligere er publisert for et c- sis-gen isolert fra et humant fosterleverkromosombibliotek (Josephs et al., Science, 223: 487 (1984)). Den fullstendige sekvens til eksonene 2 - 6 er vist i figur 4.

Eksempel 2

Konstruksjon av pattedyrekspresjonsvektorer som inneholder rPDGF B- sekvenser

2(a) Konstruksjon av pDSVE: Vektoren valgt for ekspresjon av rPDGF B-gener i DHFR~-celler fra kinesisk hamster-ovarie, ble kalt pDSVE. Denne vektor ble konstruert ved å bruke fire grunnleggende DNA-sekvenselementer. Ett av disse elementene ga DNA-sekvenser som er nødvendige for seleksjon og autonom replikasjon i bakterieceller. Disse karakteristika tilveiebringes ved DNA-sekvensene for replikasjonsopprinnelse og ampicillin-resistensgen i området som spenner over nukleotidene 2448-4362 (standardnummereringssystem) i plasmidet pBR322. Dette DNA-fragment med 1918 basepar, avledet fra pBR322-derivatet pSV08 (erholdt fra dr. R. Tjian, Uni-versity of California, Berkeley) ble modifisert strukturelt ved addisjonen av den følgende HindiII-linker like ved siden av nukleotid 2448:

Et andre element ga DNA-sekvenser som utgjør en virus-promoter som er funksjonell i pattedyr- og andre hvirveldyrceller. Et DNA-fragment inneholdende en tidligpromoter fra apevirus 40 (SV40) ble generert ved først å oppløse SV40-DNA med restriksjonsendonukleaseenzym PvuII, hvorved man fikk tre PvuII/ PvuII-fragmenter med forskjellige størrelser. Ett av disse fragmentene inneholdt sekvensen (Hindlll i posisjon nr. 5171 til PvuII i posisjon nr. 270) som koder for den moturs "tidliggen" promoter og replikasjonsopprinnelse i SV40-viruset. En EcoRI-linker ble addert til 5'- og 3'-endene til hver av de tre fragmentene, hvorved det ble dannet tre EcoRI/ EcoRI-fragmenter med forskjellige størrelser. Disse fragmentene ble oppløst med Hindlll og et resulterende 340 bp HindiII/ EcoRI-fragment ble isolert ved polyacrylamidgel-elektroforese.

Et tredje element ga et signal for terminering av transkripsjon av gener innføyet i vektoren. Et DNA-fragment som inneholdt terminatorsekvensen til de tidligere SV40-gener, ble erholdt ved først å oppløse det fullstendige SV40-genom med restriksjonsendonuklease Hpal, og så omdanne en butt ende til et Sali gjenkjenningssted ved tilfesting av en Sall-linker. Denne ikke-ligerte Hpal/ Sall SV40-sekvens ble deretter oppløst med EcoRI, og Sali/ EcoRI-fragmentet med 2030 bp ble isolert ved hjelp av agarosegelelektroforese.

Det fjerde element inneholdt i pDSVE ga et middel for utvelgelse av pattedyrceller som inneholder vektoren. Genet for de dihydrofolatreduktase (DHFR) koder for et enzym som gjør det mulig for celler å vokse i medier som mangler thymidin og hypoxanthin, samt gjør det mulig for cellene å vokse i medier som inneholder visse mengder av legemidlet methotrexat. Dette genet omfattet et omtrentlig 2500 bp mus-DHFR-minigen, med EcoRI- og HindiII-restriksjonsendonuklease-"sticky ends", isolert fra plasmid pMG-1 som i Gasser et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 19_ : 6522-6526 (1982).

De fire DNA-fragmentene som inneholder disse elementene, ble ligert sammen med T4 DNA-ligase, hvorved man fikk vektoren pDSVE. Et diagram over denne vektor er vist i figur 5.

2(b) Konstruksjon av pDSVE/ c- sis: Et område av

c- sis kosmidklonen U2-OS56.1 som inneholder alle nødvendige sekvenser for transformasjon av NIH-3T3-celler, ble subklonet inn i Sall-stedet i plasmidet pDSVLd (Lin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82^: 7580 (1985)). Dette område omspennes av EcoRI-stedene ved 3,9 kb og 26,85 kb på U2-OS56.1-kartet i figur 3. EcoRI-endene til c- sis-fragmentet ble omdannet til Sall-endene før kloning av c- sis-fragmentet inn i pDSVLd. Tre mikrogram av kosmid U2-OS56.1-DNA ble begrenset med EcoRI, etterfulgt av fenol/kloroform-ekstraksjon og ethanolutfelling. Jevne ender på den dobbeltrådede DNA ble generert ved å fylle inn de entrådede områder i en 15 yl reaksjonsblanding inneholdende Klenow-fragmentet til E. coli DNA-polymerase I og alle fire deoxynukleosidtrifosfåtene, i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis, ibid. Reak-sjonen ble avsluttet ved oppvarming av reaksjonsblandingen til 70°C i 5 minutter. Syntetiske DNA-linkere inneholdende gjenkjenningsstedet for restriksjonsendonuklease Sali ble addert til det butt-endede c- sis-fragment i en 21 yl reaksjonsblanding inneholdende 1 yg kinasebehandlet linkere og T4 DNA-ligase. Etter inkubasjon over natten ved 14°C, fenol/ kloroform-ekstraksjon og ethanolutfelling, ble den sammen-knyttede DNA restriksjonsbehandlet i en 100 yl reaksjonsblanding med 26 enheter Sali i 3 timer. Den begrensede DNA ble ethanolutfelt, oppløst i et lite volum buffer og underkastet elektroforese i en 1% agarosegel med lavt smeltepunkt. 23 kb båndet ble skåret ut av gelen og renset i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis, ibid.

23 kb båndet ble ligert til pDSVLd-DNA som var blitt gjort lineær med Sali, i en 20 yl reaksjonsblanding inneholdende T4 DNA-ligase. Den ligerte DNA ble transformert inn i E. coli K12 stamme DHl (ATCC nr. 33849). Ampicillin-resistente

32

kolonier ble utsortert ved hybridisering med en p-merket v- sis-søker i overensstemmelse med fremgangsmåter beskrevet av Maniatis, ibid. En hybridiserende klon ble valgt ut og plasmid DNA ble fremstilt fra klonen. En innføyelse fra denne klon, pDSLVd/ c- sis, lot seg fjerne ved restriksjon med Sali. Restriksjonskartlegging bekreftet at denne klon inneholdt det forventede 23 kb c- sis-DNA-fragment.

Overraskende transformerte pDSVLd/ c- sis ikke lett NIH-3T3-celler, og etter innføring i COS-l-celler, eller ovarie-celler fra kinesisk hamster (CHO), førte pDSLVd/ c- sis ikke til produksjon av et produkt med påvisbare nivåer fra PDGF-aktivitet. Et beslektet plasmid konstruert av Gazit et al.

(ibid.) var blitt påvist å være i stand til å transformere NIH-3T3-celler. Ettersom pDSLVd/ c- sis inneholdt et 6,7 kb område av DNA mellom de formodede områder for ekson 1 og ekson

2, som ikke var til stede i konstruksjonen til Gazit et al., forelå det en mulighet at dette område inneholdt sekvenser som inhiberer ekspresjon av c- sis-genet i noen pattedyr-celletyper. En ny pattedyr- c- sis-ekspresjonsvektor ble derfor konstruert hvor det 6,7 kb store DNA-fragment mellom Hindlll-stedene ved 5,2 kb og 11,9 kb på c- sis-kartet var fjernet. Denne nye vektor ble konstruert ved å bruke patte-dyrekspresjonsvektoren pDSVE beskrevet i avsnitt (a) ovenfor. Det ble funnet at pDSVE vanligvis ga høyere ekspresjons-nivåer for det innføyde gen i CHO-celler enn pDSVLd gjorde.

Et mikrogram pDSVE ble begrenset med Sali, fenol/kloroform-ekstrahert og ethanolutfelt, og anvendt i ligeringen beskrevet nedenunder.

For fremstilling av et fragment inneholdende det formodede område for ekson 1 til c- sis, ble 3 yg pDSVLd/ c- sis restriksjonsbehandlet med BamHI og Kpnl. DNA-fragmentene ble separert ved elektroforese gjennom en 0,7% agarosegel med lavt smeltepunkt. Et 1,25 kb fragment som utgjør området mellom BamHI-stedet ved 4,6 kb og Kpnl-stedet ved 5,85 på c- sis-kartet i figur 3, ble fjernet fra gelen og ekstrahert som beskrevet av Maniatis (ibid.). 75 nanogram av dette fragment ble ligert med T4-DNA-ligase i en 20 yl reaksjonsblanding til 75 ng M13mpl8-DNA som var blitt restriksjonsbehandlet med Kpnl og BamHI på forhånd. Den ligerte DNA ble transformert inn i E.coli K12 stamme JM103 som beskrevet ovenfor; flere klare plakker ble valgt ut og dyrket i væskekultur. Dobbeltrådet DNA i replikativ form (RF) ble isolert fra de infiserte celler og undersøkt ved hjelp av restriksjonskartlegging med BamHI, Kpnl og Hindlll. En klon som ut-viste det korrekte mønster, ble valgt ut for anvendelse ved isolering av et c- sis restriksjonsfragment.

Fire mikrogram Ml3mpl8/ c- sis (Bam-Kpn) RF DNA ble re-striks jonsbehandlet med Sali og Hindlll. Restriksjonsbehandling med Sali resulterer i avkutting på et sted i polylinkerområdet til M13mpl8 som er 13 basepar borte fra BamHI-stedet hvor c- sis (Bam-Kpn)-fragmentet ble innføyet. Restriksjonsbehandling med Hindlll resulterer i avkutting i Hindlll-stedet til M13mpl8. Det er viktig at restriksjonsbehandling med Hindlll resulterer i avkutting i Hindlll-stedet innenfor c- sis (Bam-Kpn)-fragmentet, i en posisjon som svarer til 5,2 kb på U2-OS56.1-kartet fremskaffet i figur 3. Effek-ten av denne fremgangsmåten er således å addere et Sall-sted nær BamHI-stedet ved 3,9 kb på kartet over U2-OS56.1 i figur 3. Det 0,6 kb store Sa_ll-HindiII-fragment ble isolert fra reaksjonsblandingen ved elektroforese gjennom en 1,0% agarosegel med lavt smeltepunkt og ekstraksjon. Dette fragmentet er nedenunder henvist til som fragmentet ekson 1.

For å erholde et DNA-fragment som inneholder c- sis-eksonene 2-7 med de korrekte restriksjonssted-"sticky ends", ble 4 yg pDSLVd/ c- sis restriksjonsbehandlet med Hindlll og Sali. Den restriksjonsbehandlede DNA ble underkastet elektroforese gjennom en 0,7% gel med lavt smeltepunkt og et 14,75 kb stort fragment som utgjør området mellom 11,9 kb og 26,85 kb på U2-OS56.1-kartet i figur 3, ble isolert. Dette fragmentet er henvist til nedenunder som fragmentet ekson 2-7.

I en endelig 20 yl ligeringsblanding, ble 50 ng Sall-restriksjonsbehandlet pDSVE blandet med 5 ng av fragmentet ekson l og 80 ng av fragmentet ekson 2-7. Etter reaksjon over natten ved 14°C i nærvær av T4 DNA-ligase, ble reaksjonsblandingen transformert inn i E. coli K12 stamme DHL. To replikafiltere ble laget av ampicillin-resistente kolonier, et filter ble hybridisert til en v- sis-søker for å påvise tilstedeværelsen av fragmentet ekson 2 - 7, og det andre ble hybridisert til et syntetisk oligonukleotid som er komplementært med en sekvens inneholdt i et oppstrøms-område av en c- sis-cDNA-klon (Josephs et al., Science, 225: 636 (1984)). Dette oligonukleotid var tidligere blitt påvist å hybridisere til ekson 1 fragmentet beskrevet ovenfor. En klon som hybridiserte til begge søkerne ble valgt ut og dyrket opp for plasmidisolering. Restriksjonsanalyse bekreftet at dette plasmid, kalt pDSVE/ c- sis, inneholdt elementer som er ordnet som vist i figur 6.

2(c) Konstruksjon av pDSVE/ v- sis: For å konstruere

en pattedyrekspresjonsvektor inneholdende v- sis-genet som ville bruke translasjonsinitieringssignalet benyttet av ape-

sarkomvirus, ble et DNA-fragment inneholdende v- sis-genet og 178 bp av SSV-DNA oppstrøms for det innføyet i pDSVE.

