DK176036B1 - Ekspression af biologisk aktive PDGF analoger i eukaroyte celler - Google Patents

Description

DK 176036 B1

Den foreliggende opfindelse angår fremstillingen af PDGF-analoger i almindelighed og nærmere bestemt ekspressionen af biologisk aktive PDGF-analoger i eukaryo-ter.

Det er blevet vist, at human blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) er det væsent-5 ligste mitogene protein i serum for mesenchymafledte celler. Dette er veldokumenteret ved adskillige undersøgelser af blod pladeekstrakter eller ved induktion af enten cellemultiplikation eller DNA-syntese (en forudsætning for celledeling) med oprenset PDGF i dyrkede glatmuskulaturceller, fibroblaster og gliaceller (Ross et al., PNAS 71: 1207, 1974; Kohier og Lipton, Exp. Cell Res. 87: 297, 1974; Westermark og Wasteson, 10 Exp.Cell Res. 98: 170, 1976; Heldin et al., J.Cell Physiol. 105: 235, 1980; Raines og Ross, J.Biol.Chem. 257: 5154, 1982). Ydermere er PDGF et stærkt virkende kemisk stof, som tiltrækker celler, der er modtagelige overfor stoffet som et mitogen (Groten-dorst et al., J.Cell Phvsiol. 113: 261, 1982; Seppa et al., J.Cell Biol. 92: 584,1982). Det er ikke almindeligvis tilfældet, at mitogener også fungerer som kemisk tiltrækkende 15 stoffer. På grund af PDGF’s mitogene aktivitet er det nyttigt som en vigtig komponent i et defineret medium til dyrkning af pattedyrceller i kultur, hvilket gør stoffet til et værdifuldt forskningsreagens med adskillige anvendelser i undersøgelsen af dyrecellebiologi.

In vivo cirkulerer PDGF normalt opbevaret i blodpladernes alfa-granula. Beskadigelse af arterie-endothellagene får blodplader til at klæbe til det eksponerede binde-20 væv og frigøre deres granula. Det frigjorte PDGF formodes at trække fibroblaster og glatmuskulaturcellerne kemotaktisk til beskadigelsesstedet og at inducere deres fokale proliferation som en del af sårhelingsprocessen (Ross og Glomset, N.Eng.J.of.Med.

295: 369. 1976).

Det er blevet postuleret, at som en del af dette svar på beskadigelse kan PDGF, 25 som er frigjort af blodpladerne, spille en forårsagende rolle ved udviklingen af de profi-lerative læsioner ved atherosclerose (Ross og Glomset, se ovenfor), hvilket er en af hovedårsagerne til hjerte- og hjerneinfarkt. Strategier til forebyggelse og behandling af atherogenese er tidligere blevet snævert rettet mod at nedsætte risikofaktorerne for sygdommen, såsom at sænke blodtrykket hos personer med for højt blodtryk og ned-30 sætte forhøjet cholesterolniveauer hos personer med forhøjet niveau af cholesterol.

Nylige undersøgelser har vist, at mindst én af de to proteinkæder, som udgør PDGF, og det formodede transformerende protein fra simian sarcomavirus (SSV), et akut transformerende retrovirus, synes at oprinde fra de samme eller nært beslægtede, cellulære gener. Nærmere bestemt har computeranalyse af en delvis aminosyrese- 2 DK 176036 B1 kvens af PDGF afsløret udbredt homologi med genproduktet, p28sis, fra SSV (Doolittle et al., Science 221: 275, 1983; Waterfield et al., Nature 304: 35, 1984 og Johnson et al.. EMBO J. 3: 921, 1984). Ydermere har senere undersøgelser illustreret, at p28sis og PDGF udviser antigene ligheder såvel som strukturelle ligheder (Robbins et al., Nature 5 305; 605, 1983; Niman, Nature 307: 180, 1984).

Det er blevet bevist, at porcin PDGF bærer antigene determinanter, som er fælles med human PDGF. Imidlertid er porcin PDGF på andre måder klart forskellig fra human PGDF. Derfor er den tilsyneladende molekylærvægt for porcin PDGF, som påvist på SDS gels, 38.000 Dalton sammenlignet med en række, som er centreret om-10 kring 30.000 Dalton for human PDGF (Stroobant et al, EMBO J. 3; 2963,1984).

En vækstfaktor, som er en homodimer af polypeptidkæder som er strukturelt beslægtede med human PDGF A-kæden har været isoleret fra en human osteosarco-macellelinie (Heldin et al., Nature 319: 511,1986).

Ingen mitogenaktivitet kunne påvises med en B-kæde monomer i en undersø-15 gelse som foreslog, at en PDGF B-kæde homodimer kan være et aktivt mitogen i blodplader, og at A-kæden ikke er nødvendig (Kelly et al., EMBO J. 4: 3399,1985).

Europæisk patentansøgning med publiceringsnummeret 177 957 beskriver en DNA konstruktion, som er i stand til at dirigere ekspressionen og sekretionen af biologisk aktive PDGF analoger i eukaryote celler, en fremgangsmåde til fremstilling af så-20 danne analoger, samt en fremgangsmåde for at fremme væksten af mammale celler ved anvendelsen af sådanne analoger.

Skønt der som opsummeret af Devare et al., (Cell 36: 4, 1984) tidligere har været gjort forsøg på at udtrykke v-sis genet i en transformeret mikroorganisme, er det ikke lykkedes at fremstille mitogent materiale. Forskere har senere beskrevet fremstil-25 lingen af p28sts i E.coli som et fusionsprotein (Wang et al., J.Biol.Chem. 259: 10645, 1984). Dette protein synes at konkurrere med PDGF for binding til PDGF- receptorsteder. Skønt det er blevet vist, at SSV-transformerede celler fra gnavere udviser en mitogen aktivitet i lighed med PDGF (Deuel et al., Science 221: 1348, 1983;

Owen et al., Science 225: 54, 1984) er det ikke klart, at denne aktivitet skyldes et gen-30 produkt fra SSV (dvs. p28s,s). Ydermere producerer celler, som er transformeret med en række andre vira end SSV, et PDGF-lignende mitogen i dyrkningsmediet (Bowen-Pope et al.. PNAS81: 2396, 1984).

Skønt naturligt PDGF kan isoleres fra humant plasma eller humane blodplader som udgangsmateriale er det en kompleks og dyr fremgangsmåde, hvilket til dels skyl 3 DK 176036 B1 des, at udgangsmaterialet er til rådighed i begrænset mængde. Ydermere er det vanskeligt at oprense PDGF med højt udbytte fra andre serumkomponenter på grund af, at det forekommer i yderst lave mængder og på grund af dets biokemiske egenskaber.

Den terapeutiske anvendelse af produkter, som hidrører fra humant blod, medfører 5 ydermere risikoen for sygdomsoverføring på grund af kontaminering med f.eks. hepatitis-virus, cytomegalovirus eller HIV.

På baggrund af PDGF’s kliniske anvendelighed ved behandling af beskadigelser, ved hvilke heling kræver proliferation af fibroblaster eller glat-muskulatur-celler, og dets værdi som en vigtig komponent i et defineret medium til dyrkning af pattedyrceller i 10 kultur, er fremstillingen af brugbare mængder af proteinmolekyler som ligner autentisk PDGF, og som udviser mitogen aktivitet, klart uvurderlig.

Ydermere vil muligheden for at fremstille forholdsvis store mængder af PDGF eller PDGF-analoger være et nyttigt værktøj til klarlægning af den rolle, som v-sis-proteinet, p28sis, spiller ved den neoplastiske proces.

15 Eftersom lokal akkumulering af glat-muskulatur-celler i det indre lag af en arterie- · væg er central for udviklingen af atherosclerotiske læsioner (Ross og Glomset, se ovenfor), vil en strategi til forebyggelse og behandling af atherosclerose ydermere være at undertrykke proliferation af glat-muskulatur-celler. Muligheden for at fremstille store mængder af PDGF vil være nyttig ved uvikling af hæmmere eller ved udformning 20 af specifikke fremgangsmåder, som forhindrer eller interfererer med PDGF’s in vivo aktivitet hos personer med atherosclerose.

I korthed angår den foreliggende opfindelse fremgangsmåder til ekspression af en række biologisk aktive PDGF-analoger i eukaryotiske celler. Generelt omfatter fremgangsmåderne, at der i en eukaryotisk værtscelle indføres en DNA-konstruktion, 25 som er i stand til at dirigere ekspression og sekretion af biologisk aktive PDGF-analoger i eukaryotiske celler. DNA-konstruktionen indeholder en transkriptionel promotor, som nedenstrøms er efterfulgt af en hensigtsmæssig DNA-sekvens.

Ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en rekombinant protein homodimer med to polypeptidkæder bundet med disulfidbindinger, hvilke kæder 30 er valgt blandt gruppen bestående af: (a) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104 (b) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (c) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, og (d) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, I 4 DK 176036 B1 hvilket protein har human PDGF mitogenaktivitet. I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen er mindst én cysteinrest i stilling 37,46 eller 47 i proteinet substitueret med en anden aminosyrerest. Fortrinsvis er denne anden aminosyrerest en serinrest.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et rekom-5 binant protein med to polypeptidkæder bundet med disulfidbindinger, hvor mindst en af kæderne er en mosaik af aminosyresekvenser af A- og B-kædeme af human PDGF, hvor mosaikkæden er valgt blandt gruppen bestående af: (a) A-kæde-aminosyrerne 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrerne 24-109, (b) A-kæde-aminosyrerne 1-31 bundet til B-kæde-aminosyrerne 38-109, 10 (c) A-kæde-aminosyrerne 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrerne 24-97 bundet til A- kæde aminosyrerne 92-104, | og hvor den anden kæde er valgt blandt gruppen bestående af: kæderne (a), (b) og (c) som defineret ovenfor, (d) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104, 15 (e) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (f) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, (g) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, (h) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 109, (i) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 101, 20 (j) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 tit aminosyre 101, og (k) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 109, hvilket protein har human PDGF mitogenaktivitet. I en anden foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen er mindst én cysteinrest i en position svarende til position 37 i A-kæde, position 46 i A-kæde, position 47 i A-kæde, position 43 i B-kæde, position 52 i 25 B-kæde eller position 53 i B-kæde er substitueret med en anden aminosyrerest. Fortrinsvis er denne aminosyrerest en serinrest.

Fortrinsvis er det rekombinante protein ifølge den foreliggende opfindelse ugly-cosyleret.

Ifølge et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en terapeutisk 30 sammensætning omfattende et protein ifølge opfindelsen og en fysiologisk acceptabel bærer. Foretrukne eksempler af bærere er albumin, sterilt vand og saltvand. Den terapeutiske sammensætning ifølge opfindelsen kan yderligere omfatte en adjuvans. Fortrinsvis er adjuvansen valgt blandt kollagen, hyaluronsyre, fibronektin, faktor XIII og et j | j ! i 5 DK 176036 B1 antibiotikum. Fortrinsvis er proteinet ifølge opfindelsen tilstede i den terapeutiske sammensætning i en koncentration på fra 1 til 50 pg/ml af totalvolumenet.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse anvendes den terapeutiske sammensætning omfattende proteinet ifølge opfindelsen til fremme af sårhelings-5 processen hos varmblodede dyr.

Ifølge et yderligere aspekt angår opfindelsen anvendelse af et protein ifølge opfindelsen til fremme af vækst af pattedyrceller ved at inkubere cellerne med proteinet.

Ifølge yderligere et aspekt angår opfindelsen en sårforbinding indeholdende et protein ifølge opfindelsen.

10 Ifølge endnu et aspekt angår den foreliggende opfindelse anvendelsen af et pro tein ifølge opfindelsen til fremstilling af et lægemiddel til fremme af sårhelingsprocessen i varmblodede dyr.

Ifølge et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en DNA-konstruktion, som er i stand til at dirigere ekspressionen og sekretionen i eukaryote celler af et poly-15 peptid valgt blandt gruppen bestående af: (a) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104 (b) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (c) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, og (d) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, 20 Ifølge en foretrukken udførelsesform er mindst én cysteinrest i en position sva rende til A-kæde position 37, 46 eller 47 i det kodede protein substitueret med en anden aminosyrerest. Fortrinsvis er denne aminosyrerest en serinrest.

Ifølge et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en DNA-konstruktion, som er i stand til at dirigere ekspressionen og sekretionen af biologisk 25 aktive humane PDGF analoger i eukaryote celler, hvilken DNA-konstruktion indeholder en transkriptionel promotor nedenstrøms efterfulgt af en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som er en mosaik af aminosyresekvenser af A- og B-kædeme af human PDGF, hvilken polypeptidkæde er valgt blandt gruppen bestående af: (a) A-kæde-aminosyrer 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrer 24-109, 30 (b) A-kæde-aminosyrer 1-31 bundet til B-kæde-aminosyrer 38-109, og (c) A-kæde-aminosyrer 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrer 24-97 bundet til A-kæde-aminosyrer 92-104.

6 DK 176036 B1

Ifølge en foretrukken udførelsesform er mindst én cysteinrest i en position svarende til A-kædeposition 43, 52 eller 53 substitueret med en anden aminosyrerest. Fortrinsvis er denne aminosyrerest en serinrest.

Ifølge et yderligere aspekt indeholder polypeptidet, der kodes af DNA-5 konstruktionen ifølge opfindelsen, ikke et N-bundet glycosyleringssted.

Ifølge et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktive humane PDGF analoger, hvilken fremgangsmåde omfatter at en DNA-konstruktion ifølge opfindelsen indføres i en eukaryot værtscelle 10 at den eukaryote værtscelle dyrkes i et egnet medium, og at PDGF analogen isoleres fra den eukaryote vært.

Ifølge et yderiigere aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktive human PDGF analoger hvilken fremgangsmåde omfatter, 15 at en DNA-konstruktion ifølge krav 19 indføres i en eukaryot værtscelle at der i den eukaryote værtscelle indføres en anden DNA-konstruktion som indeholder en transkriptionel promotor nedenstrøms efterfulgt af en DNA-sekvens som koder for et polypeptid valgt blandt gruppen bestående af: (a) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104, 20 (b) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (c) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, (d) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, (e) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 109, (f) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 101, 25 (g) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 101, og (h) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 109, den eukaryote værtscelle dyrkes i et egnet medium, og PDGF analogen isoleres fra den eukaryote vært.

Andre aspekter ifølge den foreliggende opfindelse vil fremgå af den efterfølgende 30 detaljerede beskrivelse samt den tilhørende tegning.

7 DK 176036 B1

Figur 1A viser et skematisk restriktionskort af SSV-provirai-genomet.

Figur 1B viser nukleotidsekvensen og den forudsagte amino-syresekvens, som kodes af v-sis-området i SSV-genomet.

5 Figur 2 illustrerer konstruktionen af et plasmid, som inde holder MForl -promoteren og secerneringssignalsekvensen opstrøms v-sis-genet.

Figur 3 viser konstruktionen af plasmid p192.

Figur 4 viser den oligonukleotidstyrede deletionsmutagenisering 10 af de 66 aminoterminale v-sis-codoner.

Figur 5 viser konstruktionen af plasmid p270.

Figur 6 viser indføjelsen af v-sis-ekspressionseheder opstrøms TPII-terminatoren.

Figur 7 viser konstruktionen af plasmid pTVS2orT.

15 Figur 8 viser konstruktionen af en B-kaedeekspressionsenhed VSB og dens indføjelse i pMPOT2-vektoren.

Figur 9 viser aminosyresekvenserne for de modne A- og B-kæder i PDGF.

Figur 10 viser en dosisresponskurve for PDGF-receptorbinding 20 af mediekoncentrater fra gaertransformanter, som indeholder plasmi-derne pVSBm og pMPOT2, sammenlignet med autentisk PDGF, Før opfindelsen forklares, kan det for at forstå denne, være nyttigt at anføre definitioner for visse udtryk, som anvendes herefter.

25 Polypeptid: En polymer af aminosyrer.

Læseramme: Den ordning af nukleotidcodoner, som koder for en uafbrudt strækning af aminosyrer. Under translation af en mRNA skal den rigtige læseramme bevares. F.eks. kan sekvensen GCU-GGUUGUAAG translateres i tre læserammer eller -faser, afhængig 30 af, om man starter med G, med C eller med U, og således give tre forskellige peptidprodukter. Translation af templaten begynder med en AUG-codon, fortsætter med codoner for specifikke aminosyrer og slutter med en af translationstermineringscodonerne.

Kodende sekvens: DNA-sekvenser, som i den rette læseramme 35 direkte koder for aminosyrerne i et protein.

Komplementært DNA: eller cDNA. Et DNA-molekyle eller en DNA-sekvens, som er blevet syntetiseret enzymatisk ud fra de sekvenser, der er til stede i en mRNA-template eller en klon af et sådant molekyle.

8 DK 176036 B1

Sekretorisk signalsekvens: Den del af et gen eller cDNA, som koder for et signalpeptid. Et signalpeptid er den aminosyresekvens i et sekretorisk protein, som signalerer dets translokation ind i cellens sekretoriske bane. Signalpeptiderne forekommer almindeligvis 5 i begyndelsen (den aminoterminale) af proteinet og er ca. 20-40 aminosyrer lang med en strækning pi ca. 9-10 hydrofobe aminosyrer nær midten. Meget ofte spaltes sekvensen proteolytisk fra proteinet under sekretionsprocessen.

Cel leoverfladereceptor: Et proteinmolekyle i overfladen af en 10 celle, hvilket molekyle specifikt vekselvirker med eller binder et molekyle, der nærmer sig cellens overflade. Når receptoren har bundet det beslægtede molekyle, effektuerer det specifikke ændringer i cellens fysiologi.

Mitogen: Et molekyle, som stimulerer cellerne til at gennemgå 15 mitose. Mitose er aseksuel somatisk celledeling, som fører fil to døtreceller, der hver har det samme antal kromosomer som modercellen.

Transformation: Den proces, hvormed man stabilt og på arvelig måde ændrer genotypen af en modtagercelle eller mikroorganisme 20 ved indføring af oprenset DNA. Dette påvises typisk ved en ændring i modtagerorganismens fænotype.

Transkriptlon: Den proces, hvorved der dannes en mRNA-tem-plate fra et strukturgen.

Ekspression: Den proces, som går ud fra et strukturgen eller 25 cDNA og frembringer det polypeptid, den koder, hvilket er en kombination af transkription og translation. En ekspressionvektor er en piasmidafledt konstruktion udformet til at muliggøre ekspression af et gen eller cDNA, som bæres pi vektoren.

Plasmid: En extra kromosomal, dobbeltstrenget DNA-sekvens, 30 som omfatter en intakt "replikon", således at plasmidet replikeres i en værtscelle. Når plasmidet anbringes i en encellet organisme, kan denne organismes egenskaber ændres eller transformeres som et resultat af ekspressionen af plasmidets DNA-sekvenser. F.eks. transformerer et plasmid, som bærer genet for tetracyklinresistens 35 (tet ), en celle, som tidligere var følsom overfor tetracyklin til en celle, som er resistent overfor stoffet.

Gærpromotor: DNA-sekveser opstrøms et gærgen, hvilke se kvenser starter transkriptionen.

Λ 9 DK 176036 B1

Biologisk aktivitet: En eller anden funktion eller et sæt af aktiviteter, som udøves af et molekyle i en biologisk sammenhæng, dvs. i en organisme eller en in vitro kopi). I tilfælde med PDGF inkluderer disse biologiske aktiviteter induktionen af kemotaxi 5 og/eller mitogenese hos modtagelige celletyper efterfulgt af bindingen af PDGF til specifikke celleoverfladereceptorer. Andre biologiske virkninger af human blodplade-PDGF inkluderer: phospho-lipaseaktivering, forøget phosphatidylinositolomsætning og prosta-glandinmetabolisme, stimulering af bSde kollagen- og kollagenase-10 syntese hos modtagelige celler, et indirekte proliferativt svar hos celler, som mangler PDGF-receptorer og stærkt virkende karsammenshøringsaktivitet.

PDGF-analog: Et polypeptid, som i det væsentlige er homolog med mindst en del af A-kæden eller B-kæden i PDGF eller med 15 begge, hvor polypeptidet udviser biologisk aktivitet som her defineret.

Som anført ovenfor har det vist sig, at human blodpladeafiedt vækstfaktor (PDGF) er i det væsentligste mitogen i serum. Det 20 PDGF, som isoleres fra blodplader, er et molekyle, som er forskelligt fra de nye proteiner ifølge den foreliggende opfindelse. Det er kendt, at PDGF er sammensat af to polypeptidkæder, en A-kæde og en B-kæde, som holdes sammen ved hjælp af disulfidbindinger til dannelse af det biologisk aktive, heterodimere molekyle. Denne 25 struktur er blevet bekræftet ved immunopræcipiteringsforsøg (Hart et al., Heldin et al., upublicerede resultater). Disse forskere anvendte monoklonale antistoffer, som var rettet specifikt mod A-kæden eller B-kæden for at immunopræcipitere PDGF. Deres resultater indikerer, at PDGF kan fjernes fra opløsningen med 30 antistoffer, som genkender en hvilken som helst af kæderne. Dette bekræfter strukturen af PDGF som en heterodimer af to forskellige polypeptidkæder. Ydermere indeholder naturligt forekommende PDGF kulhydrat (Deuel et al.,, J.Biol.Chem. 256: 8896-8899, 1981). Efter fuldstændig kemisk reduktion udviser de enkelte polypeptidkæder 35 ikke nogen mitogen aktivitet (Raines og Ross, se ovenfor), og forsøg på at rekonstituere aktivitet ved genoxidation af de reducerede polypeptider er ikke lykkedes. For nyligt er aminosyre-sekvensen af B-kæden blevet bestemt og viser sig at være i det væsentlige homolog med en del af v-sis-genproduktet, p28s,s, 10 DK 176036 B1 (Doolittle et al., se ovenfor; Waterfield et al., se ovenfor, og Johnson et al., se ovenfor). Homologien mellem disse to proteiner antyder kraftigt, at de hidrører fra de samme eller nært beslægtede cellulære gener.

5 Pi baggrund af den kendsgerning, at et enkelt, reduceret A-kæde polypeptid eller B-kæde polypeptid ikke er biologisk aktiv, og at tidligere forsøg pi at udtrykke v-sis-sekvenser i E.coli ikke gav et mitogent materiale, ville det ikke være forventet, at den blotte ekspression af en sekvens, som koder for PDGF eller et 10 lignende molekyle i en mikroorganisme, vil resultere i et molekyle, som udviser biologisk aktivitet.

Men i modsætning til de ovenfor nævnte tidligere forsøg tilvejebringer den foreliggende opfindelse uventet ekspression af DNA-sekvenser, som koder for PDGF A-kæde eller B-kæde, va-15 rianter eller derivater af A- og B-kæderne, såvel som mosaikker af dele af A- og B-kæderne eller deres derivater, på en sådan måde, at de udtrykte molekyler udviser biologisk aktivitet, som er karakteristisk for PDGF. Ydermere var ekspressionssystemet ifølge den foreliggende opfindelse udformet til at tilvejebringe genproduktet 20 via en eukaryotisk sekretionsbane. Dette muliggør, at de udtrykte polypeptidmolekyler processeres korrekt, foldes korrekt og samles i biologisk aktive dimerer. I modsætning til tidligere forsøg resulterer den foreliggende opfindelse faktisk i sekretionen af PDGF-lignende dimerer, som er biologisk aktive i etablerede analyser for PDGF-ak-25 tivitet, dvs. radioreceptoranalyse (RRA), mitogeneseanalyse og kemotaxianalyse.

PDGF er i sin biologisk aktive form et varmestabilt protein bestående af kæder med en heterogen størrelse på mellem ca. 28.000 og 31.000 dalton, hvor alle de individuelle former er aktive, idet de 30 stimulerer DNA-syntesen (Raines og Ross, se ovenfor, Deuel et al., J.Biol.Chem. 256: 8896, 1981, Antoniades, PNAS 78: 7314, 1981).

Når individuelle former med molekylstørrelser på 27.000, 28.500, 29.000 og 31.000 dalton er blevet isoleret og analyseret, har de udvist udbredt tryptisk peptidhomologi og har vist sig at have 35 sammenlignelig mitogenaktivitet og aminosyresarnmensætning (Raines og Ross, se ovenfor). De små variationer i størrelse blandt formerne skyldes højst sandsynligt forskelle i kulhydratsammensætning og mindre proteolyse.

11 DK 176036 B1

Ud fra undersøgelse af PDGF, som er blevet grundigt oprenset fra blodpladerigt, humant plasma, er det som ovenfor anført sandsynligt, at PDGF er sammensat af to polypeptidkæder, en A-kæde (14.000 dalton) og en B-kæde (16.000 dalton), som er bundet 5 sammen ved hjælp af disulfidbindinger til dannelse af det biologisk aktive., dimere molekyle (Raines og Ross, Deuel et al., Antoniades, se ovenfor). Den PDGF-nomenklatur, som findes i litteraturen, stemmer ikke overens (Doolittle et al., Waterfield et al., Raines og Ross, Johnsson et al., se ovenfor). Her anvendes nomenklaturen 10 ifølge Johnson et al., (se ovenfor), hvor de to polypeptidkæder, som findes i ren PDGF, kaldes "A-kæde" og "B-kæde". B-kæden er homolog med p28S,S og blev tidligere kaldt "peptid I" (Waterfield et al., se ovenfor) eller "1a" (Doolittle et al., se ovenfor). A-kæden blev tidligere kaldt "peptid II" (Waterfield et al., se ovenfor) eller 15 "2a" (Doolittle et al., se ovenfor). Resultater afledt fra en delvis aminosyresekvens af PDGF indikerer, at de to polypeptidkæder (A-kæden og B-kæden) udviser udbredt homologi (Doolittle et al., se ovenfor, Waterfield et al., se ovenfor og Johnsson et al., se ovenfor, Antoniades og Hunkapiller, Science 220: 963, 1983). Det er 20 nærmere bestemt blevet rapporteret, at der er 56% aminosyreiden-titet mellem de to kæder. Ydermere er der som vist i figur 9 adskillige blokke med perfekt homologi mellem de to kæder. Ydermere indeholder begge kæderne 8 cysteinrester ved de samme positioner, hvilket antyder, at hvert polypeptid folder op i en lignende tre-25 dimensional struktur.

Det virker som om disse to polypeptider er nært beslægtede medlemmer af en lille familie. Blokkene med perfekt homologi mellem A- og B-kæderne reflekterer områder af proteinet, som kan bidrage til funktionen, medens de mindre homologe områder kan reflektere 30 områder af proteinet, som er mindre vigtig for dets funktion. Som yderligere eksemplificeret ved den foreliggende opfindelse kan visse dele af enten A- eller B-kæderne derfor fjernes eller udskiftes under bevaring af biologisk aktivitet i det fremkomne protein.

Ud fra belæringerne ifølge den foreliggende opfindelse, homo-35 logien mellem A- og B-kæderne sammen med overensstemmelsen mellem cysteinrester kan en fagmand udforme yderligere egnede medlemmer af denne homologe familie. En fagmand ville f.eks. kunne konstruere en række hybrider mellem A- og B-kædegenerne, som ville kode for proteiner, i hvilke de homologe domænestrukturer er DK 176036 631 12 bevaret. Det påvises her, at disse proteiner kan forventes at antage en lignende tredimensional struktur som vildtype A- eller B-kæderne og bevare biologisk aktivitet.

v-sis-genet er som ovenfor nævnt det transformerende gen i 5 simian sarcomavirus (SSV). v-sis-genet er blevet klonet, og dets DNA-sekvens er blevet bestemt (Devare et al., PNAS 79: 3179, 1982; Devare et al., PNAS 80: 731, 1983). Analyse af denne sekvens afslørede en åben læseramme, som kunne kode for et 28.000 dalton stort protein, betegnet p28sis. Senere blev et sådant protein 10 immunologisk identificeret i SSV-inficerede celler. (Niman, se ovenfor, Robbins, se ovenfor). Den forudsagte aminosyresekvens af v-sis-genproduktet, p28sls, fandtes at have en høj grad af homologi med den faktiske aminosyresekvens af en del af B-kæden i PDGF. (Johnson, se ovenfor). Homblogien mellem PDGF B-kæden og v-sis-15 genproduktet begynder ved aminosyre 67 i p28sis, en serin, og fortsætter for 109 aminosyrer til en threoninrest ved aminosyre 175.

De aminosyresekvenser, som går forud for og efterfølger det B-kædehomologe område i p28sls, er ikke homologe med hverken A-eiler B-kæden i moden PDGF (Johnson, se ovenfor) og repræsen-20 terer dele af B-kædeforstadiet. Ydermere er det blevet vist, at PDGF og p28sls ligner hinanden antigenisk (Niman, se ovenfor,

Robbins, se ovenfor), v-sis-genproduktet, p28S,S, et protein med ca. 226 aminosyrer, dimeriserer og processeres proteotytisk til et protein pi ca. 20.000 dalton (p28s,S) i SSV-inficerede celler 25 (Niman, se ovenfor, Robbins, se ovenfor). Dette 20.000 dalton store protein kan immunopræcipiteres med antiserum mod PDGF.

Det område af v-sis, som er homolog med moden B-kæde, koder for et 109 aminosyrer langt polypeptid, som næsten er identisk med den humane B-kæde. De 4 aminosyreforskelle mellem disse 30 to genprodukter findes ved positionerne 6, 7, 91 og 97. Den modne, humane A-kædesekvens er 104 aminosyrer lang og er 56% homolog med B-kæden og har derfor en lignende homologigrad med v-sis-produktet som homologien med B-kæden.

I modsætning til naturligt forekommende PDGF viser et specielt 35 aspekt ifølge den foreliggende opfindelse proteinprodukter, som er disulfidbundne dimerer af to A-kædelignende polypeptider. En sådan dimer, som omfatter kæder, der har fuldstændig homologi med de 104 aminosyrer i PDGF A-kæden, vandrer på polyacrylamidgeler med en tilsyneladende molekylvægt pi ca. 31.000 dalton. Nlr dimeren 13 DK 176036 B1 reduceres kemisk vandrer komponentkæderne til en position, som stemmer overens med et polypeptid pi 104 aminosyrer. Aminosyre-sammensætningen for det rene protein er blevet bestemt, og resultaterne viser, at sammensætningen stort set er identisk med den i 5 fig. 1 viste A-kædesekvens. Aminosyresekvensen for dette rene, gærudtrykte protein blev bestemt under anvendelse af en gasfase-sekvenator (Applied Biosystems). Den sekvensinformation, der er vist for A-kæden i fig. 9, kan gøre rede for hele den opnåede aminoterminale sekvens. Disse resultater indicerer, at proteinerne 10 ifølge dette aspekt af den foreliggende opfindelse er homodimerer, som består af polypeptidkæder, der er homologe med A-kæden i PDGF. Aminosyresekvensen af A-kæden, som er frembragt i gær, indeholdt ikke N-bundne glycosyleringssteder. Det glycosylerings-sted, som er til stede i den native, humane A-kæde, blev med vilje 15 udeladt fra denne konstruktion for at undgå gærkulhydrattilføjelse.

Baseret på polyacrylamidgelelektroforese er der ingen evidens for, at "den gærudtrykte A-kæde indeholder kulhydrat. Den biologiske aktivitet, som blev observeret for disse ikke-glycosylerede PDGF-analoger, er noget overraskende i betragtning af at adskillige glyco-20 proteinhormoners og andre vækstfaktorers biologiske aktivitet afhænger af glycosylering.

Som ovenfor anført angår endnu et aspekt ifølge den foreliggende opfindelse proteiner, som omfatter polypeptider, der er varianter og derivater af A-kæden eller B-kæden i PDGF. Disse 25 modifikationer falder basalt i 2 klasser: aminosyredeletioner og aminosyresubstitutioner, herunder de nedenfor diskuterede cystein-og phenylalaninsubstitutioner.

Med hensyn til deletionen af aminosyrer har det vist sig, at PDGF A-kæden og B-kæden kan være trunkeret i enten den amino-30 terminale eller den carboxyterminale ende eller i begge og stadig danne biologisk aktive molekyler. Fjernelse af disse amino- og/eller carboxyterminale aminosyrer resulterer i mindre, biologisk aktive molekyler, som kan have bredere terapeutisk anvendelighed. Aminosyrer, som kan deleteres uden at ødelægge det fremkomne molekyles 35 biologiske aktivitet inkluderer aminosyreresterne 1 til 22 og 96 til 104 i A-kæden. Specielt foretrukne, trunkerede A-kædeanaloger består af aminosyrerne 1 til 95, 9 til 95 , 23 til 95, 9 til 104 og 23 til 104, skønt det vil være nærliggende for en fagmand, at andre polypeptider også kan konstrueres, idet der stadigvæk tilvejebringes et molekyle med biologisk aktivitet. Ydermere omfatter i DK 176036 B1 14 aminosyrer, som kan deleteres uden at ødelægge den biologiske aktivitet af det fremkomne B-kædemolekyle, aminosyreresterne 1 til 28 og aminosyreresterne 102 til 109. Specielt foretrukne, trun-kerede B-kædeanaloger bestir af aminosyrerne 1-101, 15-101, 5 29-101, 15-109 og 29-109, skønt det vil være nærliggende for en fagmand, at der kan konstrueres andre polypeptidr, som stadig tilvejebringer et molekyle med biologisk aktivitet.

Ydermere er en række aminosyresubstitutioner mulige. Foretrukne aminosyresubstitutioner inkluderer udskiftning af udvalgte 10 cysteinrester med en anden aminosyre, f.eks. serin, såvel som udskiftningen af andre aminosyrer, hvis udskiftning ikke ødelægger det fremkomne molekyles biologiske aktivitet. Skønt dimeriseringen af proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse involverer disul-fidbinding mellem komponentkæderne, har det vist sig, at ikke alle 15 cysteinresterne deltager i dannelsen af disulfidbindinger eller er nødvendige for biologisk aktivitet. Cysteinresterne ved positionerne 43, 54 og 91 i A-kæden er essentielle for dannnelsen af biologisk aktive molekyler. Cys 93 kan også bidrage til den rigtige struktur. Cysteinen ved position 10 er måske ikke nødvendig for dannelsen af 20 biologisk aktive molekyler. De resterende cysteiner ved positionerne 37, 46 og 47 er ikke nødvendige for dannelsen af aktive dimerer.

Proteiner med aminosyresubstitutioner ved aminosyreresterne 10, 37, 46, 47 eller 93 kan derfor også være egnede til brug ifølge den foreliggende opfindelse, såsom ved en fremgangsmåde til fremskyn-25 delsen af sårhel ingsprocessen hos varmblodede dyr. Ydermere, kan A-kædemole kyler, som indeholder mere end én cystein-til-serin-mutation også være biologisk aktive. Foretrukne kombinationer inkluderer serinsubstitutioner ved positionerne 37 og 46 eller ved positionerne 37 og 47. Kombinationer af seriner ved positionerne 37 30 og 10 eller 93 kan også være egnede til brug i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

Cysteinresterne ved positionerne 49, 60 og 97 i B-kæden er essentielle for dannelsen af aktive molekyler. Cys 99 kan også bidrage til den rigtige struktur. Cysteinen ved position 16 er måske 35 ikke nødvendig for dannelsen af aktive dimerer. De resterende cysteiner ved positionerne 43, 52 og 53 er ikke nødvendige for dannelsen af aktive molekyler. Derfor kan B-kædelignende polypep-tider med aminosyresubstitutioner ved aminosyreresterne 16, 49, 52, 53 eller 99 også være egnede til brug i forbindelse med den fore- 15 DK 176036 B1 liggende opfindelse, såsom inden for en fremgangsmåde til fremning af sårhelingsprocessen hos varmblodede dyr. B-kædemolekyler, som indeholder mere end én cystein-til-serin mutation, kan ydermere også være biologisk aktive. Foretrukne kombinationer inkluderer 5 serinsubstitutioner ved positionerne 43 og 52 eller ved positionerne 43 og 53. Kombinationer af serinsubstitutioner ved positionerne 43 og 16 eller 99 kan også være egnet ifølge den foreliggende opfindelse.

Andre foretrukne aminosyresubstitutioner inkluderer udskift-10 ningen af en phenylalaninrest i B-kæden med en tyrosinrest. Denne substitution er brugbar til f.eks. at lette den radioaktive iodering af B-kæden som et laboratoriereagens til brug i bindingsundersøgelser og lokaliseringsundersøgelser. Tyrosinresterne mærkes med iod under milde betingelser, som ikke ændrer proteinets biologiske 15 aktivitet. Foretrukne phenylalanin-til-tyrosin udskiftninger er ved positionerne 23 og 37 i B-kæden. Dette blev opnået ved oligo-nukleotidstyret mutagenisering under anvendelse af standardmetodik. Oligonukleotid ZCIlie^'-AGATCTCGTAAACTTCGG-S·) blev anvendt til at indføre ty rosinsubstitution ved position 23. Der kan 20 foretages lignende substitutioner af andre phenylalaninrester i B-kæden.

Ud over de ovenfor beskrevne aminosyresubstitutioner er visse andre aminosyresubstitutioner også mulige så længde det fremkomne polypeptid bevarer i det væsentlige homologi med A-kæden eller 25 B-kæden i PDGF. F.eks. koder en DNA-sekvens afledt fra v-sis-genet for et protein, som, skønt det er homolog med den humane B-kæde, adskiller sig fra den humane aminosyresekvens ved 4 positioner. Der kan fremstilles biologisk aktive dimerer under anvendelse af v-sis-sekvensen eller den autentiske, humane sekvens, som 30 kan være afledt fra et human cDNA eller som her beskrevet konstrueres ved ændring af v-sis-sekvensen.

Der findes én række varianter og derivater, som anvendes inden for den foreliggende opfindelse. Der kan f.eks. foretages aminosyresubstitutioner i enten A-kæden eller B-kæden, som: (a) 35 modificerer den tredimensionale struktur af den bestemte kæde uden på signifikant måde at påvirke dets biologiske aktivitet, (b) modificerer den tredimensionale struktur, hvilket resulterér i en ændring af den biologiske aktivitet, eller (c) påvirker den biologiske aktivitet uden på væsentlig måde at ændre den tredimensionale struktur.

16 DK 176036 B1 F.eks. kan aminosyre nr. 98 i B-kæden ændres fra iysin til leucin, hvilket resulterer i et molekyle, som har monomer størrelse og udviser biologisk aktivitet. Alternativt kan der opnås biologisk aktive monomerer ved at ændre cysteinrester, som er involveret i 5 interkædedisulfidbindinger mellem polypeptiderne i dimeren, til en aminosyre, som ikke danner en disulfidbinding. Molekyler, som er biologisk aktive som monomerer, kan muliggøre en større terapeutisk anvendelighed. Monomeranaloger kan også yderligere manipuleres uden behov for at danne en dimer for at opnå biologisk aktivitet.