Det første translasjonsprodukt som resulterte fra transkripsjon av denne vektor, er en fusjon av SSV kappeglycopro-teinet og ^ rPDG<F> B v-si. s (Robbins et al., Nature, 305: 605

(1983)). Bearbeiding av aminoendedelen av fusjonsproduktet kan så resultere i fremstilling av et fullt ferdig rPDGF B-protein som mangler SSV-kappeproteinsekvenser. To mikrogram av RF-formen av M13mpl8/ v- sis(Kpn-Xba)-subklonen beskrevet i eksempel 1 ble restriksjonsbehandlet med Sali. Dette resulterer i frigjørelse av et fragment med 1191 basepar som spenner over området mellom Sall-stedet i posisjon 3633 i SSV (nummereringssystem til Devare et al., ibid.), og Sall-stedet i polylinkerområdet til Ml3mpl8; idet det sistnevnte sted er 7 basepar borte fra Xbal-stedet hvorved v- sis-genet ble innføyet. Dette fragment ble renset ved elektroforese gjennom en 0,7% agarosegel med lavt smeltepunkt, etterfulgt av fjerning av båndet og ekstraksjon. 35 nanogram av fragmentet ble ligert med T4 DNA-ligase til 50 ng Sall-kuttet pDSVE-DNA i en 20 yl reaksjonsblanding ved 14°C i 16 timer. Reaksjonsproduktet ble transformert inn i E. coli K12 stamme DH1, ampicillin-resistente kolonier ble sortert ved hybridi-32

sering inntil en p-merket v- sis-søker ifølge fremgangsmåter beskrevet av Maniatis ibid. Flere hybridiserende kloner ble valgt ut, dyrket i væskekultur og underkastet plasmidisolering under anvendelse av standard fremgangsmåter. Plasmidene ble kartlagt med restriksjonsenzymene Hindlll, Xbal .og Pstl for å identifisere kloner som inneholder innføyelser i den korrekte orientering for transkripsjon ved hjelp av SV 40 til promoteren pDSVE. En slik klon ble kalt pDSVE/ v- sis og ble brukt i eksemplene beskrevet nedenunder. Strukturen dens er tegnet skjematisk i figur 7.

2(d) Konstruksjon av pDSVE/ cv- sis: For å konstruere en pattedyrekspresjonsvektor hvor det fullt ferdige rPDGF B-proteinområde kodes for av v- sis-genet, men translasjonsinitieringssignalet og aminoendeområdet til rPDGF B-pre-proteinet kodes for av c- sis-genet, kan følgende fremgangsmåte anvendes. Et mikrogram pDSVE ble gjort lineært med

Sali, etterfulgt av fenol/kloroform-ekstraksjon og ethanol-utf elling. Tre mikrogram av RF-formen av M13mpl8/ v- sis(Kpn-Xba)-subklonen beskrevet i eksempel 1 ble restriksjonsbehandlet med Sstl og Sali. Dette resulterer i frigjørelsen av et fragment med 991 bp som spenner over området mellom Sstl-stedet i posisjon 3833 i SSV (Devare et al., ibid., nummereringssystem) og Sall-stedet i linkerområdet til M13mpl8. Det sistnevnte sted er 7 bp borte fra Xbal-stedet hvor v-sis-genet ble innføyet. Etter rensing ved elektroforese i en 0,5% agarosegel med lavt smeltepunkt, ble fragmentet ligert som beskrevet nedenunder.

Et DNA-fragment svarende til det antatte rPDGF Bc_sis~ proteinforløper-aminoendeområde ble syntetisert i henhold til publiserte fremgangsmåter (McBride og Caruthers, Tetra-hedron Lett., 2_4: 245 (1983)). Dette fragment, hvis sekvens er vist i figur 8, svarer til området som spenner fra nukleo-tidet 111 til nukleotid 203 i rPDGF B-protein-cDNA-klonen beskrevet av Josephs et al., Science, 225: 636 (1984). Et Sall-sted ble addert ved den oppstrøms ende for å muliggjøre ligering til pDSVE vektoren. Sstl-stedet ved den nedstrøms ende opptrer naturlig i denne posisjon både i c- sis og v- sis.

Den endelige ekspresjonsvektor ble satt sammen i en 3-veis ligeringsreaksjonsblanding inneholdende 100 ng Sal I-kuttet pDSVE, 2,6 ng av det syntetiske Sall/ Sstl- c- sis-fragment og 25 ng av Ssti/ Sall- v- sis-fragmentet. Etter inkubasjon over natten ved 14°C i nærvær av T4 DNA-ligase, ble reaksjonsproduktene transformert inn i E. coli K12 stamme

DH1. Doble replikafiltere ble laget av ampicillin-resistente kolonier. Et av filtrene ble hybridisert til en radioaktivt merket v- sis-søker som beskrevet ovenfor; den andre ble hybridisert til radioaktivt merket syntetisk Sall/ Sstl-c- sis-fragment. En klon som hybridiserte til begge søkerne ble dyrket i væskekultur og plasmidet som den huset, ble isolert ved standard fremgangsmåter. Restriksjonskartlegging med Xbal, Hindlll, EcoRI og Pstl bekreftet at dette plasmidet, kalt pDSVE/ cv- sis, inneholdt elementer ordnet som vist i figur 9. Aminosyresekvensen til proteinet som var forventet som det første translasjonsprodukt av dette gen, er vist i figur 10.

Eksempel 3

Pattedyrcelletransformasjon, klonutvelgelse og genformering

For å oppnå høynivå produksjon av biologisk aktiv

rPDGF B, ble ekspresjonsplasmidene beskrevet i eksempel 2 innført i en pattedyrcellelinje. Fremgangsmåtene som anvendes er hovedsakelig de som er beskrevet i PCT patent-søknad nr. US84/02021, sider 58 - 63.

CHO-DHFR~-celler (DuX-811)-celler beskrevet av Urlaub et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Tl_ i 4461 (1980), mangler enzymet dihydrofolatreduktase (DHFR) på grunn av mutasjoner i de strukturelle gener, og krever derfor tilstedeværelsen av glycin, hypoxanthin og thymidin i kulturmediene. Plasmidene pDSVE/ c- sis, pDSVE/ v- sis eller pDSVE/ cv- sis ble transfisert sammen med bærer-DNA inn i CHO-DHFR -celler som vokste i medier inneholdende hypoxanthin, thymidin og glycin i 60 mm dyrkningsplater. Plasmid- og bærer-DNA-blandingen ble transfisert inn i CHO-DHFR~-celler.

Etter tre dager ble cellene spredd ved trypsinisering i flere 100 mm kulturplater i medier som manglet hypoxanthin og thymidin. Bare de cellene som er blitt transformert stabilt med DHFR-genet og derved rPDGF B-genet overlever i disse mediene.

Etter 7-21 dager ble kolonier av overlevende celler synlige. Disse transformante kolonier kan etter spredning ved trypsinisering forverres kontinuerlig som en blandet populasjon i medier som mangler hypoxanthin og thymidin, hvilket skaper nye cellestammer (f.eks. CHO-pDSVE/ v- sis, CHO-pDSVE/ cv- sis). Alternativt kan individuelle kolonier trypsini-seres og overføres til brønnene i mikrotiterskåler, hvilket skaper nye klonale cellelinjer ( f.eks. CHO-pDSVE/ c- sis). Cellelinjene CHO-pDSVE/ v- sis, CHO-pDSVE/cv-sis og CHO-pDSVE-c- sis ble deponert 13. mars 1987 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland

20852, som henholdsvis ATCC nr. CRL 9359, CRL 9360 og CRL 9358.

Kulturvæsker fra cellestammene ovenfor, inkludert de som ble utvunnet ved dyrking av CHO-pDSVE/ c- sis-kloner i mikrotiterbrønner, ble testet i en biologisk analyse og i en radioimmunologisk analyse (RIA) som beskrevet i eksempel 4, med hensyn på tilstedeværelse av rPDGF B. Representative 5-dagers kulturvæsker fra CHO-pDSVE/ v- sis og CHO-pDSVEcv- sis-celler inneholdt omtrent 100 - 200 ng/ml rPDGF B som bestemt i begge analysene. Kulturvæsker fra en av CHO-pDSVE-c- sis-klonene, en klon som ble anvendt i etterfølgende arbeide, inneholdt omtrent 20 0 ng rPDGF B pr. milliliter. Kulturvæsker fra celler transformert bare med pDSVE inneholdt ikke påvisbare mengder rPDGF B.

Mengden av rekombinant rPDGF B produsert av de ovenfor beskrevne cellestammer kan økes ved genformering, noe som gir nye cellestammer med større produktivitet. Enzymet i dihydrofolatreduktase som er produktet kodet for av DHFR-genet, kan inhiberes ved hjelp av legemidlet methotrexat (MTX). Nærmere bestemt inhiberes eller drepes celler formert i medier som mangler hypoxanthin og thymidin ved hjelp av MTX. Under de passende betingelser (f.eks. minimale konsentrasjoner av MTX) kan det fåes celler som er resistente mot og i stand til å vokse i MTX. Disse cellene finnes vanligvis å være resistente mot MTX på grunn av en forverring av antallet av deres DHFR-gener, noe som resulterer i forøkt produksjon av DHFR-enzym. De overlevende celler kan igjen behandles med økende konsentrasjoner av MTX, noe som resulterer i cellestammer som inneholder til og med høyere antall DHFR-gener. "Passasjergener" (f.eks. rPDGF B) båret på ekspresjons-vektoren sammen med DHFR-genet finnes ofte også å være for-økt med hensyn til genkopiantall.

Illustrerende for dette formeringssystem ble cellestammene CHO-pDSVE/ c- sis, CHO-pDSVE/ v- sis eller CHO-pDSVEcv- sis underkastet økende MTX-konsentrasjoner (0 nM, 30 nM

og 100 nM). Representative 5-dagers kulturmedieprøver fra hvert formeringstrinn til CHO-pDSVE/ c- sis ble analysert ved hjelp av RIA og bestemt å inneholde henholdsvis 0,2, 2,0 og 2,0 ug/ml rPDGF B. Representative 5-dagers kulturmedieprøver fra hvert formeringstrinn for CHO-pDSVE/- v- sis og CHO-

pDSVE/ cv- sis inneholdt rPDGF B ved henholdsvis 0,15, 1,0 og 1,0 ug/ ml. I disse fremgangsmåtene ble 1 x 10^ celler platet ut i 5 ml medium i 60 mm skåler. 24 timer senere ble mediene fjernet og erstattet med 5 ml serumfrie medier (høy-glucose-DMDM supplert med 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 2 mM L-glutamin). rPDGF B fikk akkumulere i 5 dager i de serumfrie medier. Mediene ble samlet opp for RIA-analyse og cellene ble trypsinisert og tellet. De gjennomsnittlige RIA-verdier på 2,0 yg/ml og 1,0 yg/ml for henholdsvis CHO-pDSVE/ c- sis og CHO-pDSVE/ v- sis (eller CHO-pDSVE/ v- sis) celler dyrket i 30 nM MTX, ga faktiske utbytter på 10 yg/plate og 5 ug/plate. Antallet celler pr. plate var 2,5 x 10 . De effektive produksjonshastigheter for disse dyrkningsbeting-elser var således 0,8 og 0,4 ug/10<**> celler/24 timer.

Cellene i CHO-pDSVE/v^sis-og CHO-pDSVE/ cv- sis-kulturene beskrevet umiddelbart ovenfor var en genetisk heterogen populasjon. Standard sorteringsfremgangsmåter ble anvendt for disse cellene, samt for pDSVE/ v- sis-cellene, for å iso-lere genetisk homogene kloner med den største produksjons-kapasitet. Se avsnitt 1, del 2 i "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologics", 1. juni 1984, Office of Biologics Research Review, Center for Drugs and Biologics, U.S. Food and Drug Administration.

Produktiviteten til de rPDGF B-produserende CHO-cellelinjer beskrevet ovenfor kan forbedres ved hjelp av passende celledyrkningsteknikker. Formeringen av pattedyrceller i kultur krever generelt tilstedeværelse av serum i dyrkningsmediene. En fremgangsmåte for fremstilling av rPDGF B fra CHO-celler i medier som ikke inneholder serum,

er forventet å lette rensingen av rPDGF B fra kulturmediet mye når standard proteinrenseteknikker anvendes. Fremgangsmåten beskrevet nedenunder er i stand til å produsere rPDGF B på en økonomisk måte i serumfrie medier i store mengder som er tilstrekkelige for produksjon.

rPDGF B-produserende CHO-celler, dyrket under standard celledyrkningsbetingelser, anvendes til å inokulere spinner-cellekulturkolber. Cellene formeres som en suspensjonscelle-linje i spinner-cellekulturkolben i medier bestående av

50:50 blanding av høy-glucose DMEM og Ham's F12 supplert med 5% kalverfosterserum, 2 mM L-glutamin, 0,05 mM ikke-essensielle aminosyrer og den passende konsentrasjon av methotrexat. Suspensjonsjoncellekulturen lar de rPDGF B-produserende CHO-celler lett bli utvidet til store volumer.