TO Dette vil lette strukturelle analyser, hvilket fører til defineringen af et aktivt receptorbindingssted, hvorved det bliver muligt at udforme yderligere terapeutiske analoger.

Ydermere kan fjernelse af en eller flere aminosyrer også resultere i en modifikation af det fremkomne molekyles struktur uden at 15 dets biologiske aktivitet ændres væsentligt. Dette kan føre til udviklingen af et mindre, aktivt molekyle, men som har en bredere terapeutisk anvendelighed. Man kan f.eks. som her beskrevet fjerne aminoterminale aminosyrer, som ikke er nødvendige for biologisk aktivitet. Carboxyterminale aminosyrer kan ligeledes fjernes under 20 bevarelse af biologisk aktivitet.

Ydermere kan mosaikker af dele af A- og B-kæderne eller derivater heraf også anvendes inden for den foreliggende opfindelse. Det her anvendte udtryk "mosaik" inkluderer sammenhængende dele af A-kæden og B-kæden, som er tilstrækkeligt til at 25 kode for et molekyle, der har en som her defineret biologisk aktivitet. Enkelte dele af mosaikken kan udvælges fra vild-type A-kæden eller B-kæden, såvel som varianter eller derivater af A-kæden eller B-kæden. Dele af mosaikken kan omfatte fra 1 til ca. 75 aminosyrer i længde forudsat af de primære samlede strukturelle 30 træk af A- og B-kæderne bevares. De fælles strukturelle træk for A- og B-kæderne er de relative positioner af (a) cysteinresterne, (b) områderne med aminosyreladning og (c) områder af hydrofob og hydrofil karakter. Ydermere kan det være nyttigt at bevare blokkene med sekvensidentitet mellem A- og B-kæderne.

35 Som et yderligere alternativ kan sekvenserne i disse hybrider modificeres under bevarelse af biologisk aktivitet. F.eks. resulterer en eller flere aminosyreændringer, såsom ændring i A-kæde aminosyre nr. 10 eller i B-kæden ved aminosyre 16 fra en cystein til en serin i et molekyle, som bevarer biologisk aktivitet.

17 DK 176036 B1

Ydermere kan kombinationer af A- og B-kæderne eller derivater heraf ogsl anvendes inden for den foreliggende opfindelse.

Det her anvendte udtryk "kombinationer" inkluderer heterodimerer sammensat af to forskellige polypeptider, f.eks. A-kæden og B-5 kæden. En keltpolypeptid kæderne i heterodimeren kan udvælges blandt vildtype A-kæden eller B-kæden eller dele heraf, såvel som blandt varianter eller derivater af A-kæden eller B-kæden. De DNA-sekvenser, som anvendes ved ekspression af disse PDGFer kan isoleres, syntetiseres eller konstrueres under anvendelse af rekom-10 binant-DNA-standardmetoder.

For at frembringe A-B-heterodimerer i gær indføres konstruktioner, som udtrykker både A-kæden og B-kæden i PDGF i den samme gærcelle. På denne måde går begge polypeptidkæder samtidig ud i den sekretoriske bane og er i stand til at samles i hetero-15 dimerer. En foretrukken fremgangsmåde er at anbringe A-kæde- og B-kædeekspression konstruktioner på et enkelt plasmid. På denne måde forbliver kopiantallet af de to sekvenser ens. Det er også muligt i den samme gærcelle at indføre og bevare separate plasmi-der, et der koder for A-kæden, og et andet, der koder for B-20 kæden.

Med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at ved at anvende den sekretoriske bane i eukaryotiske celler til at udtrykke proteiner, som i det væsentlige er homologe eller i det væsentlige er identiske med A-kæden eller B-kæden i PDGF eller dele heraf, kan 25 biologisk aktive PDGF-analoger opnås. Ekspression og sekretion af disse genprodukter fra en eukaryotisk celle muliggør processe-ring og samling, som resulterer i molekyler med nativ og biologisk aktiv konformation.

De sekretoriske baner i eukaryoter formodes at være ganske 30 ens. Navnlig de sekretoriske baner i pattedyrceller og gærceller er blevet vel karakteriseret og er homologe. Tilstedeværelsen af en sekretionssignalsekvéns på det udtrykte polypeptid er et vigtigt element i eukaryoter på grund af dets rolle ved at styre det primære translationsprodukt ind i den sekretoriske bane, hvorved det 35 fører til korrekt processering og samling. Forudsat at der udnyttes hensigtsmæssige transkriptionelle promotersekvenser og sekretionssignalsekvenser, kan en hvilken som helst eukaryot i almindelighed udtrykke og secernere PDGF-analoger i en biologisk aktiv form.

18 DK 176036 B1

En let manipulerbar og vel karakteriseret eukaryot er gærcellen. Af disse grunde blev gærcellen valgt som et modeleksempel pi en egnet eukaryotisk celle ved den foreliggende opfindelse. Ifølge den foreliggende opfindelse efterfølges gærpromotoren nedenstrøms 5 af en DNA-sekvens, som koder for et protein, der har stort set samme biologiske aktivitet som POGF. F.eks. blev DNA-sekvenser, som koder for de 109 aminosyrer i PDGF-B-kæden eller de 104 aminosyrer i A-kæden indføjet i gærextrakromosomale elementer, som indholder en gærpromoter, der er i stand til at styre deres ekspres-10 sion. Disse extra kromosomale elementer blev transformeret i gærceller, som var i stand til at udtrykke og secernere disse biologisk aktive PDGF-analoger. Ydermere blev varianter og derivater af PDGF-A-kæderne og B-kæderne såvel som mosaiksekvenserne også indføjet i et sådant gærextrakromosomalt element.

15 De gener eller sekvenser, som skal anvendes ved den fore liggende opfindelse, kan isoleres under anvendelse af rekombi-nant-DNA-standardmetoder.

DNA-sekvenser, som koder for et protein med i det væsentlige samme struktur og/eller biologiske aktivitet som PDGF inkluderer 20 v-sis-genet eller derivater af v-sis-genet eller dele heraf eller de humane cDNA'er for A-kæden eller B-kæden i PDGF eller dele heraf.

Det humane PDGF B-kæde cDNA isoleres fra et humant cDNA-bibliotek fremstillet ud fra en egnet kilde af messenger-RNA, for-25 trinsvis ved at anvende v-sis-genet eller et fragment heraf som hybridiseringsprobe eller ved at anvende oligonukleotidprober udformet fra B-kæde-DNA-sekvensen. En foretrukken mRNA-kilde er human navteveneendothelceller. Disse celler kan dyrkes in vitro i korte tidsperioder og vides at secernere PDGF i dyrkningsmediet 30 (DiCorleto og Bowen-Pope, PNAS, 80: 1919, 1983) og indeholder høje niveauer af B-kæde-mRNA. I korthed blev polyadenyleret RNA fremstillet ud fra frisk dyrkede humane navteveneendothelceller og anvendt til at fremstille dobbeltstrenget cDNA ved hjælp af traditionelle metoder. Dette cDNA blev klonet i bakteriofag-lambda-gtll.

35 Det fremkomne cDNA-bibliotek blev screenet med prober, der hidrørte fra v-sis-genet. Der blev fremstillet et andet sådant bibliotek, og det blev screenet på lignende måde. Kloner, der blev identificeret på denne måde, blev kortlagt ved restriktionsenzymanalyse for at fastlægge deres overlapningsudstrækning. Identiteten af disse 19 DK 176036 B1 kloner som kodende for PDGF B- kæden blev verificeret ved DNA-sekven tering.

Human A-kæde cDNA kan isoleres fra et human cDNA-bibliotek fremstillet ud fra en egnet kilde af messenger RNA ved at anvende 5 v-sis-genet eller et fragment heraf som en hybridiseringsprobe eller ved at anvende oligonukleotidprober udformet fra A-kæde DNA eller -aminosyresekvensen (se f.eks. Betsholtz et al., Nature 320: 695-699, 1986). Foretrukne mRNA-kilder er humane, transformerede cellelinier, f.eks. U2-OS og T-24. Disse celler kan dyrkes in vitro 10 og vides at secernere et protein med en PDGF-lignende aktivitet (Heldin et al., Nature 319: 511-514, 1986). Identiteten af det cDNA, som kodede for A-kæden, kan verificeres ved DNA-sekven-tering.

Ydermere kan egnede DNA-sekvenser konstrueres under an-15 vendelse af syntetiske oligonukleotider.

Når en egnet DNA-sekvens, som koder for et profein, der udviser en PDGF-lignende biologisk aktivitet, er identificeret, ligeres sekvensen til et fragment med én egnet promoter og et secerneringssignal. Promotorer, som kan anvendes i gær, inkluderer 20 gær alfa-faktor-promotoren (MFort ^promotoren) og gærtriosephos-phatisomerasepromotoren ( TP11-promotoren) (Kawasaki, US patent nr. 4.599.311). Der kan også opnås promotorer fra andre gærgener, f.eks. al koholdehyd rogenase 1 (ADH1), . alkoholdehydro-genase 2 (ADH2). Der kan også anvendes egnede promotorer fra 25 andre eukaryotiske arter, hvilket vil være nærliggende for en fagmand. De her beskrevne konstruktioner blev udformet således, at de PDGF-relaterede genprodukter vil blive secerneret fra værtscellen i mediet. I gær blev dette opnået ved at anvende præpro-secerneringssignalsekvensen i gærparringspheromon aipha-faktor 30 (Kurjan og Herskowitz, Cell 30: 933, 1982; Julius et al., Cell, 36: 309, 1984; og Brake et al., PNAS 81: 4642, 1984), skønt der kan anvendes andre secerneringssignaler. For at sikre effektiv tran-skriptionsterminering og polyadenylering af mRNA blev der tilføjet en gærterminatorsekvens, såsom ΤΡΠ-terminatoren (Alber og 35 Kawasaki, J. Molec.Genet. Appl., 1_: 419, 1982). Metoder til ligering af DNA-fragmenter er beskrevet mange gange (Maniatis et al.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982), og kan nemt udføres af en fagmand. Efter fremstilling åf ekspressionsenhedskonstruktioner indsættes konstruktionerne i en egnet ekspressionsvektor.

20 DK 176036 B1

Det foretrækkes at anvende en ekspression, som bevares stabilt i værtscellen, for at kunne fremstille mere biologisk aktivitet pr. kulturenhed. Egnede gærekspressionsvektorer i denne henseende inkluderer plasmiderne pCPOT og pMPOT2, som inkluderer 5 Schizosaccharomyces pombe genet, der koder for det glykolytiske enzym triosephosphatisomerase ( POT1-genet). Indføjelse af POT1-genet sikrer den stabile bevarelse af plasmidet i en egnet værtscelle, som har en deletion i TPI-genet, på grund af plasmidets evne til at supplere værtscel legendeletionen. Der kan ogsl anvendes 10 andre selektionssystemer, såsom det Jeu2-selektionssystem, som beskrives af Beggs (Nature 275: 104-109, 1978).

Efter fremstillingen af DNA-konstruktionen, som omfatter promotoren, alfa-faktor-secerneringssignalsekvenserne, den hensigtsmæssige DNA-sékvens, som koder for et molekyle, der har en 15 PDGF-lignende biologisk aktivitet, samt TPI-terminatoren i en egnet vektor, transformeres konstruktionen ind i gærværten med en TPI -deletion. Fremgangsmåder til transformering af gær er velkendte fra litteraturen (se f.eks. Beggs, se ovenfor, og Hinnen et al., Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75: 1929-1933, 1978).

20 De transformerede gærceller kan selekteres ved vækst på traditionelt, kompleks medium, som indeholder glucose, når pCPOT-eller pMPOT2-vektoren anvendes. Der kan anvendes et traditionelt medium, såsom YEPD (20 g glucose, 20 g Bacto-peptone, 10 g gærekstrakt pr. liter). Når transformanter, som indeholder de 25 hensigtsmæssige ekspressionskonstruktioner, er selekteret, dyrkes de til stationær fase på traditionelle, komplekse medier, cellerne fjernes ved centrifugering eller filtrering, og mediet koncentreres.

Idet man vidste, at autentisk, human PDGF er et meget kationisk og hydrofobt protein (Raines og Ross, se ovenfor, Antoniades, se 30 ovenfor, Deuet et al., 1981, se ovenfor) var det forventet, at de gærudtrykte PDGF-beslægtede produkter ville have lignende egenskaber, hvilket gjorde det muligt at anvende ionbytningskromatografi ved deres oprensning.

Under anvendelse af en række analyser kan det påvises, at 35 brugte medier fra gærkulturer, der udtrykker PDGF-analoger, udviser biologiske aktiviteter, der stort set er identiske med autentisk human PDGF.

Ekspressionen af biologisk aktive PDGF-analoger i andre eu-karyotiske celler end gærceller kan opnås af en fagmand under 21 DK 176036 B1 anvendelse af egnede ekspressions/regulatlonsslgnaler. Transkrip-tionelle promotorer, som er Γ stand til at dirigere ekspressionen af disse sekvenser vælges for deres evne til at give effektiv og/eller kontrolleret ekspression i den bestemte eukaryotiske celletype. Der 5 findes en række promotorer, inklusive virale promotorer, f.eks.

SV40- og adenoviruspromotorer) og cellulære promotorer (f.eks. metallothionein-gen-karin-promotor US patent nr. 4.601.978). Signalsekvenser, som er i stand til at dirigere genproduktet ind i cellens sekretoriske bane, udvælges på grund af deres funktion i 10' den hensigtsmæssige celletype. Andre brugbare regulatoriske signaler, såsom transkriptionstermineringssignaler, polyadenylerings-signaler og transkriptionelle enhancersekvenser, udvælges også på grund af deres funktion i den hensigtsmæssige celletype, hvor udvælgelsen heraf vil være nærliggende for en fagmand. Metoder til 15 transformering af pattedyrceller og til ekspression af klonede DNA-sekvenser omtales af Kaufman og Sharp (J.Mol.Siol. 159 : 601-621, 1982), Southern og Berg (J.Mol. Appl.Genet., 2· 327-341, 1982), og Neumann et al., (EMBO J., 1: 841-845, 1982).

Ifølge den foreliggende opfindelse er det muligt at fremstille 20 rekombinerede, PDGF-lignende molekyler, som er homodimerer eller heterodimerer med i det væsentlige identiske polypeptidkæder. For at frembringe heterodimerer indføres to forskellige ekspressionsenheder i den samme celle, og heterodimerer identificeres blandt de biologisk aktive produkter. Ekspressionsenhederne kan være på 25 forskellige ekspression s vektorer med forskellige selekterbare markører eller fortrinsvis på en enkelt ekspressionsvektor. Den sidstnævnte strategi giver den fordel, at der tilvejebringes et lige kopiantai af de to ekspressionsenheder.

Celledyrkningsmetoderne er blevet forbedret betragteligt i 30 løbet af de sidste adskillige år ligesom antallet og rækkerne af pattedyrceller, som vil vokse i kultur. Centralt for disse fordele er en bedre forståelse af dyrkede cellers næringskrav (f.eks. hormoner og vækstfaktorer) (Barnes og Sato, Cel 1, 22: 649, 1980). De typer af celler, som er i stand til at vokse i kultur, kan groft klassi-35 ficeres i to grupper: normale og transformerede. De såkaldte "normale" celler er almindeligvis ikke udødelige i kultur, de danner ikke tumorer, når de injiceres i dyr, og de bevarer en normal diploid karyotype. Normale celler kan også bevare meget af deres differentierede karakter i kultur. Inden for kategorien af normale celler er « de celler, som kun vil vokse i et begrænset antal generationer i DK 176036 B1 r : 22 kultur, kaldet "cellestammer" eller "primære kulturer". Nogle normale cellelinier kan, selv om de ikke opfylder alle transformations-kriterierne, vokse uendeligt i kultur. Transformerede celler er udødeliggjorte til vækst i kultur, de har typisk tabt deres diffe-5 rentierede fænotype, og de har fået karyotypiske afvigelser. De kan også være uafhængige af forankring for at vokse, og de inducerer tumorer, når de injiceres i et passende værtsdyr. Cellen i en hvilken som helst af disse kategorier, som vokser in vitro og har PDGF-receptorer, vil være modtagelige overfor PDGF-analogerne 10 ifølge den foreliggende opfindelse.

Som ovenfor anført er de her beskrevne proteiner egnede til brug i terapeutiske sammensætninger til at fremskynde sårhelingsprocessen hos varmblodede dyr. Den normale sårhelingsproces hos varmblodede dyr forløber i en ordnet serie af begivenheder, som 15 involverer interaktionen mellem kemotaktiske stoffer, vækstfaktorer og en række specialiserede celletyper. Denne proces inkluderer en ordnet vandring og i nogle tilfælde den efterfølgende proliferation af en række af disse specialiserede celletyper ind i sårområdet og involverer den komplekse vekselvirkning mellem en række biologisk 20 aktive faktorer. Denne proces omtales i detaljer i Hunt et al., (red.) "Soft and Hard Tissue Repair; Biological and Clinical Aspects", Praeger Publishérs, New York, 1984, som medtages her ved denne henvisning. I korthed resulterer vævsbeskadigelse i frigørelsen af kemotaktiske faktorer, der tiltrækker bestemte celle-25 typer, som derefter frigør yderligere og/eller andre kemotaktiske stoffer eller mitogene faktorer. Disse faktorer påvirker igen yderligere specialiserede celler, hvorved det beskadigede væv i sidste ende genopbygges. Der er ydermere evidens for, at den hastighed, hvormed denne proces normalt forløber, er begrænset af niveauet af 30 kemotaktiske stoffer og vækstfaktorer på sårstedet, og kan forøges ved tilsætningen af disse midler (Grotendorst et al., J.Clin.Invest.

76: 2323-2329, 1985, medtaget her ved denne henvisning).

Sårhelingsprocessen i huden begynder med dannelsen af et koagulat fra blodet, hvilket koagulat strømmer ind i såret. Dette 35 resulterer i et krydsbundet netværk af fibrinmolekyler, som binder såret sammen. Under denne proces klæber blodplader til beskadiget væv, bliver aktiveret og frigør indholdet af deres alfa-granula.

Bruddet i hudvævet, blod koaguleringsreaktionerne og blodplade-aktiveringen skaber alle molekyler, som forårsager vandringen af .en 23 DK 176036 B1 serie af nye celler hen til såret, hvorved repareringsprocessen initieres.

Blandt indholdet i de alfa-granula, som frigøres af blodpladerne, er PDGF. Ydermere inducerer et andet indhold i alfa-gra-5 nulaene og biprodukter fra koaguleringsreaktionerne tilsynekomsten af makrofager. Makrofager er en anden vigtig kilde til PDGF i såret. Afsættelsen af PDGF på beskadigelsesstedet tilvejebringer en kemotaktisk stimulus for fibroblaster til at komme ind i sårområdet, og en mitogen stimulus for fibroblasterne til herefter at proliferere, 10 hvorved de deltager i repareringsprocessen. En vigtig rolle for fibroblasterne er genskabelsen af bindevæv på sårstedet. Fibroblasterne prolifererer i såret og afsætter kollagen type I og II og andre extracellulære proteiner på bindevævsmatrixen. Tilstedeværelsen af nye fibroblaster og deres proteinprodukter rekonstrue-15 rer hudarkitekturen, således at den kan blive genepithelialiseret, og såret derved helet.

På lignende måde kræver også sårhelingsprocessen i relation til reparationen af bindevæv fibroblastinfiltration og -proliferation, hvilket fører til en efterfølgende kollagenafsætning.

20 Det er blevet vist, at proteinet ifølge den foreliggende opfin delse har i det væsentlige den samme biologiske aktivitet som autentisk PDGF. PDGF's basale biologiske aktivitet., navnlig induktionen af kemotaksi og mitogenese i modtagelige celletyper (inklusiv fibroblaster og glat-muskulatur-celler), ligger til grund for mange af 25 dette proteins fysiologiske roller, herunder dens rolle ved vævsgenopbygning.

Fordi PDGF's kemotaktiske og mitogene egenskaber er centrale for dets rolle i sirhelingsprocessen, vil de biologisk aktive proteiner ifølge den foreliggende opfindelse have en lignende terapeu-30 tisk anvendelighed. Disse biologisk aktive proteiner forventes derfor at have klinisk anvendelighed ved behandling af sir, hvor heling kræver vandringen og/eller proliferationen af fibroblaster. Ydermere virker PDGF som et kemotaktisk stof og et mitogent middel for glat-muskulatur-celler, hvis proliferation kan bidrage til 35 helingen af visse sår. Glat-muskulatur-celler vil blive påvirket af PDGF på en lignende måde, som beskrevet ovenfor for fibroblaster, hvorved de bidrager til helingsprocessen.

Hos personer med normal helingskapacitet accelererer exogene proteiner med PDGF's biologiske aktivitet tilsynekomsthastlgh'eden DK 176036 B1 24 for fibroblaster i siret og deres efterfølgende proliferation. Ydermere er der et stort antal personer, som har væsentlig svækket sirhelingskapacitet og derved mangler evnen til at bringe éndogene vækstfaktorer, som er nødvendige for sirhelingsprocesen, til sår-^ stedet. Hos disse personer får tilføringen af exogene proteiner med PDGF's biologiske aktivitet sårhelingen til at forløbe på normal mide.

Proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse forventes at accelerere helingsprocessen i et bredt spektrum af sirtilstande. I forbindelse med den foreliggende opfindelse inkluderer udtrykkene ,,sir‘l eller '‘sårtilstand" ethvert brud på hudens dermale lag. Eksempler på brud pi det dermale lag inkluderer kroniske, ikke-helende dermale ulcus (som kan have en . række årsager), overfladiske sår og flænger, afskrabninger, kirurgiske sår og nogle forbrændringer. Ydermere kan sår også skyldes beskadigelse af bindevæv, hvis genopbygning involverer fibroblastproliferation og col lagenafsætning. Proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse er nyttige til at fremme helingsprocessen af alle disse sir og vil også være nyttige ved behandling af andre sår, hvor helingen kræver vandringen 2Q og/eller proliferation af fibroblaster. Ydermere kan normal sårheling være forsinket af en række faktorer, herunder fremskreden alder, diabetes, cancer og behandling med anti-inflammatoriske lægemidler eller antikoagulerende midler, og de foreliggende proteiner kan anvendes til at udligne de forsinkende .sårhelingsvirkninger af 25 sådanne behandlinger. Lawrence et al., (Ann.Surgery 203: 142-147, 1986) påviste, at PDGF genetablerede sårhelingsprocessen til det normale hos diabetiske rotter. Knighton et al., (Ann.Surgery 204: 322-330, 1986) anvendte en blandet vækstfaktorpræparation, som omfattede PDGF, på kroniske, ikke-helende hudsår hos patienter og jq observerede dramatiske positive resultater. Deres resultater indikerede, at noget af aktiviteten af deres præparation skyldtes PDGF, og at PDGF bidrager til den hurtige heling, som de ser hos mennesker, sådan som det gør i dyreforsøg. PDGF virker synergistisk sammen med andre komponenter i præparationen.

35 T" terapeutisk anvendelse i de her beskrevne anvendelses områder indgives proteiner ifølge den foreliggende opfindelse fortrinsvis topisk i kombination med en fysiologisk acceptabel bærer eller fortynder. Ydermere foretrækkes det at anvende en i det 25 DK 176036 B1 væsentlig ren præparation af proteinet, dvs. en, som almindeligvis ikke indeholder urenheder eller kontaminerende forbindelser, som kunne interferere med dets terapeutiske anvendelse. Specielt fore-trukne er de præparationer, som ikke indeholder toxiske, antigene 5 eller inflammatoriske substanser eller andre skadelige substanser, og som er mere end 80% rent. Typist findes de her ønskede proteiner i en koncentration på fra ca. Ί til 50 pg/ml total volumen, skønt det vil være indlysende, at koncentrationer i området fra 10 pg/ml til 100 pg/ml kan anvendes. Det skal imidlertid bemærkes, at 10 koncentrationer på over 50 pg/ml kan resultere i nedsat terapeutisk virkningsfuldhed. En terapeutisk effektiv mængde, som er tilstrækkelig til at accelerere tilsynekomsten og forøge antallet af nye fibroblaster i sårrummet og til at stimulere DNA-syntese i fibro-blasteme og collagenafsætningen af disse fibroblaster vil typisk 15 ligge i området fra 1 til 5 ml af præparationen, hvilket afhænger af sårets karakteristika.

Terapeutiske sammensætninger ifølge den foreliggende opfindelse omfatter de her beskrevne proteiner i kombination med egnede bærere, såvel som adjuvanser, fortyndingsmidler eller stabilisatorer.

20 Egnede adjuvanser inkluderer collagen- og hyaluronsyrepræpara-tioner, fibronectin, faktor XIII og andre proteiner eller substanser, som er beregnet til at stabilisere eller på anden måde forøge den (de) aktive terapeutiske bestanddel(e). Fortyndingsmidler inkluderer albuminer, salin, sterilt vand osv. Der kan også tilsættes andre 25 stabilisatorer, antioxidanter ellér proteaseinhibitorer. Alternativt kan proteinerne tilføres sårforbindinger som vandige opløsninger.

De terepeutiske sammensætninger ifølge den foreliggende opfindelse kan tilføres igen med én til adskillige dages intervaller, indtil heling er fuldstændig.

30 De terapeutiske sammensætninger ifølge den foreliggende opfin delse kan også indeholde andre farmaceutisk aktive bestanddele, f.eks. heparin, som kan vises at accelerere helingen af varme-forbrændringer. Andre vækstfaktorer, såsom TGF-a, TGF-β, EGF, FGF, blodpladefaktor 4, insulin eller somatomediner (se GrotendOrst 35 et al., 1985) og angiogenesefaktor, kan også fungere synergistisk med de her beskrevne PDGF-analoger. Der kan også inkluderes antibiotika for at holde såret fri for infektion.

I korthed angår eksemplerne følgende. Eksempel I viser konstruktionen af en v-sis-subklon af en pSSV-11 i det E.coli replike- 26 DK 176036 B1 rende plasmid pUC13, herefter betegnet pVSIS/Pst. Eksempel II viser konstruktionen af plasmidet pVSa, som inkluderer ligeringen af v-sis til MFa1 -promotoren og -secerneringssignalsekvensen.

Eksempel III viser den oligonukleotidstyrede deletionsmutagenisering 5 af de første 195 basepar af v-sis-genet under anvendelse af en metode, som udnytter den enkeltstrengede bakteriofag M13 til at eliminere de første 66 aminosyrer i v-sis-genproduktet, p28SIS, som ikke er homologe med B-kæden i PDGF. En fremkommet fag med den korrekte deletion blev betegnet m11vs2a. Eksempel IV viser kon-10 struktionen af ekspressionsvektoren pVSBm. Eksempel V viser transformationen af gærværtsceller. Eksempel VI viser konstruktionen af pSBI. Eksempel VII viser konstruktionen af varianter og derivater af B-kæden. Eksempel VIII viser konstruktionen af varianter og derivater af A-kæden. Eksempel IX viser konstruktionen 15 af gærekspressionsvektorer for A- og B-kædevarianterne og -derivaterne. Eksempel X viser en fremgangsmåde til fremstilling af en A-B-heterodimer i gær. Eksempel XI viser koncentreringen af brugt gærvækstmedium fra transformerede kulturer og efterfølgende analyse for PDGF-lignende materiale. Der anføres klar evidens for, at 20 disse gærmedier, som indeholder de her beskrevne PDGF-analoger, har i det væsentlige den samme biologiske aktivitet som autentisk human PDGF. Eksempel XII viser fremgangsmåder til at optimere proteinekspression.

De efterfølgende eksempler er anført alene til illustrering og 25 skal ikke på nogen mide betragtes som begrænsende.

Eksempel I

Subkloning af v-sis fra pSSV-11..

Det retrovirale SSV-genom blev klonet fra normale rottenyre-30 celler (NRK-celler), som var inficeret med SSV-11 på ikke produktiv måde, og som havde SSV integreret i deres genom (Devare et al., 1982, se ovenfor). SSV-DNA'et blev isoleret som et 5,8 kilobase (kb) langt Eco RI fragment og blev derefter indsat i plasmidet pBR3H2, hvilket resulterede i klonen pSSV-11. Denne klon 35 blev opnået fra S. Aaronson (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Fig. 1A viser et skematisk restriktion s kort for det 5,8 kilobase lange provirale genom af SSV. Kun de restriktionssteder, som er relevante i forbindelse med den foreliggende opfindelse, er angivet.

Den åbne kasse betegner den p28sis-kodende del af v-sis-genet.

27 DK 176036 B1

Fig. IB viser nukleotidsekvensen af v-sis-genet og nogle SSV-sekvenser. v-sis-genet blev indsat 19 nukleotider 3' for den formodede ATG-initieringscodon i hylstergenet (env-genet) i SSV (Devare et al., 1982, se ovenfor). Det formodes, at transkription 5 og translation af v-sis-sekvenser styres af SSV-sekvenser, hvilket resulterer i et env-sis-fusionsprotein. Den i fig 1B viste nukleo-tidsekvens er korrigeret i forhold til den, der er publiceret af Devare et al. 1982 (se ovenfor). Korrektionerne omfatter de korrektioner, der blev foretaget af Devare et al. i 1983 (se ovenfor) 10 og af de foreliggende opfindere. Det originale nummeringsskema ifølge Devare et al. (1982, se ovenfor) er bevaret her for at lette sammenligning. De tal, der er brugt på restriktionsstederne i figur 1A, stammer fra figur 1B.

En subklon af pSSV-11 (figur 2), som indeholdt en del af 15 v-sis-genet, blev konstrueret i det E.coli replikerende plasmid pUC13 (Vieira og Messing, Gene, 19: 259, 1982 og Messing,

Meth.in Enzymology 101: 20, 1983). Fem mikrogram (pg) af pSSV-11 blev fordøjet med restriktionsendonukleasen Pst I, og det 1,2 kb lange fragment, som indeholdt sekvenserne nummereret 454-1679 20 (fig.1), blev oprenset ved agarosegelelektroforese (0,9%) og blev ekstraheret fra gelen med cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) plus butanol (Langridge et al., se ovenfor). 2 pg.pUC13 blev også fordøjet med Pst I, blev phenol/chloroform (CHCI3)-ekstraheret og præcipiteret med ethanol (EtOH). 40 ng af det 1,2 kb lange v-sis-25 fragment og 50 ng af det Pst I skårne pUC13 blev ligeret natten over ved stuetemperatur med 40 enheder (u) T^-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli K-12 stamme i JM83 (Messing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publica- j tion No. 79-009, 2, Nr. 2 , 43-48, 1979) i nærværelse af 5-brom-30 4-chlor-3-indolyl-p-D-galactosid (X-gal) og isopropyl-p-D-thiogalac-tosid (IPTG). Plasmid-DNA, som var fremstillet ud fra ampicillin-resistente hvide kolonier, blev fordøjet med Pst1 for at bekræfte tilstedeværelsen af indføjelsen, og det fremkomne plasmid blev betegnet pVSIS/Pst.

35 28 DK 176036 B1

Eksempel l>

Konstruktion af plasmidet pVSa A. Præparation af v-sis til fusion med MFal.

5 600 mikrogram plasmid pSSV-11 (fig.2) blev fordøjet med re stri ktionsendonukleaserne Barn Hl og Pvu II i 200 mi kroliter 50 mM NaCI, 10 mM MgCI2/ 10 mM Tris pH 7,5 (medium salt puffer) og 100 pg/ml bovinserumalbumin (BSA) natten over ved 37°C. De fordøjede produkter blev underkastet elektroforese gennem en 1,1% agarose-10 gel, og det 1100 basepar lange Bam Hl - Pvu II fragment (figur 2) blev skåret ud, ekstraheret og præcipiteret med EtOH. DNA-pelle-ten blev opløst i 75 μΙ Hph I puffer, hvortil var tilsat 20 μ| af 1 mg/ml BSA og 5 μΙ Hph I. Efter fordøjelse natten over ved 37°C blev blandingen underkastet elektroforese gennem en 1,25% aga-15 rosegel, og det 396 bp lange Hph I - Pvu II fragment blev isoleret fra gelen og præcipiteret med EtOH. DNA-pelleten blev opløst i 30 μΙ Klenow-puffer (6 mM Tris, pH 7,5, 6 mM MgCI2, 60 mM NaCI) og det 3'-fremstikkende nukleotid ved Hph I spaltningsstedet blev fjernet ved behandling med 5 u Klenow-polymerase i 5 minutter ved 20 37°C. Der tilsattes 1 μΙ af en blanding, som indeholdt alle 4 deoxy- ribonukleotider hver ved 1 mM, og reaktionsblandingen blev inkuberet i yderligere 10 minutter. Efter ekstraktion med phenol/CHCI^/ ether (EtgO) og præcipitation med EtOH blev DNA-pelleten opløst i 30 μΙ medium salt puffer og fordøjet med 5 u Bgl II i 3 timer ved 25 37°C. DNA'et blev underkastet elektroforese gennem en 1,25% aga- rosegel, og det 269 bp lange Hphl-Bgl II fragment blev ekstraheret og EtOH-præcipiteret. Hphl-spaltningsenden af det stumpendede Klenow-fragment begynder med trinukleotidsekvensen 5'ATG... (fig.2) 30 3‘TAC...

B. MFal-promotor- og -sekretionslederfragment.

Plasmid pi92 (fig.3) omfatter en del af genet for gærparrings-pheromonet α-faktor (MFal-genet) klonet i det bakterielle plasmid 35 pUC13 (Vieira og Messing, se ovenfor, og Messing, Meth in Enzy-mology 101:20, 1983). Kloning af MFal-genet fra et genomisk bibliotek var blevet beskrevet af Kurjan og Herskowitz (se ovenfor).

Genet blev isoleret i dette laboratorium pi lignende måde, idet der som udgangsmateriale blev anvendt et genomisk gærbibliotek med 29 DK 176036 B1 partielle Sau3A-f ragmenter klonet i Barn Hl-stedet I Yep13 (Nasmyth og Tatchell, Cell, 19: 753, 1980). Fra dette bibliotek blev der isoleret et plasmid, som udtrykte α-faktoren i en diploid stamme af gær, der var homozygot for mata2-34-mutationen (Manney et al., 5 J.Cell Biol 96:1592, 1983). Klonen indeholdt en indføjelse, som overlappede med det MFa1 -gen, som er karakteriseret af Kurjan og Herskowitz (se ovenfor). Dette plasmid, kendt som pZA2 (fig.3), blev skåret med Eco RI, og det 1700 bp lange fragment, som omfattede MForl -genet blev oprenset. Dette fragment blev derefter sub-10 klonet i Eco RI-stedet i pUC13 til frembringelse af piasmidet pl92.

15 pg plasmid pl92 blev fordøjet i 30 μΙ medium salt puffer med 20 enheder Hind III natten over ved 37°C. Reaktionsblandingen blev fortyndet til 60 μΙ med Klenow-puffer, og de 4 deoxyribonukleotider blev tilsat til en slutkoncentration på 50 μΜ af hver. 10 enheder 15 Klenow-polymerase blev tilsat til den iskolde blanding, og inkube- ringen fik lov til at fortsætte 12 minutter ved 15°C. Efter phenol/ CHCIg/EtgO-ekstraktion blev den vandige fase koncentreret ved frysetørring til et volumen på 10 μΙ og blev fordøjet med 20 enheder Eco RI i 70 minutter ved 37°C. Produkterne blev underkastet elek- 20 troforese gennem en 0,9% agarosegel, og det 1,2 kb lange Eco Ri-

Hind II l-(stumpendede)MFor1-fragment blev ekstraheret og EtOH-præcipiteret. Dette fragment indeholdt sekvenserne for den tran-skriptionelle promoter og secerneringssignalet i MFo1.

25 C. Fremstilling af v-sis 3'-sekvenser og kloning af vektor pUC12; fragmentligering.

20 pg plasmid pVSIS/Pst blev fordøjet med Bgl II og Xba I i 40 μΙ medium salt puffer. Efterfølgende elektroforese gennem 1% aga-30 rose, ekstraktion af DNA'et og EtOH-præcipitering tilvejebragte det oprensede 756 bp lange Bgl 11-Xba I v-sis-fragment (fig. 2). Det E.coli-replikerende plasmid pUC12 (5 pg) blev fordøjet med Eco RI og Xba I og blev gelrenset som ovenfor (fig.2).

Under henvisning til fig. 2 blev ækvimolære mængder af de 35 fire DNA-fragmenter, som er beskrevet ovenfor, og som er indstillet til 10 ng af det 296 bp lange Hphl-Bgl 11-v-sis-f ragment blandet i 15 μΙ ligasepuffer (6 mM Tris pH 7,6, 6,6 mM MgClg, 0,4 mM ATP, 2 mM spermidin, 20 mM DTT og 100 pg/ml BSA) og blev ligeret med 40 enheder T4~DNA-ligase natten over ved 14°C. Reaktionsbian- DK 176036 B1 30 dingen blev bragt til stuetemperatur, der blev tilsat yderligere 150 enheder T^-DNA-ligase, og blandingen blev inkuberet endnu 10 timer. 7 μΙ af ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli K12 RR1 (ATCC nr. 31343, Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977) 5 og ampicillinresistente transformanter blev selekteret. Der blev fremstillet plasmid-DNA fra 12 sidanne bakteriekolonier, og de blev fordøjet med Xba I. To kloner gav et 2,2 kb stort bånd, som er forudsagt ved den korrekte fragmentgruppering (fig.2). Yderligere j analyse af disse med Bgl ll-Xba l-restriktionskortlægning gav 10 forventede bind ved ca. 1,5 kb fra MFcr1/v-sis-fusionen og 760 bp for Bgl ll-Xba l-v-sis-fragmentet. DNA-sekvensanalyse bekræftede den ønskede nukleotidsekvens ved MFal/v-sIs-sammenslutningen.

Det fremkomne plasmid blev betegnet pVSa.

Eksempel III

15 Konstruktion af m11VS2a

Homologt mellem v-sis-proteinet p28SIS og PDGF begynder ved sis aminosyre 67 i p28 , en serinrest, som svarer til den NHg-termi- nale rest i B-kæden i PDGF (Johnson, se ovenfor).

Proteolytisk processering af det primære MFal-translationspro- 20 dukt finder sted ved Lys-Arg-spaltningssignalet 85 aminosyrer fra initieringsmethioninet (Kurjan og Herskowitz, se ovenfor). Der blev sis konstrueret et v-sis-derivat, hvorhos de første 66 codoner af p28 blev fjernet, således at serinrest 67 i v-sis umiddelbart følger MFcrt Lys-Arg-processeringssignalet.

25 Under henvisning til fig. 4 blev ca. 40 ng af det geloprensede 2,2 kb lange Xba I fragment ligeret med 120 ng Xba I fordøjet, alkalisk phosphatasebehandlet fVi13mp11.-DNA (Messing, Meth.in En-zymology, se ovenfor). Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli K12 stamme JM101 (ATCC 33876) i nærværelse af 30 X-gal og IPTG. Isolerede, hvide plaque blev opsamlet og anvendt til at inficere 3 ml kulturer af JM10l-celler i logaritmisk vækstfase.