CHO-cellene, dyrket i suspensjon, anvendes til å inokulere rulleflasker ved en innledende inokuleringstetthet på 7 2

1,5 x 10 synlige celler pr. 850 cm rulleflaske i 200 ml medium. Cellene får vokse til sammenflytning som et ved-heftet monolag over en tre-dagers periode. Mediet som anvendes til denne vekstfasen er det samme som ble anvendt til dyrkning i suspensjon. Ved slutten av den tre-dagers vekst-periode, fjernes de serumholdige medier og erstattes med 100 ml serumfrie medier; 50:50 blanding av høy-glucose DMEM og Ham's F12 supplert med 0,05 mM ikke-essensielle aminosyrer og 2 mM L-glutamin. Rulleflaskene returneres til rulleflaske-inkubatoren for et tidsrom på 1 - 3 timer og mediene fjernes igjen og erstattes med 100 ml av friske serumfrie medier. Inkubasjonen i 1 - 3 timer av de serumfrie medier reduserer konsentrasjonen av forurensende serumproteiner.

Rulleflaskene returneres til inkubatoren for 7 dager, hvorunder rPDGF B akkumuleres i de serumfrie dyrkningsmedier. Ved slutten av den 7-dagers produksjonsfase fjernes de kondisjonerte medier og erstattes med friskt serum-fritt medium for en andre produksjonssyklus. Som en illustrasjon på dette produksjonssystem, inneholdt en representativ 7-dagers, serum-fri mediumprøve rPDGF Bc_s^s ve<^ 1 ug/ml bedømt ved hjelp av RIA- og mitogeneseanalyse. Basert på en beregnet celletetthet på 0,9 - 1,8 x 10 5 celler/cm 2, inneholdt hver 850 cm<2> rulleflaske fra 0,75 til 1,5 x IO<8> celler, og følge-lig var produksjonshastigheten for rPDGF Bc_s^s i ^en 7-dagers, 100 ml kultur 0,10 - 0,19 ug/10<6> celler/24 timer.

Når det ble anvendt en foretrukket fremgangsmåte for rPDGF B-rensing som omfattet affinitetskromatografi (beskrevet nedenunder i eksemplene 6 og 10), ble det funnet at tilstedeværelsen av små mengder serum i det kondisjonerte medium ikke kompliserte rensing. Disse små serummengder

førte imidlertid til forøkte nivåer av rPDGF B . som ut-c-sis

skiltes i mediet av CHO-pDSVE/ c- sis-eller CHO-pDSVE/ v- sis-celler. Det ble derfor tatt i bruk en fremgangsmåte modifisert i forhold til den som er beskrevet ovenfor for stor-skala vevkultur.

Celler ble dyrket i spinnerkolber og inokulert i rulleflasker nøyaktig som beskrevet ovenfor. Etter 3 dager med vekst til sammenflytning, ble mediet fjernet og erstattet med 100 ml av det samme medium inneholdende 1% serum. Flaskene ble returnert til inkubatoren og etter 7 dager ble mediet fjernet. Ytterligere 100 ml kan tilsettes til cellene for en ytterligere 7-dagers akkumuleringssyklus for rPDGF B i mediet. Denne syklus kan gjentas flere ganger før produk-sjonsnivåene avtar i betydelig grad. En representativ 7-dagers prøve inneholdt 3 ug/ml rPDGF Bc_sj_s'

De store mengder aktive rPDGF B produsert ved hjelp

av CHO-celler inneholdende et fremmed rPDGF B-gen var uventet, idet de var 20 - 100 ganger høyere enn de mengder som angive-lig er produsert ved hjelp av flere andre celletyper hvori et rPDGF B-gen tidligere var blitt innført (Huang et al., Cell, _39: 79 (1984); Johnsson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 1721 (1985); Kelly et al., EMBO J., _4: 3399 (1985); eller celler hvor et endogent PDGF B-gen uttrykkes (Nilsson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, J32: 4418 (1985); Marti-net et al., Nature, 319: 158 (1986); Goustin et al., Cell,

41: 301 (1985); Rizzino et al., Dev. Biol., 110: 15 (1985); Westermark et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 8_ 3: 7197

(1986); Fox og DiCorleto, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83: 4774 (1986); Heldin et al., Nature, 319: 511 (1986). I motsetning til tidligere rapporterte resultater er PDGF-mengdene produsert i henhold til foreliggende eksempel tilstrekkelig store til å være praktiske og nyttige.

Mengdene av aktiv rPDGF B utskilt i dyrkningsmediene

av CHO og andre hvirveldyrceller kan økes ved å endre aminosyresekvensen til forløperproteinet som er "oppstrøms" for, eller aminoterminalt til, den fullt ferdige, utskilte form av proteinet. F.eks. kan den delen av rPDGF B-kjedegenet som koder for området til rPDGF Bc_s^s oppstrøms for aminosyrenummer 82 i figur 2, fjernes og erstattes med en DNA-sekvens

som koder for aminoendeområdet til et annet protein, idet dette protein er kjent for å bli utskilt av CHO eller andre hvirveldyrceller i stor mengde. Nærmere bestemt kan den opp-strøms DNA-sekvens erstattes med en DNA-sekvens som koder for aminoendeområdet til proteinet erythropoietin, et protein som kan utskilles fra CHO-celler i stor mengde.

Eksempel 4

Analyse av PDGF- beslektede proteiner i CHO- celler og kondisjonerte medier

4(a) Mitogeneseanalyse av kondisjonerte medier: Prøver av rPDGF B ble testet med hensyn på biologisk aktivitet i en mitogenanalyse. NIH 3T3-celler ble utplatet ved en tetthet på 3 x 10 4 celler pr. brønn i en 24-brønners plate (areale omtrent 2 cm 2), og fikk vokse til sammenflyting ved 37°C i et celledyrkningsmedium bestående av Dulbecco's minimale essensielle medium ("DMEM"), supplert med penicillin (100 enheter pr. ml) og streptomycin (100 yg pr. ml), og inneholdende 10% varmeaktivert kalveserum. Ved sammenflytning ble mediet byttet til det samme supplerte DMEM inneholdende

5% humanblodplate-fattig plasma (Rutherford og Ross, J. Cell Biology, 69_ z 196 (1976) . 48 timer etter bytte av medium ble PDGF-standarder og analyseprøver tilsatt til brønnene og inkubasjon ved 37°C fortsatte i 18 timer. Medier ble fjernet og cellene ble merket i nøyaktig 1 time ved 37°C i 1 ml nysupplert DMEM inneholdende 5% varmeinaktivert kalveserum og 2 yCi pr. ml me- 3H-thymidin (20 Ci/mmol). Etter 1 time ble cellene avkjølt, mediet ble fjernet og cellearkene ble vasket med kald fosfatbufret saltoppløsning (PBS), så med kald 5% trikloreddiksyre (TCA) som fikk stå i 5 minutter på is. TCA ble fjernet, cellene ble vasket 1 gang med ny kald 5% TCA, vasken ble avdampet og cellearkene ble tørket. Innholdene i hver brønn ble oppløst i 1,0 ml 0,25 M natrium-hydroxyd, overført til en glassampulle inneholdende 10 ml "Aquasol II" scintillasjonblanding, og tellet i en Beckman væskescintillasjonsteller. Det ble konstruert en standard kurve som dekket konsentrasjonsområdet fra 2 til 120 mg pr. ml PDGF, og PGDF-aktivitet av prøvene ble beregnet ut fra

standardkurven.

4(b) Radioimmunologisk analyse under anvendelse av

PDGF fra humanblodplater og anti- PDGF- serum; Den spesifikke radioimmunologiske analyse som ble brukt til å påvise og kvantifisere rPDGF B gjorde bruk av PDGF renset fra humanblodplater og polyklonale antisera fra kanin frembragt mot PDGF fra den samme kilde. Humanblodplate-PDGF (0,5 yg) ble jodert under anvendelse av [ 125I] Na og "Iodo-Gen" ved fremgangsmåten til Fraker og Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun., 80: 849 (1978) ble inkubert med en mengde antiserum som resulterte i halvparten av maksimal utfelling av den merkede PDGF i en 60 yl reaksjonsblanding inneholdende RIA-buffer

(10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl; 0,4% "Nonidet P-40" og 0,1% BSA) i 16 timer ved 4°C. En standardkurve ble frem-

bragt ved hjelp av forinkubering av antiserumet med varierende mengder umerket humanblodplate-PDGF i 1 time ved

125

værelsetemperatur før tilsetning av I-PDGF. Ved slutten av reaksjonsperioden ble 50 yl av en vasket, 10% suspen-

sjon av drept Staphylococcus aureus (S. aureus) tilsatt og blandingen ble inkubert i 45 minutter ved værelsetemperatur.

S. aureus ble sammen med bundet, antistoff og antistoff-antigen-komplekset pelletert ved sentrifugering i 2 minutter i en Beckman mikrosentrifuge. Pelleten ble vasket tre ganger med RIA-buffer og den utfelte radioaktivitet ble bestemt i en gamma-strålingsteller. Mengden av inhibering av antistoff- 125I-PDGF-reaksjonen ble plottet mot mengden av blodplate-PDGF-konkurrent tilsatt. Mengden av PDGF immunoreak-tivt materiale i ukjente prøver ble bestemt ved sammenligning av dets kompetitive aktivitet med standardkurven.

4(c) Immunoutfelling av in vivo merkede intracellulære og utskilte PDGF- beslektede proteiner: For å bestemme størrelsen til rPDGF B-proteinene syntetisert i og utskilt av CHO-celler som inneholder sis-vektorer, ble cellene først inkubert med <35>S-cystein i 20 timer for å merke cystein-holdige proteiner. Markøren inkorporert i proteiner antas å nå en stabil fordelingstilstand i løpet av dette tidsrom. Merkede PDGF-beslektede proteiner ble spesifikt påvist ved immunoutfelling med antiserum mot humanblodplate PDGF og

analysert ved hjelp av SDS-PAGE og fluorografi. CHO-pDSVE-c- sis-, CHO-pDSVE/ v- sis-, CHO-pDSVE/ cv- sis- eller som en kontroll CHO-pDSVE-celler ble dyrket i omtrent 80% sammenflytning i 10 cm dyrkningsplater. Cellene ble vasket to ganger med medium som var mangelfullt med hensyn på cystein. Fire milliliter medium som var mangelfullt med hensyn på

35

cystein, inneholdende 0,625 mCi S-cystem ble tilsatt til hver plate. Etter inkubasjon i 20 timer ved 37°C ble mediene

samlet inn og gjort ImM med hensyn på PMSF og 0,'.025% med hensyn på natriumazid, for å inhibere proteasevirkning og bakterievekst. Cellene på hver plate ble lyset med tilsetning av 1,5 ml oppbrytningsbuffer (0,025 M Tris-HCl, pH 8,0;

0,05 M NaCl; 0,5% natriumdeoxycholat; 0,5% "Nonidet P-40";

1 mM PMSF). Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering i 1 minutt i en Beckman mikrosentrifuge. Aliquoter av medier eller celleekstrakter inneholdende like store mengder TCA-uoppløselig merket materiale ble forinkubert med ikke-immunt serum fra kanin. Proteiner som ikke hadde reagert

spesifikt, ble fjernet ved tilsetning av protein A-Sepharose og sentrifugering som ovenfor. Anti-PDGF-serum ble tilsatt til hver supernatant. Etter inkubasjon ved 4°C i 16 timer ble proteinene som reagerte spesifikt, fjernet ved tilsetning av protein A-Sepharose i 1 time ved værelsetemperatur, etterfulgt av sentrifugering som ovenfor. Protein A-Sepharose/ immunkompleksene ble vasket 6 ganger med RIA-buffer. Bundne immunkomplekser ble oppbrudt og frigjort fra protein A-Sepharosen véd koking i 1% SDS i 5 minutter. Hver supernatant ble splittet i to like deler, og gelladingsbuffer (1% SDS, 20% glycerol, 0,1% bromfenolblått), enten med eller uten reduksjonsmiddel (3% 2-mercaptoethanol), ble tilsatt til hver aliquot. Prøvene ble kokt på nytt og så underkastet elektroforese gjennom en 18% SDS-polyacrylamidgel. Gelene ble behandlet med En <3>Hance, tørket og eksponert mot

røntgenfilm i 2 - 10 dager.

Den viktigste stabile intracellulære form av rPDGF B

i celler transformert ved hjelp av sis-holdige vektorer fremkom som et homogent bånd på 23 kd. Etter reduksjon ble denne form omdannet til mindre arter med omtrent 8,5 kd,

7,5 kd og 7 kd.

De viktigste ekstracellulære former av rPDGF B utskilt av disse cellene var heterogene. De to artene med de største styrkene på autoradiogrammene hadde mobiliteter som svarer til 27,5 kd og 25 kd. En art på 30,5 kd var noe mindre sterk. En fjerde art med mye lavere styrke var lik i størrelse med den viktigste intracellulære form, dvs. 23 kd. De reduserte former av ekstracellulær rPDGF B var også heterogene. Det sterkeste bånd hadde en mobilitet som svarer til 13,5 kd. Noe mindre sterke bånd på 17 kd, 16 kd og 12 kd var også til stede. Mye mindre sterke bånd på 8,5 kd, 7,5 kd og 7 kd ble observert, som er like med størrelsene til båndene observert i feltene for redusert intracellulær rPDGF B. Det bør legges merke til at båndstyrker i disse autoradiogrammene ikke nød-vendigvis gjenspeiler den samme fordeling av masse mellom de forskjellige molekylformer, men er heller også avhengig av cysteininnholdet i hver art.

Ingen av artene beskrevet ovenfor ble observert i celleekstrakter eller medier fra kontroll-CHO-pDSVE-celler, heller ikke ble de observert etter omsetning med ikke-immunt kontrollserum. Størrelsene og heterogeniteten til de observerte rPDGF B-proteiner immunoutfelt fra celleprodukter fra CHO-celler transformert med sis-vektorer er i generell overensstemmelse med tidligere observasjoner vedrørende PDGF renset fra humane blodplater.

Eksempel 5

Frembringelse av antisera mot et kyllingveksthormon/ PDGF-fusjonsprotein

5(a) Konstruksjon av pCGPl og transformasjon av E. coli;

For å tilveiebringe en kilde for store mengder antisera som ville reagere med rPDGF B, og derved lette analyse og rensing, ble det konstruert et ekspresjonsplasmid for inn-føring ie. coli. Plasmidet ble utformet for å kode for et fusjonsprotein bestående av de aminoterminale 120 aminosyrene i kyllingveksthormon (CGH) (Souza et al., J. Exp. Zoology, 232: 465 (1984) og de carboxylterminale 136 aminosyrene i proteinet som kodet for av v- sis-genet. Den fullstendige sekvens til det resulterende protein, kalt CGP1, er vist i figur 11.

To mikrogram Ml3mpl8/ v- sis(Kpn-Xba)-RF-DNA ble restriksjonsbehandlet med Bglll og BamHI. Fragmentet med 16 0 basepar som spenner over området mellom Bglll-stedet i posisjon 4061 i SSV (Devare et al., ibid., nummereringssystem) og BamHI-stedet i polylinker området til M13mpl8, ble renset på en agarosegel med lavt smeltepunkt. 75 nanogram av fragmentet ble ligert til 90 ng pCGHTl/CFM414-DNA (Souza et al., ibid.) som var blitt restriksjonsbehandlet med BamHI som kutter etter aminosyrenummer 120 i CGH-genet. Den ligerte DNA ble transformert inn i E. coli K12 stamme JM103.

Ampicillin-resistente kolonier inneholdende v- sis ble identifisert ved hybridisering til en v- sis-søker. Plasmid-DNA ble isolert fra flere slike kolonier og analysert ved restriksjonskartlegging med Xbal, BamHI og EcoRI. En klon, kalt pCGPl, hadde v- sis-DNA innføyet i den korrekte orientering for ekspresjon og ble valgt ut for videre bruk.

5(b) Rensing av CGP1 fusjonsprotein: pCGPl-DNA ble transformert inn i E. coli stamme K12 for ekspresjon. Celler av E. coli K12 stamme AM7 transformert med pCGPl ble deponert 13. mars 1987 ved"American Type Culture Collection,

12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, med depo-neringsnummer 67352. En 20 milliliter kultur ble dyrket over natten ved 28°C i Luria-næringsvæske. En milliliter av denne kultur ble brukt til å inokulere en liter Luria-næringsvæske, og den største kulturen ble inkubert ved 28°C på en roterende plattform. Kulturens absorbans ble overvåket og da absorbansen ved 600 nm var 0,5, ble kulturen overført til 37°C i 13,5 timer for å indusere ekspresjon av fusjonsproteinet. Cellene ble pelletert ved sentrifugering og på nytt oppslemmet i 12 milliliter 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA. Cellene ble brudt opp i et fransk trykkammer og

uoppløselig materiale ble pelletert ved hjelp av sentrifugering ved lav hastighet.

Analyse ved hjelp av SDS-PAGE avslørte et protein i den pelleterte fraksjon omtrent 28 kd som ikke var til stede i ikke-induserte celler eller i celler transformert med vektoren alene. Proteinet var omtrent 60% rent på dette stadium. Den uoppløselige pellet ble oppslemmet i 20 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA og 0,2 mg/ml lysozym, og inkubert i 30 minutter ved værelsetemperatur. "Nonidet P-

40" ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,5% og inkubasjon ble fortsatt i ytterligere 30 minutter. Uoppløselig materiale ble pelletert ved sentrifugering (5 minutter, 10.000 x g),

og pelleten ble vasket med 10 ml vann. Etter sentrifugering ble pelleten omrørt med 4 ml 50 mM Tris-HCl,(pH 8,5), 5% ethanol, 5% natriumlaurat i 30 minutter ved værelsetemperatur. Etter sentrifugering som ovenfor ble natriumlauratvaskingen gjentatt. Pelleten ble oppløst i 4 ml 1% SDS og 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) ved omrøring over natten ved værelsetemperatur. Dette preparat ble bedømt til å være omtrent 80% rent ved hjelp av SDS-PAGE-analyse.

5(c) Immunisering av kaniner, fremstilling av fler-valente sera mot rPDGF B fusjonsprotein CGPl og analyse av antisera: Kaniner ble injisert med CGPl og blodprøve tatt i henhold til den følgende plan: På dag 0 ble det tatt en preimmun-blodprøve, og hver kanin ble injisert intradermalt på flere steder på ryggen med i alt 250 yg CGPl i 1,0 ml av en blanding inneholdende 50% emulgert BACTO/Freunds fullstendige adjuvans H37 Ra (DIFCO 3113-60). 14 dager senere ble kaninene injisert intradermalt med 250 yg CGPl blandet med 50% Freuds ufullstendige adjuvans (DIFCO, BACTO 0639-60-6), som tidligere. En annen, identisk forsterkningsinjeksjon ble gjort på dag 30, og på dag 42 ble det tatt testblodprøver fra kaninene. De resulterende sera ble testet med hensyn på produksjon av anti-CGPl-antistoffer.

Deretter ble kaninene som viste seg å være positive

med hensyn på CGPl-antistoffer, injisert hver 30. dag som ovenfor, med 250 yg CGPl-protein i 50% Freund ufullstendige adjuvans, idet halvparten av dosen ble administrert intradermalt og den andre halvparten intraperitonealt. Det ble tatt blodprøver av kaninene på dagene 14 og 21 etter injek-sjonen. De resulterende sera ble testet med hensyn på anti-CGPl-aktivitet i en bindingsanalyse på ELISA-plate. 96-brønners Immulon-II-brønner ble belagt med CGPl-fusjonsprotein

ved å inkubere brønnene i 16 timer ved værelsetemperatur med 50 yl hver av en blanding inneholdende 5 yg/ml CGPl-protein i en carbonat/bicarbonat-buffer (0,015M Na2C03 og 0,035M NaHCO^ ved pH 9,5). Blandingen ble fjernet og brønnene ble blokkert med 200 yl 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 time ved værelsetemperatur. Blokkeringsmidlet ble fjernet og fortynninger av kaninseraene, både preimmune og immune, ble gjort i PBS og 1% BSA, og anbragt i brønnene, 50 yl i hver.

Etter inkubasjon i 3 timer ved værelsetemperatur, ble oppløsningene fjernet og brønnene ble vasket 3 ganger med PBS. Bundet kaninantistoff ble påvist ved å inkubere hver brønn i 1 time med 50 yl PBS/0,1% BSA inneholdende 1 x 10<5>

125

cpm av I-protein A (NEX146L). Den radioaktive oppløsning ble fjernet og hver brønn ble vasket 5 ganger med PBS. Individuelle brønner ble fraskilt og tellet i Bekcman 5000 gammateller.

Aktivitetskurver ble konstruert ved å plotte kanin-serumfortynning (10 -1 til lo -5) mot tellinger pr. minutt av bundet <125>I-protein-A, og titeren til hvert serum ble bestemt å være den resiproke verdi av den fortynning hvor 50% av den maksimale telling var bundet. To av tre kaniner var sterkt positive med hensyn på antistoffer mot CGPl-protein (nr. 304 og nr. 305), idet de ga titere som varierte fra henholdsvis 5,6 x IO<3> og 1,5 x IO<3> ved start, til 2,6 x IO<4>

3

og 4 x 10 .

Eksempel 6

Konstruksjon av anti-CGPl-agaroseaffinitetskolonne og anvendelse for rensing av rPDGF B fra kondisjonerte medier

6(a) Immunoglobulinrensing og konstruksjon av agarose-affinitetsmatriks: Ti milliliter serum fra kanin nr. 304 (anti-CGPl-titer på mer enn 10 4) ble sentrifugert ved 40.000 x g i 20 minutter. Den klare supernatant ble anbragt på toppen av en 1,5 x 6 cm kolonne av protein A-agarose som på forhånd var blitt ekvilibrert med 0,02 M natrium-fosfat (pH 7,4), 0,14 M natriumklorid, 0,02% natriumaz.id (PBS). Serumet fikk strømme inn i kolonnnen og kolonnen ble

vasket med PBS inntil U.V.-absorbansen til eluatet var mindre enn 0,02 enheter ved 280 nm.

Immunoglobulin absorbert til kolonnen ble eluert med med 0,58% eddiksyre i 0,15 M natriumklorid, og ble lokalisert i resulterende fraksjoner ved hjelp U.V.-absorbans. Fraksjonene som inneholdt immunoglobulin ble nøytralisert

med 1,0 M Tris-buffer (pH 8,0). Etter dialyse mot 3 byttinger av 4 liter med 0,1 M natriumbicarbonat og 0,5 M natriumklorid (pH 8,5) ved 4°C, ble immunoglobulinkonsentrasjonen bestemt ved hjelp av U.V.-absorbans ved 280 nM ved anvendelse av en ektinksjonskoeffisient på 1,46. Utbyttet av kaninimmunoglobulin var 42,9 mg.

Tre gram cyanobromid-aktivert Sepharose 4B ble svellet

i 0,001 M HC1 og vasket på en glasstrakt med 600 ml av den samme oppløsning. Den våte gel ble overført til et 50 ml sentrifugerør og vasket med 20 ml koblingsbuffer (0,1 M natriumbicarbonat og 0,5 M natriumklorid ved pH 8,5). Etter en 4 minutters sentrifugering ved 6 00 x g ble supernatantvæsken fjernet og de 42,9 mg kaninimmunoglobulin i 9,7 ml koblingsbuffer ble tilsatt til Sepharose 4B. Blandingen ble rotert ved 4°C over natten, sentrifugert som ovenfor og supernatanten testet med hensyn på tilstedeværelse av restimmuno-globulin. Mindre enn 3% av opprinnelig immunoglobulin ble tilbake i supernatanten. Effektiviteten av kobling var således bedre enn 99,7%.

Den immunoglobulin-koblede Sepharose 4B ble vasket med

4 sykluser av 0,1 M natriumacetat (pH 4,0) og 0,5 M natriumklorid, etterfulgt av koblingsbuffer. Gelen ble ekvilibrert med buffer E (0,0026 M KCL, 0,1369 M NaCl, ©,0014 M KH2P04

og 0,008 M ^2^0^) , helt over i en 1,5 x 10 cm glasskolonne og vasket ved 4°C med 100 ml buffer E.

6)b) Affinitetsrensing av rPDGF B fra kondisjonerte medier: Kulturvæsker, innhøstet etter 4-7 dager fra rulleflaskekulturer av CHO-pDSVE/ c- sis-, CHO-pDSVE/ v- sis-eller CHO-pDSVE/ cv- sis-celier ble sentrifugert ved 10.000 x g i 20 minutter, og supernatantvæsken sendt gjennom et 0,45 ym filter. 100 til 400 ml filtrert medium ble adsorbert til en 10 ml anti-CGPl-Sepharose-aktivitetskolonne ved en strømnings-hastighet på 30 - 40 ml/time, ved 4°C. Kolonnen ble vasket i rekkefølge med 2 0 kolonnevolumdeler buffer F, (0,5M NaCl, 0,025M Tris-HCl, pH 7,5, og 0,1% "Nonidet P-40"og minst 5 kolonnevolumdeler buffer G (0,15M NaCl, 0,01% "Nonidet P-40"). Bundet rPDGF B ble eluert med buffer H (0,2 M eddiksyre,

0,15 M NaCl og 0,01% NP40) ved en hastighet på 30 ml/time. Fraksjoner av en milliliter ble samlet opp,fraksjoner inneholdende rPDGF B ble lokalisert ved testing av 50 yl aliquoter i Bio-Rad proteinanalysen, og ved hjelp av immuno-logisk analyse i en flekk-immunobindingsanalyse under anvendelse av kanin-anti-CGPl-antiserum som beskrevet nedenunder. Proteinholdige fraksjoner ble slått sammen, dialysert mot 0,1 M eddiksyre og 0,01% "Nonidet P-40" ved 4°C, og så lyofilisert.