DNA i replikativ form (RF) blev fremstillet, og der blev identificeret kloner, som bar det indføjede fragment i samme orientering som den positive (+) strengform af de enkeltstrengede, modne fager.

35 Enkeltstrenget fag-DNA blev fremstillet ud fra en sidan klon og betegnet mllVSct.

For præcist at fjerne codoner 1-66 i v-sis blev der udført oligonukleotiddirigeret mutagen i sering stort set ifølge den af Zoller et al. beskrevne 2-primermetode (Manual for Advanced Techniques 31 DK 176036 B1 in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). Oligonukleotidet ZC 130 3' AGAAACCTATTTTCCTCGGACCCA-5* blev syntetiseret på et Applied Biosystéms 380-A DNA-syntetiserings-apparat. 50 pmol ZC 130 blev kinasebehandlet i 10 μΙ kinasepuffer 5 (BRL) med 4 enheder T^-polynukleotidkinase i 45 minutter ved 37°C. Enzymet blev inaktiveret ved opvarmning ved 65°C i 10 minutter.

Et halvt pmol mllVSa blev anneleret (eng.: annealed) med 1 pmol kinasebehandlet ZC130 og 1,5 pmol universal sekventerings-10 primer (BRL) under anvendelse af beskrevne betingelser (Zoller et al., se ovenfor) med undtagelse af, at anneleringsblandingen først blev opvarmet til 65°C i 10 minutter, overført til 37°C i 10 minutter og derefter hurtigt afkølet på is. Anneleringsblandingen blev derefter behandlet med Klenow-polymerase som beskrevet af Zolier et 15 al., (se ovenfor) til frembringelse af cirkulært duplex-DNA. Portioner af elongeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli K12, JMl01-cel!er. De fremkomne fagplaque blev screenet for den korrekte deletion ved overføring til nitrocellulosefiltre og efterføl- 32 o gende hybridisering med cP-phosphoryleret ZC130 ved 65°C.

20 Sekvenser sat korrekt ved siden af hinanden dannede stabile du-plekser med den radioaktive probe ved den anvendte stringente hybridiseringstemperatur. Cirka 1% af de screenede transformanter gav positive signaler ved autoradiografi. 10 kloner blev plaque-oprenset, og der blev fremstillet RF-DNA til restri ktionsenzym-25 analyse. 5 i sol ater viste det forventede fald i størrelse pi 195 bp til det 1450 bp lange Hind lll-Bgi 11-fragment (fig. 4). DNA-se-kvensanalyse af de to isolater bekræftede, at den korrekte fusionssammenslutning var sket, således at den korrekte translationslæseramme blev bevaret. En af disse fager blev betegnet 30 m11 VS2a.

Eksempel IV Konstruktion af pVSBm 35 A. Konstruktion af plasmiderne YEpVSa og YEpVS2a.

Den gærreplicerende vektor YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121, 1979) blev anvendt som en ekspressionvehikel for de v-sis-afledte konstruktioner, som er beskrevet i eksemplerne II og III.

32 DK 176036 B1 YEp13 er et multikopi extra kromosomalt plasmid, som indeholder en 2 mikron replikationsorigin samt LEU2-gærgenet. Dette gør det muligt at selektere plasmidet i gaerstammer, som har et defekt kromosomalt LEU2-gen, når gæren dyrkes på syntetisk medium, som 5 mangler leucin. Tilføjelsen af gærtermineringssekvenser til fremmede gener, som udtrykkes 5 gær, sikrer effektiv transkriptionstermine-ring og polyadenylering af mRNA. v-sis-ekspressionsenhederne VSor og VS2« blev anbragt ved siden af TPI-terminatorfragmentet, som tidligere var blevet klonet i YEp13 (se nedenfor).

TO Plasmid p270 (se figur 5) indeholdt transkriptionsterminerings- området af gærtriosephosphatisomerasegenet (TPI). Det blev konstrueret pi følgende måde. Gsar-TP I -terminatorf ragmentet blev opnået fra plasmid pFG1 (Albert og Kawasaki, se ovenfor). Det omfattede området fra den næstsidste aminosyrecodon i TPI-genet til 15 Eco RI-stedet ca. 700 basepar nedenstrøms. Et Barn Hl genkendelsessted blev indsat i stedet for dette unikke Eco RI - sted i pFGI ved først at skære plasmidet med Eco RI, derefter gøre enderne stumpendede med DNA-polymerase I (Klenow-f ragment), tilsætte syntetiske Barn Hl-linkere (CGGATCCA) og genligere til frembrin-20 gelse af plasmid p136. TPI-terminatoren blev derefter udskåret fra p136 som et Xba Ι-Bam Hl-fragment. Dette fragment blev ligeret ind i YEp13 (Broach et al., se ovenfor), som var blevet linialiseret med Xba I og Barn Hl. Det fremkomne plasmid er kendt som p213.

Hind I Il-genkendelsesstedet blev derefter fjernet fra TPI-termina-25 torområdet i p213 ved at fordøje plasmidet med Hind III, gøre de fremkomne ender stumpe med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og gendanne en cirkel af det liniære molekyle under anvendelse af T^-DNA-ligase. Det fremkomne plasmid er p270.

Alternativt kan p270 konstrueres ved at fordøje plasmid pM220 30 (se nedenfor) med Xba I og Barn Hl, og oprense TPl-terminerings-fragmentet (ca. 700 bp) og indsætte dette fragment i YEp13 fordøjet med Xba I og BamHI.

Under henvisning til fig. 6 blev plasmid p270 DNA fordøjet med Xba I og behandlet med kalve-alkalisk-phosphatase for at 35 forhindre genligering af de klæbrige vektorender, v-sis-ekspres-sionsenhederne VSa og VS2ot blev fremstillet ved Xba I-fordøjelse og agarosegeloprensning af pVSa henholdsvis m11vs2a. Hver af de isolerede fragmenter blev ligeret med ca. ækvimolære mængder af phosphatasebehandlet p270-vektor i nærværelse af 40 enheder 33 DK 176036 B1 T^-DNA-ligase, og ligeringsblandingerne blev transformeret ind i E.coli ΚΊ2 RR1. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra ampicillin-resistente kolonier, og der blev udført restriktionsenzymanalyser for at identificere kloner, som havde TPI-terminatoren naboliggende 5 til 3'-v-sis-sekvenser. Tilstedeværelse af 3,3 kb eller 3,1 kb lange Bgl 11-fragmenter efter gelelektroforese indikerede den korrekte orientering af YEpVSa henholdsvis YEpVS2a.

B. Konstruktion af plasmidet pVSB.

10 Fordi det produkt, som kodes af pVS2a, er større end auten tisk, human PDGF B-kæde, og fordi et mindre produkt resulterer i højere ekspressionsniveauer i en transformeret gærværtscelle, blev der konstrueret en vektor, som omfattede v-sis-sekvensen af pVS2a trun keret ved 3'-enden. Det poly peptid, som kodes af denne se-15 kvens, omfatterné aminosyrerne 67 til 175 i p28sls og er homolog med B-kæden i PDGF.

Der blev konstrueret en ekspressionsvektor, som indeholdt denne nB-kaedeu-sekvens, ved at kombinere elementer af pVS2a-ekspressionsenheden med et partielt v-sis-gen og et syntetisk 20 dobbeltstrenget DNA-fragment, som koder for aminosyrerne 158 til 175 i p28s,s. Dette syntetiske fragment blev udformet til at substituere foretrukne gaercodoner med mange af de 13 v-sis-codoner, den erstatter, og til at tilvejebringe en stopcodon i slutningen af den kodende sekvens. Konstruktionen af denne vektor er illustreret 25 pi figurerne 7 og 8.

Plasmid YEpVS2cr blev fordøjet med Pst1 og Barn Hl, og det 1,8 kb lange fragment, som omfattede de partielle MFa1-, v-sis- og TPl-terminatorsekvenser blev oprenset ved agarosegelelektroforese.

Plasmid plC19R (March et al., Gene 32 : 481-486, 1984), som om-30 fattede den polylinker, der er vist pi diagram 1, indsat i Hind III-genkendelsesstedet for pUC19 (Norrander et al., Gene 26: 101-106, 1983) blev fordøjet med Pstl og Barn Hl, og vektorfragmentet blev geloprenset og sammensluttet med det 1,8 lange fragment fra pVS2or til frembringelse af plasmidet pVS2«T.

35 Diagram 1 gaattcatcgatatctagatctcgagctcgcgaaacctt

ECO RI ECO RV_Bgl 11 Sac I_Hind III

Cla I Xba I xho i Nru I

DK 1176036 B1 34 S.cerevisiae TPI-promotoren blev anvendt til at styre ekspressionen af VS2ct-sekvenser i en gærekspressionsvektor. Plasmid pM220 indeholder TPI-promotoren fusioneret til MFa1 -signalsekvensen. E.coli RRI transformeret med pM220 er blevet deponeret hos 5 American Type Culture Collection under deponeringsnummer 39853.

Plasmid pM220 blev fordøjet med Bgl II og Pstl (figur 7), og det ca. 1 kb lange fragment, som omfattede TPI-promotoren og 5'-delen af MFort-sekvensen, blev isoleret og klonet i plC19R fordøjet med Bgl II og Pst1. Det fremkomne plasmid blev fordøjet med 10 Cla I og Pst1, og TPI-promotor-MJForl-fragmentet blev geloprenset.

Plasmid pVS2aT blev udskåret med Cla I og Pst1 og sammensluttet med TPI -promotore-MFa1 -fragmentet. Den korrekte konstruktion blev identificeret ved tilstedeværelsen af et 2,6 kb langt Cla I-Bam Hl fragment og blev betegnet pTVS2ctT.

15 10 mikrogram plasmid pVSa blev fuldstændig fordøjet med

Xma I og Sph I (figur 8). Det fremkomne ca. 4,9 kb lange vektorfragment, som også omfattede det meste af v-sis-sekvensen, blev oprenset ved agarosegelelektroforese, ekstraktion af DNA'et og EtOH-præcipitation.

20 For at tilføre en nye 3'-ende i v-sis-sekvensen blev et dob- beitstrenget DNA-fragment konstrueret ud fra oligonukleotider, som blev syntetiseret på et Applied Biosystems Model 380-A DNA-synte-tiseringsapparat. 0,7 pmol oligonukleotid ZC299 (tabel 1) blev opvarmet med en ækvimolær mængde oligonukleotid ZC300 i et volu-25 men på 10 mikroliter, som indeholdt 40 mM NaCl, i 5 minutter ved 65°C.

TABEL 1 ZC299 : 5'tAAG TGT G AA ATC GTT GCC GCG GCT AGA GCT GTT ACC TAA TCT AGA3' 30 ZC3000: 3'gTACA TTC ACA CTT TAG CAA CGG CGC CGA TCT CGA CAA TGG ATT AGA TCT GGCC5’

Blandingen blev derefter inkuberet ved 37°C i 5 minutter og 35 fik lov til at afkøle ved stuetemperatur. 0,2 pmol af det oprensede, 4,9 kb lange vektorfragment blev tilsat, blandingen blev ligeret i 18 timer ved 12°C og anvendt til at transformere E.coli HB101 (ATCC 33694) til ampicillinresistens. DNA blev fremstillet ud fra ampicillin-resistente kolonier og blev fordøjet med Bgl II og Xba I. Efter 35 DK 176036 B1 elektroforese gennem agarose blev den ønskede klon (kendt som pVSaB) til slut identificeret ved tab af et ca. 750 bp langt Bgl ll-Xba l-fragment og tilsynekomsten af to mindre fragmenter på ca. 500 og 260 bp.

5 Ca. 8 mikrogram plasmid pTVS2aT (figur 8) blev fordøjet fuldstændig med Xba I i et volumen på 10 μΙ. Voluminet blev forøget til 40 μ! Bgl 11-puffer, og blev tilsat 6 enheder Bgl II, og blandingen blev inkuberet ved 37°C. 10 μΙ delprøver blev overført til en stoppuffer, som indeholdt 50 mM EDTA, ved 15 og 30 minutter, 10 og de resterende 20 mikroliter . blev standset efter 45 minutter. De fremkomne blandinger blev separeret ved elektroforese gennem 0,7% agarose. Det ca. 4,6 kb lange Bgl 11-Xba I-vektorfragment blev skåret ud, blev ekstraheret fra gelen og EtOH-præcipiteret. Plasmid pVSaB blev fordøjet med Bgl II og Xba I, og det ca. 260 bp lange 15 fragment, som indeholdt den syntetiske 3'-ende og stopcodon, blev isoleret ved elektroforese gennem agarose, efterfulgt af ekstraktion fra gelen og EtOH-præcipitering.

Det 4,6 kb lange Bgl ll-Xba I-vektorfragment fra pTVSaT og det 260 bp lange Bgl ll-Xba i-fragment fra pVSaB blev ligeret i 20 nærværelse af T^-DNA-ligase i 7 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli HB101 til ampicillinresistens. DNA blev fremstillet ud fra transformanter, og tilstedeværelsen af den ønskede indføjelse blev bekræftet ved at screene for et 550 bp langt Pst I--Xba I bånd på en agarosegel. Et 25 plasmid, som havde den korrekte konfiguration, blev betegnet pVSB.

Der er adskillige alternative fremgangsmåder, som kan anvendes til at konstruere plasmid pVSB. De essentielle elementer i pVSB inkluderer: TPI-promotor/alfa-faktorfusionen, som kan opnås 30 ud fra plasmid pM220, den B-kæde kodende sekvens (baserne 551 til 877 vist i figur 1B) af v-sis-genet, som er almindelig tilgængelig, og TPI-terminatoren, som kan opnås fra plasmid p270. En fagmand kan udvikle adskillige strategier til at opnå pVSB under anvendelse af disse elementer.

35 C. Konstruktion af pMPOT2.

For at opnå den maximale protein produktion I en gærkultur, er det ønskeligt at anvende ekspressionsvehikier, som bevares meget stabilt i værtscellen. Plasmid pCPOT er en sådan foretrukken ekspressionsvehi kel.

DK 176036 B1 36 E.coli HB101 transformeret med pCPOT er deponeret hos American Type Culture Collection under deponeringsnummer 39685. Plasmid pCPOT omfatter det cirkulære 2 mikron genom (Hartley og Donelson, Nature 286: 860, 1980), E.coli plasmid pBR322-replike-5 rings- og selektionssekvenser og Schizosaccharomyces pombe DNA-sekvenser, som koder for det glykolytiske enzym triosephosphat-isomerase (POT1). Tilstedeværelsen af POT1-genet i pCPOT sikrer stabil bevarelse af plasmidet I den passende værtsbaggrund under vækst pi ikke-selektivt medium under anvendelse af glucose som en 10 carbonkilde.

Til ekspression af v-sis-derivaterne i gær blev der konstrueret en stabil ekspressionsvektor, som omfattede REP1-, REP2-, REP3-og ori-sekvenserne fra gær 2 mikron DNA og Schizosaccharomyces pombe triosephosphatisomerase-genet POT1. POT1-genet sørger for 15 plasmidbevarelse i en transformeret gærvært, som dyrkes pi et kompleks medium, hvis en sådan vært er defekt for triosephosphat-isomerase.

POT1-genet blev opnået ud fra plasmidet pFATPOT. S.cere-visiae stamme E18 transformet med pFATPOT blev deponeret hos 20 ATCC under deponeringsnummer 20699. Plasmidet kan oprenses fra værtscellerne ved hjælp af traditionelle metoder. POT1 -sekvensen blev fjernet fra pFATPOT ved fordøjelse af plasmidet med Sal I og Barn Hl. Dette ca. 1600 lange fragment blev derefter ligeret til plC19R, som først var blevet liniariseret ved fordøjelse med Sal I 25 og Barn Hl. Genkendelsesstederne for Barn Hl, Pst I og Sal I i det fremkomne plasmid blev ødelagt i to trin til tilvejebringelse af plasmidet pICPOT*. Genkendelsesstederne for Pst l og Sal I blev fjernet ved at skære med Pst I og Sal I; endernv gjort stumpe ved at fordøje de Pst I 3'-fremstikkende ender med DNA-polymerase i 30 (Klenow-fragment) og udfylde den fremstikkende 5'-ende fra Sal I med Klenow-fragment. De stumpe ender blev derefter ligeret.

Barn Hl-genkendelsesstedet blev fjernet ved at skære plasmidet med Barn Hl, udfylde enderne med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og genligere de stumpe ender.

35 2 μ sekvenserne blev opnået ud fra plasmiderne YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121-133, 1979) og C1/1. C1/1 blev konstrueret ud i fra pJDB248 (Beggs, Nature 275: 104-109, 1978) ved at fjerne I pMB9-sekvenserne ved partiel fordøjelse med Eco RI og erstatte det med pBR322 behandlet med Eco RI. REP3 og ori-sekvenserne blev fjernet fra YEp13 ved fordøjelse med Pstl og Xba I og geloprens- 37 DK 176036 B1 ning. REP2 blev opnået fra C1/1 ved fordøjelse med Xba I og Sph l og geloprensning. De to fragmenter blev derefter føjet sammen med pUC18 (Norrander et al., Gene 26: 101-106, 1983), som var blevet liniariseret med Pst I og Sph I til frembringelse af plasmid 5 pUCREP2,3. REP1 blev opnået ud fra C1/1 ved fordøjelse med EcoRI og Xba I og geloprensning af det 1704 bp lange fragment. Eco Rl-Xba l-fragmentet blev klonet i pUC13, som var blevet liniariseret med Eco RI og Xba I. Det fremkomne plasmid blev betegnet pUC13+ REP1. pUC13+REP1-p!asmidet blev skiret med Hind II og ligeret i 10 nærværelse af Eco RI-linkere (opnået fra Bethesda Research Laboratories). REPT-genet blev derefter fjernet som et Eco Rl-fragment på ca. 1720 bp. Dette Eco Rl-fragment blev klonet i plC7 (March et al., se ovenfor), som var blevet liniariseret med Eco RI og Xba I.

Det fremkomne plasmid blev betegnet pICREPI nr.9.

15 For at konstuere den endelige ekspressionsvektor pMPOT2 (fig. 8) blev pICPOT* liniariseret ved en partiel Hind Hl-fordøjelse og en fuldstændig Sst I-fordøjelse. Plasmid pUCREP2,3 blev skåret med Hind III og Sst I, og det fragment, som omfattede REP2-, REP3-og ori-sekvenserne blev geloprensét og sat sammen med det 20 liniariserede pICPOT*. Det fremkomne plasmid, som omfattede REP2-, REP3-, ori-, POT1- og ampr-sekvenserne, blev betegnet pMPOTI. REP1 blev derefter fjernet fra pICREPI som et Bgl 11 -Nar I fragment og blev ligeret til pMPOTI, som var blevet spaltet med Bgl II og Nar I. Produktet fra denne ligering blev betegnet 25 pMPOT2 (deponeret hos ATCC, deponeringsnummer 20744). Plasmid pMPOT2 blev fordøjet med Cla I og Barn Hl, og vektorfragmentet blev oprenset som ovenfor.

D. Indsættelse af VSB-ekspressionsenheden i pMPOT2.

30 Plasmid pVSB blev fordøjet med Cla l og Bam Hl, og det 2,2 kb lange fragment, som indeholdt "B-kæde"-ekspressionsenheden blev oprenset ved agarosegelelektroforesé og EtOH-præci pi tering.