6(c) Karakterisering av rPDGF B fra kaninimmunoglobulin- affinitetskolonne ved hjelp av flekk- immunobindings-analysen: Fraksjoner utvunnet fra anti-CGPl-agaroseaffini-tetskolonnen ble analysert med hensyn på rPDGF B ved hjelp av en flekk-immunobindingsanalyse i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet av (Towbind et al., J. Immunol. Methods, 7_2: 313 (1984)). 25 - 100 yl testf raks joner ble adsorbert til nitrocellulosepapir (0,2 ym, nr. BA-83) i en 96-brønners forgreningsapparat (SRC-96). Varierende mengder av CHO-pDSVE/ v- sis-medier inneholdende 10 - 400 ng rPDGF B v-si. s , ble absorbert hver for seg ^ og tjJente som standarder. Nitrocellulosepapiret ble "blokkert" ved rysting i en oppløsning av 10% tørket, ikke-fettholdig melkepulver i PBS (pH 7,4) (0,15M NaCl, 10 mM Na2HP04 (pH 7,4)), inkubert med en 1:50 fortynning av kanin-anti-CGPl-serum i PBS/1% tørket melkepulver og vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,025% Tween 20. Påvisningen av bundet antistoff ble utført med et VectaStein-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Omtrentlige rPDGF B-konsentrasjoner i kolonne-fraksjoner ble beregnet ved hjelp av fargestyrke på kolonne-fraksjon-"flekker" ved sammenligning med standard-"flekker".

6(d) Karakterisering av rPDGF B fra kaninimmunoglobulin-. affinitetskolonne ved hjelp av SDS- PAGE- analyse, Coomassie Blue, sølvfarge og immunoblotting: Lyofiliserte rPDGF B-

fraksjoner fra kaninimmunoglobulin-affinitetskolonnen ble rekondisjonert i 10 mM eddiksyre. Aliquoter (0,2 - 2 yg)

ble fylt (enten ikke-redusert eller redusert med 5% 2-mercaptoethanol) i brønner med enten 15% eller 18% polyacrylamidgeler, 1,5 mm tykke. Elektroforese ble utført i Tris-glycin-buffer (0,025 M Tris, 0,192 M glycin) inneholdende 0,1% SDS, ved 80 - 90 volt i 10 - 12 timer. Proteinbånd ble visualisert ved fremkalling med "Coomassie Blue"-farge eller med sølvfarge (RAPID-A -farge), eller protein ble overført fra den fremkalte gel til nitrocellulosepapir (BA83) ved hjelp av en elektroforetisk overføringsteknikk (Trans-blot-celle, katalog nr. 170 - 3910) under anvendelse av elektrisk strøm for å drive de oppløste bånd fra gelen til overflaten

av papiret. Overføringen ble utført i en buffer inneholdende 0,15 M glycin, 0,02M Tris-base og 20% methanol (volum/volum), i 6 timer ved 60 volt ved værelsetemperatur. "Coomassie Blue"- og sølvfargede geler oppviste to hovedproteinbånd

som fremkom i området til en markør med molekylvekt 25.400 for ikke-reduserte prøver, og to bånd nært opp til en markør med molekylvekt 14.4 00 for reduserte prøver. Ut fra de sølv-fargede geler ble rPDGF B beregnet å være mer enn 95% ren. Nitrocelluloseflekker ble blokkert med 10% geitserum og

2% BSA i PBS i 1 time, inkubert med det primære antistoff i 2 - 3 timer, vasket med KP vaskeoppløsning, inkubert med sekundært biotinylert geit-anti-kanin-serum i PBS i 1,5 timer, og antistoffpåvisningen utført under anvendelse av et VectaStein-sett som ovenfor (se eksempel 6 (c)). Det primære antistoff anvendt til immunoflekkingen var kanin-anti-CGPl-serum (nr. 305) fortynnet 1:50.

To hovedbånd var synlige på flekken fra ikke-redusert rPDG<F><B>v_sis' ved omtrent molekylvekt 26.000 og 30.000, basert på forfargede molekylvektmarkører kjørt på den samme gel og overført til nitrocellulose. Mindre klare rPDGF B-spesifikke bånd var synlige ved litt høyere molekylvekter. I flekken fra den reduserte gel ble to hoved-rPDGF B-spesifikke bånd påvist mellom markøren med molekylvekt 14.400

og markøren med molekylvekt 18.300. I tillegg ble utydelige bånd observert ved molekylvekter som er litt mindre enn

14.400 og ved omtrent 18.00 0.

Eksempel 7

Frembringelse av polyklonale og monoklonale antistoffer mot renset rPDGF B

v - sis

7(a) Immunisering av kaniner og analyse av polyklonale antisera: Kaniner ble immunisert med rPDGF B . (renset

v-sis

som beskrevet i eksempel 6) i det vesentlige som beskrevet for CGPl-fusjonsproteinet i eksempel 5 (c). Sera ble titrert som beskrevet i eksempel 5 (c), under anvendelse av rPDGF B-bundet til mikrotiterplatebrønnene; generelt var v-sis ^

titrene større enn 1 x 10 .

Disse antisera var i stand til spesifikt å påvise så lite som 1 ng rPDGF B eller 5 ng PDGF renset fra humanblodplater i en flekk-immunobindingsanalyse (som beskrevet i eksempel 6 (c)), ved en fortynning på 1:100. Antiseraene reagerte også spesifikt med humanblodplate-PDGF som var merket med radioaktivt jod som beskrevet i eksempel 4 (b), eller rPDGF B merket med radioaktivt jod ved Bolton-Hunter-teknikken (Bolton et al. , Biochem. J., 133: 529 (1973)), i en radioimmunologisk analyse utført som beskrevet i eksempel 4(b) .

7(b) Fremkalling av monoklonale antistoffer: Immunisering av mus og analyse av sera. Fem mus av hunkjønn,

av stamme Balb/c, ble hver injisert først med 10 yg rPDGF B-v-sis renset som beskrevet i eksemp eel 6, i omtrent 0,3 ml av en oppløsning bestående av 0,15 ml PBS (0,15 M NaCl og 0,01 M Na2HP04 (pH 7,4)) emulgert ved lydbølgebehandling med 0,15 ml Freunds fullstendige adjuvans (Calbiochem-Behring-modifikasjon). Musene fikk flere subkutane injek-sjoner på ryggen. Ti dager senere fikk hver mus en for-sterkningsimmunisering intraperitonealt som besto av 10 yg rPDGF B . i 0,3 ml PBS emulgert i MPL/TDM spesialemul-v-sis ' y ' r

sjon R-700. Musene fikk 0,15 ml på flere steder på ryggen, som tidligere, og 0,15 ml intraperitonealt. 2 0 dager senere ble det tatt blodprøver av musene og sera ble analysert med hensyn på antistoffer mot rPDGF B ..

J v-sis

En platebinding-immunoanalyse ble benyttet til å

teste musseraene. rPDGF B v-si. s , (700 yg/ml) i 0,035 M NaHCO3-, og 0,015 M Na2C02 ble bundet til brønnene i en serologisk 96-brønners plate ved å inkubere 50 yl antigenoppløsning over natten ved værelsetemperatur. Fjerning av ikke-bundet antigen ble etterfulgt av blokkering av ikke-bundne steder med 250 yl pr. brønn av PBS inneholdende 5% bovint serumalbumin i 1 time ved værelsetemperatur. 50 yl musserafortynn-inger, fra 10<-1> til 10~<5> i PBS ble tilsatt til de antigen-holdige, blokkerte brønner, inkubert ved værelsetemperatur i 3 timer og fjernet. Brønnene ble så vasket tre ganger med KP vaskeoppløsning. Hver brønn mottok 50 yl PBS inneholdende 1 x 10 5 cpm 125I-kanin-antimus- .immunoglobulin G (IgG) (NEX 1610) med 0,1% bovint serumalbumin. Brønner ble inkubert i 90 minutter, vasket 5 ganger med KP vaskeoppløsning og tellet i en Beckman 5500 gammateller. Tre mus produserte antistoffer mot rPDGF B . med titere som er større eller

2 v-sis

lik med 10 . Disse tre ble gitt to ytterligere forsterknings-immuniseringer, identiske med den første forsterkning i 1 uke etter at blodprøven ble tatt, og 10 dager etter at blodprøven ble tatt.

7(c) Fremkalling av monoklonale antistoffer: Gene-rering og screening av hybridomer: Tre dager etter den siste forsterkning3 simmunisering med rPDGF B v-si. s, ble tre mus av-livet ved cervikal dislokasjon og skyllet med 70% ethanol. Milter ble fjernet aseptisk og plassert i petriskåler (på is) inneholdende Dulbecco's modifiserte Eagle's medium med penicillin G og streptomycin ved henholdsvis 200 enheter og 200 yg pr. ml. Miltene ble fraskåret fett og bindevev, sendt gjennom to skyllinger i friske medier (som ovenfor) og plassert i en steril "stomacher"-pose med 10 ml av det samme medium. Oppbrytning av miltene i "stomacher"-apparatet (Stomacher Lab-Blender 80) i 90 sekunder ble etterfulgt av filtrering gjennom fire lag av steril gas, og de resulterende miltceller ble pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 1000 rpm i en IEC-HN-SII-sentrifuge. Cellepelleten ble vasket to ganger med medier (som ovenfor) inneholdende penicillin-streptomycin , og en gang med medium som

ikke inneholdt noe antibiotika. Cellepelleten ble på nytt oppslemmet i friskt medium og cellekonsentrasjonen ble bestemt ved å telle i et hemocytometer i nærvær av 0,2% trypan-blått.

Musmyelomceller SP 2/0, utvunnet fra Balb/c-stamme,

ble dyrket i HBlOl-medium (NC-200) inneholdende 1% varmeinaktivert bovint fosterserum (FBS). Cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 10 0 0 rpm i 10 minutter, som for milt-cellene, og vasket med Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) som ikke inneholdt noe antibiotikum. Cellekonsentrasjonen ble bestemt ved å telle i et hemocytometer i 0,2% trypan-blått etter resuspensjon i det samme medium.

Milt- og SP 2/0-celler ble blandet i et forhold på

3:1 og sentrifugert ved 1000 rpm i 10 minutter som ovenfor. Supernatantvæsken ble suget bort og cellefusjon ble utført

ved 37°C under anvendelse av polyethylenglycol (PEG) 1500, molekylvekt 500 - 600. Denne fremgangsmåte ble utført med konstant forsiktig omrøring ved tilsetning av det følgende ved de angitte tider: 1,0 ml 50% PEG i DMEM tilsatt i løpet av 1 minutt, med ett minutts omrøring; 1,0 ml DMEM inneholdende 10% bovint fosterserum (FBS) i løpet av 1 minutt;

1,0 ml DMEM inneholdende 10% FBS tilsatt i løpet av ett minutt; og 8 ml DMEM inneholdende 10% FBS tilsatt i løpet av 2 minutter.

De resulterende fusjonerte celler ble sentrifugert ved 1000 rpm i 10 minutter som ovenfor, på nytt oppslemmet i omtrent 45 ml DMEM inneholdende 10% FBS og også inneholdende penicillin G og streptomycin ved henholdsvis 10 0 enheter og 100 yg pr. ml. Cellene ble platet ut med 0,1 ml pr. brønn i 96-brønners plater som på forhånd var ekvilibrert i 9%

C02. Platene ble inkubert ved 37°C i 9% C02.

På dag 2 mottok hver brønn 0,1 ml HAT-medium (13,6 yg/ ml hypoxanthin, 0,176 yg/ml aminopterin og 3,88 yg/ml thymidin) i DMEM inneholdende 10% FBS. Dette medium lar selek-

tivt miltcelle SP 2/0-hybrider overleve, idet ikke-fusjonerte SP 2/0-celler eller de som er fusjonert med andre SP 2/0-celler utsorteres. Ikke-fusjonerte primære miltceller fra fullvoksne mus vil ikke overleve i kultur i mer enn noen

få dager.

På dagene 3, 4, 6, 9 og 12 ble 0,1 ml medium fjernet fra hver brønn, og 0,1 ml frisk HAT i DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt. På dagene 15, 19, 23 og 27 ble 0,1 ml medium fjernet fra hver brønn, og ble erstattet med 0,1 ml DMEM inneholdende 10% FBS og bare hypoxanthin og thymidin

i den samme konsentrasjon som ovenfor. På dag 18 ble kultur-supernatanter fra alle brønnene undersøkt ved hjelp av ELISA-analyse for påvisning av antistoff spesifikk for rPDGF B.

En enzym-bundet immunosorbent-analyse (ELISA) ble benyttet til påvisningen av hybridomer som produserer anti-

stoffer mot rPDGF B .. Brønner i 96-brønners plater ble

v-sis ^

belagt over natten ved værelsetemperatur med 50 yl carbonat/ bicarbonat-oppløsning, som i eksempel 5 (c), inneholdende 0,7 yg/ml rPDGF & v_ s^ s- Antigen ble fjernet og brønnene ble blokkert i 1 time ved værelsetemperatur med 200 yl 5% BSA

i PBS.

Femti mikroliter aliquoter av kulturvæske fra hver hybridombrønn ble inkubert i de rPDGF Bv_s^g-belagte brønner ved værelsetemperatur i 3 timer, fjernet og brønnene ble vasket en gang med PBS inneholdende 0,025% Tween 20 (vaske-oppløsning) . Pepperrotperoxydase-merket geit-antimus-IgG

ble fortynnet 1:300 med PBS og 50 yl ble inkubert i hver brønn i 2 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble vasket 5 ganger med vaskeoppløsning, slått tørre og fargereaksjon fremkalt med 125 yl ABTS fargereagens. Brønnene ble avsøkt ved 414 nm under anvendelse av en Titertek Multiscan.

Av de 432 masterplatebrønnene som ble undersøkt, var 173 signifikant positive med hensyn på reaksjon med rPDGF B .. Blant de positive ble celler fra 22 brønner

v-sis c

valgt ut for videre formering og kloning. Cellene fra hver av de utvalgte brønner ble fortynnet i 3 x 96 brønner hver, noe som gir opphav til individuelle kloner, eller i noen tilfeller et lite antall kloner pr. brønn. Etter 17 dager med videre dyrking i DMEM-kulturmedium inneholdende 10%

FBS, ble kulturvæsker fra alle brønnene som inneholdt én eller flere cellekloner, testet ved hjelp av ELISA-analyse

som beskrevet ovenfor. Anti-rPDGF B . -antistoff ble på-v-sis

vist i noen brønner i plater som utgjorde 15 av de 22 opprinnelige masterplatebrønnene, og tilsvarende celler ble underkastet ytterligere kloning. Av disse 15 ble cellene svarende til brønner med høyestetiter valgt ut for rekloning, hvorved man fikk éncellekloner.

Fra en ytterligere ELISA-analyse av éncelleklonene ble det valgt ut 12 kulturer som produserte de høyeste titere, som utgjorde 12 forskjellige brønner i de opprinnelige master-platene. Hver av de utvalgte hybridomkulturer fikk vokse for ytterligere testing og ascitesproduksjon i mus.

7(d) Produksjon og rensing av høytiter monoklonale antistoffer: Utvalgte positive éncellehybridomkloner fikk vokse i kultur, celler ble innhøstet, sentrifugert ved 700 rpm i en IEC-HNSII-sentrifuge i 5 minutter, vasket en gang med DMEM (ikke noe serum) og en gang med PBS. Vaskede hybri-domceller ble oppslemmet ved 2 x 10 7 celler/ml i PBS, og 5 x 10 c celler ble injisert intraperitonealt i Balb/c-mus av hunkjønn, 6-8 uker gamle, eller iLCDFI-hybridmus av hun-kjønn fra den samme kilde.

Ascitesvæske utviklet seg i injiserte mus etter 8-14 dager. Ascitesvæsken ble innhøstet, sentrifugert ved 2000

rpm (IEC-HN-SII) i 10 minutter, og den klare supernatant-væske ble benyttet videre som en kilde for monoklonalt antistoff.

Reaktivitet og titer til de monoklonale antistoffer i ascitesvæskene ble analysert mot rPDGF Bv_sj_s ved hjelp av en platebindingsanalyse hovedsakelig som beskrevet i eksempel 5(c) hvor rPDGF B . ble belagt ved 0,7.yg/ml, og 10-

v-sis

gangers fortynninger i serie av ascitesvæsker ble gjort i PBS inneholdende 1% BSA. I dette tilfelle ble det murine mono-125

klonale antistoff påvist med I-kanm-anti-mus-IgG-antistoff (NEX 161), omtrent 10 <5>cpm (Beckman 5500 gammateller) pr. brønn. Titere av individuelle ascitesvæsker ble beregnet som den resiproke verdi av den fortynning hvor 50% av maksimal binding oppsto. Titere av ascites fra 12 forskjellige monoklonale antistoff-produserende kloner varierte fra

1,5 x IO<4> til 7,5 x IO<5>. Resultater er gitt i tabell 1.

Rensing av immunoglobulin fra hybridomaascitesvæsker ble utført ved hjelp av en 2-trinnsrenseplan hvor klaret ascitesvæske først ble sendt gjennom en "CM-Affi-Gel Blue"-kolonne som primært . binder albumin og proteaser, men som lar immunoglobuliner passere gjennom. Dette trinnet ble ut-ført med PBS som vaskebuffer. Ikke-adsorbert materiale ble fortynnet med et like stort volum bindingsbuffer (MAPS II)

og adsorbert til en 1,5 x 6 cm "Affi-Gel Protein A"-kolonne (MAPS II) som beskrevet i eksempel 7(b). Resulterende rensende immunoglobulinfraksjoner ble dialysert mot PBS,

og immunoglobulinkonsentrasjoner ble beregnet ut fra absorbansen ved 280 nm, ved bruk av en ekstinksjonskoeffisient på 1,46.

7(e) Karakterisering av monoklonale antistoffer mot rPDGF_Bv_ Reaksjon med PDGF fra humanblodplater:

Individuelle monoklonale antistoffer ble analysert med hensyn på deres evne til å gjenkjenne naturlig humanblodplate-PDGF under anvendelse av en modifikasjon av flekk-immuno-bindingsanalysen (som beskrevet i eksempel 6(c)). Nitro-cellulosepapirkvadrater (2,5 cm 2) ble delt opp i 5 avsnitt. Hvert avsnitt ble flekket i et bestemt mønster med 1 yl PBS-oppløsning inneholdende en av de følgende: 10 ng rPDGF Bv_sj_s/ 50 ng rPDGF Bv_sig, 10 ng blodplate-PDGF, 50 ng blodplate-PDGF eller 50 ng av en ikke-beslektet vekstfaktor (EGF). Nitrocelluloseflekkene ble blokkert ved å ryste med 10% hesteserum, 2% BSA i PBS i 1 time. Blokkeringsoppløsningen ble fjernet og flekken ble omsatt med én av ni primæranti-stoffer (8 rPDGF B monoklonale antistoffer og et kanin-anti-blodplate-PDGF-serum) i 3 timer og vasket med KP vaskeopp-løsning. Bundet primært antistoff ble påvist ved omsetning med et sekundært biotinylert hest-anti-mus-IgG-antistoff, et avidin-pepperrotperoxydase-kompleks, og substratfarge-reagens HRP (BioRad 1.70-6534) inneholdende 4-klor-l-nafthol; 60 mg av det sistnevnte reagens ble oppløst i 20 ml methanol, fortynnet i 100 ml PBS (0,2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 7,4) inneholdende 60 yl 30% hydrogenperoxyd.

Alle åtte monoklonale antistoffer testet ga forskjellige reaksjoner med både 10 og 50 ng rPDGF Bv_s^s. Seks av de åtte monoklonale antistoffer (betegnet som nummer 162,

30, 20, 219, 191 og 52) reagerte med 50 ng blodplate-PDGF,

og et av disse seks reagerte med 10 ng blodplate-PDGF. Kanin-anti-blodplate-PDGF-serum påviste lett 10 ng blodplateav-ledet materiale. Ingen reaksjon var synlig mellom noen av antistoffene og den ikke-beslektede proteinvekstfaktor.

Reaktivitet og spesifisitet til monoklonalt antistoff ble også fastlagt i et Western immunoblot-format som i eksempel 6(c) hvor både redusert og ikke-redusert rPDGF B-v-sis ble testet. Alle 12 monoklonale antistoffer *påviste

lett de to hovedbåndene av ikke-redusert rPDGF B . som

v-sis migrerte som proteiner med molekylvekt 25.000 og 27.500 i 15% ikke-reduserende polyacrylamidgeler, men ingen ga noen synlig reaksjon med redusert rPDGF B kjørt på identiske geler og overført til nitrocellulose under identiske betingelser. 7(f) Karakterisering av monoklonale antistoffer mot r PDGF B.^ sj_ B'' Undertypeanalyse: De 12 utvalgte kloner av monoklonalt antistoff ble undersøkt med hensyn på deres immunoglobulinundertype.. ved benyttelse av et identifikasjons-sett med mus-immunoglobulin-undertype (katalog nr. 100 036) . For hvert antistoff som ble testet, ble 9 brønner i et 96-brønners brett belagt med 50 yl av en oppløsning av 0,7 yg/ ml rPDGF Bv_sj_s i carbonat/bicarbonat-buf f er (som i eksempel 5) over natten. Gjenværende proteinbindingssteder ble blokkert ved inkubasjon med 200 yl pr. brønn av 2% BSA i PBS i 2 timer ved værelsetemperatur. Til hver brønn ble det tilsatt 50 yl av et av de monoklonale antistoffer (omtrent 0,5 yg immunoglobulin), og inkubasjon ble fortsatt i 3 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble vasket med 200 yl vaskebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,0; 0,05% Tween 20; 0,01% thimeri-sol) fire ganger. Femti mikroliter av hvert kanin-anti-mus-underklasse-spesifikt immunglobulin, rekondisjonert i henhold til produsentens instruksjoner, ble tilsatt til hver av 8 brønner pr. monoklonalt antistoff. Normalt kaninserum ble tilsatt til en niende brønn som kontroll. Inkubasjon i 2 timer ved værelsetemperatur ble etterfulgt av fire vask-inger som beskrevet ovenfor. 50 yl peroxydasemerket geit-anti-kanin-IgG ble tilsatt til hver brønn ved inkubasjon i 1 time ved værelsetemperatur. Etter fire ytterligere vasker ble farge fremkalt ved tilsetning til hver brønn av 100 ul nyfremstilt ABTS-H202 (1 mM ABTS i 0,03% H202). Etter inkubasjon i 20 til 30 minutter ble fargereaksjonen stanset (ved hjelp av 2,5% SDS) og farge ble kvantifisert ved å lese av platene i en Titertek Multiscan ved 414 nm. Resultatene er gjengitt i tabell 1. Seks hybridomer produserte antistoffer av IgG-j^-undertype, mens tre ble klassifisert som IgG2a , og to ble klassifisert som IgG2b. I tabell 1 er antistofftiter angitt som den resiproke verdi av den fortynning hvor 50% av den maksimale cpm er bundet.

7(g) Analyse med hensyn på nøytralisering av

rPDG<F> B vi - si. s mitog2en aktivitet: Monoklonale antistoffer fremkalt mot rPDGF B . ble testet med hensyn på evne til å

v-sis J c

nøyJ tralisere den biol^ ogiske aktivitet av rPDGF B v-si. s i den mitogene analyse for H-thymidin-inkorporering i murine NIH-celler (som i eksempel 4). Immunoglobulinfraksjonen fra hver av 6 ascitesvæsker, frembragt fra 6 forskjellige hybridomer, ble isolert ved hjelp av kromatografi på en protein A-agarose-kolonne. Den bestemte teknikk som ble benyttet, var Bio-Rads "Affi-Gel Protein A MAPS II" system for rensing av monoklonalt antistoff. 2-5 milliliter klaret ascitesvæske fortynnet 1:1 med bindingsbuffer ble adsorbert til en 5 ml kolonne renset protein A og koblét til kryssbundne agarosekuler og forekvilibrert med bindingsbuffer tilveiebragt av produsenten. Etter bortvasking av ikke-bundet protein fra kolonnen med omtrent 10 volumdeler bindingsbuffer, ble det bundne immunoglobulin eluert ved pH 3, og immunoglobulinfraksjonene lokalisert ved avlesning av absorbans ved 280 nm. Sammenslåtte fraksjoner ble nøytralisert med 3,0 M Tris-buffer (pH 9,5) og dialysert mot PBS. Immunoglobulinkonsentrasjonen ble bestemt.

Seriefortynninger av de rensede monoklonale immuno-g3 lobuliner ble inkubert med 8 ng 3 rPDGF B v-si. s ved 4°C i 12 timer før hver blanding ble anbragt i en individuell bioana-lysebrønn i standard-mitogeneanalysen som beskrevet i eksempel 4. Antistoffer fra klon nr. 162 var mest effektiv når det

o 3

gjelder å nøytralisere virkningen av rPDGF B pa H-thymidm-opptak, idet de ga aktivitet ved mindre enn 10 ng. Antistoffer fra klonene 155, 133, 52 og 30 var middels gode med hensyn til aktivitet, men nøytraliserte fortsatt. Klon 232 oppviste ingen aktivitet.