Plasmid pMPOT2 blev også fordøjet med Cla I og Bam Hl. Fragmenterne blev ligeret natten over ved stuetemperatur i nærværelse 35 af T4-DNA-ligase, og reaktionsbtandingen blev anvendt til at transformere E.coli HB101 til ampicillinresistens. DNA blev fremstillet ud fra transformanter, og tilstedeværelsen af indføjelsen blev bekræftet ved fordøjelse med Cla I og Bam Hl samt agarosegelelektroforese.

Den fremkomne ekspressionsvektor blev betegnet pVSBm (figur 8).

____________________ ______i 38 DK 176036 B1

Eksempel V Gærtransformation

Plasmiderne pVSBm og pMPOT2 blev anvendt til at transformere S.cerevisiae stamme ΕΊ8 nr. 9 med traditionelle metoder.

5 Stamme E18 nr. 9 er en diploid stamme fremstillet ved at krydse stammerne E11-3c (ATCC nr. 20727) (Atpi::L£U2 pep4 Ieu2 MAToQ og Atpi29 (Atpi: :LEU2 pep4 Ieu2 his MATa). Atpi29 er fremstillet ved at afbryde triosephosphatisomerasegenet i stamme E2-7b (ATCC Nr.

20689), stort set som beskrevet af Rothstein (Meth. in Enzymology 10 101: 202-210, 1983).

Eksempel VI Konstruktion af pSB1

For at begynde udskiftningen af den B-kæde-kodende sekvens med den A-kæde-kodende sekvens i pVSB-vektoren blev der skabt 15 et hensigtsmæssigt Sst l-restriktionsendonukleasested tæt ved α-faktor-præpro-B-kædegrænsen (fig.8). Dette blev opnået ved oligonukleotidstyret mutageni sering (Zoller og Smith, DNA 3: 479-488, 1984) på en enkeltstrenget pVSB-template under anvendelse af velkendte metoder. Det anvendte mutagene oligonukleotid 20 blev kaldt ZC506 og kan ses i tabel 2.

Tabel 2

ZC505 GAACCCAGGCTTGCAGCTGGCAAAGATACCCC ZC506 GGCTCCTTTT GAGCT CAGAT ACCCCT ZC545 GAT CTCGT AGAT AACGGT ACGCGT CTT ACAAACAGCTCT-25 CTTGAGCT

ZC546 CAAGAGAGCTGTTTGTAAGACGCGTACCGTTATCTACGA ZC547 CAAGAGATCTATCGAAGAAGCGGTACCAGCCGTTTGTAA-GACGCGTGA

ZC548 GATCTCACGCGTCTTACAAACGGCTGGTACCGCTT.CTTCGA-30 TAGATCTCTTGAGCT

ZC671 CGCGT CTT AGAAACAGCT G ZC672 GT ACCAGCTGTTTCT AAGA

ZC675 CAAGTGTGAAACCGTTGCTGCTGCTAGACCAGTTACCTAAT ZC676 CTAGATTAGGTAACTGGTCTAGCAGCAGCAACGGTTTCACA-35 CTTGCATG

ZC685 CAAGAGATCCTT GGGTT CTTT GACCATCGCTGAA ZC686 AGCTGGTTCAGCGATGGTCAAAGAACCCAAGGATCTCTT-GAGCT

39 DK 176036 B1

ZC687 CCAGCTATGAT CGCTGAATGTAAGACCAGAACCGAAGTTTT -CGA

ZC688 GATCT CGAAAACTTCGGTTCTGGTCTTACATTCAGCGATCAT ZC692 GATCCCAAGATCCCAAGTTGACCCAACCTCTGCCAACTTC 5 ZC693 TT GGCAGAGGTTGGGTCAACTTGGGATCTTGG

ZC746 TTGATTTGGCCACCATGTGTTGAAGTTAAGAGATGTACTGG-GTGT

ZC747 CAGTACATCTCTTAACTTCAACACATGGTGGCCAAATC AAG-AAG

10 ZC748 TGTCAAACCTCGAGTGTTAAGTGTCAACCATCCAGAGT

ZC749 GAT GGTT GACACTT AACACT CGAGGTTT GACAACACC ZC750 T CACCACAGATCCGTTAAGGTTGCCAAGGTTGAATACGTT-ACAAAGAAGCCAA

ZC751 AGCTTTGGCTTCTTTCT AACGTATTCAACCTTGGCAACCTT-15 AACGGATCTGTGGTGAACTCTG

ZC752 AGCTTAAGGAAGTTCAAGTT AGATTGGAAGAACACTTGGAA-T GT GCAT GCGCT ACCACCT CTTTGAACCCAGACT ÅCAGAGAA-T AAT

ZC753 CT AGATTATTCTCTGTAGTCTGGGTTCAAAGAGGTGGTAGC 20 GCATGCACATTCCAAGTGTTCTTCCAATCTAACTTGAACTT-

CCTTA

ZC ABA-1 CGCTTGTGCTACCACCTCTTTGAACCCAGACTACAGA-GAATAAT

ZC ABA-2 CT AGATT ATT CT CT GT AGT CT GGGTT CAAAGAGGTGG-25 TAGCACAAGCGCATG

Et Pst l-Xba t-fragment fra pVSB (figur 8) blev subklonet i M13-fagvektoren mp19. Enkeltstrenget template DNA blev fremstillet ud fra E.coli JM107 kulturer inficeret med denne rekombinerede fag og blev anvendt i den efterfølgende mutageniseringsreaktion. 5 μΙ 30 M13-template DNA (0,5 pmol) blev kombineret med 2 ml oligonukleo-tid ZC506 (1,8 pmol) plus 2,5 μΙ vand og 1,5 μΙ ΙΟχ annelerings-puffer A (0,2 M Tris-HCI, 0,0 M MgClg, 0,01 M DTT pH 7,5, Zoller og Smith, DNA 3: 479-488, 1984). Denne blanding blev anneleret ved opvarmning til 70°C i 5 minutter, langsom afkøling til stue-35 temperatur og derefter anbringelse på is. Til denne kolde annele-ringsblanding blev tilsat 1,5 μΙ 10x elongeringspuffer B (0,2 M Tris-HCI, 0,1 M MgClg, 0,1 M DTT pH 7,5, Zoller og Smith, se ovenfor), 6 μΙ deoxynukleotidtriphosphater (2,5 mM af hver dNTP) 1 μΙ T^-DNA-ligase, 1 μΐ DNA-polymerase Klenow-fragment, 1 μΙ DK 176036 B1 40 ATP (10 mM) og 5 μΙ vand. Denne blanding blev inkuberet i 16 timer ved 18°C. Denne reaktionsblanding blev derefter fortyndet 20 gange med vand, og 2 mikroliter af den fortyndede blanding blev anvendt til at transformere E.coli JWI107 celler. De fremkomne fag-5 plaques blev overført til nitrocelluloseskiver ved fremgangsmåden ifølge Benton og Davis (Science T96: 180, 1977) og blev screenet 32 med P-mærket ZC506, som var blevet mærket med T.-polynukleo- ** 32 tidkinase under standardbetingelser. Hybridiseringen af P-ZC506 til filtrene blev udført ved 37°C i 6x SSC (0,9 M NaCI), 0,09 M 10 Na-Citrat, pH 7,2), 100 pg/ml bærer-DNA, 0,05% natri umpyrophos-phat. Efter hybridisering blev filtrene vasket ved 54°C i 6x SSC, 0,1% 5DS. Fagplaques, som gav stærke autoradiografiske signaler, blev opsamlet, og RF-DNA blev fremstillet og analyseret for tilstedeværelsen af et nyt Sst l-restriktionsendonukleasested. Se-15 kvensen omkring Sstl-stedet blev også bekræftet ved DNA-se-kvensanalyse. Pstl-Xbal-subklonen, som nu indeholdt et Sstl-sted, blev ligeret tilbage i Pstl-Xbal-fordøjet pVSB, og det fremkomne plasmid blev kaldt pSB1. Plasmid pSB1 koder for to aminosyre-ændringer (Leu til Glu og Asp til Leu) i alfa-faktorlederen umid-20 delbart opstrøms Lys-Arg. Den fremkomne sammenkædningssekvens er: α-faktor ... Glu Leu Lys Arg Ser ... B-kæde. De B-kæde-kodende sekvenser i pSBI flankeres således af et Sstl-sted ved 5'-enden,og et Xba-sted ved 3'-enden.

Eksempel VII

25 Konstruktion af varianter og derivater af B-kæden A. Konstruktion af en human B-kæde ekspressionsenhed.

B-kædekonstruktionen pVSB beskrevet i eksempel IV ovenfor koder for abe B-kæde-aminosyresekvenseh hid rørende fra v-sis-30 genet. Denne B-kæde-aminosyresekvens adskiller sig fra den human B-kæde-aminosyresekvens ved 4 positioner: 6, 7, 101 og 107. Disse aminosyreforskelle er stort set konservative og påvirker sandsynligvis ikke B-kædens biologiske aktivitet.

For at udtrykke autentisk human B-kæde blev de abe-speci-35 fikke aminosyrer ændret til den humane sekvens ved at inkorporere syntetiske oligonukleotidduplexer, som koder for de humane aminosyrer, i pVSB-konstruktionen. I dette tilfælde var den foretrukne udgangsvektor pSBI (beskrevet ovenfor), som havde fået et Sstl- 41 DK 176036 B1 sted introduceret ved cr-faktor-B-kædesammenføjningen. DNA-se-kvenserne mellem dette Sst I-sted og Bgl 11-stedet ved aminosyre nr. 24 (fig.9) blev erstattet for at kode for de humane aminosyrer threonin og isoleucin ved positionerne 6 og 7. Der blev udformet 4 5 oligonukleotider, ZC685, ZC686, ZC687 og ZC688 (tabel 2) for at erstatte pSB1 -sekvenserne mellem Sst I og Bgl II. ZC685 og ZC686 blev anneleret til dannelse af én duplex, og ZC687 og ZC688 blev anneleret til dannelse af den anden. Disse to annelerede duplexer blev derefter ligeret med en pSB1-vektor fordøjet med Sst I og 10 Bgl II. Det fremkomne plasmid blev bekræftet ved DNA-sekven-tering og blev kaldt pSB11.

Aminosyreændringerne ved B-kæde-carboxylenden blev foretaget på en lignende made. Plasmid pSB11 blev fordøjet med Sph I og Xba I, og sekvenserne i dette området blev erstattet med en 15 syntetisk DNA-duplex udformet til at kode for de humane aminosyrer threonin ved position 101 og prolin ved position 107. Oligonukleotider ZC675 og ZC676 blev anneleret og ligeret i pSB11 fordøjet med Sph Ι-Xba I under standardbetingelser. Konstruktionen blev bekræftet ved DNA-sekventering og blev kaldt pB12. Dette 20 plasmid koder for den autentiske humane B-kæde-aminosyresekvens.

Alternativt kunne den humane B-kæde aminosyresekvens udtrykkes ved at udføre en stedspecifik mutagenisering på pVSB-plasmid for at ændre de pågældende fire aminosyrer og for at udtrykke en human B-kæde cDNA-sékvens.

25 B. .B-kæde mutant i monomer størrelse.

Biologisk aktivt PDGF, er, når det isoleres fra blodplader eller transformerede celler i kultur, en disulfidbundet dimer. Kemisk reduktion af dette dimére molekyle ødelægger dets biologiske aktivi-30 tet. Det har overraskende vist sig, at ændringer af cysteinrester i B-kæden, som er involveret i disulfidbindinger mellem kæder, til andre aminosyrer eller ændring af aminosyren nær disse cysteinrester tillader B-kæde-polypeptidet at folde korrekt, men tillader ikke, at disulfidbindinger mellem kæder dannes. Dette resulterer i 35 en monomer B-kæde opfoldet i en konformation, som tillader binding til PDGF-celleoverf ladereceptoren. Ændring af B-kæde-aminosyre lysin 98 til en leucin har resulteret i et molekyle, som er aktiv som en monomer. Dette molekyle blev fremstillet pi følgende måde.

i 42 DK 176036 B1

Plasmid pVSB (fig. 8) blev fordøjet med Sph I og Xba I, og DNA-sekvenser mellem disse restriktionssteder blev erstattet med en syntetisk oiigonukleotidduplex. Duplexen blev fremstillet ved at annelere oligonukleotider analoge til ZC299 og ZC300, men som 5 indeholder en leucincodon ved position 98 i stedet for en lysincodon.

Alle de andre codoner i dette område er bevaret og koder for B-kæde-aminosyresekvensen. Den annelerede duplex har en klæbrig 5'-Sph I ende og en 3'-Xba I-ende og ligeres ind i pVSB fordøjet med Sph I og Xba I. Denne B-kædemutant blev kaldt pSB6.

10 Nir denne konstruktion klones ind i pMPOT2-plasmidet (her efter kaldt pSB6m) og transformeres ind i gær, producerer den mitogent, aktivt materiale. Når det udtrykte, mitogene materiale yderligere fraktioneres på en polyacrylamidgel og derefter elueres fra stykker af gelen, findes det mitogene, aktive materiale i mono-15 merstørrelsesområdet i gelen. Dette demonstrerer, at det er muligt at frembringe en biologisk aktiv PDGF-monomer ved at ændre cy-steinrester eller området omkring dem. Mutagenisering af andre cysteinrester i molekylet kan derfor forventes at føre til et lignende resultat.

20 C. B-kædemutant med trunkeret aminoterminal.

Under biosyntesen af B-kæden i gærekspressionsystemet fjernedes a-faktor-præpropolypeptidet fra B-kæden ved proteolytisk processering ved det basiske dipeptid, Lys-Arg. Et andet basisk 25 dipeptid Arg-Arg forekommer 27 aminosyre nedenstrøms i B-kæden (figur 9). Det var af interesse at vide, om gærprocesseringsma-skineriet ville processere B-kæden ved dette interne sted og stadig give et aktivt protein. For at få den proteolytiske processering til at finde sted ved det interne Arg-Arg sted blev Lys-Arg ved 30 grænsen mellem α-faktor og B-kæden fjernet ved oligonukleotid-styret mutagenisering.

Mutageniseringen blev udført stort set som beskrevet for konstruktionen af pSB1 ovenfor. Pst I - Xba I-fragmentet i pVSB (figur 8) blev subklonet i M13-fag vektoren mpl9, og der blev frem-35 stillet enkeltstrenget template-DNA. I dette tilfælde var det anvendte mutagene oligonukleotid, ZC505 (tabel 2), udformet til at ændre «-faktoren Lys-Arg resterne til Gly-Leu og til at indføre et nyt genkendelsessted for Pvu II. Mutageniseringsreaktionerne blev udført som ovenfor beskrevet for pSB1, og de fremkomne mutanter ! ! 43 DK 176036 B1 blev screenet for det nye Pvu I!-genkendelsessted, og det blev derefter bekræftet ved DNA-sekvensanalyse. Det mutageniserede Pst I -Xba I fragment blev subklonet tilbage i B-kæde-ekspressionsenheden (pVSB), og det nye plasmid blev kaldt pSB3.

5

Eksempel VIII

Konstruktion af varianter og derivater af A-kæden.

A. Syntese af den N-terminale ende af A-kæden og konstruktion af A-B-hybridfusioner 10 De A-kæde-kodende sekvenser blev indsat i pSBI-vektoren som korte, syntetiske oligonukleotldduplexer udformet til at kode for den kendte A-kædeaminosyresekvens (Johnson et al-, Embo J. 3: 921-928, 1984). 2CS45 og ZC546 (tabel 2) blev anneleret, hvilket frembragte et kort duplex DNA-fragment med en klæbrig 5'-Sstl-15 ende, et unik Mlu I-restriktionssted og en klæbrig 3'-BgMl-ende.

Denne duplex blev klonet ind i pSB1 fordøjet med Sst I og Bgl II.

1 μΙ pSB1-vektor (0,15 pmol) blev kombineret med 1 μΙ ZC546 (ca.

1,6 pmol) og 0,6 μΙ ZC545 (ca. 1,5 pmol) plus 0,25 μ! 0,3 M NaCI (slut-NaCI-koncentration i anneleringsreaktionen var 30 mM), og 20 blandingen blev opvarmet til 60°C i 5 minutter. Efter opvarmning blev blandingen bragt til stuetemperatur og derefter anbragt på is.

Derefter tilsattes 0,5 μΙ 10x ligasepuffer (0,5 M Tris-HCI, 0,1 NI NlgCI2, 2M DTT, 0,01 M ATP, pH 7,8), 0,1 μΙ T^-DNA-ligase (New England Biolabs) og 2,5 μΙ vand, og denne ligeringsblanding blev 25 fortyndet og anvendt til at transformere E.coli HB101 celler. Ampi-cillin-resistente, plasmidbærende kolonier blev opsamlet, dyrket, og plasmid-DNA blev isoleret ved "miniprep"-metoden ifølge Ish-Horo-wicz og Burke (Nuc.Acid Res. 9: 2989-^2998, 1981). Plasmiderne blev analyseret for tilstedeværelsen af Sst I - Bgl il -indføjelsen og 30 et nyt Mlu l-réstriktionssted og blev bekræftet ved DNA-sekvensanalyse. ZC545-546 duplexen kodede for A-kæde aminosyrerne alanin 8 til thyrosin 17 (figur 9), og det fremkomne plasmid blev kaldt pAI.

ZC547 og ZC548 (tabel 2) blev anneleret til frembringelse af et 35 andet kort Sst I - Bgl .11 fragment, som kodede for A-kæde amino-syrerne serin 1 til arginin 13 (figur 9), og som ogsl indeholdt et Mlu I-restriktionssted. ZC547-548 duplexen blev separat klonet i pSB1 fordøjet med Sst I og Bgl II. 1 μΙ pSB1 (1,5 pmol) fordøjet med Sst I og Bgl II blev kombineret med 2 μΙ ZC547 (1 pmoi) og 2 μΙ ZC548 (1 pmol) plus 0,25 μ! 0,3 M NaCI, og blandingen blev DK 176036 B1 44 opvarmet til 50°C i 5 minutter. Efter opvarmning blev annelerings-blandingen bragt til stuetemperatur og derefter anbragt på is.

Derefter tilsattes 0,6 μΙ ΙΟχ ligasepuffer og 0,1 μΙ T^-DNA-ligase (New England Biolabs), og reaktionsblandingen blev inkuberet 5 natten over ved 12°C. En delprøve af denne ligeringsreaktionsblanding blev fortyndet og anvendt til at transformere E.coli HB101 celler, og de fremkomne plasmider blev screenet og analyseret som ovenfor beskrevet for pA1. I dette tilfælde blev det fremkomne plasmid kaldt pA2.

10 De overlappende A-kædekodende omrider i pA1 og pA2 blev føjet sammen ved det unikke Wllu l-restriktionssted under anvendelse af traditionelle metoder. Plasmid pA2 blev fordøjet med Mlu I og Barn Hl, og det ca. 1,4 kb lange vektorfragment (som indeholder pUC) blev isoleret ved agarosegelelektroforese og blev ekstraheret 15 fra agarosen med CTAB (Langridge et al., Anal.Biochem. 103: 264-271, 1980). Plasmid pA1 blev også fordøjet med Mlu I og Barn Hl, og det ca. 800 basepar lange fragment, som kodede for A-kæde aminosyrerne 13-17, og som er fusioneret til B-kæde amino-syrerne 24-109 efterfulgt af TPI-terminatoren, blev isoleret og 20 ekstraheret som ovenfor. Ækvimolære mængder af disse to fragmenter blev ligeret under standardbetingelser, og en delprøve blev anvendt til at transformere E.coli HB101 celler. Plasmider opnået fra ampicillin-resistente kolonier blev analyseret ved restriktionsenzymfordøjelse for de korrekte fragmenter, og det blev bekræftet ved 25 DNA-sekventering. Det fremkomne plasmid, kaldt pA3, kodede således for et hybrid protein, som begyndte med A-kæde aminosyrerne 1-17 efterfulgt i læseramme af B-kæde aminosyrerne 24-109.

Cla I-Barn Hl-fragmentet i pA3, som indeholdt hele ekspressionsenheden, blev klonet i pMPOT2, og det fremkomne plasmid pA3m 30 blev transformeret ind i gær.

Yderligere tilføjelse af A-kæde-aminosyrer til A-B-hybriden blev udført pi lignende mide. Plasmid pA3 blev først fordøjet med Asp718, som skærer plasmidet engang i A-kædesekvensen ved prolincodon 7, og med Barn Hl, og det hybridaminosyrekodende 35 fragment blev subklonet i pUC1l8. Denne subklon blev kaldt pA3N og blev efterfølgende fordøjet med Bgl II og Bst XI. Bgl II skærer ved grænsen mellem A- og B-kædesekvenserne i hybriden, og Bst XI skærer ca. 40 basepar nedenstrøms i B-kæden. Vektorfragmentet (pUC-holdig) fra denne fordøjelse blev isoleret ved 45 DK 176036 B1 agarosegelelektroforese og blev ekstraheret med CTAB. 1 pmol af hver af oligonukleotiderne ZC692 og ZC693. (tabel 2) blev anneleret til dannelse af en kort DNA-duplex med en 5* Bgl 11-ende og en 3' Bst XI-ende. Denne duplex kodede for glutaminsyre 18 til phe-5 nylalanin 31 i A-kæden og blev ligeret med 0,1 pmol pA3N fordøjet med Bgl II og Bst XI. Ligeringen blev udført natten over, og de ligerede produkter blev transformeret i E.coli MV1193 celler. Det fremkomne plasmid, kaldt pA6N, har nu forlænget A-kæde amino-syresekvensen til Bst XI-stedet ved aminosyren A31 efterfulgt af 10 B-kæde aminosyrerne B38 til B109.

Plasmid pA6N blev derefter fordøjet med Asp718 og Barn Hl, og A-B-hybridfragmentet blev klonet tilbage i pA3m fordøjet med Asp718 og Barn Hl. Dette nye A-B-hybridplasmid blev kaldt pA6m og kodede for A-kæde-aminosyresekvensen indtil aminosyre 40, fordi 15 Bst Xl-stedet ligger ved starten af et område med høj homologi mellem A- og B-kæderne.

B. Konstruktion af .A-B-A hybridfusioner.

Eftersom A- og B-kæderne i PDGF er så homologe med hensyn til struktur og funktion, findes der sandsynligvis adskillige biolo-20 gisk aktive hybridmolekyler, som kan fremstilles mellem de to. En række eksempler, som indeholder den aminoterminale A-kædesekvens efterfulgt af B-aminosyrer er beskrevet ovenfor. Et andet eksempel pi dette koncept vil være at konstruere et hybridprotein, som indeholder A-kæde-aminosyre-sekvensen ved den N-terminale ende 25 og'den carboxyterminale ende og B-kædesekvensen i midten.

I en foretrukken udførelsesform vil der blive anvendt plasmid pA6, som koder for hybridproteinet A1-17, B24-109 og udskifte B-kæde aminosyresekvensen ved dens carboxyterminale ende med A-kæde. 1 dette tilfælde fordøjedes det B-kæde kodende område med 30 restriktionsendonukleasen Sph I, som skærer i B-kædecodoner 96 og 97 (figur 9). Plasmidet pA6 blev igen skiret med Xba I, som skærer umiddelbart 3' for translationstermineringscodonen. Denne sekvens blev derefter erstattet med to oligonukleotider, som, når de er anneleret, danner en duplex med en klæbrig 5' Sph I ende 35 henholdsvis en 3' Xba I ende, og som indeholder A-kæde-codoner (figur 9). De to oligonukleotider, ZC ABA-1 og ZC ABA-2, er vist i tabel 2. Disse to oligonukleotider anneleres ved opvarmning til 65°C og langsom afkøling som ovenfor beskrevet. Den annelerede duplex ligeres derefter ind i pA6-plasmid, som er fordøjet med 46 DK 176036 B1

Sph I og Xba I, og som er blevet isoleret ved agarosegelelektro-forese. Det ligerede produkt transformeret ind i E.coli MV1193 celler, og transformerede kolonier blev opnået på ampicillinplader. I dette tilfælde blev der ikke indført nogen nye restriktionssteder af 5 den nye A-kæde-duplex, så konstruktionen blev bekræftet ved DMA-sekvensanalyse.

C. Konstruktion af en A-kæde cysteinmutant.

Som det fremgår af figur 9 indeholder både A- og B-kæderne i 10 PDGF 8 cysteinrester, som er i stand til at danne disulfidbindinger.

Det fremgår også af figur 9, at disse cysteinrester findes i analoge positioner i de to polypeptider og derfor kan deltage i lignende disulfidarrangementer imellem de to kæder og endog mellem to forskellige kæder (A og B). Det har været kendt i adskillige ir, at 15 kemisk reduktion af disulfidbundet PDGF dimerer til monomerer ødelægger dets biologiske aktivitet. Det er interessant at vide, hvilken af de pågældende cysteinrester, der er involveret i disulfidbindinger af bide den intramolekylære type og den intermoleky-lære type. Det er meget sandsynligt, at rollen af hver cystein vil 20 være analog i både A- og B-kæderne.

Den første cysteinrest i A-kæden findes ved position nr. 10, som er analog med nr. 16 i B-kæden (figur 9). A-B-hybriden pA3 (beskrevet ovenfor) koder for A - kæde-aminosy rerne 1-17 efterfulgt af B-kæden. Ved syntesestrategien, som førte til konstruktion af 25 pA3, indførtes unikke restriktionssteder, som flankerede cysteinen ved resten A10. Et Asp718 og et Mlu I restriktionssted blev anbragt 5' henholdsvis 3' i forhold til A10 cystein-codonen ca. 20 basepar fra hinanden. Der blev syntetiseret to oligonukleotider (ZC671 og ZC672 tabel 2), og de blev anneleret til dannelse af en kort 30 DNA-duplex med en klæbrig 5'-Asp718-ende og en klæbrig 3'-

Mlu I-ende. Denne duplex koder for en serinrest i stedet for cystein A10. Plasmid pA3 blev fordøjet med Asp718 og med Mlu 1, og det store vektorfragment (pUC-holdigt) blev isoleret ved agarose-gelelektroforese. Ækvimolære mængder af vektoren og ZC671-672 35 duplexen blev ligeret under standardbetingelser, som ovenfor be skrevet, og derefter transformeret i E.coli MV1193 celler. Plasmid-DNA (miniprep) blev fremstillet ud fra de fremkomne transformanter og blev screenet for et nyt Pvu II -restriktionssted i ZC671-672 duplexen. Piasmidets duplexområde blev derefter bekræftet ved i | i 47 DK 176036 B1 DNA-sekvensanalyse. Det fremkomne plasmid, kaldt pA5, kodede for et A-B-hybridprotien med A-kædeaminosyrerne 1-17 i den aminoter-minale ende, men aminosyreresten 10 er serin i stedet for en cy-stein. De resterende aminosyrer i pA5-hybriden er de normale 5 B-kæderester (Glu 24 til Thr 109).

D. Fuldstændig syntese af A-kædegenet.

Det resterende af A-kædegenet blev syntetiseret med oligo-nukleotider på lignende måde som ovenfor beskrevet. Der kan udformes mange strategier til at udføre denne opgave. En sådan 10 strategi beskrives nedenfor. De oligonukleotoder, som blev anvendt ved denne strategi, er vist i tabel 2, og deres udformning afspejler optimal codonudnyttelse for Saccharomyces cerevisiae. I denne strategi blev resten af A-kædegenet syntetiseret med unikke restriktionssteder indført for at lette subkloning og sekventering af 15 de syntetiske oligonukleotidsekvenser. Alle otigonukleotiderne blev syntetiseret på et Applied Biosystems 380-A-DNA-syntetiserings-apparat. Oligonukleotiderne ZC752 og ZC753, hver 87 merer, blev anneleret og subklonet som et Hind-111 - Xba I-fragment, der kodede for A-kædeaminosyrerne 77-104. ZC752 og ZC753 (1,25 pmol 20 af hver) blev anneleret i 5 mikroliter 40 mM NaCI ved opvarmning til 65°C i 15 minutter, og blandingen fik derefter lov til at komme til stuetemperatur og blev sat på is. En tiendel af denne annelerede duplex (0,0125 pmol) blev ligeret både ind i pUC118 (0,07 pmol) og M13mp18 (0,02 pmol), som tidligere var blevet fordøjet med Hind III 25 og Xba I. De ligerede blandinger blev anvendt til at transformere den egnede E.coli værtsstamme (JM107 i tilfældet med M13mpl8 og MV1193 i tilfældet med pUV118), og det fremkomne plasmid eller RF DNA'er blev analyseret med restriktionsendonukleasefordøjelse og DN A-sekventering.

30 Oligonukleotiderne ZC746 + 747, 748 + 749 og 750 + 751 blev udformet til dannelse af korte duplexer med klæbrig ende, som, når de sluttes sammen udgør sekvensen mellem Bst XI-stedet ved A31 og Hind I Il-stedet ved A77. Oligonukleotiderne blev phosphoryleret 32 med P og T^-polynukleotidkinase under standardbetingelser.

35 Parrene ZC746 + ZC747, zc748 + 749 og ZC 750 + 751 blev hver anneleret ved at kombinere 2,5 pmol af hver oligonukleotid i 5 μΙ 40 mM NaCI, opvarme blandingen til 65°C i 15 minutter, lade blandingen komme til stuetemperatur og anbringe den på is. De tre annelerede blandinger blev kombineret (nu 15 μΙ) og blev ligeret i 48 DK 176036 B1 et slutvolumen pi 20 μΙ. De ligerede produkter blev underkastet elektroforese i en 4% NuSieve agarosegel (FMC Corporation) i TBE-puffer (90 mM Tris, 90 mM borsyre, 2 mM dinatrium-EDTA) efterfulgt af autoradiografi. Det 140 basepar lange fragment, som 5 svarede til de korrekt ligerede duplexer, blev skåret ud af gelen og ekstraheret med CTAB. Dette fragment sammen med det tidligere klonede Hind Ill-Xba l-fragment blev ligeret i pA6N-vektoren fordøjet med Bst XI og Xba I. Det fremkomne plasmid blev kaldt pA6N+. Plasmid pA6N·«· blev derefter fordøjet med Asp718 og Xba I, 10 og det A-kædekodende fragment blev klonet tilbage i pA3. Dette plasmid pA7 kodede for hele den modne A-kæde.

Med hensyn til gærekspression vil en foretrukken udførelsesform udnytte oligonukleotiderne ZC748 og ZC749. Disse koder for en glutamin ved position A-48 i stedet for en asparagin. Denne æn-15 dring ødelægger det N-koblede glycosyleringssted, som kan glyco-syleres afvigende i gær. Oligonukleotider, som er udformet til at bevare det N-koblede glycosyleringssted, kan ogsi anvendes.

Den strategi, som udnytter den ovenfor beskrevne totale gensyntese, er ønskelig, eftersom aminosyresekvensen af A-kæden 20 er kendt, og codonudnyttelsen optimeres for gær. Alternativt kunne en A-kæde cDNA-sekvens udtrykkes i gær eller andre eukaryote celler forudsat, at cDNA'et var hensigtsmæssigt inkorporeret i en egnet ekspressionsvektor. Et A-kæde cDNA kunne opnås ud fra en række pattedyrcellelinier ved hjælp af traditionelle metoder 25 (Betsholtz et al., Nature 320, 695-699, 1986).

E. Konstruktion af A-kæde aminoterminal trun keret mutant.

Under biosyntesen af A-kædeproteinet i gærekspressionssystemet fjernes α-faktor-præpropeptidet fra A-kæden ved proteolytisk processering ved det basiske dipeptid Lys-Arg, α-faktor amino-30 syreresterne nr. 84 og nr. 85. For at drive den proteolytiske processering til at finde sted ved et internt A-kædested, fjernedes Lys-Arg ved grænsen mellem d-faktoren og A-kæden, og der blev skabt et internt Arg-Arg ved oligonukleotidstyret mutagen i sering.

Mutageniséringen til fjernelse af Lys-Arg blev udført stort set 35 som beskrevet ovenfor for pSBI. Pst I -Xba I-fragmentet fra pVSB (figur 8) blev sub klonet i M13-f ag vektoren mpl9, og der blev fremstillet enkeltstrenget template-DNA. I dette tilfælde er det mutagene oligonukleotid udformet til at ændre α-faktor Lys-Arg resterne til Gly-Leu og til at indføre et nyt Pvu II restriktionssted.

49 DK 176036 B1

Mutageniseringsreaktionerne blev udført som ovenfor beskrevet for pSB1/ og de fremkomne mutanter blev screenet for det nye Pvu 11-sted, og det blev derefter bekræftet ved DNA-sekvens-analyse. Det mutagen i serede Pst I - Xba I -fragment blev subklonet 5 tilbage i A-kæde-ekspressionsenheden (betegnet pA7).

For at indføre et dibasisk peptidsted i den A-kædekodende sekvens blev oligonukleotidstyret mutagenisering anvendt som ovenfor beskrevet. Aminosyreest nr. 22 i A-kæden er en serin, medens nr.21 er en Arg. I dette tilfælde blev det mutagene oligonukleotid 10 udformet til at ændre Ser nr. 22 til en Arg, hvorved der skabes sekvensen Arg-Arg ved positionerne nr. 21 og nr. 22. Dette nye dibasiske sted i A-kæden findes i en position, som er præcis analog med en, som normalt er tilstede i B-kæden (fig. 9). Ved at udtrykke denne mutantkonstruktion fra or-faktorlederen, som det 15 dibasiske processeringssted, skulle det fremkomne A-kædemolekyle blive processeret internt ved det nye Arg-Arg og blive secerneret som et trunkeret polypeptid.

Eksempel IX

Indføjelse af ekspressionsenhedskonstruktioner i pMPOT2.

20 Hver af de molekyler, som blev konstrueret i eksemplerne VI-VIII ovenfor, blev ført tilbage i den basale ekspressionsenhed pVSB eller pSBI, hvis Sst l-stedet blev anvendt. Derefter blev hver af dem endelig klonet i gærplasmidet pMPOT2 (eksempel IV). I hvert tilfælde blev dette gjort ved at fjerne ekspressionsenheden 25 som et enkeltfragment fra pVSB eller pSB1 ved fordøjelse med Cla I og Bam Hl. Cla I- Barn Hl -fragmentet er hver blevet isoleret ved agarosegelelektroforese og blev klonet i pMPOT2, som var blevet fordøjet med Cla I og Barn Hl. Navnene på de fremkomne plasmider blev derefter rettet med et lille bogstav "m", f.eks. blev pA2 til 30 pA2m.

Hver af mPOT-konstruktionerne blev derefter transformeret i gærstammen E18 nr. 9 (eksempel VI).

Eksempel X

A-B heteromer ekspressionskonstruktion.

35 PDGF er en disulfidbundet dimer og består som isoleret fra blodplader af to aminosyrekæder, en A-kæde og en B-kæde. Det formodes, at dette materiale foreligger i form af en A-B hetero-dimer. Der er nu en række eksempler på PDGF-homodimerer, som er ' DK 176036 B1 50 sammensat af enten A- eller B-kaeden (Kelly et al., EMBO J. 4: 3399-3405 1985; Stroobant og Waterfield, EMBO J. 3: 2963, 1984 og Heldin et al., Nature 319.: 511, 1986). Skønt man stadig tror, at blodplade PDGF er en heterodimer, rejser disse resultater den 5 mulighed, at det faktisk kan være en blanding af A-A og B-B homodimerer.

Efter at have udtrykt biologisk aktive A- og B-former i PDGF i gærekspressionssystemet er det muligt at indføre både en A- og en B-kædeekspressionsenhed i den samme gærcelle og at identificere 10 A-B heterodimerer blandt de biologisk aktive produkter. Dette kan gøres ved at indføre respektive ekspressionsenheder i gærcellen pi forskellige plasmider, eventuelt med forskelligt selekterbare markører. Under anvendelse af denne strategi kan det være vanskeligt at styre det relative kopiantal af de to plasmider, og dette kan resul-15 tere i mængder af A- og B-kædepolypeptiderne, som står i et misforhold til hinanden i cellen. En foretrukken strategi ville være at anbringe både A-kæde og B-kæde ekspressionsenhederne på det samme plasmid. På denne måde ville kopiantallet altid være ens.

Der findes adskillige måder til at inkorporere begge ekspres-20 sionsenheder på det samme plasmid. I den foreliggende opfindelse blev B-kæde ekspressionsenheden fra plasmid pVSB (figur 8) fjernet ved fuldstændig fordøjelse med Barn Hl efterfulgt af partiet fordøjelse med Bgl II. Det fragment, som svarer til ekspressionsenheden (TPI-promotor-MFal-B-kæde-terroinator), blev isoleret ved 25 agarosegelelektroforese og blev subklonet i Barn Hl-restriktionstedet i pUC18. Orienteringen af indføjelsen i de fremkomne subkloner blev fastlagt ved traditionelle restriktionsenzymfordøjelser. En subklon, i hvilket Bgl 11-enden af indføjelsen lå umiddelbart ved siden af Sal I stedet i polylinkeren, blev valgt til det næste trin. Denne 30 subklon blev fordøjet med Sal I og Barn Hl, og det indføjede fragment blev isoleret. Dette B-kæde-fragment blev derefter ligeret ind i plasmid pA7m, som var blevet fordøjet med Sal I og Barn Hl. Det fremkomne plasmid pAB2m indeholdt både A- og B-kædeekspres-sionsenhederne orienteret ende mod ende. Dette plasmid blev der-35 efter transformeret i gærstammen E18 nr.9.

51 DK 176036 B1

Eksempel XI

Analyser for biologisk aktivitet A. Radioreceptoranalyse (RRA) for PDGF.

Radioreceptoranalysen for PDGF (Bowen-Pope og Ross, J.Biol.

5 Chem. 257: 5161, 1982) er en specifik og følsom (0,2-2 ng/ml PDGF) metode til påvisning af biologisk aktivt, PDGF-lignende materiale i gær. Ved denne analyse undersøges det PDGF-lignende materiale for dets evne til at konkurrere med oprenset, radioaktivt 125 mærket l-PDGF for bindingssteder pi celleoverflade-PDGF-10 receptorer. Resultaterne fortolkes ved sammenligning med en standardkurve frembragt med oprenset, umærket PDGF. Sammenligning med resultater opnået med andre analysemetoder (f.eks. ELISA) tilvejebringer indikation for styrken af receptor/ligand-interaktionen ud over en kvantificering af det bundne materiale. Analysen blev 15 udført på følgende måde: Der blev frembragt næsten sammenløbende 4 monolag af diploide humane fibroblaster ved at udplade 1,5 x 10 2 celler pr. 2 cm kulturbrønd i Costarbakker med 24 brønde i Dulbecco modificeret Eagles medium (DMEM) suppleret med 1% human, plasmaafledt serum (PDS). Kulturerne blev sat på en 20 isbakke og skyllet 1 gang med iskold bindingsskyllepuffer (Ham's medium F-12 pufret ved pH 7,4 med 25 mM HEPES og suppleret med 0,25% BSA). Der blev tilsat 1 ml/brønd testsubstans i bindingsmedium, og kulturerne blev inkuberet i et afkølet rum på en oscillerende plade i 3-4 timer. Bakkerne blev derefter anbragt pi is, 25 aspireret, skyllet 1 gang med kold bindingsskyllepuffer og inkuberet i 1 time som ovenfor med 1 ml/brønd bindingsmedium, som 125 indeholdt 0,5 ng/ml I-PDGF. Mærkningen blev afsluttet med 4 125 skylninger med bindingspuffer, og celletilknyttet I-PDGF blev bestemt ved ekstraktion med opiøseliggørende puffer. Der blev 30 opnået standardkurver med 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 og 0,8 ng/ml oprenset PDGF, og testprøverne blev sammenlignet med disse værdier.