7(h) SDS- PAGE- analyse av rensede monoklonale antistoffer: Immunoglobulinfraksjonene fra ascitesvæskene med monoklonalt antistoff ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE på 12,5% geler. Omtrent 2 yg av hvert immunoglobulin ble kjørt i sammenligning med den samme mengde immunoglobulin fra ikke-fraksjonert ascites. Alle prøver ble redusert ved behandling ved 10 0°C i 5 minutter i 5% 2-mercaptoethanol før anbringelse på gelen. Elektroforese og sølvfarging av geler ble ut-

ført som beskrevet i avsnitt 6(d). De fargede geler avslørte en høy grad av renhet for alle immunoglobulinfraksjoner og tilstedeværelsen av mengder av tung- og lett-IgG som forventet ut fra de påfylte mengder. Hver immunoglobulinprøve som ble analysert inneholdt tung- og lett-kjedebestanddeler som migrerte på gelen til de forventede molekylvektposi-sjoner med henholdsvis 50.000 og 25.000.

Eksempel 8

Utvikling av immunologiske analyser for PDGF under benyttelse av monoklonale og polyklonale antistoffer mot rPDGF Følsomme og svært spesifikke immunologiske analyser kan anvende monoklonale antistoffer mot rPDGF B i en rekke forskjellige kombinasjoner og variasjoner, og kan benytte en rekke forskjellige påvisningsskjemaer. Slike analyser kan anvendes til diagnose og forutsigelse av prognose i visse patologiske tilstander, f.eks. visse former for kreft.

Renset monoklonalt antistoff 162 (50 yl) ble adsorbert på brønnene i Nunc 96-brønners mikrotiterplater ved 5 yg/ml i 0,05 M natriumcarbonat (pH 9,2) i en inkubasjon over natten ved værelsetemperatur. Oppløsningen ble suget bort og de gjenværende proteinadsorpsjonssteder ble blokkert med 150 yl av 2% gelatin i 45 minutter ved værelsetemperatur. Oppløsningen ble suget bort og brønnene ble skylt en gang med PBS inneholdende 0,025% Tween 80. 50 yl antigen i PBS inneholdende 0,025% Tween 80 og 0,2% gelatin ble tilsatt til hver brønn før inkubasjon i 1,5 - 2 timer ved værelsetemperatur .

Antigenoppløsningen ble fjernet og brønnene ble vasket en gang med PBS inneholdende 0,025% Tween 80. Et polyklonalt antiserum fra kanin frembragt mot rPDGF B ble fortynnet 1:1000 i PBS inneholdende 0,025% Tween 80 og 0,2% gelatin, og 50 ul ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubasjon ved værelsetemperatur i 1 - 1,5 timer ble oppløsningen fjernet. Brønnene ble vasket en gang med PBS inneholdende 0,025% Tween 80. Et kommersielt preparat av geit-anti-kanin-immunoglobulin, koblet til pepperrotperoxydase, ble fortynnet 1:4000 i PBS inneholdende 0,025% Tween 80 og 0,2% gelatin, og 50 ul ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubasjon i 1 - 1,5 timer ble oppløsningen fjernet og brønnene ble vasket fire ganger med PBS inneholdende 0,025% Tween 80. ABTS per-oxydasesubstratoppløsningene A og B ble nyblandet i et forhold på 1:1, og 100 ul ble tilsatt til hver plate. Absorbansen til hver brønn ble bestemt ved 414 nm i en Titertek Multiscan ELISA plateavleser 5-20 minutter etter tilsetning av substratet. En representativ standardkurve frembragt ved hjelp av denne analyse er vist i figur 12.

Eksempel 9

Konstruksjon av monoklonalt antistoff/ agarose- affinitets-

kolonner og anvendelse til rens ing avrPDGF B . fra

v- sis kondisjonerte medier: 9(a) konstruksjon av affinitetskolonner med monoklonalt antistoff: Rensede monoklonale antistoff-immunoglobulin 52 og 162 ble koblet til CnBr-aktivert Sepharose 4B for utvikling av affinitetskolonner. Koblingen ble utført som beskrevet i eksempel 6(d). Forholdet mellom immunoglobulin og Sepharose 4B var 3,5 mg pr. ml Sepharose for monoklonalt antistoff 52, og for monoklonalt antistoff 162 var forholdet 3,0 mg/ml.

9(b) Rensing av rPDGF B under anvendelse av monoklonale affinitetskolonner: Affinitetsrensing av rPDGF B fra dyrkningsmedier fra rPDGF B-produserende celler (f.eks. CHO-pDSVE/ c- sis, CHO-pDSVE/ v- sis eller CHO-pDSVE/ cv- sis), kan utføres ved å bruke kolonner med monoklonalt antistoff 52 og 162 ("Seph 52" og "Seph 162"). Driften av de to affinitetskolonnene med monoklonalt antistoff var i det vesentlige som beskrevet i eksempel 6 for kanin-anti-CGPl-immunoglobulin-affinitetskolonnene. Fra 0,1 til 3,0 1 dyrk-

ningsvæsker fra CHO-rPDGF B ble adsorbert til affinitetskolonnene (10 ml), vasket med buffere F og G ved strømnings-hastigheter på 30 - 40 ml/time og eluert med 1,0 M eddiksyre, 0,15 M NaCl.

Proteinholdige (PDGF) fraksjoner ble lokalisert ved hjelp av Bio-Rad proteinanalysen, mitogenanalyse med hensyn på <3>H-thymidin-inkorporering, eller i noen tilfeller, ved flekk-immunobindingsanalyse. rPDGF B-holdige fraksjoner ble slått sammen og lagret for senere analyse som beskrevet nedenunder.

Eksempel 10

Karakterisering av renset rPDGF B

10(a) SDS- PAGE- analyse av umerket og merket rPDGF B;

For å bestemme renheten til rPDGF B kromatografert på Seph 52 eller, Seph 162 affinitetskolonne, ble den analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Umerket rPDGF B ble påvist ved hjelp av sølvfarging, en teknikk som muliggjør påvisning av små mengder av et protein, eller ved farging med Coomassie Brilliant Blue. Selv om sølvfarging generelt er en mer føl-som metode, påvises noen proteiner bedre med Coomassie-farging. Typiske resultater avslørte tilstedeværelse bare

av rPDGF B-polypeptider. Størrelsene til disse peptidene var de samme som de som ble påvist når in vivo merkede proteiner ble immunoutfelt ved hjelp av anti-PDGF-serum fra CHO-pDSVE/ c- sis-medium (eksempel 4). Ingen andre proteiner ble observert i slike høyrensede preparater. Ettersom 2 yg protein ble fylt på denne gel og følsomheten under disse betingelser er 20 - 50 ng, beregnes renheten av rPDGF B til å være mer enn 95%. En immunoflekk-analyse (se eksempel 6c) av dette preparat av rPDGF B under anvendelse av et polyklonalt antiserum fra kanin mot CGPl kyllingveksthormon/PDGF-fusjonsprotein (eksempel 5) viste at alle proteinarter observert ved hjelp av sølvfarging var PDGF-beslektede.

Affinitetskolonnerenset rPDGF B ble jodert ved hjelp av fremgangsmåten til Bolten og Hunter, ibid. Den merkede rPDGF B (2 x IO<5> cpm) ble elektroforesebehandlet gjennom en SDS-polyacrylamidgel, tørket og eksponert til røntgenfilm i 16 timer. De eneste bånd som ble påvist i autoradio-grammet, svarte til rPDGF B-polypeptider. Ettersom selv 50 cpm i et bånd ville ha vært påvisbart under disse betingelser, viser denne analyse at renheten av denne bestemte mengde rPDGF B, renset ved hjelp av disse metodene, var mer enn 9 9%.

10(b) Spesifikk mitogenaktivitet sammenlignet med PDGF fra blodplater: Fraksjoner av rPDGF B utvunnet fra kaninimmunoglobulin-affinitetskolonnen, og sammenslåtte frak-sjonsprøver ble testet med hensyn på biologisk aktivitet i en mitogenanalyse som beskrevet i eksempel 4a. Alle rPDGF B-holdige affinitetskolonnefraksjoner var aktive i mitogenana-lysen, og konsentrasjonene beregnet ut fra bioanalyse-standard kurven korrelerte godt med konsentrasjonene som ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad proteinanalyse, og ved hjelp av flekk-immunobindingsanalyse . Den spesifikke aktivitet av rPDGF B var lik med flere porsjoner PDGF renset fra humanblodplater.

10(c) Analyse av N- terminal aminosyresekvens: rPDGF B renset som beskrevet i eksempel 9 ble underkastet N-terminal sekvensanalyse og de første 14 aminosyrene i rPDGF B C™ _ S1 .s ble identifisert som Ser-Leu-Gly-Ser-Leu-Thr-Ile-Ala-Glu-Pro-Ala-Met-Ile-Ala. Disse er de samme 14 aminosyrene som opptrer ved N-enden i B-kjeden til PDGF renset fra humanblodplater (Johnsson et al., supra). Små prosentandeler av aminoendene begynte ved aminosyre nr. 33 (Thr-Asn-Ala-Asn-Phe) og ved aminosyre nr. 80 (Lys-Lys-Pro-Ile-Phe), noe som også er likt med resultatene funnet med PDGF renset fra blodplater (Johnsson et al., supra). De aminoterminale sekvenserings-resultater av rPDG<F> B v-si. s var like, med unntak av at amino-syrernr. 6 og 7 var Ser-Val i stedet for Thr-Ile, i overensstemmelse med tidligere publiserte resultater (Devare et al., ibid.). Disse resultater indikerer at rPDGF B bearbeides i sin aminoende i CHO-celler på samme måte som den gjøres i humanblodplater.

De små mengder av aminoender som begynner ved aminosyrer nr. 33 og 80 er sannsynligvis resultatet av virkningen av spesifikke proteolytiske enzymer som finnes inne i CHO-celler og blodplater. For noen formål kan det være ønskelig å oppnå et rPDGF B-produkt som ikke inneholder disse indre spaltinger. Dette resultatet kan oppnåes ved å endre aminosyresekvensen i spaltingsstedene på en måte som forhindrer gjenkjenning av de bestemte proteolytiske enzymer som er involvert. Således kan de bestemte aminosyrerester nr. 32, 33, 79 og/eller 80, samt umiddelbart tilgrensende rester, endres for å variere aminosyrer ved å endre DNA-sekvensen som koder for disse restene.

10(d) Analyse av carbohydratinnhold; Glycosylering av proteiner kan være en av to typer. Den vanligste type er N-bundet, hvor sukkerrester bindes til asparagin på steder med sekvensen: asn-X-thr/ser. I den andre typen, O-bundet glycosylering, bindes sukkerrester til seriner eller threo-niner; ingen annen konsensussekvens for denne type glycosylering er blitt identifisert.

PDGF renset fra humanblodplater inneholder omtrent

7 vekt% carbohydrat (Deuel et al., J. Biol. Chem., 256; 8896

(1981)). Fordelingen av sukkerrester mellom A- og B-kjeden er ukjent. Det kan imidlertid utledes at B-kjeden ikke inneholder N-bundet carbohydrat ettersom sekvensen asn-X-thr/ser ikke opptrer i den. Det gjenstår å bli påvist hvorvidt 0-bundet glycosylering oppstår i B-kjeden til blodplate-PDGF.

For å bestemme om rPDGF B . produsert ved hjelp v—sxs

av CHO-celler inneholder carbohydrat, ble det utført to analyse-typer. Den første analyse overvåket endringer i den elektro-foretiske mobilitet til proteinet under SDS-PAGE, etter inkubering med glycosidasene neuraminidase, endoglycosidase F eller O-glycanase. Resultater av disse forsøk indikerte at bare en svært liten bestanddel av proteinet ble endret ved behandling med disse enzymene.

Den andre form for carbohydratanalyse omfattet fri-gjørelse av sukkerrester ved hjelp av syremethanolyse, og kvantifisering ved gasskromatografisk analyse, i henhold til fremgangsmåten til Zanetta et al., J. Chromatogr., 6_9: 291

(1972). Resultatene av denne analyse var: 0,025 vekt/vekt% fucose, 0,125% galactose, 0,075% mannose, 0,038% N-acetyl-glucosamin og 0,525% sialinsyre.

Ut fra disse data kan det konkluderes med et

rPDGF Bv_s^s produsert ved hjelp av CHO-celler inneholder mindre enn 1 vekt% carbohydrat.

10(e) Kjemotaktiske egenskaper: PDGF renset fra humanblodplater er blitt påvist å være kjemotaktisk for hybro-blastere, glatte muskelceller, granulocytter og monocytter (Deuel et al., J. Clin. Invest. , . 69_: 1046 (1982); Seppa et al., J. Cell. Biol., 92.: 584 (1982); Grotendorst et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7_8: 3669 (1981). For å bestemme om rPDGF B deler disse egenskaper, ble den testet i kjemo-taksis-analyser som beskrevet av Deuel et al., supra. rPDGF B ble funnet å være kjemotaktisk for alle celletypene ovenfor, i en grad som er lik med PDGF renset fra humanblodplater.

10(f) In vivo aktivitet av rPDGF B: Sårkamre ble konstruert fra 3,0 x 3,5 cm stykker av klede av rustfri stål-wire (40 mesh, 0,010 mesh-wire). Wirekledet rulles rundt en pinne for å frembringe en sylinder som er 3,5 cm lang og 0,95 cm i diameter. En ende av sylinderen trykkes sammen for å danne en butt ende, mens en skillevegg av silikongummi festes til den åpne enden. Det fullførte sårkammer varmeste-riliseres (120°C i 30 minutter) før implantering.

Sårkamre implanteres subkutant på ryggen til Sprague-Dawley-rotter av hankjønn (350 - 400 g) i lommer laget av

et 2 cm skalpell-innsnitt og stump dissikering til nivået på panniculus carnosus. Etter implantering av kamrene, lukkes sårene med klemmer av rustfritt stål. På denne måte mottar hvert dyr to kamre på skuldernivå og to ytterligere kamre på nivå med bakbenene.

Idet man begynner tre dager etter kammerimplantering, injiseres 0,1 ml kontrolloppløsningsmiddel eller 0,1 ml test-artikkel i kammeret ved gjennomtrengning av silikongummi-pluggen med en kanyle, injeksjonsmønstret varieres syste-matisk blant dyrene for å forhindre anatomisk lokalisering av kamre fra å influere på resultatene. 24 timer etter den niende daglige injeksjon fjernes kamrene og innholdene skrapes ut på en tarert veieskål for bestemmelse av nettovekt. I tillegg bestemmes totalt protein ved hjelp av BioRad proteinanalysen, total DNA ved hjelp av metoden til Vytasek, Anal. Biochem., 120: 243 (1982), og totalt hydroxyprolin ved hjelp av metoden til Berg, Methods Enzymol., 82: 372

(1982) .

Tabell II viser virkningen av daglig av 5,0 yg rPDGF B-på oppsamlingen av granulasjonsvev i sårkamrene. Data-ene viser at den totale nettovekt av oppsamlet vev var nesten tre ganger høyere enn det som ble oppnådd fra kamre injisert med kontrolloppløsningsmidler. Lignende økninger ble lagt merke til i de totale mengder av protein, DNA og hydroxyprolin som ble avsatt innenfor kamrene.

Eksempl 11

Demonstrasjon av utnyttbarheten av rPDGF B i helingen av sår

Unge, 300 - 350 g fullt utvokste Sprague-Dawley-rotter av hankjønn fikk anbragt 6 cm innsnitt gjennom huden, 1,5 cm på hver side av snittlinjen, under bedøvelse med pentobarbi-tol (16 mg). En suspensjon av bovint kollagen (Xiderm II) ved 10 mg/ml, enten med eller uten rPDGF B, ble anbragt på kantene av de åpne sår (0,1 ml/sår). Sårene ble lukket med tre kirurgiske klemmer. På tidspunktet for innhøsting ble hele rygghuden til rotten fjernet. Ved å bruke en sjablong med parallelle kirurgiske kniver ble to 8 ml strimler inn-høstet mellom klemmer for hvert innsnitt.

Den maksimale belastning tolerert av hudens sår ble målt med Tensometer 10. Målinger ble utført på strimler strukket 10 mm pr. minutt, idet den maksimale belastning ble registrert på en kurve. Målinger av bruddfasthet ble ikke utført på sår som viste tegn på infeksjon, for stor blødning eller dårlig sammenklemming (mindre enn 5% av alle sår) .

Resultatene av denne undersøkelse, oppsummert i tabell III, indikerer at rPDGF B signifikant øker bedringen i strekk-fasthet hos hudsår under heling når den påføres på den beskrevne måte i mengder større eller lik 5 yg pr. sår.

Eksempel 12

Redusert sårheling er et karakteristisk trekk ved mange sykdomstilstander. Et klassisk eksempel er insulinav-hengig sukkersyke hvor forstyrret blodomløp og nedsatte mono-cytt/makrofag- funksj oner er forbundet med en forminsket grad av sårheling. Ettersom disse tilstander vil kunne resultere i en redusert utsendelse av vekstfaktorer til sårstedet, var det av interesse å finne ut om direkte levering av rekombinant human PDGFk_s-j_s kunne omgå denne defekt. Følgelig ble rotter veiet og så gjort diabetiske ved hjelp av en enkel intravenøs injeksjon av streptozotocin (70 mg/kg kroppsvekt) på tidpunktet for implantering av subkutane sårkamre. Sårkamrene er beskrevet i eksempel 10(f). Idet man begynte 3 dager deretter, ble sårkamre injisert daglig med enten 0,1 ml kontrolloppløsningsmiddel eller oppløsningsmiddel inneholdende 1,0 yg rekombinant PDGF, .. Behandling fortsatte i 9 på hver-b-sis

andre følgende dager hvoretter rottene ble veiet på nytt, blodprøver ble erholdt for plasmaglucoseanalyse og sårkamre ble fjernet for bestemmelse av dannelse av granulasjonsvev.

De oppnådde resultater ble så sammenlignet med resultatene fra en samtidig gruppe av ikke-diabetiske rotter hvis kamre var blitt injisert med kontrolloppløsningsmiddel.

Som vist i tabell IV ble det observert alvorlig hyper-glycemi ledsaget av markert vekttap og et betydelig svinn i sårkammer-granulasjonsvev i rotter forbehandlet med streptozotocin. Plasmaglucose hos diabetiske rotter ble således for-høyet omtrent 4 ganger sammenlignet med den ikke-diabetiske gruppe. Mens de diabetiske dyrene tapte 35 - 40 g i løpet av undersøkelsen, vant de ikke-diabetiske dyrene dessuten en lignende vektmengde. Ingen av disse diabetiske virkninger ble endret ved injeksjon av PDGF, . i sårkamrene. I motsetning

J J b-sis ^ til dette reverserte lokal administrering av rekombinant PDGFj3_s^s fullstendig den diabetes-induserte mangel på akku-mulering av totalt protein, DNA og hydroxyprolin i sårkamrene. Disse resultater indikerer at lokal administrering av denne rekombinante vekstfaktor kan snu mangler ved sårheling som er forbundet med slike tilstander som sukkersyke, uten å endre sykdommens underliggende systemiske patofysiologi.

Eksempel 13

Utnyttelse av rPDGF B i behandling av sår i kaninørehull-modellen

I preliminære forsøk har rPDGF B utvist virkningsfull-het når det gjelder å fremme helingen av kaninørehull-sår.

I denne modellen fjernes plugger av vev med 6 mm i diameter ned til nivåer for brusk. Gjenvekst av vev omfatter både granulasjonsvev og epitel. Som vist i figur 13 ble det gjort 3 målinger av tverrsnitt gjennom midten av hvert sår til for-skjellig tidspunkt etter at sårene ble laget. To av målingene, dvs. maksimal dybde for granulasjonsvev og avstand mellom fremadskridende kanter for granulasjonsvev, gjaldt veksten av granulasjonsvev. Den tredje måling, av reepiteliseringsåpningen, vedrørte gjenveksten av epitel over såret.

De preliminære resultater av disse forsøk indikerer

at en 1-timers anbringelse av rPDGF B i en bærer av kollagen umiddelbart etter sårdannelse, har en virkning på alle tre parametrene. Etter 7 dager var den maksimale dybde av granu-las jonsvev i kontrollsår 0,76 - 0,03 mm, mens dybden var

1,02 - 0,06 mm i sår som var behandlet med rPDGF B (p<0,0001). Avstanden mellom fremadskridende kanter av granulasjonsvev

i kontroller var 4,68 - 0,12 mm, mens avstanden i sår behandlet med rPDGF B var 4,05 - 0,17 mm (p < 0,004). Den gjennomsnittlige avstand over reepiteliseringsåpningen for kontrollsår var 1,78 - 0,21 mm og for sår behandlet med rPDGF B var den gjennomsnittlige avstand 1,10 - 0,22 mm. Ettersom mange av de sistnevnte sår ble fullstendig reepitelisert i løpet av 7 dager, var den samme type statistiske analyse ikke anvendbar. Som et alternativt mål ble antallet sår (n=18) som ble fullstendig reepitelisert, bestemt. For kontroller ble 24% fullstendig reepitelisert, mens 56% av sårene behandlet med rPDGF B ble fullstendig reepitelisert. Disse resultater angir at rPDGF B kan være anvendbar ved behandlingen av sår, slik som magesår som ikke helbredes, mens gjenveksten av både granulasjonsvev og epitel er ønskelig.

Selv om foreliggende oppfinnelse her er blitt beskrevet med hensyn til særlige utførelsesformer, skal det forståes at variasjoner og forbedringer vil oppstå for fagfolk innen teknikken etter betraktning av den åpenbaring som her finnes.

F.eks. kan monoklonale antistoffer gjenkjenne epi-

toper som er til stede på A- og/eller B-kjedene til PDGF

(enten v- sis, c- sis eller andre varianter og analoger derav), anvendes for rensing av PDGF. Ettersom PDGF er hovedmitogen for bindevevceller, vil i tillegg den høyrensede PDGF ifølge foreliggende oppfinnelse kunne anvendes til stimulering av sårhelbredelse. PDGF frigjøres fra blodplater bare på stedet for sår, og den er både mitotisk og kjemotaktisk for bindevevceller. En undersøkelse viste større kollagensyntese i PDGF-behandlede sår hos rotter enn når ett av flere andre hormoner ble anvendt.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for rensing av et polypeptid som har en tilstrekkelig del av den strukturelle oppbygning til PDGF B

til å gi minst én epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF B,karakterisert ved at: (a) en oppløsning som inneholder polypeptidet, sendes gjennom en kromatografikolonne, hvor det til kolonnen er bundet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF, eller et antistoff frembrakt mot PDGF B/CGH-fusjonspolypep-tidet, som har aminosyresekvensen vist i figur 11, og (b) polypeptidet elueres fra kolonnen, idet polypeptidet har en renhet som er høyere enn 95 % renhet bestemt ved hjelp av SDS-PAGE.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at polypeptidet har den strukturelle oppbygning til PDGF Bc.sis som angitt i figur 2.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at polypeptidet er produktet av prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens båret på et autonomt replikerende DNA-plasmid eller en virusvektor.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er et monoklonalt antistoff valgt fra gruppen bestående av monoklonale antistoffer uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9354, ATCC nr. HB 9355, ATCC nr. HB 9361, ATCC nr. HB 9366, ATCC nr. HB 9367, ATCC nr. HB 9368, ATCC nr. HB 9370 eller ATCC nr. HB 9372.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at polypeptidet har den strukturelle oppbygning til PDGF Bc.sis som angitt i figur 2.

6. Fremgangsmåte for rensing av et polypeptid som har en tilstrekkelig del av den strukturelle oppbygning til PDGF B til å gi minst én epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF B, karakterisert ved at: (a) en oppløsning som inneholder polypeptidet, sendes gjennom en kromatografikolonne, hvor det til kolonnen er bundet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for en epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF, og (b) polypeptidet elueres fra kolonnen, idet polypeptidet har en renhet som er høyere enn 99 % renhet bestemt ved hjelp av SDS-PAGE.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at polypeptidet har den strukturelle oppbygning til PDGF Bc.sis som angitt i figur 2.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at polypeptidet er produktet av prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens båret på et autonomt replikerende DNA-plasmid eller en virusvektor.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert ved at det monoklonale antistoff er et monoklonalt antistoff valgt fra gruppen bestående av monoklonale antistoffer uttrykt av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9354, ATCC nr. HB 9355, ATCC nr. HB 9361, ATCC nr. HB 9366, ATCC nr. HB 9367, ATCC nr. HB 9368, ATCC nr. HB 9370 eller ATCC nr. HB 9372.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert ved at polypeptidet har den strukturelle oppbygning til PDGF Bc.sis som angitt i figur 2.

11. Monoklonalt antistoff,karakterisert ved at det er spesifikt for en epitop som finnes i B-kjeden, men ikke i A-kjeden til PDGF.

12. Monoklonalt antistoff ifølge krav 11, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er er et monoklonalt antistoff valgt fra gruppen bestående av monoklonale antistoffer uttrykt ved hjelp av et hybridom deponert som ATCC nr. HB 9354, ATCC nr. HB 9355, ATCC nr. HB 9361, ATCC nr. HB 9366, ATCC nr. HB 9367, ATCC nr. HB 9368, ATCC nr. HB 9370 eller ATCC nr. HB 9372.