PDGF-receptorbinding med CM-Sephadex-mediekoncentrater fra transformanter, som indeholdt plasmiderne pVSBm og pMPOT2, blev 35 sammenlignet med receptorbinding af autentisk PDGF. Efter koncentrering af binding til og eluering fra CM-Sephadex blev pVSBm-koncentratet normaliseret til PDGF-ækvi valenter i ELISA under anvendelse af polyklonalt gedeantistof mod PDGF. RRA-resultaterne blev fortolket ved at sammenligne med en standardkurve frembragt i 52 DK 176036 B1 med oprenset, umærket PDGF, hvilket er vist på fig. 10. Det er vist, at medier fra kulturer transformeret med pVSBm-konstruk- 125 tionerne, konkurrerer med I-PDGF for binding til PDGF-recep-toren. Medier fra gærceller, som er transformeret med pMPOT2, 5 konkurrerer ikke med radioaktivt mærket PDGF for receptorbinding.

B. Mi togeneanalyse PDGF's evne til at stimulere DNA-syntese og cellevækst i 3 kultur var basis for bestemmelsen og opdagelsen af PDGF. H-

Thymidininkorporering i DNA i dyrkede celler, som er modtagelige 10 overfor PDGF (Raines og Ross, Meth.in Enzymology 109: under trykning) er en foretrukken metode til påvisning af den biologiske aktivitet hos PDGF-lignendé molekyler frembragt i gær.

Testprøver af umiddelbart brugte medier eller koncentrater af brugte medier eller testprøver i 10 mM eddikesyre (op til 100 pi/ 2 15 brønd) blev tilsat til hvilende kulturer af muse 3T3 celler i 2 cm

O

Costardyrkningsplader med 24 brønde (2-3 x 10 celler/brønd i 1 ml). Hvilende testkulturer kan opnås ved at udplade cellerne i 10% serum og lade dem få lov til at udtømme mediet, 4-5 dage. Testprøverne blev fjernet fra brøndene efter 20 timer og erstattet med 3 20 0,5 ml frisk medium pr. brønd indeholdende 2 pCi/ml [ H]-Thymidin og 5% (volumen/volumen) kalveserum. Efter yderligere 2 timer inkubering ved 37°C blev cellerne høstet ved: bortsugning af mediet, vask af cellerne 2 gange, hver gang med 1 ml iskold 5% TCA, opløsning af TCA-uopløseligt materiale med 0,8 ml 0,25 N 25 NaOH under blanding og tælling af 0,6 ml af denne opløsning i 5 ml Aquasol i en væskescintillationstæller. Antal gange stimulering i forhold til kontrolbrønde (100 μΙ i 10 mM eddikesyre alene) blev bestemt (normal 30-50 ganges maksimal stimulering) og blev sammenlignet med en standardkurve opnået under anvendelse af op-30 rensede PDGF-præparationer.

A-kæde homodimeren og B-kæde homodimeren er blevet oprenset til homogenitet, er blevet kvantificeret ved aminosyreanalyse og er fundet at have stort set lige stor specifik aktivitet i mito-geneseanalysen.

35 53 DK 176036 B1

Eksempel XII

Optimering af proteinekspression.

A. Konstruktion til optimeret B-kæde ekspression.

De DNA-sekvenser, som koder for alfa-faktor-lederen og 5 PDGF-B-kæden, blev modificeret til at indeholde gæroptimale co-doner og til at kode for vildtype alfa-faktoren såvel som autentisk human B-kæde. Dette genetablerede alfa-faktorsekvensen, som var blevet ændret i tidligere konstruktioner, og muliggør optimeringen af B-kæde ekspressionsniveauer.

10 Den codonoptimerede alfa-faktorledersekvens blev opnået fra en ekspressionsvektor, som indeholdt genet for insulinanalogen B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) (Markussen et al., EP 163,529). Et Eco Rl-Xba I-fragment, som omfattede alfa-faktor, præpro- og insulin-sekvenserne blev klonet i pUC118, som var fordøjet med 15 EcoRI og Xbal (opnået fra J.Vieria og J.Messing, Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, Piscalaway, N.J.) og der blev fremstillet enkeltstrenget template-DNA. Denne template blev derefter mutage-niseret ifølge 2-primermetoden (Zoller og Smith, DNA 3:479-488, 1984) under anvendelse af det mutagene oligonukleotid ZC862 (5' 20 CGA ATC TTT TG A GCT CAG A AA CAC C 3'). Mutageniseringen resulterede i skabelsen af et Sst I-restriktionssted ved 3'-enden af alfa-faktorlederen. Et korrekt ændret plasmid blev selekteret og betegnet pKP23. Ledersekvensen blev skåret ud fra pKP23 ved fordøjelse med Eco RI og Sst I, og lederfragmentet blev subklonet i 25 plC19 (Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984). Det fremkomne plasmid blev benævnt pKP24.

Den humane B-kædesekvens blev opnået fra plasmid pB12 (eksempel VII A). pB12 blev fordøjet med Sst I og Xba I, og B-kædefragmentet blev indvundet. Plasmid pKP10, som omfattede 30 TPI-promotor--ot-faktor--VSB—TPI-terminator i pSBI (eksempel VI) indsat i en pBR322-vektor, som manglede et EcoRI-sted, blev fordøjet med Sst I og Xba I til fjernelse af VSB-sekvensen. pB12 B-kædesekvensen og pKP24 cr-f aktorsekvensen (Eco RI-Sst l) blev derefter indsat i pKPlO ekspressionsenheden. Det fremkomne plas-35 mid blev benævnt pKP26.

Det Sst I-sted, som var indført i alfa-faktorlederen for at lette konstruktionen af pKP26, blev derefter fjernet for at genetablere vildtypekodesekvensen. Plasmid pKP26 blev fordøjet med EcoRI og Xba i, og alfa-faktoi—B-kædefusionssekvensen blev indvundet.

DK. 176036 B1 54

Dette fragment blev klonet i pUC1l8, og der blev isoleret enkelt-strenget template-DNA. Templaten blev mutageniseret med to-pri-mermetoden under anvendelse af det mutagene oligonukleotid ZC1019 (5‘ ACC CAA GGA TCT CTT GTC CAA AGA AAC ACC TTC TTC 5 3'). Et korrekt mutageniseret plasmid blev benævnt pKP32.

Hele ekspressionsenheden blev derefter rekonstrueret. Plasmid pKP32 blev fordøjet med EcoRI og Xbal, og alfa-faktor--B-kæde fragmentet blev indvundet. Dette fragment blev indsat i pKP25 fordøjet med EcoR I og Xba I til konstruktion af pKP34. Plasmid 10 pKP34 blev fordøjet med Cla I og Barn Hl, og ekspressionsenheden blev indvundet. Dette fragment blev indsat i pMPOT2 fordøjet med Cla I og Barn Hl til·konstruktion af pKP36.

B-kædesekvensen blev derefter codonoptimeret. Et internt Bgl II—Sph i-fragment af B-kædesekvensen fra pKP36 blev er-15 stattet med en sekvens samlet ud fra de oligonukleotider, som er vist i tabel 4. Den pMPOT2-baserede ekspressionsvektor, som indeholdt den helt optimerede ekspressionsenhed, blev betegnet pB170m.

B. Optimeret A-kæde ekspressionskonstruktion.

20 Den codonoptimerede A-kædesekvens fra plasmid pA7 (eksempel VIII D) blev kombineret med den codonoptimerede alfa-faktorleder-sekvens i en serie af konstruktionstrin, som er parailele med de trin, der er beskrevet ovenfor for B-kæden. Alfa-faktorsekvensen i pKP24 blev kombineret med pA7-A-kædesekvensen og pKPlO fordøjet 25 med med EcoRI og Xbal til konstruktion af pKP27. Plasmid pKP27 blev fordøjet med Eco RI og Xba I, og alfa-faktor--A-kædefragmen-tet blev klonet i pUC118.

Mutagen i sering under anvendelse af oligonukleotidet ZC1018 (51 TTC GAT AGA TCT CTT GTC CAA AGA AAC ACC TCC TTC 3') 30 blev udført som ovenfor beskrevet til fjernelse af Sst I stedet og genetablering af vildtype alfa-faktorsekvensen. Det korrekte plasmid blev betegnet pKP31.

En codonoptimeret ekspression s vektor blev derefter konstrueret. Plasmid pKP31 blev fordøjet med Eco RI og Xba I, og alfa-fak-35 tor—A-kædefragmentet blev sammenføjet med pKP24 fordøjet med Eco RI og Xba I. Den fremkomne vektor, betegnet pKP33, indeholdt hele ekspressionsenheden. Plasmid pKP33 blev fordøjet med Cla I og BamHI, og ekspressionsenhedsfragmentet blev genvundet. Dette fragment blev indføjet i pMPOT2 fordøjet med Cla I og Barn Hl til konstruktion af ekspressionsvektoren pKP35.

55 DK 176036 B1 C. Ekspression af A-kæde og B-kæde.

S.cerevisiae, stamme XB13-5B, blev separat transformeret med plasmiderne pB170m og pKP35 ifølge standardprocedurer. Transformanterne blev dyrket i glucosemedier ved 30°C under omrystning.

5 Kulturerne blev høstet, cellerne blev fjernet ved centrifugering, og proteinet blev oprenset fra supernatanterne som nedenfor beskrevet.

S.cerevisiae stamme XB13-5B transformanter, som indeholdt plasmiderne pB170m og pKP35, er blevet deponeret hos American 10 Type Culture Collection, Rockville, Md. 20852, USA.

D' Proteinoprensning Gærkultursupernatanter (12 liter), fremstillet som ovenfor beskrevet, blev koncentreret på en Amicon RA2000 ultrafiltrerings-15 membran med en strømhastighed på 60 ml/min. til et volumen p§ 350 ml. Pufferen blev udskiftet med 25 mM Na-acetat pH 5,5, som indeholdt 0,1% NaNg. De koncentrerede prøver blev centrifugeret ved 15000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter og opbevaret ved -20° C.

20 De frosne prøver blev tøet op, centrifugeret ved 15.000 om drejninger pr. minut i 20 minutter og blev fraktioneret på en S-Sepharosesøjle (Pharmacia). 300 ml prøver blev sat på en 30 ml søjle med en strømhastighed på 2 ml/min. Søjlen blev derefter vasket med 25 mM Na-acetat pH 5,5 indeholdende 0,1% NaN^. Søjlen blev elueret 25 ved en hastighed på 2 ml/min under anvendelse af følgende elue-ringsprogram: 20 min. med 20 mM Na-phosphat pH 7,3 indeholdende 0,1% N.aNj, 30 min. med 20 mM Na-phosphat pH 7,3, 0,2 M NaCI, 50 min. med 20 mM Na-phosphat pH 7,3, 0,5 M NaCI, 20 minutter med Na-phosphat pH 7,3, 1 M NaCI. A- og B-kædepolypeptiderne elue-30 rede ved 0,5 M NaCI. Fraktionerne blev analyseret for mitogen aktivitet og ved gelelektroforese. Mitogent aktive fraktioner blev hældt sammen, og pH blev indstillet til 6,0.

Endelig oprensning blev udført ved højeffektiv væskekromatografi (HPLC). De sammenhældte fraktioner fra Sepharose-kromato-35 grafien blev ført over en MicroPak C-18 søjle ved en strømhastighed på 1 ml/min. PDGF-polypeptiderne blev elueret under anvendelse af en gradient af puffer B (0,1% TFA i CHjCN) i puffer A (0,1% TFA i HgO). Elueringsprogrammet var: 56 DK 176036 B1

Time (min.) % puffer B

0 0 17.5 35 32.5 50 5 33,0 100

Der blev opsamlet 0,5 ml fraktioner, og de blev analyseret for mitogen aktivitet, og de aktive fraktioner blev hældt sammen.

Tabel 4 10 ZC886 GGCCACCATGTGTTGAAGTT CAAAGATGCT CGGGTTGTTG-

TAACAACAGAAACGTTCAATG

ZC887 Tcgacattgaacgtttctgttgttacaacaacccgagcatct

TTGAACTTCAACACATG

ZC888 GAT CT CT AGAAGATT GAT CGACAGAACCAACGCCAACTTC-15 TTGGTTT

ZC889 GT GGCCAAACCAAGAAGTTGGCGTTGGTTCTGT CGATCAA-TCTTCTAGA

ZC907 CGTT AGAAAGAAGCCAATCTTCAAGAAGGCTACCGTTACCC TCGAGGACCACTTGGCATG

20 ZC908 TCGACCAACCCAAGTTCAATTGCGGCCGGTTCAAGTGCGCA

AGATCGAAAT

ZC909 CT AACGATTT CGAT CTT GCGCACTT GAACCGGCCGCAATTGA ACTTGGGTTGG

ZC910 CCAAGTGGTCCTCGAGGGTAACGGTAGCCTTCTTGAAGATT 25 GGCTTCTTT

30 35

Claims (24)

1. Rekombinant protein homodimer med to polypeptidkæder bundet med disulfidbin-dinger, hvilke kæder er valgt blandt gruppen bestående af: 5 (a) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104 (b) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (c) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, og (d) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, hvilket protein har human PDGF mitogenaktivitet. 10

2. Rekombinant protein homodimer ifølge krav 1, yderligere kendetegnet ved en substitution af mindst én cysteinrest i stilling 37, 46 eller 47 med en anden aminosyrerest.

3. Rekombinant protein homidmer ifølge krav 2, hvor den anden aminosyrerest er en 15 serinrest.

4. Rekombinant protein med to polypeptidkæder bundet med disulfidbindinger, hvor mindst en af kæderne er en mosaik af aminosyresekvenser af A- og B-kæderne af human PDGF, hvor mosaikkæden er valgt blandt gruppen bestående af: 20 (a) A-kæde-aminosyrerne 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrerne 24-109, (b) A-kæde-aminosyrerne 1-31 bundet til B-kæde-aminosyrerne 38-109, (c) A-kæde-aminosyrerne 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrerne 24-97 bundet til A-kæde aminosyrerne 92-104, og hvor den anden kæde er valgt blandt gruppen bestående af: 25 kæderne (a), (b) og (c) som defineret ovenfor, (d) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104, (e) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (f) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, (g) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, 30 (h) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 109, (i) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 101, (j) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 101, og (k) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 109, hvilket protein har human PDGF mitogenaktivitet. DK 176036 B1 58

5. Rekombinant protein ifølge krav 4, yderligere kendetegnet ved substitutionen af mindst én cysteinrest i en stilling svarende til position 37 i A-kæde, position 46 i A- -kæde, position 47 i A-kæde, position 43 i B-kæde, position 52 i B-kæde eller position 5 53 i B-kæde med en anden aminosyrerest.

6. Rekombinant protein ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den anden aminosyrerest er en serinrest.

7. Rekombinant protein ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at prote inet er uglycosyleret.

8. Terapeutisk sammensætning, kendetegnet ved, at den omfatter et protein ifølge ethvert af kravene 1-7 og en fysiologisk acceptabel bærer. 15

9. Terapeutisk sammensætning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at bæreren er valgt blandt albumin, sterilt vand og saltvand.

10. Terapeutisk sammensætning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den inklude-20 rer en adjuvans.

11. Terapeutisk sammensætning ifølge krav 10, kendetegnet ved, at adjuvansen -er valgt blandt kollagen, hyaluronsyre, fibronektin, faktor XIII og et antibiotikum.

12. Terapeutisk sammensætning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at proteinet er tilstedet i en koncentration på fra 1 til 50 μg/ml af totalvolumenet.

13. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 8-12 til brug ved fremme af sårhelings-processen hos varmblodede dyr. 30

14. Protein ifølge ethvert af kravene 1-7 til brug ved fremme af vækst af pattedyrceller ved at inkubere cellerne med proteinet. 59 DK 176036 B1

15. Sårforbinding, kendetegnet ved, at den indeholder et protein ifølge ethvert af kravene 1-7.

16. Anvendelsen af et protein ifølge ethvert af kravene 1-7 til fremstilling af et læge-5 middel til fremme af sårhelingsprocessen i varmblodede dyr.

17. DNA-konstruktion som er i stand til at dirigere ekspressionen og sekretionen af et protein ifølge ethvert af kravene 1-3 i eukaryote celler.

18. DNA-konstruktion ifølge krav 17, hvor polypeptidet er yderligere karakteriseret ved substitutionen af mindst én cysteinrest i en stilling svarende til A-kædeposition 37, 46 ~ eller 47 med en anden aminosyrerest.

19. DNA-konstruktion som er i stand til at dirigere ekspressionen og sekretionen af 15 biologisk aktive humane PDGF analoger i eukaryote celler, hvilken DNA-konstruktion indeholder en transkriptionel promotor nedenstrøms efterfulgt af en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som er en mosaik af aminosyresekvenser af A- og B-kædeme af human PDGF, hvilken polypeptidkæde er valgt blandt gruppen bestående af: (a) A-kæde-aminosyrer 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrer 24-109, 20 (b) A-kæde-aminosyrer 1-31 bundet til B-kæde:aminosyrer 38-109, og (c) A-kæde-aminosyrer 1-17 bundet til B-kæde-aminosyrer 24-97 bundet til A-kæde-aminosyrer 92-104.

20. DNA-konstruktion ifølge krav 19, hvor polypeptidet er yderligere kendetegnet ved 25 substitutionen af mindst én cysteinrest i en stilling svarende til B-kædeposition 43, 52 eller 53 med en anden aminosyrerest.

21. DNA-konstruktion ifølge krav 18 eller 20, kendetegnet ved, at den anden aminosyrerest er en serinrest. 30

22. DNA-konstruktion ifølge ethvert af kravene 17-21, kendetegnet ved, at polypeptidet ikke indeholder et N-bundet glycosyleringssted. 60 DK 176036 B1

23. Fremgangsmåde'til fremstilling af biologisk aktive humane PDGF analoger, hvilken fremgangsmåde omfatter at en DNA-konstruktion ifølge ethvert af kravene 17-22 indføres i en eukaryot værtscelle 5 at den eukaryote værtscelle dyrkes i et egnet medium, og at PDGF analogen isoleres fra den eukaryote vært.

24. Fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktive human PDGF analoger hvilken fremgangsmåde omfatter, 10 at en DNA-konstruktion ifølge krav 19 indføres i en eukaryot værtscelle · at der i den eukaryote værtscelle indføres en anden DNA-konstruktion som indeholder en transkriptionel promotor nedenstrøms efterfulgt af en DNA-sekvens som koder for et polypeptid valgt blandt gruppen bestående af: (i) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 104, 15 (j) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 9 til aminosyre 95, (k) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 95, (l) A-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 104, (m) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 109, (n) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 101, 20 (o) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 15 til aminosyre 101, og (p) B-kæden af human PDGF fra aminosyre 1 til aminosyre 109, den eukaryote værtscelle dyrkes i et egnet medium, og PDGF analogen isoleres fra den eukaryote vært. 25